Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Ингибиторы протеаз как иммуномодуляторы в норме и при некоторых формах экспериментальной патологии

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР КУРСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

Нл правах рукописи

ЛАТЫШ Наталия Александровна

ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕАЗ КАК ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ В НОРМЕ И ПРИ НЕКОТОРЫХ ФОРМАХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ

14. 00. 36—Аллергология н иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени х-^,-кандидата биологических наук

О)

Курск—1991 г.

1

Работа выполнена в Курском ордена Трудового Красного Знаиеаи государственном медицинском институте

Научный руководитель?

т- доктор биологических наук, профессор Г. А. Чалый

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

— доктор медицинских наук, профессор Н. Б. Луцюк

— доктор медицинских наук, профессор А. И, Конопля

Ведущее учреждение: институт иммунологии Минздрава СССР

Москва

Защита состоится , № - ^лба/ил 19 Л г. в час. иа заседании специализированного Совета К С84. 57. 01 при Курском ордена Трудового Красного Знамени государственном медицинском институте (305033. г. Курск, ул К. Маркса-3)

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке Курского ордена Трудового Красного Знамени государственного медицинского института.

Автореферат разослан

.30>1аМЖ19 3/ г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук доцент

В. В. Новиков

0Б1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РуШОГЫ ■. •

Фармацевтические грегораты ингибиторов зротсэз (КП) обхайаг.х аирохии спектров Фармакологического дзкствил и успешна приценяется в клинике как противовоспалительны«, антимикробные и гомостатические средства при различных заболсгэнгя':.. Показаниями для применения ИП природного и синтетического происхогаекня являются шоковые состояния, обусловленные трзвмми, ологаки, гзморро-гичеехко состояния посла хирургического шгесотельстра, ■острие и хронические панкреатиты, перитониты, аллергические состояния СК.Н.Зерзме'-енко, 1571; К.й. Вврамознко и др., 1538; В.З. Мосолов,1933; А.О.Скно-вэи и др., 15Ь5). Течение и исход больимстза этих заболеваний зависит от иммунологической реактивности организма. Вместе с ток, влияние препаратов Ш на иммунные реакция организма исследовзно на достаточ-ко .

В литературе приводятся отрывочные противоречите сведения о елиянии препаратов ИП (контрикала и е - АКК) на иммунный статус организма в корке (Ю.В.Закдборг, 1937; Г .Т. Клыкова, 1553; А.П.Цы-булькин и др., 1961). Данных о влиянии ¿кбе!на, синтетического ИП, на гуморальный, иммунный ответ СГЙО) в норма не обнаружено. Отсутствуют данные о влиянии препаратов ИП на гиперчувстэительность замедленного типа СГЗХ). Не достаточно исследовано влияние препаратов ИП на ■ иммунный ответ организма при патологических состояниях, в патогенезе и оэногендэ-а которых вавнуи роль играют иммунные механизмы. ; - Учитывая изложенное, изучение влияния ИП на развитие иммунного ; ответа в норке и при патологии представляет научный и практичэс-' кий интерес.

Целью работы быг.о исследование влияния природного ИП контрикала ' и синтетических ЙП £ - АКК и амо'ена на развитие ГКО в норме и при нзкоторыу. формах аксг.ерикзнтальной патологии, сопровождающихся-развитием вторичных имкунодефиикгов (экспериментальном остром панкреаги-те (сОП) а стефилококовоя инфекиии) и обоснование применения вшэтуха- " заиках препаратов в качестве иммудамодулируших средств".

__нсокедованиэ влияния контрикала,

-ЛКК и ас^ена на ГКО, индуцированный тимусзанисиыым и тииуснозави-■ ешшы анптенами, и развития реакции ГЗТ, индуцированной тимусэави-симцк антигеном; 2) исследование влияния указанных препаратов на активность О^-ИЛ, -^-М, об^'ю протиолмгичэскув и ангипротеалитичес-кув окт1;;нос:'ь сыгорстки крови в норме; 3) исследование влияния ИП на развитие актггенспешфичоскоя имиуносупрзссии; ч) исследование акстракорпорального икмуномодудируьцего действия ИП, опосредованного ■лимфоцитам; се.й зенки к периферической хрови; 5) исследование и.чкунонодулмрусцьго действия ИИ при' их сочетаьном применении с препаратами террилитииа; б) исзледованиа иымунокодулируссего и протекторного дойсггия коьгрикала.е - ¿КК иамбена при некоторых иккуно-опосредэванных формах экспериментальной патологии (острой панкреатите, стафилококковой инфекции).

Н & чя о в из на. Получении да кии а сб иммуностимулирующем влиянии препаратов ИП (.контрикала, £ « АКК и амбена) на развитие ГИО И реакции Г£Т, индуцированных ткмусзависиши антигеном, в норме и при некоторых формах патологии, сопровокдающихоя вторичными иммунодефици-тани..

Изучено,влияние препаратов ИЛ на фенокен анг.1ГвнспеиифическО0 имиуиосупрэсии.'Препараты контри кал, йНК и ьксен оказывает угнета-шее действие и; формирование и функциональную активность Т-супрэс-соров. • • ■

Установлена ахстракорпорал ьная «мнунокодулирус^я активность. Ш,

опосредованная сплЕ-'окитани и яимфоцигаии периферичаокей крови.

Исследовано иныуноыодулируюкае действие контрихала, £ - .АКХ н

о •

амбена при их оочетанкон применении о препаратами протеаз (тырри-

литином и терридвкааой).

Установлено, что п^огеазы и ИП при их комбинированном введении ока-з1вают иммуностимулирующее действие, наиболее выраженное при отсроченной введении ИП.

Практическая значимость. Получены данные об иммуномодулирусиом Действии препаратов ИП при МП и протективном дзйствии указанных препаратов при стафилококковой инфзкиии, что экспериментально обосновывает целесообразность использования ИП в хачоства иммуномодулирую-иих средств при данных формах патологии. Установлены опгинальные сроки введения Ktl с целы) псвтвения иммунологической реактивности организма срн указанных патологических процессах.

