Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунопатогенез и иммунологические критерии прогрессирования хронического вирусного гепатита С

На правах рукописи

НИКИТИН Владимир Юрьевич

ИММУНОПАТОГЕНЕЗ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.46 — клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени дои opa медицинских наук

Санкт-Петербург - 2007

Работа выполнена в Военно-медицинской академии им. С М Кирова

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор доктор медицинских наук

ЦЫГ АН Василий Николаевич МИТИН Юрий Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор доктор медицинских наук профессор доктор медицинских наук профессор

ВАСИЛЬЕВ Андрей Глебович МОСКАЛЕВ Александр Витальевич ЯКОВЛЕВ Алексей Авенирович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится « '» марта 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 215 002 08 при Военно-медицинской академии имени СМ Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул Академика Лебедева, б)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им С М Кирова

Автореферат разослан декабря 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор ПАСТУШЕНКОВ Владимир Леонидович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования По данным ВОЗ в настоящее время в мире насчитывается более 170 млн больных хроническим вирусным гепатитом С, а количество инфицированных HCV (вирус гепатита С) достигает 500 млн человек [Радченко В Г и соавт, 2004, Lauer GM et al, 2001] Вирусный гепатит С занимает лидирующее место среди гепатотропных инфекций в развитых странах, где инфицировано 1-2% населения [Alter Н J et al, 2000, Afdhal N H et al, 2004] В России больных хроническими формами и носителей HCV не менее 2 млн человек [Шахгильдян И В и соавт , 2003] Характерной особенностью вирусного гепатита С является высокая частота хронизации инфекции (>85%), развития цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%) [Соринсон СБ, 1998, Marcelim Р et al, 2002, Ahmad А et al, 2004] Различное течение и исходы заболевания обусловлены гетерогенное! ью иммунного ответа, определенного как иммуногенетическим своеобразием организма-хозяина, так и биологическими особенностями HCV

Считается, что главным фактором, обуславливающим персистенцию HCV, является высокая скорость мутаций вируса Благодаря высокой генетической вариабельности, HCV у каждого инфицированного лица существует в виде комплекса генетически близких постоянно изменяющихся вариантов (квазивидов) [Соринсон С Н и соавт, 1998, Kanto Т , 1995, Alter Н J , Seeff L В , 2000] Другим механизмом, реализующим возможность персистенции, может быть подавление иммунного ответа под действием белков HCV [Фридлянд И Ф и соавт, 2002, Sarobe Р et al, 2003] Третьим фактором, способствующим персистенции HCV, считается инфицирование этим вирусом лимфоидных клеток [Соринсон С Н и соавт, 1997, Lauer GM et al, 2001, Kanto T, Hayashi N, 2006] Резервуаром инфекции в периферической крови и других тканях организма могут служить В- и Т-лимфоциты, моноциты/межрофаги, гранулоциты и другие клетки Кроме названных механизмов персистенции, имеется предположение о том, что важнейшую роль в хронизации и прогрессировании гепатита С играют дисбаланс между ТЫ- и ТЬ2-лимфоцитами и секретируемыми ими цитокинами [Приймяги Л С и соавт , 2002, Царегородцева Т М , Серова Т И, 2003, Наследникова И О и соавт, 2005, Рязанцева Н В и соавт, 2006, Antonaci S et al, 1998; Fan X et al, 1998, Cramp M et al, 1999, Boyer N et al, 2000]

Наличие хронического инфекционного процесса, безусловно, является следствием недостаточности противовирусного иммунитета Как продемонстрировали многочисленные исследования, главную роль в элиминации HCV играет Т-клеточный ответ, так как действие нейтрализующих антител зачастую оказывается неэффективным Спонтанное прекращение острой HCV-инфекции ассоциируется с сильным продолжительным мультиспецифическим С04+-Т-клеточным пролиферативным и IFN-y-ответом, направленным одновременно на множество вирусных эпитопов-мишеней [Cramp М et al, 1999, Day С L et al, 2002, Rosen H R et al., 2002, Chang К M et al, 2003, Wertheimer AM et al, 2003, Wollard D J et al, 2003] При хроническом течении болезни наблюдается утрата способности С04^- и С08+-Т-клеток к пролиферации

секреции IFN-y [Wedemeyer H et al, 2002, Ulsmheimer A et al., 2003] В ряде исследований было показано, что HCV способен снижать CD8" -Т-клеточный ответ [Wedemeyer H et al, 2002, Sugimoto К et al, 2003, Boettler T et al, 2005]. Этот факт может объяснять частую клиническую ассимптоматичность острой HCV-инфекции и слабую степень повреждения печени у большинства пациентов [Wedemeyer H et al, 2002, Accapezzato D et al, 2004, Kanto T , Hayashi N , 2006J

