Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Интравитреальная антимикробная фотодинамическая терапия в комплексном лечении экспериментального эндофтальмита

Плахотний Михаил Алексеевич

ИНТРАВИТРЕАЛЬНАЯ АНТИМИКРОБНАЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО

ЭНДОФТАЛЬМИТА

14.01.07. - глазные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 ДПР 2011

Москва-2011

4842348

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждение «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Научный руководитель:

доктор медицинский наук, профессор Белый Юрий Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Захаров Валерий Дмитриевич

доктор медицинских наук, профессор Бойко Эрнест Витальевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Росздрава.

Защита состоится 2011 года в 14-00 часов на заседании

диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора медицинских наук Д.208.014.01 при Федеральном государственном учреждении «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (127486, Москва, Бескудниковский бульвар, 59А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Автореферат разослан

<¿2К 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Агафонова В.В.

Список сокращений

MRS А - метициллинрезистентный стафилококк а/б - антибиотики

АФДТ - антимикробная фотодинамическая терапия

ВСС - клетки внутреннего сетчатого слоя сетчатки

ИВО - интравитреальное облучение

КОЕ - колониеобразующие единицы

М/о - микроорганизмы

ОГ - оптикоганглионарные клетки

ГТФОС - перфторорганическое соединение

СБК - клетки слоя биполярных клеток сетчатки

УБМ - ультразвуковая биомикроскопия

ФДВ - фотодинамическое воздействие

ФДТ - фотодинамическая терапия

ФС - фотосенсибилизатор

ЦВС — центральная вена сетчатки

ЭРГ - электроретинография

ЭЭФ - экспериментальный эндофтальмит

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема лечения эндофтальмита обусловлена тяжестью инфекционных процессов, в большинстве случаев приводящих к потере зрительных функций, а порой и глаза как органа.

По данным литературы, развитие внутриглазной инфекции при проникающих ранениях глаза отмечается в 5-50%, а при хирургических вмешательствах на глазном яблоке в 0,02-0,5% случаев (Минц С.С., 1983, Федорищева Л.Е., 1993, Albert D.M., 2000, Alfaro D.V., 1997, Callegan М.С., 2002, Eifrig C.W., 2002, Roberts C.W., 2002, Taban M., 2005).

Одним из самых серьезных и опасных проявлений внутриглазной инфекции продолжает оставаться экзогенный эндофтальмит. Возбудителями эндофтальмита

iry

могут быть самые разнообразные патогенные микроорганизмы (Гундорова P.A., 1980, Майчук Ю.Ф., 1984, Al-Omran A.M., 2007, Anand A.R., 2000).

Существенный положительный сдвиг в лечении эндофтальмита произошел благодаря внедрению в клиническую практику комбинированной методики, включающей проведение витрэктомии, интраокулярной антибиотикотерапии и интравитреальной тампонады стекловидного тела различными заместителями (Федоров С.Н., 1984, Даниличев В.Ф., 2000, Южаков A.M., 1981; Гундорова P.A., 1986). Однако и в этих случаях не всегда удается купировать воспалительный процесс из-за невозможности определить возбудителя непосредственно в момент операции, что, соответственно, затрудняет правильный выбор антимикробного препарата (Davis J.L., 1988, Fridkin S.K., 2001, Das Т., 2001, Anand A.R., 2000).

В последнее время появились работы по использованию сильных окислителей в лечении воспалительных заболеваний глаза: озон, гипохлорит натрия, оксид азота, -которые обладают широким антисептическим спектром действия в отношении большинства микроорганизмов, ряда вирусов, грибков и простейших (Лапина И.М., 1996, Каторгина O.A., 2001, Юдина H.H., 2005, Мамиконян В.Р.2007, Brozou C.G., 2009). Однако предложенные средства воздействуют не только на белково-липидные плазматические мембраны микроорганизмов, но и на клеточные мембраны структур глаза, активируя перикисное окисление липидов, что приводит к токсическому воздействию на зрительный нерв и сетчатку.

В связи с вышеизложенным, поиск методов лечения эндофтальмита, обладающих максимально эффективным дозированным и направленным действием, сохраняет высокую актуальность и социальную значимость. На наш взгляд, этим требованиям отвечает методика фотодинамической терапии (ФДТ).

ФДТ - часть фотохимиотерапии, которая использует свойства препаратов-фотосенсибилизаторов (ФС) образовывать активные формы кислорода и другие радикалы под действием облучения (Черняева Е.Б., 1990, Решетников A.B., 2001, Пометун Е.В., 2004, Alexiades-Armenakas M.R., 2004). На сегодняшний день синтезировано несколько сотен химических соединений, способных выступать в роли ФС. ФС хлоринового ряда являются относительно новой группой, хорошо зарекомендовавшей себя в клинической практике (Каплан М.А., 2004, Demidova Т.,

2005), поскольку обладают высокой фотохимической активностью, быстрой элиминацией из организма (в течение 24-48 часов) и низкой общей фототоксичностью (LD50=140 мг/кг).

В последние десятилетия были достигнуты серьезные успехи в разработке методик антимикробной фотодинамической терапии (АФДТ) (Tang Н.М., 2007). В настоящее время наиболее широко антимикробное действие ФДТ используют в стоматологии и дерматологии (Толстых П.И., 2001, Ceburkov О., 2002, Alexiades-Armenakas M.R., 2004, Meisel P., 2005, Tang H.M., 2007).

В доступной нам литературе не найдены сведения об использовании ФДТ с интравитреальным введением ФС хлоринового ряда при лечении внутриглазных инфекционных заболеваний. В связи с этим нам представляется целесообразным изучить применение АФДТ с ФС хлоринового ряда в комплексном хирургическом лечении экспериментального эндофтальмита, которое включает в себя проведение витрэктомии, интравитреальное использование ФС «Фотодитазин» с последующим инравитреальным лазерным облучением соответствующей длины волны.

Цель исследования - разработать методику интравитреальной антимикробной фотодинамической терапии с отечественным фотосенсибилизатором «Фотодитазин» в комплексном хирургическом лечении экспериментального эндофтальмита и оценить ее эффективность в эксперименте.

В соответствии с поставленной целью задачи решались в следующей последовательности:

1. В эксперименте in vitro определить антимикробную активность различных концентраций «Фотодитазина».

2. В эксперименте in vitro определить зависимость антимикробного эффекта и чувствительность патогенной микрофлоры к антибиотикам от плотности лазерной энергии, используемой при АФДТ.

3. Разработать автоматизированную систему расчета параметров интравитреальной АФДТ.

4. В эксперименте in vivo изучить состояние внутриглазных структур после интравитреальной АФДТ с ФС «Фотодитазин».

5. В эксперименте in vivo провести анализ эффективности интравитреальной АФДТ с ФС «Фотодитазин» в комплексном лечении экзогенного бактериального эндофтальмита.

Научная новизна

В лабораторных условиях in vitro изучено влияние фотодинамического воздействия отечественного ФС хлоринового ряда «Фотодитазин» на патогенные микроорганизмы, а также подобраны концентрации препарата и параметры лазерного излучения при АФДТ, обладающие выраженным бактерицидным эффектом.

На основании характеристик витреальной полости глаз подопытных животных разработана автоматизированная система расчета параметров интравитреальной АФДТ.

В экспериментальных исследованиях in vivo определены безопасные для сетчатки и внутриглазных структур концентрации «Фотодитазина» и параметры интравитреальной АФДТ.

В экспериментальных исследованиях in vivo разработан метод комплексного хирургического лечения экспериментального бактериального эндофтальмита, включающий проведение витрэктомии с интравитреальной АФДТ и интравитреальной антибиотикотерапией.

В экспериментальных исследованиях in vivo проведен сравнительный анализ эффективности витрэктомии в сочетании с интравитреальной АФДТ с «Фотодитазином», интравитреальной антибиотикотерапией и без ант'ибиотикотерапии при лечении экспериментального экзогенного бактериального эндофтальмита.