Установлена высокая иимуномодулирусщая активность окстракорпораль-. > кого применения И1# опосредованного лимфоцитами селезенки и периферической крови. Полученное данные обосновывают возможность применения контрикала, ? - ШК и екбена нетрадиционны* методом имкунофармачо-тарапии.

Этработанз схема жокбдаароганногс применения протааз свободного я иммобилизованного террилитина я ИП, пра котороя достигается наиболее вкракениая стимуляция ГЙС.

' В ходе выполнения работы подано 3 рзц. предлохения, новизна и полезность которых подтверждены положительными решениями; 1)"Экстра-хорпоральныя способ стимуляции иммунного ответа геррилитйном*. 2)"Способ погывения препаратами ОТ иммунологической реактивности организма при "стафилококковой инфекции? 3)"Экстракорпоральный способ стимуляции ГйО препаратами ИП (контрикалом и£-ЖК)"

Апробация работы. Материалы исследования обсуиденв на конференции молодых ученых Курского ордена Трудового Красного Знамени государственного медицинского института (1989, I9S0), В Менделеевском съезде по обчеи к прикладной химии (1989)» научно-практической конференции»

посвяченноя 25-летию фарм. факультета КГМЙ (Курок, 1991), Всесоюзно* конференции по химиотерапии (Москва, 199I), научной конференции "Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Дальнем Востоке" (Токек, 1991)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

ЕйЁ^ЕМ» Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главк I и 2)рписания использованных материалов и методов ^глава 3), наложения собственных исследовании (главы 4-6), заключения и ьиводог. лзтериалц диссертации изложены на 178 страницах машинолио! включая 28 таблиц, 12 рисунков, указатель использованной литературы* содерисадий 195 источников отечественной и 90 источников зарубежной литературы,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования ¡Зксперииентальнье исследования выполнены на 2412 иивотных в том числе на 1692 крысах Вис тар кассой 120-1б0г к 520 мышах-гибридах Р|/СВАхС57В1/, пассов 19-21г, получеьных из питомников АШ СССР "Столбовая". "Крюково". Объектами исследования служили сыворотка кров лимфоциты селезенки и периферическое крови, ткань лимфоузлов.

В работе использовали природный поливалентный ингибитор чэ^зэ коаврикал (. ц'.оизеодство ГДР., Уев! синтетические ингибитора Ррстея £~АКК (прояЕгодйтво СССР) и аыбон (производство ГДР,Уев) А препараты протеэлитических ферментов? «вррилч*як •=

протеазу никробного происхождения, выпускаемый объединением "Моепрела раты" ик. Л.Я. Карпова, терридеказу - иммобилизованный на декстрдт твррилитин, полученную и првцоставленную для работ лабораторией н>шр билизаиуи ферментов ВНИГИАФ (директор, профессор Б.В. Москвючев)п Растворы препаратов ИЛ вводили внутрибрьшияяо одно- или мното*рз:да

терапевтических дозах (?Д), принятых для чо-тогока и перосчптонних I единицу кассы животного. Расггсри прзпаратов протээз вводили, [утрчмывечио, одно- или трехкратно в дозе 5 ПЕ на IGG г мзоск те-(Г.А.Чалый, IS88).

око пе£игэкмльнка _модели

Цодел:, острого панкреатита. У к^ыс, находящихся под гоксекильным фхоэок, проводил:: .-.аларотомкю. ЗОН вызывал, комбинируя перевязку шкреатического протока, прагму селззонсчнсго сегмента и пзрогкз-' сосудов под«о,-удоч!!0й кодзаа (ватной селеззпочкой артерии, кроео-1абрз»с;ев подьелудочнуа »елвйу (С.А. Еал!ков и др. I98b).

Модель генерализованной стафилококковой инфбкиии. Исследуя протск-[зное действие Ш при стафилококковой кнфакши, использовали культуру' ;aphyloooccus aureus L7aK Культура обладала типичными для

»лотиотого стафилококка свойствами и эираьеннь-м'и признаками патогэн-•отй. Заражение производили предварительно оттитрованными дозами 40® (сублетальная доза) или 4x10" Слетальная дзза}. Наблюдение за [фицироранниии кивотньми проводили f течонии 10 днзй. На.протяжении "ого периода определяли выкиваемость и сродною продолжительность (ЭНИ в днях.

зимечэние: Работы выполнялись на кафедра микробиологии Курского пединститута (зав. кафедрой» профессор Е.Б. Вельский).

• ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ зиготавлэние антигена (Аг) и схема' вямунигзики. Б.работе изучали ^моральные и клеточные реакции именного ответа' в условиях применения нипротеаз. природного и синтетического происхождения на Т^зэвисикып ггиган - эритроциты барана (сБ) и Т-нззависимый антиген лкпополи-)Харид3« *7рЫ-901(ЛПС).Крыс и мышей иммунизировал!? ¡¿Б однократ-), внутрибрвгинно, «з расчета 2x1 С? клеток на 0,1 кг массы тала 1И ЯЮ таквд Е.чутрибркь'инно однократно'из расчета 500 ккг на 0,1кг эссы. ;

i, •'•>!?.:ü;-.h h-cnp? n; ьггчгоккаииз CtM у.опольгояани тесты - антигены Ж,, «»•ода.. •: г<5ироватцр не Г5 СЕ.Кэбот, М. Kefiep, 1968).

' Определение jw.- • _*0К. Количество ДОК в селезенке опреде-•""ли методой jeme и IJordii. (IS53).

Определение иммунных РОК. Количество РОК определяли методой -3oii dal'л др, Q972) Рвзеткообраэушшки считали клетки, имеющие на своей поверхности три и более прилипающих эритроцитов.

Определение_титровi антител в сывороткеi крови. Уровень антиэритро антител т> сыворотка крови определяли раакиией прямой ■с: л■r.'.PTf.iuuHK. Антитела к растворимому антителу - ЛЯС S-typhi-goj г.(|].и.ч«(л ч ; :-а;щией ■ ивпрр: ■ «.¡агглютинации (Е.Кзбот, Мэйер,19б8; ЕОЙА, т9C/JJ.

