Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунотропные свойства синтетических пептидных производных белков фетоплацентарного комплекса человека
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.03.09
Автореферат диссертации по медицине на тему Иммунотропные свойства синтетических пептидных производных белков фетоплацентарного комплекса человека
На правах рукописи
МАКАРОВ ТИМОФЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ
Иммунотропные свойства синтетических пептидных производных белков фетоплацентарного комплекса человека.
14.03.09.- Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
904606251
МОСКВА-2010
004606251
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Салмаси Жеан Мустафаевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, Козлов Иван Генрихович
профессор
доктор медицинских наук, Лусс Людмила Васильевна
профессор
Ведущая организация:
Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова» Росздрава
Защита состоится «_»_2010 г. в_часов
на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» 117997 Москва, ул. Островитянова д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997 Москва, ул. Островитянова д.1.
Автореферат разослан
« »_2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова.
Общая характеристика работы.
Актуальность исследования. Современная медицинская наука развивается высокими темпами, и достигла значительных успехов. Раскрыты многие звенья патогенеза иммунопатологических заболеваний и получены лекарственные средства, позволяющие эффективно контролировать развитие клинических симптомов. Однако современные методы лечения аллергических и аутоиммунных заболеваний недостаточно эффективны и практически не влияют на патогенетическую основу данных заболеваний [Грачева Л.,1997; Чучалин А.Г., 1995]. В тоже время, современная биотехнология позволяет получать вещества заданного состава и с необходимыми свойствами [Халимская Л.М., 2000]. Синтетические вещества отличаются от природных постоянством химического состава и отсутствием необходимости использовать донорский материал. В настоящее время создано большое количество синтетических иммуноактивных пептидов: гепон, вилон, бестим и другие. Они созданы на основе естественных тимических пептидов и обладают заметным иммунорегулирующим действием. Однако они чаще применяются при лечении острых и хронических инфекций [Оковитый С. В., 2005], так как обладают иммуностимулирующими эффектами. Следовательно, возникает необходимость поиска новых иммуноактивных веществ, которые могут применяться для лечения иммунопатологических состояний.
Имеется ряд наблюдений, что в третьем триместре беременности у больных иммунопатологическими болезнями (ревматоидный артрит, ревматизм, тромбоцитопеническая пурпура, рассеянный склероз) наблюдается развитие ремиссии. Это связывают с эффектами фетоплацентарных белков [Кузник Б.И., Васильев Н.Б., 1998]. Получение и применение фетоплацентарных белков природного происхождения имеет ряд существенных трудностей: поиск донорского материала, нестабильность химической структуры и возможность парентеральной передачи вирусов [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003].
В последние годы появились работы, в которых показано наличие иммуномодулирующих свойств, присущих нативным фетоплацентарным
белкам, а также синтетическим пептидам, содержащим определенные пептидные последовательности фетоплацентарных белков. На кафедре биохимии РГМУ профессором Терентьевым A.A. в молекулах АФП и ТБГ были определены пептидные последовательности, которые согласно теоретическим представлениям должны отвечать за ограничение активации иммунной системы.
В лаборатории кафедры патологической физиологии РГМУ ранее исследовался синтетический аналог белка АФП, были получены данные о его влиянии на пролиферацию лимфоцитов [Казимирский А.Н. и соавт., 1999]. Позднее были проведены исследования влияния белков АФП и на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов, активационные процессы в культуре клеток больных АБА [Казимирский А.Н., 2003], где было показано снижение клеток с экспрессией ранних активационных маркеров. Затем, было выдвинуто, предположение о наличии активных центров в нативных молекулах АФП и ТБГ. Позже были выделены и синтезированы полипептидные последовательности, предположительно отвечающие за иммунотропные эффекты АФП и ТБГ [Терентьев A.A., 2001].
Необходимость прицельно изучить иммунотропные свойства синтетических пептидов аналогов белков АФП и ТБГ, которые могут стать новыми средствами для лечения иммунопатологических и аллергических заболеваний человека, обосновало выбор направление исследования. Цель работы. Исследовать иммунотропное действие синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса (БТК) человека, на экспериментальных моделях. Задачи работы.
1. Изучить действие синтетических аналогов пептидов БТК человека на изменение количества лимфоцитов экспрессирующих поверхностные маркеры здоровых доноров in vitro.
2. Изучить действие синтетических аналогов пептидов БТК человека на изменение количества лимфоцитов экспрессирующих поверхностные маркеры больных ревматоидным артритом in vitro.
3. Изучить действие синтетических аналогов пептидов БТК на изменение количества лимфоцитов экспрессирующих поверхностные маркеры больных атопической бронхиальной астмой in vitro.
4. Исследовать влияние синтетических аналогов пептидов БГК человека на анафилактическую и медиатор-индуцированную контрактуру гладких мышц in vitro.
5. Исследовать влияние синтетических аналогов пептидов БТК человека на развитие сенсибилизации морских свинок.
Научная новизна исследования.
Диссертационная работа посвящена исследованию иммунотропных свойств ранее не изучавшихся синтетических пептидов, производных БТК человека.
Впервые изучено влияние пептида АФП14.20, пептида V, пептида Q, пептид СЕА, пептида Е на изменение количества клеток несущих ранние активационные маркеры (CD25, CD71), поздние активационные маркеры (HLA-DR, CD95) при культивировании лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, больных ревматоидным артритом.
Впервые изучено влияние пептида V, пептида Q, пептид СЕА, пептида Е на изменение количества содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+), NK-клеток (CD16+, CD56+), В-лимфоцитов (CD20+), изменения количества разных форм дифференцировки В-лимфоцитов (CD72+, CD23+, IgM+, IgG+) при культивировании лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, больных ревматоидным артритом. Показана способность всех исследованных пептидов аналогов БТК человека снижать содержание Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), цитотоксических лимфоцитов (CD8+) при культивировании лимфоцитов здоровых доноров.
Впервые исследовано действие синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей БТК человека на развитие экспериментальной анафилаксии и медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц.
Впервые показано, что пептиды АФП14.20, V, CEA, Е не влияют на развитие медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морской свинки под действием ацетилхолина и гистамина. Была выявлена способность пептида Q, увеличивать медиатор-индуцированную контрактуру гладких мышц морской свинки к ацетилхолину и снижать медиатор-индуцированную контрактуру к гистамину.
Впервые была исследована и охарактеризована, способность пептидов аналогов БТК человека влиять на развитие сенсибилизации in vivo. Показано, что пептид АФП14.2о способен усиливать сенсибилизацию морских свинок.
Полученные результаты, позволяют охарактеризовать иммунотропные эффекты синтетических пептидов аналогов БТК человека.
Практическая значимость работы. Предложен способ оценки иммунотропных свойств пептидов при культивировании лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, больных ревматоидным артритом, включающий широкий спектр антигенных маркеров. Полученные данные расширяют представления о взаимосвязи структуры и функции пептидов. Показанные иммунотропные свойства исследованных пептидов позволяют рассматривать их в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
Положения, выносимые на защиту. 1. Синтетические пептиды, аналоги некоторых пептидных производных белков трофобластического комплекса оказывают иммунотропное действие на лимфоциты здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, ревматоидным артритом.
2. Пептид АФПн-20 и пептид Е, in vitro в исследованных моделях, уменьшают количество клеток зкспрессирующих ранние активационные маркеры (CD25, CD71) больных иммунопатологическими заболеваниями.
3. Пептиды, синтетические аналоги белков ТБГ - V, Q, СЕА подавляют Т-клеточное звено (CD3, CD4, CD8) иммунной системы больных иммунопатологическими заболеваниями.
4. Синтетический пептид АФПн.2о усиливает сенсибилизацию.
5. В условиях in vitro пептид Q, способен усиливать действие ацетилхолина и значительно снижать эффект гистамина на гладкую мускулатуру тонкого кишечника морской свинки.
Внедрение результатов исследования. Полученные результаты используются в учебном процессе и научной деятельности кафедры патологической физиологии и кафедры биохимии РГМУ.
Апробация работы.
Материалы диссертации представлены на конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины, (Москва, 2003), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006). Основные положения диссертации доложены на совместной научно-практической конференции кафедры патофизиологии и кафедры биохимии ГОУ ВПО РГМУ от 13.02.2007. Также материалы диссертации представлены на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе три в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, включает в себя введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, заключение,
выводы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 16 рисунками. Обзор литературы содержит 190 источников, из них 59 отечественных и 131 зарубежных автора.
Материалы и методы исследования.
В работе представлены результаты исследований на лимфоцитах периферической крови 10 больных атопической бронхиальной астмой, 10 больных ревматоидным артритом, и 9 здоровых доноров. Всего проведено 196 исследований, каждое из которых включало определение 16 поверхностных маркеров лимфоцитов
Для проведения нашего исследования были отобраны здоровые доноры в возрасте 19-22 года. Всего мы исследовали субпопуляционный состав лимфоцитов у 9 здоровых доноров. Все обследованные доноры не страдали аллергическими, иммунопатологическими и хроническими воспалительными заболеваниями. Последнее острое заболевание завершилось не менее, чем за два месяца до проведения исследования.
Группа больных атопической бронхиальной астмой (сенсибилизация к пыльце растений) состояла из 10 человек, мы проводили наше исследование в приступный период заболевания (апрель-июнь). Диагноз был подтвержден данными анамнеза, клинического обследования и лабораторных данных (кожные пробы, титр антител). При постановке кожных проб была выявлена поливалентная сенсибилизация к пыльце деревьев и трав, продуктам питания. Среди этиологически значимых аллергенов были выявлены: дуб, подсолнечник, рожь, ежа сборная, амброзия, полынь, одуванчик, береза, овсяница, ольха, клен, ясень, мятлик, райграс, фундук, яблоки, груша. Все обследованные пациенты получали базисную медикаментозную терапию: кромогликаты, антигистаминные препараты, {3-адреномиметики, М-холиноблокаторы. Степень тяжести заболевания (средне-тяжелая) и период (приступный) были подтверждены на основании критериев классификации бронхиальной астмы [ОИЛ, 2003]. Для купирования приступов не применялись кортикостероидные препараты.
Группа больных ревматоидным артритом включала в себя 10 больных. Диагноз был подтвержден данными анамнеза, клинической картиной, данными инструментальных (рентгенография) и лабораторных исследований (ревматоидный фактор, С-реактивный белок). В исследование были включены как серопозитивные, так и серонегативные пациенты. Все обследованные больные находились в стадии обострения заболевания и получали соответствующую терапию: нестероидные противовоспалительные препараты, протекторы хрящевой ткани, хондроитинсульфаты, витамины и общеукрепляющие средства. Терапия этих больных не включала стероидные противовоспалительные и цитостатические препараты в период не менее 6 месяцев до проведения нашего исследования.
