Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунорегуляторные белки и цитокины при беременности на фоне носительства антител к Chlamydia trachomatis

На правах рукописи

БОТВИНЬЕВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА

ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ И ЦИТОКИНЫ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ НА ФОНЕ НОСИТЕЛЬСТВА АНТИТЕЛ К CHLAMYDIA TRACHOMATIS

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005548714

2 L ИДЯ 2С14

Москва - 2014

005548714

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, главный научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории иммунологии

Зорина Вероника Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник ФГБУН «Институт биологии развития

им. Н.К. Кольцова» РАН Захарова Людмила Алексеевна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Николаева Марина Аркадьевна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «16» июня 2014 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 и на сайте www.rsmu.ru

Автореферат разослан «28» апреля 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Татьяна Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Особенности жизненного цикла Chlamydia trachomatis (способность длительно персистировать в неактивной форме, низкая иммуногенность и стертость клинических проявлений), вкупе с увеличением количества врожденных и функциональных иммунодефицитов и изменениями сексуального поведения в популяциях (Taylor B.D., et. al., 2011) привели к широкому распространению заболевания во всем мире. Диагностика хламидиоза при беременности затруднена, поскольку повышает риск выкидыша и не является достаточным критерием для прогноза состояния новорожденного - инфицированные женщины нередко рожают здорового ребенка. В то же время наличие антител класса G к Chlamydia trachomatis во время беременности, при отсутствии клинических признаков инфекции и отрицательных результатах ПЦР, не является показанием для проведения специфической терапии, однако нередко приводит к рождению ребенка с признаками внутриутробной инфекции. Более того, антитела к антигенам хламидии (в т.ч. гомологичные человеческому HPS-60 по данным Stephens A. J., et. al, 2011) могут оказать негативное влияние на плод и при отсутствии активного возбудителя. Поскольку при беременности адаптивный иммунитет подвержен супрессии, актуальным является изучение роли компонентов врожденного иммунитета в патогенетических процессах (Макаров О. В. и др., 2008), приводящих к рождению антителоносительницами детей с осложненным течением раннего неонатального периода. В их числе полифункциональные белковые компоненты врожденного иммунитета - лактоферрин (ЛФ) и альфа-2-макроглобулин (а2-МГ). Эти белки принимают активное участие в оплодотворении и развитии плода, задействованы в воспалительных и аутоиммунных реакциях, участвуют в распознавании и элиминации патогенов, оказывают модулирующее воздействие на синтез цитокинов, транспортируют ци-токины, металлы, гормоны и другие биологически активные вещества к клеткам-мишеням.

Цель исследования состояла в сравнительном изучении содержания иммунорегуляторных белков (а2-МГ, ЛФ), иммунокомплекса a2-Mr-IgG и некоторых цитокинов у беременных женщин, носительниц IgG антител к Chlamydia trachomatis, для уточнения их роли в иммунопатогенезе процессов, оказывающих негативное влияние на плод.

Задачи исследования:

1. Оценить содержание ЛФ и а2-МГ в сыворотке венозной и пуповин-ной крови, а также в околоплодных водах рожениц - носительниц IgG антител к Chlamydia trachomatis в зависимости от состояния новорожденного в раннем неонатальном периоде. Исследовать взаимодействие а2-МГ и ЛФ с антигенами Chlamydia trachomatis in vitro.

2. Изучить уровень иммунокомплекса a2-MT-IgG в сыворотке венозной и пуповинной крови, в околоплодных водах рожениц, а также наличие антител к HSP-60 к Chlamydia trachomatis в сыворотке крови во II триместре беременности у антителоносительниц.

3. Исследовать в сыворотке венозной и пуповинной крови, околоплодных водах рожениц - антителоносительниц (Ch. trachomatis) содержание цитокинов (TNF-a, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y IL-18, IL-1RA) в зависимости от состояния новорожденного.

4. Определить концентрации острофазовых белков - альбумина и СРБ в сыворотке венозной и пуповинной крови у рожениц - носительниц IgG антител к Chlamydia trachomatis, а также альбумина в околоплодных водах.

5. Провести коррелятивный анализ полученных результатов для уточнения роли ЛФ и а2-МГ в патогенезе процессов, оказывающих негативное влияние на плод. Определить их диагностическую и прогностическую значимость в оценке состояния новорожденного.

Научная новизна исследования

Впервые получены данные по сравнительному содержанию ЛФ, а2-МГ и иммунокомплексов a2-MT-IgG в сопоставлении с уровнями различных цитокинов, С-реактивного белка и альбумина в сыворотке венозной крови, пуповинной крови и в околоплодных водах женщин, имеющих антитела

класса G к Chlamydia trachomatis и к MOMP+pgp3 Ch. tr., позволяющие уточнить роль ЛФ и а2-МГ в иммунопатогенезе процессов, приводящих к рождению ребенка с признаками внутриутробного инфицирования и осложненным течением раннего неонатального периода.

Впервые установлено, что наличие признаков внутриутробного инфицирования у новорожденных ассоциировано с повышенными сывороточными концентрациями ЛФ и а2-МГ у рожениц - антителоносительниц. При этом оценка содержания ЛФ в крови во II триместре беременности не имеет диагностической либо прогностической ценности. Повышение уровней ЛФ и а2-МГ сопровождается статистически значимым увеличением сывороточных концентраций TNF-a, IL-6 и IL-8 и снижением альбумина в группе женщин, родивших детей с осложнениями в раннем неонаталыюм периоде.