Определения кнтеьси; ■ UУ мышей индуцировали,'

используя в качества антше».. -b Чвриоусава, Л.,Ч.Кульб^рг,19В1)

Оценивали ГЗГ, определяя индокс реакции СИР) по формуле: роп » Рк

ИР * ц- .. -___х 1002, где Роп и Ря - показатели опытный к контрол

Рк

<шй. Вычисляли ИР для следуыцил показателей: вес дапок, вез лимфоузлов, количество кариоцитов.

Способ индукши актигвнспецийиЧ'чакок иикуносуг.рессии. " ' ——

Дитигенспеиифичвскув иккуносупресию у ¿ей, обусловленную Т»>оупрвс-

й

сора«и, йндуикрогали гкперкк.чуиизьииj> животных 4x10 оБ СР.М.Хаитов и др.. 1960). .

^акционирование силаис'щггсв. Слленоцигы фракционировали ' по их способности прилипать к стеклу n¿ грилипавше (ПНС) м неприлипав-аие (НПКС) клетки сеадаенк^СКС) (3.$. Лилуакина и др., 1583).

Ликсэииты видз^.я-.и ии ■ гепаринизировэнной крови. Ьритроииты удаляли гемолитическим еоком (Ю,В. Буруэястер, 1979). Готовили взвесь лимфоцитов в сре^е 199 и» расчета 2x10' клеток в I мл.

Обработка лимфицотов селезенки и периферической крови препаратами «П. Б части опытов КС, ПКЗ, НПКС и лимфоциты периферической крови обрабатывали препаратами ЯП (Из расчета 1/2 ТД на 2x10^ клеток). Количество жизнеспособных клеток оцэнигэли в тзсте поглощения трипаноЕот синего,! условиях опыта оно равнялось 85£.

Биохимические_мегоды Определение обсей протеолитической| ангипротеолитическоИ_§¿тквности,

активности сС j-ИП и С^-М__в сыворотке крови. Протеолитическую

активность сыворотки крови определяли по орлангеру в модификации Иатэрниковэ (A.A. Покровский, IP79).

Обеуя антипротеолитическуо активность определяли спектрофотометри-ческим методом. (К.Н. Верекеенко и др. 1975).

Определение активности естественных ИП и Q^-М в скэоротке

крови кквотных проводили методом B.fi. Нзртиковой и Т.С. Пасхинок (1979).

Статистическую обработку цифрового материала проводили путек вычисления средней арифметической 00, квадратичного отклонения (б) и доверительного интервала Q-) с вероятностьк 95$ по таблицам (Р,Б. Стрелков, 1936). Существенность ■ различий И оценивал!' с помощью критерия Вилкоксоиа-Маннг-Уитни при Р^- 0,05 (E.S. Гублер, А.Р. Генкин, Г973).

Вычисляли коэффициент стимуляции (Кс) показателей ГИО, равный ■ отношении показателей опытной и контролькой Групп:

Кс. »__L£H-

" ? к.

РЕЗУЛЬТАТЫ.!! ИХ 0БСШЕНКЕ Иммуноуодулир} юсэе гегстнио ИП природного v синтетического .проиохо^ь- __ дения, использ^эмых_в_кач9стве лека^стврннцхj^penaparos."

Чзучеко влияние препаратов ИП Сконтрикзла, £ - А?К и ачбена) на1 развитие ГКО и Еырааенносгь реакции ГЗГ в зависимости от дозы препаратов, кратное:и иньокиий и соотношение сроков введ,ения 1Ш и антигена.

Е результате провзд?кных исследований установлено, что прег.арать контрикал, £ -АлК и а>;Сен при одно- и пятикратном их введении дозэ-заЕиеимо стимулируют гуморальную фор.\;у иммунного ответа и р^згитиэ реакции ГЗГ, индуцированных тшусзевисюшм антигеном (££). Анализ данных о стину лиру шеи влийну.и препаратов ЯП на ГШ дает основание зехлкчить, что иммунэстикулируккий эффект !'Л в болы_ей степени проявляется в индуктивной фазе ГШ (таол.Х). Б то ¡хе арекя, препараты У.71, введенные аналогично, ко оказывает влияния на иммунный ответ, там;снезависящим антигеном СХПЗ),

Нами установлено, что контриквд и ё -АНК усиливает варааониок реакции Г^Г при ввегении их одновременно с сенсибилизирускай дозой « Амбен стимулирует развитие ГЗГ при инье.цировакии одновременно с разраиаьсэй дозой антигена.

Исследование влияния препаратов ЯП на активность С'-2~ИД#ОС^-!.;

обцую протеолитичьскую и антипротеолиткчзскус активность сыворотки

крови показало, что одно- и пятикратное введении крысам хонтрикала,

£-АКК и лмбена приводит к снижению активности &Т-ИП, но повыазае

а- х

об^ую протеолитяческуй активность сыворотки крови.

На осное&нии проведенных исследований к ямзецкхся в литературе данных можно предположить, что кину но модулирующий аффект ИЯ реализуется путем связыв-ния с иитоплазматической прохеазой, фиксации ее

. на поверхности клетки и последующем взаимодействии МП со ртруктурами

С

клеточной мембраны. Возможно, Й1 взаимодуяствуст о прогеазами, встроэ ними в' цитоплазкатическу!) моибрану лимфоцитов и участвующими в актив аапии лимфоцитов антигенами, Вполне вероятно, что изменение ¡актйгносг

Влияний пятикратного ввадания прапаратив ии на ши J луы,- таблица I

ГО Условия опыта :Стат. ;покеза- :тзли г Количзстао на орган

: • аок х 1<Р I РОК х Ю6

: '5-й День 1 Кот, :8-й день: Кот. 4 5-й дэнь :■ Кот. :8-й дань :Кст,

I. Иммунизация ЗБ М+« 57» 5+7.0 . 31.3+3,5 29.7^ 2,4 45,5+4,1

2. £Б + тд . конТригсала М+еГ Р1 121,6+11,1 •■¿0,001 . 2,2 77,2+6,5 ¿•0,005 2,5 46,8+ 4.7 ¿0,05 1.6 67,2+5,6 ¿■0,05 1.5

3. ТД контрикала + ЭБ М+(? 181,9+17.6 ¿■0,001 3,2 107.1+11,3 < о7оох 3.4 91,2^ 8,5 ¿0,001 3,1 121.3+11,2 ¿0,001 2.7

4. Иммунизация ЭБ м +(з 51,4+5,0 31,3-3,7 31,2+3.7 51,6+5,6

5. об + тд « -акк ы +0 ,120.8+9.8 ■ 2,3 73,8+5.8 2,4 50,1+4,8 1.6 83,2+7.4

Р4 ¿0,001 <0,001 ¿0,01 ¿0.005.