Практическая значимость

Разработанный в эксперименте метод комплексного хирургического лечения экзогенного бактериального эндофтальмита, включающий витрэктомию в сочетании с интравитреальной АФДТ с «Фотодитазином» и интравитреальную антибиотикотерапию, позволяет уже в ранние сроки эффективно воздействовать на внутриглазную патогенную флору.

Проведение клинической апробации разработанного метода с последующим его внедрением в офтальмологическую практику позволит эффективно и быстро бороться с экзогенным бактериальным эндофтальмитом и, таким образом, улучшить качество медицинской реабилитации данного контингента больных.

Положения, выносимые на защиту

Экспериментально рассчитанные и обоснованные параметры интравитреальной АФДТ, включающие концентрацию ФС хлоринового ряда «Фотодитазин» 0,05 мг/мл и плотность энергии лазерного излучения инфракрасного диапазона 10 Дж/см2, обладают выраженным антимикробным действием на различную патогенную микрофлору и являются безопасными для сетчатки и других внутриглазных структур.

Проведение витрэктомии, интравитреальной АФДТ с интравитреальным введением «Фотодитазина» в сочетании с интравитреальной антибиотикотерапией является эффективным методом комплексного хирургического лечения экзогенного бактериального эндофтальмита.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Высокие технологии в офтальмологии» (г. Анапа,

2008); на научно-практической конференции в ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» (г. Москва, 2008); нанаучно-практической конференции, посвященной 70-летию заслуженного деятеля науки РФ и РБ, академика М.Т. Азнабаева (г. Уфа,

2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 научных работы, из них 5 в журналах рецензируемых ВАК РФ. Имеется один патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 32 рисунками, содержит 12 таблиц, 11 графиков. Указатель литературы включает 158 источников, из них 64 отечественных и 94 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Особенности воздействия различных параметров антимикробной фотодинамической терапии на патогенные микроорганизмы (экспериментальные исследования in vitro)

Первый этап экспериментальных исследований, проведенный in vitro, включал серию экспериментов, направленных на изучение особенностей воздействия различных параметров АФДТ на патогенные микроорганизмы: 1) определение минимального времени «темновой» инкубации культур патогенных микроорганизмов с раствором «Фотодитазина»; 2) оценку антимикробной активности АФДТ при использовании различных концентраций раствора «Фотодитазина» и плотности энергии лазерного излучения; 3) изучение влияния АФДТ на чувствительность патогенной флоры к антибиотикам.

В качестве объектов исследования использовались бульонные культуры грамположительных (St. aureus, Ent. faecium), грамотрицательных (P. aeruginosa) микробных, а также грибковых (С. albicans) клеток. Для приготовления микробной взвеси использовали стандарт мутности на 5 Единиц в соответствии с Международным ОСО 42.28.86.07П. В ходе экспериментов использовались десятикратные разведения культур на изотоническом растворе NaCl. Для выбора минимально необходимого времени темновой инкубации микроорганизмов с раствором «Фотодитазина» была проведена серия экспериментов in vitro. В лунки 96 луночного планшета (ТУ 64-2-278-79) вносилось по 0,1 мл взвеси микроорганизмов и 0,1 мл раствора «Фотодитазина» в концентрациях 5 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,005 мг/мл и 0,0005 мг/мл. После добавления «Фотодитазина» культуру инкубировали при температуре 37°С без доступа света, при этом время инкубации составляло от 0 до 40 минут. Затем производилось облучение культуры клеток диодным лазером (плотность энергии 30 Дж/см2, длина волны 662 нм) с помощью световода через отверстие 0 6 мм (площадью - 0,28 см2) в черном светонепроницаемом трафарете, соответствующем диаметру лунки. Далее 10 мкл от общего объема рабочей смеси высевали на селективные питательные среды. Проводилась инубация культур и подсчет КОЕ (колониеобразующих единиц). В

результате проведенных исследований было установлено, что АФДТ с «Фотодитазином» в концентрации от 5,0 мг/мл до 0,0005 мг/мл обладает бактериостатическим/бактерицидным действием. Причем оптимальный диапазон концентрации «Фотодитазина» находится в интервале от 5,0 мг/мл до 0,005 мг/мл. Минимальный срок инкубации изучаемых микроорганизмов с раствором ФС «Фотодитазин», необходимый для дальнейшего проведения АФДТ, составляет не менее 5 минут и зависит от концентрации ФС. При данном временном диапазоне «темновой» инкубации отмечено статистически подтвержденное уменьшение количества выживших микроорганизмов и проявление бактериостатического эффекта «Фотодитазина».

В следующей серии экспериментальных исследований изучалось влияние различных доз лазерного облучения и концентраций «Фотодитазина» на культуры микроорганизмов. Плотность энергии лазерного облучения составляла от 5 Дж/см2 до 30 Дж/см2 с интервалом 5 Дж/см2. При проведении экспериментов использованы десятикратные разведения раствора «Фотодитазина» в концентрации от 5 мг/мл до 0,005 мг/мл. Время «темновой» инкубации культуры микроорганизмов с раствором «Фотодитазина» составляло 5 минут. В результате проведенных исследований было установлено, что выраженной фотодинамической активностью обладают концентрации «Фотодитазина» 0,05 мг/мл и 0,5 мг/мл. При увеличении плотности энергии лазерного излучения увеличивается эффективность АФДТ по отношению ко всем исследованным микроорганизмам. Вместе с тем при использовании лазера в диапазоне от 5,0 Дж/см2 до 30 Дж/см2 бактерицидный эффект был получен только в отношении культуры St.aureus. В отношении других исследованных микроорганизмов определялся лишь бактериостатический эффект различной степени выраженности. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что применение только АФДТ с предложенными параметрами не может во всех случаях обеспечить полную гибель микроорганизмов, что указывает на целесообразность использования в ходе дальнейших экспериментальных исследований вариантов лечения экспериментального эндофтальмита с помощью АФДТ в сочетании с антибиотиками.

В следующей серии эксперимента было изучено влияние АФДТ на чувствительность к антибиотикам микроорганизма Ent. faecium, обладающего множественной антибиотикорезистентностью и проявившего одновременно достаточно выраженную чувствительность к АФДТ. Для выполнения данного этапа экспериментальных исследований на стерильном физиологическом растворе готовились взвеси микроорганизма Ent. faecium, соответствующие стандарту мутности №10 ЕД, для чего было подготовлено 10 опытных и 5 контрольных чашек Петри с питательной средой АГВ. В начале эксперимента при наливании среды в чашку Петри к ней добавляли раствор «Фотодитазина» в концентрации 5,0 мг/мл по 1,0 мл на каждую чашку (конечная концентрация 0,5 мг/мл). Производился посев 1 мл микробной культуры на чашки Петри. Затем на поверхность питательной среды во всех чашках укладывались 5 дисков, пропитанных различными антибиотиками: левомицетином, гентамицином, ампициллином, ципрофлоксацином и ванкомицином. Через 5 минут поверхность питательной среды облучали лазером с плотностью энергии 30 Дж/см2. После суточной инкубации в термостате диаметр зоны задержки роста культуры вокруг диска в опытных экземплярах сравнивали с таковым в контроле. Чувствительность культуры Ent. faecium к антибиотикам определяли по стандартным таблицам коррелятивной связи диаметра зоны задержки роста культуры вокруг диска и значений МПК антибиотиков. В сравнении с контролем при воздействии на культуру АФДТ отмечалось общее уменьшение обсемененности поверхности питательной среды, уменьшение количества колоний в зонах, не прилежащих к дискам, пропитанным антибиотикам. Зоны задержки роста микроорганизма не отличались в контроле и опыте, в связи с чем был сделан вывод об отсутствии влияния АФДТ на чувствительность микроорганизма Ent. faecium к антибиотикам и о возможности последовательного, совместного использования АФДТ и антибиотикотерапии.