Предполагается, что и острое и хроническое повреждение печени при гепатите С происходит, в основном, за счет реализации иммунного ответа на HCV, а не его цитопатического действия [Racanelli V et al, 2001; Chang К M et al, 2003, Ahmad A, Alvares F , 2004, Kanto T, Hayashi N, 2006] Клеточный иммунный ответ играет ключевую роль не только в элиминации вируса, но и в патологии печени при хронической HCV-инфекции Однако, в настоящее время об изменениях субпопуляционного состава Т-лимфоцитов, других, участвующих в иммунном ответе факторах, связанных с повреждением печени при хронической HCV-инфекции, известно немного

Особое внимание уделяется изучению роли в иммунопатогенезе ХГС регуляторных Т-клеток с иммунофенотипом CD3+CD4+CD25+ (Tregs) [Sugimoto К et al, 2003, Cabrera R et al, 2004, Sakaguchi S , 2004, Boettler T et al, 2005] В большинстве работ сообщается о повышении содержания CD4+CD25hlgh Tregs (популяция с высокой степенью экспрессии антигена CD25) в периферической крови HCV-инфицированных пациентов по сравнению с выздоровевшими больными или .неинфицированным контролем [Sugimoto К et al, 2003, Cabrera R et al, 2004] Тем не менее, до сих пор не ясна причина повышения Tregs при HCV-инфекции [Kanto T, Hayashi N, 2006] Большой интерес представляет исследование Т-клеток с экспрессией маркеров NK-клеток (CD16, CD56, CD161), включающих CD3+CD16+56+ Т-киллеры и регуляторные NKT-клетки, несущие на своей поверхности инвариантный Т-клеточный рецептор (ТКР), также участвующие в механизме повреждения печени при ХГС за счет выработки профибротических цитокинов (IL-4 и DL-13) 2 типа [Kawarabayashi N et al, 2000, Ahmad A , Alvares F., 2004, De Lalla С et al, 2004]

В последнее время интенсивно изучается характер CD4+- и CD8+-T-клеточного ответа на белки HCV как в печени, так и в других компартментах (периферическая кровь, костный мозг и др ) [Shirren С A et al, 2000, Ferma A et al, 2002, Leroy V et al, 2003, Watson M W et al, 2003, Monta К et al, 2005] Было выявлено, что IFN-y-ответ мононуклеаров периферической крови (МНШС) на С-соге-антиген HCV может быть маркером тяжести заболевания при ХГС [Watson M W et al, 2003] Важное прогностическое значение при хронических заболеваниях печени могут иметь исследования цитокинового спектра Как показано в большинстве работ, повышение содержания некоторых цитокинов связано с изменением активности и прогрессией ХГС [Логинов АС и соавт, 2001, Приймяги Л С и соавт , 2003; Наследникова И О и соавт , 2005, Скляр Л Ф и соавт , 2005, Рязанцева H В и соавт , 2006, Zdberberg H et al, 1999] Появились публикации о связи В-клеточного фенотипа со степенью фиброза у пациентов с хронической HCV-инфекцией [Racanelli V. et al, 2001, Ni J et al, 2003, Sansonno D et al, 2004, Monta К et al, 2005]

В то же время, многие аспекты иммунопатогенеза НСУ-инфекции остаются неясными и требуют более глубокого изучения Так, практически отсутствуют сведения об экспрессии активационных маркеров (С025, НЬА-БИ, С095) на поверхности основных субпопуляций Т-, В-лимфоцитов и натуральных киллеров (ЫК-клеток) у больных с различной степенью фиброза печени Важной представляется оценка роли Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих антигены СВ25 и НЬА-БК, а также Т-киллеров (СВЗ+СБ16+56+) в иммунопатогенезе ХГС и прогрессировании заболевания на стадии формирования цирроза печени Мало изучена диагностическая значимость изменений провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, которые могли бы выступать в качестве иммунологических маркеров прогрессирования и дифференцирования стадий ХГС До сих пор не установлены взаимосвязи между факторами гуморального, врожденного иммунитета и темпами прогрессирования фиброза печени у больных ХГС

Особое значение приобретает создание дифференциально-диагностических и прогностических алгоритмов при ХГС, разработанных на основе анализа изменений клеточного и гуморального звена иммунной системы дтя случаев, когда отсутствует возможность проведения пункционной биопсии печени. В настоящее время их практически нет, поэтому разработка и практическое внедрение таких алгоритмов поможет клиницисту дифференцировать стадии, тип иммунного ответа при ХГС, оценить прогноз и выбрать рациональную лечебную тактику у конкретного больного

Таким образом, дальнейшее уточнение иммунопатогенеза хронической НСУ-инфекции и идентификация иммунологических критериев, ассоциированных с прогрессией ХГС, нарастанием степени фиброза печени и благоприятным ответом на лечение, является актуальной медицинской проблемой

Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования

Цель исследования. Изучить иммунопатогенез хронической НСУ-инфекции при различных степенях фиброза печени и генотипах НСУ, разработать дифференциально-диагностические и прогностические критерии заболевания

Задачи исследования.

