Автореферат и диссертация по медицине (14.00.22) на тему:Использование деминерализированного костного матрикса для восстановления поврежденных длинных трубчатых костей со значительными дефектами (экcпериментальное исследование) травматология и ортопедия, гистология, цитология, клеточная биология

На правах рукописи

РГ5 ОД

17 ШН Ш

КАРПОВ Игорь Николаевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕННЫХ

ДЛИННЫХ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ СО ЗНАЧИТЕЛЬНЫМИ

\

ДЕФЕКТАМИ

(Экспериментальное исследование)

14.00.22 - травматология и ортопедия;

03.00.25 — гистология, цитология, клеточная биология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в ГУН Центральном научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова МЗ РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Троценко В.В.

доктор медицинских наук, профессор Омельяненко Н.П.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Шерепо K.M. академик РАМН

доктор медицинских наук, профессор Денисов-Никольский Ю.И.

Ведущая организация Российский университет Дружбы Народов (РУДН)

Защита состоится «j^L.» 2002г. ъ/З ч.

На заседании диссертационного совета К 208.112.01 в Центральном научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии им. H.H. Приорова. (Москва, 125299, ул. Приорова, 10).

О

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУН ЦИТО им. H.H. Приорова.

Автореферат разослан « » 2002г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Родионова С.С.

Рч51 oPh (-■

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Восстановление целостности поврежденных длинных трубчатых костей со значительными дефектами остается одной из сложных и до конца не решенных проблем в травматологии и ортопедии. Дефекты длинных трубчатых костей могут быть следствием как непосредственно травмы (дорожно-транспортные происшествия, техногенные катастрофы, огнестрельные ранения и т.п.), так и результатом осложнений, возникающих в процессе лечения (ложные суставы, длительно не срастающиеся переломы, онкологические заболевания, остеомиелит). Сложность данной патологии заключается, с одной стороны, в полиморфности патологических состояний, приводящих к появлению дефектов длинных трубчатых костей, с другой стороны, в ограниченном количестве методов лечения, способных в короткие сроки полноценно восстановить поврежденную кость. Травма или патологический процесс в длинных трубчатых костях, сопровождающиеся потерей значительного количества костной ткани, как правило, завершается формированием дефекта или ложного сустава, что, вероятно, связано с ограниченностью потенций естественной репаративной регенерации. Очевидно, что эта причина является основой неудачных исходов, встречающихся при оперативном лечении поврежденных трубчатых костей со значительными дефектами (при компрессионно-дистрахционном остеосинтезе, ауто- и аллотрансплантации) (Оноприенко Г.А., 1995; Барабаш Ю.А., 1997). Сложность некоторых методов лечения, таких как компрессионно-дистракционный остеосинтез или аутотрансплантация на сосудистой ножке, не позволяет широко использовать их в клинической практике.

Пролонгировать репаративную регенерацию костной ткани, которая является сложным многостадийным процессом, можно путем местного (в области дефекта кости) применения стимуляторов, к которым относится группа факторов роста (TGF-ß, IGF, a-FGF, b-FGF, PDGF, BMP1-15), постоянно присутствующих в костной ткани и участвующих в физиологической и репаративной регенерации (Mohan S, Baylink DJ, 1991; Solheim E, 1998). Факторы роста регулируют процессы дифференцировки стволовых полипотентных клеток костного мозга, пролиферации остеогенных клеток, ангиогенеза и минерализации костной ткани (Балаболкин М.И., 1998). Однако низкие концентрации этих полипептидов в костной ткани взрослых животных и человека не позволяют получать их в необходимом количестве для использования в травматологии и ортопедии (WozneyJN, 1988).

В тоже время, повышенное содержание факторов роста в фетальной костной ткани позволяет использовать ее в качестве стимулятора репаративной регенерации кости. Однако доступность фетальных тканей весьма ограничена. Ее близким аналогом по структурной организации является костная ткань новорожденных животных (НКТ). При этом получение последней не представляет серьезных проблем. В связи с этим использование НКТ для стимуляции репаративной регенерации перспективно.

До настоящего времени незрелая костная ткань новорожденных животных не исследовалась и не использовалась в качестве стимулятора репаративной регенерации. Применение ее отмечено в единичных случаях и то только в деминерализованной форме в экспериментах для оценки остеоиндуктивности ДКМ от доноров разного возраста (Wang JS, Aspenberg Р, 1994; Lind M, 1996).

Анализируя современные литературные данные, можно сделать вывод, что другим материалом, сочетающим высокую стимуляционную активность и структурную организацию, способствующую созданию местных условий для

репаративной регенерации, является деминерализованный костный матрикс (ДКМ) (Савельев В.И., 1996; Solheim Е, 1998; Russell JL, Block JE, 1999). ДКМ, состоящий, в основном, из костного коллагена и небольшого количества водорастворимых белков (часть из которых является стимуляторами остеогенеза), полностью утилизируется как при помещении в область костного повреждения, так и при эктопической трансплантации, стимулируя при этом остеогенез (Urist MR, 1965; Urist MR et all, 1967; Harakas NK, 1984; Sampath TK et all, 1984; Савельев В.И., 1996). Его волокнистая структура полностью соответствует структуре нативной кости, при этом ДКМ имеет более высокую пористость, что способствует быстрому врастанию сосудов при ангиогенезе и, в итоге, созреванию образующегося костного регенерата (Denner et all, 1991). Наличие этих качеств приближает ДКМ по эффективности воздействия на репаративную -регенерацию к аутотрансплантатам (Schwarz N et all, 1991; Rosen PS et all, 2000; Goldberg VM, 2000).