Разработка автоматизированной системы расчета параметров интравитреальной антимикробной фотодинамической терапии (экспериментально-теоретические исследования) Следующий этап экспериментальных (in vivo) и теоретических исследований был направлен на разработку автоматизированной системы расчета индивидуальных

параметров интравитреальной АФДТ: экспозиции лазерного излучения в зависимости от требуемой плотности энергии. На всех глазах подопытных животных проводили ультразвуковую биомикроскопию, ультразвуковое В-сканирование, томографию с использованием рентгеновского спирального компьютерного томографа. В результате были получены серии томографических изображений в трех перпендикулярных плоскостях с шагом 1.0 мм, а также данные ультразвуковых измерений параметров глаз подопытных животных. Средние значения составили: расстояние от заднего полюса хрусталика до заднего полюса глаза (мм) - 6,043, вертикальный размер наибольшего поперечного сечения витреальной полости (мм) - 16,63, горизонтальный размер наибольшего поперечного сечения витреальной полости (мм) - 17,1, толщина хрусталика (мм) -6,84, поперечные размеры хрусталика (мм) - 10,55.

В дальнейшем на основании полученных данных проводилось разработка математической модели витреальной полости подопытных животных, изменяющая свои пропорции в соответствии с индивидуальными параметрами глаза. В оснрву модели были положены сечения глазного яблока, полученные в ходе томографии. Построение модели осуществлялось в системе автоматизированного проектирования «SolidWorks 2007». В результате нами была получена трехмерная модель витреальной полости глаза кролика, которая позволила визуально оценить свою адекватность по отношению к реальной анатомии глаза. Использование специальных возможностей программы позволило определять индивидуальные параметры витреальной полости: объем, площадь полной и боковой поверхности — в каждом конкретном случае. В то же время, применение программного пакета «Solid Works» для проведения расчетов параметров АФДТ было связано с рядом трудностей. К ним относились: громоздкость программы, требовательность к системным ресурсам компьютера, а также необходимость соблюдения лицензионных соглашений. Таким образом, нами была разработана собственная система расчета размеров витреальной полости и параметров интравитреального лазерного облучения при АФДТ. Полный объем модели составляла сумма объемов эллиптических усеченных конусов, из которых состояла вся модель. Сечеция

являлись основаниями этих конусов, поэтому формула подсчета объема модели (1) имела вид:

у^-^-М-ь^.ьХ (1)

где а] и Ь) - половины горизонтального и вертикального габаритных размеров 1-го основания, соответственно; а2 и - половины горизонтального и вертикального габаритных размеров 2-го основания, соответственно; Ь - расстояние между сечениями.

Площадь боковой поверхности витреальной полости подсчитывалась как сумма боковых площадей эллиптических усеченных конусов, из которых состоит вся модель. Сечения являлись основаниями этих конусов, поэтому формула подсчета

площади (2) имела следующий вид :

^ ^ (2)

где а] и Ь] - половины горизонтального и вертикального габаритных размеров 1-го основания, соответственно; а2 и Ь2 - половины горизонтального и вертикального габаритных размеров 2-го основания, соответственно; Ь - расстояние между сечениями.

При разработке алгоритма системы расчета параметров ФДТ была использована формула расчета плотности энергии лазерного излучения:

Р=\\М5,

где Р - плотность энергии лазерного излучения; - мощность лазерного излучения на конце световода; I - время облучения (экспозиция); Б - площадь облучаемой поверхности.

Разработанная программа выполняла следующие функции: при введении в соответствующие поля данных ультразвукового В-сканирования, а именно, расстояния от задней поверхности хрусталика до заднего полюса глаза, поперечного размера витреальной полости и толщины хрусталика, автоматически проводился расчет площади поверхности витреальной полости глаза; на основании полученных данных проводился расчет мощности лазерного излучения и времени экспозиции лазера, необходимых для получения заданной плотности энергии лазерного

излучения при проведении интравитреальной ФДТ. На заключительном этапе был произведен расчет параметров лазерного излучения с использованием усредненных данных анатомических характеристик глаз подопытных животных (табл. 1). Энергия лазерного излучения составляла 0,15 Вт. Выбор этого постоянного значения объясняется проведенными ранее исследованиями по воздействию рассеянного лазерного излучения на структуры глаза (Белый Ю.А. с соавт., 2005), в результате которых было установлено, что мощность 150 мВт не оказывает повреждающего воздействия на ткани глаза.

Таблица 1.

Зависимость времени воздействия лазерного излучения от площади облучаемой

поверхности и плотности энергии лазерного излучения

Плотность энергии лазерного излучения (Дж/см2) Время воздействия лазером (сек) Площадь облучаемой поверхности (мм2)

5 231,5 6,95

10 463,1 6,95

15 694,7 6,95

20 926,3 6,95

25 1157,8 6,95

30 1389,4 6,95

В дальнейших экспериментальных исследованиях in vivo мы сочли не целесообразным применять экспозицию, превышавшую 15 минут, а использовали плотность энергии лазера в диапазоне 5-15 Дж/см2 при времени воздействия 231-695 сек. В то же время, полученные на предыдущих этапах результаты экспериментальных исследований in vitro, не позволяли сделать окончательный выбор безопасных параметров плотности энергии лазерного излучения и концентрации «Фотодитазина» при проведении АФДТ, вследствие чего нами проведены экспериментальные исследования in vivo.

Состояние внутриглазных структур после интравитреальной АФДТ (экспериментальные исследования in vivo) Данный этап экспериментальных исследований проводился in vivo и был направлен на выбор наиболее безопасных и эффективных параметров АФДТ с точки

зрения состояния внутриглазных структур подопытных животных. Исследование проводилось в 2 этапа.

На первом этапе изучалось влияние плотности энергии лазерного излучения на состояние внутриглазных структур. Исследование проводилось на 40 глазах 20 кроликов породы шиншилла, разделенных на 3 опытные и 1 контрольную группы по 10 глаз (5 животных) в каждой группе.

Методика вмешательства: после местной анестезии в 2 мм от лимба формировалось склеротомическое отверстие, затем в витреальную полость вводился кварцевый световод с диффузором на конце, после чего в опытных группах проводилось облучение. В первой опытной группе использовали плотность энергии лазерного излучения 5 Дж/см2, во второй - 10,0 Дж/см2, в третьей - 15 Дж/см2. Срок наблюдения 1, 3, 7,30 суток и 3 месяца.

Ь результате было выявлено, что интравитреальное лазерное облучения при плбтности энергии 15 Дж/см2 вызывает выраженный дозозависимый эффект, который проявлялся в умеренном снижении показателей «Ь» волны ЭРГ, а также в повреждении слоя оптикоганглионаров и дезорганизации пигментного эпителия. Вследствие чего данная плотность энергии не использовалась при проведении дальнейших исследований.

На следующем этапе было изучено влияние интравитреальной АФДТ с «Фотодитазином» в различных концентрациях на состояние внутриглазных структур. Данный этап экспериментальных исследований был выполнен на 36 глазах 18 кроликов. Животные были разделены на 2 опытные и 1 контрольную группу по 12 глаз (6 кроликов) в каждой группе. В первой опытной группе проводили витрэктомию и интравитреальную АФДТ с «Фотодитазином» в концентрации 0,05 мг/мл, во второй опытной группе - витрэктомию и интравитреальную АФДТ с «Фотодитазином» в концентрации 0,5 мг/мл. Во всех случаях плотность энергии лазерного излучения составляла 10 Дж/см2. Предварительно (за 1 месяц) на всех глазах подопытных животных выполняли фаКоаспирацию.

