Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Иммунотропная активность природного каротин-токоферолового комплекса

Р г ь ол

2 0 "

На правах рукописи УДК 615.283.926.357:612.017.1

Погабало Андрей Владимирович

*$4

ИММУНОТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРИРОДНОГО КАРОТИН-ТОКОФЕРОЛОВОГО КОМПЛЕКСА

i4.oo.25- ФАРМАКОЛОГИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В РОССИЙСКОМ ГОСУДАРСТВЕННОМ МЕДИЦИНСКОМ УНИВЕРСИТЕТЕ И ОНКОЛОГИЧЕСКОМ НАУЧНОМ ЦЕНТРЕ им. H.H. БЛОХИНА РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор медицинских наук, чл. -корр. РАЕН, профессор Б.С.УТЕШЕВ доктор медицинских наук А.В.СЕРГЕЕВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: . доктор медицинских наук, профессор И.Е. КОВАЛЕВ доктор медицинских наук, профессор Р.Н. СЕЙФУЛЛА

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК,

Защита состоится "_"_ 1997 г в_час.

На заседании специализированного ученого совета К.084.14.05 при Российском Государственном медицинском университете по адресу: 117513 Москва, ул. Островитянова, Д.1

С диссертацией можно ознакомится б библиотеке Российского Государственного медицинского унизерситета.

Автореферат разослан "_"___1957 г

Ученый секретарь совета кандидат медицинских наук,

Т.Н. КЛУШИНА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы было обнаружено, что число заболеваний, в этиологии которых лежит нарушение иммунной системы, довольно значительное (Петров Р.В. 1981 г., Хаитов P.M. 1992 г., 1995 г.). Если еще учесть болезни, при которых иммунные расстройства являются существенным звеном патогенеза, то перечень всех первичных и вторичных поражений иммунной системы становится необычайно широким. В связи с этим перед современной иммунофармакологией встает проблема создания новых и безопасных иммуномодуляторсв, пригодных для лечения разнообразных иммунологических расстройств (Eer.dich A. 19S2 г., Mcon R.S. 1989).

В настоящее время стало ясно, что большинство неблагоприятных экологических факторов, нездоровый образ жизни, постоянные стрессы и различные факторы риска (возраст, гипертоническая болезнь, курение, поражение ионизирующим излучением и др.) в первую очередь отрицательно воздействуют на иммунную систему организма и уже вторично приводят к развитию других заболеваний (Букин Ю.В., Заридзе Д.Г. 1992 г.). Поэтому, иммунофармакология должна разработать эффективные иммуномодуляторы, пригодные для приема в популяции здоровых или ослабленных людей с профилактической целью. В области создания препаратов, предназначенных для лечения заболеваний иммунной системы имеются серьезные достижения (Петров Р.В. 1995). Достаточно указать на такие препараты как циклоспорин А, рапамицин, левамизол, глюкокортикоиды и другие (Bennet M.R. 1992), которые сделали переворот в лечении некоторых заболезаний. Однако эффективность иммунофармакологии по разработке средств профилактики иммунных нарушений значительно ниже. Препараты, во-первых, должны быть почти абсолютно нетоксичными в обычном понимании этого слова. Так, для профилактики возрастной инволюции иммунной системы, очевидно, необходимо иметь такой препарат, который можно без какого-либо существенного риска принимать годами. Более того, такой иммуномодулятор должен иметь черты не лекарствен-ного препарата, а пищевой добавки.

Научный коллектив, сложившийся в последние годы на базе кафедры фармакологии РГМУ и лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодуляторов НИИ ИДиЭТ ОНЦ РАМН проводит изыскания в этой области. Были разработаны и доведены до уровня практического применения ряд препаратов,

пригодных для профилактики нарушений иммунной системы <• (Буюклинская О.В. 1992 г., Сергеев A.B. 1995 г.). Настоящая работа является продолжением и дальнейшим развитием этого направления.

Поиск новых нетоксичных иммуномодуляторов этим коллективом ведется в ряду природных и синтетических ретиноидов и каротиноидов (Плецитый К.Д. 1992, Leid М 1992 г.). Идейные предпосылки, лежащие в основе того, что именно этот ряд был взят за основу по созданию иммуномодуляторов, являются следующими.

Во-первых, витамин А и его дериваты обладают иммунотропностью (Murohara I. 1994, Erdman J.W. 1993, Prabhala R.H. 1993).Уже относительно давно было установлено, что гиповитаминоз и гипервитаминоз А сопровождается резким угнетением иммунной системы.

Во-вторых, достижения современной и молекулярной биологии позволили выделить и проклонировать ретиноидные рецепторы (Beato М. 1995г.). Эти рецепторы идентифицированы на клетках иммунной системы.

Таким образом; ретиноевая кислота является, очевидно регуляторной молекулой, контролирующей функции иммунной системы. С другой стороны, ретиноиды и каротиноиды как природные молекулы, может быть, как никакие другие классы иммунотропных соединений отвечают требованиям безопасности: человек на протяжении всей своей жизни потребляет витамин А. Все эти соображения послужили основанием для того, чтобы и в данной работе в качестве изучаемого препарата был взят природный каротин-тоКофероловый комплекс.

Цель работы.Целью работы являлось изучение на различных экспериментальных моделях. гуморального и клеточного иммунитета иммуномодулирующей активности . природного каротин-токоферолового комплекса. Кроме того объектом изучения являлась оценка гемо- и генотоксических свойств препарата. Планируя проведение настоящей работы, мы преследовали также цель разработать экспериментальные модели, пригодные для изучения специфического класса препаратов - иммуномодуляторов профилактического действия.