6. тде.-ш + ЗБ м+с 176,0+20,5 <0.001 3,4 <.С~001 4,3 58.7+7.1 ¿.0.С05 1.9 90,2+7.7 <0,001 1.7

7. Иммунизация ЗБ м+<? 47:4+4,5 ■ 28.2 +2.2 31,1+3,8 52 „3+6,0

8. ¿Б + ТД амбена М+ 6 -Р7 .. 72,3+6,9 <0705 1.5 . 43,4+5,0 < 0.01 1.5 51,3+4,8 <0,005 1,6 81,2+8.6 ¿0,005 1.5

о ^ ТД амбена + ЗБ К+<3 139.3+13,3 ¿.0,001 2,9 62.0+5.7 ¿.оТооэ 2,2 34,9+8,2 ■ <0,001 2,7. 124,5+10.9 ¿0,001 2,4

Примечаний: Какдгя средняя получана а опытах кз 10 крысах

компсентоЕ системы протеазы-антипротеазы-крови под действием Ш оказывает рогулируюсзе влияние на развитие иммунного ответа. Проявлз-нко иммуностимулирующего действия ИГГ в аироделенной степени может быть обусломено сниконкем под их влиянием активности C^j-ЙП, обладасщего, согласно данных литературы, имкуносупрессорным действием.

Üсолелование влияния препаратов ИГ! на антигенспеиифи»

ческ^в_^^¡¿таос^П£ессию_

Известно, что ведусую роль в регуляции различных форы иммунного ответа к ¿тимусзависиныи антигенам играет Г-супрессоры С "oreta et a3j;980;B.Perais,H.Vogel.iSBO). Поэтому на модели анти-ге«специфическое инмуяосупрессии исследовали влияние препаратов j ffl на формирование и функциональную активность Т-клеток-суг.рессо- 1 ров. |

Результаты проведенных опытов показали, что лимфоциты селезенки ! Гиперккмунизированкых мышей угнетают развитие ГИО на ¿Б у мцеей-реиипиентов, что подтверждает специфичность Т-супрессоров по отношение к антигену. Введение контрикала, £ -АКК и ембена одновременно О'гкпориммунизируювдй дозой антигена донорам сплсноцитоз сникает сулресоорныя гф^ект, susuEacmT. лимфоцитами зелезонкк - спленоииты доноров, получавших препарату КП, при адоптивном переносе на способны подавлять м.'муиний otlot (таб;,.2). При введении ИП реципиентам спле-ноцитов одновременно иммунизацией их тимусзависимым антигеном таккэ имеет место ослабление икнуносупрассорного действия лимфоцитов галерйммунизироЕанкьгх мышей и усиление гуморальной формы иммунно- _

го ответа. ■

О

На основании полученных данных «окно предположить, что КП оказывает влияние на формирование и функциональную активность Т-супрессоров. Возкокно, они стимулируют формирование и активность Т-халпэров■или ' подавляют формирование и .активность Т-супрйссоров. Кроме того, контр))-кбл, АКК к амбен влияют на зрелые имму та регудяторнце клетки, '

Влияние одно- к пятикратного введения препаратов ИП гепиримыунизированнкм донорам на развигие ГИО у реципиентов КСГЛ

К : Условия-опыта: Стэтиот.: ; пока'зэт.:"

АОК х 1С3 К/К2

Количество на орган

РСК х 10°

1. Контроль, £Б И

2. КСГЛ + ЗБ М 7б '

3.. Конт^икал^кр.М +б Р

Р2

4. е -АКК-ЖСГД+2Б м +б

I кр. р •.

Р2

5. Амбен I ко. +-М +б КСГД + ЗБ* р

Р1 2

'б. Контриквл 5кр.«~М +б

КСГД + ЗБ

7. £ -АКК 5Кр. КСГД + ЗБ

3, Амбен 5 кр. •КСГД + ЗБ

2

М +б

Рт р I

м ¿6

р!'

2

7.3 + 0,6

3.0 ~± 0,3 '

¿0,001

7,5 + 1,1

>0,05

-С 0,001

8.7 + 1,2

>0,05

•¿-0,001

15,7 + 1,0

4.0,001 ¿.0,001

23,6 + 3,9 4 0,001 <0,001 12,1 + 1,0 4-0,001. 4.0,001

15,0+1,4 40,001 4-0,001

ОН 1,0/2,5

1,2/2,9 2,3/5,6 4,0/9,6 1,7/4,0 2,1/5,0

21,4 + 1,9 12.9 + 1.6 4.0,001 38,6 + 3.4 4 0,001 4.0,001

27,9

,2

4.0,01 4-0,001

42,'7 х 3'9 40,001 4.0,001

•'(7,4 + Ч,'3 4 0,001 4-0,001

40,0 + 4,8 4 0,001 4 0,001

49.6 + 5,0 40,С01

К/Кг

■ 0,6 1.8/3.0

1,3/2,2 2.0/3,3 2,2/3,7 1,9/3,1 2,3/3,6

Примечание: Каждая средняя получзна в опытах ка 10 м^сзх

осляб-яя вызываемую ими антигенспеиифическуе иммуносупрессив. Зк 'JT £а к орпо va л ь ко в_И!£М£Н омощгли £у ВДее_дейотЕИе п£епа£атов__КП

