Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуностимулирующее действие полисахаридов, выделенных из корня и культуры клеток женьшеня

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

СМОЛИНА ТАТЬЯНА ПАВЛОВНА

ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КОРНЯ И КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖЕНЬШЕНЯ

(14.00.36 — аллергология и иммунология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток — 1994

Диссертация выполнена в НИИ СО РАМН г. Владивостока.

эпидемиологии и микробиологи

Научные руководители: член-корреспондент РАМН, лауреат Государственной премии доктор медицинских наук, профессор

Н.Н. Беседнова Т.Г. Орлова

Научный консультант: доктор химических наук

Т.Ф. Соловьева

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

кандидат биологических наук

Б.Н. Ковалев Ю.Н. Лоенко

Ведущее учреждение, дающее внешний отзыв о научно-пракп ческой ценности работы: Государственной научный центр г антибиотикам ИЗ Российской Федерации.

Защита диссертации состоится " ___199'

на заседании специализированного Совета К 084.24.05 при BJ дивосгокском Государственном медицинском институте по адре< 690600 ГСП, г. Владивосток, пр. ОстрякоЕа 2.

С'диссертацией модно ознакомиться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского института.

Автореферат разослан ___ 1994 г.

Зченый секретарь специализированного

Совета, кандидат медицинских наук^У^у^-- Е.В. Власов.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск иммуномодуляторов является одной из актуальных задач современной биологии и медицины, так как" эти вещества осуществляют регуляцию иммунных процессов в организме, что необходимо для лечения и профилактики целого ряда заболеваний и патологических состояний человека и животных. Особое место среди иммуномодуляторов занимают индукторы интерферона (ИФ), которые, обладая широким спектром иммунорегуляции, играют большую роль при лечении вирусных, онкологических и других заболеваний (Ф.И.Ершов, Э.Б.Тазула-хова, 1989). В настоящее время количество иммуномодуляторов, находящихся на стадии доклинических исследований, достаточно велико. Ограниченное же их применение в практической медицине связано либо с проявлением нежелательных эффектов этих препаратов в организме, либо со сложностью их получения и стандартизации. Поэтому поиск и разработка новых иммуномодуляторов продолжает оставаться актуальной проблемой.

К настоящему времени иммуноактивные вещества обнаружены среди различных классов химических соединений (Д.Н.Лазарева, Е.К.Алехин.1905: В.Н. Земсков, 1991). Вазное место среди них принадлежит полисахаридам природного происхождения, в том числе и выделенным из растений ( Ю.С. Оводов и соавт., 1983: С.В.Турина и соавт., 1988). Растительные полисахариды слабо или вообще не токсичны, апирогенны, неантигенны, чем выгодно отличаются от бактериальных полисахаридов (В. Ц. Ширине кий,. Е.А.Жук, 1990).

В последнее время наряду с поиском новых источников биологически активных веществ изучаются иммуномодулирующие свойства различных биополимеров, выделенных из уже использующихся в медицине лекарственных растений.

Женьшень, с давних пор. применяющийся как тонизирующее и адаптогенное средство (И.В.Дардымов, 1987), лишь в последние годы стал объектом иммунологических исследований ( В.Н.Чуба-рев, 1988: S.K.Chong et al.. 1984). Ввиду того, что запасы дикорастущего женьшеня ограничены, а плантационное культивирование его не достигло промышленных масштабов, это растение начали выращивать в виде культуры ткани. Работами ряда авторов было показано, что настойки из природного корня и биомассы селективных штаммов культуры ткани Р.ginseng оказывают

п

~ с. ~

влияние на различные звенья иммунной системы (Т.Ф.Соловьева и соавт.,1989; Л.И. Слепян и соавт., 1990). Однако невозможность точной фармакологической стандартизации суммарных препаратов и получение противоречивых результатов поставили ученых перед проблемой выделения в относительно чистом виде •активно действующих компонентов кеньиеня. Объектами изучения р последние годы стали лолисахаридные препараты из этого растения. Имеются работы, характеризующие отдельные показатели иммуноыодулирцящёго влияния полисахаридов женьшеня,' не раскрывающие, однако, механизмов этого воздействия (К.(Ма-п1, К. МигиЬагп, 198?; Б. Ш-р1п ег а1 ., 1989 ).

Учитывая то, что в процессе приготовления официнальной настойки аеньшеня остается неутилизированной масса, содержащая полисахаридную фракцию, -а в литературе имеются немногочисленные данные о том. что полисахариды женьшеня обладают иммуномодулирующими свойствами, представлялось актуальным исследование - полисахаридных препаратов из корня и культуры ткани женьшеня.

