Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунотропные препараты из кожи. Разработка методов получения, физико-химическая и иммунобиологическая характеристика и перспектива клинического применения

На правах рукописи

Белова Ольга Владимировна

ИММУНОТРОПНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИЗ КОЖИ. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ПЕРСПЕКТИВА КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

003064Т1Э Москва - 2007

003064719

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава»

Научные консультанты:

академик РАЕН, доктор биологических наук, профессор Арион Виталий Яковлевич;

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Лопухин Юрий Михайлович

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук, профессор Захарова Людмила Алексеевна

2. Доктор биологических наук, профессор Константинова Нелля Александровна

3. Академик Российской академии естественных наук и Российской академии медико-технических наук, доктор медицинских наук, профессор Земсков Владимир Михайлович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Росздрава.

Защита состоится «Z^/ » б^У ¿ЫгМ 2007 г. в часов на заседании

диссертационного совета""Д 208(072.05 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1).

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совет кандидат медицинских наук, доцент

Кузнецова Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Разработка новых иммунотропных препаратов является актуальной проблемой современной иммунологии. Кожа представляет собой богатый источник иммунобиологически активных веществ. В ней обнаружены клетки и медиаторы, принимающие участие как в естественном (врожденном), так и в адаптивном иммунном ответе. В коже выявляют несколько субпопуляций дендритных клеток [Lew W. et al., 2004; Becker Y., 2003; Wollenberg A. et all, 2002; Пащенков M.B. и др., 2001; Ярилин A.A., 1994; Stingl G., 1994]. Лимфоциты осуществляют свои функции в организме, в том числе и в коже, путем постоянной рециркуляции [Катунина О.Р., 2005; Lew W. et al., 2004; Ковальчук Л.В., 2003; Зимина И.В., Лопухин Ю.М., Арион В.Я., 1994; Ярилин A.A., 1994; Скрипкин Ю.К., Лезвинская Е.М., 1989]. В нормальной коже обнаруживается небольшое количество естественных киллеров [Cameron A.L. et al., 2002]. Они относятся к клеткам естественного (врожденного) иммунитета и способны оказывать прямое цитотоксическое действие на злокачественно-трансформированные и вирусинфицированные клетки. Гистиоциты - макрофаги дермы реализуют первую линию иммунной защиты, но принимают участие и в адаптивном иммунитете [Ярилин A.A., 1994]. Большую роль в реализации иммунного ответа играют эндотелиальные клетки сосудов. Они имеют на своей поверхности молекулы адгезии, которые взаимодействуют с соответствующими молекулами на поверхности лимфоцитов и гранулоцитов и обеспечивают миграцию клеток из кровяного русла в ткани, в том числе и в кожу [Lew W. et al., 2004; Зимина И.В., Лопухин Ю.М., Арион В.Я., 1994; Ярилин A.A., 1994]. Тучные клетки (лаброциты, мастоциты) кожи участвуют в аллергических реакциях, немедленного и замедленного типов. Лейкоциты могут покидать кровеносное русло, попадая сначала в дерму, а затем в эпидермис. Нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, выявляемые в коже, принимают участие в иммунологической функции кожи как клеточные факторы естественного

иммунитета. Фибробласты, фиброциты, меланоциты, клетки Меркеля, адипоциты вносят свой вклад в иммунологическую функцию кожи за счет взаимодействия с клетками иммунной системы и синтеза ряда цитокинов [Ярилин A.A., 1994].

Выявлена иммунологическая функция кератиноцитов. Эмбриональные кератиноциты секретируют гормон тимуса тимопоэтин, аналогичный тимопоэтину, выделенному из тимуса взрослых особей [Audhia Т.К., Goldstein G., 1988]. Кератиноциты взрослых особей секретируют эпидермальный фактор дифференцировки лимфоцитов (ELDIF), ингибирующий пролиферацию и стимулирующий созревание лимфоцитов [J.F. Nicolas, 1988].

Помимо клеток большую роль в функционировании иммунной системы играют такие медиаторы иммунного ответа, как цитокины: интерлейкины, интерфероны, хемокины, факторы некроза опухолей, колониестимулирующие факторы, факторы роста, а также противомикробные пептиды [Зимина И.В., Лопухин Ю.М., Арион В.Я., 1994; Ярилин A.A., 1994; Ковальчук JI.B., 2003]. Все сказанное выше говорит о том, что кожа является богатым источником для получения иммунологически активных веществ, хотя используется для этого очень редко.

Существует взаимосвязь между процессами, протекающими в коже и иммунной системой. Многие заболевания кожи протекают на фоне иммунодефицитного состояния. Так при псориазе выявляются нарушения в естественном (врожденном) и адаптивном иммунитете [Катунина O.P., 2005; Короткий Н.Г. и др., 2005; Lew W. et al., 2004; Nickoloff B.J. et al., 2004; Bos J.D., De Rie M.A., 1999; Ortonne J.-P., 1999]. Кроме того, основным проявлением псориаза является гиперпролиферация и незавершенность дифференцировки кератиноцитов. Доказанным фактом при псориазе является сдвиг регуляции Т-лимфоцитов в сторону Т-хелперов типа 1 и цитотоксических Т-лимфоцитов типа 1 [Lew W. et al., 2004; Austin L.M. et al., 1999].

Разработка новых иммунотропных препаратов, регулирующих иммунологические процессы и процессы, протекающие в коже, является актуальной проблемой современной иммунологии.

Цель работы. Разработать методы получения иммунотропных препаратов из кожи, изучить физико-химические и иммунобиологические свойства препаратов и оценить возможность применения одного из них для лечения псориаза.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методы получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи.

2. Определить содержание белка, углеводов, РЫК и общих липидов в полученных препаратах.

3. Изучить некоторые иммунологические свойства полученных препаратов (влияние на количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа и на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей).

4. Исследовать полученные препараты методами изоэлектрофокусирования в агарозе, электрофореза в полиакриламидном геле, а отдельные препараты методами высокоэффективной жидкостной хроматографии.

5. Изучить влияние полученных препаратов на процессы, протекающие в коже (на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и на пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А431).

6. Изучить фармакологические свойства препарата, ингибирующего пролиферацию и стимулирующего дифференцировку кератиноцитов человека (К-активина): кожно-резорбтивное действие, острую и хроническую

токсичность, аллергизирующее действие (в реакциях анафилактического шока и активной кожной анафилаксии).

7. Изучить физико-химические и иммунобиологические свойства К-активина (методами обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, влияние на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей ин виво, влияние на уровень сывороточной тимической активности, на пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А431 и эмбриональных фибробластов человека).

8. Изучить содержание в К-активине и некоторых иммунотропных препаратах цитокинов: трансформирующих факторов роста-бета1 и -бета2, интерлейкина-4, интерлейкина-1бета, фактора некроза опухолей-альфа и эпидермального фактора роста.

9. Сравнить физико-химические и иммунологические свойства аналогичных препаратов, полученных ацетоновым методом и методом, включающим этапы высаливания.

10. Сравнить физико-химические и иммунологические свойства аналогичных препаратов, полученных ацетоновым и безацетоновым методами.

Научная новизна работы

1. Разработаны три новых метода получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи: ацетоновый, безацетоновый и метод с высаливанием.

2. С использованием новых методов получены новые иммунотропные препарата из кожи свиньи, влияющие на показатели гуморального и клеточного иммунитета, а также на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А 431.

3. Изучены физико-химические свойства новых иммунотропных препаратов из кожи свиньи: содержание белка, углеводов, РНК и общих

липидов; гетерогенность, р1 и молекулярные массы белков, белковых субъединиц и РНК. Изучено содержание некоторых цитокинов в отдельных препаратах.

4. Разработан новый иммунотропный препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин.

5. Изучены фармакологические свойства К-активина: кожно-резорбтивное действие, острая и хроническая токсичность, аллергизирующее действие (в реакциях анафилактического шока и активной кожной анафилаксии). В настоящее время материалы по К-активину находятся в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора».

6. Изучен механизм действия К-активина: препарат ингибирует пролиферацию и стимулирует дифференцировку кератиноцитов человека. Помимо этого он повышает сывороточную тимическую активность и стимулирует созревание Т-лимфоцитов.

7. Сравнение аналогичных препаратов, но полученных тремя различными методами, показало, что они отличаются как по физико-химическим, так и по иммунологическим свойствам.

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования. Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин. Метод лечения псориаза запатентован. В настоящее время материалы по К-активину находятся в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора».

Разработаны новые иммунотропные препараты из кожи. Методы их получения запатентованы. После проведения доклинических и клинических испытаний они могут быть использованы в качестве иммунокорригирующих препаратов, а также препаратов, стимулирующих или ингибирующих процессы кератинизации, заживления ран в дерматологии и косметологии.

Разработаны новые методы получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи, которые могут быть использованы для получения препаратов из других источников. По материалам диссертации получены три патента. Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны три новых метода получения эндогенных иммунотропных препаратов из кожи свиньи: ацетоновый, безацетоновый и метод с высаливанием.

2. Продемонстрирована эффективность иммунотропных препаратов из кожи свиньи, полученных новыми методами, по влиянию на показатели гуморального и клеточного иммунитета, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А 431.

3. Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин.

4. Выявлена тимоподобная активность препарата из кожи (К-активина): восстановление сниженной сывороточной тимической активности у тимэктомированных мышей и стимуляция созревания Т-лимфоцитов.

5. Механизмом действия К-активина, эффективного в клинике при лечении псориаза, является ингибирование пролиферации и стимуляция дифференцировки кератиноцитов, повышение сывороточной тимической активности и стимуляция созревания Т-лимфоцитов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на: - 2-м Международном симпозиуме «Реабилитация иммунной системы», Дагомыс, 1990; 1-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1992; Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии, Алма-Ата, 1992; 1-м Съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992; 8-th International Symposium on Infections in the Immunocompromised Host, Davos, Switzerland, 1994; - XY International Congress of Allergology and Clinical Immunology, Stockholm, Sweden, 1994; - 1-ом

Международном конгрессе по иммунореабилитации, Сочи, 1994; - 3-м Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1996; -Всероссийской конференции "Биология клетки в культуре", Санкт-Петербург, 1996; - 2-м Национальном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии", Москва, 1998; - на 2-м конгрессе с международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация", Москва, 1998; - V Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1998; - 2-м Съезде иммунологов России, Сочи, 1999; - 4-м симпозиуме "Неинвазивные физико-химические методы диагностики", Москва, 2000; - VIII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 2001; - V Всероссийской конференции "Паллиативная помощь в онкологии", 2001; - 5-м Конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", Москва, 2002; - Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака», Москва, 2002; - 5-й конгресс с международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении", Египет, 2003; - 1-й Всероссийской конференции по иммунотерапии, Сочи, Дагомыс, 2003; -Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии», Москва, 2005; - XI Международный конгресс по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Тенерифе, Испания, 2006.

Награды. Доклад «Ростовые факторы и цитокины кожи» ("Growth Factors and Cytokines from Skin"), представленный на 8-м Международном симпозиуме по инфекциям у иммунокомпромиссного хозяина, который проводился в Давосе (Швейцария) в 1994 году, получил награду - President Award (8-th International Symposium on Infections in the Immunocompromised Host, Davos, Switzerland, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 научных работ. Получено три патента РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 320 страницах, включая 17 таблиц и 44 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография содержит 429 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.

Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Часть исследований, составивших предмет диссертации, была выполнена совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной иммунологии (зав. лабораторией - академик РАЕН, д.б.н., профессор Арион В .Я.), лаборатории клеточных культур (зав. лабораторией -д.б.н., профессор Капитанов А.Б.), лаборатории экспериментальной гемосорбции и окислительных методов детоксикации (зав. лабораторией -к.м.н. Мартынов А.К.) ФГУ «НИИ физико-химической медицины Росздрава», сотрудниками лаборатории проблем клеточной пролиферации (зав. лабораторией - д.б.н., профессор Терских В.В.) Института биологии развития им. Н.К. Колоцова РАН, сотрудниками кафедры иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (зав. кафедрой - академик РАЕН, д.м.н., профессор Ковальчук Л.В.), сотрудником экспериментально-биологической лаборатории (зав. лабораторией - д.б.н., профессор Степаненко Р.Н.) ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы представлены данные по строению кожи, участию клеток и цитокинов в осуществлении иммунологической функции кожи, по влиянию веществ на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов, нейроиммунокожной системе. Отдельная глава посвящена проблеме псориаза.

Материалы и методы исследования

При разработке методов получения иммунотропных препаратов была использована кожа свиней, полученная на мясокомбинатах г. Москвы и Московской области.

Группа добровольцев - больных псориазом, включала 18 человек обоего пола в возрасте от 23 до 56 лет в активной фазе заболевания, проходивших лечение в дерматологическом отделении и Медицинском центре «Диагностика» 52-й больницы г. Москвы. Лечащий врач - с.н.с. НИИ ФХМ Росздрава, к.м.н. Е.М.Воронцова.

В опытах были использованы инбредные линии мышей C57B1/6J и СВА, полученные из питомника «Столбовая» и вивария Онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН. Изучение фармакологических свойств К-активина проводилось на беспородных белых мышах, беспородных белых крысах, морских свинках и кроликах породы Шиншилла, полученных из питомника «Крюково».

В полученных иммунотропных препаратах определяли содержание белка по методу Lowry О.Н. et al. [1951] и биуретовым методом [Gornall A.C. et al., 1949], РНК по методу Schmidt G., Tannhauser SJ. [1945], углеводов антроновым методом [Seifter S., 1950] и общих липидов -сульфофосфованилиновым методом [Zollner N., Kirsch К., 1962].

Оценивали влияние препаратов на количество антителообразующих клеток селезенки мышей СВА на пике первичного иммунного ответа - метод Ерне [Зигль Э., Бем Э. 1979], и на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезёнки тимэктомированных мышей C57B1/6J к ингибирующему действию азатиоприна ин витро и ин виво по методу Bach J.-F. et al. [1975]. Мышей самцов C57B1/6J тимэктомировали по методу Luckey [1973]. Влияние иммунотропных препаратов на уровень сывороточной тимической активности крови мышей C57B1/6J определяли по методу Dardanne М. et al. [1976].

Иммунотропные препараты исследовали методами гель-хроматографии, высокоэффективной жидкостной гель-хроматографии, обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, изоэлектрофокусирования в тонком слое агарозы [Laas Т. et al., 1980], вертикального двуступенчатого электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Laemmli U.K. [1970], вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 7М мочевины [Maxam A.M., Gilbert W., 1977]. МАЛДИ масс-спектрометрия выполнена с.н.с., к.б.н. Третьяковым В.Е. (лаб. искусственного антителогенеза НИИ ФХМ Росздрава, зав. лабораторией -д.м.н., профессор Петрунин Д.Д.). Выделение и культивирование ксратиноцктов проводили по методу Rheinwald J.G., Green Н. [1975]. Уровень клеточной пролиферации оценивали, определяя количество клеток, выросших за 14 дней. В качестве фидерного слоя использовали фибробласты человека. Дифференцировку кератиноцитов оценивали в культуре кератиноцитов, подвергнутой стриппингу [Rice R.H., Green Н., 1979]. Влияние препаратов на пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток А431 и эмбриональных фибробластов человека изучали по включению [3Н] - тимидина в ДНК клеток. Замеряли уровень радиактизности проб на счетчике "Intertechnique" SL30-300.

Определяли содержания интерлейкина-4, интерлейкина-1бета и фактора некроза опухолей-альфа в иммунотропных препаратах с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, используя диагностические наборы производства НИИ особо чистых препаратов (Санкт-Петербург). Определяли содержания трансформирующих факторов роста-бета1 и бета2 в иммунотропных препаратах с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, используя диагностические наборы "Quantikine", R&D systems, США. Определяли содержания эпидермального фактора роста в иммунотропных препаратах методом конкурентного иммуноферментного анализа, используя набор "Accucyte" фирмы Cytimmune Sciences Inc. (США).

Изучение фармакологических свойств К-активина проводили совместно с сотрудниками лаборатории экспериментальной гемосорбции и окислительных методов детоксикации НИИ ФХМ (зав. лабораторией - к.м.н, Мартынов А.К.). Изучение кожно-резорбтивного действия проводили на белых беспородных мышах и белых беспородных крысах посредством погружения их хвостов в испытуемую 0,03% мазь К-активина на 4 часа. Определение острой токсичности осуществляли на 3-х видах животных: белых беспородных мышах, белых беспородных крысах и морских свинках. Водный раствор К-активина вводили внутрибрюшинно или наносили на кожную поверхность животных. Через 72 часа животных забивали декапитацией, после чего было проведено гистологическое изучение сердца, легкого, печени, почек, селезенки, тонкого и толстого кишечника и кожи. Срезы тканей и органов окрашивали гематоксилином (по Pero) и эозином и по методу Ван Гизона.