Так, например, ДКМ длительное время применяется в измельченном виде, в виде стружки и массивных фрагментов в экспериментальных целях и в клинике при различных повреждениях костей, сопровождающихся потерей костной ткани (Russell JL, Block JE, 1999). Однако применение ДКМ в качестве трансплантата сводится к заполнению всего дефекта в поврежденных костях. Восстановление поврежденных длинных трубчатых костей со значительными дефектами, в этом случае, затягивается в связи с утилизацией трансплантата в месте образования регенерата и длительностью его последующего ремоделирования в полноценную кость. Исследований, посвященных возможности влияния формы трансплантата из ДКМ и способа установки его в костном дефекте на скорость и качество репаративной регенерации, в настоящее время в доступной литературе не обнаружено.

Таким образом, деминерализованный костный матрикс и незрелая нативная костная ткань могут быть использованы в качестве трансплантатов при значительных дефектах поврежденных длинных трубчатых костей, так как

они обладают свойствами остеоиндуктивности и способностью стимуляции остеогенеза.

В связи с этим целью исследования являлось изучение влияния фрагментированной нативной незрелой костной ткани новорожденных животных и трубчатого перфорированного имплантата из деминерализованной компактной кости взрослых животных на репаративную регенерацию кости.

Задачи исследования:

1. Разработка приборного и технического обеспечения для изготовления имплантатов из выбранного материала.

2. Создание экспериментальной модели имплантата из деминерализованного костного матрикса.

3. Изучение динамики формирования костных регенератов при помещении разработанных имплантатов из деминерализованной компактной костной ткани в костные дефекты длинных трубчатых костей экспериментальных животных.

4. Изучение динамики формирования костных регенератов при помещении углеродных трубчатых перфорированных имплантатов в костные дефекты длинных трубчатых костей экспериментальных животных.

5. Изучение динамики формирования костных регенератов при помещении фрагментированной нативной незрелой костной ткани в костные дефекты длинных трубчатых костей экспериментальных животных.

Новизна предлагаемого решения проблемы полноценного восстановления поврежденных трубчатых костей заключена: в форме предлагаемого имплантата из деминерализованного костного матрикса в виде полого цилиндра с перфорированными стенками и в способе его установки; форма, материал и способ имплантации создают условия для образования продольно

ориентированной компактной кости между свободными кортикальными частями дистального и проксимального костных отломков, а также восстановление целостности костного мозга в области дефекта и его интеграцию с костным мозгом всей кости; структура костного имплантата, имеющая многоуровневую, широко разветвленную систему каналов, предполагает возможность свободной микроциркуляции тканевой жидкости и миграции предшественников костных клеток в зону остеогенеза; в использовании фрагментированной нативной костной ткани новорожденных животных для стимуляции репаративной регенерации кости при значительных дефектах.

Практическая значимость работы заключается в разработке имплантатов с оптимальными параметрами, способных в клинической практике сократить сроки лечения и уменьшить количество осложнений при лечении больных со значительными дефектами поврежденных длинных трубчатых костей.

Положения, выносимые на защиту.

1. При помещении в дефект длинных трубчатых костей кролика фрагментированной незрелой костной ткани происходит заполнение всего дефекта волокнистой соединительной тканью, замещение ее ретикулофиброзной костной тканью и последующее ремоделирование регенерата в пластинчатую костную ткань с формированием полноценной кости в течение 6 месяцев. Фрагменты незрелой костной ткани (ФНКТ), распределенные в костном дефекте, не являются центрами остеогенеза.

2. Поврежденные длинные трубчатые кости кролика со значительными дефектами при помещении в них трубчатого перфорированного имплантата из деминерализованного костного матрикса восстанавливаются в течение 4 месяцев путем формирования органоспецифичного костного регенерата на поверхности имплантата, между кортикальными пластинками проксимального и дистального костных отломков.

3. Длинные трубчатые кости кролика при значительных дефектах (1 см средней части диафиза) самостоятельно не восстанавливаются. При этом из проксимального и дистального костных отломков формируются отдельные структурно и функционально неполноценные кости. Имплантат из углерода не обеспечивает полноценного восстановления поврежденной кости, в то же время не вызывает реакцию отторжения со стороны окружающих тканей и не препятствует костеобразованию.

Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ: пять статей, девять тезисов докладов, получены патенты на «Способ замещения дефекта длинной кости» и «Способ пластики дефекта кости». Материалы доложены: на 5-ом съезде Европейского общества тканевой репарации, Падуя, Италия, 1995; 20-ом Всемирном Конгрессе SICOT, Амстердам, 1996; XV съезде FECT, Мюнхен, 1996; 6 съезде травматологов и ортопедов России, Н. Новгород, 1997; Конгрессе травматологов и ортопедов России с международным участием, Ярославль, 1999; симпозиуме по проблемам тканевых банков с международным участием, Москва, 2001; научно-практической конференции посвященной 80-летию ЦИТО им. Н.Н.Приорова, Москва, 2001; ежегодных научно-практических конференциях НИЦ БМТ (ВИЛАР) в 1997, 1998, 2001 годах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 136 страницах, из них 95 страниц - собственно текст. Содержит 41 рисунок.

Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы (43 отечественных и 59 иностранных источников).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Оборудование и материалы

Для изготовления трубчатых перфорированных деминерализованных имплантатов и фрагментированной незрелой костной ткани использовались

диафизы длинных трубчатых костей крупного рогатого скота в возрасте 1 года и новорожденных свиней. Механическая обработка компактной костной ткани производилась с помощью специального оборудования: станки с охлаждением рабочей области проточной водой УОК-2 и УРК-1, высокоскоростной микроэлектродрели с плавной регулировкой скорости вращения вала, с набором сверл от 0,35 до 2,5 мм и алмазных фрез, измельчающей установки ножевого типа. Углеродные имплантаты для группы сравнения изготавливались из углеродной трубки диаметром 2,5 мм.

Имплантаты биологического происхождения подвергались лнофилизапии на установке LZ-9.1 производства Чехии.

Радиационная стерилизация всех видов имплантируемых материалов проводилась на гамма-установке Кобальт-60.

Для морфологического исследования использовались световые микроскопы Carl Zeiss "JENALUMAR" (Германия) и электронный сканирующий микроскоп СЭМ S-800 Hitachi (Япония), компьютерный видеокомплекс для денситометрии и количественной . обработки морфологических данных по программам "CITO" и "Color" (DiaMorph), рентгенологический контроль проводился на серийном рентгеновском аппарате 12П6.

Методика изготовления трубчатых перфорированных имплантатов из деминерализованного костного матрикса (ДТПИ)

Фрагменты кортикальной части нативной кости перед механической обработкой тщательно очищалась от мягких тканей, остатков костного мозга, отмывались в проточной воде, обезжиривались в эфире и спирте. С помощью станков УОК-2 и УРК-1 и высокоскоростной дрели из кортикальной части изготовлялись имплантаты трубчатой формы размерами 25x2,5 мм с микроперфорациями диаметром 0,35 мм. Все этапы механической обработки проводились с постоянным охлаждением проточной водой.

Затем проводилась деминерализация заготовок по методике Савельева В.И. (1983). Заготовки помещали в раствор соляной кислоты 1,2 н. Сроки деминерализации не превышали 4-5 суток при температуре 5 - 7°С. После удаления остатков кислоты следовала лиофилизация, упаковка в стерильную тару и стерилизация.

Методика изготовления углеродных трубчатых перфорированных имплантатов (УТПИ).

Материалом для изготовления углеродного трубчатого перфорированного имплантата служили отрезки плетеного шнура из химически чистого углерода. Диаметр шнура составлял 2,5 мм, толщина стенки 0,5 - 0,7 мм. Так как текстура исходного шнура не обеспечивала сохранение трубчатой формы при имплантации в дефект лучевой кости кролика, было произведено упрочнение его структуры, путем армирования атомарным пироуглеродом, т.е. осаждением атомарного углерода в промежутках между нитями углеродного шнура и образованием поперечных «сшивок», за счет чего обеспечивается жесткость его фибриллярной конструкции. Затем с помощью микроэлектродрели нанесены перфорации диаметром 0,25 мм по всей поверхности углеродной трубки (примерно по 4 отверстия на 1 мм2). Углеродные трубки разделены на отрезки по 20 мм алмазной фрезой, закрепленной в цанговом зажиме микроэлектродрели.

Методика изготовления фрагментированных имплантатов из незрелой костной ткани новорожденных животных (ФНКТ)

Диафизы бедренных костей новорожденных животных (свиней) тщательно очищались от мягких тканей, промывались в проточной воде и помещались в физиологический раствор. Затем замораживались до -70°С. В замороженном состоянии проводилось измельчение на ножевой установке. Учитывая

высокую степень заморозки костной ткани новорожденных животных и большую скорость работы измельчающей установки, температура в рабочей зоне измельчающих ножей не превышала 10 - 15°С.

Полученная измельченная кость лиофилизироваласъ, последовательно просеивалась до получения фракции с размером частиц от 0,2 до 0,7 мм. Б.экв., упаковывалась в стерильную тару.

Экспериментальные группы

В эксперименте были использованы 4 группы половозрелых кроликов породы шиншилла по 16 животных в каждой группе, возрастом 1 год, весом около 3,0 кг. У всех кроликов была произведена резекция 1см. центральной части диафиза лучевой кости с помощью алмазной фрезы, закрепленной в зажиме микроэлектродрели.

В первой группе кроликов (контрольной) костный дефект оставался свободным.

Во второй группе — в созданный дефект лучевой кости помещалась лиофилизированная фрагментированная незрелая костная ткань в количестве, равном по весу удаленной части лучевой.

В третьей группе - кроликам в дефект лучевой кости помещали деминерализованный трубчатый перфорированный имплантат. При помещении имплантата в дефект производилась корректировка (подгонка) его размера по месту дефекта лучевой кости. Концевые участки имплантатов длиной по 5мм вводились в костномозговые каналы дистального и проксимального костных отломков.

В четвертой группе - экспериментальным животным в созданный дефект лучевой кости помещался углеродный трубчатый перфорированный имплантат, концевые участки которого также вводились на 5 мм в костномозговые каналы дистального и проксимального отломков лучевой кости.