Существенным недостатком КП как лекарственных препаратов являет« ся политропноегь их действия - они действуют не на одну, а на Несколько бункииоиальных систем (свертывавшую, фибркнолитичэскую, систему комплемент», калликреин-кининову» и ренинангиотензивную системы). Введение ИП в организм сопровождается возникновением побочных эф$эк toe. Следует учитывать индивидуальную чувствительность организма к действие препаратов ИП. Таким образом,введение в организм ИП имоет

ряд огоаничений. В связи с атим перспективным является экстракорпо-

i

ральши принцип применения ИП, основанный на индукции или повышении j ими функциональной активности иммунокомпетентных клзток líT^^'j с последующим ЕЕвдснио!-- стих клеток в организм (И.С.Гувдн и др., 1982) Исследовали возможность ьктракорпоргльного, опосредованного лимф» 'цитаии селезенки и периферической крови, применения препаратов ИП. как иммуномодулирувщих средств.

Проведенные нами эксперимента показали, что лимфоциты селезенки, обработанные in vitro контрикалом и £ -АПК» усиливает развитие ГИО. Обработка спленоцитов амбеном не влнлет на развитие ГИО. С целью выяснения отдельны^-популяиий клеток» участв/евих а реализации стимуляции ГИО, проводили разделение спленоцитов на КС и HUMS, обрабатывали их препаратами ИП и веоди'ли интактныи сингенным реципиентам одновременно с иммунизацией ' £Б. Полученные данные похааали, что иммуностимулирующее действие в орг кизмо реципиентов епденоцитов оказывает ПНС, обра

' ботанные in vitxo ИП. _

О

Введение сингенкым реципиентам лимфоцитов селезенки доноров, полу, чавких ^^ре'параты. ИП оказывает слабо выраженное • иммуносгимул» руввде влияние ив Г}Ю.

Нами также установлено, что лимфоцит периферической крови, обработанные контрикалом к £ —ЛКК тл введенные за три дня до иммунизации ли одновременно с иммунизацией оказывают выраженное стиму;.иру^аее лиянне на инд>к?ивнув фазу ГКО (табл.З). Инъецирование реципиентам имфоиитов периферической крови, обработанных указанными препаратами и веденных через три дня после иммунизации вызывает слабо выраленную сти-уляцию ГИО, т!е. иммуностимулирующий эффект КП в продуктивной фазе ГИО роявляется г меньшая степени. Введение кивогным-репипиентаи лимфоцитов, брабстанных in vitro амбеном, не оказывает влияния на развитие у них НО.

йнлукомодулирув^ее депсгвид препаратов Щ при их сочетанием__гШименении_с_твр£илитином__2_тер£идекбЗоя

. В литература приводятся данные о пэтсйЗвгически обоснованном приме-ении препаратов протеаз и ИП при гног.но-воопалктальных процессах Й.А.Сушко, К.Н.Веренеенко и др., I99l). При этом учитывается устодчи» ость препаратов протеаз (в частности террилитина нативного и икмобили-ованчого) к действию белковых ИЛ. Препараты протеаз и ИП применяют омбинированно в различные баэц развития воспалительного процесса, звестно, пто препараты протеаз оказывает выраженное иммуностимулиру-' нее действие (Г.Л. Чалый, и др., 1989). Нами установлено, что прэпара-ы ИП также усиливают развитие ГКО и реакции ГЗГ на тимусзависимый анти-ен. Учитывая изложенное, изучали влияние ГИО препаратов террилитиня и ерридекэзы и препаратов ИП (контрикала, Е-АКК и акбена) при их сочетай-ом применении.

Проведенные исследования показали, что одновременно одно» и трех-ратное введение опытным животным протеаз (террилитина нативного и ммобилизованного) и ИП оказывает иммуностимулирующее, действие (табл.А) репараты протеаз и ИП'вызывают адьовантный аффект, однако„ механизм erf «одинаков. Согласно данные литературы, дв&Гствив фермента опосредуется ритропитами и сывороточными факторами СГ.А» Чадыя, 1988). Иммуности-улирусщий ' эффект' Ш осуществляется , по-видимому.

« S

m

0

Сч

«

SS

О

c\ к

О

œ о

a V

Г-

tí п.

ю ÍD

to О

s:

О,

о

с

«

CM

К

X

« I o I i

ÍCI

Kl — i

Ol

SI

al CM

2! « Г \

о

я о ь а;

= ЕЗ

ф о

о, и

•н

>»т< ?

§й С-,-*

ci X

s д

US

я а 11 £.

CD О

ез.чэ ш а о* SO

íb

i m ю i ■< i

s: to

н сгз

10 У.

ь о i о с

■3- ¿r СМ mm 1—f—ч

* • IA k 00 ОО ; J IA in

с- 0 00 ОО 14 О О

и « M A * c- «* ч •0

+1 0 OO ОО О О

+1 л +1 VV % W +Í A A

VO m СМ 0

* • H *

о 1—t 00 О

со со 1—1 M СО

n n

40 ¿r OJ

*

rs\ IA и

0 C? CO s— ( -1

* «

-O- CA »—í

into нн о оО о о • '-А СО ОО СУ ОО ОО •t * * » « * ЬН f»

оэ ОО ОО о +1

+1 "+( W

- \û

л

о in

1A¡ Ol

с?! Л|

CU ON m * VA

\o с- о

+1 -HO

1Г» и c->

eu

им n oo -

OO OJ

SI

и

+ 1 +Рч

tâ Cl

ta

CM

+1 oo

ai » et lA ml C--s I l—l SI >J 21

SI I

Cl

«I i

со

CSO

+1 Cö

• lo m ил о о

» ч

+1 о о

О А ^

к с\

31 h-l +1

go со

о о win ini

lO » о о «о о I * •» О » л » »I

ОО t-< о о о О I

к га о а

Оч

о!