Задачи исследований. В соответствии с общей целью работы конкретными задачами исследований являлось:

1. Изучение иммунотропной активности природного каротин-токоферолового" комплекса на модели первичного иммунного ответа мышей на эритроциты барана.

2. Изучение иммуномодулирующей активности препарата in vitro на различных моделях клеточного иммунитета.

3. Разработка новой экспериментальной модели для оценки иммуномодуляторов, обладающих антиоксидантным действием.

4. Оценка гемо- и генотоксичности природного каротин-токсфероловсго комплекса.

Научная новизна работы. БперЕые в иммунологических системах изучена и охарактеризована иммуномодулирующая активность природного каротин-токоферолового комплекса. Получена экспериментальная кривая доза- и время- эффект. Иммуномодулирующее действие исследовано на моделях первичного и вторичного иммунодефицита. Научную новизну представляют данные о стимулирующем действии препарата на гемопоэз и об антимутагенном эффекте. Предложена модель для оценки иммуномодулирующих препаратов с антиоксидантными свойствами.

Практическая значимость. Работа выполнена в рамках совместной программы ЭДиТО ОНЦ РАМН и РГМУ по созданию нетоксичных иммуномодуляторов. Проведенные исследования являются фрагментом комплексной работы по углубленному доклиническому изучению активности и безопасности природного каротин-токоферолсзого комплекса. Конечной целью этой программы является создание лекарственного препарата, пригодного для профилактики иммунссупрессий. Препарат такого типа действия необходим для разработки национальных программ профилактики атеросклероза, злокачественных новообразований и поражений иммунной системы у лиц с факторами риска. Иммуномодулятор профилактической направленности требуется для создания региональных программ борьбы с экологически неблагоприятными факторами.

Апробация работы. Материалы исследования обсуждены на заседаниях и межкафедральных конференциях кафедр иммунологии, фармакологии, биохимии РГМУ и лабораториях НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМН, на III и IV Всероссийском конгрессе «Человек и лекарство» (1996-97 гг.)

л

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), изложения методов исследования (глава 2) и полученных результатов (главы 3 - 7), заключения, выводов, сведений о внедрении результатов исследований, списка цитированной литературы. Текст диссертации включает 18 таблиц и 15 рисунков. Библиография содержит ссылки на 236 источника ( 55 отечественных и 181 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования. Исследования проводили на 2200 половозрелых линейных мышах СБА, (СВАх C57BI/6) F1 , C57BI/6 , BalB/c , СЗН весом 18-22 грамма (в возрасте 4 - 6 мес.). Животных содержали в стандартных условиях. В качестве иммуномодулятора применялся природный каротин-токоферо-ловый комплекс (КТК) (АО "Белгородвитамины"). Производили исследования первичного иммунного ответа и изменения активности клеточного иммунитета под влиянием однократного и курсового введения КТК. При изучении первичного иммунного ответа исследования проводили на линии мышей с генетически детерминированным высоким уровнем иммунного ответа (СВА) и на модели с врожденным иммунодефицитом (линия мышей C57BI/6). Содержание»7 количества антителообразующих клеток (АОК) определяли методом A.Canningham в модификации H.A. Назаренко .

В работе также была использована модель вторичного иммунодефицита, вызванного введением винбластина. Винбластин вводили внутрибрюшинно, однократно,' на 48 часов иммунного ответа в дозе 1 мг/кг.

Клеточный иммунитет исследовали постановкой реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ); определеляли образование и активность цитолитических Т - лимфоцитов. В культуре клеток изучали также активность естественных киллерных клеток и активность перитонеапьных макрофагов методом хемилюминисценции.

Следующим этапом исследования было определение активности природного КТК на патологической модели токсико-анемического синдрома методом эндогенного

колониеобразования (Till - Mc'Culloch).

Вследствии поражения ионизирующим излучением организма, в первую очередь страдают наиболее радиочувствительные системы, органы и клетки. Нарушение метаболизма клеток и активация свободно - радикальных процессов характеризуется как токсико - анемический синдром. Восстановление популяции кроветворных .клеток происходит за счет увеличения скорости пролиферации и дифференцировки полипотентных стволовых кроветворных клеток (ПСК), находящихся в "нишах" микроокружения костного мозга, определяющих дальнейшее направление в дифференцировке и развитии клеток крови (Цветков И.Д. 1984 г.). Количество ПСК переходящих из G0 или длительной G, фазы в состоянии активной пролиферации, зависит от дозы излучения, определяющей выживаемость стволовых клеток. Для определения антиокси-дантной активности КТК была разработана патологическая модель, основанная на гипербарической оксигенации. Чрезмерное насыщение кислородом тканей вызывает защитные реакции клеток от гипероксии и усиление образования активных форм кислорода, усиливающих процессы свободно - радикального окисления. При этом происходит угнетение кооперации регуляторных клеток, снижается активность макрофагов, что соответствует ускоренному жизненному циклу с запрограммированной гибелью клеток - апоптозу. Также изучалось коррегирующее влияние КТК на действие гипербарической оксигенации в первичном иммунном ответе.

Было проведено исследование влияния КТК на мутагенез в 1слеткгх костного мозга мышей различных линий (С57 BI/6, СБА), при индукции хромосомных аберраций назначением циклофосфана, ионизирующей радиацией и гипербарической оксигенацией.

Статистический анализ цифрового материала, полученного в результате экспериментальных исследований, проводили по общепринятой методике с вычислением среднего арифметического (М) и его ошибки (м). Для установления статистически достоверных различий между сравниваемыми средними арифметическими различных серий вычисляли критерий Стьюдента. Для переменных значений использовали коэффициент Вилкинсона-Манна-Уитни. Вычисления производи-

лись на ЭВМ IBM Pentium 100 по программе «Медстат» ЦКВГ им. H.H. Бурденко.