Определение содержания в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих поверхностные маркеры: CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD20, CD72, CD23, IgM, IgG, CD25, CD71, HLA-DR, CD95 оценивали с помощью моноклональных антител («Медбиоспектр», Москва; «Сорбент» Москва) в реакции непрямой иммунофлюоресценции (микроскоп «Люмам-ИЗ»).
Лимфоциты культивировали с синтетическими пептидами, аналогами некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса человека (таблица 1), в течении 16 часов. Для оценки жизнеспособности лимфоцитов проводился тест с трипановым синим.
Таблица 1.
Аминокислотные последовательности исследованных пептидов.
Исследованные пептиды Аминокислотная последовательность
АФПн-20 14- Leu-Asp-Ser-Tyr-Gln-Cys-Thr - 20
Е 213-Рго-Туг- Glu- Cys- Glu -217
Q 306-Pro-Tyr-Gln-Cys- Glu -310
V 391-Leu-Tyr-Val-Cys-Ser-395
СЕА 71-Ser-Tyr-Lys-Cys- Glu -75
Синтетические пептиды получены методом твердофазного синтеза в лаборатории синтеза пептидов Кардиологического научного центра РФ.
Препарат микроскопировали в водной иммерсионной системе с использованием люминесцентного микроскопа "Люмам И-3". В каждой лунке считали не менее 200 клеток, исключая клетки с морфологией моноцитов, затем вычисляли процент клеток несущих соответствующие поверхностные маркеры.
На животных моделях была проведена серия экспериментов. Сенсибилизацию животных вызывали трехкратным, с интервалом в 1 сутки, введением антигена - яичного альбумина (ЯА). ЯА вводили в неполном адъюванте Фрейнда по 2 мг на животное (8 мг белка/кг массы тела). С первого дня индукции сенсибилизации подопытным свинкам ежедневно, в течении 21 дня, внутримышечно вводили пептид АФП14.2о (8 животным) и пептид Е (8 животным) в дозировке таким образом конечная концентрация
составила за счет объема распределения. Выбор дозы был обусловлен
ранее проведенными исследованиями [Терентьев A.A., и соавт. 2003]. Опыты проводились на 21 сутки от начала сенсибилизации на 1,5 см. отрезках подвздошной кишки морских свинок. Отрезки подвздошной кишки прошивали с обеих сторон и помещали в термостатируемую ванночку для изолированных органов объемом 10 мл при 37°С и постоянной аэрации. Сократительную реакцию гладкомышечных органов вызывали дигидрохлоридом гистамина фирмы Merck в концентрации 0,1 мкг/мл и регистрировали в изометрическом режиме с помощью механотрона на самописце. После получения устойчивых контрольных реакций в ответ на действие гистамина в раствор Кребса вносили яичный альбумин в конечной концентрации 0,1 мкг белка/мл.
Исследование медиатор-индуцированной и анафилактической контрактуры гладких мышц морских свинок проводили на отрезках кишки, полученных от интактных животных. В ванночку с отрезком подвздошной кишки морской свинки добавляли пептиды: АФП14.2о, Е, СЕА, Q, V и фиксировали изменение сократительной активности при помощи механотрона. Добавление пептидов не вызвало развитие контрактуры. После отмывки в ванночку добавляли гистамин и после повторной отмывки раствором Кребса ацетилхолин. Величину полученных кривых сравнивали с амплитудой кривых
после добавления ацетилхолина и гистамина без предварительного введения пептида, эти значения были приняты за 100%.
Статистические методы обработки полученных результатов.
Статистическая обработка выполнена пакетом прикладных программ 8ТАТ18Т1КА 5.1. Для статистической оценки был применен параметрический метод, так как было обнаружено нормальное распределение признака в изучаемых группах и равенство дисперсий. В таблицах приведены средние значения изучаемого признака и его стандартное отклонение.
Результаты исследования и их обсуждение.
В эксперименте на животных мы смогли изучить действие пептидов на развитие сенсибилизации и влияние пептидов на контрактуру гладких мышц, вызванную гистамином, ацетилхолином и антигеном.
Исследование на клеточных моделях, позволило выявить и охарактеризовать иммуноактивные свойства у синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса.
При воспроизведении анафилактической контрактуры гладкой мускулатуры тонкого кишечника, было выявлено, что пептид Е не влияет на развитие сенсибилизации у животного. В тоже время у морских свинок, получавших пептид АФП14.20, анафилактическая контрактура гладкой мускулатуры тонкого кишечника значительно превышала показатель контрольной группы. В группе животных получавших пептид АФП14.2о произошло достоверное (р<0,00009) увеличение амплитуды анафилактической контрактуры гладких мышц, по сравнению с контролем, ее величина составила 128,25±6,14% от контрактуры вызванной гистамином. Следовательно, пептид АФП14.20 при парентеральном введении совместно с антигеном способен усиливать сенсибилизацию подопытных животных, что приводит к изменению степени выраженности контрактуры гладкой мускулатуры в ответ на введение значимого антигена. Можно предположить, что подобное явление может
иметь в своем патогенезе несколько механизмов. Которые связанны с влиянием на гладкую мускулатуру, тучные клетки или иммунную систему.
Можно предположить, что под влиянием пептида АФП|4_2о имеет место увеличение плотности рецепторов к гистамину на мембране гладкомышечной клетки и, следовательно, увеличивается ответ на внешние спазмогенные стимулы. Однако в ответ на введение разрешающей дозы гистамина увеличения амплитуды кривой не отмечалось, что позволило исключить данный механизм увеличения контрактуры.
Таблица 2.
Изменение медиатор-иидуцированной контрактуры гладких мышц морских свинок при добавлении синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса человека.
Исследованные пептиды Величина амплитуды в %
По отношению к гистамину По отношению к ацетилхолину
Контроль п=14 100 100
Пептид АФП м-20 п=7 93,97±4,66 94,97±6,88
Пептид Е п=7 104,07±4,94 103,45±6,66
Пептид <2 п=7 69,78±8,13* 116,56±9,20*
Пептид V п=14 105,43±6,59 100,56±6,81
Пептид СБА п=14 108,14±6,53 87,89±6,87
Примечание: ♦-р<0,05.
Результаты эксперимента по изучению медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морской свинки представлены в таблице 2.
Полученные данные убедительно показывают, что все исследованные пептиды не обладают спазмогенной активностью и не влияют, кроме пептида <3, на выраженность контрактуры гладких мышц при добавлении гистамина и ацетилхолина. Пептид <3, единственный из исследованных пептидов, приводил к изменению амплитуды кривой после добавления гистамина и ацетилхолина. Следует отметить, что пептид снижал амплитуду кривой при добавлении
гистамина и, напротив, увеличивал указанный показатель при добавлении в ванночку ацетилхолина.
Исследование иммунотропного действия пептидов на клеточных моделях in vitro мы начали с изучения изменения количества лимфоцитов экспрессирующих исследуемые маркеры на клеточной модели здоровых доноров. Выбранные антигенные маркеры лимфоцитов позволяют количественно охарактеризовать популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов, а также оценить состояние активационных процессов в иммунной системе.
Все исследованные пептиды у здоровых доноров снижали содержание Т-лимфоцитов, за счет однонаправленного изменения численности CD4+ клеток и CD8+ (Т-цитотоксических лимфоцитов) (таблица 3).
Таблица 3.
Изменение популяционного и субпопуляционного состава Т- лимфоцитов
здоровых доно ров после культивирования с пептидами.
Исследованные количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
пептиды CD3 CD4 CD8 CD16 CD56
Контроль 66,71±1,32 39,40±1,34 27,33±1,24 14,08±0,96 5,79±0,60
АФПн-го п=10 45,12±0,63* 11,82±0,42* 17,14±0,62* 8,32±0,70* 4,32±0,46
Еп=10 46,73±1,46* 17,65±1,87* 18,41±0,95* 7,24±1,04* 6,22±1,27
V п=10 53,90±1,75* 11,42±1,02* 16,40±1,17* 6,96±1,06* 5,96±0,53
Q п=10 48,84±1,74* 12,07±1,19* 15,02±1,52* 9,90±1,46* 6,24±0,83
СЕАп=10 34,40±0,61* 9,92±1,25* 10,67±0,86* 5,54±0,65* 5,59±1,42
Примечание: *-р<0,05; достоверность различий указана по сравнению с
контролем.
При детальном анализе описанных изменений выяснилось, что сумма С04+ клеток и СБ8+ клеток, превышает общее количество Т-лимфоцитов (СОЗ+). В соответствии с литературными источниками подобное явление можно объяснить активацией Т-лимфоцитов при ограничении их пролиферации вне тимуса, или гибелью некоторой части лимфоцитов [Казимирский А.Н., 2002].
На В-лимфоцитарное звено здоровых доноров оказали влияния только два, из всех исследованных пептидов: пептид СЕА и пептид АРР14.20 (таблица 4). На количество В-лимфоцитов (СБ20+) оказал влияние пептид АРРн.20, уменьшив их содержание в культуре клеток. Пептид СЕА снизил содержание В-лимфоцитов (СБ20+) и их активированных форм (СЭ72+).
Таблица 4.
Изменение содержания В-лимфоцитов и их основных форм дифференцировки здоровых доноров после культивирования с пептидами.
Исследованные пептиды количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
С020 СЭ72 ígM
Контроль 8,58±0,97 4,91±0,77 6,94±0,71 7,36±0,59
АФПм.20 П=10 6,10±0,21* 3,26±0,47 5,93±0,68 6,19±0,59
Е п=10 7,76±1,17 4,34±0,70 6,49±1,43 6,09±0,81
V п=10 9,48±1,08 5,31 ±0,70 7,61 ±0,53 6,21 ±1,02
(2п=10 7,01±1,15 4,47±0,61 6,00±0,98 6,53±1,25
СЕА п=10 4,88±2,51 5,50±1,30 1,76±0,50* 2,01±0,98*
Примечание: *-р<0,05; достоверность различий указана по сравнению с
контролем.
На экспрессию активационных маркеров лимфоцитов здоровых доноров оказали влияние пептид СЕА, пептид V, пептид АФПм-го- Пептид СЕА уменьшил количество С023-позитивных клеток и зрелых лимфоцитов (НЬА-
Пептид АФП14.20 увеличил содержание зрелых лимфоцитов, не изменив численность клеток, готовых к активационному апоптозу (СВ95+). Под влиянием пептида V произошло увеличение количества лимфоцитов с экспрессией раннего активационного маркера СБ25 рецептора (таблица 5). Таким образом, под влиянием описанных пептидов у здоровых доноров происходит: снижение общего количества (СШ+) и субпопуляций Т-лимфоцитов (С04+ и С08+).