■<см Ю neu Х> i—) t\j ©I им® м см'О

^¡'ДчСХ, +1СЦ04 -j-fl, Ol

s +10-IPL, +Р1Р1

<Я1 col

з; I a í->

m ra I и s

of. t -s а

ч a j о

-t> с 1 S 18

о s Ä M +

О

■о

. ГЗ 4 fr, С! S X

гз s ■о а, ■«■fTta л ж га s о м « +

frei

чэ о

ti

Sät

I

cu а ■s:

»i (и

Ol

- Kl •Öi >»

0 Ol к О

a: с

CJ

и а;

i п;

О К

5 •3 3 5,

X X о

X X X

ce Ci а CS w

f* t?IQ и f' аз

О о о H

>o •о x> а

та ГЗ аз аз аз

о* а. + а. ti. tu

ю ■о о

о о о OW

s СЗ ••

« » О f* О

а a s a Э! + s

н t» СЗ f- ■ X

s s к S а

3 я s п 3 z у

ом 0 а. OW О о <о

•g-H •eí'j •е-х s

s S О s Q,

« + >=; M + ез t=:

» • • •

LA VO СО

на развитие ГИО

ил и^иш^е^ил нротеаз м ил

Условия опыта

: Статист. |похазат.

I, Контроль, ЬБ . ;2. Таррилатин + Э£

3. Террили^'ин + контрикал + ЗБ

М +6Г М

М

______________ Количество_на орган___!___

________АОК______________:_______"

_____дэнь______♦ _ ^й-ёЛНк_______1Ё_ат нм^хяи

4. Террилотин + £- АКК М +6 . + 2Б

5« Тещилитин + амбен б.. Терридеказа + сБ М

Р

Р1 М +6'

Р1 М +5

7. Торридекаэа + контрикал + ЗБ

Г1

н +е

8. Терридаказа + £ - АКК М +е

. ?! 9» Тецзидзказа + амбан М

Р1

ЗС.5

6,1

71.4 ¿0,001

76,6 + 7,8 ¿0.001

33.6 » 3.7

¿0705

63.5 * Ч,ч ¿0,005

122,7 ¿11.7 ¿0.001 135.7 ¿15.4 ¿0,001

67,2 + 5,1 ¿0,001

54,8 + 4,6 ¿0,005

2.3 2,5

I»3. 2,1 4,0

4.4 2,9 1,8

95,0 + 13,0

173.5 + 12,7 ¿0.005

149.6 + 15,6 ¿0,005

•106,4 + 10,0 >0~05

136.7 л 12.1

¿0705

169.1 + 13,0 ¿0,001

142.2 + II ;в ¿0,01

203.8 + 15,3 ¿0,005

163,1 + 13.7 ¿0,005

1.8 1.6

1.1

1.4 1,8

1.5 2.1 1.7

Примечание: Каждая оредняя получана в опытах на Ю животных.

за счет их взаимодействия о мембранными протеазаяи, участвующими е активации лимфоцитов антигенами. Б. результате, при ссчетанном применении препаратов террилитина и ИЛ мы наблюдаем выраженный иммуностиму лиру>пдий эффект.

Результаты проведенных исследований позволили предположить, что иммуностимулирующий ьффект может Сыть усилен, если ЯП вводить но одновременно д ферментом, а несколько позже, когда последний У«е успеет индуцировать появление адъмактных свойств у эритроцитов, Прзпараты ееодили по схеме 3 дня протоазы, зате:1 3 дня ИП. Установлено, что при введении препаратов по данной схеме иммуностимулирующее действие сочетанию применяемых протеаз и ИП проявлялось в индуктивной фазе ГКО и было белее выраженным, чзу при- одновременном их введении. Суммарный адыквантный эффект значительно превышал эффокт какде го препарата, применяемого в отдельности. Введение препаратов по схеме 3 дн§ ИП, затек 3 дня протеазы оказывало какое выраменное стимулирующее влияние на ГИО.

Полученные данные свидетельствует о целесообразности использован* комбинированного введения препаратов террилитина и ИП при отсроченнс применении ингибиторов для усиления иммунного ответа в эксперим&н те и испытания данной схемы в клинике..

Ккмуьомодулируецее и протективное действие препаратов ИП

при__кежоторух формах__экспериментальной патологии.

Иммуностихулируссеэ влияние препаратов ИП на гуморальное и клею* нов звенья иммунного ответа в условиях иелестного организма, .стимулир »«ее дегстие ИП на функциональную активность изолированных иммуно компетентных рлоток позволили исследовать препараты контрикал, £ -АКК и амбен как икмуноьодуляторы при патологических состояниях, сопровождавшихся втормчны-иимкунодефицитами.

В качество одной из таких .дорм патологии била использована .модель «• строго панкреатита. Лрзпарать; природных :i синтетических ИП ироко с пользуетея в комплексной торапик острого панкреатита (K.F .Взренэан- | о, A.C. Сыновей и др., 1985). В патогенезе дан:.ого заболевания. сумеет-енпуа роль играет изменение иммунологической реактивности организма иммуномодулирукшее влияние активируемых при дэпнпп $орме патологии ротзаз и их ингибиторов. При остром панкреатита снижается интенсив-ость первичного и вторичного иммунного ответа но тимусзагисикы^ анти-ен. Б основе угнетения иммунного ответа- хеыит изменение миграционной активности. Т-лимфоцитов, вызываемое гуморальными и кетзболи-ескими' нарушениями и повысанич количества и активкост:1 'Т-супрессоров С.К.Вольбри, 1985; IS87). При указанной форме патология изменяйся !3аимоотно"!8г1ия в системе птотеазы-УЛ; в период развития заболевания :роисходит пориюнио активности трипсина сыворотки крови параллэль-:о с менее.зараженным нарастанием активности (H.A. 5ыстрова,1?50).

Воспроизведение ОП в скспер^меите приводит к сукесгвенноку узе-

[иченио обсей протеолитической активности крови, а г.'аккз активности

^т-ИП я oL-^M. Учитывая изменение активности компонентов системы [ротоазы-аптипротоазы при ЗОЛ, практический интерес представляет изу-

юнвр возмовпости применения Ш в качестве иммунокоррегиру юцих ерздетв

\

|ри данной форме патологии.