Цель работы - исследование некоторых механизмов действия новых веществ - панаксана-1 (П-1), выделенного из натурального корня, и панаксана-2 (П-2), полученного из культуры ткани женьшеня, и экспериментальное обоснование возможности применения их в качестве индукторов гамма-интерферона и им-мунокорректоров при иммунодефицитных состояниях.

Основные задачи исследования:

1. Изучить иммуномодулирунщее влияние П-1 и П-2 на гуморальные и клеточные, факторы иммунитета.

2. Исследовать воздействие П-1 и П-2 на некоторые факторы неспецифической резистентности организма, в том числе на индукции интерферона и фактора некроза опухолей (ФИО).

3. На модели экзо- и зндоколониеобразования исследовать влияние П-1 и П-2 на кроветворение.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

1. Впервые проведено сравнительное экспериментальное исследование влияния полисахаридных препаратов, получениях из натурального корня и культуры ткани женьшеня, на основные звенья иммунной системы.

2. Впервые показана интерферониндуцирунщая активность П-1 и П-2 ( авторские свидетельства Государственного комитета по изобретениям и открытиям СССР N 1748325 и N 1748326 от 15

- 3 -

марта 1992 года "Индуктор гамма-интерферона" ).

3. Впервые установлена продукция ФИО лейкоцитами человека под действием П-1 и П-2.

4. На моделях зкзо- и эндогенного колониеобразования показано стимулирупщее влияние П-1 и П-2 на пролиферации и миграцию стволовых кроветворных клеток.

5. Установлено, что иммуностимулирующее действие П-1 и П-2 реализуется через активации макрофагов и Т-лимфоцитов, выработку клетками цитокинов - Г-ИФ и ФНО.

6. Показано, что действие П-2, выделенного из культуры ткани, аналогично действии П-1, полученного из натурального корня женьшеня.

Практическая значимость.

1. Результаты экспериментов открывают перспективы использования П-1 и П-2 в качестве индукторов у-ИФ. стимуляторов иммунитета и факторов неспецифической резистентности организма.

2. Использование полисахаридных препаратов из корня и культури ткани аеньшеня. получаемых из массы, остающейся после приготовления официнальной спиртовой настойки, способствует более полной утилизации первичного сырья.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. П-1 и П-2 - новые индукторы у-ИФ.

2. П-1 и П-2 - препараты, выделенные из натурального корня и культуры ткани аеньшеня, обладают иммуностимулирующим действием: повышают уровень гуморального и клеточного иммунитета, а такяе неспецифической резистентности организма.

3. Механизм действия П-1 и П-2 в значительной степени определяется повышением функциональной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), индукцией у-ИФ и ФНО.

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (Владивосток, 1994).

Материалы диссертации долояены на Всесоюзной конференции "Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока" (Томск. 1989), на рабочем совещании "Иммуномодуля-торы природного происхождения" (Владивосток. 1990), представлены на 1-ом съезде иммунологов России (Новосибирск 1992), и на международном симпозиуме по клинической гипертермии, активационной, иммуномодулирукщей и радйосенсибилизирующей терапии рака (Владивосток, 1992), а также на VI международ-

- А -

ном симпозиуме по женьиеню (Сеул, Корея , 1993).

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Лиссертация состоит из введения. 2 глав обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 6 рисунками. Указатель цитируемой литературы включает 95 отечественных и 99 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования^

Экспериментальные исследования выполнены на 665 неинбред-ных мышах, 258 мышах линии СВй, 90 иыиах линии C57BL/6, 1925 мышах - гибридах (CBAxC57BL/6)Fl массой 18-20 г. 20 морских свинках массой 300-500 г.

Основными объектами экспериментального изучения были по-лисахаридсодержащие препараты: панаксан-1 (П-1), выделенный путем водной экстракции из корня женьшеня (Panax ginseng) и панаксан-2 (П-2), полученный тем se методом из биомассы культуры ткани женьшеня штамма ИФРШ-2. П-1 содераит 80'/. моносахаридов : 3.5И белка: 6.?'/. уроновых кислот и 13.57. золы: в его состав входят полисахариды: глвкан,и пектин. П-2 состоит из 43.42 моносахаридов: ÍQ.77. уроновых кислот: 2.57. белка: 3.22 золы: препарат содераит крахмал и 2 кислых полисахарида: арабиногалактан и ксилоглюкан. В ряде экспериментов были использованы препараты, выделенные из биомассы культуры ткани неныеня штамма 5И0-2 и представляющие собой две полисахаридсодержащие фракции ПФ-1 и ПФ-2. Фракции близки по химическому составу, содераат 55.42 углеводов: 6У. белков; 10.2% уроновых кислот и 1ЛУ. золы; в их состав входят крахмал и 2 кислых полисахарида. Фракции ПФ-1 и ПФ-2, последовательно извлекаемые из биомассы, различаются относительным содержанием полисахаридов.