Впервые обнаружено повышение сывороточных концентраций имму-нокомплексов a2-MT-IgG, в дополнение к появлению аутоантител к HSP-60 Ch. trachomatis, у трети беременных антителоносительниц.

Показано дозозависимое связывание ЛФ и а2-МГ с антигенами Chlamydia trachomatis в эксперименте in vitro.

Установлено, что повышение содержания ЛФ, IL-6, IL-8 и IL-10 в пу-повинной сыворотке при антителоносительстве не зависит от состояния новорожденного.

Помимо статистически значимого увеличения содержания TNF-a, IL-8 и IL-18 в околоплодных водах рожениц - носительниц IgG антител к Chlamydia trachomatis, родивших детей с признаками внутриутробного инфицирования, впервые выявлено значительное повышение концентраций а2-МГ, его иммунокомплекса с IgG и альбумина, а также снижение уровня ЛФ, что свидетельствует о нарушении проницаемости барьерных функций фетоплацентарного комплекса.

Активное участие а2-МГ и ЛФ в развитии локальных иммунопатогене-тических процессов подтверждается результатами корреляционного анализа, выявившего наибольшее количество значимых взаимосвязей между содержанием а2-МГ и ЛФ с цитокинами в околоплодных водах.

Практическая значимость работы

Выявленные изменения свидетельствуют об участии иммунорегуля-торных ЛФ и а2-МГ в процессах, приводящих к повреждению фетоплацен-тарного барьера и плода у женщин-носительниц антител к Chlamydia trachomatis: локальный дефицит ЛФ, заброс а2-МГ в околоплодные воды с локальным повышением количества иммунокомплексов a2-Mr-IgG, а также гиперсинтез ЛФ и накопление а2-МГ в сыворотке крови беременной способны не только оказать прямое негативное влияние на плод, но и влиять на синтез цитокинов. Полученные данные могут быть использованы в качестве лекционного материала для студентов биологических и медицинских вузов.

Определение повышенных концентраций а2-МГ, ЛФ и сниженных концентраций альбумина в венозной крови беременных носительниц антител к Chlamydia trachomatis в III триместре, а также высоких уровней а2-МГ, альбумина и сниженного содержания ЛФ в околоплодных водах (в родах) может быть использовано в прогнозе состояния новорожденного в ражем неонатальном периоде.

Положения, выносимые на защиту:

1. В сыворотке венозной крови рожениц, имеющих антитела к Chlamydia trachomatis и родивших детей с клиническими признаками внутриутробного инфицирования, статистически значимо повышены уровни лакто-феррина и альфа-2-макроглобулина, а также С-реактивного белка, цитокинов TNF-a, IL-6, IL-8 и снижено содержание альбумина, что свидетельствует о наличии воспалительных процессов с аутоиммунными проявлениями в III триместре, при отсутствии клинических проявлений заболевания, и может быть использовано для прогнозирования состояния новорожденного. При этом определение содержания ЛФ во П триместре не имеет диагностической либо прогностической значимости. Повышенные уровни иммунокомплексов a2-MT-IgG и наличие IgG антител к HSP-60 Chlamydia trachomatis обнаруживаются в крови у трети антителоносительниц. Экспериментально (in vitro) установлено дозозависимое взаимодействие высокоочшценных препаратов а2-МГ и лактоферрина с антигенами Chlamydia trachomatis.

2. В сыворотке пуповинной крови рожениц с антителами к Ch. trachomatis статистически значимо увеличены концентрации ЛФ, IL-6, IL-10, вне зависимости от состояния ребенка в раннем неонатальном периоде. При этом со-

держание а2-МГ, его иммунокомплексов с IgG и острофазового альбумина при антителоносительстве не отличается от контроля.

3. В околоплодных водах женщин, имеющих антитела к Chlamydia trachomatis и родивших детей с признаками внутриутробного инфицирования, значительно увеличено содержание а2-МГ и альбумина, что свидетельствует о нарушении проницаемости фетоплацентарного барьера, а также статистически значимо увеличены концентрации TNF-a, IL-8, IL-18 и им-мунокомплекса a2-Mr-IgG на фоне снижения уровней IFN-y и ЛФ, что способствует развитию локальных воспалительных и аутоиммунных процессов, негативно влияющих на плод. Данные изменения цитокинового профиля взаимосвязаны и зависят от изменений локальных уровней иммунорегу-ляторных а2-МГ и ЛФ - наибольшее количество значимых коррелятивных взаимосвязей между содержанием этих белков и других изученных показателей было выявлено в околоплодных водах, что подтверждает участие а2-МГ и ЛФ в развитии процессов, приводящих к рождению ребенка с осложнениями в раннем неонатальном периоде.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследования и вытекающие из них практические рекомендации внедрены в лечебную практику МБЛПУ «Зональный перинатальный центр» и МБЛПУ «Клинический родильный дом №3» г. Новокузнецка, а также в учебный процесс кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ДПО «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения Российской Федерации (далее ГБОУ ДПО НГИУВ)

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XVII международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабили-тации, (Нью-Йорк, США, 2012); Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013).

Диссертационная работа обсуждена на межкафедралыюм заседании апробационной комиссии ГБОУ ДПО НГИУВ 21.01.2014г., протокол №1.