Пептид СЕА и пептид АФПн.го оказали воздействия на В-клеточное звено. Пептид Е несколько увеличивает показатель пролиферативной активности, а под влиянием пептида СЕА, напротив увеличивается склонность
к элиминации лимфоцитов, подтверждением чему, служит значительное снижение содержания Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов (рисунок 4).
Затем были проведены эксперименты с культивированием лимфоцитов, полученных от больных АБА и РА, в присутствии пептидов. При анализе полученных результатов, оказалось, что исследованные пептиды можно разделить на две группы, по влиянию на количество клеток с экспрессией активационных маркеров. В первую группу вошли пептиды АФПи-го и Е, они снижали количество лимфоцитов, несущих ранние активационные маркеры. Во вторую группу вошли пептиды: СБА, V, р. Пептиды второй группы не оказали столь выраженного влияния на количество клеток с экспрессией ранних маркеров активации.
Таблица 5.
Изменение содержания лимфоцитами экспрессии ранних и поздних активационных маркеров, здоровых доноров после культивирования с пептидами.____
пептиды количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
CD23 CD25 CD71 HLA-DR CD95
Контроль 4,41±0,47 4,35±0,45 4,23±0,56 10,37±0,31 6,50±1,11
АФПМ-2О п=10 4,32±0,74 5,08±0,46 4,44±0,63 12,44±0,83* 8,21±0,98
Е п=10 4,94±0,87 5,44±1,01 3,98±0,68 9,87±1,23 4,50±0,67
V п=10 5,67±0,56 6,37±0,59* 5,10±0,57 12,53±1,23 8,65±1,43
Q п=10 5,22±0,73 5,35±1,08 3,70±0,55 9,83±1,05 8,88±1,19
СЕАп=10 2,81±0,23* 0,98±2,34 3,67±1,28 2,48±2,69* 6,25±1,59
Примечание: *-р<0,05; достоверность различий указана по сравнению с
контролем.
При культивировании с пептидом АФП|4.20 и пептидом Е у больных АБА произошло снижение численности CD3-положительных клеток (таблица 6). Данное снижение произошло вследствие однонаправленного изменения количества клеток с поверхностным рецептором CD4 и CD8.
У больных РА более значительное снижение общего количества Т-лимфоцитов (CD3+) сопровождалось снижением количества хелперов (CD4+) и цитотоксических лимфоцитов (CD8+) (таблица 7). Под действием пептида
15
АФП н-20 и пептида Е в обеих группах больных произошло значительное снижение содержания С020+, СБ72+ клеток вплоть до нормальных показателей.
Таблица 6.
Характеристика состава поверхностных маркеров лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой после культивирования с пептидом АФП 14_2о и пептидом Е._
количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
маркеры АБА до культивирования Пептид АФП14-20 п=10 Пептид Е п=10
Т- лимфоциты СОЗ 58,09±0,94 40,02+1,14* 45,12±1,24*
С04 36,05±1,05 18,70±1,27* 23,38±1,28*
СИ8 24,25±0,91 12,64±0,90* 13,48±0,23*
ЫК-клетки С016 15Д5±0,66 7,35±0,90* 7,59±0,89*
С056 15,10±0,73 8,93±0,57* 5,52±0,76*
В- лимфоциты СОЮ 19,01 ±0,4 5 13,44+0,98* 9,01±0,56*
сои 17,28±0,78 4,72±0,60* 9,34+0,80*
Ранние активационные маркеры С023 19,97±1,25 18,83±0,56 24,71±1,04*
СТО 5 10,83±0,90 4,63±0,92* 5,54±0,99*
СО!\ 12,06±0,67 2,69+0,90* 4,71±0,96*
Поздние активационные маркеры НЬА-ОЯ 20,62±0,95 15,6б±1,50* 13,99±0,93*
С095 14,27±1,24 10,86±0,87* 10,68±1,23*
Примечание: +-р<0,05; достоверность различий указана по сравнению с
больными.
Все активационные маркеры по времени их появления на мембране лимфоцитов делятся на ранние и поздние. Активационные маркеры появляются на поверхности клеток в следующем порядке: С025-С071-НЬА-0Я-С095 [Порядин Г.В. с соавт., 2006] .при оценке количества лимфоцитов с экспрессией активационных маркеров появляется возможность оценить процессы активации происходящие в иммунной системе. Это обстоятельство позволяет более широко рассмотреть эффект исследованных пептидов. В проведенном исследовании пептиды АРР14.2о и Е существенно снижали численность лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние активационные маркеры. При расчете соотношения, характеризующего элиминацию
16
лимфоцитов, выявлено снижение соотношения НЬА-0Я/С095 под действием пептидов (АРР|4.2о и Е), что характерно для увеличения элиминации лимфоцитов.
Таблица 7.
Характеристика состава поверхностных маркеров лимфоцитов больных ревматоидным артритом после культивирования с пептидом АФП^о и пептидом Е.____
количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
| маркеры РА до культивирования Пептид АФП14.20 п=10 Пептид Е п=10
Т-лимфоциты СИЗ 54,68±1Д5 30,09+3,15* 27,70±0,81*
СОА 33,94±0,90 18,53±1,92* 17,85±1,28*
С08 26,78±1,57 12,55±0,48* 15,63±1,02*
ЫК-клетки СШ6 16,11±1,Э5 5,90±0,93* 8,06±0,75*
С056 13,98±0,87 9,05±0,58* 12,21+2,21*
В-лимфоциты С020 17,11±0,82 9,01±1,02* 10,23+0,94*
С012 13,97±1,02 6,65±0,59* 6,65±0,86*
Ранние активационные маркеры стг 13,21±1,23 8,36±0,76* 13,52+1,34
С025 10,91±0,86 6,41+0,35* 8,00±1,01*
С071 14,44±0,92 5,55±0,68* 6,50+0,78*
Поздние активационные маркеры 19,84±1,05 13,29+0,61* 15,05+2,50
С095 12,73±0,68 18,99±0,71* 12,45±1,46
Примечание: *-р<0,05; достоверность различий указана по сравнению с
больными.
Таким образом, анализируя полученные данные можно сделать следующее заключение - пептид АФПм.го и пептид Е обладают выраженными иммунотропными свойствами, к основным эффектам можно отнести снижение общего количества Т-лимфоцитов (СОЗ+), субпопуляций Т-лимфоцитов (С04+, С08+), содержания натуральных киллеров у больных АБА и РА. Аналогичное действие исследованные пептиды оказывают и на В-клеточное звено иммунного ответа (снижение общего количества СЭ20 и отдельных форм дифференцировки В-клеток) у больных АБА и РА. Культивирование лимфоцитов больных в присутствии пептида АФП14.20 и пептида Е приводит к
значительному снижению количества лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние маркеры активации. Особо следует отметить увеличение количества СЭ95+ лимфоцитов у больных РА. То есть, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что пептиды синтетических аналогов белков трофобластического комплекса человека АФП14.20 и Е оказывают иммунотропное действие (супрессивного характера).
При исследовании действия пептидов из второй группы (V, 0 и СЕА) на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и количество лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры у больных иммунопатологическими заболеваниями были получены следующие результаты (таблица 8).
Таблица 8.
Характеристика состава поверхностных маркеров лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой после культивирования с пептидом пептидом V, пептидом О и пептидом СЕА._
количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
маркеры АБА до культивирования Пептид V п=10 Пептид Q п=10 пептид СЕА п=10
Т-лимфоциты СОЗ 58,09±0,94 41,65±1,27* 50,70±0,86* 59,52±1,23
С04 36,05±1,05 21,91±0,81* 33,10±0,92 30,49±1,32
СЭ8 24,25±0,91 15,28+0,67* 24,99±0,59* 14,34±1,59*
ЫК-клетки С016 15,15+0,66 6,42±0,43* 18,61+0,69* 11,02±1,46
СБ56 15,10±0,73 7,97+0,86* 17,38+0,89 6,13±0,74*
В-лимфоциты С020 19,01±0,45 13,33±0,96* 29,83+0,54* 22,98+1,13
СО 72 17,28±0,78 5,68±0,55* 15,35±0,89 13,97±1,07*
Ранние активационные маркеры С023 19,97±1,25 19,23±1,15 24,14±1,02* 23,24±1,22*
С025 10,83±0,90 18,62+1,06* 18,84+0,91* 7,75±0,66*
С071 12,06+0,67 18,44+1,06* 15,45+0,73* 4,74+0,39*
Поздние активационные маркеры Н1.А-ОЛ 20,62±0,95 19,45+1,10 33,10±1,38* 39,39+1,41*
С095 14,27+1,24 16,75+1,08 14,24±1,02* 22,50±1,07*
Примечание: *-р<0,05; достоверность различий указана по сравнению с
больными.
Под влиянием пептида V произошло достоверное снижение общего количества Т-лимфоцитов, количества Т-хелперов и Т-цитотоксических
1В
лимфоцитов у больных АБА и РА. Отмечалось снижение содержания В-лимфоцитов (CD20) и примированных В-клеток (CD72) у больных иммунопатологическими состояниями.
У больных РА (таблица 9) под действием пептида V произошло снижение соотношения CD25/CD95 и соотношения HLA-DR/CD95, в основном за счет значительного прироста числа CD95-позитивных лимфоцитов. Именно такое изменение соотношений характерно для преобладания процессов элиминации лимфоцитов [Казимирский А.Н., 2002]. У больных АБА, произошло увеличение численности С025-позитивных лимфоцитов, что привело к увеличению соотношения CD25/CD95, а подобное явление характерно для преобладания процессов активации над процессами элиминации лимфоцитов.
Под влиянием пептида CEA отмечено преимущественное снижение численности Т-цитотоксической субпопуляции у больных АБА. При этом количество CD3+ лимфоцитов превышало сумму CD3+ и CD4+, клеток в субпопуляциях при культивировании с пептидом V на 4,46% (р<0,02) и при культивировании с пептидом CEA на 14,68% (р<0,0006).
Под действием пептида CEA у больных АБА произошло снижение клеток с экспрессией ранних активационных маркеров и увеличение числа клеток, экспрессирующих поздние активационные маркеры. Вероятно, в этом случае может идти речь об элиминации лимфоцитов. Действие пептида CEA на В-лимфоциты исследованных групп больных в отличалось. У больных АБА произошло снижение численности CD72+ (примированных В- лимфоцитов). У больных РА Пептид CEA не оказал влияния на число CD20+ клеток. По действию на количество лимфоцитов с экспрессией активационных маркеров влияние пептида CEA значительно отличалось в исследованных моделях. Так, у больных АБА произошло достоверное снижение, до нормальных показателей, количества лимфоцитов, экспрессирующих ранние активационные маркеры (CD25, CD71), при одновременном увеличении количества HLA-DR+, CD95+ клеток. У больных РА напротив, произошло увеличение клеток CD25+, CD71+ и HLA-DR+ лимфоцитов, количество CD95+ клеток не изменилось. Соотношение
СЭ25/С095 увеличилось у больных РА, то есть можно думать об увеличении активации в культуре лимфоцитов больных РА под действием пептида СБА.