Результаты и обсуждение. При изучении влияния природ-ного КТК на В-звено иммунитета, оценивали действие препарата в зависимости от дозы, времени введения относительно момента иммунизации эритроцитами барана (5x108 клеток) и длительности введения. Препарат вводили однократно (или курсами 5-30 дней), внутрибрюшинно, в виде масляной суспензии в интервале доз от 0,001 до 30,0 мг/кг из расчета содержания бета-каротина. Исследования проводили на мышах линий СВА (высокоотвечающие) и С57В1/6 (генетически детерминированный низкий иммунный ответ) самцах.

Однократное введение препарата оказывало умеренно выраженное иммуностимулирующее действие, наблюдался дозозависимый эффект: число АОК в контроле на 96 часов иммунного ответа составляло 58398 ±4618, при введении дозы 0,001 мг/кг ответ составлял 74749±6841 (128%, р<0,05, по сравнению с контролем). Назначение дозы 0,01 мг/кг (рис.1.) давало стимуляцию равную 122% (р<0,05) 1дМ - продуцирующих клеток. Однократное применение КТК в дозах 0,1, 1,0 и 10,0 мг/кг не давали значимого повышения иммунного ответа. При введении 30 мг/кг количество АОК вновь увеличивалось до 83070±4852 (128%, р<0,05). Иммуностимулирующее действие КТК сильно зависило от момента введения препарата относительно дня иммунизации (рис. 2). При введении дозы 1,0 мг/кг за 96 часов до иммунизации число АОК было равным 53868±3852 (84%, р<0,05). Введение препарата за 72 часа сопровождалось образованием 62905±3283 АОК (92%, р>0,05) (табл. 1).

Таблица. I Влияние природного карот пи-токоферол оною комплекса на число АОК. в селезенках мышей линии СВА при «ведении препарата и дозах с» и,()()1 до Л) мг/кг на различимо сроки иммуногенеза

Время контроль доза. 0,001м(/кг 0,01 мг/кг 0.1 мг/кг 1 мг/кг 10м1/кГ 30м|/кг

иммунизации

а часах число А01С % АОК % дои % АОК % АОК % АОК %

-96 64 128' 61 563' 96 50 230» 94 55 11-0+ Ьо 53 С63* 81 62 845» 98 65411 + 102

5273 6217* 5102 4237 3852 ■3742 4267

-72 68 375 + 60 854' 89 01 1М+ 89 51 065 + 76 52 935* 92 79 315» 116 76 580+ 112

4 В /4 5740 41/8 53?0* 1203 49 70 5234

-48 75 624* 81 800». 108 79 800» 108 71 275 + 94 0» 439+ 114 еа г/2» 118 93 264+ 123

459.4 9750* 7532* 5051 6754 а/но* 7452'

-24 62 654» 60 340» 96 62 3:10 * 96 70 2 та» 112 /ЗОБЗ + 121 а» 2.4' 134 75 425+ 120 '

37И2 5391 3984 411'3 5912 551:, 4945

0 67 2 ГС* 61 894» 02 66 21)4» 94 01 221» 91 (.а 022+ 102 70010» 105 85 930 + 120

Ь67в 7368' 4/90 5127 5720 4'$.»!» 3472

24 72 819* 107 7 /2' 148 90 НСК+ 138 78 045» 108 82 285 + 113 77 1ьЪ» ' 106 91 557+ 122

6842 961/ 12472* 8229* ,'65Э 7143* 7359*.

43 58 зна* 74 749» 128 71 843* 123 1.5 406» 112 02 486+ 107 ¿5 406» 112 83 070+ 118

4618 6841 6345 5;У1 •1813 43 12 4852

72 62 427+ 67 421» 108 64 321» 103 55 560* 89 57 433+ 32 ■ Ь0 797» 107 73 040* 117

42/8 5125 5732 438/ а 128* 31112 4836

• а>0.05

Таблица г.Втмнио природного каротип-токпф^мшопнго коипликс.а при курсоном

введении на число АОК о силезенках мышин линии С57Ш/0 и порцичним иммунном ответе па зрифоциты барана.

Длительность КОН 1роль доза: 0,5 мг/су г 1,0 мг/сут Ю мг/су! 30 м(/су!

введения

в сутках М+м число АОК й' /0 АОК 0/ /и АОК АОК О' /о

5 46 259 -13815 54 12311 +4305 117 59 212* +6814 128 54 586« +3917 на ;;<> ¡¡09 (4(11)3 123

10 44 172 (3385 53 006 +4703 120 61 841 +5820 140 68 467 +7035 1Ь5 63 603 +5003 144

20 •13 293 +4154 60 610 +5935 140 59 744 +3825 138 75 330 +8298 174 71 001 +6174 164

* Л>о 05

К 0,001 0,01 0,1 1,0 10 30 60

Мг/кг

Рис. 1. Влияние КТК при однократном внутрибрюшинного введении мышам линии СВА в дозах 0,001-60 мг/кг в различные сроки иммуногенеза: +48 часов (в), -48 часов (•)

Ось абсцисс - количество АОК в селезенках мышей ось ординат - доза препарата

-96 -72 -48 -24 0 +24 +48 +72

ЧАС

Рис. 2. Влияние КТК при однократном внутрибрюшинного введении мышам линии СВА в дозах 1(н) и 30 ( • ) мг/кг в различные сроки относительно момента иммунизации

Ось абсцисс - количество АОК в селезенках мышей ось ординат - часы относительно момента иммунизации