Выделение и изучение химического состава всех вышеназванных препаратов проведено в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВ0 РАН под руководством д.х.н. Т.Ф. Соловьевой.

При изучении прогивоинфекционной активности исследуемых

препаратов в качестве экспериментальных моделей были использованы локализованная стафилококковая инфекция и генерализованные инфекции, вызванные введением Е. со 1i. St.aureus и Y. pseudotuberculosis. Эффект препаратов оценивали по проценту выживших животных в опытных и контрольных группах.

Выявление антителоабразующих клеток (АОК) в селезенках мышей к эритроцитам барана (35) производили модифицированными методами A.Cunningham, A.Szenberg (1968) и N.Jerne, A.Nordin (1963).

Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к ЭБ определяли по методу P.H.Lagrange, G.B.Maskaness (1974).

Изучение фагоцитарных процессов клеток СМФ проводили по методу Н.И. Брауде (1964) на культуре перитонеальных макрофагов, выделенных от интактных морских свинок либо от свинок, за сутки до этого инъецированных панаксанаыи.В качестве тест-микроба использовали Y. pseudotuberculosis.

Фагоцитарную активность полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) по отношению к У. pseudotuberculosis и St. aureus определяли на моделях in vivo и in vitro по методу В.М. Бер-мана и Е.М. Славской (1385).

Действие полисахаридов на интенсивность развития и исход местного гнойно-воспалительного процесса оценивали по степени отека конечностей мышей и срокам его ликвидации у опытных животных по сравнению с контрольными (Н.В. Крылова, 1986).

Влияние П—1 и П-2 на индукцию ИФ и ФНО определяли in vitro в культуре лейкоцитов периферической крови человека. Титрование интерферона проводили в диплоидной культуре фиб-робластов человека М-19. В качестве тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей (В.Д. Соловьев.Т.А.Бектемиров 1981).

Концентрации ФНО определяли по цитотоксическому действию разведений культуральной жидкости в отношении чувствительных клеток L929, обработанных актиномицином-D (А.К. Peter et al. 1988).

Влияние панаксанов на эндо- и экзогенное колониеобразова-ние оценивали по общепринятому методу, описанному J. Е. Till и Е.А. McCulloch (1961). Облучение животных осуществляли на аппарате "РОКУС-М" гамма-лучами Со .

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики (Ашмарин И.П., Воробьев А.А.,1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСШНДЕНИЕ Влияние полисахаридов яеньшеня на показатели неспецифической резистентности организма.

На модели экспериментального коли-сеписа установлено усиление антиинфекционной.резистентности мышей под действием парентерально введенных П-i или П-2 (Табл. 1).

Таблица i.

Влияние панаксанов на уровень выживаемости мышей при генерализованной инфекции, вызванной E.coli ( в У.)

Способ Доза Стат. Введение П-1 за Введение П-2 за

ПВО поиип п nt/я

ООСДСПЛЯ 11 Una

препарата (мг/кг) затели 1 сут. 3 сут. 1 сут. 3 сут.

М 6.7 3,3 6,7 . 3,3,

0.05 ±т- 3,3 3,3 3,3 3,3

М 50,0 40,0 40,0 43,3

Внутри- 0.5 ±т 5,8 10.0 5,8 8.8

брюшинное И 56,7 53,3 53,3 46,7

введение 5 +ш 3,3 13,3 3,3 8,8

М 63,3 60,0 53,3 56,?

25 " +т 3,3 5,8 8,8 13,3

Н 10,0 6,7 6,7 10,0

0.05 ±ш 5.8 6,7 6,7 5,8

Н 36,7 30,0 33,3 36,7

Подковное 0.5 3,3 5,8 13,3 3,3

введение М 53,3 43,3 50,0 63,3

5 ±а 6,7 8,8 11,5 ' 3,3

Н 50,0 43,3 60,0 66.7

25 ±ш 5,8 12,0 -5,8 8,8

Контроль: 0

Эффект при этом зависел от пути, дозы и времени введения препарата относительно заражения животных. Наиболее сильное защитное действие оказывало парентеральное введение панаксанов в дозах 0,5-25 мг/кг за 1-3 суток до зарааения мышей, что приводило к защите 40-60* животных на фоне 100* гибели в

контрольной гриппе. Троекратное введение П-1 или П-2 ( за 1, 3, б суток до заражения) не приводило к достоверному увеличения выживаемости животных по сравнению с таковой при однократном инъецировании.