Таблица 9.
Характеристика состава поверхностных маркеров лимфоцитов больных ревматоидным артритом после культивирования с пептидом V, пептидом О и пептидом СЕА._
количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
маркеры РА до культивирования Пептид V п=10 Пептид О п=10 Пептид СЕА п=10
Т- лимфоциты СБЗ 54,68±1,15 39,23+2,22* 42,36±2,98* 51,91±2,44
СЭ4 33,94±0,90 20,71±0,96* 24,93±1,61* 27,93±2,41
СБ8 26,78±1,57 14,13+1,59* 16,99±3,67* 25,17±2,35
>1К-клетки С016 16,11±1,35 11,88+2,20 22,15±3,05* 16,47±2,12
С056 13,98±0,87 11,62+1,23 23,92±1,72* 20,30±2,49*
В- лимфоциты сто 17,11+0,82 13,19±0,76* 21,39±1,46* 18,88±2,16
С012 13,97±1,02 8,67±0,85* 23,54±2,22* 16,47±2,38
Ранние активационные маркеры СЭ23 13,21+1,23 9,89±1,43* 20,74±1,73* 1б,68±2,87
С025 10,91±0,86 12,32±2,16 11,50±1,65 27,20±2,50*
С071 14,44+0,92 15,27±2,12 10,57±2,21* 22,67±1,89*
Поздние активационные маркеры НЬА-БК 19,84±1,05 16,19±1,93 18,75±3,01 30,91±2,38*
С095 12,73+0,68 22,76±2,70* 12,06±1,38 13,22±2,03
Примечание: *-р<0,05; достоверность различий указана по сравнению с
показателями больных.
При культивировании с пептидом 9 было отмечено снижение общего количества Т-лимфоцитов у больных АБА; у больных РА произошло пропорциональное снижение общего количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т-цитотоксических лимфоцитов. Пептид <3, единственный из исследованных, повышал количество клеток с экспрессией СБ23 у больных АБА и у больных РА. У больных АБА, также отмечалось увеличение количества клеток с экспрессией ранних активационных маркеров и позднего активационного маркера НЬА-ОЯ. У больных РА произошло снижение содержания С071-позитивных клеток, но не отмечалось достоверных изменений количества лимфоцитов с экспрессией поздних активационных маркеров. У больных АБА
вследствие, увеличения числа С025-позитивных лимфоцитов увеличилось соотношение С025/СБ95, одновременно выросло соотношение НЬА-ВЯ/СБ95 в результате повышения содержания НЬА-ТЖ+-лимфоцитов. Такое однонаправленное изменение указанных соотношений указывает на увеличение процессов активации и нарушение процессов элиминации лимфоцитов у аллергических больных под действием пептида р. У больных РА изменений не отмечено.
Выводы.
1. Под влиянием пептида АФП14.20 в культурах лимфоцитов здоровых доноров, больных АБА и РА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (СОЗ+, С04+, С08+), Ж-клеток (С016+), В-лимфоцитов (С020+); в культурах лимфоцитов больных АБА и РА также наблюдается снижение клеток с экспрессией активационных маркеров (СВ25+, С071+, НЬА-ЭЯ+).
2. В культурах лимфоцитов всех исследованных групп под влиянием пептида Е наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (СОЗ+, СБ4+, С08+), ЫК-клеток (С01б+), В-лимфоцитов (С020+). В культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение клеток с экспрессией ранних активационных маркеров (С025+, С071+); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается снижение клеток с экспрессией как ранних так и поздних активационных маркеров (С025+, С071+, СБ95\ НЬА-011+).
3. Под влиянием пептида V в культуре лимфоцитов здоровых доноров наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (СОЗ+, С04+, С08+); в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (СОЗ+, С04+, СБ8+), ЫК-клеток (СБ16+), В-лимфоцитов (С020+), повышение клеток с экспрессией ранних (С025+, СЭ71+); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (СБЗ+, СБ4+, С08+), В-лимфоцитов (С020+), повышение количества СБ95+ лимфоцитов.
4. Под влиянием пептида С? в культуре лимфоцитов здоровых доноров наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (СОЗ+, С04+, С08+), МК-
клеток (С016+); в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (СЭЗ+), повышение количества клеток с экспрессией ранних и поздних активационных маркеров (С025+, С071+, НЬА-ВЯ+); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (СОЗ+, СБ4+, С08+), Сй71+ лимфоцитов.
5. Под влиянием пептида СЕ А в культуре лимфоцитов здоровых доноров наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (СОЗ+, СЭ4+, С08+), ИК-клеток (С016+), НЬА-ВЯ+лимфоцитов; в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение содержания (С08+ С025+, СБ7Г) лимфоцитов, повышение количества клеток с экспрессией ранних и поздних активационных маркеров (СВ25+, СБ7Г, НЬА-ВЯ+); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается повышение количества клеток с экспрессией ранних и поздних активационных маркеров (С025+, С071+, НЬА-ОЯ+).
6. Пептиды V, Е, СЕА не влияют на развитие медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морской свинки; пептид 0 увеличивает медиатор-индуцированную контрактуру гладких мышц морской свинки к ацетилхолину и снижает к гистамину.
7. Пептид АФП14.20 не влияет на развитие медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морской свинки, однако усиливает развитие сенсибилизации морской свинки на яичный альбумин.
Практические рекомендации Полученные иммунотропные свойства исследованных пептидов позволяют рекомендовать изучение синтетических аналогов БТК в научных лабораториях, в медицинских научно-исследовательских центрах в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. А.А.Терентьев, Г.В.Порядин, Ж.М.Салмаси, Ю.С.Татаринов. А.К.Тагирова, Н.Т.Молдогазиева, И.А.Александрова, Т.В.Макаров, З.В.Рябинина, Л.Ю.Семенова, А.Н.Казимирский. Пептиды трофобластического бета-глобулина модулируют экспрессию рецепторов активационного апоптоза
лимфоцитов (Fas и Fas-L)// Материалы конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины, М., 2003, С. 91. 1
2. А.А.Терентьев, Ю.С.Татаринов, Г.В.Порядин, Ж.М.Салмаси, И.А.Александрова, Т.В.Макаров, З.В.Рябинина, А.Н.Казимирский. Регуляция мембранной экспрессии Fas (CD95) и FasL (CD95L) - рецепторов запуска активационного апоптоза пептидными модуляторами белков фетоплацентарного комплекса. У/ Белки - маркеры патологических состояний. Астрахань-Москва, 2003, С.35-44.
3. А.А.Терентьев, Г.В.Порядин, Ж.М.Салмаси, И.А.Александрова, Т.В.Макаров, А.Н.Казимирский. Модулирование экспрессии рецепторов активационного апоптоза лимфоцитов CD95 (Fas) и CD96L (FasL) с помощью различных пептидов из альфа-фетопротеина и трофобластического бета-глобулина человека. // Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины. Астрахань-Москва, 2004, С. 150-151.
4. А.Н.Казимирский, А.А.Терентьев, И.А.Александрова, А.К.Тагирова, Н.Т.Молдогазиева, Т.В.Макаров, З.В.Рябинина. Модулирование экспрессии активационных антигенов лимфоцитов у больных иммунопатологическими заболеваниями. // Медицинская иммунология, 2004, т. 6, № 3-5, С.231-232
5. A.N.Kazimirski, A.A.Terentiev, G.V.Porjadin, J.M.Salmasy, I.A.Alexandrova, T.V.Makarov. Modulation of expression of apoptosis activation lymphocytes antigens (Fas and Fas-L) with the help of various peptides from human trophoblastic beta-globulin (TBG, sPl, PSG). // Abstracts of the 32th Meeting of International Society for Oncodevelopmental ISOBM 2004, Helsinki, Finland, P-265. P. 108
6. Терентьев A.A., Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Александрова И.А., Тагирова А.К., Макаров Т.В., Рябинина З.В., Казимирский А.Н. Пептиды из трофобластического Р-глобулина человека изменяют экспрессию рецептора
CD95L (FASL) в лимфоцитах в зависимости от их функционального состояния // Медицинская иммунология, 2005, том7, №2-3, С. 124.
7. Salmasi J.M., Terentiev A.A., Makarov T.V. The influence of synthetic fragments of afphjo and peptides from a human's TBG on the superficial markers of healthy donor's lymphocytes. // JAP AIR, 2005,v.6,suppl.l, M-28.
8. Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Кузьменко Л.Г., Рябинина З.В., Ларькова И.А., Макаров Т.В.. Влияние антигенной стимуляции на поверхностные маркеры лимфоцитов при обострении атопической бронхиальной астмы и при проведении специфической иммунотерапии у детей.// Вестник РГМУ.-2005- №7.-С.42-46.
9. Порядин Г.В., Балаболкин И.И., Салмаси Ж.М., Рябинина З.В., Ларькова
И.А., Макаров Т.В.. Изменение экспрессии маркера активации лимфоцитов CD23 у детей с атопической бронхиальной астмой зависит от эффективности антигенспецифической иммунотерапии. // Материалы конгресса XIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Москва 2006. С.-256.
10. Терентьев A.A., Казимирский А.Н., Салмаси Ж.М., Макаров Т.В., Рябинина З.В., Порядин Г.В. Синтетический пептид на основе АФП способен нормализовать активационные процессы в лимфоцитах больных ревматоидным артритом.// Материалы XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», М., 2010, С125.
Список использованных в автореферате сокращений.
БТК - белки трофобластического комплекса;
АБА - атопическая бронхиальная астма;
РА - ревматоидный артрит;
ИЛ - интерлейкин;
ЗФР - забуференный физиологический раствор;
ЯА -яичный альбумин.
Подписано в печать: 27.04.10 Объем: 1,5 усл.печ.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 25609878 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского, 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru
Оглавление диссертации Макаров, Тимофей Вячеславович :: 2010 :: Москва
Введение
Оглавление.
Обзор литературы.
Глава 1. Характеристика поверхностных маркеров лимфоцитов при атопической бронхиальной астме и ревматоидном артрите и влияние на них белков трофобластического комплекса.
Глава 2. Иммуноактивное действие синтетических пептидов, применяющихся в практической медицине.
Собственные исследования.
Глава 3. Материалы и методы исследования.
Глава 4. Исследование действия синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса человека на развитие сенсибилизации морской свинки.