По мере приближения времени введения препарата, к моменту иммунизации наблюдалось незначительнее узеличение образования АОК. Так, доза 0,01 мг/кг приводила к образсканию 81895±9750 (108%, р>0,05), а доза 10 мг/кг - к возникновению 8S472-6780 АОК (118%, р>0,05). Приближение воемени введения КТК к развитию максимального иммунного отзета (на 72 час. от момента иммунизации) иммуностнмули-рующий при приеме доз 0,001; 0,01 и 30,0 мг/кг эффект достигал максимальных значений. >

Однократное введение КТК мышам линии C57Bi/5 давало относительно более высокий уровень стимуляции. Введение 0,001 мг/кг препарата в день иммунизации вызы-вало повышение антителообразования до 152% (63592±4348 АОК, р<0,05). Введение дозы 30 мг/кг в момент иммуни-зации приводило к повышению содержания АОК до 133% (55543±^427, р<0.05) по сравнению с контролем. Одно-кратное введение препарата в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг не вызы-зало существенного увеличения иммунного ответа. Иммун-ный ответ достоверно увеличивался по мере приближения времени введения препарата к моменту иммунизации. Курсовое введение КТК в течение 5, 10 и 20 суток приводило к устойчивой стимуляции первичного иммунного ответа у мышей линии СВА (табл. 1) и C57BI/6.

Следующим этапом исследования было определение зависимости величины иммунного ответа от пути введения КТК. Однократное введение per os препарата в дозе 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 10,0 мг/кг ка 24, 48 и 72 часа иммунного ответа у мышей СВА и C573S/6 не выявили значительного различия антителообразования.

Проводили также изучение влияния КТК на вторичный иммунодефицит, обусловленный действием винбластина (рис. 3). Однократное введение препарата мышам СЕА и C57BI/S в изучаемых дозах приводило к отмене иммуносуг.рессии. Введение, препарата на 72 час иммунного ответа б дезе 1 мг/кг приводило к образованию 25219=3370 (141% р<0,05). 30 мг/кг стимулиоозапи образование 28260±2210 (158% р<0,05) АОК. Мыши линии C57BI/6 с генетически детерминированным низким уровнем иммунного ответа в ответ на препарат давали число АОК сравнимое с числом АОК у мышей линии СВА. Назначение КТК привело к переходу первичного иммунного ответа на более высокий порядок реагирования. Введение 10 мг/кг за 48 часов до иммуннизации мышей линии C57BI/6 приводило к появлению

23116+1076 (133% р<0,05 от контроля), а введение препарата 30 мг/кг на 24 час иммуногенеза стимулировало образование 21005+3026 (172%) АОК.

10

дозы, мг/кг

Рис.3 Влияние КТК при курсовом десятидневном введении на число АОК в селезенках мышей линии С57В1/6 при иммунодепрессии, индуцированной винбластином.

По оси абсцисс - доза препарата;

по оси ординат - число АОК в селезенке мышей.

25 ооо

Изучение влияния КТК на показатели клеточного иммунитета заключалось в исследовании пролиферации Т-лимфоцитов в РБТЛ и РСКЛ. Пролиферация Т- лимфоцитов у животных, получавших КТК в течение 12 дней и спонтанная пролиферация достоверно не отличались от контроля. Добавление митогена ФГА повышало уровень г.ролифератизной активности по сравнению с группой контроля в 9.8 раз. Индекс пролиферации в .контрольной группе при использовании Кон-А составил 10.3 (68785^4478 имп/мин). Значительных отличий показателей у животных, получавших препарат, не наблюдалось.

Курсовое введение КТК в течение 18 дней не давало значимых изменений спонтанной и митогениндуцированной пролиферативной активности (рис.4). Доза 1.0 мг/кг вызывала умеренное (до 130% р<0,05) увеличение ФГА-индуцированной пролиферации спленоцитов, и в этой же дозе отмечалось недостоверное повышение спонтанной" пролиферации. Индекс

пролиферации в этих группах животных (13.5) фактически не отличался от показателя в контрольной группе (10.4). Добавление в культуру Кон'А не давало достоверных различий пролиферативной активности лимфоцитов. Более выраженные изменения пролиферации лимфоцотов были отмечены при введении препарата в течение 30 дней. Уровень спонтанной пролиферации псд влиянием различных доз КТК не изменялся. Использование ФГА сопровождалось повышением индекса пролиферации, составляющего 25.6 и 38.7 соответственно, при контроле -25.4. Индекс пролиферации контрольной группы составлял 12.6, повышение индекса псслифесаиш в группах, получавших 0.01 мг/кг -14.4, 0.1 мг/кг - 18.7, 1.0 мг/кг - '7.4, 20 мг/кг - 2С.2. Увеличение соска введения препарата до 45 дней приводило к ссгсстзз/л'.сму повышению 1 -н£;9'<са грслиснсации ИП=28.3 для дезы 1.0 мг/кг (СГА).

1 2 3 4 5

спонтанная поолиферз'^ия

Рис. 4. Влияние курсового введения природного кзротин-токсферолового комплекса (в течение 18 дней) на пролиферативную активность спленошгтов мышей линии СВА

(по оси ординат - импДиш), * - р>0,05.