Зааным звеном в повышении резистентности организма является активация полиморфноядерных лейкоцитов, т.к. эти клетки располагают богатым эффекгорным потенциалом и рано включаются в работу по восстановлению гомеостаза сА.Н.Маянский, Д.Н.Маянский. 1983).

Нами показано увеличение поглотительной и переваривавшей способности ПМЯЛ. активированных введением П-i либо П-2 в дозе 5 мг/кг за сутки до инфицирования мыией. При использовании в качестве инфекционных агентов St.aureus и Y.pseudotuberculosis узе в первые часы после заражения показатели фагоцитоза мыией, получивших П-1 или П-2, в 2 раза превышали таковые в контроле, что особенно важно для течения и исхода инфекционного процесса. К 24 часам в экссудате опытных мыией, не инъецированных полисахаридами, внеклеточно расположенные микробы не обнаруживались, в то время как у контрольных животных процесс поглощения микробов еще не был завершен.

Одним из механизмов стимуляции неспецифической резистентности и имунного ответа полисахаридами является активация клеток СЙФ (В.А. Никитин, 1983; N.R. DiLuzio, 1985). Наиболее универсальным тестом для определения функциональной активности клеток СМФ является изучение фагоцитоза и последующего внутриклеточного переваривания бактерий.

Наши исследования выявили усиление поглотительной и переваривающей активности перитонеальных макрофагов по отношению к псевдотуберкулезному микробу под действием П-1 и П-2, введенных парентерально морским свинкам С In vivo) или HenocpejF~ ственно в культуру макрофагов С in vitro).

В-экспериментах in vivo через 1 час после зараяения ФП опытных групп превышал контрольный на 18-232. При этом среднее количество, микробов, поглощенных одной клеткой, во всех опытных группах превосходило аналогичный показатель контроля в 2 раза (табл.2).

К б часу эксперимента показатели фагоцитарной активности контроля почти не изменяются, в то время как в опытных группах - количество микробов в клетках уменьшается в среднем в 3 раза, что- свидетельствует об активном процессе переваривания.

' ; :.:. : Таблица 2.

Влияние П-L и П-2 на фагоцитоз Y. pseudotuberculosis"

- . т-: -1- В ЩПЬГуре МаКрОфаГОВ

... . - -г - ..... Врема наблюдения

Вещество,, Стат.~ -

доза пока- 1 час. 6 час.

с ыг/кг) затели

ФП ФЧ ФП ФЧ

in vivo

П-1 М 92,0 17,4 68,3 5,7

5 ±а 3,1 1,9 0,9 0,6

Р <0.01 <0.01 >0.05 >0.05

П-1 К 89,7 19,1 85,3 6,5

25 ±в 1.9 0,3 2,7 0,1

Р <0.01 <0.01 <0.05 >0.05

П-2 М 88,0 ' 15,2 67,7 5,0

5 ±ш 1,7 0,5 1.5 0,2

Р <0.01 <0.01 >0.05 <0.05

П-2 И 87,0 16,0 59,7 4,5

25 ±ш 1.0 1.3 1.5 0,2

Р <0.01 <0.01 . >0.05 <0.01

in vitro

П-1' М 73,3 9,1 57,0 4,4

10 ±ш 3,8 0,4 7,8 1.0

Р >0.05 >0.05 >0.05 <0.05

П-1 Н 78,0 9,8 51,7 3,7

100 ±ш 1.0 0,9 9,2 1,3

Р <0,05 >0.05 >0.05 <0.05

П-2 М 74,3 12,4 50,7 3,4 '

100 ±и 5,3 1.3 5,0 0,9

Р >0.05 ' <0.05 >0.05 <0.05

Контроль И 69,3 8,0 62,0 8,0

±ш 2,0 0,7 8,6 0,8

В экспериментах in vitro также показана активация процесса фагоцитоза в макрофагах под действием панаксанов, причем в большей степени переваривающей активности.

Установленное нами усиление активации СМФ под действием панаксанов имеет большое значение не только для элиминации чужеродных агентов, но и для осуществления регуляторных процессов, т.к. макрофаги синтезируют большое количество биологически активных веществ.

Из данных литературы (Y.H. Jie et al., 1984) известно о том, что полисахариды натурального корня женьшеня обладают противовоспалительной активностью. Нами изучено влияние гто-лисах'аридных фракций ПФ-I и ПФ-2, выделенных из селективного -штамма женьшеня БИО-2 на противовоспалительную активность. На модели локализованной стафилококковой инфекции установлено. что профилактическое введение этих препаратов приводит к снижению уровня отечности в гнойно-воспалительном очаге на 70-80% по сравнении с контролем Iтабл.3).