VМетодика АФДТ. Операцию проводили под внутривенным наркозом, производили 3 склеротомии размером 0,5 мм. В одну из склеротомий вводили

ирригационную систему 250. Две другие склеротомии использовались для введения эндоосветителя и наконечника витреотома. В качестве ирригационного раствора использовался раствор ВББ. Производилась субтотальная витрэктомия по стандартной методике. После выполнения обмена вода/воздух в переднюю камеру для защиты эндотелия роговицы вводили вискоэластик, после чего в витреальную полость вводился раствор «Фотодитазина». Затем глаз герметизировали на 5 минут, по истечению которых ФС полностью удаляли из глаза, проводя повторный обмен вода/воздух. Затем через склеротомическое отверстие в витреальную полость вводили световод и проводили интравитреальное лазерное облучение. В контроле проводилась витрэктомия без введения ФС и лазерного облучения. В сроки 1, 3, 7, 30 суток, 3 и 6 месяцев послеоперационного периода глаза экспериментальных животных исследовали клинически, проводили ЭРГ, а затем патоморфологические исследования.

В результате было выявлено, что интравитреальное проведение ФДТ с «Фотодитазином» в концентрации 0,5 мг/мл (2 опытная группа) вызывало у экспериментальных животных развитие умеренной воспалительной реакции и повреждение сетчатки, происходило снижение показателей ЭРГ. При патоморфологическом исследовании выявлялись слабые фотодинамические проявления в заднем отделе глаз, практически без изменений диска зрительного нерва, с разрушением перипапиллярной сетчатки, приводящие к 6 месяцу к формированию хориоретинального рубца в заднем полюсе глаза.

В то же время, послеоперационная реакция на глазах 1 опытной группы (концентрация «Фотодитазина» 0,05 мг/мл) не отличалась от таковой в контроле Поэтому именно вышеуказанные параметры интравитреальной АФДТ, расцененные нами как наиболее щадящие, были выбраны для использования при лечении экспериментального бактериального эндофтальмита.

Интравитреальная антимикробная фотодинамическая терапия в комплексном лечении экзогенного бактериального эндофтальмита

(экспериментальные исследования in vivo)

Экспериментальные исследования in vivo проведены на 42 глазах 21 кролика

породы шиншилла весом 2,5-3,5 кг в возрасте 6 месяцев. Исследования включали 4 этапа.

На первом этапе на всех глазах подопытных животных проводилась факоаспирация прозрачного хрусталика по стандартной методике для исключения развития катаракты при последующем моделировании экспериментального эндофтальмита. На втором этапе (через 20-30 дней после факоаспирации и клинического успокоения глаз) создавали экспериментальную модель экзогенного бактериального эндофтальмита. Для этого 0,2 мл приготовленной культуры Enterococcus faecium в заведомо высокой дозе 100 000 микробных вводили в витреальную полость глаз кроликов. На третьем этапе зараженные подопытные животные были разделены на три опытные группы по 6 животных (12 глаз) в каждой группе и одну контрольную группу (6 глаз). В первой опытной группе проводили субтотальную витрэктомию, при этом в качестве ирригационного раствора использовали раствор антибиотика ванкомицина в дозе 30 мкг/мл. Во второй группе проводили витрэктомию в сочетании с интравитреальной АФДТ по предложенной нами методике, при этом в качестве ирригационного раствора использовали физиологический раствор. В третьей группе проводили витрэктомию и интравитреальную АФДТ, а в качестве ирригационного раствора использовали раствор антибиотика ванкомицина в дозе 30 мкг/мл. Сразу после заражения, через 12 часов до начала хирургического лечения и в дальнейшем на 1,3 и 14 сутки послеоперационного периода на всех глазах экспериментальных животных проводили биомикроскопию, непрямую офтальмоскопию и ЭРГ. Выраженность воспалительных изменений оценивали по 5 степеням: 0 степень (0 баллов) -признаки воспаления отсутствуют, детали глазного дна легко офтальмоскопируются; 1 степень (1 балл) - незначительная гиперемия конъюнктивы, радужки и отек роговицы, единичные преципитаты, в передней камере 5-10 клеток в поле зрения, глазное дно легко офтальмоскопируется; 2

степень (2 балла) - умеренная гиперемия конъюнктивы и умеренно выраженный отек роговицы, преципитаты, множественные воспалительные клетки во влаге передней камеры, гипопион до 2 мм, рисунок радужки стушеван, плавающие помутнения в стекловидном теле, рефлекс глазного дна снижен, детали глазного дна под густым флером или не офтальмоскопируются; 3 степень (3 балла) - тяжелая выраженная инъекция, гиперемия конъюнктивы, выраженный отек и преципитаты роговицы, гипопион более 2 мм, рефлекса с глазного дна нет; 4 степень (4 балла) -тотальный отек роговицы, гипопион, заполняющий всю переднюю камеру, глубжележащие структуры не офтальмоскопируются (Forster R. 1192, Callegan М.С. 2002).

В результате каждому глазу присваивали определенное количество баллов, затем производили их суммирование и, таким образом, получали количественную оценку клинических признаков воспалительного процесса глазного яблока. Сложив все баллы, присвоенные глазам экспериментальных животных, в каждой исследуемой группе получали сумму группы в определенные сроки наблюдения, а затем рассчитывали их средние значения. После клинического исследования из каждого глаза брали по 0,2 мл содержимого витреальной полости для дальнейшего микробиологического исследования. Далее на 1, 3 и 14 сутки глаза энуклеировали для последующего морфологического исследования.

Анализ результатов количественной оценки выраженности клинических проявлений воспаления, а также микробиологических и электроретинографических исследований показал положительную динамику воспалительного процесса при использовании каждого из лечебных мероприятий.

Наиболее быстро стихание воспалительного процесса, элиминация возбудителя (снижение значения количественной оценки клинических признаков воспалительного процесса с 2,79 баллов до начала лечения до 1,0 балла к двум неделям), а также отсутствие роста микроорганизмов на 3 сутки исследования наблюдались в 3 группе, где проводимое лечение включало витрэктомию, интравитреальную АФДТ и интравитреальное введение ванкомицина. Своевременное удаление возбудителя из витреальной полости в комбинации с ирригацией ванкомицином и АФДТ в короткие сроки приводило к стиханию

воспалительного процесса и наилучшему сохранению функции нейрорецепторного аппарата сетчатки (волна «Ь» ЭРГ на уровне 46 мкВ - 36% от нормы).

Для сравнения выраженности патоморфологических изменений в различных структурах глаза была разработана система количественной оценки гистологических признаков воспалительного процесса глазного яблока (табл. 2).

Согласно использованной системе, каждому патоморфологическому признаку присваивали определенное количество баллов, затем производили их суммирование и вычисляли среднее значение количественной оценки патоморфологических признаков воспалительного процесса. Результаты сопоставляли между собой для оценки динамики воспалительного процесса.

В таблице 3 представлены средние значения количественной оценки патоморфологических признаков воспалительного процесса в группах экспериментальных животных в различные сроки наблюдения.

Анализ морфологической картины показал, что течение воспалительного процесса в каждой опытной группе имело свои особенности. Так, наиболее быстро стабилизация процесса с выраженными эффектами противовоспалительной терапии наблюдалась в группе 3 (витрэктомия + АФДТ + ванкомицин). Отмечалось снижение значения количественной оценки патоморфологических признаков воспалительного процесса с 14,5 баллов в 1 сутки до 6,75 баллов к двум неделям.

Таблица 2.