В течение эксперимента проводился ежедневный визуальный контроль области операции и общего состояния кроликов. Рентгенологический контроль оперированных конечностей кроликов проводился через 2, 4, 8, и 16 недель от момента операции. Животные выводились из эксперимента, согласно приказу МЗ СССР №755 от 12 августа 1977г, передозировкой тиопентала по 4 кролика в каждой группе через 2, 4, 8, 16 недель от момента операции. Оперированные конечности отсекали и фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 7 дней. После деминерализации в азотной кислоте проводили повторную фиксацию в 10% нейтральном формалине. Далее следовало обезвоживание в этиловом спирте возрастающей концентрации и эфире, заливка образцов в целлоидин. Полученные с помощью микротома срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону и исследовали с помощью световой микроскопии. Для морфологического исследования использовались световые микроскопы Carl Zeiss "JENALUMAR" и компьютерный видеокомплекс для обработки морфологических данных по программам "CITO" и "Color" (DiaMorph). Некоторая часть исходных материалов и имплантатов исследовалась с помощью электронного сканирующего микроскопа СЭМ S-800 Hitachi, Япония.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Динамика костной регенерации в области костного дефекта

Через 2 недели после операции при гистологическом исследовании установлено, что костный дефект заполнен различными видами соединительной ткани. У краев дистального и проксимального костных отломков и на поверхности локтевой кости, граничащей с костным дефектом, обнаруживаются костные регенераты в виде губчатой кости, лишь частично заполняющими костный дефект. При этом костномозговой канал не закрыт регенератом. На рентгенограммах в области дефекта лучевой кости

дополнительных теней не определяется. На концах костных отломков видны легкие тени периостальных регенератов. Локтевая кость не изменена.

Через 4 недели после операции большая часть дефекта лучевой кости заполнена плотной и рыхлой неоформленной волокнистой соединительной тканью. У концов костных отломков сформированы костные регенераты в виде губчатой кости. Они имеют периостальное или эндостальное происхождение. Наряду с периостальными и эндостальными регенератами наблюдается, выраженная в разной степени, очаговая резорбция кортикальной части костных отломков, вблизи костных дефектов. Внутренняя кортикальная часть локтевой кости, обращенная к дефекту лучевой кости, также подвержена двум видам изменений противоположного характера: периостальному костеобразованию и резорбции вокруг сосудов. Костномозговой канал заполнен костным мозгом. На отдельных препаратах наблюдается образование и слияние периостальных и эндостальных регенератов на костных отломках, при этом закрывается костномозговой канал, и на конце костного отломка формируется своеобразная "культя". На рентгенограммах в области дефекта лучевой кости отмечается наличие выраженных периостальных регенератов, замыкающих концы костных отломков. Регенераты у костных отломков лишь частично заполняют костный дефект, не достигая друг друга.

Через 8 недель после операции костномозговые каналы дистального и проксимального костных отломков закрыты регенератами в виде замыкательных пластинок. Костный дефект в большей части заполнен рыхлой и плотной соединительной тканью, а также мышечными волокнами и жировой тканью. Глубокую часть дефекта занимает периостальный костный регенерат, образовавшийся на внутреннем ксртикале локтевой кости. Костномозговые каналы костных отломков и локтевой кости заполнены костным мозгом. На рентгенограммах к этому сроку на концах отломков лучевой кости определяются периостальные регенераты, полностью

закрывающие костномозговые каналы. Дефект заполнен этими регенератами приблизительно на одну треть.

Через 16 недель после операции костные отломки закрыты замыкательными пластинками. Пластинки представлены зрелой компактной костной тканью, костные каналы и проходящие в них сосуды не имеют преимущественной ориентации. Большая часть дефекта сохранена и заполнена жировой тканью, ретикулярной плотной и рыхлой неоформленной соединительной тканью, мышечной тканью. Как в регенератах, так и в остальных кортикальных частях локтевой и лучевой костей отсутствуют периваскулярные зоны (очаги) резорбции. На рентгенограммах в области дефекта лучевой кости определяются замыкательные пластинки на концах отломков. Дефект остается незаполненным. Кортикальная часть локтевой кости, прилегающая к дефекту, утолщена.

Таким образом, поврежденная лучевая кость кролика с диафизарным дефектом в 1 см самостоятельно полностью не восстанавливается после завершения репаративного процесса. Костные регенераты из компактной костной ткани, сформированные у концов костных отломков в виде замыкательных пластинок, закрывают костномозговые каналы, образуя «замкнутый кортикал», который частично заполняет дефект. Проксимальный и дистальный костные отломки становятся самостоятельными неполноценными костями, разделенными и одновременно связанными различными видами соединительной ткани, заполняющими оставшийся промежуток между костными отломками.

Имплантация в дефект лучевой кости кролика фрагментированной незрелой костной ткани (ФНКТ)

Через 2 недели после имплантации ФНКТ в костный дефект при гистологическом исследовании установлено, что пространство между проксимальным и дистальным костными отломками заполнено различными

видами соединительной ткани. Костномозговые каналы отломков частично или полностью закрыты волокнистой соединительной тканью. С внешней стороны этот волокнисто-клеточный конгломерат покрыт плотной оформленной соединительной тканью. Костно-хрящевые регенератк сформировались к этому сроку у периоста и эндоста костных отломков, а также на поверхности локтевой кости, граничащей с областью дефекта. В кортикальных пластинках костных отломков встречаются расширенные центральные каналы, или очаги периваскулярной резорбции, сосуды с агрегированными эритроцитами. Через 2 недели после имплантации ФНКТ в области дефекта лучевой кости на рентгенограммах сохраняется слабоконтрастная тень.