1 Дать характеристику изменений клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и неспецифической резистентности у больных ХГС на различных стадиях заболевания

2 Исследовать изменения клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и неспецифической резистентности у больных ХГС с циррозом печени

3 Оценить роль клеточных и гуморальных факторов иммунной сис темы в иммунопатогенезе хронической НСУ-инфекции

4 Выявить особенности изменений иммунной системы при хронической НСУ-инфекции, вызванной За и 1Ь генотипами вируса

5 Разработать иммунологические критерии дифференциальной диагностики и прогноза течения хронической НСУ-инфекции

Научная новизна исследования. У больных ХГС со слабой, умеренной, тяжелой степенями фиброза и циррозом печени впервые выявлены обусловленные прогрессией заболевания достоверные различия в содержании субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, ЦИК, иммуноглобулинов, интерлейкинов и функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов

Впервые выявлены особенности иммунопат огенеза ХГС со слабой и умеренной степенью фиброза печени и сформулированы положения о доминировании гуморального иммунного ответа по ТЬ2 типу и снижении субпопуляций Т- и ИК-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности

Впервые выявлены прогностические и дифференциально-диагностические иммунологические критерии, позволяющие проводить иммунологический мониторинг и прогнозировать течение ХГС у больных с различными степенями фиброза и компенсации цирроза печени

Вйервые выявлены закономерности и взаимосвязь процессов активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток у больных ХГС

На основе изученных у больных ХГС закономерностей изменений клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности для практического здравоохранения впервые разработаны расширенный и сокращенный варианты обследования больных и а тгоритмы дифференциальной иммунодиагностики ХГС на различных стадиях заболевания

Практическая значимость. В целях дифференциальной диагностики и прогнозирования течения ХГС при слабой, умеренной и тяжелой степени фиброза, компенсированном и декомпенсированном циррозе печени предложен перечень иммунологических критериев и алгоритмы дифференциальной иммунодиагностики заболевания

Определен объем первичного иммунологического обследования больных ХГС, включающий изучение показателей Т-, В-систем иммунитета, факторов неспецифической резистентности Разработаны расширенный и сокращенный варианты углубленного иммунологического обследования больных ХГС, позволяющие установить доминирующий тип иммунного ответа

Предложена система иммунологического мониторинга у больных ХГС, включающая изучение в динамике определенных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, в том числе, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза На основании изучения соотношений активированных и неактивированных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, разработаны иммунологические критерии прогноза ХГС

Личное участие автора в получении результатов. Автором уточнены особенности иммунопатогенеза начальных и поздних стадий НСУ-инфекции, проанализированы иммунологические, клинико-лабораторные и морфологические проявления заболевания на различных его этапах, созданы алгоритмы дифференцирования начальных и поздних стадий ХГС, а также оценки

характера иммунного ответа, разработаны иммунологические критерии прогрессирования ХГС на основе анатиза изменений иммунной системы у больных с различной степенью выраженности фиброза печени

Автор осуществлял планирование и принимал непосредственное участие в иммунологическом обследовании больных, организации всех лабораторно-инструментальных и гистологических исследований, самостоятельно проводил анализ количественного состава субпопуляций лимфоцитов периферической крови на проточном цитометре с использованием тройных комбинаций прямых моноклональных антител, а также осуществлял определение содержания различных цитокинов в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Изменения иммунной системы у больных ХГС при слабой и умеренной степенях фиброза печени проявляются снижением уровня клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксической активности, доминированием гуморального иммунного ответа с преобладанием цитокинов ТЪ2-профиля, высоким уровнем В-лимфоцитов, иммуноглобулинов и ЦИК, нарушением функциональной активности нвйтрофильных лейкоцитов

2 При тяжелой степени фиброза и компенсированном циррозе печени у больных ХГС наряду с сохраняющимся превалированием В-клеточного иммунного ответа при прогрессии заболевания еще более снижается уровень CD3" CD8+, CD3"CD16+56"r естественных киллеров и усиливается активность Т-клеточного звена иммунной системы, проявляющаяся повышением содержания CD3+CD4+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD95+ субпопуляций T-лимфоцитов

3 Прогрессирование ХГС сопровождается патогенетически значимыми изменениями Т-клеточного звена иммунной системы, характеризующимися взаимосвязью процессов активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу ПИЛ общей иммунологии и иммуногенетики НИО передовых медико-биологических технологий НИЦ ВМедА им СМ Кирова, кафедр и клиник инфекционных болезней, факультетской терапии, клинической биохимии и лабораторной диагностики, микробиологии ВМедА им СМ Кирова, инфекционных центров и отделений госпиталей МО РФ На основании пол5'ченных данных изданы методические рекомендации ГВМУ МО РФ «Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов» (М , 2002), «Латентные формы вирусных гепатитов В, С и D диагностика, лечение и профилактика» (М, 2002), подготовлены к изданию методические рекомендации «Иммунологическое обследование больных вирусными гепатитами» (2006)

s

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции с международным участием «Вирусные инфекции на пороге XXI века эпидемиология и профилактика» (Санкт-Петербург, 1999), Научной конференции «Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней» (Санкт-Петербург, 1999), 4 научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000» (Санкт-Петербург, 2000), 5 Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2001), 5 научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001 >> (Санкт-Петербург, 2001-), Всероссийской научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения профессора НК Розенберга и 105-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2001), 6 Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург, 2002), 1 съезде военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ (Санкт-Петербург, 2002), Научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002), VII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), VI Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2003), VIII, IX, X, XI Всероссийских научных Форумах с международным участием имени академика В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004-2007).