1 - контроль 2 - ХТК 0.01 мг/кг 3 - КТК 0,1 мг/кг - КТК 1,3 мг/кг 5 - КТК ¡0,0 мг/кг

Исследования влияния препарата в смешанной культуре лимфоцитов дали следующие результаты: во-первых индекс пролиферации зависел от соотношения реагирующих и стимулирующих клеток в культуре. В соотношении 5:1 ИП равнялся-8.4, изменение этого соотношения до 2:1 приводило к увеличению индекса пролиферации до 12.1. Введение различных дез КТК в течение 10 дней не изменяло уровня пролиферации спленсцитов мышей линии ВА1_3/С: уровень включения 3Н-

тимидина не отличался от показателей контроля. Повышение „ пролиферативной активности спленоцитов под влиянием КТК, происходило с увеличением срока приема до 30 дней. Индекс пролиферации в экспериментальной группе животных был равен 8.2 (доза 1.0 мг/кг, соотношение респондер: стимулятор - 1:5), что составило 134% относительно контрольной группы (ИП=6.1). Более длительное введение препарата (40 дней) давало увеличение пролиферативной активности до 138% (доза 1.0 мг/кг). Индекс пролиферации был равен 13.1 (соотношение респондеров и стимуляторов - 1:5). В группе животных, получавших 10.0 мг/кг КТК индекс пролиферации составлял 13.7 (в контроле - 10.2). При увеличении срока введения комплекса до 50 и 60 дней наблюдался выраженный рост пролиферативной активности спленоцитов. Максимальный стимулирующий эффект КТК был отмечен от дозы 1.0 мг/кг, вводимой в течение 50 дней, и составлял 175%. Другие дозы КТК также обладали стимулирующим действием, индекс стимуляции колебался от 15,2 до 17,0 относительно контрольной группы.

Для оценки влияния КТК на образование цитолитических Т-лимфоцитов использовали модель однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов. Цитолитическую активность образовавшихся специфических Т-киллеров определяли по способности лизировать клетки-мишени L-929

(трансформированные фибробласты). Достоверное повышение выхода радиоактивности изотопа в надосадочную жидкость наблюдалось в пробах с лимфоцитами мышей, получавших 0.110.0 мг/кг каротин-токоферолового комплекса, при сроке введения не менее 30 дней. Увеличение количества цитолитических Т-лимфоцитов в этих группах животных составляли 112-130% (р<0.05) по сравнению с контролем.

05 изменении активности естественных киллеров (рис.5) судили по выходу 51Сг из клеток-мишеней, которыми служили лейкозные клетки YAC-1. Активность НК определяли'по величине индекса литической активности. Выход 51Сг из клеток-мишеней YAC-1 в контроле составлял 26.4%.

При введение препарата в течение 20 суток не происходило достоверного изменения показателей, увеличе-ние срока введения до 30 суток сопровождалось повышением показателей выхода 51Сг на 26-30% (р<0,05) .

Влияние КТК на активность перитонеальных макрофагов (рис.6) изучалась методом хемилюминесценции (ХЛ). Уровень спонтанной ХЛ составлял 1427 имп/мин. Однократное введение препарата оказывало

достоверное увеличение ХЛ при назначении дозы 10 мг/кг до 2048 имп/мин.(148%). При курсовом введении препарата в течение 10 дней значимого отличия результатов опыта от контроля не было, но сохранялась тенденция к росту индекса фагоцитоза (до 138% от контроля).

Следующим этапом исследования было изучение влияния КТК на гемопозгический эффект при применении патологической модели токсико-анемического синцрома, вызванного ионизирующей радиацией. Наибольший стимулирующий эффект при однократном введении препарата до облучения наблюдался у мышеи линии СБА при введении дозы, равной 10 мг/кг за 24 часа до радиационного поражения: 6.2+6.7КОЕс (148% р<0,05). При увеличении дозы количество колониеобразующих единиц селезенки (КОЕс) существенно не менялось. Введение препарата через 1 час после облучения вызывало умеренную стимуляцию гемопоэтического процесса до 135% (5.8+1.1, р<0.05) по сравнению с контролем 4.2+0.7 (100%). Так, при приеме дозы 30,0 мг/кг за 24 часа колнчестао КОЕс составило 5.2+1.1 (124%), р<0.05, при введении за 48 часов количество колоний было 4.9±1.7 (117%) р<0.05. Введение препарата непосредственно до облучения в дозе 0,01 мг/кг приводило к повышению колонеобразования до 5.5±0.6 (132%, р<0,05) в дозе 0,001, а получение животными КТК сразу после облучения приводило к незначительному увеличению числа колоний. Максимальное увеличение КОЕс при действии комплекса в период после облучения отмечалось при получении 30 мг/кг во время, равное +1 час после облучения - 9.0±2.9 (145%, р<0.05). У мышей линии С57В1./6 введение препарата также оказывало умеренную стимуляцию при однократном введении от 112% до 128% при назначении КТК в дозах 10-30 мг/кг за 48 часов до облучения. Содержание КОЕс после однократного приема было несколько ниже, но и в этом случае сохранялась тенденция к увеличению числа колоний.

Курсозоэ применение КТК приводило к выраженному проявлению стимуляции. Проведение профилактического приема комплекса в дозе 30 мг/кг/сутки вызывало у мышей линии СВА (табл. 3) значительную стимуляцию колониеобразования: до 186% при приеме в течение 20 суток и 167% при курсе в течение 10 суток. У мышей линии С57В1У6 уровень стимуляции гемопозза был следующем: прием препарата в дозе 10 мг/кг/сутки в течение 10 суток приводил к образованию 152% КОЕс, назначение препарата в течение 20 суток до радиационного поражения в дозах 30 мг/кг в сутки приводило к возрастанию колониеобразования: до 157% (р<0.05,11.6±2.2, доза 10 мг/кг).

Ряс. 5. Зтиялие курсового в^едгдая ярнрсл::лго хароткн-токошеролового комплекса на активность еет;стгсииьд клеток

(по оси абсцисс - длительность введения, дни; по оси ординат - специфический цитолиз, Тс).

О - контроль ИЗ - 0,01 мг/кг

□ - 0,1 мг/кг О - 1,0 мг/кг

□ - 10,0 мг/кг

2000

Рис. 6. Вляянпе курсового введения природного каротин-токоферолового комплехса на хемилюмшшсиенсию перктонеальных макрофагов (по оси абсш!сс - время измерения, мин; по оси ординат -

уроаеиь жммюминисценаи!, мз).