Через 4 недели после имплантации ФНКТ в костный дефект место костного дефекта заполнено различными разновидностями соединительной ткани. Значительная часть представлена костно-хрящевым регенератом, берущим свое начало от периоста костных отломков. Его костная часть состоит из первичной губчатой (ретикулофиброзной) костной ткани, а хрящевая представлена хондроцитами, разделенными небольшим количеством хрящевого межклеточного матрикса. Отмечены признаки минерализации костной части регенерата. Костно-хрящевой регенерат соединяет проксимальный и дистальный костные отломки, восстанавливая, таким образом, непрерывность поврежденной кости. В костных отломках, вблизи дефекта, наблюдается периваскулярная резорбция. На поверхности локтевой кости, обращенной к лучевой, обнаружен слой периостального регенерата как на уровне дефекта лучевой кости, так и по обе стороны от него. На рентгенограммах через 4 недели в костных дефектах определяется слабоконтрастная тень, указывающая на образование регенерата и частичное заполнение им дефекта кости.

Через 8 недель после имплантации ФНКТ в костный дефект проксимальный и дистальный костные отломки поврежденной лучевой кости соединены костным регенератом. Восстановлена целостность поврежденной

кости, при этом костный регенерат не выходит за пределы анатомических границ кости. Регенерат построен частично из компактной и ретикулофиброзной костной ткани различной степени зрелости, не имеющей определенного преимущественного направления. Костномозговой канал отсутствует. В периостальном регенерате, обращенном к локтевой кости, видны полости резорбции вокруг сосудов. Часть ранее образовавшихся полостей резорбции заполнена новообразованной костью. Через 8 недель на рентгенограммах тень регенерата становится более интенсивной, занимая весь дефект. В ней отмечаются контуры кортикальной пластинки.

Через 16 недель после имплантации ФНКТ в дефект лучевой кости центральная часть регенерата полностью состоит из компактной костной ткани, а его периферические части ремоделированы в трубчатую кость и консолидированы с проксимальными и дистальными костными отломками. Пространство между новообразованными кортикальными пластинками заполнено костным мозгом и является продолжением костномозгового канала костных отломков. В кортикальной пластинке локтевой кости происходит полное восстановление структуры кости в очагах резорбции. Через 16 недель после операции на рентгенограммах тень регенерата заполняет весь дефект, имея более высокую плотность в его центральной части.

Через 24 недели после имплантации ФНКТ в костный дефект полноценная структура поврежденной трубчатой кости восстановлена. Граница перехода новообразованной компактной костной ткани в костную ткань отломков не определяется. Полностью восстановлен костномозговой канал. Через 24 недели после операции, при рентгенологическом исследовании, регенерат заполняет весь дефект, костномозговой канал прослеживается на всем протяжении лучевой кости.

Таким образом, репаративная регенерация поврежденных длинных трубчатых костей со значительными дефектами при помещении в них фрагментированной незрелой костной ткани (ФНКТ) проходит многоэтапно:

1) заполнение дефекта рыхлой волокнистой соединительной тканью, окружающей фрагменты НКТ; 2) замещение волокнистой соединительной ткани хрящевой и ретикулофиброзной костной тканью, источником которой являются периост и эндост костных отломков лучевой кости и периост локтевой кости; 3) резорбция первичного костного регенерата, и образование на его месте регенерата из компактной костной ткани в виде конгломерата, заполняющего весь костный дефект; 4) ремоделирование конгломерата из компактной костной ткани в органоспецифичную трубчатую кость. Кортикальные пластинки костных отломков лучевой кости и неповрежденной локтевой кости, подвергшиеся очаговой резорбции в период формирования первичного костного регенерата, восстанавливаются.

Имплантация трубчатой перфорированной матрицы из деминерализованного костного матрикса в дефект лучевой кости

При гистологическом исследовании через 1 день после помещения трубчатой перфорированной матрицы в костный дефект установлено, что перфорированная трубчатая матрица находится в костном дефекте, а ее концевые отделы — в костномозговом канале дистального и проксимального костных отломков. На рентгенограммах имплантат в дефекте не определяется.

Через 14 дней после помещения в костный дефект трубчатого перфорированного имплантата последний занимает большую часть дефекта, а его концы находятся в костномозговом канале костных отломков. В области дефекта имплантат окружен слоем вновь образованного костного мозга. Слой плотной оформленной соединительной ткани соединяет периостальные костно-хрящевые регенераты, образовавшиеся на наружной поверхности костных отломков, недалеко от их краев. На границе новообразованного костного мозга и плотной соединительной ткани встречаются очаги регенерации в виде «свободных» костных регенератов,

построенных из губчатой ретикулофиброзной костной ткани. На рентгенограммах определяется наличие слабоконтрастной тени периостальных регенератов на концах костных отломков. Имплантат в дефекте не виден.

Через 4 недели после помещения в костный дефект трубчатого перфорированного имплантата гистологически обнаружено, что дефект лучевой кости заполнен новообразованным костным регенератом, центральная часть которого имеет выраженное губчатое строение. В периферических частях регенерата, вблизи костных отломков, в костномозговом канале имеются остатки имплантата. Остальное пространство заполнено костным мозгом. Внутренняя кортикальная часть локтевой кости, находящаяся рядом с дефектом, заполненным регенератом, утолщена и спонгизирована, т.е. подвержена очаговой резорбции вокруг сосудов в центральных каналах. Наружная кортикальная часть локтевой кости интактна. На рентгенограммах в области дефекта лучевой кости определяется тень регенерата, соединяющая отломки и имеющая большую плотность в периферических отделах.