Изучение хронической токсичности 0,03% мази К-активин проводили для выявления степени повреждающего действия препарата при его длительном применении. Исследование проводили на кроликах породы Шиншилла в течение 60 дней. Животные были разделены на 3 группы: первые две - опытные и третья - контрольная, по пять кроликов в каждой группе. Первой опытной группе животных мазь К-активин наносили на чистый оголенный участок кожи. Второй опытной группе мазь наносили на оголенный поврежденный (ссадина) участок кожи. Третья группа - контрольная, ей мазь не наносили. Двум кроликам контрольной группы только выщипывали участок кожи, трем кроликам на месте выщипанного участка наносили ссадину, такую же, как у опытных кроликов. На протяжении всего опыта животные находились под ежедневным наблюдением. Раздражающее действие препарата оценивали визуально в баллах по развитию эритемы и отека. Каждые 10 дней на протяжении двух месяцев изучали биохимические показатели крови. Аспарагиновая аминотрансфераза, аланиновая аминотрансфераза и амилаза определялись на биохимическом анализаторе Reflotron, производства фирмы

«Boehringer Mannheim», ФРГ. Все остальные показатели определялись на биохимическом анализаторе Humalyzer 2000, производства фирмы «Human», ФРГ. Определялись следующие показатели: общий белок, альбумин, триглицериды, липопротеины высокой плотности, холестерин, калий, кальций, магний, железо, глюкоза, билирубин общий, мочевина, креатинин, щелочная фосфатаза, аспарагиновая аминотрансфераза, аланиновая аминотрансфераза, амилаза, лактатдегидрогеназа. Спустя 60 дней все кролики были забиты, после чего было проведено гистологическое изучение сердца, легкого, печени, почек, селезенки, тонкого и толстого кишечника и кожи. Срезы тканей и органов окрашивали гематоксилином (по Pero) и эозином и по методу Ван Гизона.

Анафилактогенную активность оценивали в реакции общей анафилаксии (анафилактический шок) на морских свинках. Интенсивность анафилактического шока оценивали в индексах по Weigle. Активную кожную анафилаксию изучали также на морских свинках. Интенсивность реакции оценивали по размерам синего пятна на внутренней стороне кожи после введения исследуемого препарата и раствора синего Эванса.

Статистическую обработку результатов проводили по t-критерию Стьюдента и непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка и создание новых иммунотропных препаратов является одной из перспективных проблем современной иммунологии. Особый интерес представляют эндогенные препараты, т.к. они являются элементами естественных метаболических процессов. Богатым источником иммунотропных веществ является кожа, причем, соотношение этих веществ в здоровой коже хорошо отрегулировано в процессе эволюции. В коже обнаружено большое количество иммунобиологически активных веществ. Необходимо было разработать способ получения иммунотропных препаратов из кожи.

Разработка ацетонового метода получения илтунотропных препаратов Поскольку мы планировали создание лекарственных препаратов и внедрение их в производство, в качестве сырья было решено использовать кожу свиньи. Это было обусловлено тем, что человек и свинья близки между собой по антигенному составу. В ходе выполнения данного исследования был разработан способ получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи, позволяющий получить препараты, обладающие иммунологической активностью. Метод включает следующие этапы: измельчение кожи, гомогенизация, центрифугирование, термоденатурация, центрифугирование, прикапывание супернатанта к охлажденному ацетону, центрифугирование, отмывка осадка ацетоном, высушивание и растворение осадка, центрифугирование, гель-хроматография супернатанта, сбор фракций, их обессоливание и лиофилизация. После разделения на колонке с сефадексом G-50 собирали три фракции с различными молекулярными массами. Фракция №1 имела молекулярную массу более 15 кДа, фракция №2 - от 1,4 до 15 кДа и фракция №3 - менее 1,4 кДа. Фракции обессоливали и лиофилизировали, после чего их обозначали как препарат №1 (П1), препарат №2 (П2) и препарат №3 (ПЗ) соответственно. Разработанный метод мы назвали ацетоновым, т.к. в нем используется ацетон. Метод был запатентован [Арион В.Я., Белова О.В. и др., 1995. Патент №2038087].

В препаратах определяли содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов. Данные представлены в таблице 1. Как видно из представленных данных, содержание белка и общих липидов уменьшается от П1 к ПЗ, в то время как содержание углеводов и РНК увеличивается.

Затем мы изучили влияние препаратов на количество антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей СВА на пике первичного иммунного ответа (метод Ерне). Данные представлены на рис. 1.

Можно отметить, что все три препарата увеличивали количество АОК, но в разных дозах и в различной степени.

Таблица 1. Процентное содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов в препаратах из кожи, полученных ацетоновым методом (М± ш)

П1 ГО ПЗ

Белок (метод Лоури) 91 ± 2,9 51 ±3,2 8,2 ±1,1

Белок (биуретовый метод) 87 ± 7,3 56 ± 6,0 15 ±2,0

Углеводы 0,74 ± 0,30 8,0 ±1,4 9,0 ±2,7

РНК 2,0 ± 0,4 5,4 ±1,0 14 ±2,4

Общие липиды 2,2 ±0,1 1,4 ±0,3 1,4 ±0,2

М - средняя арифметическая; т - стандартная ошибка средней арифметической . Здесь и далее: П1 - препарат №1, П2 - препарат №2, ПЗ - препарат №3.

Рис. 1. Влияние препаратов из кожи свиньи, полученных ацетоновым методом, на количество АОК селезенки мышей линии СВА на пике первичного иммунного ответа.

Самым активным препаратом оказался ПЗ. Он достоверно увеличивал количество АОК во всех исследуемых дозах: 1, 10 и 100 мкг/мышь (Р> 0,99 для всех трех доз). Максимальный эффект проявляла доза 100 мкг/мышь. П1

К П1 П2 пз

достоверно увеличивал количество АОК лишь в дозе 10 мкг/мышь (Р>0,95). П2 достоверно увеличивал количество АОК в дозах 1 и 100 мкг/мышь (Р>0,99 - для 1 мкг/мышь и Р>0,95 - для 100 мкг/мышь).

Поскольку АОК являются потомками В-лимфоцитов, можно говорить о стимулирующем влиянии препаратов на гуморальный иммунитет к Т-зависимому антигену - эритроцитам барана. Не исключено, что все три препарата, активные в данном тесте, содержат одну и ту же аминокислотную последовательность, отвечающую за активность, т.к. известно, что многие белки синтезируются в виде высокомолекулярных предшественников, которые претерпевают созревание, проходя несколько стадий. Возможно также, что препараты содержат различные вещества, не имеющие эту одинаковую аминокислотную последовательность.

Затем мы изучили влияние препаратов на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро. Активными в данном тесте считаются препараты, для которых процент Т-лимфоцитов, чувствительных к азатиоприну составляет 50% или ниже. Данные представлены на рис. 2.

120

20 50 100 мкг'ип

I Рис. 2. Влияние препаратов,

полученных ацетоновым

методом, на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна.

Тест восстановления чувствительности к азатиоприну применяется рядом исследователей для оценки активности тимических факторов. Тимэктомия

приводит к резкому снижению чувствительности Т-лимфоцитов селезенки к азатиоприну, что связано с уменьшением количества зрелых Т-лимфоцитов. Тимические факторы восстанавливают это свойство, способствуя созреванию Т-клеток.

Активным в данном тесте оказался ПЗ в концентрации 10 мкг/мл. В остальных исследованных концентрациях (1, 5, 20, 50 и 100 мкг/мл) ПЗ был неактивен. П1 и П2 не проявляли активность в тесте с азатиоприном. Проявление активности ПЗ в тесте восстановления чувствительность к азатиоприну указывает на увеличение зрелых Т-лимфоцитов среди клеток селезенки тимэктомированных мышей. Препарат проявляет активность, присущую тимическим факторам, что говорит о его влиянии на созревание Т-клеток.

Все три препарата анализировались методом гель-хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) на колонке ТБК в 2000 в условиях высокой ионной силы. Данные представлены на рис. 3.

I ши

1 3 34 6«

I Ш 11

1 ШИ

2 &

П1

пг

ПЗ

Рпс. 3. Гель-хроматография высокого давления (ВЭЖХ) препаратов, выделенных ацетоновым методом. Стрелками указано место выхода маркеров: 1 - голубой декстран (2 000 кДа), 2 - овальбумин (45 кДа), 3 - альфа-химотрипсиноген (25 кДа), 4 - цигохром С (12,3 кДа), 5 - ингибитор трипсина (6,5 кДа), 6 -витамин В12 (1357 Да).

Как видно из представленных данных, при гель-хроматографии высокого давления в П1 выявляются 2 мажорных пика с молекулярной массой (м.м.) 100 кДа (76% площади) и 1800 кДа (20% площади) и два минорных пика с м.м. 400 и 7 кДа. В П2 выявляются четыре мажорных пика с м.м. 100 кДа (14% площади); 11,5 кДа (64% площади); 7,4 кДа (15% площади) и 3,2 кДа (5% площади). Молекулярная масса максимального пика составляет 11,5 кДа. Помимо этого выявляются два минорных пика с м.м. 4600 и 1800 кДа. В ПЗ выявляются два мажорных пика с м.м. 7 кДа (91% площади) и 83 кДа (6% площади) и четыре минорных пика с м.м. 1800, 520, 14 и 0,05 кДа. Таким образом, гель-хроматография высокого давления выявила гетерогенность всех трех препаратов, наиболее гетерогенным является П2.

Препараты были исследованы методом изоэлектрофокусирования в тонком слое агарозы. После проведения ИЭФ пластина разрезалась пополам. Одна половина окрашивалась красителем Кумасси голубым R-250 на белок, другая - метиленовым синим на РНК. Данные представлены на рис. 4.

Рис. 4. ИЭФ в тонком слое агарозы препаратов, выделенных ацетоновым методом (П1, П2, ПЗ) и методом с высаливанием (П1В). Окраска на белок Кумасси R-2S0. М -маркеры pi (стрелками указано положение маркеров): 1 - amyloglucosidase (pi 3.5); 2 -soybean trypsin inhibitor (pi 4.55); 3 - p-lacto-globin A (pi 5.2); 4 - bovine carbonic anhydrase В (pi 5.85); 5 - human carbonic anhydrase В (pi 6.55); 6 - acidic band myoglobin (pi 6.85); 7 -basic band myoglobin (pi 7.35); 8 - acidic band lentil lectin (pi 8.15); 9 - middle band lentil lectin (pi 8.45); 10 - basic band lentil lectin (pi 8.65); 11 - tripsinogen (pi 9.3).

В препарате №1 (П1) были обнаружены 3 мажорных белковых компонента с р! 4,9; 5,0 и 5,1 и один минорный белковый компонент с р! 5,5.

Окраска на РНК метиленовым синим не выявила полос. При окраске на белок П2 были обнаружены 15 полос с р! от 4,3 до 8,3. Основные компоненты сосредоточены в областях с р! от 4,7 до 5,4 и от 7,5 до 8,2. При окраске на РНК П2 были обнаружены три полосы с р! 3,5; 3,8 и 4,3. Полоса с р1 4,3 окрашивалась также на белок. Возможно, этот компонент представляет собой рибонуклеопротеид. При окраске на белок ПЗ было обнаружено два мажорных белковых компонента с р1 4,8 и 5,1 и один минорный - с р! 5,3. При окраске на РНК выявлялся один мажорная компонент с р1 3,6 и один минорный компонент С р! 3,9. Полученные данные по ИЭФ подтверждают данные по гель-хроматотрафии высокого дав ленда о гетерогенности всех трех препаратом. Наибольшей гетерогенностью по данным ИЭФ обладает препарат №2 (П2).

Далее препараты анализировались методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии до деци л сульфата натрия (ДСН-ПААГЭ). После проведения электрофореза гель разрезался пополам. Одна половина окрашивалась красителем Кумасси голубым 11-350 на белок (рис. 5), другая - этидиум бромидом на РНК.

ПЗ П2 ш М

Рис. 5, 6-15% ДСН-ПААГЭ препаратов (П1, П2, ПЗ), выделенных ацетоновым методом. Окраска на бедок Куыаеси R-350. М -маркеры: 1 - hen egg ovotransferrin (76-78 Ша); 2 - bovine serum albumin (66.25 Ша); 3 -hen egg ovalbumin (43 kDa); 4 - bovine carbonic anhydrase (30 kDa); 5 - equine myoglobin (17.2 kDa); 6 - equine cytochrome С (12.3 kDa), 7 - chain JJ insulin (3.5 kDa).

После ДСН-электрофореза в 6-15% ПААГ и окраски на белок были получены следующие данные (рис. 5): в П1 выявлен один мажорный компонент

с молекулярной массой 58 кДа и до 15 минорных компонентов с м.м. от 5,4 до 246 кДа; в П2 найдены три мажорных компонента с м.м. 3,5; 4,5 и 61 кДа и до 13 минорных компонентов с м.м. от 14 до 132 кДа; в ПЗ обнаружены три мажорных компонента с м.м. 3,5; 25 и 59 кДа и до 8 минорных компонентов с м.м. от 23 до 132 кДа. Однако, после ДСН-ЭФ в 6-20% ПААГ и окраски на белок П2 были найдены пять мажорных компонента с м.м. 6,9; 8,4; 11; 12 и 61 кДа. Очевидно, что 20% ПААГ разделяет низкомолекулярные белки лучше, чем 15% ПААГ. Кроме того, оценить молекулярные массы белков в 15% разделяющем геле в области от 3 до 8 кДа можно лишь приблизительно, т.к. маркеры с м.м. 3,5 и 12 кДа находятся достаточно близко. Все это объясняет различие молекулярных масс компонентов, полученных в 15% и 20% ПААГ.

После ДСН-ПААГЭ П1 в 6-15% геле и окраски на РНК этидиум бромидом был обнаружен один мажорный компонент. По отношению к маркерным РЖ его молекулярная масса составляет 50 кДа. этого компонента равен ЯГ мажорного белкового компонента с м.м. 58 кДа. В П2 выявляются два мажорных компонента: с м.м. 52 кДа и приблизительной м.м. 8 кДа. И!" первого компонента равен Ш" одного из мажорных белковых компонентов с м.м. 61 кДа. КГ второго компонента равен ИГ мажорного белкового компонента с м.м. 3,5 кДа. В ПЗ был обнаружен один мажорный компонент с м.м. 51 кДа. ^компонента равен ЯГ одного из основных белковых компонентов с м.м. 59 кДа. После ДСН-ЭФ в 6-20% ПААГ и окраски на РЖ П2 выявляется один мажорный компонент с м.м. 47 кДа по отношению к маркерным РЖ и окрашенная зона с м.м. от 18 до 25 кДа. Увеличение концентрации разделяющего геля с 15 до 20% привело к тому, что низкомолекулярный компонент с м.м. 8 кДа, выявляемый в 15% геле, разделился в виде окрашенной зоны с м.м. от 18 до 25 кДа в 20% геле. Молекулярная масса высокомолекулярного компонента П2, определяемая в 15% и 20% разделяющем геле составляет 52 и 47 кДа соответственно.

Очевидно, что 15% разделяющий гель более точно определяет молекулярную массу высокомолекулярного компонента РНК, чем 20% разделяющий гель.

Для характеристики РНК, входящей в препараты, последние были проанализированы методом вертикального электрофореза в 16% ПААГ в присутствии 7М мочевины. Препараты предварительно растворялись в 7М мочевине в присутствии формамида и выдерживались при 65°С три минуты. При окраске на РНК П1 не было выявлено окрашенных участков. При окраске на РНК П2 выявлялась низкомолекулярная зона от 5,0 до 7,5 кДа. При окраске на РНК ПЗ выявлялись две более узкие зоны с м.м. от 4,8 до 5,2 кДа и от 6,2 до 7,0 кДа.

Методом ДСН-ПААГЭ во всех трех препаратах мы обнаружили мажорные компоненты, которые окрашивались как на белок, так и на РНК. Возможно, они являются смесью белка и РНК, которые мигрируют вместе. Не исключено, однако, что эти компоненты представляют собой комплексы РНК-белок или рибонуклеопротеиды. В П2 выявлена полоса методом ИЭФ, которая окрашивается и на белок, и на РНК. Не исключено, что это рибонуклеопротеид. В ПЗ, вероятнее всего, это смесь белка и РНК, которые мигрируют вместе, т.к. при ИЭФ не выявлено полос, которые окрашиваются и на белок и на РНК.