Нами установлено, что препараты КП при пятикратном их введении о tepEHX суток после воспроизведения ОП, нормализуют развитие ГКО, «датированного ¿Б спустя 24 часа после операции. Вместе с тем, [ропэраты КП снимет активность антипротеаз, не изменяя при этом 'бщую протеолитичоскую активность сыворотки хрови животных. Этот эффект ИП СЕИДутуаютвует о возможности их влияния на развитие ГИО а только путем ипгибирования протеолитичвеких ферментов».но и 'следствии угнетения активности антилротэаз. которые, как известно, i6 лада от юыунооупрессириьми свойствами.

Применение ЯП о седьмых суток посла воспроизведения ОП не влияв! на ГИО, индуцированный 2Б через семь суток после операции. Вероятно к этому периоду развития ОП механизм иммуносупрессии, прерываемый препаратами ЯП, оказывается полностью сформированным.

Результаты проведенных экспериментов обосновывает применение препаратов ИП хак иммуномодуляторных средств при СП с учетом стадии развития патологического процесса.

Известно, что патогенные микроорганизмы и вирусы мвгут активно воздействовать на иммунную систему организма, угнетая ее и даке отмен) формирование иммунного ответа, вызывая том самым вторичную иммунологическую недостаточность (А. .Метин и др., 1533; В.В.Смирнов и др., 1959). Возникновение эторичных имуунодефицитов может быть потет ровано примэняемыкипри инфекционных процессах фармакологическими препаратами, в том числе, антибиотиками и салицйлатами. Поэтому в настоящее время неспицифические иммуностимуляторы, прежде оцениваемые как вспомогательные средства, рассматривает в качестве средств профилактики и терапии инфекционных заболеваний» Данные литературы свидетельствуют о действии ИП на биологичесхие свойства и чувствительность стафилококков к антибиотикам. В присутствии ЙГ. значительно снижается частота образования патогенных ферментов стафилококком и повышается чувствительность к антибиотикам (А.С. Сыновей и др., 1935). Препараты ИП активирует фагоцитоз» Учитывая иммуностимулирующее дейзтвио препаратов ИП при введении их здоровым животным ослаблявшее влияние ИП на антигенспепифическую ихмуносупрессию, обусловленную гапе; иммунизирующей дозой антигена, исследовали протективное действие препаратов ЙП при стафилококковог инфекши:. Установлено, что контрикал, £. - АКК и амбек при трехкратном их введении г.овывают выживаемость и .увеличивает продолжительность жизни инфицированных стафилококком мышей (табл.5). Следует отметить, что протэхтиЕнсе действие ИЛ болев вправе-но при введении их до инфицирования животных.

слияние препаратов ии на выживаемость и предолкитвдьнмет» ¡»ианк инфицированных стафилококком мышей

К: . Условия Опита [е/к5 • Ч;,2Л0 павних иксе я ^Количество '.Средняя

. /ело вия опьта :с/к .-р-----1---т---г—г—:---г----—Ьык._удаей продолжит.

______;___:кл. ; I ) 2 : Э { м 5 ? б I 7 .' В I 9 У юЬбс. i в %___;Я"зн..,дни^

1. Инфицирование ^хГо5 18 2------ - - 0 0 5,1 "

2хЮ9 14 2 2.......2 10 1.3

2. 0,15М »аС1+ . 4хЮ9л 14 42------ - 0 0 ' 0,3

инфицированиз 2 х109 1<1г2------ 2 10 1 3

3. Конгрика'л Э кр. 4хЮ9 I 2 - -- -- - - - 17 65 8,6 + инфицирование 2х109 .........--20 100 10

4. е.АКК 3 кр. Щ09 13 5 - - -- -- - - 2 Ю 1,25

+ инфицирование 2х109 _ 1 _ . & 95 9,55 «

5. Акбен 3 кр. + 4x10"' 82-1---- - - 9 45 4;75 • инфицирование ¿х1С9 _ х „•....... 19 95 9.55

6. Инфицирование ♦ 4хЮ9 20--- ---- - - 0 О О кон*рикал 3 кр. 2x10 10.....I - - - 9 45 4,6

7. Инфицирование «• 4хЮ5 17 I------ - - 2 10 1,05

£-АКК 3 кр. 2x10® ю 2 ------ - - 6 40 4,1

б. Инфицирование ♦ 4хЮ9 20 О О

акбен 3 кр. гх109 п 5........20 2)25

Примечание: В какдой опытной групп® 20 жиьотных.

Протек? ив коз действие Ш, вероятно, и значительной степени обусловлено их ста ку лиру пд;::; влияние:-: на ГКО и ГЗТ. Je исклсчено, что активизация VZ иагоцитар::ор активности лейкоцитов периферической крови так^е имеет значение а проявлении протекткьного действия КП.

Б гаклечение елгдует отметит», что выявленное нами иикуностлмулиру-stioe действие препаратов ИТ в норме и при патологии, ослабление под их влиянием янтигс.кспвииф;:ческой иммуносупрзссии, стимулирукжее влияние контрикгла, £-~ АКл и аибена на пзолировамнь'з имкунокэкпатентные клетки, данное о стимуляции ГШ npi: комбинированном лримзнг.чик претеаз у, ИЛ представляют собой эксгеринентальн'ув оснсзу для разработки рационально;" тактики применения препаратов КП и терапии заболеваний, сопрововда-скахся каруиенизм иммунологического и структурного гоиеостаза организ-г.з человека как традиционным, так и принципиально новым, зкстракоспорал н»к способом фармакотерапии.