Через 8 недель после помещения в костный дефект трубчатого перфорированного имплантата при гистологическом исследовании обнаружено, что кортикальные части дистального и проксимального костных отломков соединены регенератом из компактной костной ткани. Ее пластинчатая структурная организация менее упорядочена, чем в неизмененной кости. В регенерате отсутствует преимущественная ориентация центральных каналов и остеонов. У большинства животных в значительной степени восстановлен костномозговой канал, который заполнен костным мозгом. На рентгенограммах определяется тень регенерата, по плотности сравнимая с плотностью неповрежденной локтевой кости и отломками лучевой. Виден формирующийся костномозговой канал, имеющий неоднородную плотность.

Через 16 недель после помещения в костный дефект трубчатого перфорированного имплантата гистологически определяется полное структурное восстановление поврежденной кости. Новообразованная кортикальная часть, без видимых границ, переходит в кортикал костных отломков. Межкостный промежуток заполнен плотной оформленной соединительной и мышечной тканью. На рентгенограммах определяется полное восстановление поврежденной лучевой кости, локтевая кость - без видимых изменений. Костномозговой канал сформирован полностью.

Таким образом, репаративная регенерация поврежденных длинных трубчатых костей со значительными дефектами при помещении в них трубчатых перфорированных имплантатов из деминерализованного костного матрикса происходит многоэтапно: 1) формирование регенерата из хрящевой и ретикулофиброзной костной ткани между кортикальными пластинками костных отломков на поверхности имплантата и его последующее ремоделирование в органоспецифичную компактную костную ткань, образующую кортикальную костную пластинку, восстанавливающую целостность поврежденной кости; 2) резорбция и замещение имплантата ретикулофиброзной костной тканью; 3) резорбция ретикулофиброзной костной ткани и образование костномозгового канала с последующим заполнением его новообразованным костным мозгом. Источником костной регенерации является периост и эндост костных отломков, периост локтевой кости, обращенной в дефект лучевой кости, а также новообразованный костный мозг, окружающий имплантат на начальной стадии регенерации.

Динамика формирования костного регенерата при помещении углеродного трубчатого перфорированного имплантата (УТПИ) в

костный дефект

Через 16 недель после имплантации поврежденная кость в присутствии УТПИ полностью не восстановлена. По состоянию костной и других

разновидностей соединительной ткани, установленному при гистологическом исследовании, можно констатировать завершение процесса регенерации. Сохранившийся дефект наружного кортикала заполнен плотной оформленной и рыхлой неоформленной соединительной тканью. Образовавшиеся регенераты периостального происхождения у костных отломков наружных кортикалов лишь частично закрывают углеродную матрицу. В некоторых случаях один из концов матрицы выходит из костномозгового канала костного отломка, в связи с чем последний закрывается замыкательной пластинкой. Отдельные фрагменты углеродной матрицы могут быть полностью замурованы костной тканью без прослоек соединительной ткани между углеродными нитями и новообразованной костью. Это указывает на индифферентность углеродного материала: помещение в значительный дефект длинной трубчатой кости кролика углеродного трубчатого перфорированного имплантата не приводит к восстановлению поврежденной кости, но при этом не вызывает реакцию отторжения со стороны окружающих тканей и не препятствует процессу костеобразования.

Таким образом, анализ результатов собственных исследований и литературных данных показывает, что при определенном (значительном) размере дефекта длинной трубчатой кости восстановление ее полноценной структуры не происходит, хотя репаративная регенерация имеет место.

Следовательно, восстановление полноценной в структурном и функциональном отношении кости при ее значительных дефектах возможно только при дополнительном вмешательстве в процесс заживления кости. Одним из факторов, активирующих предшественники остеогенных клеток в периосте и эндосте, являются продукты распада поврежденной костной ткани. Интенсивность и длительность стимуляции предшественников остеогенных клеток продуктами распада костной ткани зависит от площади поврежденной костной поверхности. Исходя из вышеуказанного, в проведенном исследовании в качестве пролонгированного стимулятора

репаративной регенерации использовалась незрелая костная ткань, измельченная до размеров фрагментов 200 - 700 мкм. Фрагменты НКТ, распределенные в дефекте, окружались рыхлой неоформленной соединительной тканью. Сами частицы не являлись центрами остеогенеза, но их присутствие и постепенная деградация или резорбция, очевидно, служили источниками продуктов распада, которые могли являться активаторами предшественников остеогенных клеток, находящихся в периосте и эндосте. Через месяц фрагменты НКТ оставались в костном дефекте, окруженные клеточно-волокнистой рыхлой соединительной тканью. При этом наблюдалась их частичная резорбция. Вокруг частиц отсутствовали остеокласты, что указывало на неклеточную природу резорбции. Вероятно, распад костных частиц происходит за счет определенных физико-химических параметров окружающей среды, которая создается соединительнотканными клетками, плотно окружающими фрагменты НКТ.