Публикации: по теме диссертации получены 2 патента РФ и опубликовано 8 печатных работ, из них 5 в рецензируемых журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, самостоятельных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 25 таблицами и 13 рисунками. Список цитируемой литературы включает 115 источников, в т.ч. 81 зарубежного автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дизайн исследования представлен на рисунке 1. Для решения поставленных задач обследовано 197 беременных женщин, поступивших в структурные подразделения МБЛПУ «Зональный перинатальный центр» г. Новокузнецка: консультативную поликлинику Центра планирования семьи и репродукции и клинический родильный дом. В исследовании не принимали участие женщины, имеющие тяжелые хронические или острые заболевания. Пациентки подписали информированное согласие на участие в программе исследования.

Контрольная группа - 60 беременных, в том числе 23 практически здоровых женщин (27,3±4,6 лет), в сроке гестации 13-24 недели и 37 практически здоровых женщин (28,0±5,2 лет) в гестационном сроке 38-40 недель. Критерии включения: 1) отсутствие антител к Ch. trachomatis; 2) неос-ложненное течение беременности; 3) отсутствие отклонений в развитии плода; 4) благоприятный исход родов (оценка плода по шкале Апгар 7-9 балов, физиологическое течение раннего неонатального периода); 5) отсутствие осложнений в послеродовом периоде.

Основная группа — 137 беременных носительниц антител класса G к Chlamydia trachomatis без клинических проявлений заболевания (27,7±5,8 лет). Из них 55 женщин в гестационных сроках 13-24 недель и 82 роженицы в сроках 38-40 недель. Критерии включения: 1) наличие IgG антител к Chi. Тг в титре 1:10-1:40; 2) наличие IgG антител к MOMP+pgp3 Chi. tr; 3) отсутствие ДНК Chi. tr. в клетках эпителия с соскоба шейки матки; 4) отсутствие клинических признаков хламидийной инфекции; 5) естественные роды в сроке гестации 38-40 недель. По данным ретроспективного анализа роже-

ницы основной группы были разделены на 2 подгруппы: 1-я подгруппа (п=46) - родившие здорового ребенка и 2-я подгруппа (п=36) - родившие ребенка, имеющего осложнения в раннем неонатальном периоде. Критерии включения для 2-ой подгруппы: 1) наличие осложнений в раннем неонатальном периоде (клинические проявления внутриутробного инфицирования — задержка внутриутробного развития, лихорадка, лейкоцитоз и/или сдвиг лейкоцитарной формулы влево, гепатоспленомегалия, дыхательные расстройства, срыгивание), 2) морфологические признаки повреждения плаценты инфекционного генеза (восходящая инфекция I степени, гной-ный/серозно-гнойный хорионамнионит).

Рисунок I. Дизайн исследования.

У женщин во II триместре беременности были взяты образны сыворотки крови. От рожениц, участвовавших в исследовании, получены образцы венозной сыворотки крови (ВС), пуповинной сыворотки (ПС) и околоплодных вод (OB) в родах.

Для определения концентраций альфа-2-макроглобулина (а2-МГ) в ВС и ПС использовали метод количественного горизонтального низковольтного ракетно-линейного иммуноэлектрофореза в пластинах агарозного геля (.Зорин H.A., 1983).

Определение уровней цитокинов, ЛФ, СРБ, а также антител класса IgG к Chlamydia trachomatis, IgG к MOMP+pgp3 Chlamydia trachomatis, IgG к HSP 60 Chlamydia trachomatis в ВС, ПС и OB проводилось методом ИФА с использованием коммерческих наборов (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) и инструкций к ним.

Для оценки содержания иммунных комплексов (a2-MT-IgG) в ВС, ПС и OB, а также а2-МГ в OB применяли исследовательские тест-системы, сконструированные на базе НИЛ иммунологии ГБОУ ДПО НГИУВ (патент РФ №2209435).

Уровни альбумина определяли колориметрическим методом с использованием реагента «бромкрезоловый зеленый» с помощью коммерческих тест-систем («Spinreact», Испания).

Статистическая обработка результатов проводилась при помощи сертифицированной PC программы для биостатистики InStat 2.0 (Graph Pad, США). Для обработки полученных данных применялась тесты Ordinary Anova и корреляционный анализ. Проверка нормальности распределения признаков проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Критическое значение уровня значимости (р) - 0,05. Параметры, приводимые в работе: М - среднее, ±т — ошибка средней, п — объем анализируемой выборки, г - коэффициент корреляции.

Результаты исследования и их обсуждение

Считается общепринятым, что осложнения хламидийной инфекции при беременности в значительной степени обусловлены локальной активацией синтеза цитокинов, часто приводящей к воспалению и преждевременным родам (Макаров О. В. и др., 2008). Однако для реализации ряда эффектов цито-кины должны быть доставлены к клеткам-мишеням в комплексе с регулятор-но-транспортным белком семейства макроглобулинов (Birkenmeier G., 2001). Кроме того, на синтез цитокинов активно влияет лактоферрин, обладающий выраженными антибактериальными свойствами (Le grand D., et al., 2005). В рамках данного исследования мы изучили содержание а2-МГ, иммуноком-плекса a2-MT-IgG и ЛФ в сравнении с уровнями ряда про-, противовоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов, а также с уровнями «классических» реактантов воспаления (СРБ и альбумина) для уточнения их роли в иммунопатогенезе процессов, оказывающих негативное влияние на плод при носительстве антител к Ch. trachomatis.