По материалам исследования опубликовано 32 печатные работы, в том числе 2 методических рекомендаций, 16 научных публикаций, в журналах реферируемых ВАК

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 318 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 8 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, шести глав результатов собственных исследований), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 265 источников, в том числе 76 отечественных и 189 зарубежных Текст содержит 92 таблицы, 20 рисунков и 8 приложений

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Всего было обследовано 247 больных хроническим гепатитом С на различных стадиях заболевания Возраст больных находился в пределах от 18 до 60 лет и в среднем составил 32,4+0,52 года Подавляющее большинство обследованных являлись лицами мужского пола -212 человек (86%), женщины составили 35 человек (14%) Большинство пациентов (80%) были жителями Санкт-Петербурга, Ленинградской области и Северо-Западного региона России Остальные пациенты проживали в других областях страны Большая часть обследованных была представлена военнослужащими РФ (73%) и меньшая часть - гражданскими лицами (27%) Контрольную группу составляли здоровые лица (п=76), у которых отсутствовали любые клинико-лабораторные и морфологические признаки поражения печени, а также соматические заболевания Большинство обследованных в контрольной группе также являлись лицами мужского пола - 65 человек (86%), женщины составили 11 человек (14%) Все они проживали в Санкт-Петербурге, Ленинградской области или Северо-Западном регионе России Их возраст находился в пределах от 18-40 лет и в среднем составил 30,2+0,43 года

Диагноз ХГС был установлен с помощью клинических, лабораторных (в т ч, обнаружением в периферической крови суммарных антител к НСУ) и морфологических (биопсия печени) методов Клинический осмотр больных, УЗИ органов брюшной полости, общеклинический анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови, пункционная биопсия печени, молекулярно-генетические исследования проводились совместно с кафедрой инфекционных болезней ВМедА (заместитель начальника кафедры по клинической работе доктор медицинских наук К В Жданов и доктор медицинских наук Д А Гусев) В обследование были включены только те пациенты, у которых анализ методом ПЦР выявил в крови наличие РНК НСУ Больные с острой формой ГС, а также лица с алкоголизмом и наркоманией в исследование не включались

Морфологические исследования гепатобиоптатов проводились совместно с кафедрой патологической анатомии ВМедА им С М Кирова (начальник кафедры - профессор доктор медицинских наук С.А. Повзун, преподаватель кафедры -доктор медицинских наук В С Чирский) Полуколичественно оценивались активность и стадия патологического процесса в печени Для этого использовался индекс гистологической активности (ИГА), предложенный Яй Кпо<1е11 (1981), в дальнейшем модифицированный (без четвертой составляющей, характеризующей выраженность фиброза), а для диагностики стадии патологического процесса применялся индекс фиброза в соответствии со стандартизированной системой «МЕТАУЩ» В соответствии с этими индексами устанавливали гепатит с минимальной активностью (ИГА 1-3 балла), со слабо выраженной активностью (ИГА 4-8 баллов), с умеренной активностью (ИГА 9-12 баллов) и с выраженной активностью (ИГА 13-18 баллов), а также степень фиброза (Ф0 - отсутствие фиброза, Ф1 - слабый (портальный) фиброз, Ф2 - умеренный (с порто-портальными септами), ФЗ - тяжелый (с порто-центральными септами) и Ф4 -цирроз) [Кпо<1е11 Я в & а1, 1981, Бевте! VI е1 а!, 1994, Роупагс! Т и а1,1997]

На основании морфологического обследования больные с хронической HCV-инфекцией были разделены на группы по стадиям хронического гепатита -Ф1 (п=110), Ф2 (п=59), ФЗ (п=19) и Ф4 (п=13) В группу с циррозом (Ф4) входили больные как с компенсированным (7 пациентов), так и декомпенсированным (6 пациентов) циррозом печени

Большинство серологических и молекулярно-биологических исследований осуществлялись совместно с городским центром вирусологических исследований г Санкт-Петербурга (заведующий отделом ЕЦР-диагностики - кандидат медицинских наук А В Семенов) и лабораторией вирусных гепатитов НИИЭМ им JI Пастера (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук В В Малышев) Определение анти-HCV выполнялось с применением тест-системы "Anti-HCVab" производства "Abbott" (США) на иммунохимическом анализаторе "Architect 2000 SR" Выявление генома HCV (РНК) проводилось методом обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени Для качественной детекции генома применялась тест-система "АмплиСенс HCV-FRT", для количественной - "АмплиСенс HCV-монитор- FRT", производства ЦНИИЭ (Россия) Принцип тестирования основан на выделении тотальной РНК из плазмы крови совместно с внутренним контрольным образцом, проведении реакции обратной транскрипции РНК и амплификации с детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени Исследования проводились на приборе iCycler фирмы "Rio-Rad" (США) согласно инструкции производителя Генотипирование HCV производилось с использованием тест-системы "АмплиСенс-50-R HCV-генотип", производства ЦНИИЭ (Россия) Me год основан на проведении обратной транскрипции РНК и последующей амплификации участков к ДНК HCV генотипов la, lb, 2, За