Глава 5. Влияние синтетических пептидов аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса человека на поверхностные маркеры лимфоцитов здоровых доноров.
Глава 6. Влияние синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса человека, АФП^о и Е на лимфоциты больных атопической бронхиальной астмой и ревматоидным артритом.
Глава 7. Влияние синтетических пептидных производных бежов фетоплацентарного комплекса человека V,Q и СЕА in vitro на лимфоциты больных атопической бронхиальной астмой и ревматоидным артритом.
Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Макаров, Тимофей Вячеславович, автореферат
Имеется ряд наблюдений, что в третьем триместре беременности у больных иммунопатологическими болезнями (ревматоидный артрит, ревматизм, тромбоцитопеническая пурпура, рассеянный склероз) наблюдается развитие ремиссии. Это связывают с эффектами фетоплацентарных белков [Кузник Б.И., Васильев Н.Б., 1998]. Получение и применение фетоплацентарных белков природного происхождения имеет ряд существенных трудностей: поиск донорского материала, нестабильность химической структуры и возможность парентеральной передачи вирусов [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003].
В последние годы появились работы, в которых показано наличие иммуномодулирующих свойств, присущих нативным фетоплацентарным белкам, синтетическим пептидам, содержащим определенные пептидные 5 последовательности фетоплацентарных белков. На кафедре биохимии РГМУ профессором Терентьевым А.А. были определены пептидные последовательности, которые должны отвечать за ограничение активации иммунной системы белками АФП и ТБГ.
В лаборатории кафедры патологической физиологии РГМУ ранее исследовался синтетический аналог белка АФП, были получены данные о его влиянии на пролиферацию лимфоцитов [Казимирский А.Н. и соавт., 1999]. Позднее были проведены исследования влияния белков АФП и ТБГ на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов, активационные процессы в культуре клеток больных АБА [Казимирский А.Н., 2003], отмечалось снижение клеток с экспрессией ражих активационных маркеров. Затем, было выдвинуто, предположение о наличии активных центров в нативных молекулах АФП и ТБГ и выделены полипептидные последовательности, предположительно отвечающие за иммунотропные эффекты АФП и ТБГ [Терентьев А.А., 2001].
Необходимость прицельно изучить иммунотропные свойства синтетических пептидов аналогов белков АФП и ТБГ, которые могут стать новыми средствами для лечения иммунопатологических и аллергических заболеваний человека, обосновало выбор направление исследования. Цель работы исследовать иммуноактивное действие синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса человека, на экспериментальных моделях. Задачи работы.
1. Изучить действие синтетических аналогов пептидов белков трофобластического комплекса человека in vitro на поверхностные маркеры лимфоцитов здоровых доноров.
2. Изучить действие синтетических аналогов пептидов белков трофобластического комплекса человека in vitro на поверхностные маркеры лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой.
3. Изучить действие синтетических аналогов пептидов белков трофобластического комплекса человека in vitro на поверхностные маркеры лимфоцитов больных ревматоидным артритом.
4. Исследовать влияние синтетических аналогов пептидов белков трофобластического комплекса человека на анафилактическую и медиатор-индуцированную контрактуру гладких мышц in vitro.
5. Исследовать влияние синтетических аналогов пептидов белков трофобластического комплекса человека на развитие сенсибилизации морских свинок овальбумином с неполным адъювантом Фрейнда.
Научная новизна исследования.
Диссертационная работа посвящена исследованию иммунотропных свойств ранее не изучавшихся синтетических пептидов, производных БТК человека.
Впервые изучено влияние пептида АФП14.20, пептида V, пептида Q, пептид СБА, пептида Е на изменение количества клеток несущих ранние активационные маркеры (CD25, CD71), поздние активационные маркеры (HLA-DR, CD95) при культивировании лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, больных ревматоидным артритом.
Впервые изучено влияние пептида V, пептида Q, пептид СБА, пептида Б на изменение количества содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD Б4), NK-клеток (CD16+, CD56+), В-лимфоцитов (CD204), изменения количества различных форм дифференцировки В-лимфоцитов (CD72+, CD23+, IgM*, IgG ) при культивировании лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, больных ревматоидным артритом. Показана способность всех исследованных пептидов аналогов БТК человека снижать содержание Т-лимфоцитов (CD34), Т-хелперов (CD44), цитотоксических лимфоцитов (CD84) при культивировании лимфоцитов здоровых доноров.
Впервые исследовано действие синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей БТК человека на развитие 7 экспериментальной анафилаксии и медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц.
Впервые показано, что пептиды АФГ^.го, V, СБА, Е не влияют на развитие медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морской свинки под действием ацетилхолина и гистамина. Была выявлена способность пептида Q, увеличивать медиатор-индуцированную контрактуру гладких мышц морской свинки к ацетилхолину и снижать медиатор-индуцированную контрактуру к гистамину.
Впервые была исследована и охарактеризована, способность пептидов аналогов БТК человека влиять на развитие сенсибилизации in vivo. Показано, что пептид АФП 142о способен усиливать сенсибилизацию морских свинок.
Полученные результаты, позволяют охарактеризовать иммунотропные эффекты синтетических пептидов аналогов БТК человека.
Теоретическое значение работы.
Показан выраженный иммунотропный эффект синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса, на поверхностные маркеры лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, ревматоидным артритом экспериментальной анафилаксии на животных. Получены сведения, расширяющие существующие представления о последовательности аминокислот активного центра молекул АФП и ТБГ.
Практическая значимость работы
Предложен способ оценки иммунотропных свойств пептидов при культивировании лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, больных ревматоидным артритом, включающий широкий спектр антигенных маркеров. Полученные данные расширяют представления о взаимосвязи структуры и функции пептидов. Показанные иммунотропные свойства исследованных пептидов позволяют рассматривать их в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
Положения, выносимые на защиту.
1. Синтетические пептиды, аналоги некоторых пептидных производных белков трофобластического комплекса оказывают иммунотропное действие на лимфоциты здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, ревматоидным артритом.
2. Пептид АФП14.20 и пептид Е, in vitro в исследованных моделях, уменьшают количество клеток экспрессирующих ранние активационные маркеры (CD25, CD71) больных иммунопатологическими заболеваниями.
3. Пептиды, синтетические аналоги белков ТБГ - V, Q, СЕ А подавляют Т-клеточное звено (CD3, CD4, CD8) иммунной системы больных иммунопатологическими заболеваниями.
4. Синтетический пептид АФПи-20 усиливает сенсибилизацию.
5. В условиях in vitro пептид Q, способен усиливать действие ацетилхолина и значительно снижать эффект гистамина на гладкую мускулатуру тонкого кишечника морской свинки.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины, (Москва, 2003), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006). Основные положения диссертации доложены на совместной научно-практической конференции кафедры патофизиологии и кафедры биохимии ГОУ ВПО РГМУ от 13.02.2007. Также материалы диссертации представлены на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010).
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, включает в себя введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 16 рисунками. Обзор литературы содержит 190 источников, из них 59 отечественных и 131 зарубежных автора
Заключение диссертационного исследования на тему "Иммунотропные свойства синтетических пептидных производных белков фетоплацентарного комплекса человека"
Выводы.
1. Под влиянием пептида АФП^о в культурах лимфоцитов здоровых доноров, больных АБА и РА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD84), NK-клеток (CD164), В-лимфоцитов (CD204); в культурах лимфоцитов больных АБА и РА также наблюдается снижение клеток с экспрессией активационных маркеров (CD25+, CD71+, HLA-DR4).
2. В культурах лимфоцитов всех исследованных групп под влиянием пептида Е наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD84), NK-клеток (CD164), В-лимфоцитов (CD204). В культуре лимфоцитов больных РА наблюдается снижение клеток с экспрессией ранних активационных маркеров (CD25+, CD714); в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение клеток с экспрессией как ранних, так и поздних активационных маркеров (CD25+, CD71+, CD95+, HLA-DR4).
3. Под влиянием пептида V в культуре лимфоцитов здоровых доноров наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD84); в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD84), NK-клеток (CD164), В-лимфоцитов (CD204), повышение клеток с экспрессией ранних активационных маркеров (CD25+, CD714); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD84), В-лимфоцитов (CD204), повышение количества CD95+ лимфоцитов.
4. Под влиянием пептида Q в культуре лимфоцитов здоровых доноров наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD84), NK-клеток (CD164); в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD34), повышение количества клеток с экспрессией активационных маркеров (CD25+, CD71+, HLA-DR4); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD84), CD7Г лимфоцитов.
5. Под влиянием пептида СЕА в культуре лимфоцитов здоровых доноров наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD84), NKклеток (CD164), HLA-DR+ лимфоцитов; в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение содержания (CD8+ CD25+, CD714) лимфоцитов, повышение количества клеток с экспрессией поздних активационных маркеров (HLA-DR+, CD954); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается повышение количества клеток с экспрессией активационных маркеров (CD25+, CD71+, HLA-DR+).
6. Пептиды V, Е, СЕА не влияют на развитие медиатор-индуцироваьшой контрактуры гладких мышц морской свинки; пептид Q увеличивает медиатор-индуцированную контрактуру гладких мышц морской свинки к ацетилхолину и снижает к гистамину.
7. Пептид АФП и -20 не влияет на развитие медиатор-индуцированнои контрактуры гладких мышц морской свинки, однако усиливает развитие сенсибилизации морской свинки на яичный альбумин.
Практические рекомендации
Полученные иммунотропные свойства исследованных пептидов позволяют рекомендовать изучение синтетических аналогов БТК в научных лабораториях, в медицинских научно-исследовательских центрах в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Макаров, Тимофей Вячеславович
1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: Эдиториал УРСС- 2002 . 320 стр.
2. Бобков В.А., Брыленкова Т.Н., Моисеенко Р.С. показатели кислотно-основного состояния синовиальной жидкости у больных ревматоидным артритом в ранней стадии.// Ревматол.-2000.-№12.-С. 35-38.
3. Бойчук С.В., Мустафин И.Г., Фассахов Р.С., Мбаинаджи JL Апоптоз лимфоцитов при атопической бронхиальной астме.// Пульмонология 2003, Vol.13, №5.
4. Грачева JI. Лечение ревматоидного артрита метотрексатом, сульфасалазином и гидроксихлорохином или комбинацией всех трех препаратов. 04 января 1997 г, том 5, №1.
5. Дранник Г.Н., Клиническая иммунология и аллергология-М. 2003.
6. Епишин А.В., Грыщив В.Е., Венгер Е.П. "Иммунные нарушения у больных первичным гипотиреозом." Врач, дело 6: 51-53, 1991.
7. Журавлева Н.Е.// Апоптоз лимфоцитов в механизме развития атопической бронхиальной астмы и влияние на него специфической иммунотерапии. -дисс.доктора мед.наук.-М.-2003.