Согласно полученным данным (рис. 2), а2-МГ накапливался в венозной сыворотке крови (ВС) женщин, родивших детей с признаками внутриутробного инфицирования (ПВИ) - р~0,0279. Однако его содержание в пуповин-ной сыворотке (ПС) практически не различалось с контролем у антителоно-сительниц и не зависело от состояния новорожденного.

При рождении детей с признаками внутриутробного инфицирования содержание а2-МГ в ВС и IIC было сопоставимым, а в контроле и при рождении здорового ребенка на фоне антителоносительства - несколько ниже в ВС по сравнению с ПС.

Известно, что при хроническом воспалении происходит обеднение ПУЛа а2-МГ, однако при аутоиммунных процессах его молекулы начинают накапливаться в циркуляции. Это связано с продолжительным повреждением (окислением) молекул а2-МГ продуктами воспалительной реакции, сопровождающимся нарушением структуры молекулы и снижением ее сродства к рецепторам (IVu S.M. et. al., 1998, Chiabrando, G.A.,2002). Можно предположить, что процессы, происходящие при беременности на фоне антителоносительства, и, возможно, врожденные дефекты синтеза а2-МГ при-

водят к его активному повреждению (5/г'е/ Т. !¥.„ еЛ а1, 2000), и подобные молекулы, отличающиеся иммуногенностью, а также с частичным сохранением литической активности связываемых протеиназ (Ко/осЫе/ 5./., е1. а1, 1998), высвобождающихся при воспалении, накапливаются в циркуляции.

а2-МГ

ЛФ

2,99 ^ 2,95

ШВС

□ ПС

IBC

И ПС

Рисунок 2. Уровни а2-МГ (г/л) и ЛФ (мг/л) в венозной и пуповинной сыворотке у здоровых рожениц и носительниц антител к Ch. trachomatis. Пятиконечная звезда - статистически значимое отличие (р<0,05) от контроля, четырехконечная звезда — значимое различие между группами ан-тителоносителъниц.

Не менее интересные, особенно с точки зрения практического применения, данные были обнаружены при изучении содержания лактоферрина (ЛФ) в сыворотке крови рожениц. Установлено, что у антителоносительниц его уровни повышаются, достоверно отличаясь от контроля (р=0,0063, при рождении здорового ребенка, и р<0,0001, при ПВИ). При этом наиболее выраженное повышение зафиксировано именно при признаках внутриутробного инфицирования у новорожденого (р=0,0003, при сравнении с антите-

лоносителышцами, родившими здорового ребенка). Содержание ЛФ в пу-повинной сыворотке также было повышено у беременных с антителами (р=0,0010 - при рождении ребенка с клиническими признаками инфицирования и р=0,0131 - при рождении здорового), однако не зависело от состояния новорожденного в раннем неонатальном периоде. Известно, что данный белок является высокочувствительным реактантом воспаления и модулятором синтеза цитокинов (Legrand D., et al., 2005). Можно предположить, что выявленное повышение его уровней в крови у беременных с антителами активирует воспалительные процессы, не проявляющиеся клинически, но оказывающие негативное воздействие на плод.

Высокая диагностическая ценность определения ЛФ в ВС беременных с антихламидийными антителами на поздних сроках для прогноза состояния новорожденного (наличие либо отсутствие признаков внутриутробного инфицирования) не повторяется при изучении уровней ЛФ во втором триместре в крови беременных с IgG антителами к Ch.trachomatis - его содержание было повышено вне зависимости от состояния новорожденного (1,9±0,3 мг/л, р=0,0001 при сравнении с нормой, 0,7±0,1 мг/л).

Поскольку ранее мы высказали предположение об активации аутоиммунных процессов у беременных - антителоносителышц, а также, учитывая сообщения других авторов, описывающих увеличение концентраций антител к HSP-60, имеющему гомологичные антигенные детерминанты у хламидии и человека (Gammazza AM., et. al., 2012, Stephens A. J., et. al., 2011) в качестве причины нарушения фертильности у инфицированных, мы определили содержание иммунокомплексов a2-MT-IgG в ВС и ПС антителоносителышц в зависимости от состояния новорожденного. Мы не проводили отделение специфических аутоантител от противоуглеводных, однако, согласно исследованиям по содержанию данных иммунокомплексов при эклампсии, имеющей более выраженный аутоиммунный компонент (Зорина В.Н., 2001), содержание противоуглеводных антител класса G к а2-МГ при физиологически и патологически протекающей беременности не превышает 20% от общего ПУЛа.

Относительно небольшое количество обследованных не позволило нам выявить статистически значимых отличий от контрольной группы, однако очевидно, что у беременных с антителами наблюдается явная тенденция к

накоплению подобных иммунокомплексов в циркуляции, особенно при рождении ребенка, имеющего признаки внутриутробного инфицирования (рис. 3).

Повышенное содержание иммунокомплексов выявлялось у 33% анти-телоносительниц, родивших здорового ребенка, и у 38% женщин, родивших ребенка с ПВИ (7% в контроле). Обращает на себя внимание то, что имму-нокомплексы а2-МГ-ТвО обнаруживаются и в ПС, однако в меньшем количестве, чем в ВС.

шве апс

Рисунок 3. Уровень иммунокомплексов a2-MT-IgG (мг/л) в сыворотке венозной и пуповинной крови у здоровых рожениц (38-40 недель) и у носительниц антител к Ch. trachomatis.

При этом во II триместре IgG антитела к HSP-60 Ch.trachomatis выявлялись тоже в среднем у 29% ангителоносительниц.