На основании молекулярно-генетического обследования больные с хронической HCV-инфекцией были разделены на группы по генотипам HCV - lb (п=22) и За (п=30)

Иммунологические исследования крови включали в себя изучение гуморального и клеточного иммунитета, а также факторов неспецифической защиты организма (таблица 1)

Изучение количественного состава с^бпопуляций лимфоцитов в периферической крови выполнялось на проточном цитометре Facscan фирмы "Becton Dickinson" (США) с использованием тройных комбинаций прямых моноклональных антител (CD95/CD3/CD19, CD25/CD4/CD3, CD25/CD8/CD3, HLA-DR/CD4/CD3, HLA-DR/CD8/CD3, CD16+56/CD3) и изотипических контролей той же фирмы Внешний контроль качества определения на проточном цитометре различных субпопуляции лимфоцитов проводился в рамках центральной Европейской программы по контролю качества иммунологических исследований (CEQUAL) В результате оценки качества исследований, выполняемых на проточном цитометре, получены сертификаты (№299 от 27 09 2002 г , №299 от 2 04 2004 г, №299 от 6 05 2005 г )

Таблица 1

Объем иммунологических исследований__

Количество

Иммунологические исследования исследований (п)

Больные ХГС здоровые

Определение в периферической крови субпопуляций лимфоцитов методом

проточной цитометрии с использованием двух- и трехцветных реагентов

СОЗ4, СБ19+ 78 29

СБЗ+С04+, СБ34С08+, СОЗ+СБ16+56+ 78 29

СБЗ+СР25+, СОЗ+НЬА-ВИ+, СПЗ СБ25\ СБЗ"НЬА-ВЫ+ 78 29

С;03+С04 Х:Г)25" , СОЗ+СВ4д НЬА-ОК+ 44 -

СБЗ+СВ8+СВ25+, СХ>3+СВ8+Н1А-ГЖ ' 44 -

С03+С095+, СП194С095", С1ЭЗ"С016+56+С095+ 45 10

СВЗ'С08+, СОЗ СБ16+5б" 78 29

Определение цитокинов и иммуноглобулинов методом ИФА

ПЛР, ШЫ-уДЬ-Ю, 1Т-6 68 28

ФНО-а 108 21

ИФН-а 96 22

ИЛ-4 43 11

1<?Е, 1вО), ^2, ^йЗ и 1^04 74 15

Прочие иммунологические методы исследования

IgA, (по в Мапаш) 247 74

ФЧ, ФП, ПЗФ, ЛКТ, НСТ-тест (спонтанный и индуцированный) 247 54

ЦИК высокомолекулярные, 247 125

ЦИК среднемолекулярные 94 46

ЦИК низкомолекулярные 94 44

ВСЕГО 1763 566

Определение в сыворотке крови фактора некроза опухолей-а (ЮТ-а), интерферона-а (1КМ-а), интерферона-у (№N-7), интерлейкина-1р (1Ь-1р), интерлейкина-4 (1Ь-4), интерлейкина-6 (1Ь-6), интерлейкина-10 (1Ь-10) проводилось методом иммуноферментного анализа (ИФА) Для этого использовались отечественные коммерческие тест-системы НПО «Протеиновый контур» Методом ИФА определялись также сывороточные иммуноглобулины и подклассы 1^2, и 1^04) с использованием отечественных

диагностикумов (ООО "Стибиум плюс") Для определения иммуноглобулинов классов М, О и А в сыворотке крови использовался стандартный метод простой радиальной иммунодиффузии по в Мапыт и соавт (1965)

Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводилось методом, предложенным Ю А Гриневичем и А Н Алферовым (1981)

Степень активности кислородзависимых и кислороднезависимых микробицидных систем нейтрофильных лейкоцитов оценивали по НСТ-тесту [Виксман M Е , Маянский А И, 1977] и ЖТ [Пигаревский В Е, Мазинг Ю А, 1981] Определение параметров фагоцитарной реакции нейтрофилов крови проводили по методу H В Васильева и соавт (1972) в модификации В Г Морозова и В X Хавинсона (1980)