Суммируя результаты, полученные методами ВЭЖХ, изоэлектрофокусирования и электрофореза, можно сказать, что П1 содержит одну мажорную белковую субъединицу с м.м. 58 к Да и ряд минорных белковых субъединиц, которые формируют три мажорных белка с р1 4,9; 5,0 и 5,1 и м.м. 100 и 1800 кда и и ряд минорных белков. Кроме того, П1 содержит РНК с м.м. 44 кДа. П2 содержит пять мажорных белковых субъединиц с м.м. 6,9; 8,4; 11; 12 и 61 кДА и ряд минорных белковых субъединиц. Вероятно, белковые субъединицы с м.м. 6,9; 8,4; 11 и 12 кДа представляют собой отдельные белки с р1 от 4,7 до 8,2; а субъединица с м.м. 61 кДа и другие субъединицы, вероятно, формирует мажорный белок (белки) с м.м. 100 кДа и р1 от 4,7 до 8,2 и минорные белки. Кроме того, П2 содержит РНК с м.м. от 5 до 7,5 кДа. ПЗ

содержит три мажорных белковых субъединицы с м.м. 3,5; 25 и 59 кДа и ряд минорных субъединиц, которые формируют два мажорных белка с м.м. 7 и 83 кДа и р1 4,8 и 5,1 и ряд минорных белков. ПЗ также содержит РНК с м.м. от 4,8 до 7 кДа.

Для того, чтобы изучить, как иммунотропные препараты, выделенные из кожи, влияют на процессы, протекающие в самой коже, мы исследовали влияние препаратов на пролиферацию кератиноцитов человека в первичной культуре. Данные представлены на рисунке 6.

Рис. 6. Влияние препаратов из кожи свиньи, полученных ацетоновым методом, на пролиферацию кератиноцитов человека в первичной культуре.

Как видно из представленных данных, П1 и ПЗ в концентрации 100 мкг/мл стимулируют пролиферацию кератиноцитов, в то время как П2 ингибирует. Различия по отношению к контролю достоверны для всех препаратов (Р>0,95). В концентрации 10 и 1 мкг/мл препараты практически не влияют на пролиферацию (Р<0,95). Определение жизнеспособности кератиноцитов в присутствии П2 в различных концентрациях не обнаружило нарушений метаболизма и структурной целостности мембран. Можно полагать, что ингибирующий эффект П2 не является цитотоксическим.

Для выявления эффекта препаратов на дифференцировку кератиноцитов человека был введен этап "стриппинга" или принудительного слущивания зрелых кератиноцитов. Культуру кератиноцитов, выращенных на полноценной среде, переводили на третьи сутки на среду, не содержащую ионов кальция. В результате происходит дозревание клеток, начавших дифференцировку, и

о

х

1! и 5 о 1 а.т

38

а

800 600 400 200 0

П1 П2 ПЗ

□ 1 мс/мп

аюшЛл

ВТСОют/м!

отслаивание зрелых слоев клеток. Содержание клеток, обладающих роговой оболочкой, после "стриппинга" возрастает, и в такой тест-системе можно достоверно оценивать эффект препаратов на дифференцировку кератиноцитов человека. Данные представлены на рис. 7.

| Рис 7. Влияние препаратов из кожи свиньи, выделенных ацетоновым методом, на дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре.

Выявлено, что П1 и П2 стимулируют дифференцировку кератиноцитов человека, однако статистически достоверные различия получены лишь для П2 (Р> 0,95). Процент клеток, обладающих роговой оболочкой, после влияния П2 увеличивается в 2,6 раза по отношению к контролю. Влияние ПЗ достоверно не отличается от контроля. Таким образом, П1 стимулирует пролиферацию кератиноцитов человека в первичной культуре и имеет тенденцию к стимуляции их дифференцировки. П2 ингибирует пролиферацию и стимулирует дифференцировку кератиноцитов человека. ПЗ стимулирует пролиферацию кератиноцитов человека и не влияет на их дифференцировку.

В ряде экспериментов нами было исследовано содержание в препаратах таких цитокинов как интерлейкин-4 (ИЛ-4), эпидермальный фактор роста (ЭФР) и фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа). Содержание ИЛ-4 определяли потому, что все три препарата стимулировали гуморальный иммунитет к Т-зависимому антигену, а ИЛ-4 является В-клеточным специфическим ростовым фактором. ЭФР определяли в связи с тем, что П1 и ПЗ стимулировали пролиферацию кератиноцитов человека. Кроме этого, мы определили содержание в препаратах такого ключевого провоспалительного

80

II

§о60 а 3

.>5

55 о

ея го

Ш

П2

ПЗ

цитокина как ФНО-альфа. Он синтезируется моноцитами, макрофагами, Т-клетками (ТЫ), кератиноцитами, нейтрофилами, МК-клетками, эндотелиальными клетками и оказывает иммуностимулирующее действие на Ти В-лимфоциты. Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2. Процентное содержание цитокинов в препаратах, полученных ацетоновым методом (М ± т).

П1 П2 ПЗ

ИЛ-4 (1,4 ± 0,4)х10"7 (1,5 ± 1,1)х10"6 (1,7 ± 0,1)х10"6

ФНО (4,0±0,4)х10"6 0 0

ЭФР (1,4±0,1)х10"3 (1,1 ±0,2)х10'5 (0,97 ± 0,02)х10"5

М - средняя арифметическая; m - ошибка средней арифметической.

Было обнаружено, что содержание ИЛ-4 нарастает от П1 к ПЗ. Эти данные коррелируют с активностью препаратов в методе Ерне. В методе Ерне активность также нарастает в направлении П1-П2-ПЗ. ФНО обнаружен в П1 и не обнаружен в П2 и ПЗ. Присутствие ФНО-альфа в П1 может вносить свой вклад в стимулирующую активность препарата в методе Ерне. ЭФР обнаружен во всех трех препаратах, причем его содержание снижается от П1 к ПЗ. С помощью иммуноферментного набора "Accucyte" фирмы Cytimmune Sciences Inc. мы определяли содержание общего, как связанного, так и несвязанного ЭФР в препаратах. Вероятно, этим объясняется то, что мы выявляем ЭФР во всех трех препаратах. Содержание ЭФР в препаратах не коррелирует с влиянием препаратов на пролиферацию кератиноцитов человека в первичной культуре. Как было отмечено, П1 и ПЗ стимулируют пролиферацию

кератиноцитов и обнаружение ЭФР в этих препаратах может объяснить их стимулирующую активность, хотя не исключает присутствие других стимулирующих факторов. В то же время ЭФР обнаружен в П2, который ингибировал пролиферацию кератиноцитов человека. Вероятно, в П2 присутствуют ингибирующие факторы, действие которых перекрывает влияние ЭФР. Таким образом, обнаружение в иммунотропных препаратах ИЛ-4, ФНО-альфа и ЭФР объясняет часть выявленной иммунобиологической активности, но также наводит на мысль о присутствии других активных факторов.

Поскольку П2 ингибировал пролиферацию кератиноцитов человека в первичной культуре и стимулировал их дифференцировку, а при псориазе одним из основных проявлений является гиперпролиферация и незавершенность дифференцировки кератиноцитов, мы предположили, что П2 может проявить лечебный эффект при псориазе. ГО, полученному ацетоновым методом, мы дали название К-активин. Было решено применять препарат неинвазивным методом - наружно в виде мази. В качестве основы мази было решено использовать крем Унны, состоящий из ланолина, оливкового или подсолнечного масла и воды в соотношении 1:1:1. Необходимо было провести доклинические испытания К-активина, изучив его фармакологические свойства.

Фармакологические свойства К-активина

Кожно-резорбтивное действие мази К-активин. При изучении кожно-резорбтивного действия 0,03% мази К-активин было обнаружено, что целостность кожного покрова на хвостах животных не нарушена.

Острая токсичность. При наблюдении за животными в течение 72 часов не было обнаружено заметных изменений в состоянии животных. Ни одно животное не погибло. Изменения массы тела не было зарегистрировано. Кожный и шерстный покров был в прежнем состоянии. При гистологическом исследовании органов и тканей не было обнаружено достоверных отличий от контрольных групп у всех видов животных (мыши, крысы, морские свинки) как

при внутрибрюшинном введении, так и при накожной аппликации препарата при использовании как терапевтической, так и 100-кратной терапевтической дозы препарата. Проведенное гистологическое исследование показало, что у всех видов животных воздействие К-активина не вызывало нарушений в гистологическом строении внутренних органов.

Хроническая токсичность. На всем протяжении ежедневных наблюдений испытуемые кролики были активны и с хорошим аппетитом. При взвешивании животных было зафиксировано, что они постепенно прибавляли в весе. В опытной группе №2 (мазь + царапина) у кроликов на месте царапины образовывалась корочка, при этом воспалительного отека и болезненности вокруг корочки не наблюдалось. К 4-6 суткам корочка отлетала, к 10-м суткам исчезали легкая пигментация, легкое шелушение и гиперемия. У кроликов опытных групп при накожной аппликации К-активина не было обнаружено достоверных отличий гистологической картины внутренних органов и тканей от контрольной группы. Гистологическая картина кожи кролика с экспериментальным разрезом кожи и последующим нанесением препарата показала успешную репарацию эпидермиса и соединительнотканных компонентов кожи и практически не отличалась от состояния кожи в области пореза у контрольных животных. Проведенное гистологическое исследование показало, что у кроликов воздействие препарата К-активин как при нанесении его на оголенный участок кожи, так и при нанесении на травмированный участок кожи (ссадина) не вызывало нарушений в гистологическом строении внутренних органов и кожного покрова. При изучении биохимических показателей крови было обнаружено, что все исследуемые показатели в обеих опытных группах достоверно не отличались от показателей контрольной группы. Для уровней триглицеридов, липопротеидов высокой плотности и холестерина наблюдались довольно существенные колебания по декадам, однако внутри каждой декады различий между опытными и контрольной группами не отмечалось.

Аллергизирующее действие К-активина. Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок). При постановке реакции общей анафилаксии (анафилактического шока) было обнаружено, что в контрольной группе у всех самцов и у всех самок морских свинок интенсивность анафилактического шока была равна нулю: индексы по Вейглю для каждого животного были равны нулю. Средний индекс по Вейглю в контрольной группе составил нуль. Средний индекс по Вейглю в группе №1 (терапевтическая доза) составил 0,57. В опытной группе №2, которой вводили 10-кратную терапевтическую дозу К-активина, средний индекс по Вейглю составил 1,19. Суммируя результаты реакции анафилактического шока на морских свинках, можно сказать следующее:

1) при использовании терапевтической дозы у большинства животных отсутствовала анафилактогенная активность. У отдельных животных наблюдались начальные слабые проявления анафилактогенной активности. Средний идекс по Вейглю в этой опытной группе составил 0,57, что говорит о слабой анафилактогенной активности.

2) при использовании дозы в 10 раз превышающей терапевтическую у большинства животных анафилактогенная активность также отсутствовала. У отдельных животных наблюдались проявления анафилактогенной активности средней тяжести. Индекс по Вейглю в этой опытной группе составил 1,2; что говорит о слабой анафилактогенной активности.

Заключение: при возможном применении препарата у человека следует ожидать достаточно низкую анафилактогенную активность.

Реакция активной кожной анафилаксии. При исследовании реактивности кожи на введение стерильного физиологического раствора не было обнаружено окрашенных пятен ни у одной из морских свинок. Суммируя результаты реакции активной кожной анафилаксии, можно сказать следующее:

1) Отрицательной считали реакцию, когда диаметр окрашенного пятна был равен или был менее 2 мм. Самки контрольной группы давали

неспецифическую реакцию в дозах 5 и 10 мкг: диаметр окрашенного пятна составлял 4 мм, поэтому в опытной группе оценивали результаты начиная с дозы 2,5 мкг и ниже. Самцы контрольной группы давали неспецифическую реакцию в дозах от 1,25 до 10 мкг: диаметр окрашенного пятна составлял 5-7 мм, поэтому в опытной группе оценивали результаты в дозах 0,625 и 0,31 мкг.

2) Положительной считали реакцию, когда диаметр окрашенного пятна был равен или был более 6 мм. Ни у одной из трех самок в опытной группе не было положительной реакции в дозах от 0,31 до 2,5 мкг. У самцов положительная реакция в опытной группе была лишь у одного самца из трех в дозе 0,625 мкг. Таким образом, у пяти животных из шести отсутствовала анафилактогенная активность. Лишь у одного животного из шести проявлялась анафилактогенная активность. В целом по всей опытной группе можно говорить о слабой анафилактогенной активности.

Заключение: при возможном применении препарата у человека следует ожидать достаточно низкую анафилактогенную активность.

Итак, К-активин не нарушал кожных покровов при изучении кожно-резорбтивного действия, не вызывал заметных изменений в состоянии животных, не вызывал нарушений в гистологическом строении внутренних органов и тканей при изучении острой и хронической токсичности, не вызывал изменений биохимических показателей крови при изучении хронической токсичности и обладал слабым аллергизирующим действием.

После этого мы изучили лечебный эффект препарата на ограниченном количестве добровольцев - больных псориазом путем наружного применения. Группа добровольцев - больных псориазом, включала 18 человек обоего пола в возрасте от 23 до 56 лет в активной фазе заболевания. Препарат применялся наружно 1-2 раза в день в течение 3-х недель. Использовали мазь с содержанием К-актизина 0,01 и 0,03%. Выделяли следующие эффекты лечения К-активином: ремиссия, значительное улучшение, незначительное улучшение, без эффекта и отрицательный эффект. Уже на третий день после применения

препарата у больных псориазом наблюдалось уменьшение инфильтрации очагов поражения, побледнение бляшек, а также уменьшение зуда и жжения. В конце третьей недели лечения эти симптомы постепенно уменьшались, а в случае ремиссии исчезали совсем. В конце лечения исчезала инфильтрация и шелушение кожи. В результате лечения 18 добровольцев - больных псориазом, 39% больных вышли в ремиссию, у 39% больных наблюдалось значительное улучшение, у 5% больных - незначительное улучшение и у 17% больных - не было эффекта. Отрицательный эффект не наблюдался ни у одного больного. Способ лечения псориаза путем наружного применения был запатентован [Лопухин Ю.М., Воронцова Е.М., Белова О.В., Арион В.Я., Машков O.A. Патент №2084230. 1997].

Поскольку К-активин оказался активным при лечении больных псориазом, мы провели более широкое изучение его физико-химических и иммунобиологических свойств.

К-активин был проанализирован методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенной фазе на колонке Lichrospher 100 RP8 (0,4x25 см), уравновешенной 5% ацетонитрилом. Элюцию проводили линейным градиентом концентрации ацетонитрила в диапозоне от 5 до 100% ацетонитрила. В результате проведения хроматографии было выявлено более 50 пиков. Было обнаружено, что К-активин содержит компоненты, не связывающиеся с носителем и выходящие в свободном объеме, в то время как основное количество компонентов сорбируется на носителе. Наиболее легко элюируемый компонент выходит с колонки при 18% концентрации ацетонитрила. Далее компоненты сходят с колонки по ходу всего градиента концентрации ацетонитрила. Можно выделить 9 мажорных компонентов, которые выходят при концентрации ацетонитрила 27%, 33%, 41%, 54%, 71%, 74%, 77%, 87% и 97% и более 40 минорных компонентов. ВЭЖХ в обращенной фазе еще раз подтвердила гетерогенность К-активина.

Молекулярную массу белков, входящих в К-активин изучали методом масс-спектрометрии МАЛДИ (рис. 8). В качестве матрицы использовали синапиновую или 2,5-дигидроксибензойную кислоты.

Intens. ГагЬ1

2000

1000

,0

m/z

Рис. 8. МАЛДИ масс-спектр К-активина от 2000 до 20000 m/z; матрица -синапиновая кислота. По оси абсцисс - отношение массы к заряду (m/z). По оси ординат - интенсивность сигнала.

При использовании в качестве матрицы синалиновой кислоты и разбросе m/z от 2000 до 20000 на масс-спектре можно выявить четыре высокомолекулярных мажорных пика с m/z 6850; 9200; 9810,77; 11 696,96 и 9 низкомолекулярных мажорных пиков с m/z от 2041,23 до 3538,80 (рис. 8). Наиболее интенсивным является пик с m/z равным 11 696,96. Кроме этого выявляется ряд минорных пиков с m/z от 2000 до 15000.