Таким образом, при наличии антител к Ch. trachomatis в циркуляции, даже в небольших титрах и без клинических проявлений заболевания, происходит активация аутоиммунных процессов, по крайней мере, у трети инфицированных беременных. Подобные процессы способствуют повреждению тканей и оказывают негативное влияние на развитие плода.

Помимо уровней а2-МГ и ЛФ в сыворотке, мы изучили возможность связывания данных белков с антигенами Chlamydia trachomatis в эксперименте in vitro. Было установлено дозозависимое связывание с овердозами высокоочи-щенных препаратов данных белков методом иммуноферментного анализа.

Предполагая, что повышение уровней ЛФ связано с воспалительными процессами, мы исследовали содержание классических острофазовых белков — альбумина и СРБ в венозной и пуповинной сыворотке рожениц. Согласно результатам, уровни СРБ в ВС были повышены у антителоносительниц вне зависимости от состояния новорожденного (135±31мг/л, р=0,0136 при рождении здорового ребенка; 135±34мг/л, р=0,0245, при ПВИ у новорожденного; 25±5мг/л в норме), а в ПС соответствовали показателям контрольной группы. Содержание альбумина, напротив, достоверно снижалось при ПВИ у новорожденного (38,7±1г/л при ПВИ р=0,0163; 40,8±1г/л без ПВИ и 41,5±0,7г/л в норме). Выявленные изменения подтверждают наличие проявлений хронической воспалительной реакции у антителоносительниц, более выраженных при рождении ребенка с признаками внутриутробного инфицирования.

Изучив содержимое вышеперечисленных белков и иммунокомплексов в сыворотке крови, мы сочли необходимым изучить их концентрации непосредственно в «зоне локализации процессов», а именно в околоплодных водах (табл. 1).

Установлено, что, в отличие от ВС и ПС, содержание ЛФ в околоплодных водах антителоносительниц было значительно ниже, чем в контрольной группе, особенно при рождении ребенка с признаками внутриутробного инфицирования. Поскольку значительная часть данного белка синтезируется локально (в т.ч. в составе секретов влагалища) и обладает выраженными антибактериальными и противовирусными свойствами (Legrand D., et al., 2005), очевидно, что его дефицит как способствует инфицированию женщины, так и повышает риск инфицирования плода (в т.ч. в родах), особенно при повреждении плаценты продуктами воспаления и аутоантителами.

Содержание а2-МГ в ОВ, напротив, было значительно выше при рождении ребенка с признаками внутриутробного инфицирования как при сравнении с нормой, так и с антителоносительницами, родившими здорового ребенка. Поскольку данный белок синтезируется преимущественно печенью, по-

добное повышение, прежде всего, свидетельствует о серьезном нарушении функций фетоплацентарного барьера, приводящем к «забросу» а2-МГ из крови в околоплодные воды.

Таблица 1

Уровни белков и иммунокомплексов в околоплодных водах рожениц с 1§С к СЬ. йасИота^ в зависимости от состояния новорожденного

Показатель Контроль (п=49) Роженицы с 1™С АТ к СМатусНа ^асИотаНз

Здоровые новорожденные (п=53) Новорожденные сПВИ (п=39)

Лактоферрин (мг/л) М±т 7,65±0,54 6,12±0,34 5,60±0,42

Р= р 1=0,0159 р1=0,0091

альфа-2- макроглобулин (г/л) М±т 0,038±0,012 0,043±0,013 0,120± 0,024

Р= р1 =0,0018 р2=0,0035

а2МГ-ТЯ(; (мг/л) М±т 0,73±0,13 0,86±0,11 1,94±0,49

Р= р1=0,0065 р2 0,0289

Альбумин (г/л) М±т 2,24±0,27 1,88±0,11 31,34±6,53

Р= р1=0,0001 р2=0,0001

Примечание: р1 - статистическая достоверность отличий показателей от контрольной группы; р2 - статистическая достоверность различий между подгруппами антителоносительнт

Подтверждение данного предположения обнаруживается при изучении уровней альбумина в ОВ. Его содержание значительно повышено при рождении ребенка с признаками инфицирования, и вполне очевидно, это взаимосвязано с эксудативными процессами при вышеупомянутом нарушении проницаемости фетоплацентарного комплекса.

Уровни иммунокомплексов а2-МГ-1§0 также достоверно повышены в ОВ антителоносительниц при рождении ребенка, имеющего осложнения в раннем неонатальном периоде. Безусловно, значительная часть этих комплексов также может поступать из крови. Однако сам факт их избытка в ОВ,

вне зависимости от источника а2-МГ, может нанести серьезный вред целостности плаценты: поврежденный а2-МГ медленно утилизируется, может, как упоминалось выше, повреждать ткани связанными протеиназами, способствовать синтезу антител на транспортируемые лиганды (Зорина В.Н., Зорин Н.А., 2013), а также обладает видоизмененным сродством к рецепторам и цитокинам (Wu S.M. et. al„ 1998 Chiabrando, G.A.,2002), нарушающим регуляцию их синтеза.

Поскольку и а2-МГ, и ЛФ способны оказывать иммуномодулирующее воздействие на синтез цитокинов, мы изучили содержание провоспалитель-ных TNF-a и IL-8, иммунорегуляторных IL-6 и IFN-y, противовоспалительного IL-10, а также IL-18 и IL-1RA в сыворотке крови, пуповинной сыворотке и околоплодных водах рожениц в норме и при носительстве IgG антител к Chlamydia trachomatis без клинических проявлений заболевания, в зависимости от состояния новорожденного (табл. 2). Согласно полученным данным, уровни всех изученных цитокинов отличаются крайне высокой индивидуальной вариабельностью, что не позволяет их использовать в диагностических либо прогностических целях. Тем не менее, в сыворотке крови рожениц-антителоносительниц при рождении детей с признаками инфицирования отмечено статистически значимое повышение концентраций про-воспалительных TNF-a, IL-8 и IL-6.