рЗ - 10 дней О -20 дней

О - 30 дней И - контроль

Таблица з Влияние курсового приема КТК на образование КОЕс

при радиационном облучении мышей линии СВА в ЬР 50

Доза мг /сутки Контроль КОЕс Длительность и время введения

Профилактический курс Лечебный курс

М ±м % 5 суток приема 10 суток приема 30 суток приема 5 суток приема

од 8,2+0,5 100 9,4+1,2* 115 10,7+2,1 130 10,2+1,3 126 9,2+1,7* 112

0,5 6,4+1,2 100 7,3+2,1* 114 8,2+2,3* 128 8,6+1,2 134 8,4+1,5 131

10 7,2+1,4 100 8,6+1,8 120 9,7+1,7 134 10,2+2,1 143 8,9+1,9 127

30 8,3+0,8 100 10,2+2,3 128 11,2+2,8 138 12,4+3,1 151 11,3+2,1 135

*-р>0.05

С точки зрения радиобиологического подхода в лечении, острой лучевой болезни было проведено исследование гемопоэтической стимуляции курсовым приемом каротин-токоферолового комплекса. Количество КОЕс у мышей линии СВА после 5-суточного введения 10 мг/кг составило 6,7-0,4 (138% р<0.05). Стимуляция колониеобразования у мышей линии С57В!_/о вызывала образование 10,1+1,9 (140%, р<0.05) колоний. Введение препарата в дозе 30 мг/кг/сутки мышей линии СВА приводило к образованию 7,4±0,9 (153% р>0,05), а у мышей С57В|/6"- 10,4=1,8 (144% р<0,05).

ПроЕОДилэсь изучение влияния К7К на увеличение продолжительности жизни мышей С57В1-/6. По сравнению с контрольной группой увеличение продолжительности жизни наблюдалось уже при однократном приеме препарата. Наибольший эффект (90%, р<0.05) наблюдался при профилактическом приеме КТК в течение 30 дней до облучения.

С целью создания патологической модели для исследования иммуномодуляторэв-антиоксидантоз был использован гемопоэти.ческий и иммунотрзпный эффекты гипербарической оксигенации в режиме 0,2 и 1,2 Ата по 30 минут ежесуточно, 5 сеансов, 100% кислород. КТК назна-чался в дозе 10 мг/кг на 24 час иммуногенеза, однократно.

Были получены следующие результаты: в группе контроля число АОК составляло - 6252±640 АОК (100%). Мыши, получавшие гипербарическую оксигенацию в режиме 1.2 Ата, образовывали на 4-й день иммунного ответа 1дМ-секретирующие клетки в количестве 6011=240 (95%), а животные, получавшие режим гипероксии 2Г0 Ата: 5132+264 (82% р<0.05). Группы животных, получавшие КТК, давали в контроле 11624±820 антителообразующих клеток (186 % р<0,05), при режиме 1.2 Ата -9285=850 АОК (148 %), при режиме 2.0 Ата - 5=75=533 (54% р>С,05). Мыши линии (С5А<С57В1;'6)Р, дали -аналогичные результаты: контроле был равен 5331=334 (100%) АОК. Мыши получавшие гипербарическую оксигенацию в режиме 1.2 Ата реагировали образованием 8475=343 (88 % р<0,05), в режиме 2.0 Ата - 7750±1230 (80 % р<0,05) АОК. Мыши, получавшие сочетание КТК и ГБО в режиме 1.2 Ата образовали 11515±980 (120 % р<0,05), а в режиме 2.0 Ата- 8283=460 ( 86 % р<0,05) АОК.

Следующим направлением в нашей работе являлось изучение антимутагенных свойств КТК. Были проведены 2

независимых опыта с индукцией хромосомных аберраций циклофосфаном. Срок введения КТК - 7 и 18 дней. При применении циклофосфана в дозах 15, 30, 60 мкг/г число хромосомных аберраций возрастало по сравнению с контролем статистически достоверно (р<0.001). В группах животных, получавших каротин-токоферолов'ый комплекс, процент метафазных пластинок с хромосомными аберрациями снижался, по сравнению с мышами не получавшими препарат КТК. Уменьшение количества аберраций достигало 30-50%. При этом отличие от контроля было статистически достоверно. Циклофосфан вызывал значительное число перестроек (транслокаций) и множественных разрывов хромосом. Прием КТК значительно уменьшал количество' таких тяжелых повреждений хромосом, и в основном аберрации представляли однонитчатые разрывы.

Проводилось также сравнение цитотвксического действия гипербарической оксигенации в режимах 1.2 Ата 30 мин, 5 сеансов и 2.0 Ата 60 мин, 5 сеансов на фоне приема КТК курсом в течение 5 дней 10 мг/кг/сут. и при однократном внутрибрюшинном введении комплекса. ГБО в режиме 2.0 Ата вызывала статистически достоверное увеличение числа хромосомных аберраций (14 - 17%), которое все же не достигало значения, получавшегося при назначении циклофосфана. Число хромосомных аберраций, индуциро-ванных режимом ГБО 1.2 Ата было повышенным (6 - 8% р<0,05). Однократное применение каротин-токсферолового комплекса приводило к снижению числа хромосомных аберраций в группах животных получавших 2.0 Ата до 8-10% (р<0.01) и 1.2 Ата - 4 - 6% (р>0.05). Курсовой прием каротин-токоферолового комплекса приводил к более значительному снижению хромосомных аберраций, которые составляли соответственно 4,0% (р<0.01) и 1.7% (р<0.01).