При использовании в качестве матрицы 2,5-дигидроксибензойной кислоты и разбросе m/z от 4000 до 12000 на масс-спектре можно выявить 14 мажорных пиков с m/z от 8182,78 до 11287,51. Кроме этого выявлен ряд минорных пиков с m/z от 4226 до 7200,22. При использовании в качестве

матрицы синапиновой кислоты и разбросе m/z от 10000 до 200 000 m/z можно выявить пик с m/z 22868. Более высокомолекулярных пиков не выявлено. Это не говорит о том, что в пробе отсутствуют высокомолекулярные белки. Такие белки могут присутствовать, но не давать ионов при ионизации.

Методом SDS-ПАГЭ мы выявляем белок с м.м. 61 кДа. Вероятно, он не подвергается ионизации при масс-спектрометрии, т.к. мы его не обнаружили этим методом. Методом SDS-электрофореза в 6-20% полиакриламидном геле мы выявили в К-активине 5 мажорных белков с м.м. 6,9; 8,4; 11; 12 и 61 кДа. Методом масс-спектрометрии в диапазоне m/z от 4000 до 12000 мы выявляем мажорные или минорные белки с m/z 6850; 8452,61; 11150; и 11696,96; что соответствует молекулярным массам белков, выявленных методом электрофореза.

Как было показано выше, К-активин не проявлял активность в азатиоприновом тесте ин витро (рис. 2). Тем не менее, мы изучили влияние К-активина и Тактивина в азатиоприновом тесте у тимэктомированных мышей ин виво. Результаты исследования представлены на рис.9.

Мы обнаружили, что К-активин оказался активным в данном тесте ин виво, хотя был неактивен ин витро. Обращаясь к рисунку 9, можно увидеть,что К-активин в дозе 100 мкг/мышь восстанавливает чувствительность Т-лимфоцитов к азатиоприну в тесте ин виво. Процент Т-лимфоцитов составляет 43%. Тактивин в гораздо меньшей дозе 10 мкг/мышь проявляет большую активность и процент Т-лимфоцитов для него составляет 23%.

Рис. 9. Влияние К-активина, и Тактивина на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к инги-бирующему действию азатиоприна ин виво. Т/Э — тимэктомия.

150 Ш125

§100 о

f 75

50 t— 25

КЬкгрогъ К-активин Тактивин К-активин (Т/3) +

Тактивж

При совместном влиянии К-активина и Тактивина процент Т-лимфоцитов такой же, как и для К-активина - 43%. Исследование К-активина в тесте восстановления чувствительность к азатиоприну ин виво указывает на то, что К-активин способен перевести незрелые формы Т-лимфоцитов в более зрелые. Препарат проявлял активность, подобную тимическим факторам.

В следующей серии экспериментов мы изучили влияние К-активина и Тактивина на уровень сывороточной тимической активности (СТА). Группе тимэктомированных мышей вводили К-активин в дозе 100 мкг/мышь. В качестве контроля использовались две группы мышей. Одной группе была проведена ложная операция: был сделан разрез как при тимэктомии, однако тимус не удаляли, а разрез затем зашивали. Другой группе проводили тимэктомию. Вместо К-активина этим группам вводили физиологический раствор. Четвертой группе мышей делали тимэктомию и вводили Тактивин в дозе 10 мкг/мышь. Данные представлены на рис. 10.

Как видно из представленных данных, уровень сывороточной тимической активности в контрольной группе мышей с ложной тимэктомией составляет 3,0. После тимэктомии уровень СТА снижается до 1,5. При введении К-активина уровень СТА повышался почти до контрольного уровня и составлял 2,7. При введении Тактивина уровень СТА даже превышал уровень контрольной группы и соствлял 3,5. Таким образом, К-активин восстанавливал уровень СТА тимэктомированных мышей почти до контрольного уровня, хотя его активность была ниже активности Тактивина.

Рис. 10. Влияние К-активина и Тактивина на уровень сывороточной тимической активности у мышей С57В1/6.Г.

У

-Л.

1

Контроль Тимэктомия Тимэктомия Тимэктомия (ложная + Тактивин + К-активин

операция)

Таким образом, К-активин, подобно препарату Тактивин, выделенному из тимуса, повышает уровень СТА и стимулирует созревание Т-лимфоцитов. Ранее было показано, что у больных псориазом снижен уровень СТА и имеются нарушения в Т-звене иммунитета. Еще одним механизмом действия К-активина, помимо влияния на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов, является восстановление уровня СТА и влияние на созревание Т-лимфоцитов. Это тем более важно, что последние научные данные говорят о решающей роли Т-лимфоцитов в патогенезе псориаза.

Как можно объяснить, что К-активин неактивен в азатиоприновом тесте ин витро, но активен в том же тесте ин виво? Это может быть связано либо с отсутствием клеток-мишеней в селезенке тимэктомированных мышей, либо с присутствием ингибиторов в составе К-активина. В качестве ингибиторов может быть РНК. Введение этапов высаливания в ацетоновый метод приводит к появлению активности П2 в азатиоприновом тесте ин витро, которой ранее не было. Поскольку высаливание также приводит к резкому снижению РНК в П2, можно предположить, что именно РНК препятствует выявлению активности в азатиоприновом тесте ин витро.

Можно предложить две гипотезы влияния К-активина на созревание Т-клеток. По обеим гипотезам после введения К-активин попадает в кровь, повышая уровень сывороточной тимической активности. С кровью он разносится по всему организму, проникая в костный мозг и селезенку. По первой гипотезе К-активин по пути от момента введения в организм до момента проникновения в селезенку претерпевает изменения - теряет ингибирующую активность (возможно, связанную с РНК). Затем К-активин действует на клетки-мишени в селезенке. В результате его действия в селезенке увеличивается количество зрелых Т-лимфоцитов. По второй гипотезе К-активин действует на клетки-мишени в костном мозге, стимулируя дифференцировку и созревание Т-лимфоцитов. Зрелые Т-лимфоциты попадают в соответствующие зоны селезенки, где мы их и выявляем с помощью

азатиопринового теста ин виво. Не исключено влияние К-активина на дифференцировку В-лимфоцитов.

Затем мы исследовали влияние К-активина на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 и эмбриональных фибробластов человека в культуре. Данные представлены на рис. 11 (А, Б).

£ 125 ч

1 100 ?

? 75

2 25

5

ш о

А)

¥1 -

— 1 -

в Юмг/мл □ 100 мг/мл

Контроль К-активин

120 80 40 О

Б)

Контроль

К-активин 100 мкг/мл

Рис. 11. Влияние К-актививна на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 в культуре (А) и эмбриональных фибробластов человека в культуре (Б).

Как видно из представленных данных, К-активин в концентрации 100 мкг/мл ингибирует пролиферацию как эпидермоидных клеток карциномы человека А431 в культуре, так и эмбриональных фибробластов человека в культуре. Различия с контролем достоверны по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (Р>0,95). В концентрации 10 мкг/мл К-активин практически не влияет на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431. Эти данные говорят о противоопухолевой активности препарата К-активин в отношении эпидермоидных клеток карциномы человека А431.

Помимо ИЛ-4, ФНО-альфа и ЭФР, которые мы уже определяли в К-активине (табл. 2), мы определили содержание в К-активине трансформирующих факторов роста-бета1 и -бета2 (ТФР-бета1 и ТФР-бета2) и интерлейкина-1бета (ИЛ-1бета). Поскольку К-активин ингибировал пролиферацию кератиноцитов человека в первичной культуре и стимулировал

их дифференцировку, мы определили содержание в препарате ТФР-бета1 и ТФР-бета2. ТФР-бета1 был обнаружен в К-активине, его содержание составило 1,6x10"6 %. ТФР-бета2 не был выявлен в К-активине. Обнаружение ТФР-бета1 в К-активине объясняет ингибирующий эффект препарата на пролиферацию кератиноцитов, но не исключает присутствие в К-активине других ингибирующих факторов. Мы также определили содержание в К-активине ИЛ-1бета. Кератиноциты, макрофаги, клетки Лангергенса, фибробласты, В-лимфоциты, эндотелиальные клетки в коже продуцируют ИЛ-1. Содержание ИЛ-1бета в К-активине составило 1,3х10"5 %.

В К-активине мы выявили ЭФР в концентрации (1,1 ± 0,2)х10'5 . Поскольку К-активин ингибировал пролиферацию кератиноцитов, видимо, эффект ТФР-бета1, выявленного в К-активине (или других ингибирующих факторов), перекрывал эффект ЭФР. Не исключено, что в К-активине присутствуют и другие факторы, влияющие на пролиферацию кератиноцитов.

Таким образом, мы выявили в К-активине ТФР-бета1, ИЛ-4, ИЛ-1 бета и ЭФР, но не обнаружили ТФР-бета2 и ФНО-альфа. Присутствие выявленных цитокинов объясняет часть биологической активности К-активина, который представляет собой гетерогенный препарат. Мы определили лишь некоторые ключевые цитокины в препарате. С большой долей вероятности К-активин содержит и другие цитокины и факторы, проявляющие большой спектр биологической активности. Все это дает возможность К-активину оказывать лечебный эффект у больных псориазом.

Таким образом, был разработан ацетоновый метод получения иммунотропных препаратов. С помощью этого метода были выделены три препарата, были изучены их физико-химические и иммунобиологические свойства. Был разработан препарат К-активин для лечения псориаза путем наружного применения. Были изучены фармакологические свойства К-активина, после чего он был испытан в клинике на ограниченном количестве добровольцев - больных псориазом и дал обнадеживающие результаты. Метод

лечения псориаза был запатентован. Были изучены более подробно физико-химические и иммунобиологические свойства К-активина.

Изучение физико-химических свойств иммунотропных препаратов, полученных с помощью разработанного нами ацетонового метода, показало, что все они, помимо белков, содержат РНК. Для получения более чистых белковых препаратов был разработан метод с высаливанием.

Разработка метода получения иммунотропных препаратов, включающего этапы высаливания Мы ввели в ацетоновый метод получения иммунотропных препаратов этапы высаливания сульфатом аммония - один из широко применяемых способов очистки белков. Этапы нового метода повторяли этапы разработанного нами ацетонового метода вплоть до стадии получения "ацетонового порошка". После чего осадок растворяли, центрифугировали, проводили высаливание №1, доводили рН до 4, проводили высаливание №2 и №3, центрифугировали. После последнего центрифугирования супернатант наносился на колонку с сефадексом С-50. Собирали три фракции с теми же молекулярными массами, что и при разработанном ранее ацетоновом методе, обессоливали и лиофилизировали. Фракция №1 имела молекулярную массу более 15 кДа, фракция №2 - от 1,4 до 15 кДа и фракция №3 - менее 1,4 кДа. Фракции обессоливали и лиофилизировали, после чего их обозначали как препарат №1 (П1), препарат №2 (П2) и препарат №3 (ПЗ) соответственно. Метод был запатентован [Белова О.В., Арион В.Я. и др., 2003. Патент № 2203070]. Определяли содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов. Данные представлены в таблице 3.

Как видно из представленных данных, содержание белка уменьшается от П1 к ПЗ, содержание углеводов нарастает от П1 к ПЗ, а содержание РНК и общих липидов колеблется в пределах от 0,5 до 3,2%.

Таблица 3. Процентное содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов в препаратах из кожи, полученных методом с высаливанием (М ± ш).

П1 П2 ПЗ

Белок (метод Лоури) 98 ±3,3 76 ±15 2,9 ± 0,3

Белок (биуретовый метод) 97+ 2,9 83 ± 11 25 ± 7,4

Углеводы 0,51 ±0,06 3,9 ±0,2 5,9 ±1,8

РНК 3,2 ±0,6 1,2 ±0,4 2,0 ±1,1

Общие липиды 1,9 ±0,5 0,5 ± 0,2 1,0 ±0,7

М - средняя арифметическая; т - стандартная ошибка средней арифметической .

Затем было изучено влияние препаратов на количество АОК селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа. Данные представлены на рисунке 12.

Как видно из представленных данных, П2 и ПЗ увеличивали количество АОК во всех исследованных дозах (1, 10 и 100 мкг/мышь). Различия с контролем достоверны по критерию Стьюдента, Р > 0,95 для всех доз. П1 достоверно увеличивал количество АОК лишь в дозе 100 мкг/мышь. Максимальный эффект оказывал П2 в дозе 10 мкг/мышь. Поскольку АОК являются потомками В-лимфоцитов, можно говорить о стимулирующем влиянии препаратов на гуморальный иммунный ответ к Т-зависимому антигену.

Рис- 12. Влияние препаратов из кожи свиньи, полученных методом с высаливанием, на количество АОК селезенки мышей линии СВЛ на пике первичного иммунного ответа.

Затем было изучено влияние препаратов на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро. Данные представлены на рисунке 13.

□ 5миАя1

ЕПОж^ьл

В20|>кгЛ*1

Рис. 13. Влияние препаратов из кожи свиньи, полученных методом с высаливанием, на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна.

Как видно из представленных данных, активными в данном тесте оказались все три препарата. П1 и ПЗ были активными в концентрации 20 мкг/мл, а П2 - в концентрации 10 мкг/мл. Б настоящем исследовании препараты восстанавливали чувствительность к азатиоприну, что говорит об их влиянии на созревание Т-клеток.

Затем препараты были проанализированы методом ИЭФ в тонком слое агарозы. После постановки ИЭФ пластину разрезали пополам. Одну половину окрашивали красителем Кумасси голубым 11-250 на присутствие белка, а другую - метиленовьгм синим - на РНК. Данные представлены на рис. 14.

Piic. 14. ИЭФ в тонком слое агарозы препаратов, выделенных методом с высаливанием (окраска на белок Кумасси R-250). М

- маркеры pi (стрелками указано положение маркеров): 1 -amyloglucosidase (pi 3.5); 2 - soybean trypsin inhibitor (pi 4.55); 3

- p-lactoglobin A (pi 5.2); 4 - bovine carbonic anhydrase В (pi 5.85); 5 - human carbonic anhydrase В (pi 6.55); 6 - acidic band myoglobin (pi 6.85); 7 - basic band myoglobin (pi 7.35); 8 - acidic band lentil lectin (pi 8.15); 9 - middle band lentil lectin (pi 8.45); 10 - basic band lentil lectin (pi 8.65); 11 - tripsinogen (pi 9.3).

При окраске на белок П1 были обнаружены 3-4 мажорных компонента с р! от 4,6 до 5,3 и до семи минорных компонентов с pi от 4,4 до 5,6. При окраске на белок П2 было обнаружено 5-6 мажорных компонентов с pi от 4,3 до 5,0 и до 14 минорных компонентов с pi от 3,6 до 8,2. При окраске на белок ПЗ были обнаружены 4 слабо окрашенных компонента с pi 4,3; 4,4; 4,6 и 8,2. При окраске на РНК метиленовым синим не было выявлено полос ни в одном из препаратов.

Затем препараты анализировались методом ДСН-ПААГЭ в 6-15% геле. После проведения электрофореза и окраски красителем Кумасси R-350 в П1 были обнаружены два мажорных белковых компонента с м.м. 54 и 56 кДа и до 13 минорных компонентов с м.м. от 8,5 до 105 кДа. В П2 были найдены пять мажорных белковых компонентов с м.м. 7,4; 9,3; 12; 52 и 54 кДа. Кроме того, было обнаружено 5 минорных компонентов с м.м. от 3,8 до 23 кДа. В ПЗ были обнаружены два мажорных белковых компонента с м.м. 5,8 и 51 кДа и 3 минорных компонентов с м.м. от 7,9 до 63 кДа.

Затем мы исследовали влияние препаратов на пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А431. Данные представлены на рис. 15. Как видно из представленных данных, все три препарата ингибировали пролиферацию эпидермоидных клеток, П2 и ПЗ - в

М П1 П2 ПЗ

обеих исследуемых концентрациях, а П1 в концентрации 100 мкг/мл (различия достоверны по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни, Р>95%).

Рис. 15. Влияние препаратов, полученных методом с высаливанием, на

пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431.

Итак, все три препарата ингибируют пролиферацию эпидермоидных клеток А431. Возможно, что это свойство связано с различными белковыми молекулами. Но может быть, что все три препарата содержат одну и ту же белковую последовательность, которая и проявляет активность в данном тесте. Эти данные говорят о противоопухолевой активности препаратов в отношении эпидермоидных клеток карциномы человека А431.