Количественная оценка патоморфологических признаков воспалительного процесса глазного яблока_

№ Структуры глаза Баллы

п/п 0 1 2 3

1. Роговица (воспалительная инфильтрация) нет Слабая Выраженный кератит, инфильтрация стромы воспалительными клетками Гнойно- некротическое воспаление с нарушением архитектоники роговичной ткани и расплавлением роговицы

2. Роговица (отечность) нет Легкий отек Умеренный отек Выраженный отек

3. Роговица (неоваскуляризация) нет По периферии Неоваскуляризация без поражения центральной зоны Врастание сосудов в центральную зону

4 Передняя камера (экссудат) Без экссудат а Экссудат серозный Фибриноидный экссудат с наличием включений из воспалительных клеток Гипопион

5. Радужка и цилиарное тело норма Слабая периваскулярная воспалительная инфильтрация Умеренная периваскулярная воспалительная инфильтрация со слабой диффузной в строме, полнокровие и эктазия сосудов Явления выраженного иридоциклита

6. Витреальная полость (экссудат) Без экссудат а Нежно волокнистый фибриноидный экссудат Очаговое уплотнение экссудата Плотный фибриноидный экссудат

7. Витреальная полость (клеточная реакция) нет Слабая клеточная инфильтрация остатков витреума и экссудата Умеренная клеточная инфильтрация Абсцесс

8. Сетчатка норма Слабая, поверхностная воспалительная инфильтраты Выраженная воспалительная инфильтрация с очагами деструкции Гнойное расплавление сетчатки

9. Хориоидея норма Слабая периваскулярная воспалительная инфильтрация Диффузная воспалительная инфильтрация, участки кровоизлияний Гнойное расплавление хориоидеи

10. Склера норма Слабая воспалительная инфильтрация внутренних слоев Диффузная инфильтрация внутренних слоев склеры Склеромаляция вследствие гнойного расплавления

11. Зрительный нерв норма Слабая, поверхностная воспалительная инфильтрация ДЗН, не выходящая за пределы lamina cribrosa Периваскулярная воспалительная инфильтрация, выходящая за пределы lamina cribrosa, но не достигая линии пересечения нерва, расширение межоболочечного пространства Диффузная воспалительная инфильтрация по линии отсечения зрительного нерва с вовлечением оболочек

Таблица 3.

Количественная оценка (в баллах) патоморфологических признаков воспалительного процесса во всех группах экспериментальных животных в _ различные сроки наблюдения__

Сроки энуклеации после заражения Опытные группы Контроль

1 группа в/э + ванкомицин 2 группа в/э+ АФДТ 3 группа в/э + АФДТ+ ванкомицин

Количество баллов

12 часов (исходное состояние глаз перед лечением) 13

1 сутки 14,5 15 14,5 19,5

3 сутки 11,75 И 9,75 29

14 сутки 10,5 8,75 6,75 -

Своевременное удаление возбудителя из витреальной полости в комбинации с ирригацией ванкомицином и АФДТ в короткие сроки приводило к стиханию воспалительного процесса.

В группе 1 (витрэктомия + ванкомицин) проведение антибиотикотерапии ванкомицином также быстро элиминировало возбудителя из витреальной полости (стабилизация процесса от 12 до 24 часов на уровне средней тяжести - 14,5 баллов). Однако наблюдалось воспаление в поверхностных слоях сетчатки, чему могло способствовать сохранение структуры экссудата.

В группе 2 (витрэктомия + АФДТ) отмечалось прямое бактерицидное воздействие лазерного излучения на экссудат. Но в некоторых случаях труднодоступные передние отделы кортекса вместе с дополнительным экссудатом в передней камере подвергались лишь частичному разрушению. Однако в динамике этот метод проявил более благоприятный исход, составив к 14 суткам 8,75 баллов по сравнению с 10,5 баллами в группе 1.

Наиболее пристальное внимание в ходе патоморфологических исследований уделяли сетчатке. Ее структура была условно сохранна во всех трех опытных группах в экваториальной зоне и более подвержена воспалительной инфильтрации в центральной перипапиллярной зоне. Воспалительные явления угасали, но с

сохранением слабой воспалительной инфильтрации в поверхностных слоях после применения витрэктомии в сочетании с антибиотикотерапией ванкомицином. При применении комбинированной методики (АФДТ в сочетании с ванкомицином) таких явлений обнаружено не было. Результаты патоморфологических исследований были подтверждены данными статистической обработки. Значения критерия Фишера Р, превышающие критические, отражают эффективность метода лечения и скорость стихания воспалительного процесса в каждой опытной группе. Упорядоченная последовательность опытных групп для всех сроков наблюдения при оценке патоморфологических признаков воспаления имеет вид: группа 1 (Р1) < группа 2 (Б2) < группа 3 (РЗ) (табл. 4). Данное обстоятельство свидетельствует о наибольшей эффективности лечения экспериментального экзогенного бактериального эндофтальмита в группе 3, когда в ходе витрэктомии проводили АФДТ, а в качестве ирригационного раствора использовали раствор антибиотика ванкомицина.

Таблица 4.

Результаты однофакторного корелляционного анализа (критерий Фишера Б) в

зависимости от методики лечения экспериментального эндофтальмита

Способ лечения Р Б критическое

Витрэктомия + ванкомицин (У7;) 3,14 3,06

витрэктомия + АФДТ 9,15 3,06

витрэктомия + АФДТ + ванкомицин (Р,) 14,16 3,06

Результаты проведенных клинических и патоморфологических исследований, расчет значений количественной оценки признаков воспаления с их последующим сравнением и статистической обработкой полученных данных в каждой группе экспериментальных животных указывают на то, что наиболее эффективным методом лечения экспериментального эндофтальмита является витрэктомия в сочетании с АФДТ и антибиотикотерапией.

Проведение витрэктомии с интравитреальной АФДТ и антибиотикотерапией по лечебному эффекту превышает по эффективности на 35,7% традиционно

применяемый в лечебной практике метод - витрэктомию с интравитреальным введением антибиотика

С нашей точки зрения, проведение последующей клинической апробации разработанного метода с его внедрением в клиническую практику позволит значительно повысить эффективность хирургического лечения экзогенного бактериального эндофтальмита, улучшив тем самым качество медицинской реабилитации данного контингента больных.

ВЫВОДЫ

1. В эксперименте in vitro установлено, что наибольший антимикробный эффект фотосенсибилизатора «Фотодитазин» отмечается при его использовании в концентрациях 0,5 мг/мл и 0,05 мг/мл при условии предварительной темновой инкубации патогенных микроорганизмов с «Фотодитазином» в данных концентрациях в течение 5 минут.

2. В эксперименте in vitro доказано, что антимикробный эффект АФДТ напрямую зависит от плотности энергии лазерного излучения, при этом АФДТ не влияет на чувствительность патогенной микрофлоры к антибиотикам.

3. Разработанная система автоматизированного расчета позволяет с высокой точностью определять параметры лазерного излучения при интравитреальной АФДТ.

4. В эксперименте in vivo доказано, что интравитреальная АФДТ с ФС «Фотодитазин» в концентрации 0,05 мг/мл при плотности энергии лазера 10 Дж/см2 не вызывает каких-либо патологических изменений со стороны сетчатки и других внутриглазных структур.

5. Результаты проведенных клинических, микробиологических и патоморфологических исследований, а также расчет значений количественной оценки признаков воспаления с их последующим сравнением и статистической обработкой указывают на то, что наиболее эффективным методом лечения экспериментального бактериального эндофтальмита является проведение витрэктомии в сочетании с интравитреальной АФДТ с ФС «Фотодитазин» и антибиотикотерапией.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А. Фотодинамические эффекты хлорина Е6 на культуру St. aureus // Актуальные вопросы профилактики, диагностики и терапии хирургической инфекции: Сб. материалов VII Всеармейской международной конференции. - М., 2007. - С. 133.

2. Плахотний М.А., Белый Ю.А., Терещенко A.B., Кучеров A.A. Математическая модель витреальной полости глаза // III Всероссийская науч. конф. молодых ученых с участ. иностр. специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии»: Сб. науч. ст. / под ред. Х.П. Тахчиди. - М., 2008. - С. 209-210.

3. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А. Лечение экспериментального эндофтальмита методом фотодинамической терапии // Высокие технологии в офтальмологии: Сб. науч. тр. - Краснодар, 2008. - С. 188-191.

4. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А. Интравитреальная фотодинамическая терапия внутриглазного воспалительного процесса // Инфекции в хирургии.-2008.-Т. 6. - Приложение 1.-С. 12-13.

5. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А., Шацких A.B., Игнатенко Г.К. Лечение экспериментального эндофтальмита методом интравитреальной фотодинамической терапии // Офтальмология. - 2008. - Т. 5. - №4. - С. 27-33.

6. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А. Интравитреальная фотодинамическая терапия внутриглазного воспалительного процесса с препаратом «Фотодитазин» // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. -№2. - С. 28.

7. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А., Шацких A.B., Игнатенко Т.К. Интравитреальная фотодинамическая терапия в лечении экпериментального эндофтальмита // Материалы V Евро-Азиатской конференции по офтальмохирургии. - Екатеринбург, 2009. - С. 166-167.

8. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А., Шацких A.B., Игнатенко Т.К. Фотодинамическая терапия экспериментального эндофтальмита// Актуальные проблемы офтальмологии: Материалы научно-практич. конф., посвященной 70-летию заслуженного деятеля науки РФ и РБ, академика М.Т. Азнабаева. - Уфа, 2009.-С. 563-567.

9. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А. Интравитреальное фотодинамическое лечение внутриглазного воспалительного процесса // Лазерная медицина XXI века: Материалы науч.-практич. конф. - М., 2009. - С. 140.

10. Плахотний М.А., Белый Ю.А., Терещенко A.B., Шацких A.B., Игнатенко Т.К., Евстигнеев А.Р. Фотодинамическая терапия внутриглазного воспалительного процесса // Современные возможности лазерной медицины и биологии: Материалы XVII Всероссийской науч.-практич. конф. - Великий Новгород-Калуга, 2009.-С. 108-109.

11. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А., Шацких A.B., Игнатенко Г.К. Интравитреальная фотодинамическая терапия в лечении экспериментального эндофтальмита // Офтальмохирургия. - 2009. - №3. - С. 47-52.

12. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотний М.А., Шацких A.B. Экспериментальная антимикробная фотодинамическая терапия в лечении эндофтальмита // Роль и

место фармакотерапии в современной офтальмологической практике: Тез. докл. -Санкт-Петербург, 2009. - С. 34-35.

13.Белый Ю.А., Терещенко A.B., Володин П.Л., Плахотний М.А., Игнатенко Г.К. Экспериментальные аспекты антибактериальной фотодинамической терапии в офтальмологии // Рефракционная хирургия и офтальмология. - 2009. - № 3. - С. 37-42.

14. Белый Ю.А., Плахотний М.А., Шацких A.B., Юдина H.H. Изучение антимикробных фотодинамических эффектов на модели экспериментального эндофтальмита // Инновационная офтальмология: Сб. науч. тр. - Краснодар, 2010.-С. 173-175.

15.Плахотний М.А., Юдина H.H., Соловьев Д.К. Модель витреальной полости глаза // Инновационная офтальмология: Сб. науч. тр. - Краснодар, 2010. - С. 189.

16. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Шацких A.B., Плахотний М.А. Фотодинамическое воздействие и его эффективность в лечении экспериментального бактериального эндофтальмита // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2010. -№. 12-С. 24-28.

17.Ю.А. Белый, A.B. Терещенко, A.B. Шацких, М.А. Плахотний. Морфологическая оценка антимикробных фотодинамических эффектов на модели экспериментального эндофтальмита // Офтальмохирургия. - 2010. - № 5. - С. 3036.

Список изобретений по теме диссертации:

1. Способ хирургического фотодинамического лечения эндофтальмитов [Текст] : пат. 2253419 Рос. Федерация : МПК7 A61F9/007, A61F9/008 / Белый Ю.А., Терещенко A.B., Каплан М.А., Володин П.Л., Плахотний М.А., Юдина H.H. ; заявитель и патентообладатель Государственное учреждение Межотраслевой Научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова. - № 2003133278/14 ; заявл. 18.11.2003 ; опубл. 10.06.2005, Бюл. № 16.

Плахотний Михаил Алексеевич, 1973 года рождения, в 1997 году окончил лечебный факультет Российского Государственного медицинского университета

С 1997 г. по 1998 г. проходил обучение в интернатуре по специальности «Офтальмология» на базе Калужской областной больнице, где работал в качестве врача-офтальмолога отделения микрохирургии глаза с 1998 по 2003 г. С 2003 г и по настоящее время работает врачом-офтальмологом хирургической бригады № 2 в Калужском филиале ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии».

Автор 52 научных публикаций и 4 патентов РФ на изобретение.

ВЫВОДЫ

1. В эксперименте in vitro установлено, что наибольший антимикробный эффект фотосенсибилизатора «Фотодитазин» отмечается при его использовании* в концентрациях 0,5 мг/мл и 0,05 мг/мл при условии предварительной темновой инкубации патогенных микроорганизмов с «Фотодитазином» в данных концентрациях в течение 5 минут.

2. В эксперименте in vitro доказано, что антимикробный эффект АФДТ напрямую зависит от плотности энергии лазерного излучения, при этом АФДТ не влияет на чувствительность патогенной микрофлоры к антибиотикам.

3. Разработанная система автоматизированного расчета позволяет с высокой точностью определять параметры лазерного излучения при интравитреальной АФДТ.

4. В эксперименте in vivo доказано, что интравитреальная АФДТ с ФС «Фотодитазин» в концентрации 0,05 мг/мл при плотности энергии лазера 10 Дж/см2 не вызывает каких-либо патологических изменений со стороны сетчатки и других внутриглазных структур.

5. Результаты проведенных клинических, микробиологических и патоморфологических исследований, а также расчет значений количественной оценки признаков воспаления с их последующим сравнением и статистической обработкой указывают на то, что наиболее эффективным методом лечения экспериментального бактериального эндофтальмита является проведение витрэктомии в сочетании с интравитреальной АФДТ с ФС «Фотодитазин» и антибиотикотерапией.

119

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эндофтальмит является тяжелейшей офтальмопатологией, вызванной самыми разнообразными патогенными микроорганизмами и развивающейся, по данным разных авторов, в 4,2-50% после проникающих ранений глаза и в 0,05-4,8% после различных офтальмологических хирургических вмешательств [41,54,67,69,80,93,102,146,152].

В настоящее время наиболее распространенным методом лечения эндофтальмита является комбинированное хирургическое вмешательство, включающее витрэктомию, интравитреальную антибиотикотерапию и интравитреальную тампонаду стекловидного тела различными заместителями: жидкими и газообразными ПФОС или силиконовым маслом [17,21,29,55,56,61,97]. Однако в этих случаях нередко наблюдается токсическое воздействие на сетчатку антибиотиков, вводимых в полость стекловидного тела. Кроме того, в последние годы отмечается изменение спектра возбудителей внутриглазной инфекции, выделение ранее не встречавшихся видов и рост числа их антибиотикоустойчивых штаммов, что ограничивает круг препаратов, используемых для интравитреального введения [20,73,75,89,103]. Так появляется замкнутый круг, выход из которого заключается в поиске альтернативных способов с максимально направленным воздействием на патогенную флору.

В последнее десятилетие серьезные успехи были достигнуты в разработке методики антимикробной фотодинамической терапии — АФДТ, проведение которой в различных областях медицины стало возможным после появления новых групп современных фотосенсибилизаторов (ФС), в том числе и производных хлорина еб, с широким спектром антимикробной активности, включая и антибиотикоустойчивые грамположительные, грамотрицательные бактерии и грибковые клетки [92,119,126]. Среди них следует выделить отечественный ФС «Фотодитазин», обладающий по сравнению со своими аналогами целым рядом преимуществ для применения в офтальмологии, которые определяются его химическими, фотофизическими и фармакокинетическими характеристиками [30].