Исследовали клетки костного мозга мышей (СБА х С57В!_/6)Р, подвергшися гамма-облучению ^Со в среднеле-тальной дозе 4,7 Гр. Препарат назначался по следующей схеме:

а) за 5 суток до облучения 10 мг/сутки;

б) через 1 час после облучения внутрибрюшинно 0,5 мг/кг;

в) в течение 5 суток после облучения парентерально 10 мг/сут.

Полученные результаты показывают значительное

снижение числа хромосомых аберраций' при курсовом приеме КТК. При профилактическом приеме - снижение хромосомнх аберраций до 42% (р<0,01), в процессе назначения лечебного курса - до 53% (р<0,05). Однократный прием КТК показал

меньшую антимугагенную активность при введении после облучения - 74% (р>0,01). Значительно снижается количество тяжелых поражений хромосом в виде разрывов, транслокаций, делеций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе углубленного доклинического изучения при-родного каротин-тсхсферолсзого комплекса было выявлено, что препарат обладает иммуностимулирующим действием как з отношении гуморального, так и клеточного иммунитета, а также макрсфзгальнсй системы иммунитета. Препарат псньшает потенциал кссеетЕсрнсй системы, обладает антимутагенным и рад/сностестсрньл! действием, отменяет некоторые токсические аффекты гипербаричесхой оксигенации. Таким образом, природный каротинтскоферслсЕый комплекс обладает плейотропным действием на организм.

В состав природного каоотин-токофероловсго комплекса входят каротин, витамин Е и аскорбиновая хислотз. Витамин Е является одним из основных эндогенных антиоксидантов. Он эффективно блокирует свободно-радикальные реакции и вследствие этого термозит перекисное окисление липидов в биологических мембранах (Buetter G.R. 1993). Антисксидантные действия токоферола потенцируется бета-каротином и витамином С (Gey K.F. et al 1991 ). Последний регерирует витамин Е в антиоксидантную форму (Harris W.S. 1992, Rifici V.A. et al 1993, Seis H. Eí al 1992, Block G. 1931), а у бета-каротина хорошо доказана способность удалять свободные радикалы из липидных мембран (Harris W.S. 1992, Seis Н. Et al 1992, Buettner G.R. 1993). Таким образом, исходя из общих соображений, следует ожидать, что природный .каротин-токоферолсвый комплекс должай обладать значительным антисксидантным действием суммарно превышающим езободно-радикальные эффекты каждого из компонентов. Какие из изученных нами эффекты можно отнести за счет гашения свободно-радикальных реакций? Это в первую очередь снижзки!" радиационного повреждения кроветворной системы организма, а также отмена ряда токсических эффектов тканевой гипоксии и гипербарической оксигенации.

Если учесть, что прямым показанием к назначению фармакопейных препаратов витамина Е и аскорбиновой кислоты в клинической практике является состояние, связанное с гиперпродукцией свободных радикалов, то преимущество

исследованного нами препарата перед указанными прототипами является очевидным.

Иммуностимулирующее действие природного каротин-токоферолового комплекса было зарегистрировано по целому ряду показателей. Препарат при длительном введении стимулировал реакцию бластгрансформации, увеличивая пролиферацию в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов, повышал функцию натуральных киллеров, усиливал первичный иммунный ответ мышей на эритроциты барана. Причем, следует отметить, что иммуно-моду&фующий эффект препарата не был монотонным: амплитуда стимулирующего эффекта была различной в различных тест-системах. Это не удивительно, поскольку, хотя бы по такому параметру как кинетика клеточных популяций, различные виды ответа, сильно отличаются друг от друга.

Заслуживает внимание тот факт, что природный КТК проявил себя как истинный иммунный стимулятор. Практически все отечественные и зарубежные препараты сертифицированные как иммуностимуляторы, на стадии подробного доклинического изучения лицензировались как иммуноадъюванты. Обычной методикой оценки действия препаратов как на гуморальной, так и клеточной иммунитет является сравнение амплитуды ответа на тот или иной антиген при введении препарата и без него. Исследуемый препарат при этом вводится в различные сроки после антигенного воздействия. При оценке иммунномодулирующей активности препарат действует или на развившиеся или на развивающийся иммунный ответ. Однако, это и составляет сущность иммуноадъювантов. Истинный иммуностимулятор должен стимулировать иммунную систему в целом, а не отдельный клон активированный антигеном, и должен действовать не зависимо от антигена.

Бета-каротин, впервые систематически исследован как иммуностимулятор в диссертационной работе О. В. Буюклинской, оказался активным, даже если вводился за 11 суток до антигена. Бета-каротин воздействовал на иммунную систему организма независимо от тестирующего антигена. В фармакологии существует догма, согласно которой эффект препарата должен быть исчезающе мал через 4Т1/г, когда количество препарата составляет только 6,25% от введенной дозы. Хотя точной цифры значения Т1/2 бета-каротина в доступной нам литературе мы не встретили, однако с большой степенью вероятности • можно допустить, что за 11 дней, прошедших с момента однократного

введения бета-каротина, т.е. к моменту иммунизации коли-чество его в организме ничтожно мало. Другими словами, однократная инъекция провитамина А так изменила иммунную систему организма, что она стала отвечать на антигенное раздражение более сильной реакцией.

Какие предположения можно выдвинуть относительно механизма этих изменений? Наиболее верояной причиной иммуномодулирующего эффекта бета-каротина является, с нашей точки зрения, взаимодействие метаболита ретинола ретиноиёвой кислоты с ядерными ретиноиевыми рецепторами. Ретиноиевые рецепторы являются лиганд-индуцируемыми рецепторами, которые выполняют функцию транскрипционных факторов при экспрессии широкого класса генов, в том числе и генов, кодирующих цитокиновую сеть. Поэтому ретиноиевая кислота, как ни один другой лиганд, является значимой для иммуной системы. Она выполняет регуляторную функцию. В связи сэтим становятся понятными данные о том, что при дефеците витамина А продолжительность жизни больных СПИДом сокращается на 1 год (Benito А. 1995), а частота трансплацентарного ВИЧ-инфицирования новорожденных значительно увеличивается (Zhang X. 1995).