Исходные данные подвергались статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Excel и Statistica 6 0 для Windows [Зайцев В M, Лифляндский В Г, 2000, Реброва О Ю., 2003] При этом использовались следующие математико-статистические методы описательная статистика количественных данных в группах, нормальность распределения количественных признаков в выборке с помощью критерия Шапиро-Уилка, сравнение групп с помощью рангового непараметрического метода U-критерия Манна-Уитни (при отсутствии нормального распределения признаков) и параметрического метода t-критерия Стьюдента (при нормальном распределении признаков), корреляционный анализ (коэффициент корреляции - г) двух признаков непараметрическим методом Спирмена и параметрическим методом Пирсона для оценки направления, силы, статистической значимости корреляционной связи между различными клинико-лабораторными, иммунологическими признаками и степенью фиброза печени, с целью отбора наиболее информативных показателей для дифференциальной диагностики различных стадий ХГС, а также оценки скорости прогрессии заболевания

Результаты исследования и их обсуждение

У всех обследованных больных ХГС (группы Ф1, Ф2, ФЗ) отсутствовали внепеченочные клинические проявления вирусного гепатита, уровень общего билирубина находился в пределах нормы У 15,4% больных ХГС группы Ф4 были выявлены кожные знаки, геморрагии и желтуха

Субпопуляции Т-хелперов (CD3"CD4+) и цитотоксических лимфоцитов (CD3 CD8+) у больных ХГС изучались многими авторами [Никитин И Г и соавт, 1999, Маммаев СН, 2001, Масалова О В и соавт, 2003, Репла A et al, 2002, Monta К et al, 2005] Тем не менее, в этих работах не проводилось исследование изменений этих субпопуляций на различных стадиях заболевания

В настоящей работе при анализе содержания Т-хелперов у больных ХГС с различной степенью фиброза и циррозом печени повышение относительного и абсолютного числа CD3+CD4+ Т-лимфоцитов отмечалось только у больных с циррозом печени (Ф4) В то же время, не было выявлено статистически значимых различий (р>0,05) по сравнению с другими группами (Ф1-ФЗ) Медианы значений относительного содержания Т-хелперов в группах Ф1-Ф4 составили- здоровые — 38,5%, Ф1 - Ме=37,8%, Ф2 - Ме=37,3%, ФЗ - Ме=35,8%, Ф4 - Ме= 40,8% При этом, у больных группы Ф4 с компенсированным циррозом медиана (Me) относительного количества CD3+CD4+ клеток равнялась 35,7%, а с декомпенсированным - Ме=47,95% У 50% обследованных пациентов с декомпенсированным циррозом относительное количество CD3+CD4+

лимфоцитов превышало норму Таким образом, самые высокие значения относительного содержания CD3+CD4+ Т-лимфоцитов наблюдались у больных ХГС на стадии декомпенсированного цирроза печени Хотя, сильный СГ)4+ Т-хелперный ответ является необходимым условием для прекращения HCV-инфекции [Day СL et al, 2002, Rosen НR. et al, 2002, Wertheimer AM et al, 2003], повышение CD3+CD4+ Т-лимфоцитов в ПК на стадии тяжелого фиброза (ФЗ) имеет, по-видимому, патологический характер и вызвано развитием на поздних стадиях ХГС аутоиммунных процессов В связи с этим, увеличение в ПК содержания CD3+CD4+ Т-лимфоцитов у больных с тяжелым фиброзом (ФЗ) и компенсированным циррозом печени можно рассматривать как прогностически неблагоприятный признак течения заболевания

Исследование содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+ICD8+) показало, что медиана значений относительного количества этих клеток постепенно увеличивается по мере роста степени фиброза (Ф1-ФЗ) (здоровые -Ме=25,9%, Ф1 - Ме=24,4%, Ф2 - Afe=27,0%, ФЗ - Ме=27,1%), снижаясь у больных с циррозом печени (Ф4 - Afe=21,95%) Однако различия между группами не были статистически значимыми (р>0,05) В свою очередь, проведение-сравнительного анализа больных с компенсированным и декомпенсированным циррозом печени (группа Ф4), выявило статистически значимое уменьшение относительного (р<0,01) и абсолютного (р<0,05) количества CD3+CD8+ Т~ лимфоцитов у больных с декомпенсированным циррозом Медиана (Me) относительного содержания CD3+CD8+ Т-клеток при компенсированном циррозе была равна Ме=43,5%, а при декомпенсированном - М?=15,4% Таким образом, у больных с компенсированным циррозом чаще отмечались более высокие значения содержания CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, чем у пациентов с декомпенсированным циррозом Поэтому снижение в ПК относительного числа CD3+CD8' клеток у больных ХГС на стадии компенсированного цирроза может отражать прогрессию заболевания в декомпенсированный цирроз печени