Цель настоящего исследования — разработать и оценить в эксперименте эффективность методики интравитреальной антимикробной фотодинамической терапии с отечественным фотосенсибилизатором «Фотодитазин» в комплексном хирургическом лечении экспериментального эндофтальмита.

В соответствии с поставленной целью задачи решались в следующей последовательности:

1. В эксперименте in vitro определить антимикробную активность различных концентраций «Фотодитазина»;

2. В эксперименте in vitro определить зависимость антимикробного эффекта и чувствительность патогенной микрофлоры к антибиотикам от плотности лазерной энергии, используемой при АФДТ;

3. Разработать автоматизированную систему расчета параметров интравитреальной АФДТ;

4. В эксперименте in vivo изучить состояние внутриглазных структур после интравитреальной АФДТ с «Фотодитазином»;

5. В эксперименте in vivo провести анализ эффективности интравитреальной АФДТ с «Фотодитазином» в комплексном лечении экзогенного бактериального эндофтальмита.

Работа включает комплекс разносторонних экспериментальных исследований, проводимых поэтапно in vitro и in vivo.

Первый этап экспериментальных исследований, проведенный in vitro, включал серию экспериментов, направленных на изучение особенностей воздействия различных параметров АФДТ на патогенные микроорганизмы: 1) определение минимального времени «темновой» инкубации культур патогенных микроорганизмов с раствором «Фотодитазина»; 2) оценку антимикробной активности АФДТ при использовании различных концентраций раствора «Фотодитазина» и плотности энергии лазерного излучения; 3) изучение влияния АФДТ на чувствительность патогенной флоры к антибиотикам.

В качестве объектов исследования использовались бульонные культуры грамположительных (St. aureus, Ent. faecium), грамотрицательных (P. aeruginosa) микробных, а также грибковых (С. albicans) клеток.

В результате проведенных in vitro экспериментов было выявлено, что растворы «Фотодитазина» во всех исследованных концентрациях (5 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,005 мг/мл) обладают антимикробной активностью в отношении изучаемых патогенных микроорганизмов при условии минимального времени их «темновой» инкубации с «Фотодитазином» в вышеуказанных концентрациях не менее 5 минут. Однако наибольший антимикробный эффект был зафиксирован при использовании «Фотодитазина» в концентрации 0,5 мг/мл и 0,05 мг/мл. Кроме того, было обнаружено, что антимикробный эффект АФДТ напрямую зависит от плотности энергии лазерного излучения и не влияет на чувствительность микроорганизмов к антибиотикам. Полученные результаты были использованы в дальнейших экспериментальных исследованиях in vivo.

Следующий этап исследований заключался в разработке методики интравитреальной АФДТ для определения ее оптимальных параметров. В соответствии с нуждами разрабатываемой методики возникла необходимость расчета индивидуальных параметров витреальной полости, для чего сначала было проведено изучение анатомических характеристик витреальной полости глаз подопытных животных, а далее разработана автоматизированная система расчетов параметров интравитреальной АФДТ.

Для изучения анатомических параметров витреальной полости объектом исследования служили 14 глаз здоровых кроликов породы шиншилла весом от 2,5 до 3,5 кг в возрасте 6 месяцев, которым проводили ультразвуковую биомикроскопию, ультразвуковое B-сканирование и томографию с использованием рентгеновского спирального компьютерного томографа. В ходе исследований рассчитывались расстояние от заднего полюса хрусталика до заднего полюса глаза, вертикальный и горизонтальный размер наибольшего поперечного сечения витреальной полости, толщина и поперечные размеры хрусталика, а* также были получены серии томографических изображений в 3-х перпендикулярных плоскостях с шагом 1,0 мм.

На основании полученных данных, была разработана программа расчета мощности и экспозиции лазера, необходимых для получения заданной плотности энергии лазерного излучения при проведении интравитреальной АФДТ. Дальнейшее экспериментальное изучение эффективных и безопасных параметров интравитреальной ФДТ проводилось с использованием разработанной программы.

Следующий этап, экспериментальных исследований in vivo был направлен на изучение состояния внутриглазных структур после проведения интравитреальной АФДТ с разной плотностью энергии лазерного излучения (5 Дж/см2, 10 Дж/см2 и 15 Дж/см2) и с «Фотодитазином» в концентрациях 0,5 мг/мл и 0;05 мг/мл с целью выбора среди них наиболее эффективных и безопасных параметров.

Исследования проводилось на 40 глазах 20 кроликов породы шиншилла, разделенных на 3 опытные и 1 контрольную группу по 10 глаз (5 животных) в каждой группе.

На первом этапе выбирали оптимальную плотность лазерной энергии. Для этого после проведения местной анестезии под контролем операционного микроскопа в 2 мм от лимба формировалось склеротомическое отверстие, после чего в витреальную полость вводился световод с- диффузором и проводилось ее лазерное облучение. Время воздействия и мощность лазера рассчитывали с использованием разработанной компьютерной программы. На глазах контрольных животных проводилось только введение световода в витреальную полость. Через 1, 3, 7, 30 суток и 3 месяца после вмешательства на всех глазах экспериментальных животных проводили биомикроскопию, непрямую офтальмоскопию, ЭРГ и морфологические исследования.

Полученные результаты интравитреального лазерного облучения витреальной полости подопытных животных свидетельствовали о наличии слабо выраженного дозозависимого эффекта при использовании плотности

О "У лазерной энергии 5 Дж/см" и 10 Дж/см", когда на протяжении всего периода наблюдения морфологических изменений со стороны сетчатки и внутриглазных структур практически не наблюдалось. В то же время интравитреальное облучение сетчатки с плотностью энергии лазерного гу излучения 15 Дж/см" уже на ранних сроках после вмешательства привело к поверхностным деструктивным изменениям сетчатки и полному разрушению и дискомплексации ее ядерных слоев, а также формированию ее плотного сращения с хориоидеей в отдаленный срок наблюдения, вследствие чего данную плотность энергии не использовали в дальнейших исследованиях.

Второй этап исследований, посвященный определению влияния интравитреальной АФДТ на внутриглазные структуры при использовании «Фотодитазина» в концентрациях 0,5 мг/мл и 0,05 мг/мл, выполняли на 36 глазах 18 кроликов, разделенных на 2 опытные и контрольную группу по 12 глаз (6 кроликов) в каждой группе. Во всех случаях плотность энергии лазерного излучения составляла 10 Дж/см , выбранная, исходя из того, что, при всех равных условиях именно она обладает наиболее значительным антимикробным эффектом, подтвержденным результатами экспериментальных исследований in vitro.

Для проведения исследований на всех глазах животных за 4-6 недель до начала эксперимента была выполнена факоэмульсификация хрусталиков для исключения развития катаракты в послеоперационном периоде АФДТ.

Через месяц после клинического успокоения глаз, после проведения местной анестезии и внутривенного наркоза на всех глазах под контролем операционного микроскопа производили 3 склеротомии размером 0,5 мм. В одну из склеротомий вводили ирригационную систему 25G. Две другие склеротомии использовались для введения эндоосветителя и наконечника витреотома. В качестве ирригационного раствора использовался раствор BSS. Затем производилась субтотальная витрэктомия« по стандартной методике, обмен вода/воздух, переднюю камеру заполняли вискоэластиком, в витреальную полость вводился раствор «Фотодитазина» в соответствующих концентрациях до уровня склеротомий. Затем глаз герметизировали на 10 минут, после чего ФС полностью удаляли из глаза, повторно проводя замену вода/газ. Через склеротомическое отверстие в витреальную полость вводили световод и проводили интравитреальное лазерное облучение. По завершении операции на разрезы накладывали узловые швы 8-0. На глазах контрольной группы проводили витрэктомию и удаление остатков задней капсулы хрусталика без последующего введения ФС и лазерного облучения.