К двум месяцам после операции в костных дефектах остаются лишь единичные фрагменты НКТ с признаками глубокой резорбции. Дефекты к этому времени заполнены костными регенератами, построенными из ретикулофиброзной и компактной костной ткани. Кроме этого, за пределами регенерата и, соответственно, бывшего костного дефекта, у некоторых животных встречались фрагменты НКТ, окруженные плотной соединительной тканью. Вероятно, их распад уже существенно не влиял на процесс регенерации. Очевидно, восстановление структурной целостности поврежденной кости, т.е. ее замкнутой системы, также влиял на течение репаративной регенерации. К шести месяцам со времени операции происходило восстановление кортикальных пластинок, построенных из компактной костной ткани с преимущественной продольной ориентацией остеонов костных пластинок и сосудов. Восстанавливался также костномозговой канал и костный мозг. Полученный результат подтверждает предположение о причастности продуктов распада поврежденной кости к активации репаративного остеогенеза. Более того, определенное значение в

этом имеет степень зрелости или, точнее, незрелости костной ткани, используемой для имплантации в костный дефект. Так, полученные ранее данные указывают на низкую остеоиндуктивную способность зрелой фрагментированной костной ткани, по сравнению с ФНКТ. Наиболее вероятной причиной этого может быть состояние органической и неорганической фаз костной ткани. Очевидно, что незрелый костный коллаген и аморфный фосфат кальция быстрее подвергаются деградации, чем зрелый коллаген (содержащий большое количество внутримолекулярных поперечных связей) и кристаллический гидрооксиаппатит. Следует обратить внимание и на размер костных фрагментов. Уменьшение размера частиц приводит к увеличению их общей площади контакта с окружающей средой и, соответственно, увеличению скорости их распада или резорбции. Однако уменьшение размеров частиц ниже используемого в работе диапазона приводило к их слишком быстрой резорбции, что сокращало время стимуляции. Более значительный размер частиц не вызывал необходимого активирующего действия на камбиальные элементы периоста и эндоста, вероятно, из-за уменьшения площади резорбируемых фрагментов.

Использование ксено - ФНКТ в клинической травматологии и ортопедии вполне допустимо, с соблюдением правил, установленных для костных банков. Размер фрагментов должен быть определен, в значительной степени, опытным путем. Наиболее целесообразно использовать ФНКТ для заполнения костных дефектов, при которых не требуется восстановления органоспецифической костной анатомии.

Возможность управления формообразованием формирующегося костного регенерата в дефекте длинной трубчатой кости реализована в настоящей работе с помощью трубчатого перфорированного имплантата из деминерализованной компактной костной ткани. Имплантат, помещенный в костный дефект, служит опорной поверхностью для образующегося костного регенерата между кортикальными пластинками дистального и проксимального костных отломков. Имплантат не закрывает это

пространство, а также сохраняется сообщение между костномозговыми каналами костных отломков через канал имплантата. В него мигрируют клетки костного мозга и через перфорации перемещаются на поверхность имплантата. В результате этого на поверхности имплантата формируется костный мозг, обеспечивая среду и клеточных предшественников для образования свободных костных регенератов и развития периостальных регенератов.

Здесь в полной мере проявляется остеокондуктивное свойство трубчатого имплантата. В то же время, обладая выраженными остеоиндуктивными свойствами, ДКМ пролонгирует регенераторный процесс. Кроме этого, в состав нативной кости входит целая группа факторов роста, которые проявляют себя после деминерализации. Сочетание остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств, а также определенной формы обеспечивает формирование регенерата сразу между кортикальными пластинками костных отломков. В то же время имплантат изолирует центральную часть дефекта от проникновения периостального регенерата.

Стенки трубчатого имплантата постепенно резорбируются, и на их месте образуется губчатая ретикулофиброзная костная ткань, которая в дальнейшем также подвергается резорбции, без замещения компактной костной тканью. Таким образом, исключается заполнение всего дефекта компактной костной тканью с последующей резорбцией ее в центральной части регенерата с образованием костномозгового канала. Это ведет к сокращению времени восстановления полноценной трубчатой кости в области ее значительного дефекта.

Так же, как и в эксперименте с ФНКТ, результаты исследования трубчатого перфорированного имплантата из деминерализованного костного матрикса могут быть перенесены в клиническую практику, с соответствующей адаптацией имплантата применительно к человеку.

ВЫВОДЫ

1. Поврежденные длинные трубчатые кости кролика при значительных дефектах (1 см средней части диафиза) самостоятельно полностью не восстанавливаются. При этом из проксимального и дистального костных отломков формируются отдельные структурно и функционально неполноценные кости.

2. Восстановление поврежденных длинных трубчатых костей со значительными дефектами при помещении в них фрагментированной незрелой костной ткани происходит многоэтапно: путем заполнения дефекта волокнистой соединительной тканью, замещения ее ретикулофиброзной костной тканью и последующего ремоделирования в пластинчатую (остеонную) костную ткань с формированием полноценной кости в течение б месяцев.

3. Фрагменты незрелой костной ткани (ФНКТ), распределенные в костном дефекте, не являются центрами остеогенеза. Вокруг фрагментов НКТ образуется волокнистая соединительная ткань, создающая основу для пролиферации и дифференциации остеогенных клеток периоста и эндоста.

4. Полноценное восстановление поврежденных длинных трубчатых костей со значительными дефектами при помещении в них трубчатого перфорированного имплантата из деминерализованного костного матрикса происходит в течение 4 месяцев путем формирования органоспецифичного костного регенерата на поверхности имплантата между кортикальными пластинками проксимального и дистального костных отломков. Имплантат в процессе регенерации замещается губчатой ретикулофиброзной костной тканью с ее последующей резорбцией и формированием костномозгового канала и костного мозга.