, Таблица 3.

Влияние ПФ—1 и ПФ-2 на развитие гнойно-воспалительного очага у мышей

Препарат, доза (мг/кг) Стат. показатели Средняя разность массы больной и здоровой конечности (мг).Бремя после заражения

3 день 10 день 15 день

контроль И 42.6 81,2 54,5

±3 7.2 8,2 4,5

ПФ-1 И 36,6 21.6 15,5

' 2,3 ±1 4.8 5.4 3.8

Р >0.05 <0,05 <0,05

ПФ-2 . К 27,2 23,2 16,5

2,5 ±31 4,6 5.2 3,5

Р >0,05 <0,05 <0,05

Известно, что клетки СМФ и лимфоциты секретирушт большое количество разнообразных веществ, среди которых значительная роль в регуляции иммунных процессов принадлежит ИФ и ФНО iG.Fiorucci et ah, 1991: И.J.Ming et al.. 198?)

- 10 -

Как показано на табл.4, оба исследуемых препарата вызывают синтез ИФ и ФНО. Максимальный гигр интерферона, индуцированного П-1. составил 32 ед/мл, ФНО - 8 ед/мл; П-2 вызывал образование ИФ в более высоких титрах, равных 256 ед/мл, и ФНО в титрах 4 ед/мл.

Таблица 4.

Образование интерферона и ФНО лейкоцитами человека в ответ на индукцию П-1 и П-2

Препарат Концентрация икг/мл Титр интерферона (ед/мл) Титр ФНО

Время, дни

0 1 2 3 4 5 1

П-1 1000 500 100 50 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 32 32 <2 . 2 32 32 <2 4 32 32 32 32 32 32 32 32 8 4 2 <2

П-2 1000 <2 <2 <2~~ <2 <2 <2 2

500 <2 <2 -<2 8- -32 64 4

100 <2 <2 64 64 128 256 2

50 <2 <2 32 64 128 64 <2

Для определения типовой принадлежности интерфероны обрабатывали кислотой ipH 2.0). Кислотолабильность исследованных образцов ИФ позволила сделать- предположение об индукции у-ИФ. Для подтверждения этого исследуемые интерфероны были обработаны антисывороткой к?-ИФ человека. Исчезновение антивирусной активности в исследуемых пробах свидетельствовало о синтезе под действием панаксанов у -ИФ (табл.5). ■ Среди ИФ известны 3 основных класса* иГ-. Для«* -

и р - характерна, в основном, антивирусная активность, а f-ИФ в большей степени осуществляет регуляторнуш функцию, оказывая влияние на функциональную активность всех клеток иммунной системы и играя важную роль в осуществлении клеточной цитотоксичности, антимикробном, противоопухолевом, анти-'протозойном действии С G.Sastl, С. Huber, 1988).

Таблица 5.

Изучение кислотолабильности и видовой принадлежности ИФ. индуцированных П-1 и П-2

Интерферон Без обработки Активность интерферона Сед/мл) под воздействием

рН 2.0 Нормальная сыворотка Антисыворотка к у- ИФ человека

Индуцированный П-1 32 <2 32 <2

Индуцированный П-2 64 <2 64 <2

Г- ИФ человека 256 <2 256 <2

Иммуномодулирущая активность ИФ обусловлена их действием на клетрчные рецепторы, внутриклеточные процессы и, как следствие этого, на процессы пролиферации, дифференцировки и миграции клеток (.В.П.Кузнецов, 1987).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о повышении неспецифической резистентности организма полисахарид-ными препаратами женьшеня. Введение как П-1, так и П-2 повышает сопротивляемость организма животных к инфекциям и изменяет весь ход воспалительного процесса, активирует клетки СМФ и ПМЯЛ. индуцирует образование ¡Р- ИФ и ФИО лейкоцитами человека. Противоинфекционное действие П-1 и П-2 может быть обусловлено активацией фагоцитов, существенную роль в которой играют у —ИФ и ФНО.

Действие панаксанов на гуморальные и клеточные факторы иммунитета.

Изучение влияния панаксанов на гуморальный иммунитет проводили на модели формирования ЙОН в селезенке к тимусзави-симому антигену (ТЗА) - 35 и к тимуснезависимому антигену (ТНА) - 41-антигену брюшнотифозных бактерий.

Для ЗБ показано увеличение количество ЙОК в селезенках мышей СВА и гибридов (СВАхС57ВЬ/6)Р1 в 2-2.5 раза по сравнении

с контролем при парентеральном способе введения препаратов. Стимулирующий эффект проявлялся в диапазоне доз препаратов от 0.05 до 5 мг/кг.