В пуповинной сыворотке содержание цитокинов в целом не зависело от состояния новорожденного: статистически значимо были повышены IL-6 и IL-10, а содержание IL-8 в группе рожениц с антителами, родивших здорового ребенка, было выше, чем при рождении больных.

Необходимо отметить, что концентрации большинства изученных цитокинов заметно выше в ОВ по сравнению с ВС и ПС. Отмечено достоверное повышение содержания провоспалительных TNF-a, IL-8, а также IL-18 на фоне снижения иммунорегуляторного IFN-y в околоплодных водах беременных с антителами к Chlamydia trachomatis, родивших детей с признаками внутриутробного инфицирования, что свидетельствует о наличии локального воспаления и сопутствующих ему деструктивных процессах.

Таблица 2

Уровни цитокинов в сыворотке венозной и пуповинной крови, околоплодных водах у рожениц, имеющих антитела к СЬ. ^сИотайв

Цптокины, пкг/мл я ш ¿3 с. ю О Контрольная группа Роженицы с АТ к СЫатусНа 1гасЬота(и

Здоровые новорожденные Новорожденные сПВИ

'ШР-а ВС 1,7±0,7 6,7±2,0 9,6±2,8 Р1 =0,0163

ПС 2,3±1,0 9,7±2,2 10,3±3,3

ов 16,2±5,1 16,1±5,5 39,7±9,2 р1 =0,0278 р2=0,0318

ГЬ-6 ВС 518,6±160,0 579,7±141,4 1649,8±423,2 р! =0,0293 р2=0,0067

ПС 161,4±43,0 759,0±191,8 р1 =0,0121 880,0±233,2 р] =0,005

ОВ 10801,0±2883,0 5794,0±1956,5 14820,0±5206,0 р2=0,0542т

1Ь-8 ВС 3227,2±752,5 4676,4±1028,7 6901,9±1312,2 р1 =0,0225

ПС 1918,9±437,0 6306,6±1211,2 р1=0,0099 4803,0± 1486,3

ов 10967,0±2232,0 14530,0±2806,8 26325,0±4330,6 р!=0,0033 р2=0,0324

1Ь-10 ВС 11,0±2,3 21,0±4,8 26,2±6,7

ПС 5,7±1,3 14,8±2,4 р1=0,011б 13,7±2,7 р1 =0,0142

ов 40,5±8,3 34,0±4,7 32,2±8,9

ШЧ-у ВС 1,8±0,7 2,3±0,6 1,5±0,5

ПС 2,7±0,8 6,1±1,3 4,8±1,1

ОВ 11,2±2,4 9,2±2,3 4,2±1,0 р1=0,0421

ГЬ-18 ВС 268,9±36,3 264,7±20,8 285,1±25,5

ПС 98,1±10,1 109,7±9,3 112,4±13,7

ОВ 54,3±8,7 65,9±19,5 140,0±28,2 р1 =0,0043 р2=0.0564т

1Ь-1ЯА ВС 1356,4±245,2 1930,0±336,4 975,3±220,1

ПС 1462,6±227,7 2798,5±572,4 р1 =0,0575 т 2388,2±1029,2

ОВ 12504,0±782,4 12583,0±816,0 10814,0±1682,9

Примечание: р1 - статистическая достоверность отличий от показателей в контроле; р2 - статистическая достоверность различий между показателями подгрупп антителоносительниц; т - недостаточно значимая статистически тенденция к изменению показателя.

Далее мы изучили коррелятивные взаимосвязи уровней иммунорегуля-торных а2-МГ и ЛФ с концентрациями других изученных показателей в норме и при носительстве антител к Chlamydia trachomatis при рождении детей с признаками внутриутробного инфицирования.

Установлено, что содержание а2-МГ в венозной сыворотке контрольной группы статистически значимо (р<0,0500) взаимосвязано с концентрациями ЛФ (г= - 0,4245) и альбумина (г= 0,43626), в то время как при ПВИ - с содержанием СРБ (г= - 0,7411), TNF-a (г= 0,5687), IL-6 (г= 0,4729), IL-8 (г- 0,4834).

Содержание ЛФ в ВС в норме достоверно коррелировало с альбумином (г= 0,4865), СРБ (г= - 0,8305), a2-MT-IgG (г= 0,7426), IL-8 (г= 0,5408), а при ПВИ - с альбумином (г= 0,5525), IL-6 (г= 0,5161), IL-18 (г= 0,9329), IFN-y (г=-0,6617).

В пуповинной сыворотке уровни а2-МГ были взаимосвязаны с IL-6 (г= - 0,6617), IL-18 (г= 0,5900) в норме и с ЛФ (г= - 0,3938), альбумина (г= 0,6146), IL-8 (г= 0,4727), IFN-y (г= - 0,5336) при ПВИ.

Уровни ЛФ в ПС зависели от содержания IL-10 (г= - 0,7186), IFN-y (г= 0,6362) в норме и от TNF-a (г= 0,7372), IL-6 (г= 0,7533), IL-10 (г= - 0,4928), IFN-y (г= 0,5642) и СРБ (г= 0,7391) при ПВИ.