Считается, что соотношение CD3+CD4+/CD3+CD8+ свидетельствует об эффективности клеточного иммунного ответа Некоторые авторы предполагают, что уменьшение (менее единицы) значений этого показателя отражает слабый пролиферативный ответ Т-клеток на вирусные антигены, и связывают это с неблагоприятным прогнозом течения заболевания [Маммаев С Н, 2001, Наследникова И О и соавт, 2005] В данном исследовании, при анализе отклонений от пределов нормы пониженные значения этого показателя у больных ХГС обнаружены у пациентов группы Ф1 в 21,9%, Ф2 - в 31,8%, ФЗ - в 15,4% случаев Причем, у больных с циррозом печени (Ф4) зафиксировано не только снижение (22,2%), но и повышение (33,3%) этого индекса, а нормальные значения соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+ Т-лимфоцитов наблюдались только у 44,4% пациентов Величины медианы (Me) индекса CD3+CD4+/CD3+CD8+ в исследуемых группах составили здоровые - Ме= 1,6, Ф1 - Ме=\,Ъ5, Ф2 - Ме=1,44, ФЗ -Me—1,3, Ф4 - Ме=1,95. При этом в группе Ф4 у больных с компенсированным циррозом Me этого соотношения была равна 0,82, а у больных с декомпенсированным циррозом печени Me-2,69 Данные исследования свидетельствуют о том, что наиболее низкие значения соотношения

CD3+CD4+/CD3+CD8+ были характерны дня стадии компенсированного, а самые высокие - для стадии декомпенсированного цирроза Снижение этого индекса при компенсированном циррозе было обусловлено существенным увеличением количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, а его возрастание при декомпенсированном циррозе печени как увеличением числа CD3+CD4+, так и резким уменьшением содержания в ПК CD3+CD8+ Т-клеток В связи с этим, у больных ХГС на стадии тяжелого фиброза (ФЗ) снижение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+ Т-лимфоцитов менее единицы может отражать прогресс,ию заболевания с переходом на стадию компенсированного цирроза печени В то же время, существенное возрастание этого показателя (>2) у пациентов с ХГС на стадии компенсированного цирроза, по-видимому, может свидетельствовать о дальнейшей прогрессии, проявляющейся развитием декомпенсации цирроза печени

При фенотипическом анализе особо выделяют Т-клетки, экспрессирующие маркеры, чаще свойственные NK-клеткам (CD3+CD16+56+ Т-киллеры) и обладающие киллерной и противоопухолевой активностью Эта популяция содержит NKT-клетки и Т-клетки, экспрессирующие антигены CD 16 и CD56 [Mendes R et al, 2000, Ahmad A et al, 2004, Mercer J С et al, 2005] Оценка содержания в ПК CD3+CD16+56+ Т-киллеров можег иметь важное клиническое значение В настоящем исследовании значения Me относительного содержания CD3+CD16+56+ Т-клеток в группах составили здоровые - Ме=4,1%, Ф1 -Me—3,5%, Ф2 - Ме=3,0%, ФЗ - Ме=3,7%, Ф4 - Ме=7,3% У больных с начальными стадиями фиброза (Ф1, Ф2), по сравнению со здоровыми лицами (здоровые и Ф2, р<0,05), было выявлено умеренное снижение содержания CD3+CD16+56+ Т-лимфоцитов У больных с большей прогрессией заболевания, наблюдалось постепенное увеличение их числа, что отражалось наличием прямой корреляционной связи между количеством Т-киллеров и степенью фиброза (г=0,24, р=0,035) Было обнаружено статистически значимое (Ф2 и Ф4, р<0,05) повышение содержания этих клеток у больных с циррозом печени (Ф4) Анализ частоты отклонений значений CD3+CD16+56+ Т-¡слеток от пределов нормы показал, что на поздних стадиях заболевания (ФЗ Ф4) увеличивается частота случаев высокого относительного содержания CD3+CD16+56+ Т-лимфоцитов (Ф1 - 9,4%, Ф2 - 4,5% ФЗ - 15,4% и Ф4 - 33,3% случаев! В группе Ф4 максимальные значения содержания Т-киллеров отмечались у пациентов с компенсированным циррозом печени (Afe= 13,7%) В то же время, у больных ХГС группы Ф4 с декомпенсированным циррозом (Ме=4,15%) было зафиксировано выраженное статистически значимое уменьшение относительного (р<0,01) и абсолютного (р<0,05) количества CD3+CD16+56+ лимфоцитов Согласно данным литературы [Ahmad А et al 2004, De Lalla С et al, 2004], Т-киллеры и NKT-клетки, также как и CD8+ Т-лимфоциты, играют важную роль в повреждении печени Прогрессирование ХГС в цирроз печени связывают с продукцией инвариантными NKT-клетками профибротических цитокинов 2 типа (IL-4 и IL-13) [De Lalla С et al, 2004] Этот патогенетический механи¡м подтверждается данными настоящего исследования, что отражалось повышением при компенсированном и снижением при декомпенсированном циррозе печени относительного и абсолютного числа

обеих субпопуляций цитотоксических Т-клеток (СВЗ'СВ8+ и СВЗ'СВ1.6+56+) в периферической крови Таким образом, наиболее высокие значения СВЗ+СВ16+56+ Т-лимфоцгаов бьши характерны для больных с компенсированным циррозом печени В связи с этим повышение уровня СВЗ+СВ16+56' Т-киллеров в ПК у больных ХГС с тяжелым фиброзом (ФЗ) можно расценивать как неблагоприятный признак, отражающий прогрессирование патологического процесса с переходом в компенсированный цирроз печени Значительное уменьшение относительного содержания в ПК СВЗ!СВ1 6+56+ Т-клеток у больных ХГС при развившемся компенсированном циррозе является прогностически неблагоприятным признаком дальнейшего течения заболевания