При пероральном введении 5 мг/кг П-1 мышам СБА в течение 10 дней до иммунизации ЭБ наблюдалось увеличение числа АОК в селезенках в 1,5 раза по сравнении с контролем. П-2 не вызывал статистически достоверного изменения.

На разных линиях мышей была изучена возмоаность феноти-пической коррекции силы иммунного ответа на ЗБ панаксанами. В эксперименте использованы сильнореагирукщие на ЭБ гибриды с СВАхС5?В1/61, отвечающие на иммунизацию по родительскому генотипу СБА и слабореагируицие на этот антиген мыии С57ВЬ/6. Сравнительную оценку иммунного ответа на ЭБ у мышей разных линий проводили на 5 и 15 сутки.

Полученные результаты подтвердили известный из литературы Факт (В.Ю. Скворцов и соавт., 1984), что мыши разных линий в различной степени отвечаит на ЗБ (рис.1). Количество АОК в селезенке у гибридов С СВАхС57В1./6 ЗР1 превосходило этот показатель у мышей С5?ВЬ/б в 1,6 раза. Сравнительный анализ действия П-1 показал обратнуи зависимость между стимулирушщей активностью препарата и уровнем исходной иммунореактивности животных на 35.

Так. на 5-е сутки после иммунизации ЭБ и парентерального введения аивотныы 5 мг/кг П-1, индекс стимуляции (отношение числа йОК в опытной группе к таковому в контрольной) у гибридов (СВЙхС57ВЬ/6)Р1 равнялся 1,8, з то время как в группе мышей С5?ВЬ/6 этот показатель достигал 3,0, а величины ЙОК стимулированных панаксанои-1 мышей" С57ВЬ/6 и гибридов IСВАхС57В1./6)Р1 статистически не отличались друг от друга. К 15 суткам количество АОК в селезенках мышей уменьшилось,.и показатели, опытных групп статистически не отличались от контрольных.

Полученный эффект может быть обусловлен способностью данного полисахарида влиять на процессы,контролируемые генами иммунного ответа: 1 миграцию стволовых клеток, пролиферации, дифференцировку и кооперативное взаимодействие субпопуляций лимфоидных клеток и т.д. (Р.В.Петров и соавт., 1981). В результате этого у мышей сильнореагируюцих на ЗБ линий, генетический контроль которых обеспечивает максимальную эффективность реализации всех звеньев иммуного ответа, стимулиру-

ЙОК х 10'

1

5 день

15 день

1

3

1

2

3 4

Рис.1. Формирование РОК к ЭБ у ниией линий С57ВЬ/6 и (СВАхС57В[У6)Р1 под действием панаксанов.

По оси ординат - количество ЙОК на селезенку

после введения мышам 1. СВАхС57В1Уб)Р1 : 1 - ЭБ : 2 - ЭБ и П-1 (5мг/кг)

после введения мышам С57ВЬ/б : 3 - ЭБ ; 4 - ЭБ и П-1 (5мг/кг)

- 14 -

ющий эффект препарата выражен в меньшей степени.

Стимулируя формирование АОК к ТЗА , панаксаны не влияли на количество АОК к ТНА. что . указывает на связь эффекта стимуляции с Т-, а не В- клетками.

Итак, возможные механизмы стимуляции гуморального ответа полисахаридами женьшеня определявтея воздействием этих веществ на Т-клетки,макрофаги.кооперативные процессы между ними.а также опосредованным действием через цитокины, выделяемые активированными клетками, в частности f- ИФ и ФНО.

С целью исследования влияния полисахаридсодернащих препаратов женьшеня на реакцию ГЗТ к ЭБ, индуцированную у мышей (CBAxC5?BL/6)Fl, исследуемые вещества вводили подкожно за сутки до сенсибилизации и за сутки до разрешающей дозы ЭБ. Вещества применяли в дозах от 0,5 до 25 мг/кг.

Как показали результаты экспериментов, введение П-1 и П-2 в дозах 5 и 25 мг/кг не изменяет интенсивности реакции ГЗТ. Применение препаратов в дозе 0,5 мг/кг за сутки до введения разрешающей инъекции ЗБ прив.одит к увеличении реакции ГЗТ на 38.8'/. при введении П-1 и на 48.62 при введении П-2.