5. Перфорированный трубчатый имплантат из инертного материала -углерода, - помещенный в костный дефект, не обеспечивает

полноценного восстановления поврежденной кости, в то же время не вызывает реакцию отторжения со стороны окружающих тканей и не препятствует костеобразованию. б. Формирование первичного костного регенерата из ретикулофиброзной костной ткани на костных отломках лучевой кости и кортикальной части локтевой кости сопровождается очаговой периваскулярной резорбцией вышеуказанных костных частей с последующим восстановлением резорбируемых участков в процессе ремоделирования первичного регенерата в органоспецифичную кость при всех исследованных условиях течения репаративной регенерации.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Использование деминерализованного костного матрикса для восстановления повреждений трубчатых костей со значительными дефектами // Сб. тр. НПО Биомедицинские технологии. - М., 1997, вып. 6, С. 21-28 (соавт. Омельяненко Н.П., Шапошников Ю.Г. Базанова Э.Б. Матвейчук Н.В.)

2. Экспериментальное исследование формообразующей матрицы для замещения дефектов трубчатых костей // 6 съезд травматологов и ортопедов России, тез. докл., Н.Новгород, 1997, С. 434. (соавт. Омельяненко Н.П., Базанова Э.Б., Шапошников Ю.Г., Дорохин А.И., Матвейчук И.В.).

3. Ультраструктурный анализ дистракционных костных регенератов в эксперименте // Сб. науч. тр. НПО Биомедицинские технологии. - М., 1998, вып. 10, С. 11-15. (соавт. Омельяненко Н.П., Михайлова Л.Н.).

4. Способ замещения дефекта длинной кости // Патент № 2121815. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 20 ноября 1998 г. (соавт. Ю.Г. ШапошниковЭ.Б., Базанова А.И., Дорохин И.В., Матвейчук И.В.).

5. Использование формообразующего деминерализованного костного имплантата при дефектах длинных трубчатых костей // Мат. Конгр. травматологов-ортопедов России с международным участием «Новые имплантаты и технологии в травматологии и ортопедии», Ярославль,

1999. С.45. (соавт. Омельяненко Н.П., Базанова Э.Б., Дорохин А.И., Матвейчук И.В.).

6. Исследование влияния эмбриональной костной ткани на репаративную регенерацию кости // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Т.130, №10, 2000. С.469-474 (соавт. Омельяненко Н.П., Малахов О.А., Сухих Г.Т., Кожевников О.В., Петров И.А.).

7. Изучение воздействия имплантации эмбриональной костной ткани на репаративный остеогенез // Сборник тезисов «Биоимплантология на пороге XXI века». - М., 2001. С.47. (соавт. Малахов О.А., Омельяненко Н.П., Сухих Г.Т., Кожевников О.В.).

8. Клинико-экспериментальное обоснование использования новых костных имплантатов при лечении тяжелых последствий травм у детей // Сб. тез. «Биоимплантология на пороге XXI века». Москва, 2001. С.70. (соавт. Дорохин А.И., Меркулов В.Н., Омельяненко Н.П., Стужина В.Т.).

9. Фундаментальные исследования тканей опорно-двигательного аппарата // Мат. научной конференции посвященной 80-летию ЦИТО им. Н.Н.Приорова, «Современные проблемы травматологии и ортопедии». - М., 2001. С. 16-20. (соавт. Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Троценко В.В., Малахов О.А., Ильина В.К., Орлецкий А.К., Снетков И.В., Матвейчук И.В., Гаврюшенко Н.С., Шальнев А.Н., Кондратьева И.Е., Родионова С.С.).

10.Использование деминерализованного костного матрикса для восстановления поврежденных длинных костей со значительными дефектами // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. М., 2001, № 1, С. 53-56. (соавт. Омельяненко Н.П., Матвейчук И.В., Дорохин А.И.).

11.Возможности использования костного матрикса для стимуляции репаративного остеогенеза // Сб. тр. НПО Биомедицинские технологии. - М., 2001, вып. 17, С. 12-17. (соавт. Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Троценко В.В., Малахов О.А., Дорохин А.И., Матвейчук И.В.).

12.Способ пластики дефекта кости // Патент № 2171648. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 августа 2001 г. (соавт. Омельяненко Н.П., Малахов О.А., Кожевников О.В., Петров И.А.).

13.Formation of capillaries in distraction regenerate during bone lengthening // 5th Annual Meeting of the European Tissue Rep Soc. Padova, Italy, 1995, P.28 (Omelianenko N.P., Mikhailova LN).

14.Restoration of injured bone by the shape forming matrix // 20th World Congr. SICOT, Amsterdam. - 1996, Abstract P2.371, P.631 (Omelianenko N.P., Shaposhnikov Yu.G, Bazanova E, Markov G, Matveichuk I).

15.Elaboration of the adequate matrix for the repair of vast injured bone defect // 20th World Congr. SICOT, Amsterdam, 1996, Abstract P2.367, P.630 (Omelianenko N.P., Bazanova E, Shaposhnikov Yu.G, Markov G, Matveichuk I).

16.Repair of injured bone by collagenic implant // XV FECT Meeting, Munich, 1996, Abstract KI4, (Omelianenko N.P., Shaposhnikov Yu.G, Bazanova E, Matveichuk I).