В околоплодных водах концентрации а2-МГ в контрольной группе достоверно коррелировали с содержанием ЛФ (г= 0,4686), альбумина (г= 0,6293), иммунокомплексов a2-MT-IgG (r=0,7054), 1L-10 (г=0,6116), IFN-y (г=- 0,5971), IL-18 (г= 0,7570), а при ПВИ у новорожденного на фоне антителоноси-тельства совершенно по-другому с ЛФ (г= - 0,6607), а также с альбумином (г= 0,8749), a2-MT-IgG (г= 0,8632), IL-6 (г= - 0,8819), IL-18 (г= - 0,9174), IFN-у (г= - 0,7841), IL-1RA (г= - 0,7275).

Содержание ЛФ в OB было взаимосвязано с альбумином (г=0,4146), TNF-a (г=0,6200), IL-6 (r=0,7581), IL-8 (r=0,8398), IL-10 (r=0,6185), IL-18 (г=0,7418) в контрольной группе, а также с альбумином (г= - 0,5301), а2-МГ-IgG (г= 0,8286), TNF-a (г= 0,8213) и IL-1RA (г= 0,9530) при ПВИ у новорожденного.

Не вдаваясь в особенности и взаимосвязи синтеза изученных показателей, очевидно, что в норме и при развитии ПВИ на фоне носительства антител к Chlamydia trachomatis они значительно различаются. Выявление наи-

большего количества взаимосвязей содержания а2-МГ и ЛФ в околоплодных водах свидетельствует об их активном участии в процессах, приводящих к повреждению окружающих тканей.

Обобщая вышеизложенное, можно предположить, что у части беременных женщин, имеющих антитела к Chlamydia trachomatis, существует определенная предрасположенность к внутриутробному инфицированию плода. Даная группа женщин отличается врожденными либо хроническими функциональными дефектами синтеза белковых компонентов врожденного иммунитета - лактоферрина и альфа-2-макроглобулина. Подобные дефекты (локальный дефицит секреторного ЛФ, более активное повреждение молекул а2-МГ, их системное накопление и активация синтеза аутоантител) приводят к неадекватному развитию воспалительной реакции, гиперактивации синтеза провоспалительных цитокинов, повреждению тканей протеиназами и аутоантителами, в т.ч. в комплексе с а2-МГ и белками теплового шока, и, как следствие, к нарушению целостности фетоплацентарного комплекса при беременности. Последующее поступление в околоплодные воды из венозной крови а2-МГ вносит еще больший дисбаланс в регуляцию синтеза цитокинов и косвенно способствует усилению деструктивных процессов. Эти патологические явления, судя по всему, постепенно прогрессируют, достигая значительных изменений в белковом составе и цитокиновом профиле биожидкостей только на поздних сроках беременности. Все вышеперечисленное не только повышает риск инфицирования плода как внутриутробно, так и в родах, но и влияет на его развитие, приводя к рождению детей с признаками воспаления.

ВЫВОДЫ:

1. В крови рожениц, имеющих антитела к Chlamydia trachomatis и родивших детей с признаками внутриутробного инфицирования, статистически значимо повышены уровни а2-МГ, СРБ, TNF-a, IL-6, IL-8 и снижено содержание альбумина, что свидетельствует о наличии воспалительных процессов с аутоиммунными проявлениями в III триместре. Повышенные уровни иммунокомплексов a2-MT-IgG и наличие IgG антител к HSP-60 Chlamydia trachomatis обнаруживаются в крови у трети антителоноситель-ниц вне зависимости от состояния новорожденного.

2. Повышенный уровень ЛФ в сыворотке рожениц с антителами к Chlamydia trachomatis (в 1,5 и более раз) имеет прогностическую значимость в оценке состояния новорожденного в раннем неонатальном периоде. Определение сывороточной концентрации ЛФ во втором триместре беременности не информативно.

3. Высокоочищенные препараты а2-МГ и ЛФ дозозависимо связываются с антигенами Chlamydia trachomatis in vitro, что подтверждает их антибактериальную активность.

4. В пуповинной сыворотке рожениц - носительниц IgG антител к Chlamydia trachomatis значимо повышены уровни ЛФ, а также IL-6, IL-10, вне зависимости от состояния новорожденного в раннем неонатальном периоде.

5. При иосительстве антител к Chlamydia trachomatis и рождении детей с признаками внутриутробного инфицирования в околоплодных водах повышено в 3 раза содержание а2-МГ, в 14 раз — альбумина, в 2,5 раза - а2-МГ-IgG, TNF-a, IL-8, IL-18 и на 30% снижены уровни ЛФ и IFN-y, что свидетельствует об увеличении проницаемости фетоплацентарного барьера и нарушениях локального синтеза компонентов врожденного иммунитета.

6. Проведенный ретроспективно-коррелятивный анализ полученных данных позволил обнаружить ряд зависимостей между концентрациями а2-МГ, а также ЛФ и некоторых цитокинов в зависимости от состояния новорожденного, особенно выраженных в околоплодных водах, что подтверждает участие данных иммуномодуляторных белков в развитии осложнений раннего неонатального периода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

Полученные данные по участию иммунорегуляторных ЛФ и а2-МГ в процессах, приводящих к повреждению фетоплацентарного барьера и плода у носительниц антител к Chlamydia trachomatis, могут быть использованы в качестве лекционного материала для студентов биологических и медицинских вузов.