Основным классом клеток, обеспечивающих развитие эффек-торной стадии ГЗТ, являются лимфоциты, однако немаловажную роль играют макрофаги, которые перерабатывают антигены, представляют его лимфоцитам в виде комплекса с 1а-а, являются. клетками-мишенями для многих лимфокинов и сами вырабатывают медиаторы, влиявшие на развитие ГЗТ (Н.В.Медуницын, 1983). большую роль в модуляции ГЗТ осуществляет ФНО и ИФ. ФНО первоначально был идентифицирован как один из.главных медиаторов ГЗТ. индуцируемые им цитокины - ¡Г -ИФ, HÍI-6 приводят к активации Т-клеток_и целому каскаду ответных реакций активированых клеток еМ.М.Вядро, С.М.Навашин. 1989). Результат действия ИФ на ГЗТ зависит от времени его воздействия: введение ИФ до сенсибилизации приводит к ингибиции, а после инъекции антигена - к стимуляции ГЗТ (Н.В.Медуницын и соавг. 1987).

Анализ данных литературы и собственных исследований позволяет предположить, что стимулирующее влияние панаксанов на эффекторную стадии ГЗТ осуществляется при помощи ИФ, ФНО и, возможно, других цитокинов, которые активируют Т-клетки. Кроме того. ФНО является одним из медиаторов воспалительных реакций, клеточной мишенью для которого служат нейтрофилы.

- 15 -

Влияние полисахаридов аеныденя на кроветворение.

Для более полной оценки влияния иммуноиодуляторов на иммунную систему важно изучить их действие на гемопоэз, в том числе на процессы пролиферации и миграции стволовых кроветворных клеток (СКК).

На модели эндогенного колониеобразования нами показано, что введение препаратов за 1-3 суток до облучения увеличивало количество колониеобразуищих единиц в селезенке (КОЕс) более чем в 2 раза (рис.2).

КОЕс

35

30

20

15

10

П-1

/ /1

/

\\

л

у

У\

ч\

/

м

/

м //

П-2

л

-1 сут. -3 сут. ■ -1 сут. -3 сут. Рис.2. Влияние П-1 и ,П-2 на формирование эндогенных КОЕс.

контроль

доза

0,5 мг/кг

ГЧ

доза 5 мг/кг

25

5

- 16 -

Из данных литературы известно, что эндоколонии в селезенках при малых дозах оолучения ооразуются, в основном,за счет сохранившихся клеток в самой селезенке (Р.М.Хаитов, Т.Н.Йри-пова,1982). Из этого следует, что увеличение количества КОЕс под действием панаксанов происходит, в основном, за счет пролиферации клеток.

Стимулирующее воздействие панаксанов показано и на модели экзогенного колониеобразования (рис.3). Так, у летально облученных реципиентов при переносе им взвеси 10 клеток селезенки интактных доноров (контроль 1) через 8 суток определялось от 44,3±1,7 до 60.3+2,1 КОЕс. Если реципиентам переносили такое яе количество клеток от доноров, облученных в дозе 2 Гр (контроль 2), то число КОЕс определялось в диапазоне от 3,610,4 до 4,5±0,5. Таким образом, облучение мышей в дозе 2 Гр сопровождалось резким снижением, числа стволовых кроветворных клеток.

Если донорам за 1 час до облучения (2 Гр) инъецировали 1 мг/кг П-Гили ¡1-2. то число КОЕс превышало аналогичный показатель'контрольных (контроль 2) мышей в 5-6 раз.

Введение исследуемых препаратов донорам в таких же дозах за 24 часа до облучения (2 Гр) приводило к увеличению КОЕс реципиентов в 8-9 раз (по сравнению с контролем 2) и составляло 40,5 ± 1,1 для П-1 и 36,7 ± 1,5 для П-2. Эти показатели не имели достоверного отличия от величины КОЕс мышей, которым трансплантировали клетки селезенки интактных доноров (.контроль 1), что свидетельствует о влиянии панаксанов на процессы миграции, пролиферации СКК, а также о том, что исследуемые вещества способствуют сохранению СКК от повреждающего воздействия радиации.

На основании полученных данных можно предположить 2 пути стимуляции геиопоэза панаксанами.

Первый - предполагает опосредованную стимуляцию активированными макрофагами, вырабатывающими колониестимулирующий Фактор, что было показано в экспериментах Е.О. Шэкапеп с сотр. (1978) на модели глюкана.

Второй путь мо^ет быть основан на радиопротективном действии у- ИФ и ФИО. Одним из механизмов радиопротективного действия ФНО на систему гемопозза является ингибиция пролиферации кроветворных предшественников. Поскольку при облучении меньше всего повреждаются клетки, находящиеся в 5-фазе (фазе

- -

КОЕс

60

50

40

30

20

10

-1 час.

-24 час.

1 2 3 4 1 2 3 4

Рис.3. Влияние П-1 и П-2 на формирование экзогенных НОЕс.