8. Казимирский А.Н.// Особенности иммунопатогенеза воспалительных заболеваний различного генеза. дисс.доктора мед.наук.-М.-2002.
9. Казимирский А.Н., Бозиева Н.И., Салмаси Ж.М., Савина Н.П., Порядин Г.В. Нарушение содержания NK-клеток при бронхиальной астме.// Материалы международного конгресса «Интерастма». -1998.-С.79.
10. П.Ковальчук JI.B., Ганковская JI.B., Рубакова Э.И. Система цитокинов. М., РГМУ, 1999.
11. Ковальчук, JI.B. Система цитокинов / Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганьковская, Э.И. Рубакова. М.: РГМУ. - 2000. - 64 С
12. Ковальчук Л.В. Антигенные маркеры клеток иммунной системы человека CD система. . М., РГМУ, 2003. С.-76.
13. Кузник Б.И., Васильев Н.В., Цыбиков Н.Н. Иммуногенез, гомеостаз и неспецифическая резистентность организма. М.: Медицина, 1989. 320 с
14. Колесникова Н. В., Нестерова И. В., Чудилова Г. Ф. Ранние и отдаленные эффекты влияния экзогенного гидрокортизона на систему нейтрофильных гранулоцитов лабораторных мышей // Гематология и трансфузиология. 1999. № 5. С. 36-40.
15. Кузник Б.И., Васильев Н.Б., Цыбиков Н.Н. // Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая реактивность организма.-М., Медицина, 1989.
16. Латышева Т. В., Романова О. В., Иммунотропные препараты в комплексной терапии больных с тяжелой формой бронхиальной астмы Лечащий Врач 04/2002.
17. Ляхов В.В., Гудима С.О., Терехов О.П. Влияние трофобластического pi гликопротеина (ТБГ) на функциональную активность различных клеточных линий.//Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1990. Т. 110, №7. - С. 72-74
18. Мазуров В.И., Лила A.M. Ревматоидный артрит (клиника, диагностика, лечение). -С Пб. «Мед Масс Медиа», 2000.-96 с.
19. Медуницин Н.В. Цитокины и аллергия, опосредованная ^.//Иммунология.-1993.-№5-С. 11 -13.
20. Москалец О.В., Иваненко Т.В., Гусева О.А., Иевлева Е.С., Дурова О.М.,
21. Суровкин В.В., Сучков С.В. Диагностическое значение определения CD23клеток при аллергических заболеваниях.// Клин.лаб.диагност.-1999.-№9.1061. С.7-8.
22. Насонов E.JI. Глюкокортиконды: 50 лет применение в ревматологии //Тер. Архив. 1999. № 5. - С. 5-9.
23. Насонов Е.Л.Фактор некроза опухоли а-новая мишень для противовоспалительной терапии ревматоидного артрита.//Рус. Мед. Журнал.-2000. Т. 8, №17.-С. 718-723.
24. Насонов Е.Л.Перспективы развития ревматологии в XXI веке.//Рус. Мед. Журнал.-2001. Т. 9, №23.-С. 1031-1032.
25. Насонов Е.Л., Самсонов М.Ю.,Тилз Г.П. Растворимые молекулы адгезии (Р-селектин, 1САМ-1ДСАМ-3) при ревматоидном артрите //Тер. Архив. 1999. №5.-С. 17-20.
26. Насонов Е.Л., Белоусов Ю.Б., Чучалин А.Г. Роль воспаления в клинике внутренних болезней. Проблемы и перспективы.//Рус. Мед. Журнал.-2001. Т. 9, №12.-С. 487-503.
27. Новиков Д.К., Новикова В.И., Доценко Э.А. Бронхиальная астма у взрослых и детей.//Москва, Витебск.-1998.-203 С.
28. Окороков А.Н. "Диагностика болезней внутренних органов" //М.: Медицинская литература 2000.
29. ЗО.Оковитый С. В. Клиническая фармакология препаратов пептидных и синтетических иммуностимуляторов "ФАРМиндекс-Практик" выпуск 8 год 2005 стр. 13-29
30. Петров Р.В., Атаулоханов Р.И. Клеточные мембраны и иммунитет.//М.:Высшая школа.-1991.-141 с.
31. Поверенный AM, Виноградова Ю.Е. Дейгин В.И. Геморегуляторные синтетические пептиды. Тер. архив 2000; 7:74-76.
32. Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Макарков А.И. Молекулярные механизмы IgE опосредованной аллергии. //М. Из-во РГМУ. - 1996.
33. Порядин Г.В., Казимирский А.Н., Салмаси Ж.М., Журавлева Н.Е., Семенова
34. Л.Ю., Алиева З.О. Особенности иммунного ответа в процессе развитиявоспаления при атопии. // Клиническая патофизиология. 2002. -N 1. - С. 5107
35. Салмаси Ж.М.// Механизмы нарушения регуляторного звенаиммунной системы при бронхиальной астме и принципы коррекции, -дисс.доктора мед.наук.-М.-1998.
36. Семенова Л.Ю. //Эксперементальное обоснование использования композиций тибетской медицины для коррекции аутоиммунных и аллергических заболеваний, -дисс.доктора мед.наук.-М.-2003.
37. Сергеев П.В., Шимановский H.JL, Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ; Монография.- Волгоград: Издательство «Семь ветров», 1999.-640с.
38. Симонова А.В. Фенотип лимфоцитов крови при воспалительных заболеваниях человека. М.- ИНТО.- 2001.-227 С.
39. Сотникова Н.Ю., Бабакова JI.A., Петров Р.В. рецепторы лимфоцитов к трофобластическому pi гликопротеиду.//Бюлл. эксперим. Биол. и мед.- 1985. -Т. 99, №3. С. 326-327.
40. Сотникова Н.Ю., Бабакова JI.A., Цветкова Г.А.Выявление рецепторов к трофобластическому pi гликопротеиду на поверхности имунокомпетентных клеток.//Иммунология. -1987.-№2.-С. 81-84.
41. Татаринов Ю.С., Масюкевич В.Н. Иммунохимическая идентификация нового pi- глобулина в сыворотке крови беременных женщин.//Бюлл. эксперим. Биол. и мед.-1970. Т. 69, №6. - С. 66-68.
42. Терентьев А. А., Симонова А. В., Аршинова С. С., Кулаков В. В., Бахус Г. О., Павличенков А. В., Кудрявцева Е. В., Беспалова Ж. Д., Овчинников М. В., Молдогазиева Н. Т., Тагирова А. К. //Иммунология №5 2004 С. 279.
43. Тимофеев В.Т., Шостак Н.А., Логинова Т.К. Иммунологические аспекты диагностики ранней стадии ревматоидного артрита. // Тер.архив.-2000.-№5.-С. 19-21.
44. Туев А.В., Мишланов В.Ю. Бронхиальная астма: иммунитет, гемостаз, лечение.// Пермь: Звезда.-2001-С.219.
45. Хаитов Р. М. Физиология иммунной системы, М., 2001, 223 с.
46. Хаджави Осман, Клинико-генетические аспекты ревматоидного артрита, канд. дис. мед. Наук., Кипшнэу, 2005.
47. Халимская J1.M. Химический синтез белков и нуклеиновых кислот с использованием автоматических синтезаторов // Соросовский образовательный журнал, 2000, №10, с. 37-42.
48. ЗОЛередеев А.Н., Ковальчук JI.B. Развитие патогенетического принципа оценки иммунной системы человека. Микробиология 1997; 6: 89-92.
49. Чучалин А.Г. Бронхиальная астма // Рус. мед. журнал. 1995. - N 2. - С. 7-10.
50. Ширинский B.C., Кирикова С.Ф. Иммунологические нарушения при различных клинических вариантах ревматоидного артрита.// Тер.архив.-1992.-№5.-С.14-17.
51. Шмагель К.В., Черешнев В.А. Альфа-фетопротеин: строение, функции и роль в эмбриогенезе. //Акушерство и гинекология.- 2002.- № 5.- С.6-8.
52. Шмагель К.В., Черешнев В.А., Иммунитет беременной женщины// М.: Мед. кн.; Ниж. Новгород: Изд-во НГМА, 2003. 226с.
53. Шостак Н.А., Порядин Г.В.,Логинова Т.К. Ранний ревматоидный артрит -клинико-иммунологические аспекты. В сб.: «проблемы диагностики и лечения ревматических заболеваний», М., 1998. С. 5-8.
54. Шостак Н.А., Логинова Т.К. Ранний ревматоидный артрит.// Вопросы диагностики. Вестник РГМУ, М., 1999.-5. С. 15-20.
55. Шостак Н.А., Тимофеев В.Т. Иммунные нарушения и принципы патогенетической терапии при ревматических заболеваниях //Алерг. и иммунопатол., М., 1999. -282 с.
56. Ярилина А.А., Никонова М.Ф., Литвинова М.М. Влияние а2Ъ-интерферона in vivo и in vitro на функциональную активность Т-лимфоцитов больных ревматоидным артритом.// Тер.архив.-2000.-№5.-С.9-17.
57. Aarvak Т., Chabaud М., Thoen J., Miossec P., Natvig J.B. Changes in the
58. Thl or Th2 cytokine dominance in the synovium of rheumatoid arthritis (RA): akinetic study of the Th subsets in one unusual RA patient. Rheumatology
59. Oxford). 2000 May; 39(5):513-22.
60. Abelev G.I. Alpha-fetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors. Advanc Cancer Res 1971; 14: 295-358.
61. Akbar A.N., Salmon M., Ivory K., Taki S., Pilling D., Janossy G. Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens. Eur J Immunol. 1991 Oct;21(10):2517-22.
62. Amu S., Stromberg K., Bokarewa M., Tarkowski A., Brisslert M. CD25-expressing B-lymphocytes in Rheumatic Diseases.Scand J Immunol. 2007 Feb;65(2): 182-91.
63. Bentley AM, Durham SR, Kay AB. Comparison of the immunopathology of extrinsic, intrinsic and occupational asthma. J Investig Allergol Clin Immunol. 1994 Sep-Oct;4(5):222-32.
64. Baric I.,Reiner-Banovac Z.,Verona E., Sabioncello A., Svoboda-Beusan I. T-cell subsets in asthmatic children. Acta Med Croatica. 1993;47(3): 119-22.
65. Barnes PJ, Page C. Mediators of asthma: a new series. Pulm Pharmacol Ther. 2001;14(l):l-2.
66. Barnes PJ, Chung KF, Page CP. Inflammatory mediators of asthma: an update.Pharmacol Rev. 1998 Dec;50(4):515-96.
67. Boushey H.A., Fahy J.V. Basic mechanisms of asthma. Environ Health Perspect. 1995 Sep;103 Suppl 6:229-33.
68. Baboonian C, Venables PJW, Williams DG et al. Cross-reaction of antibodies to aglycine-alanine repeat sequence of Epstain-Barr virus nuclear antigen-1 with collagen,cytokeratin, and actin. //Ann Rheum Dis, 1991, 50: 772-75.