Затем мы сравнили физико-химические и иммунологические свойства препаратов, полученных ацетоновым методом и методом с высаливанием. Было обнаружено, что введение высаливания привело к изменению физико-химических свойств аналогичных препаратов: увеличилось содержания белка, уменьшилось содержания углеводов и общих липидов; значительно сократилось содержание РНК в препаратах №2 и №3 и имеется тенденция к ее увеличению в препарате №1. Изменилось количество белков и их субъединиц, выявляемых методами ИЭФ и ДСН-ПААГЭ в аналогичных препаратах: высаливание привело к исчезновению белков с р1 от 5,2 до 8,15 и резкому снижению числа мажорных белков в П2, к изменению молекулярных масс белковых субъединиц, выявляемых при ДСН-ПААГЭ в аналогичных препаратах. Не было обнаружено РЖ методом ИЭФ ни в одном из препаратов, полученных методом с высаливанием. Введение этапов высаливания в ацетоновый метод привело к увеличению иммунологической активности во

□ ЮмзЛС! ЕЗШЬнг/мл

всех препаратах с аналогичными молекулярными массами, как в методе Ерне, так и в азатиоприновом методе. В азатиоприновом тесте стали активными все три препарата.

Разработанные методы получения препаратов из кожи свиньи включают использование в больших количествах такого органического растворителя как ацетон, который является легковоспламеняемой жидкостью и вызывает поражение центральной нервной системы. В связи с этим одной из актуальных задач было создание экологически более чистого метода выделения иммунотропных препаратов из кожи свиньи.

Разработка безацетонового метода получения иммунотропных препаратов

Мы заменили этап прикапывания супернатанта к ацетону в ацетоновом методе этапом обработки супернатанта сжиженным углекислым газом, т.к. последний по своим свойствам близок к ацетону. Первые этапы безацетонового метода повторяют этапы ацетонового метода вплоть до этапа центрифугирования после термоденатурации супернатанта. Затем следует лиофилизация супернатанта, обработка сжиженным углекислым газом, растворение лиофилизата, центрифугирование, высаливание, центрифугирование, разведение супернатанта водой, фильтрование и гель-хроматография. После гель-хроматографии на колонке с сефадексом С-50 собирали три фракции с теми же молекулярными массами, что и при разработанном ранее ацетоновом методе, обессоливали и лиофилизировали. Фракция №1 имела молекулярную массу более 15 кДа, фракция №2 - от 1,4 до 15 кДа и фракция №3 - менее 1,4 кДа. Фракции обессоливали и лиофилизировали, после чего их обозначали как препарат №1 (П1), препарат №2 (П2) и препарат №3 (ПЗ) соответственно. Разработанный метод был назван безацетоновым.

В препаратах определяли содержание белка по Лоури и биуретовым методом, углеводов, РНК и общих липидов. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4. Процентное содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов в препаратах из кожи, полученных безацетоновым методом

Содержание в % (М± ш)

Номера препаратов П1 П2 ПЗ

Белок (метод Лоури) 87 ± 5,2 50 ± 6,5 9,1 ± 0,9

Белок (биуретовый метод) 92 ± 0,5 37 ± 11 21 ±4,5

Углеводы 3,6 + 1,1 4,1 ± 1,7 2,4 ±1,5

РНК 4,6+1,3 4,9 ±1,3 3,6 ±2,2

Общие липиды 3,5 ±1,2 0,7 ±0,2 0,6 ±0,2

М - средняя арифметическая; т - стандартная ошибка средней арифметической.

Как видно из представленных данных, содержание белка и общих липидов падает от П1 к ПЗ. Содержание РНК и углеводов колеблется в пределах от 2,4 до 4,9%.

Было изучено влияние препаратов на количество АОК селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа. Данные представлены на рисунке 16.

Как видно из представленных данных, П2 и ПЗ по разному влияли на количество АОК, в то время как П1 не вызывал достоверного увеличения количества АОК. П2 достоверно увеличивал количество АОК в дозе 10

мкг/мышь и достоверно уменьшал в дозе 100 мкг/мышь. Различия достоверны по критерию Стьюдента (Р>99%).

Рис. 16. Влияние препаратов, полученных безацетоновым

методом, на количество АОК селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа.

ПЗ достоверно увеличивал количество АОК в дозе 50 мкг/мышь (Р>99%). Поскольку АОК являются потомками В-лимфоцитов, можно говорить о стимулирующем влиянии ПЗ на гуморальный ответ к Т-зависимому антигену. Влияние П2 зависит от дозы. Он может как стимулировать, так и ингибировать гуморальный Т-зависимый ответ.

Затем мы изучили влияние препаратов на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро. Данные представлены на рис.17. Как видно из представленных данных, активностью в данном тесте обладает лишь ПЗ в концентрации 10 мкг/мл.

Рис. 17. Влияние препаратов, полученных безацетоновым методом, на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к

ингибирующему действию азатиоприна.

Препараты анализировались методом ДСН-ПААГЭ в 6-15% ПААГ. Данные представлены на рис. 18.

100

Рис. 18. ДСН-электрофорез препаратов, выделенных безацетоновым методом, в 6-15% ПААГ (окраска на белок красителем Кумасси R-350). М - маркерные белки. Стрелками указано место выхода маркерных белков: 1 - hen egg ovotransferrin (76-78 kDa); 2 -bovine serum albumin (66.25 kDa); 3 - hen egg ovalbumin (43 kDa); 4 - bovine carbonic anhydrase (30 kDa); 5 - equine myoglobin (17.2 kDa); 6 - equine cytochrome С (12.3 kDa).

После ДСН-ЭФ и окраски на белок П1 был обнаружен один мажорный компонент с молекулярной массой 55 кДа и 5 минорных компонента с м.м. от 25 до 77 кДа. В П2 были найдены 3 мажорных компонента с м.м. 6,3; 12 и 58 кДа и 7 минорных компонентов с м.м. от 17 до 77 кДа. В ПЗ был найден один мажорный компонент с м.м. 62 кДа и один минорный компонент с м.м. 27 кДа.

Затем препараты были исследованы методом изоэлектрофокусирования в тонком слое агарозы. При окраске на белок П1 были обнаружены 2-3 мажорных компонента с pi от 4,4 до 4,8 и один минорный компонент с pi 5,2. При окраске на белок П2 были обнаружены 13 мажорных компонентов с pi от 4,5 до 6,0 и 3-4 минорных компонента с pi от 3,5 до 6,6. При окраске на белок ПЗ не было обнаружено компонентов. Окраска на РНК метиленовым синим не выявила полос ни в одном из препаратов.

В процессе работы было обнаружено, что длительное хранение обезжиренного лиофилизированного супернатанта в холодильнике при +4°С в течение 4-6 лет приводит к изменению физико-химических и иммунологических свойств препаратов, выделенных из этого порошка. Уменьшается содержание белка и РНК в П1 и П2, в ПЗ - не изменяется, увеличивается содержание углеводов во всех трех препаратах. Снижается молекулярная масса мажорной белковой субъединицы в ПЗ. В процессе хранения теряется активность ПЗ в азатиоприновом тесте ин витро, но появляется в препаратах, ранее не обладающих таковой: в П1 и П2.

При сравнении физико-химических и иммунологических свойств препаратов, полученных ацетоновым и безацетоновым методами (срок хранения лиофилизата - до года), было обнаружено, что они обладают как общими, так и различными свойствами. Аналогичные препараты имели одинаковое содержание белка по Лоури и проявляли одинаковую активность в азатиоприновом тесте ин витро. П1 и П2, полученные ацетоновым и безацетоновым методами имели одинаковое количество мажорных белков с близкими р1. Методом ДСН-ПААГЭ в аналогичных препаратах, полученных ацетоновым и безацетоновым методами выявляются общие белковые компоненты с близкими молекулярными массами. В то же время, аналогичные препараты, выделенные ацетоновым и безацетоновым методами, отличаются по содержанию РНК, углеводов и общих липидов и по влиянию на количество антителообразующих клеток селезенки мышей СБА на пике первичного ответа. Не было выявлено РНК методом ИЭФ ни в одном из препаратов, полученных безацетоновым методом, хотя в препаратах, полученных ацетоновым методом, были выявлены компоненты РНК в П2 и ПЗ. Методом ДСН-ПААГЭ и ИЭФ в препаратах, выделенных ацетоновым методом, выявляются белковые компоненты, отсутствующие в аналогичных препаратах, выделенных безацетоновым методом. Все три препарата, полученные ацетоновым методом, увеличивали количество антителообразующих клеток селезенки мышей СВА на

пике первичного ответа, в то время как П2, полученный безацетоновым методом в дозе 100 мкг/мышь - уменьшал. В методе Ерне отличается характер зависимости активности аналогичных препаратов от дозы.

Выводы

1. Разработаны три новых метода получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи: ацетоновый, безацетоновый и метод с высаливанием. С помощью разработанных методов получены препараты и изучены их физико-химические и иммунобиологические свойства.

2. Содержание белка в препаратах снижается от П1 к ГО независимо от разработанного метода. Содержание углеводов, РНК и общих липидов колеблется от 0,5 до 14%.

3. Выявлена гетерогенность полученных препаратов. Наименее гетерогенными оказались П1, выделенные тремя вновь разработанными методами. Они содержат 1-2 мажорных белковых субъединицы и ряд минорных субъединиц, которые формируют 3-4 мажорных белка и ряд минорных белков. Наиболее гетерогенными оказались П2, выделенные ацетоновым и безацетоновым методами, в которых выявляется до 13-15 белков.

4. Из девяти полученных препаратов восемь препаратов в дозах от 1 до 100 мкг на мышь увеличивали количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа; П2, выделенный безацетоновым методом, в дозе 100 мкг на мышь снижал количество антителообразующих клеток, а П1, выделенный безацетоновым методом, был неактивен. Все три препарата, выделенные методом с высаливанием; П2 и ПЗ, выделенные ацетоновым методом и ГО, выделенный безацетоновым методом стимулировали созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей.

5. Препараты, выделенные ацетоновым методом, по-разному влияли на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека ин витро: П1 и ПЗ стимулировали пролиферацию и практически не влияли на дифференцировку

кератиноцитов человека, П2 ингибировал пролиферацию и стимулировал дифференцировку кератиноцитов человека. Все три препарата, полученные методом с высаливанием, ингибировали пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431.

6. Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин. Изучены физико-химические и биологические свойства К-активина (П2, полученного ацетоновым методом). Продемонстрирована гетерогенность препарата методами изоэлектрофокусорования, электрофореза в ПААГ, ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Выявлена тимоподобная активность К-активина: препарат восстанавливал сниженный уровень сывороточной тимической активности тимэктомированных мышей почти до нормы и стимулировал созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей. Кроме того, К-активин ингибировал пролиферацию кератиноцитов человека, эпидермоидных клеток карциномы человека А431 и эмбриональных фибробластов человека в культуре и стимулировал дифференцировку кератиноцитов человека.

7. Изучение биологических свойств К-активина показало, что он не нарушал кожных покровов, не вызывал заметных изменений в состоянии животных, не вызывал нарушений в гистологическом строении внутренних органов и тканей при изучении острой и хронической токсичности, не вызывал изменений биохимических показателей крови и обладал слабым аллергизирующим действием. В настоящее время материалы по К-активину находятся в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора».

8. В К-активине были обнаружены такие цитокины как ТФР-бета1, ИЛ-4, ИЛ-1бета и ЭФР, но отсутствовали цитокины: ТФР-бета2 и ФНО-альфа. В П1, выделенном ацетоновым методом, обнаружено присутствие ИЛ-4, ФНО-альфа и ЭФР, а в ПЗ, выделенном ацетоновым методом - ИЛ-4 и ЭФР.

Присутствие выявленных цитокинов объясняет некоторые иммунобиологические свойства препаратов.

9. Сравнение физико-химических и иммунологических свойств аналогичных препаратов, полученных ацетоновым методом и методом, включающим этапы высаливания, показало, что введение высаливания привело к изменению физико-химических свойств препаратов: увеличилось содержания белка, уменьшилось содержания углеводов и общих липидов; значительно сократилось содержание РНК в П2 и ПЗ. Высаливание привело к изменению молекулярных масс белковых субъединиц и количества белков в аналогичных препаратах, резкому снижению числа мажорных белков в П2 и к исчезновению белков с р1 от 5,2 до 8,15. Не было обнаружено РНК методом ИЭФ ни в одном из препаратов, полученных методом с высаливанием.

10. Введение этапов высаливания в ацетоновый метод привело к усилению иммунологической активности во всех аналогичных препаратах как по влиянию на антителогенез, так и на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей. Все три препарата, полученные методом с высаливанием, стимулировали созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей в отличии от ацетонового метода, где был активным лишь ПЗ.

11. При сравнении аналогичных препаратов, выделенных ацетоновым и безацетоновым методами, оказалось, что они обладают как общими, так и различными физико-химическими и иммунологическими свойствами. Аналогичные препараты имели одинаковое содержание белка по Лоури и одинаково влияли на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей. П1 и П2, полученные ацетоновым и безацетоновым методами, имели одинаковое количество мажорных белков с близкими р1. В аналогичных препаратах, полученных ацетоновым и безацетоновым методами выявляются общие белковые субъединицы с близкими молекулярными массами.

12. Аналогичные препараты, выделенные ацетоновым и безацетоновым методами, отличаются по содержанию РНК, углеводов и общих липидов и по влиянию на количество антителообразующих клеток селезенки мышей СБА на пике первичного ответа. Не было выявлено РНК методом ИЭФ ни в одном из препаратов, полученных безацетоновым методом, хотя в препаратах, полученных ацетоновым методом, были выявлены компоненты РНК. В препаратах, выделенных ацетоновым методом, выявляются белковые субъединицы, отсутствующие в аналогичных препаратах, выделенных безацетоновым методом. Все три препарата, полученные ацетоновым методом, увеличивали количество антителообразующих клеток селезенки мышей СВА на пике первичного ответа, в то время как П2, полученный безацетоновым методом в дозе 100 мкг/мышь - уменьшал.

Практические рекомендации Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин. В ближайшее время планируется проведение широких клинических испытаний, после чего он может быть рекомендован для лечения псориаза путем наружного применения. В дальнейшем планируется промышленный выпуск препарата.

Иммунотропные препараты из кожи, полученные новыми методами после проведения доклинических и клинических испытаний могут быть рекомендованы в качестве иммунокорригирующих препаратов, а также препаратов, стимулирующих или ингибирующих процессы кератинизации, заживления ран в дерматологии и косметологии.

Разработанные новые методы получения иммунотропных препаратов могут быть рекомендованы для получения препаратов из других источников.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Белова О.В., Иванова В.Ф., Луканидина Т. А., Капитанов А.Б. Иммунолигически активные факторы кожи. // 2-й Международный симпозиум «Реабилитация иммунной системы». Сочи-Дагомыс. - 1990. - С. 349.

2. Арион В .Я., Белова О.В., Иванова В.Ф., Плахов И.В., Зимина И.В. Кожа -источник новых лекарственных средств. // 1-й Российский национальный конгрессе «Человек и лекарство». Москва. - 1992. - С.93.

3. Белова О.В., Арион В .Я., Луканидина Т.А., Сысоева О.Б., Кротова С.Б., Короткова М.Н., Забазарных М.Ю. Иммунологически активные вещества кожи. // Международный симпозиум по аллергологии и клинической иммунологии. Алма-Ата. - 1992. - С. 28.

4. Белова О.В., Арион В.Я., Луканидина Т.А., Сысоева О.Б., Кротова С.Б., Короткова М.Н., Забазарных М.Ю. Иммунологически активные препараты кожи. // 1-й Съезд иммунологов России. Новосибирск. - 1992. - С. 32.

5. Лопухин Ю.М., Арион В.Я., Иванова В.Ф., Белова О.В., Капитанов А.Б. Биологически активные вещества кожи, влияющие на пролиферацию и дифференпировку кератиноцитов человека. // Бюл. экспер. биол. мед. - 1992. -Т. 114.-№.11.-С. 473-475.

6. Belova О.V., Korotkova M.N., Arion V.Ya., Orlova V.F., Lukanidin T.A., Sysoeva O.B., Dvortsova V.V. Growth factors and cytokines from skin. II The Eighth International Symposium on Infections in the Immunocompromised Host. Davos. Switzerland. - 1994. - N.128.