По оси ординат - количество КОЕс

1 - контроль 1 (облученные доноры и реципиенты)

2 - П-1

3 - П-2

4 - контроль 2 (интактные доноры, облученные реципиенты)

синтеза белков), то ФНО, ингибируя пролиферации, тем самым увеличивает процент клеток в 5-фазе. Более высокая степень защиты показана при введении ФИО до облучения (С.И.Кривенко и соавт., 1991).

Предварительная обработка лейкоцитов человека у -ИФ в £1-фазе митотического цикла значительно снияает количество структурных мутаций хромосом в клетках, подвергнутых облучении в дозе 2 Гр, и стимулирует процесс репарации повреяден-ной ДНК (Т.Д.Засухина и соавт., 1982).

Таким образом, исследование полисахаридных препаратов, полученных из натурального корня и культуры ткани женьшеня показало, что эти препараты оказывают стимулирушщее воздействие на неспецифическуа резистентность, гуморальные и клеточные факторы иммунитета, индуцируют важные регуляторные ци-токины ИФ и ФИО. оказывавт влияние на кроветворение, усиливая процессы миграции и пролиферации.

Предполагается, что клетками-мишенями для этих препаратов являются макрофаги и Т-лимфоциты. Посредством активации этих клеток через продукцию у- ИФ'; ФИО и других цитокинов стимулируется процесс гемопоэза, а также происходит регуляция активности всех иммунокомпетентных клеток.

Оба препарата аналогичны по характеру действия, причем П-2 является более сильным индуктором гамма-ИФ в используемых дозах. Зто открывает возможность более полного использования ценного лекарственного сырья - иеньшеня. как натурального, так и культурального, а также перспективу изучения иммунобиологической активности отдельных полисахаридов, выделенных из женьшеня,

ВЫВОДЫ

1. Новые полисахаридсодеряащие препараты - панаксан-1 -и панаксан-2, выделенные из корня и культуры клеток женьшеня, обладают выраженной биологической активностью.

2. Профилактическое введение полисахаридных препаратов женьшеня повышает сопротивляемость организма животных к генерализованным бактериальным инфекциям и оказывает выракен-ное противовоспалительное действие в .отношении локализованной экспериментальной инфекции, способствуя коррекции нарушенной бактерицидной функции ПМЯЛ и макрофагов и снижая сте-

- 19 -

пень отечности гнойно-воспалительного очага на 70-80*.

3. Ведущим фактором в механизме действия П-1 и П-2 является активация клеток СМФ и Т-лимфоцитов и синтез этими клеточными элементами ^-ИФ и ФНО - регуляторных цитокинов, обладающих антибактериальными противовирусными и тумороцидными свойствами.

4. П-1 и П-2 оказывают стимулирующее влияние на гуморальный и клеточный иммунитет, повышая число АОК в селезенках мышей СБА и (CBftxC57BL/6 )Fi и увеличивая интенсивность реакции ГЗТ. индуцированной ЭБ.

5. П-1 и П-2 оказывают выраженное действие на кроветворение путем стимуляции процессов пролиферации и миграции СКИ.

6. Полисахаридные препараты, выделенные из корня и культуры клеток женьшеня, оказывают аналогичный эффект на иммунную систему, что открывает перспективы использования в практике наряду с природным женьшенем культуры клеток этого растения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Смолина Т.П.. Соловьева Т.Ф. Адьювантное действие по-лисахаридсодержащих фракций женьшеня //Иммуномодуляторы природного происхождения : Тез. докл. рабоч. совещ., Владивосток. 1990.- С.21-22.

2. Крылова Н.В., Беседнова H.H.. Соловьева Т.Ф. и др. Противовоспалительное действие полисахарида, полученного из культуры клеток женьшеня // Антибиотики и химиотерапия. -1990.- Т.35, N 4.- С.41-42.

3. Смолина Т.П. Иммуномодулирующее действие панаксанов // I съезд иммунологов России 23-25 июня 1992г.: Тез. докл.-Новосибирск.- С.448.

4. Орлова Т.Г., Смолина Т.П., Щегловитова О.Н. и др. Индуктор гамма-интерферона. - Авторское свидетельство Государственного комитета СССР по изобретениям и открытиям N 1748325, 1992.

5. Смолина Т.П., Орлова Т.Г., Цегловитова D.H. и др. Индуктор гамма-интерферона, - Авторское свидетвльетго Государственного комитета СССР по Изобретениям и открытиям N 1748326, 1992.

6. Smolina Т.P. Interferon inducting activity of polysac-

* - 20 -

charides isolated from ginseng root and tissue culture // The Intern. 'Symp. on clinical and radiosensitizing therapy of tumors, Vladivostok, Russia, Sep,19-28,- 1992.-P.91.