69. Bach J. F. The effect of infections on susceptibility to autoimmune and allergic diseases.// N Engl J Med, 2002, 347: 911-20.
70. Beresford B.A., Sloper P. Chronically ill adolescents' experiences of communicatingwith doctors: a quantitative study. // J Adolesc Health, 2003, 33: 172-79.
71. Berner В., Wolf G., Hummel K.M., Muller G.A., Reuss-Borst M.A. Increased expression of CD40 ligand (CD 154) on CD4+ T cells as a marker of disease activity in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2000 Mar; 59(3): 190-5.
72. Berner В., Akca D., Jung Т., Muller G.A., Reuss-Borst M.A. Analysis of Thland Th2 cytokines expressing CD4+ and CD8+ T cells in rheumatoid arthritis byflow cytometry. J. Rheumatol. 2000 May; 27(5): 1128-35.1.l
73. Brosch S, Redlich K, Pietschmann P. Pathogenesis of osteoporosis in rheumatoidarthritis. //Acta Med Austriaca. 2003, 30 (1): 1-5.
74. Butrimiene, S. Jarmalaite, J. Ranceva, A. Venalis, L. Jasiuleviciute, and A.Zvirbliene.Different cytokine profiles in patients with chronic and acute reactivearthritis. Rheumatology, October 1, 2004; 43(10): 1300 1304.
75. Caponi L., E Petit-Teixeira, M Sebbag, F Bongiorni. A family based study shows no association between rheumatoid arthritis and the PADI4 gene in a white French population. Ann. Rheum. Dis, April 1, 2005; 64(4): 587 93.
76. Carmen Ubrich, Stefanie Dimmeler. Endothelial progenitor cells. Functional characterization. //Trends CardiovascMed, 2004, 14: 318-22.
77. Carosella E.D., Dausset J., Rouas-Freiss N. Transplacental transmission of natural-killer-cell lymphoma.N Engl J Med. 1999 Dec 16;341(25):1937.
78. Cha H.S., Bae E.K., Koh J.H., Chai J.Y., Jeon C.H., Ahn K.S., Kim J., Koh E.M. Tumor necrosis factor-alpha induces vascular endothelial growth factor-C expression in rheumatoid synoviocytes. J. Rheumatol. 2007 Jan;34(l):16-9.
79. Chaiamnuay S.5 Bridges SL Jr. The role of В cells and autoantibodies inrheumatoid arthritis. Pathophysiology. 2005 0ct;12(3):203-16.112
80. Chaouat G., Tranchot Diallo J., Volumenie J.L., Menu E., Gras G., Delage G., Mognetti B. Immune suppression and Thl/Th2 balance in pregnancy revisited: a (very) personal tribute to Tom Wegmann. Am J Reprod Immunol. 1997 Jun;37(6):427-34.
81. Chapuy-Regaud S., M. Sebbag, D. Baeten, C. Clavel, C. Foulquier. Fibrin Deimination in Synovial Tissue Is Not Specific for Rheumatoid Arthritis but Commonly Occurs during Synovitides. J. Immunol., April 15, 2005; 174(8): 5057 5064.
82. Christopherson K.W., Hromas R. A. Endothelial chemokines in autoimmune diseases.// Curr Pharm Des, 2004, 10(12): 145-54.
83. Clewes A.R., Dawson J.K., Kaye S., Bucknall R.C. et al. Peripheral ulcerative keratitis in rheumatoid arthritis: successful use of intravenous yclophosphamide and comparison of clinical and serological characteristics. Ann Rheum Dis 2005; 64:961-2.
84. Coleman J.W. Nitric oxide in immunity and inflammation. // Int Immunopharmacol 2001, 1: 1397-406.
85. Colville-Nash P. R., Willoughby D. A. COX-1, COX-2 and articular join disease: arolefor chondroprotective agents. //Biorheology, 2002, 39: 171-79.
86. Contard M., Hung W., Osborne-Pellegrin M., Kontos H. A. Heritability of intracerebral hemorrhagic lesions and cerebral aneurisms in the rat. // Editorila Comment.Stroke, 2000, 31: 2678-2684.
87. Cooper C. Anticollagen antibodies in rheumatoid arthritis. // J Rheumatol, 2001, 28:1261-64.
88. Corrigan C.J., Kay A.B. CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma. Relationship to disease severity and atopic status. Am Rev Respir Dis. 1990 Apr;141(4 Pt l):970-7.
89. Coumans В., Thellin O., Zorzi W., Melot F., Bougoussa M, Melen L., Zorzi D., Hennen G., Igout A., Heinen E. Lymphoid cell apoptosis induced by trophoblastic cells: a model of active foeto-placental tolerance. J Immunol
90. Methods. 1999 Apr 22;224(l-2): 185-96.113
91. Crimi E., Gaffi D., Frittoli E., Borgonovo В., Burastero S.E. Depletion of circulating allergen-specific TH2 T lymphocytes after allergen exposure in asthma. J Allergy Clin Immunol. 1997 Jun;99(6 Pt l):788-97.
92. Davila E, Kang YM, Park YW, Sawai H, He X, Pryshchep S, Goronzy JJ, Weyand CM. Cell-based immunotherapy with suppressor CD8+ T cells in rheumatoid arthritis. J Immunol. 2005 Jun 1; 174(11):7292-301.
93. Fireman P.Understanding asthma pathophysiology. Allergy Asthma Proc. 2003 Mar-Apr;24(2):79-83
94. Firestein GS. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 2005 Jun;ll(3 Suppl):S39-44.
95. Fournier C. Where do T cells stand in rheumatoid arthritis? Joint Bone Spine. 2005 Dec;72(6):527-32. Epub 2005 Jun 29.
96. Jerzak M., Kasprzycka M., Wierbicki P., Kotarski J., Gorski A. Apoptosis of T cells in the first trimester human decidua. Am J Reprod Immunol. 1998 Sep;40(3): 130-5.
97. Jones E.A., Clement-Jones M., James O.F., Wilson D.I. Differences between human and mouse alpha-fetoprotein expression during early development. J Anat. 2001 May;198(Pt 5):555-9.
98. Gardeman A., Fink M., Strieker J. et al. ACE I/D gene polymorphism: presence of the ACED allele increasing the risk of coronary artery disease in younger individuals. //Atherosclerosis, 1998, 139: 153-9.
99. Goodwin T.M, Hershman J.M. Hyperthyrodism due to inappropriate production of human chorionic gonadotropin.- Clinical Obstetrics And Gynecology.- 1997;(40) №1:32-44.
100. Goronzy J.J., Bartz-Bazzanella P., Hu W., Jendro M.C., Walser-Kuntz D.R., Weyand C.M. Dominant clonotypes in the repertoire of peripheral CD4+ T cells in rheumatoid arthritis. J. Clin. Invest. 1994 Nov; 94(5):2068-76.
101. Goronzy J.J., Zettl A., Weyand C.M. T cell receptor repertoire in rheumatoid arthritis. Int Rev Immunol. 1998; 17(5-6):339-63.
102. Gough A.K., Lilley J., Eyre S. et al. Generalised bone loss in patients with early rheumatoid arthritis. Lancet, 1994, 2; 344 (8914): 23-7.
103. Gravallese E M. Bone destruction in arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases 2002; 61: 84-86.
104. Gubitz G., Sandercock P. Acute ischemic stroke. // BMJ, 2000, 320: 692-6.
105. Guller S., LaChapelle L. The role of placental Fas ligand in maintaining immune privilege at maternal-fetal interfaces. Semin Reprod Endocrinol. 1999;17(l):39-44.
106. Gupta S., Fikring S., Good R.A.// Subpopulation of human T- lymphocytes. T cell subpopulations in children with bronchial asthma.- Int.Arch.Allergy.- 1980.-Vol.61. № 3.-P.293-298.
107. Hasbold J., Gett A.V.,Rush J.S., Deenick E., Avery D., Jun J., Hodgkin P.D. Quantitative analysis of lymphocyte differentiation and proliferation in vitro using carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Immunol Cell Biol. 1999 Dec;77(6):516-22.
108. Hooper D.C., Evans R.G. Anti-proliferative action of murine alpha-fetoprotein on activated T-lymphocytes. J Reprod Immunol. 1989 Sep;16(l):83-96.
109. Houqhton D.I., Newnham I.P., Kitau M.I., Chard T. Short-term variation in the level of alpha-fetoprotein in maternal serum. Br J Obstet Gynecol 1983; 90: 3: 235-237.
110. Isomaki P., Luukkainen R., Lassila O., Toivanen P., Punnonen J. Synovial fluid T cells from patients with rheumatoid arthritis are refractory to the T helper type 2 differentiation-inducing effects of interleukin-4. Immunology.1999 Mar; 96(3):358-64.
111. Kang Y.M., Zhang X., Wagner U.G., Yang H., Beckenbaugh R.D., Kurtin P.J., Goronzy J.J., Weyand C.M. CD8 T cells are required for the formation of ectopic germinal centers in rheumatoid synovitis. J. Exp. Med. 2002 May 20; 195(10):1325-36.
112. Klimiuk PA, Yang H, Goronzy JJ, Weyand CM. Production of cytokines and metalloproteinases in rheumatoid synovitis is T cell dependent. Clin. Immunol. 1999 Jan; 90(l):65-78.
113. Klimiuk PA, Sierakowski S, Latosiewicz R, Cylwik B, Skowronski J, Chwiecko J. Serum cytokines in different histological variants of rheumatoid arthritis. J. Rheumatol. 2001 Jun; 28(6): 1211-7
114. Kodama T, Нага T, Okamoto E, Kusunoki Y, Ohama K. Characteristic changes of large granular lymphocytes that strongly express CD56 in endometrium during the menstrual cycle and early pregnancy.Hum Reprod. 1998 Apr; 13(4): 1036-43.
115. Kraan M.C., Haringman J.J., Post W.J., Versendaal J., Breedveld F.C., Так P.P. Immunohistological analysis of synovial tissue for differential diagnosis in early arthritis. Rheumatology (Oxford). 1999 Nov; 38(11): 1074-80.
116. Kaji K., Takeshita S., Miyake K., Takai Т., Kudo A. Functional association of CD9 with the Fc gamma receptors in macrophages. J Immunol. 2001 Mar l;166(5):3256-65.
117. Krause T.G., Christens P., Wohlfahrt J., Lei U., Westergaard Т., Norgaard-Pedersen В., Melbye M. Second-trimester maternal serum alpha-fetoprotein and risk of adverse pregnancy outcome(l). Obstet Gynecol. 2001 Feb;97(2):277-82.