7. Belova O.V., Korotkova M.N., Arion V.Ya., Lukanidina T.A., Sysoeva O.B., Orlova V.F., Dvortsova V.V. The skin cytokines (isolation and characteristics). // XY International Congress of Allergology and Clinical Immunology. Stockholm. Sweden. - 1994. - p.336. - N.1206.

8. Belova O.V., ArionV.Ya., Sysoeva O.B., Lukanidina T.A., Korotkova M.N., Orlova V.F., Dvortsova V.V. The new immunomodulators from the skin. // 1 Inter. Congress on Immunorehabilitation. Inter. Jor. rmmunorehab. - 1994. - N.l. - Sapp. 1. - p.54.

9. Арион В.Я., Белова O.B., Орлова В.Ф., Капитанов А.Б., Лопухин Ю.М. Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека. // Патент № 2038087.

Зарегистрирован 27.06.1995. Бюл. изобрет. - 1995. - № 18. - С. 24.

10. Белова О.В., Арион В.Я., Дворцова В.В., Зимина И.В., Сысоева О.Б., Короткова М.Н., Капитанов А.Б. Получение и свойства иммуномодуляторов из кожи. И III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Москва. -1996.-c.10.

11. Белова О.В., Арион В .Я., Орлова В.Ф., Дворцова В.В., Бондарева Е.В., Короткова М.Н. Влияние фракций компонентов кожи на пролиферацию эпидермальных клеток в культуре. // Всероссийская конференция "Биология клетки в культуре". Санкт-Петербург. Цитология. — 1996. - т.38. - N.2. -стр. 179-180.

12. Лопухин Ю.М., Воронцова Е.М., Белова О.В., Арион В.Я., Машков O.A. Способ лечения псориаза.. // Патент № 2084230. Зарегистрирован 20.07.1997. Бюл. изобрет. открыт. — 1997. - № 20. - С. 25.

13. Белова О.В., Арион В.Я., Зимина И.В., Сысоева О.Б., Дворцова В.В., Короткова М.Н., Орлова В.Ф., Бондарева Е.В., Некрасова М.Н. Разработка и получение лекарственных препаратов из кожи животных. // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Москва. - 1998. - С. 546-547.

14. Белова О.В., Арион BJL, Воронцова Е.М., Сысоева О.Б., Орлова В.Ф., Капитанов А.Б. Новый метод лечения псориаза. // II конгресс с международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении". Москва. Паллиативная медицина и реабилитация. - 1998. - № 2-3, - С. 50.

15. Белова О.В., Арион В .Я., Воронцова Е.М., Сысоева О.Б., Луканидина Т.А., Машков O.A., Дворцова В.В., Орлова В.Ф., Капитанов А.Б. Иммунотропный препарат из кожи свиньи. // 2-й Национальный конгресс Российской ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ). Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии. Москва. - 1998. - С. 268.

16. Белова О.В., Арион В.Я., Лопухин Ю.М., Орлова В.Ф., Капитанов А.Б., Короткова М.Н., Дворцова В.В, Рабовский А.Б., Бекман Э.М., Баранова O.A.,

Зимина И.В. Получение и свойства фракций из кожи, влияющих на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека. // Russian J. Immunology. - 1999.-Vol. 4,-N2.-P. 151-157.

17. Белова O.B., Ганковская JI.B., Радыгина Т.А., Долгина E.H., Никанкина Л.В., Арион В.Я., Лопухин Ю.М. Определение цитокинов в препаратах из кожи. // 2-й Съезд иммунологов России, - Сочи, 1999. Russian J. Immunology. -1999. - Vol. 4. - Sapp. 1. - P.60.

18. Арион В.Я., Белова O.B., Луканидина Т.А., Сысоева О.Б.,. Дворцова В.В., Бреусов Ю.Н. Иммунологические свойства препаратов из кожи. // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2000. - Т.129. - № 2. - С. 194-197.

19. Арион В Л., Белова О.В. Иммунологически активные препараты из кожи (обзор собственных данных). // Inter. Jor. Immunorehab. - 2000. - Vol. 2. - N 1. -Р.ЗЗ- 36.

20. Arion V.Ya., Belova O.V., Lukanidina T/A., Sysoeva O.B., Zimina I.V., Dvortsova V.V., Breusov Yu. N. Immunological properties of the preparations from skin. // Internat. J. Immunorehabil. -2000. - Vol. 2. - N. 3. - P. 37-40.

21. Белова O.B., Арион В.Я., Зимина И.В., Лопухин Ю.М., Сысоева О.Б., Луканидина Т.А., Некрасова М.Н. Сравнительная характеристика иммунотропных препаратов из кожи. // Иммунопатология аллергол. инфектол. -2001.-№2.-С. 15-21.

22. Арион В.Я., Белова О.В., Орлова В.Ф., Зимина И.В., Сысоева О.Б., Бондарева Е.В. Ингибирование роста клеток эпвдермоидного рака А431. // V Всероссийской конференции "Паллиативная помощь в онкологии". Средиземноморье. Паллиативная медицина и реабилитация. - 2001. - №№ 2-3. -С. 67-68.

23. Белова О.В., Воронцова Е.М., Арион В.Я. Лечение псориаза иммунотропным перпаратом из кожи. // VIII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва. - 2001. - С. 354-355.

24. Мартынов А.К., Артемкина И.В.,Лаптонович A.A., Егоров Д.Ю., Цессарский A.A., Белова О.В., Арион В.Я. Фармакологические свойства иммунотропного препарата из кожи свиньи. // 5-й Конгресс Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии". — Москва. -2002. - С. 365.

25. Белова О.В., Арион В.Я., Лопухин Ю.М., Орлова В.Ф., Капитанов А.Б., Воронцова Е.М. Перспектива применения иммунотропного препарата из кожи для лечения рака кожи. // Всероссийская научно-практическая конференция «Биотерапия рака». Москва. - 2002. - С. 17-18.

26. Белова О.В., Арион В .Я., Орлова В.Ф., Лопухин Ю.М., Капитанов А.Б., Короткова М.Н., Бондарева Е.В. Иммунотропные препараты из кожи влияют на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы А431. // Иммунопатология аллергол. инфектол. - 2003. - №1. - С. 28-32.

27. Артемкина И.В., Мартынов А.К., Белова О.В., Арион В.Я. Иммунотропный препарат для лечения псориаза. II 5-й конгресс с международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении". Египет. - 2003. - С. 39.

28. Каргина И.Б., Арион В .Я., Белова О.В., Быстрова О.В., Воронцова Е.М. Влияние антигенных и иммунотропных препаратов на миграцию лейкоцитов у больных псориазом. // 5-й конгресс с международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении". Египет. - 2003. - С. 39.

29. Белова О.В., Арион В .Я., Воронцова Е.М., Зимина И.В., Сысоева О.Б., Кротова С.Б., Луканидина Т.А. Один из механизмов действия иммунотропного препарата из кожи для лечения псориаза. // 1-я Всероссийская конференция по иммунотерапии. Сочи. Дагомыс. Internation. J. Immunorehabil. -2003. - V. 5. - N. 2.- Р. 284.

30. Белова О.В., Арион В.Я., Зимина И.В., Сысоева О.Б., Луканидина Т.А.Способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи. // Патент №

2203070. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.04.2003. Москва.

31. Белова О.В., Арион В .Я., Зимина И.В. Сравнительная характеристика иммунотропных препаратов из кожи, полученных ацетоновым и безацетоновым методами. // Международный конгресс «Иммунитет и болезни: от теории к терапии». Москва. - 2005. - С. 85.

32. Белова О.В., Арион В.Я., Капитанов А.Б., Зимина И.В., Клячко A.A., Луканидина Т.А., Сысоева О.Б., Власенко Р.Я., Короткова М.Н. Получение и свойства иммунотропных препаратов из кожи, выделенных безацетоновым методом. // Иммунопатология аллергол. инфектол. - 2005. - № 3, - С. 35-44.

33. Белова О.В., Арион В.Я., Зимина И.В., Луканидина Т.А., Кротова С.Б., Сысоева О.Б. Иммунотропные препараты из кожи — настоящее и будущее. // XI Международный конгресс по реабилитации в медицине и иммунореабилитации. Тенерифе. Испания. Аллергология иммунология. - 2006, -Т. 7, - №1, - С. 33.

34. Белова О.В., Арион В.Я. Иммунологическая функция кожи и нейроиммунокожная система. II Аллергология иммунология. - 2006, - Т. 7, - № 4, - С. 492-497.

35. Белова О.В., Арион В.Я., Зимина И.В., Луканидина Т.А., Сысоева О.Б., Третьяков В.А. Новые свойства иммунотропного препарата из кожи свиньи. // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2007. - Прилож. 2. - С. 104-108.

36. Мартынов А.К., Артемкина И.В., Лаптанович A.A., Егоров Д.Ю., Цесарский A.A., Белова О.В., Арион В.Я. Некоторые фармакологические свойства иммунотропного препарата из кожи. II Бюлл. экспер. биол. мед. - 2007. -Прилож. 2.-С. 101-103.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 26.0fi.20Q7 г. Формат 60x90 1/16. Усллечл. 2,0. Тираж 90 экз. Заказ 328. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Достижения иммунологии последних десятилетий позволили отнести кожу к органу иммунной системы. В коже обнаружены клетки и медиаторы как естественного, так и адаптивного иммунитета. Т- и В-лимфоциты кожи осуществляющие свои функции путем постоянной рециркуляции. Т-лимфоциты составляют 90% всех лимфоцитов кожи и располагаются преимущественно в верхних слоях дермы и эпидермисе (120, 30, 92). Незначительная часть В-лимфоцитов встречается в средних и глубоких слоях дермы. Было обнаружено, что большинство Т-клеток, инфильтрующих кожу, экспрессирует кожный лимфоцит-ассоциированный антиген (CLA). К настоящему времени появились доказательства того, что CLA является хоминговым рецептором, вовлеченным в селективную миграцию Т клеток в кожу (273). Т-лимфоциты кожи несут на своей поверхности как аР~, так и уб-Т-клеточный рецептор (103). Эпидермис здорового человека содержит дендритные эпидермальные Т-клетки, выявленные ранее у мышей. Они относятся к уб-Т-клеткам и продуцируют ряд цитокинов (ИЛ-1 альфа, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-13, ФНО и др) (103).

К дендритным клеткам кожи относятся клетки Лангерганса, клетки Грэнстейна, дермальные дендроциты, плазмацитоидные эпидермальные клетки, воспалительные дендритные эпидермальные клетки (30, 120, 380, 413). За последние годы пересмотрена роль дендритных клеток в организме. В настоящее время их относят к наиболее мощным антигенпредставляющим клеткам. Моноциты крови мигрируют в кожу, где превращаются в макрофаги (гистиоциты). Это факторы естественного (врожденного) иммунитета. Они реализуют первую линию иммунной защиты, но они также принимают участие и в адаптивном иммунитете. Гистиоциты осуществляют фагоцитоз и представление антигенов. Большую роль в реализации иммунного ответа играют эндотелиальные клетки сосудов. Они имеют на своей поверхности молекулы адгезии, которые взаимодействуют с соответствующими молекулами на поверхности лимфоцитов и гранулоцитов и обеспечивают миграцию последних из кровяного русла в ткани, в том числе и в кожу (30, 120). Нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, тучные клетки, естественные киллеры, выявляемые в коже, вносят свой вклад как факторы естественного иммунитета.

Выявлена иммунологическая функция кератиноцитов. Они индуцируют экспрессию терминальной дезоксинуклеотидилтрансферразы и антигена Thy-1 на предшественниках Т-лимфоцитов (117). Кератиноциты эпидермиса имеют много общего с эпителиальными клетками тимуса. И те и другие относятся к эпителиальным тканям, для которых характерно наличие кератина. Эпителиальные клетки тимуса, секретирующие тимические гормоны и базальные кератиноциты имеют общие поверхностные маркеры: ТЕ-4, А2В5 и р19 (117). Было показано, что антитела к тимопоэтину - гормону тимуса, связываются с веществом, присутствующим в цитоплазме кератиноцитов базального слоя нормального эпидермиса человека (172, 236). Возникло предположение, что кератиноциты секретируют тимические гормоны. Однако это предположение оправдалось лишь для эмбриональной кожи, в которой был обнаружен тимопоэтин, аналогичный тимопоэтину , выделенному из тимуса взрослых особей (137). В коже взрослых особей тимопоэтин не был обнаружен. В то же время, кератиноциты секретируют факторы, влияющие на рост и дифференцировку Т-лимфоцитов. Это фактор дифференцировки лимфоцитов эпидермального клеточного происхождения (ELDIF) (300, 301). Он был выделен из супернатанта культивируемых кератиноцитов человека, лишенных клеток Лангерганса. ELDIF ингибировал пролиферацию лимфоцитов селезенки, влиял на дифференцировку Т-лимфоцитов и обладал регуляторной активностью (300, 301).

Помимо клеток большую роль в функционировании иммунной системы играют такие медиаторы иммунного ответа, как цитокины: интерлейкины, интерфероны, факторы некроза опухоли, колониестимулирующие факторы, факторы роста и др. Подавляющее большинство цитокипов обнаружено в коже.

Основными продуцентами цитокинов являются клетки иммунной системы, однако, помимо них, цитокины секретируются также стромальными клетками. Активированные кератиноциты выделяют широкий диапазон цитокинов: интерлейкины-1, 3, 6, 8, 10, 15, 18, фактор некроза опухоли-альфа, трансформирующие факторы роста альфа и бета и др. Важна роль противомикробных пептидов в коже (38, 39). Все сказанное выше говорит о том, что кожа является богатым источником для получения иммунологически активных веществ, хотя используется для этого очень редко. Имеются лишь отдельные исследования по выделению тимопоэтина из эмбриональной кожи крупного рогатого скота.

Существует взаимосвязь между процессами, протекающими в коже и иммунной системе. Многие заболевания кожи протекают на фоне иммунодефицитного состояния. Так при псориазе выявляются нарушения в естественном (врожденном) и адаптивном иммунитете. Кроме того, основным проявлением псориаза является гиперпролиферация и незавершенность дифференцировки кератиноцитов. Доказанным фактом при псориазе является сдвиг регуляции Т-лимфоцитов в сторону Т-хелперов типа 1 и цитотоксических Т-лимфоцитов типа 1 (138,275).

Разработка новых иммунотропных препаратов, регулирующих иммунологические процессы и процессы, протекающие в коже, является актуальной проблемой современной иммунологии.

Цель работы. Разработать методы получения иммунотропных препаратов из кожи, изучить физико-химические и иммунобиологические свойства препаратов и оценить возможность применения одного из них для лечения псориаза.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методы получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи.

2. Определить содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов в полученных препаратах.

3. Изучить некоторые иммунологические свойства полученных препаратов (влияние на количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа и на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей).

4. Исследовать полученные препараты методами изоэлектрофокусирования в агарозе, электрофореза в полиакриламидном геле, а отдельные препараты методами высокоэффективной жидкостной хроматографии.

5. Изучить влияние полученных препаратов на процессы, протекающие в коже (на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и на пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А431).

6. Изучить фармакологические свойства препарата, ингибирующего пролиферацию и стимулирующего дифференцировку кератиноцитов человека (К-активина): кожно-резорбтивное действие, острую и хроническую токсичность, аллергизирующее действие (в реакциях анафилактического шока и активной кожной анафилаксии).

7. Изучить физико-химические и иммунобиологические свойства К-активина (методами обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, влияние на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей ин виво, влияние на уровень сывороточной тимической активности, на пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А431 и эмбриональных фибробластов человека).

8. Изучить содержание в К-активине и некоторых иммунотропных препаратах цитокинов: трансформирующих факторов роста-бета1 и -бета2, интерлейкина-4, интерлейкина-1бета, фактора некроза опухолей-альфа и эпидермального фактора роста.

9. Сравнить физико-химические и иммунологические свойства аналогичных препаратов, полученных ацетоновым методом и методом, включающим этапы высаливания.

10. Сравнить физико-химические и иммунологические свойства аналогичных препаратов, полученных ацетоновым и безацетоновым методами.

Научная новизна работы

1. Разработаны три новых метода получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи: ацетоновый, безацетоновый и метод с высаливанием.

2. С использованием новых методов получены иммунотропные препараты из кожи свиньи, влияющие на показатели гуморального и клеточного иммунитета, а также на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А 431.

3. Изучены физико-химические свойства новых иммунотропных препаратов из кожи свиньи: содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов; гетерогенность, pi и молекулярные массы белков, белковых субъединиц и РНК. Изучено содержание некоторых цитокинов в отдельных препаратах.

4. Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин.

5. Изучены фармакологические свойства К-активина: кожно-резорбтивное действие, острая и хроническая токсичность, аллергизирующее действие (в реакциях анафилактического шока и активной кожной анафилаксии). В настоящее время материалы по К-активину находятся в ФГУ

Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора».

6. Изучен механизм действия К-активина: препарат ингибирует пролиферацию и стимулирует дифференцировку кератиноцитов человека. Помимо этого он повышает сывороточную тимическую активность и увеличивает количество зрелых Т-лимфоцитов в селезенке тимэктомированных мышей.

7. Сравнение аналогичных препаратов, но полученных тремя различными методами, показало, что они отличаются как по физико-химическим, так и по иммунологическим свойствам.

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования.

Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин. Метод лечения псориаза запатентован. В настоящее время материалы по К-активину находятся в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора».

Разработаны новые иммунотропные препараты из кожи. Методы их получения запатентованы. После проведения доклинических и клинических испытаний они могут быть использованы в качестве иммунокорригирующих препаратов, а также препаратов, стимулирующих или ингибирующих процессы кератинизации, заживления ран в дерматологии и косметологии.

Разработаны новые методы получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи, которые могут быть использованы для получения препаратов из других источников. По материалам диссертации получены три патента.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны три новых метода получения эндогенных иммунотропных препаратов из кожи свиньи: ацетоновый, безацетоновый и метод с высаливанием.

2. Продемонстрирована эффективность иммунотропных препаратов из кожи свиньи, полученных новыми методами, по влиянию на показатели гуморального и клеточного иммунитета, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А 431.

3. Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин.

4. Выявлена тимоподобная активность препарата из кожи (К-активина): восстановление сниженной сывороточной тимической активности у тимэктомированных мышей и стимуляция созревания Т-лимфоцитов.

5. Механизмом действия К-активина, эффективного в клинике при лечении псориаза, является ингибирование пролиферации и стимуляция дифференцировки кератиноцитов, повышение сывороточной тимической активности и стимуляция созревания Т-лимфоцитов.

Приоритетность разработок подтверждена тремя патентами:

1. Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека. Патент № 2038087. Зарегистрирован 27.06.1995. Бюл. изобрет. открыт. 1995, № 18, С. 24.

2. Способ лечения псориаза. Патент № 2084230. Зарегистрирован 20.07.1997. Бюл. изобрет. открыт. 1997, № 20, С. 25.

3. Способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи. Патент № 2203070. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27 апреля 2003 г., г. Москва.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены на: - 2-м Международном симпозиуме «Реабилитация иммунной системы», Сочи-Дагомыс, 1990; - 1-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1992; - Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии, Алма-Ата, 1992; - 1-м Съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992; - 8-th International Symposium on Infections in the Immunocompromised Host, Davos, Switzerland, 1994; - XY International Congress of Allergology and Clinical Immunology, Stockholm, Sweden, 1994; - 1-ом Международном конгрессе по иммунореабилитации, Сочи, 1994; - 3-м Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1996; -Всероссийской конференции "Биология клетки в культуре", Санкт-Петербург, 1996; - 2-м Национальном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии", Москва, 1998; - на 2-м конгрессе с международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация", Москва, 1998; - V Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1998; - 2-м Съезде иммунологов России, Сочи, 1999; - 4-м симпозиуме "Неинвазивные физико-химические методы диагностики", Москва, 2000; - VIII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 2001; - V Всероссийской конференции "Паллиативная помощь в онкологии", 2001; - 5-м Конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", Москва, 2002; - Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака», Москва, 2002; - 5-й конгресс с международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении", Египет, 2003; - 1-й Всероссийская конференция по иммунотерапии, Сочи, Дагомыс, 2003; -Международный конгресс «Иммунитет и болезни: от теории к терапии», Москва, 2005; - XI Международный конгресс по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Тенерифе, Испания, 2006.

Награды. Доклад «Ростовые факторы и цитокины кожи» («Growth factors and cytokines from skin»), представленный на 8-м Симпозиуме по инфекциям у иммунокомпромиссного хозяина, который проводился в Давосе (Швейцария) в 1994 году (The Eighth International Symposium on Infections in the Immunocompromised Host, Davos, Switzerland, 1994), получил President Award.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 научных работ. Получены три патента на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 320 странице, включая 17 таблиц и 44 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография содержит 429 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.

Выводы

1. Разработаны три новых метода получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи: ацетоновый, безацетоновый и метод с высаливанием. С помощью разработанных методов получены препараты и изучены их физико-химические и иммунобиологические свойства.

2. Содержание белка в препаратах снижается от П1 к ПЗ независимо от разработанного метода. Содержание углеводов, РНК и общих липидов колеблется от 0,5 до 14%.

3. Выявлена гетерогенность полученных препаратов. Наименее гетерогенными оказались П1, выделенные тремя вновь разработанными методами. Они содержат 1-2 мажорных белковых субъединицы и ряд минорных субъединиц, которые формируют 3-4 мажорных белка и ряд минорных белков. Наиболее гетерогенными оказались П2, выделенные ацетоновым и безацетоновым методами, в которых выявляется до 13-15 белков.

4. Из девяти полученных препаратов восемь препаратов в дозах от 1 до 100 мкг на мышь увеличивали количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа; П2, выделенный безацетоновым методом, в дозе 100 мкг на мышь снижал количество антителообразующих клеток, а П1, выделенный безацетоновым методом, был неактивен. Все три препарата, выделенные методом с высаливанием; П2 и ПЗ, выделенные ацетоновым методом и ПЗ, выделенный безацетоновым методом стимулировали созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей.

5. Препараты, выделенные ацетоновым методом, по-разному влияли на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека ин витро: П1 и ПЗ стимулировали пролиферацию и практически не влияли на дифференцировку кератиноцитов человека, П2 ингибировал пролиферацию и стимулировал дифференцировку кератиноцитов человека. Все три препарата, полученные методом с высаливанием, ингибировали пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431.

6. Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин. Изучены физико-химические и биологические свойства К-активина (П2, полученного ацетоновым методом). Продемонстрирована гетерогенность препарата методами изоэлектрофокусорования, электрофореза в ПААГ, ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Выявлена тимоподобная активность К-активина: препарат восстанавливал сниженный уровень сывороточной тимической активности тимэктомированных мышей почти до нормы и стимулировал созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей. Кроме того, К-активин ингибировал пролиферацию кератиноцитов человека, эпидермоидных клеток карциномы человека А431 и эмбриональных фибробластов человека в культуре и стимулировал дифференцировку кератиноцитов человека.

7. Изучение биологических свойств К-активина показало, что он не нарушал кожных покровов, не вызывал заметных изменений в состоянии животных, не вызывал нарушений в гистологическом строении внутренних органов и тканей при изучении острой и хронической токсичности, не вызывал изменений биохимических показателей крови и обладал слабым аллергизирующим действием. В настоящее время материалы по К-активину находятся в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора».

8. В К-активине были обнаружены такие цитокины как ТФР-бета1, ИЛ-4, ИЛ-1 бета и ЭФР, но отсутствовали цитокины: ТФР-бета2 и ФНО-альфа. В П1, выделенном ацетоновым методом, обнаружено присутствие ИЛ-4, ФНО-альфа и ЭФР, а в ПЗ, выделенном ацетоновым методом - ИЛ-4 и ЭФР. Присутствие выявленных цитокинов объясняет некоторые иммунобиологические свойства препаратов.

9. Сравнение физико-химических и иммунологических свойств аналогичных препаратов, полученных ацетоновым методом и методом, включающим этапы высаливания, показало, что введение высаливания привело к изменению физико-химических свойств препаратов: увеличилось содержания белка, уменьшилось содержания углеводов и общих липидов; значительно сократилось содержание РНК в П2 и ПЗ. Высаливание привело к изменению молекулярных масс белковых субъединиц и количества белков в аналогичных препаратах, резкому снижению числа мажорных белков в П2 и к исчезновению белков с pi от 5,2 до 8,15. Не было обнаружено РЖ методом ИЭФ ни в одном из препаратов, полученных методом с высаливанием.

10. Введение этапов высаливания в ацетоновый метод привело к усилению иммунологической активности во всех аналогичных препаратах как по влиянию на антителогенез, так и на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей. Все три препарата, полученные методом с высаливанием, стимулировали созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей в отличии от ацетонового метода, где был активным лишь ПЗ.

11. При сравнении аналогичных препаратов, выделенных ацетоновым и безацетоновым методами, оказалось, что они обладают как общими, так и различными физико-химическими и иммунологическими свойствами. Аналогичные препараты имели одинаковое содержание белка по Лоури и одинаково влияли на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей. П1 и П2, полученные ацетоновым и безацетоновым методами, имели одинаковое количество мажорных белков с близкими pi. В аналогичных препаратах, полученных ацетоновым и безацетоновым методами выявляются общие белковые субъединицы с близкими молекулярными массами.

12. Аналогичные препараты, выделенные ацетоновым и безацетоновым методами, отличаются по содержанию РЖ, углеводов и общих липидов и по влиянию на количество антителообразующих клеток селезенки мышей СВА на пике первичного ответа. Не было выявлено РНК методом ИЭФ ни в одном из препаратов, полученных безацетоновым методом, хотя в препаратах, полученных ацетоновым методом, были выявлены компоненты РНК. В препаратах, выделенных ацетоновым методом, выявляются белковые субъединицы, отсутствующие в аналогичных препаратах, выделенных безацетоновым методом. Все три препарата, полученные ацетоновым методом, увеличивали количество антителообразующих клеток селезенки мышей СВА на пике первичного ответа, в то время как П2, полученный безацетоновым методом в дозе 100 мкг/мышь - уменьшал.

Практические рекомендации Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин. В ближайшее время планируется проведение широких клинических испытаний, после чего он может быть рекомендован для лечения псориаза путем наружного применения. В дальнейшем планируется промышленный выпуск препарата.

Иммунотропные препараты из кожи, полученные новыми методами после проведения доклинических и клинических испытаний могут быть рекомендованы в качестве иммунокорригирующих препаратов, а также препаратов, стимулирующих или ингибирующих процессы кератинизации, заживления ран в дерматологии и косметологии.

Разработанные новые методы получения иммунотропных препаратов могут быть рекомендованы для получения препаратов из других источников.

ГЛАВА 6. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Научные исследования последних десятилетий позволили отнести кожу к органам иммунной системы. В коже выявлены клетки и медиаторы как естественного, так и адаптивного иммунитета (161, 30, 120). Вместе с тем кожа обладает определенными особенностями в осуществлении иммунологической функции. В коже выявлены такие уникальные дендритные клетки как клетки Лангерганса. Позже родственные им клетки были обнаружены в эпителии пищеварительного и респираторного тракта. Помимо клеток Лангерганса в коже присутствуют и другие дендритные клетки: клетки Гранштейна, дермальные дендритные клетки, лимфоидные дендритные клетки, воспалительные эпидермальные дендритные клетки (30, 120, 413, 380). После поглощения антигена дендритные клетки созревают и мигрируют в регионарные лимфоузлы, где представляют антигены Т-хелперам.

Лимфоциты осуществляют свои функции в организме, в том числе и в коже, путем постоянной рециркуляции. Т-лимфоциты составляют 90% всех лимфоцитов кожи и располагаются преимущественно в верхних слоях дермы и эпидермисе (92, 30, 120). Незначительная часть В-лимфоцитов встречается в средних и глубоких слоях дермы. Было обнаружено, что большинство Т-клеток, инфильтрующих кожу, и субпопуляция циркулирующих Т-клеток памяти/эффекторых клеток экспрессирует кожный лимфоцит-ассоциированный антиген (CLA). К настоящему времени появились доказательства того, что CLA является хоминговым рецептором, вовлеченным в селективную миграцию клеток памяти/эффекторных Т клеток в кожу (273). Т-лимфоциты кожи несут на своей поверхности как ар-, так и у5-Т-клеточный рецептор (103). Соотношение в коже ар-Т-лимфоцитов к у5-Т-лимфоцитам составляет примерно 5:1. Показано, что у5-Т-клетки распознают антиген без предварительного процессирования и участия молекул HLA комплекса, в отличие от ар-Т-клеток. Предполагают, что они создают первую линию защиты от инфекции. Эпидермис здорового человека содержит дендритные эпидермальные Т-клетки (ДЭТК), выявленные ранее у мышей (103). Они относятся к у5-Т-клеткам и продуцируют ряд цитокинов. Предполагают, что ДЭТК взаимодействуют с кератиноцитами и клетками Лангерганса.

К началу 80-х годов прошлого века появились доказательства того, что кератиноциты являются важным элементом иммунной системы. Они индуцируют экспрессию терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и антигена Thy-1 на предшественниках Т-лимфоцитов, что специфично для кератиноцитарно-лимфоцитарного взаимодействия (117, 120). После активации кератиноциты экспрессируют антигены HLA-DR и могут выполнять функции по представлению антигенов. Активированные кератиноциты экспрессируют молекулы адгезии и выделяют эйкозаноиды и цитокины, которые запускают иммунные реакции в коже (30).

Кератиноциты эпидермиса имеют много общего с эпителиальными клетками тимуса. И те и другие относятся к эпителиальным тканям, для которых характерно наличие десмосом и тонофиламентов, состоящих из кератина. Эпителиальные клетки тимуса, секретирующие тимические гормоны, и базальные кератиноциты имеют общие поверхностные маркеры: ТЕ-4, А2В5 и р 19 (117). Эмбриональные кератиноциты продуцируют тимический гормон тимопоэтин (137). Кератиноциты взрослых особей секретируют эпидермальный фактор дифференцировки Т-лимфоцитов (ELDIF) (318, 319).

В коже присутствуют такие клетки естественного иммунитета как гистиоциты (макрофаги кожи), естественные киллеры, тучные клетки, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, тромбоциты (120, 161). В коже обнаружено подавляющее большинство цитокинов: интерлейкины, хемокины, факторы роста, интерфероны, колониестимулирующие факторы и др. Особая роль принадлежит эндотелиальным клеткам кровеносных и лимфатических сосудов. На их поверхности присутствуют молекулы адгезии, при взаимодействии с которыми клетки крови проникают в кожу (30, 120).

Существует взаимосвязь между процессами, протекающими в коже и иммунной системе. Многие заболевания кожи протекают на фоне иммунодефицитного состояния. Так при псориазе выявляются нарушения в Т-, В-системах иммунитета и в макрофагальном звене. Кроме того, основным проявлением псориаза является гиперпролиферация и незавершенность дифференцировки кератиноцитов. Как показали последние исследования по псориазу, иммунологические нарушения предшествуют нарушениям в коже (326). В то же время до сих пор неизвестна причина псориаза, а потому до конца неясен патогенез заболевания. Поэтому в 80-х годах проводились лишь отдельные исследования по лечению больных псориазом иммунотропными препаратами.

В связи с этим целью настоящей работы было разработать методы получения иммунотропных препаратов из кожи, изучить физико-химические и иммунобиологические свойства этих препаратов и оценить возможность применения одного из них для лечения псориаза.

В начале был разработан ацетоновый метод получения иммунотропных препаратов из кожи: «Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека». Авторы: Арион В.Я., Белова О.В., Орлова В.Ф., Капитанов А.Б., Лопухин Ю.М. Патент № 2038087. Зарегистрирован 27.06.1995. Бюл. изобрет. открыт. 1995, № 18, С. 24. Первые эксперименты были поставлены на коже человека (трупа). Но поскольку ее нельзя было использовать при промышленном получении препаратов, дальнейшие эксперименты проводились на коже свиньи.

С помощью ацетонового метода были получены три препарата с различными молекулярными массами: препарат №1 (П1) - м.м. более 15 кДа, препарат №2 (П2) - от 1,4 до 15 кДа и препарат №3 (ПЗ) - ниже 1,4 кДа. В препаратах было определено содержание белка, РНК, углеводов и общих липидов. Содержание белка падало от П1 к ПЗ, содержание РНК и углеводов нарастало от П1 к ПЗ, а содержание общих липидов колебалось в пределах 1,42,2%.

Было исследовано влияние препаратов на гуморальный и клеточный иммунитет в двух иммунологических тестах: в методе Ерне и азатиоприновом методе. В методе Ерне мы исследовали влияние препаратов на количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа. Все три препарата обладали стимулирующей активностью в данном тесте, но в разной степени и в разных дозах. Активность нарастала от П1 к ПЗ. Поскольку антителообразующие клетки являются потомками В-лимфоцитов, можно говорить о стимулирующем влиянии всех трех препаратов на гуморальный иммунитет к тимусзависимому антигену.