Одним из основных компонентов природного каротин-токоферолового комплекса является бета-каротин. Возникает вопрос о том, имеет ли какие преимущества в качестве иммуномодулятора комплексный препарат по сравнению с чистым провитамином А. Для проведения "мягкой" иммунокоррекции при таких состояниях как старческая иммунодепрессия, вторичный иммунодефицит, обусловлен-ный сильными стрессорными воздействиями, неблагоприятными экологическими факторами, хроническими инфекциями, и др., природный каротин-токофероловый комплекс, несомненно, имеет преимущества перед "чистым" бета-каротином в силу разнообразных выше причин.

Наконец, заслуживает специального обсуждения разработанная нами патологическая модель для оценки иммуномо-дуляторов. Основу ее составляет жесткая гипербарическая оксигенация. По данным литературы токсические эффекты гипербарической оксигенации имеют свободно-радикальную природу. В наших экспериментах было установлено, что эти свободно-радикальные реакции могут реализоваться в виде иммуносупрессии. Тестирова-ние природного каротин-токоферолового комплекса на этой модели показало, что она чувствительна к воздействию препарата. Учитывая опреде-ленную

"чистоту" повреждающего воздействия, его известную контролируемость, можно полагать, что данная модель имеет определенные преимущества перед существующими, такими как, химическая радиационная иммунодепрессия. Эта модель в первую очередь пригодна для изучения антиоксидантов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

!*

В ходе -углубленного доклинического изучения был охарактеризован природный каротин-токофероловый комп-лекс, который по обследованным параметрам может быть рекомендован в качестве нетоксичного "мягкого" иммуномо-дулятора, пригодного для профилактического применения.

Препарат может быть рекомендован для применения в лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы, для уменьшения токсических эффектов при химио- и радиотерапии.

Для дальнейшего исследования препаратов антиоксидантов рекомендована патологическая модель на основе гипербарической оксигенации.

Для практического применения можно рекомендовать создание новых форм лекарственного средства на основе природного каротин-токоферолового комплекса.

выводы

1. Препарат природного КТК обладает четко выраженной иммунотропной активностью, что проявляется в стимуля-ции (иммуномодуляции) различных звеньев иммунной системы.

2. Стимуляция гуморального звена иммунитета выражается в дозо-зависимом влиянии КТК на индукцию антитело-образующих клеток в селезенке мышей и не зависит способа (пути) введения иммунсмодулятора. Показана возможность коррекции первичного (врожденного) и вторичного (индуцированного винбластинсм) иммуноде- срицитного состояния у мышей природным КТК.

3. Препарат природного КТК обладает выраженным иммуномодулирующим действием на клеточное (Т- зависимое) звено иммунитета. Стимуляция клеточного звена иммунитета природным КТК проявлялась во время-зависимом влиянии на стимуляцию пролиферации Т-лимфоцитов в реакции бласттрансформации лимфоцитов и зависит от длительности курсового введения препарата. Показано увеличение активности цитотоксических Т-лимфоцитов, натуральных киллеров и макрофагов при курсовом назначении КТК.

4.Природный КТК имеет выраженный гемопоэтический эффект, что обнаруживается при развитии токсико-анемического синдрома, вызванного сублетальной дозой гамма-облучения. Стимуляция гемопоэтического эффекта проявляется в виде время-зависимого эффекта и выражается в увеличении образования числа колониеобразующих единиц селезенки из выживших после гамма-облучения полипотентных стволовых кроветворных клеток, увеличении продолжительности жизни жиеотных и снижении токсических проявлений последствий радиационного поражения.

5. Выявлено выраженное антимутагенное действие препарата природного КТК, проявляющееся в уменьшении хромосомных аберраций, индуцированных у мышей введением циклофсс-фана, дейстзием^юнизирующей радиации (гамма-облучение) и гипербарической оксигенации.

6.Предложена новая патологическая модель для изучения иммуномодуляторов - антиоксидантов, обусловленные действием гипербарической оксигенации.

7.Препарат КТК может быть использован для иммунокор-рекции при комбинированном лечении и профилактике заболеваний, сопровождающихся развитием вторичного иммунодефицита.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

I.Sergeev A.V., Mcrtchyan T.V., Shashrina M.Y., Fogabalo A.V. et al. Pharmaceutical and biomedical aspects of beta-carotene-based drug development.// 9* NCI-EORTC symposium jn new drugs in cancer therapy. Amsterdam 1996, p.63

2. Бугаклинская O.B., Сергеев A.B., Утешев !S.C., Погабало A.B., Алпатов С.П. Использование биоантиоксидантов для коррекции вторичных иммунодефиците®// Тез. Докл. Ill Российский Конгресс "Человек и лекарство": М., 1996, с. 48

3. Погабало A.B. Иммунотропная активность природного каротин-токоферолового комплекса // Тез. Докл. Ill Российский Конгресс "Человек и лекарство": М., 1996, с. 43

4. Погабало A.B. Гемопоэтическая активность природного каротин-токоферолового комплекса // Тез. Докл. IV Российский Конгресс "Человек и лекарство": М., 1997, с. 284

5. Погабало A.B., Горожанская Э.Г., Шашкина М.Я. Показатели антиоксидантных систем при бронхиальной астмы у детей иммуномодуляторами // Тез. Докл. IV Российский Конгресс "Человек и лекарство": М., 1997, с. 229