118. Kreienberg R., Goldhofer W., Melchert F., Lemmel E.M. Inhibition of lymphocyte reactivity by pregnancy-associated serum factors. Arch Gynecol. 1979 Jul 20;228(l-4):600-l.
119. Kusaba M., Honda J., Fukuda Т., Oizumi K. Analysis of type 1 and type 2 T cells in synovial fluid and peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 1998 Aug; 25(8): 1466-71.
120. LokarR, Kolbas V, Sabioncello A, Rabatic S. T-lymphocyte subpopulations in children's atopic asthma. Allerg Immunol (Leipz). 1990; 36(2):87-94.
121. Lorenz H.M. T-cell-activation inhibitors in rheumatoid arthritis. BioDrugs. 2003; 17(4):263-70.
122. Lorenzo H.C., Geuskens M.,Macho A.,Lachkar S.,Verdiere-Sahuque M., Pineiro A., Uriel J. Alpha-fetoprotein binding and uptake by primary cultures of human skeletal muscle. Tumour Biol. 1996; 17(4):251-60.
123. Magalhaes R., Stiehl P., Morawietz L., Berek C., Krenn V. Morphological and molecular pathology of the В cell response in synovitis of rheumatoid arthritis. Virchows Arch. 2002 Nov; 441(5):415-27. Epub 2002 Nov 5.
124. Maini R.N. The role of cytokines in rheumatoid arthritis. The Croonian Lecture 1995. JR Coll Physicians Lond. 1996 Jul-Aug; 30(4):344-51
125. Maurice M.M., Lankester A.C., Bezemer A.C., Geertsma M.F., Так P.P., Breedveld F.C., van Lier R.A., Verweij C.L. Defective TCR-mediated signaling in synovial T cells in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 1997 Sep 15; 159(6):2973-8.
126. Migita K., Maeda Y., Miyashita Т., Kimura H., Nakamura M., Ishibashi H., Eguchi K. The serum levels of resistin in rheumatoid arthritis patients. Clin Exp Rheumatol. 2006 Nov-Dec;24(6):698-701.
127. Muller-Ladner U., Gay R.E., Gay S. Molecular biology of cartilage and bone destruction. Curr Opin Rheumatol. 1998 May; 10(3):212-9.
128. Norbiato G, Bevilacqua M, Vago T, Clerici M. Glucocorticoids and Th-1, Th-2 type cytokines in rheumatoid arthritis, osteoarthritis, asthma, atopic dermatitisand AIDS. Clin Exp Rheumatol. 1997May-Jun; 15(3):315-23.119
129. Poriadin G.V., Salmasi Zh.M., Kazimiskii A.N. Activation markers of lymphocytes as indicators of immune system dysregulation in inflammation. Patol Fiziol Eksp Ter. 2006 Jan-Mar; (l):2-7.
130. Rabatic S, Gagro A, Medar-Lasic M. CD21-CD23 ligand pair expression in children with allergic asthma. Clin Exp Immunol. 1993 Nov;94(2):337-40.
131. Rifas L. Bone and cytokines: beyond IL-1, IL-6 and TNF-alpha. Calcif Tissue Int. 1999 Jan;64(l):l-7.
132. Rittner H.L., Zettl A., Jendro M.C., Bartz-Bazzanella P., Goronzy J.J., Weyand C.M. Multiple mechanisms support oligoclonal T cell expansion in rheumatoid synovitis. Mol Med. 1997 Jul; 3(7):452-65.
133. Runmarker В., Andersen O. Pregnancy is associated with a lower risk of onset and a better prognosis in multiple sclerosis. Brain. 1995 Feb; 118 (Pt 1):253-61.
134. Saito S, Tsukaguchi N, Hasegawa T, Michimata T, Tsuda H, Narita N. Distribution of Thl, Th2, and ThO and the Thl/Th2 cell ratios in human peripheral and endometrial T cells. Am J Reprod Immunol. 1999 0ct;42(4):240-5.
135. Saito S, Taniguchi K. Expression patterns of glycoconjugates in the three distinctive olfactory pathways of the clawed frog, Xenopus laevis.J Vet Med Sci. 2000 Feb;62(2):153-9.
136. Schmidt D., Martens P.B., Weyand C.M., Goronzy J.J. The repertoire of CD4+ CD28- T cells in rheumatoid arthritis. Mol Med. 1996 Sep; 2(5):608-18.
137. Schmitt M, Niggemann B, Kleinau I, Nasert S, Kapp A, Wahn U. Lymphocyte subsets, sIL2-R and sICAM-1 in blood during allergen challenge tests in asthmatic children. Pediatr Allergy Immunol. 1993 Nov; 4(4):208-13.
138. Shi H.Z., Sun J.J., Pan H.L., Lu J.Q., Zhang J.L., Jiang J.D. Alterations of T-lymphocyte subsets, soluble IL-2 receptor, and IgE in peripheral blood of children with acute asthma attacks. J Allergy Clin Immunol. 1999 Mar; 103(3 Pt l):388-94.
139. Seki M., Ushivama C., Seta N. et al. Apoptosis of lymphocytes induced by glucocorticoids and relationship to therapeutic efficacy in patients with systemic lupus erythematosus // Arthritis & Rheum.- 1998.- Vol. 41.- №5.- P. 823-830.
140. Semenkova L.N., Dudich E.I., Dudich I.V., Shingarova L.N., Korobko V.G. Alpha-fetoprotein as a TNF resistance factor for the human hepatocarcinoma cell line HepG2. Tumour Biol. 1997; 18(l):30-40.
141. Simister N.E., Story C.M., Chen H.L., Hunt J.S. An IgG-transporting Fc receptor expressed in the syncytiotrophoblast of human placenta. Eur J Immunol. 1996 Jul;26(7): 1527-31.
142. Smith T. Latent period for symptomatic sensitization in bakeries. Occup Med (Lond). 2005 Mar;55(2):93-5.
143. Soos J.M., Schiffenbauer J., Torres B.A., Johnson H.M. Superantigens as virulence factors in autoimmunity and immunodeficiency diseases. Med Hypotheses. 1997 Mar;48(3):253-9.
144. Souzdaltseva T.V., Makarova T.V., Vechkanova N.N. NK Cells and IgE Level in Peripheral Blood in Aspirin-Induced and Allergic Bronchial Asthma. Russ J Immunol. 2000 Oct; 5(3):315-319.
145. Suzuki Y., Zeng C.Q., Alpert E. Isolation and partial characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes.J Clin Invest. 1992 0ct;90(4): 1530-6.
146. Steiner G, Tohidast-Akrad M, Witzmann G, Vesely M, Studnicka-Benke A, Gal A, Kunaver M, Zenz P, Smolen JS. Cytokine production by synovial T cells in rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 1999 Mar; 38(3):202-13.
147. Takemura S., Klimiuk P.A., Braun A., Goronzy J.J., Weyand C.M. T cell activation in rheumatoid synovium is В cell dependent. J. Immunol. 2001 Oct 15; 167(8): 4710-8.
148. Tomita K, Tanigawa T, Yajima H, Sano H, Fukutani K, Hitsuda Y, Matsumoto Y, Sasaki T. Expression of adhesion molecules on mononuclear cells from individuals with stable atopic asthma. Clin Exp Allergy. 1997 Jun; 27(6):664-71.
149. Trojan J., Naval J., Jusforgues H., Uriel J. Alpha-fetoprotein (AFP) in granulomatous inflammation of the mouse. Br J Exp Pathol. 1989 Aug;70(4):469-78.
150. Tsai L.C., Tang R.B., Hung M.W., et al.// Expression of serum IL-2, IL-2R, and CD8 levels during hyposensitization in house-dust-sensitive asthmatics.- J. Asthma.-1990.- Vol.27. № 5.- P. 307-313.
151. Tran C.N., Lundy S.K., Fox D.A. Synovial biology and T cells in rheumatoid arthritis. Pathophysiology. 2005 Oct;12(3): 183-9.
152. Varghese J, Gerblich A, Salik H, Schuyler M. Antigen-induced T-cell changes: modulation by pharmacologic agents. Lung. 1990; 168(2):69-78.
153. Villard-Mackintosh L., Vessey M.P. Oral contraceptives and reproductive factors in multiple sclerosis incidence.Contraception. 1993 Feb;47(2): 161-8.
154. Wagner U., Pierer M., Kaltenhauser S., Wilke В., Seidel W., Arnold S.,
155. Hantzschel H. Clonally expanded CD4+CD28 null T cells in rheumatoid arthritis122use distinct combinations of T cell receptor BV and BJ elements. Eur. J. Immunol. 2003 Jan; 33(1): 79-84.
156. Wagner U., Schulze-Koops H. T-lymphocytes-do they control rheumatic immune responses? Z. Rheumatol. 2005 Sep;64(6):377-82.
157. Wegmann T.G., Lin H., Guilbert L., Mosmann T.R. Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a TH2 phenomenon? Immunol Today. 1993 Jul;14(7):353-6.
158. Weyand C.M., Goronzy J.J. Pathogenesis of rheumatoid arthritis. Med Clin North Am. 1997 Jan; 81(l):29-55.
159. Weyand C.M., Goronzy J.J. Ectopic germinal center formation in rheumatoid synovitis. Arm NY Acad Sci. 2003 Apr; 987:140-9.
160. Williams T.J., Jones C.A., Miles E.A., Warner J.O., Warner J.A. Fetal and neonatal IL-13 production during pregnancy and at birth and subsequent development of atopic symptoms. J Allergy Clin Immunol. 2000 May;105(5):951-9.
161. Woolley D.E., Tetlow L.C. Mast cell activation and its relation to proinflammatory cytokine production in the rheumatoid lesion. Arthritis Res. 2000; 2(1): 65-74.
162. Yocum D.E. The role of T-cells in rheumatoid arthritis and the use of immunomodulating drugs. Drugs Today (Bare). 1999 Apr-May; 35(4-5):295-307.
163. Yocum D.E. T cells: pathogenic cells and therapeutic targets in rheumatoid arthritis. Semin Arthritis Rheum. 1999 Aug; 29(l):27-35.
164. Yudoh K., Matsuno H., Nakazawa F., Yonezawa Т., Kimura Т. Reducedexpression of the regulatory CD4+ T cell subset is related to Thl/Th2 balance123and disease severity in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. Mart 2000; 43 (3): 617-27
165. Zhong W.W., Chavali S.R., Forse R.A. Effect of prostaglandin E2 and other intracellular cyclic AMP elevating agents on the mitogen induced mouse splenocyte proliferation in a serum free culture condition.Life Sci. 1994; 55(ll):PL193-8.