Через 1, 3, 10, 30 суток и 3 месяца послеоперационного периода проводили биомикроскопию, непрямую офтальмоскопию, ЭРГ, морфологические исследования (световую микроскопию).

Полученные результаты клинических и морфологических исследований свидетельствовали о том, что проведение интравитреальной АФДТ с «Фотодитазином» в концентрации 0,05 мг/мл и при плотности

Г) лазерной энергии 10 Дж/см~ не вызывает каких-либо патологических изменений со стороны сетчатки и других внутриглазных структур на протяжении всего срока наблюдения до. 6 месяцев. Поэтому именно вышеуказанные параметры интравитреальной-АФДТ, расцененные нами как наиболее щадящие, были выбраны для использования на заключительном этапе экспериментальных исследований in vivo, посвященных лечению экспериментального бактериального эндофтальмита.

Данное исследование in vivo, состоящее из нескольких этапов, проводили на 42 глазах 21 кролика породы шиншилла весом 2,5-3,5 кг в возрасте 6 месяцев.

На I (предварительном) этапе на обоих глазах экспериментальных животных выполняли факоэмульсификацию прозрачного хрусталика для исключения последующего развития катаракты при моделировании экспериментального эндофтальмита и оценки степени тяжести воспалительного поражения внутриглазных структур в различные сроки послеоперационного наблюдения [49,63].

П. этапом через 20-30 дней после факоэмульсификации и клинического успокоения глаз создавали экспериментальную модель экзогенного бактериального эндофтальмита. Для этого использовали культуру ЕШегососсиз 1аесшт, которую сначала центрифугировали в течение 3 минут при 2000 об/мин, после чего надосадочную жидкость удаляли микропипеткой, а 0,2 мл приготовленной культуры в заведомо высокой дозе 100 000 микробных тел вводили в витреальную полость [63, 101].

Сразу после заражения и через 12 часов после него проводили биомикроскопию, непрямую офтальмоскопию и ЭРГ. Выраженность воспалительных изменений оценивали по 5 бальной системе [80,101], после чего каждому глазу присваивали определенное количество баллов, затем их суммировали, получая, таким образом, количественную оценку клинических признаков воспалительного процесса глазного яблока в каждой группе в определенные сроки наблюдения, а затем рассчитывали их средние значения.

На III этапе экспериментальные животные были разделены на три опытные (по 12 глаз 6 кроликов) и одну контрольную (6 глаз 3 кроликов) группы. В первой опытной группе проводили субтотальную витрэктомию по стандартной методике и в качестве ирригационного раствора использовали раствор антибиотика ванкомицина в дозе 30 мкг/мл [23]. Во второй группе проводили витрэктомию и АФДТ по предложенной нами методике. В третьей группе - витрэктомию, а в качестве ирригационного раствора использовали раствор ванкомицина в дозе 30 мкг/мл и АФДТ. Четвертая группа животных была контрольной, без лечения.

На 1, 3 и 14 сутки послеоперационного периода на всех глазах экспериментальных животных проводили клинические (биомикроскопия, непрямая офтальмоскопия, ЭРГ) исследования, после чего из каждого глаза брали по 0,2 мл содержимого витреальной полости для дальнейшего микробиологического исследования. Далее глаза энуклеировали для последующего морфологического исследования (световая микроскопия).

Выраженность воспалительных и патоморфологических изменений после хирургического лечения оценивали по той же 5 бальной системе; что и до хирургии. Тяжесть течения и исход оценивали по степеням: легкая — до 8 баллов, средняя - 9-16 баллов, тяжелая - 17-24 балла, крайне тяжелая — 25-33 балла.

Анализ результатов количественной оценки выраженности проявлений воспаления, а также микробиологических и электроретинографических исследований показал положительную динамику воспалительного процесса при применении каждого из лечебных мероприятий. При этом наиболее быстро стихание воспалительного процесса, элиминация возбудителя и отсутствие роста микроорганизмов на 3 сутки исследования наблюдались в 3 группе (снижение значения количественной оценки клинических признаков воспалительного процесса с 2,79 баллов до начала лечения до 1,0 балла ко второй неделе). Так, своевременное удаление возбудителя из витреальной полости в комбинации с ирригацией ванкомицином и АФДТ с «Фотодитазином» в короткие сроки приводило к стиханию воспалительного процесса и наилучшему сохранению функции нейрорецепторного аппарата сетчатки (волна "Ь" ЭРГ составляла 46 мкВ - 36% от нормы).

Анализ морфологической картины также показал положительную динамику воспалительного процесса при применении каждого из лечебных мероприятий. В то же время в контроле (без лечения), прогрессирование воспалительного процесса на 3 сутки эксперимента привело к панофтальмиту и гибели глаз (количество баллов к этому сроку достигало максимума — 29).

Следует отметить, что патоморфологические признаки течения воспалительного процесса в каждой опытной группе имели свои особенности. Так, наиболее быстро стабилизация процесса с выраженными эффектами противовоспалительной терапии наблюдалась в 3 группе витрэктомия + АФДТ + ванкомицин), где значение количественною оценки-патоморфологических признаков воспалительного процессах 14,5 баллов вЛ сутки-снижалось до 6,75 баллов к двум, неделям.

В» группе 1 (витрэктомия + ванкомицин) проведение антибиотикотерапии также быстро» элиминировало- возбудителя из витреальнош полости1 (стабилизация процесса от 12' до 24 часов на уровне-средней тяжести - 14,5 баллов). Однако^ наблюдалось воспаление в поверхностных слоях сетчатки, чему могло способствовать сохранение структуры экссудата.

В группе 2 (витрэктомия + АФДТ) отмечалось прямое бактерицидное воздействие лазерного излучения на экссудат. Но в некоторых случаях труднодоступные передние отделы кортекса вместе с дополнительным экссудатом в передней камере подвергались лишь частичному разрушению. Однако в условиях технически правильного проведения АФДТ в динамике этот метод проявил более благоприятный исход к 14 суткам - 8,75 баллов по сравнению с 10,5 баллами в группе Г.

Наиболее пристальное внимание в ходе патоморфологических исследований уделяли сетчатке. Ее структура была условно сохранной во всех трех опытных группах в экваториальной зоне и более подвержена воспалительной инфильтрации в центральной перипапиллярной зоне. При этом в 1 группе (витрэктомия, + ванкомицин) воспалительные явления угасали при сохранении слабой воспалительной инфильтрации в поверхностных слоях, во 2 группе (витрэктомия + АФДТ) и особенно 3 группе (витрэктомия + АФДТ + ванкомицин) таких явлений обнаружено не было.

Результаты патоморфологических исследований были подтверждены, данными статистической обработки. Упорядоченная4 последовательность опытных групп для« всех сроков наблюдения« при . оценке патоморфологических признаков воспаления имеет вид: группа 1 (Б1) < группа 2 (Р2) < группа 3 (БЗ). Данное обстоятельство свидетельствует о наибольшей эффективности лечения экспериментального экзогенного бактериального эндофтальмита в группе 3, когда в ходе витрэктомии проводили АФДТ и в качестве ирригационного раствора использовали раствор антибиотика.

Таким образом, проведенный комплекс разносторонних экспериментальных исследований свидетельствует о перспективности использования витрэктомии в сочетании с интравитреальной АФДТ с «Фотодитазином» и интравитреальной антибиотикотерапией в лечении бактериального эндофтальмита. С нашей точки зрения, внедрение разработанного метода в клиническую практику позволит уменьшить вероятность развития антибиотикорезистентности и усилить антимикробный эффект вмешательства без опасности токсического воздействия на внутриглазные структуры, улучшив, тем самым, качество медицинской реабилитации данного контингента больных.

118