Разработанные способы прогнозирования состояния плода при беременности, осложненной многоводием и наличием в крови антител класса G к Chlamydia trachomatis, без клинических проявлений (Патент №2431844 зарегистрирован 20.10.2011г.; Патент №2461006 зарегистрирован 10.09.2012г), включающие определение уровней ЛФ в ВС, а также альбумина и а2-МГ в OB, позволяющие прогнозировать состояние новорожденного (появление клинических признаков инфицирования в раннем неонатальном периоде), могут быть использованы в клинической практике.

Определение сниженных уровней ЛФ в OB свидетельствует о повышенном риске инфицирования плода.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

AT а2-МГ

- антитела

- альфа-2-макроглобулин

- высшая аттестационная комиссия

- венозная сыворотка

- иммуноферменгный анализ

- лактоферрин

- околоплодные воды

- признаки внутриутробного инфицирования

- пуповинная сыворотка

- С-реактивный белок

- Chlamydia trachomatis

- белок теплового шока

- интерферон - гамма

- иммуноглобулины класса G

- интерлейкины

- фактор некроза опухолей - альфа

ВАК

ВС

ИФА

ЛФ

OB

ПВИ

ПС

СРБ

Ch. trachomatis

HSP

EFN-y

IgG IL

TNF-a

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ботвиньева И.А. Прогностическое значение определения уровня лактоферрина в крови беременных женщин-носительниц антител класса G к Chlamydia trachomatis, как маркера внутриутробной инфекции у плода / Ботвиньева И. А., Ренте JI.B., Баженова Л.Г., Зорина P.M., Зорина В.Н. // Материалы IV Всероссийской конференции «Иммунология и репродукция», Пермь, 5-8 декабря 2010г; Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т. 4 (13), №4. - С.21-23.

2. Ботвиньева И.А. Способ прогнозирования состояния плода при беременности, осложненной многоводием и наличием в крови антител класса G к Chlamydia trachomatis / Зорина В.Н., Ренте Л.В., Ботвиньева И.А, Калинина С.Ф., Баженова Л.Г., Зорина P.M. // Патент № 2431844, зарегистрирован 20.10.2011т.

3. Ботвиньева И.А. Лактоферрин в пренатальной диагностике внутриутробного инфицирования плода у беременных с многоводием и наличием сывороточных G-антител к Chlamydia trachomatis / Баженова Л.Г., Ренте Л.В., Зорина P.M., Ботвиньева И.А. Полукаров А.Н., Зорина В.Н. // Российский вестник акушера-гинеколога. -2011-Т.11,№6.-С.11-13.

4. Ботвиньева И.А. Критерии диагностики хламидийной инфекции у беременных и риска инфицирования плода / Ренте Л.В., Ботвиньева И.А., Полукаров А.Н., Баженова Л.Г., Зорина В.Н. // Материалы XVII международного конгресса по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Нью-Йорк, США, 21-24 апреля 2012; Аллергология и иммунология. - 2012. -Т.13, №1. - С.52-53.

5. Ботвиньева И.А. Белки острой фазы воспаления в прогнозе состояния новорожденного при беременности, осложненной многоводием, и при риске внутриутробной инфекции / Ботвиньева И.А., Реете Л.В., Зорина P.M., Баженова Л.Г., Зорина В.Н. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012, №6 - С.22-25.

6. Ботвиньева И.А. Способ скринингового обследования женщин для пренатальной диагностики врожденных аномалий и внутриутробного инфицирования плода / Ренте Л.В., Ботвиньева И.А., Зорина В.Н., Полукаров А.Н., Баженова Л.Г. // Патент № 2461006, зарегистрирован 10.09.2012 г.

7. Ботвиньева И. А. Полифункциональные белки-иммуномодуляторы в диагностике внутриутробной инфекции / Зорина В.Н., Ботвиньева И.А., Зорина P.M., Ренте Л.В., Зорин Н.А. // Тезисы объединенного иммунологического форума, Нижний Новгород 30 июня - 5 июля 2013г; Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т.7(16), Xa3.-C.275.

8. Ботвиньева И.А. Уровни цитокинов в венозной и пуповинной крови у женщин с признаками внутриутробной инфекции / Ботвиньева И.А., Ренте Л.В., Зорина В.Н., Зорина P.M., Полукаров А.Н., Баженова Л.Г. // Медицинская иммунология, - 2013. -Т. 15, №3. - С.277-282.

9. Ботвиньева И.А. Полифункциональные белки-иммуномодуляторы и цитоки-ны у беременных женщин при антителоносительстве к Chlamydia trachomatis / Зорина В.Н., Ботвиньева И.А., Ренте Л.В., Зорина P.M., Чирикова Т.С., Зорин Н.А. // Иммунология. - 2013. - Т.34, №6. - С.323-326.

10. Ботвиньева И.А. Уровень лакроферрина в крови беременных при носитель-стве G-антител к Chlamydia trachomatis как маркер антенатального скрининга инфекции новорожденного / Ренге Л.В., Ботвиньева И.А., Зорина P.M., Баженова Л.Г., Зорина В.Н. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2014. - Т.13,

№1.-С.41-45.

Подписано в печать 15.04.2014 г. Гарнитура Тайме. Бумага ксероксная. Печать на ризографе 112-300 ЕР. Тираж 100. Заказ №1898

Отпечатано в типографии ГБОУ ДПО «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения РФ. 654005, г. Новокузнецк, пр. Строителей, 5.