Поскольку препараты оказались активными в методе Ерне, мы посмотрели содержание в них ИЛ-4, который является В-клеточным специфическим ростовым фактором. Мы обнаружили ИЛ-4 во всех трех препаратах. Причем, содержание ИЛ-4 коррелировало с активностью препаратов в методе Ерне. Однако, это не исключает присутствие других факторов, активных в данном тесте.

Влияние иммунотропных препаратов на Т-систему иммунитета оценивали по восстановлению чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро. Этот метод был создан в лаборатории Баха для тестирования тимического гормона тимулина (185). Тимэктомия приводит к резкому снижению чувствительности Т-лимфоцитов к азатиоприну, что связано с уменьшением количества зрелых Т-лимфоцитов. Тимические факторы восстанавливают это свойство, способствуя созреванию Т-клеток. Активностью в данном тесте обладал лишь ПЗ. Таким образом, П1 и П2 оказывали влияние на Т-зависимое антителообразование, а ПЗ - как на Т-зависимое антителообразование, так и на созревание Т-клеток.

На следующем этапе мы исследовали физико-химические свойства препаратов методами: ВЭЖХ (гель-хроматографии), изоэлектрофокусирования в тонком слое агарозы, вертикального двуступенчатого электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и электрофореза в полиакриламидном геле в 7М мочевине. Было выявлено, что наименьшей гетерогенностью обладал П1. Он содержит одну мажорную белковую субъединицу и ряд минорных субъединиц, которые формируют 2-3 мажорных белка и ряд минорных белков. Наиболее гетерогенным оказался препарат №2, в котором выявляется пять мажорных белковых субъединиц и ряд минорных субъединиц, которые, формируют до 8-10 мажорных белков и ряд минорных белков. Поскольку методом ВЭЖХ (гель-хроматографии) выявляются всего четыре мажорных белковых пика, вероятно, часть мажорных белков имеют одинаковую молекулярную массу, но разные pi. ПЗ содержит три мажорных и ряд минорных белковых субъединиц, которые формируют два белка с одинаковой молекулярной массой, но разными близкими pi. Во всех препаратах выявляется РНК: в П1- высокомолекулярная, в П2 и ПЗ -низкомолекулярная.

Затем мы оценили влияние иммунотропных препаратов на процессы, протекающие в самой коже: на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и обнаружили, что П1 стимулирует пролиферацию кератиноцитов человека в первичной культуре и имеет тенденцию к стимулиции их дифференцировки, П2 ингибирует пролиферацию кератиноцитов человека и стимулирует их дифференцировку и

ПЗ стимулирует пролиферацию кератиноцитов человека и не влияет на их дифференцировку.

Выявление ингибирования пролиферации и стимулирования дифференцировки кератиноцитов препаратом №2 навело нас на мысль, что этот препарат может оказать лечебный эффект у больных псориазом, т.к. при псориазе наблюдается гиперпролиферация и незавершенность дифференцировки кератиноцитов.

Необходимо было изучить фармакологические свойства препарата №2, которому было дано предварительное название К-активин (т.к. он стимулировал дифференцировку кератиноцитов). Было изучено кожно-резорбтивное действие К-активина, острая и хроническая токсичность и аллергизирующее действие в реакциях анафилактического шока и активной кожной анафилаксии. Оказалось, что К-активина не обладает острой и хронической токсичностью, не нарушает покровы тела при изучении кожно-резорбтивного действия, обладает слабым аллергизирующим действием и при его применении у человека следует ожидать достаточно низкую анафилактогенную активность.

Успешные доклинические испытания К-активина дали возможность проверить препарат у добровольцев - больных псориазом. Было решено применить К-активин наружно в виде мази на основе крема Унны. Исследование было проведено на небольшом количестве добровольцев. В результате лечения 39% больных вышли в ремиссию, у 39% больных наблюдалось значительное улучшение, у 5% больных - незначительное улучшение и у 17% больных - не было эффекта. Отрицательный эффект не наблюдался ни у одного больного. В настоящее время материалы по К-активину находятся в Институте доклинических и клинических исследований лекарственных средств Росздрава и планируется проведение клинических испытаний препарата. В случае успешных клинических испытаний К-активин может быть рекомендован для лечения псориаза путем наружного применения.

Способ лечения псориаза К-активином был запатентован: «Способ лечения псориаза». Авторы: Лопухин Ю.М., Воронцова Е.М., Белова О.В., Арион В.Я., Машков О.А. Патент № 2084230. Зарегистрирован 20.07.1997. Бюл. изобрет. открыт. 1997, № 20, С. 25.

Хороший результат К-активина в клинике поставил вопрос о более полном изучении его физико-химических и иммунобиологических свойств. Применение методов обращенно-фазовой ВЭЖХ и масс-спектрометрии подтвердило гетерогенность препарата. Методом обращенно-фазовой ВЭЖХ выявлено 9 мажорных и более 40 минорных пиков. Методом масс-спектроскопии выявлено 7 мажорных и до 20 минорных белков и пептидов. Была выявлена активность К-активина в тесте восстановления чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин виво, хотя препарат был неактивен ин витро. Кроме того, К-активин проявлял тимоподобную активность: восстанавливал сниженный уровень сывороточной тимической активности тимэктомированных мышей почти до нормы и ингибировал пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 и эмбриональных фибробластов человека в культуре. Итак на пролиферацию трех типов клеток человека (кератиноцитов, эпидермоидных клеток карциномы А431 и эмбриональных фибробластов) К-активин оказывал супрессорный эффект подобно таким супрессорным факторам как ТФР-бета и ИЛ-10. Хотя ТРФ-бета не проявлял свой супрессорный эффект на трансформированных клетках. В К-активине было обнаружено присутствие ТФР-бета 1, ИЛ-4, ИЛ-1 бета и ЭФР, но отсутствовали ТФР-бета2 и ФНО-альфа. Присутствие выявленных цитокинов объясняет часть биологической активности К-активина.

Надо сказать, что К-активин является уникальным оригинальным препаратом, относящимся к новому классу противопсориатических препаратов, т.к. содержит и белки и низкомолекулярную РЖ и, возможно, нуклеопротеиды. Он выделен из здоровой кожи и представляет из себя некий «природный коктейль», регулирующий процессы в коже и за ее пределами.

Кожа принимает участие в дифференцировке Т-лимфоцитов. При взаимодействии кератиноцитов и ранних Т-лимфоцитов на последних экспрессируется терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (117). Эмбриональные кератиноциты экспрессируют тимический гормон тимопоэтин (137). Кератиноциты взрослых особей секретируют эпидермальный фактор дифференцировки лифоцитов (ELDIF), ингибирующий пролиферацию и стимулирующий дифференцировку Т-лимфоцитов (318, 319).

В. лаборатории молекулярной иммунологии НИИ ФХМ с 70-х годов проводились исследования по разработке, характеристике, получению и клиничекому применению тимических факторов (3, 4, 5). Был разработан первый российский лечебный препарат из тимуса - Тактивин. Была создана оригинальная методика получения препарата, были широко изучены его физико-химические и иммунобиологические свойства (4). Тактивин с успехом прошел доклинические и клинические испытания, после чего было налажено его производство как лечебного препарата (4). В настоящее время Тактивин можно купить в аптеке. Он применяется при лечении первичных и вторичных иммунодефицитных состояний: при онкологических, инфекционных, хирургических, дерматологических и др. заболеваниях.

Разработка иммунотропных препаратов из кожи является продолжением работ по тимическим факторам. Общие свойства кератиноцитов и эпителиальных клеток тимуса, предположение о том, что кератиноциты синтезируют тимические гормоны, синтез тимопоэтина эмбриональными кератиноцитами, секреция кератиноцитами взрослых особей эпидермального фактора дифференцировки Т-лимфоцитов - все это подтолкнуло нас к работе по выделению иммунотропных веществ из кожи. Хотя дальнейшие работы показали, что кератиноциты взрослых особей человека и мыши не содержат тимических гормонов альфа]-тимозина, тимопоэтина и тимулина, это не исключает синтез в кератиноцтах других тимических факторов. Наши данные подтверждают это. Так, К-активин обладает рядом общих свойств с тимическим препаратом Тактивином:

1. Близкие способы получения препаратов.

2. Активность в азатиоприновом тесте ин виво.

3. Оба препарата повышают уровень сывороточной тимической активности у тимэктомированных мышей.

4. Оба активны а тесте Ерне.

5. Препараты имеют перекрывающиеся молекулярные массы при разделении на сефадексе G-50: Тактивни - 1-6 кДа, К-активин - 1,4-15 кДа.

6. Оба являются гетерогенными препаратами.

7. Оба проявили лечебный эффект у больных псориазом.

Препараты имеют и отличия. Одно из них - это отсутствие активности К-активина в азатиприновом тесте ин витро. Все это не исключает возможность того, что К-активин является тимическим фактором, той самой общей субстанцией между тимусом и кожей. По крайней мере, можно говорить о тимоподобной активности К-активина, т.к. он повышает сывороточную тимическую активность.

Если предположить, что К-активин, выделенный из кожи, проникает в кровь и вносит непосредственный вклад в повышение сывороточной тимической активности, то возникает вопрос о правильности термина «сывороточная тимическая активность», поскольку хотя бы часть ее составляет «сывороточная кожная активность». Может быть правильнее называть ее сывороточной тимоподобной активностью? СТА у тимэктомированных мышей не падает до нуля, а составляет 1,5. Возможно, что этот уровень СТА поддерживается факторами кожи, которая берет на себя иммунорегуляторные функции. Но если кожа и продуцирует факторы, повышающие СТА, она не в состоянии повысить уровень СТА до нормального, поскольку у тимэктомированных мышей уровень СТА низкий. У взрослых особей происходит инволюция тимуса, хотя Т-система у них работает нормально. Возможно и здесь кожа играет определенную роль: постепенно берет на себя функцию дифференцировки Т-лимфоцитов. И только в старости наблюдается снижение иммунитета. Именно тогда, вероятно, кожа резко снижает свои иммунологические функции.

Помимо К-активина, выраженными иммунотропными свойствами обладает ПЗ. Из трех препаратов он обладал наиболее выраженной активностью в методе Ерне и единственный проявлял активность в азатиоприновом тесте ин витро. ПЗ, также как К-активин, содержит белки (или пептиды), РНК и, возможно, рибонуклеопротеиды. Из трех препаратов он самый низкомолекулярный. Он обладает стимулирующей активностью на гуморальный иммунный ответ к Т-зависимому антигену, стимулирует созревание Т-клеток, стимулирует пролиферацию кератиноцитов. После доклинических и клинических испытаний может быть рекомендован как стимулирующий иммунотропный препарат.

Изучение физико-химических свойств препаратов, полученных с помощью разработанного нами ацетонового метода, показало, что все они, помимо белков и углеводов, содержат РНК. Для получения более чистых белковых препаратов мы ввели в ацетоновый метод этапы высаливания сульфатом аммония - один из широко применяемых способов очистки белков. Мы хотели избавиться от РНК и других небелковых компонентов, чтобы повысить содержания белка в препаратах.

Изменение метода привело и к изменению физико-химических и иммунобиологических свойств препаратов, имеющих одинаковую молекулярную массу. Увеличилось содержания белка в препаратах с аналогичной молекулярной массой, уменьшилось содержания углеводов и общих липидов; значительно сократилось содержание РНК в препаратах №2 и №3 и имеется тенденция к ее увеличению в препарате №1. Не было обнаружено окрашенных компонентов РНК методом ИЭФ ни в одном из препаратов, полученных методом с высаливанием. Высаливание привело к исчезновению белков с pi от 5,2 до 8,15; резкому снижению числа мажорных компонентов в П2 и к изменению молекулярных масс компонентов, выявляемых при SDS-ПААГЭ в аналогичных препаратах. Введение этапов высаливания привело к изменению и иммунологических свойств препаратов с одинаковыми молекулярными массами. В целом можно сказать, что препараты с аналогичными молекулярными массами стали более активными. В методе Ерне максимальной активностью обладает препарат №3, полученный ацетоновым методом и препарат №2, полученный методом с высаливанием. Кроме того, изменился характер зависимости активности препаратов от дозы. Введение высаливания привело к тому, что все три препарата стали активными в азатиоприновом тесте ин витро, в то время как при ацетоновом методе был активен лишь ПЗ.

Введение высаливания привело к тому, что все три препарата стали супрессировать пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431. При ацетоновом методе супрессирующей активностью обладал лишь П2 по влиянию на пролиферацию кератиноцитов человека в первичной культуре.

Разработка метода с высаливанием открывает путь к получению индивидуальных иммунотропных молекул, которые в дальнейшем можно будет использовать при лечении иммунодефицитных состояний и кожных заболеваний. Для этого необходимо провести дальнейшие исследования по очистке и изучению физико-химических и биологических свойств полученных веществ, провести их доклинические и клинические испытания. Выделение отдельных молекул открывает путь к получению синтетических лекарственных препаратов.

Ацетоновый метод и метод с высаливанием включают использование в больших количествах такого органического растворителя как ацетон, который является легковоспламеняемой жидкостью и вызывает поражение центральной нервной системы. Нельзя ли его заменить более безопасным веществом? Мы решили создать экологически более чистый метод выделения и заменили этап прикапывания супернатанта к ацетону в ацетоновом методе этапом обработки супернатанта сжиженным углекислым газом, т.к. последний по своим свойствам близок к ацетону.

При сравнении препаратов с аналогичными молекулярными массами, выделенных ацетоновым и безацетоновым методами, мы обнаружили, что они обладают как общими, так и различными физико-химическими и иммунологическими свойствами. Аналогичные препараты имели одинаковое содержание белка по Лоури и проявляли одинаковую активность в азатиоприновом тесте. П1 и П2, полученные ацетоновым и безацетоновым методами имели одинаковое количество мажорных белков с близкими pi. Методом SDS-ПААГЭ в аналогичных препаратах, полученных ацетоновым и безацетоновым методами выявляются общие белковые компоненты с близкими молекулярными массами.

В то же время, препараты с аналогичными молекулярными массами, но выделенные разными методами, отличаются по содержанию РНК, углеводов и общих липидов и по влиянию на количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного ответа. Не было выявлено РНК методом ИЭФ ни в одном из препаратов, полученных безацетоновым методом, хотя в препаратах, полученных ацетоновым методом, она выявлялась. Методом SDS-ПААГЭ и ИЭФ в препаратах, выделенных ацетоновым методом, выявляются белки, отсутствующие в аналогичных препаратах, выделенных безацетоновым методом. Все три препарата, полученные ацетоновым методом, увеличивали количество антителообразующих клеток в методе Ерне, в то время как П2, полученный безацетоновым методом в дозе 100 мкг/мышь - уменьшал. В методе Ерне отличался характер зависимости активности препаратов с аналогичными молекулярными массами от дозы.

Мы обнаружили, что в процессе хранения лиофилизированного супернатанта происходит изменение физико-химических и иммунологических свойств полученных из него препаратов. Уменьшается содержание белка в П1 и П2, в ПЗ - не изменяется. Уменьшается содержание РНК во всех трех препаратах и увеличивается содержание углеводов. Снижается молекулярная масса мажорного белкового компонента в ПЗ. В процессе хранения теряется активность в тесте восстановления чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна в препарате №3, но появляется в препаратах №1 и №2.

Преимуществом безацетонового метода является то, что нет необходимости использовать такое большое количество ацетона как в ацетоновом методе и методе с высаливанием. В перспективе можно подобрать условия и программировать получение препаратов с определенными иммунобиологическими свойствами. Метод перспективен в технологическом плане при промышленном производстве препаратов.

Разработка трех новых методов дало возможность получить новые иммунотропные препараты. К-активин, полученный ацетоновым методом, уже был испытан в клинике на ограниченной группе добровольцев - больных псориазом и дал хорошие результаты. Другие иммунотропные препараты могут быть использованы в клинике после прохождения доклинических и клинических испытаний. Особенно перспективны в этом плане низкомолекулярные препараты, обладающие высокой иммунологической активностью. Дальнейшая очистка препаратов, выделение отдельных пептидов, создание синтетических пептидов дает широкое поле для дальнейшей деятельности как в плане создания лекарств, так и в плане изучения регуляторных механизмов иммунологически активных факторов кожи.