3 К В О Л U

1. Препараты ИП ( контр i: кал, й-АКК к амбен) при одно- и пятикратном их применении стимулируют развитие ГИО на тикусзависимый антиген ССЕ), но не влияет на развитие ГИО, индуцированного тикуснолагисимк:-: антигеном СЛПС). Контрикал и ¿-ЖК усиливает выраженность реакции ГЗТ при' вваде-1 кип их одновременно с сенсиылизируюкая дозой ЗЕ. Амбек стимулирует развитие Гй? при инъг цировакии его одновременно с разрежавшая дозой антигена.

2. Одно- 'и пятикратные инъекции ЙП гиперикнунизированны:! донорам сллзноиитоЕ оказкзавт угнетающе действие на формирование и функциональ нук активность популяции Т-хлеток-супрессоров. При введении контрикала г£-ЛКК и амбекэ реципиентам клеток селезенки гиперидаунизированных до-коров, ИП влилет'на ¿рвлые Т-супрэссорк, ослабляя вызываемую ими енти-

. гонспаиийическуа имкуносупрэссив.

3. Спленоииты, обработанные ia vitro контрика лом и &--АКК, оказывай иммуьос лтудируккее действие в организма сингенкых роиВпяанхоЕ. мхкуностимуляиио. в организме рецчг.иентов вызывает при липе ьпиз клетки селезенки, обработанные ИП. Обработка сплечоцитов амбалом не влияет

'азвитив ГИО у реципиентов. Лимфоциту периферической крови, обрабо-ые*п vitro контрикалон и к. АНК, окаэцваст выраженное стимулирую-влияние на индуктивную фазу ГКО и менее вырэкено етимулируте про-'ивную фазу ГИО.

1ри одноврйманном однократном зводэнии опытным животным протеаз >рнлитина и терридеказы) и ИП (контрикала,£ - ЛКК и амбена) найлю» ^ся выраженный иммуностимулирующий эффект. Одновременное "жрехкратног «енение протеаз и ИП оказывает стимулирующее действие на индуктив-фазу ГИО. Введение препаратов по схеме 3 дня протвазы, зате;: Здня

оказывает стимулирусадо влияние на индуктивную фазу ГИО. При юани- препаратов по схеме 3 дня ИП, затем Э дня протеази стимули-аее действие на индуктивную фазу ГКО носит менее выраженный харак-

в

1ятикретноэ введение контрикала, б. - ЛКК и амбена е первых суток не воспроизведения эксперименталзного острого панкреатита (т.е. в у повышения протоолитическои активности сыворотки крови) вызывает чалиэаиис иммунного ответа, индуцированного 2Б спустя 24 часа после раиии. При введении указанных препаратов ИП с седьмых суток после произведения острого панкреатита, они не оказывают влияние на раэви* ' ГИО, индуцированного 2Б в день первой инъекции ИП. Контрикал.е- АКН и амбен, еказывает протективнве действие при $илокаовой рнфекиии, повышая выживаемость и увеличивая продолжите-ойть кизни инфицированных стафихскокком кыией. Более выражено тективное действие препаратов ИП при введении их до инфици-ания животных.

РАБОТЫ, ОПУБЛККОВШЬБ ПО ТО!Е ДИССЕРТАЦИИ Возможное?!? экстракорпорального применения протеаз //Первый Всесоиз-иммунологический съезд: Тез. докл. Москва, 1989 -T.I. -С 396 авт. Г.А. Чалый,)

йшуномодулирусщие свойства препаратов протеаз медицинекого назнамя и их ингибиторов // 14-й Менделеевский съезд по обило и прикладной

химии: Реф. дохл, и сообщ. Москва.1969 - Т.Ь - С.507 ^соавт.Г.А.Чал Л.П. Чалая, Е.В. Королева).'

3. Иммунонодулирусцее и протективное действие препаратов ингибиторов

протес:» при экспериментальном остром панкреатите и стафилококковой

инфекции //Рукопись дел. в ВИНИТИ 26.03.SI К I325-B9I, Курск, 1991-.!

Ссоавт. Г.А. Чсзлый, В.Б. Бз-'.ьские).

Имкунокодухирусщее дояствие препаратов ингибиторов протоаэ'првро,

кого и синтетического происх'оадения //Рукопись дел. в ВИНИТИ 23.03.9,

As I326-B9I, Курск, IS9J - 15 ß (еоавт. Г.А. Чалня, С.А. Лсбвноаа).

5. Влияние ингибиторов протеаз на гнтигенсг.еиифичоокус икмуносупресс

// Актуальные вопросы фаркаиевтической науки »практики: Таз, докл.

научно-практической конференции, посвявенкс|1 25. лети с фарк.ф-та КГМИ

Курск, 1991-ч.П - С. 191-195 (соам. Г,А. Чалый). , f •

о. Иммунокодулируювде действие ингибиторов протеаз ар» постт|авматич

кой форие панкреатита и острой токсическое гзсатопатия // Актуальны

вопросы фаркаиэвтичзокой науки и практики: Тез.дэкл.научно-прахтичес л»

конф., посвяЕеннсй 25-летию фарм.ф-та ШШ, Курск, .1991 - ч.П -C.I99 (соавт, Г.А. Чалыд, Jt.n. Чалая). . ' .

7. Км«укомодуотрукцэе и проективное действко препаратов ингибитора?

протеаз в корив и при стафилококковой шфекфги //Всесоюзная конферв» * *

по химиотерапии; Тез. дохл.Москва, 1991 « С* 372-373 (соавт.Г.А.Чаль Х,П. Чалая). ' '

5. Влияний протеза и»,вн?илротерэ на* иммунный ответ к тнмусзависикса антигену // Актуальные.вопроси фариацовтической науки.и практики; Т< докд, неучно-практичеокой конф., посвяадиноя 25-.1етив фарк.ф«та КП Курск, 1991 -ч.П.-С.201-202 Ссоавт. Г.А.Чел«1 , Л. П.Чалая). ' _ 9. ]:;:мунокодудирусвий эффект ингибиторов протеаз л. норме и при. ijocti виатаческой фэру-а панкреатита //Научная к>знф. "Состояние и перспект! развития фармации в Сибири и не Лвяъкьи Востоке". Томск, IS9I - С.7; Ссоавт. Г.А. Чадкй).