При анализе данных исследования о субпопуляциях активированных Т-лимфоцитов (СВЗ+СБ25+ и СВЗНЬА-ВК), наибольший интерес представляют результаты, свидетельствующие о повышении относительного и абсолютного - содержания Т-клеток, экспрес сирующих "поздний" маркер активации НЬА-ВК (СВЗНЬА-ВК^) у пациентов с высокой степенью фиброза Так, при анализе содержания СВЗ+НЬА-В1Г Т-клеток у больных ХГС (Ф1-Ф4) было обнаружено увеличение числа больных, имеющих повышенное содержание СВЗ+НЬА-ВК+ Т-лимфоцитов (Ф1 - 9,4%, Ф2 - 4,5%, ФЗ - 15,4%, Ф4 - 33,3% случаев) по мере нарастания степени фиброза, что нашло свое отражение в виде прямой умеренной корреляционной связи между количеством СВЗ+НЬА-ВК+ Т-клеток и степенью фиброза (г=0,25, р=0,028) Значения медианы (Ме) относительного содержания СВЗ+НЬА-ВИ+ Т-клеток в исстедуемых группах составили здоровые - Ме=2,5%, Ф1 - Ме= 2,6%, Ф2 - Ме=2,6%, ФЗ - Ме=Ъ,1%, Ф4 - Ме=4,0% Между группами больных ХГС Ф1 и Ф4, а также Ф2 и Ф4 были установлены статистически значимые (р<0,05) отличия по относительному и абсолютному числу этих клеток В то же время, не было зафиксировано достоверных различий в содержании СВЗ+НЬА-ЕЖ+ Т-лимфоцитов у пациентов с компенсированным и декомпенсированным циррозом печени Полученные в настоящем исследовании результаты соответствуют положению о том, что повышение числа активированных СВЗ+НЬА-В К1 Т-лимфоцитов у больных с ХГС связано со стадией заболевания [Рапавшк А, е1 а1, 2003] Поэтому повышение СВЗ+НЬА-ВИГ Т-клеток у больных ХГС с умеренным фиброзом может рассматриваться как критерий, характеризующий неблагоприятное течение заболевания

Популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТ Л) неоднородны, в периферической крови существуют субпопуляции, включающие как активированные, так и неактивированные клетки Изменения этих субпопуляций лимфоцитов на различных стадиях ХГС практически не изучены, хотя могут отражать новые механизмы иммунопатогенеза ХГС В связи с этим, следующим этапом работы являлся анализ экспрессии активационных маркеров СВ25, Ш-А-ВЫ на субпопуляциях Т-хелперов (СОЗ+СВ4+СВ25\ СВЗ 'СВ4+НЬА-ВБГ) и цитотоксических Т-лимфоцитов (СВЗ+С08+СВ25~ СВЗ+СВ8+НЬА-ВБГ) Количество активированных Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов определялось от общего числа Т-клеток (СВЗ+)

В настоящее время установлено, что повышение числа CD4+CD25+ Т-клеток может происходить при воспалительных процессах любой природы (инфекционных, аутоиммунных) [Chatila Т А, 2005, Sakaguchi S , 2005] В данном исследовании проводилась оценка общего количества CD4 CD25 активированных Т-хелперов Значения медианы (Ме) относительного содержания CD4 CD25" Т-клеток в исследуемых группах составили Ф1 - Ме= 10,9%, Ф2 -Ме= 10,1%, ФЗ -Ме=10,7%, Ф4 - Ме=\2,5% Достоверных различий в содержании CD4"'"CD25" Т-хелперов у больных ХГС групп Ф1-ФЗ не было выявлено В то же время, у пациентов с циррозом печени (Ф4) наблюдалось увеличение количества CD4+CD25+ Т-лимфоцитов, что согласуется с литературными данными [Cabrera R et al , 2004, Boettler T et al, 2005, Ormandy LA et al, 2005] Можно предположить, что увеличение CD4+CD25+ Т-хелперов связано с развитием на поздних стадиях фиброза (ФЗ, Ф4) аутоиммунных процессов Несмотря на отсутствие статистически значимых различий в количественном содержании CD4~CD25+ Т-клеток у больных ХГС (групп Ф1-ФЗ), а также корреляций между их уровнем и степенью фиброза, у больных со слабым фиброзом (Ф1) были Зафиксированы прямые взаимосвязи между ИГА и относительным (г=0,84, р=0,001) и абсолютным (г=0,89, р=0,001) числом CD4+CD25+ Т-лимфоцитов У этих же пациентов обнаружена прямая корреляция (г=0,62; р=0,023) между относительным количеством CD4+CD25+ Т-клеток и активностью цитолитического фермента АлАТ Эти данные свидетельствуют об участии на начальных стадиях заболевания CD4+CD25+ Т-хелперов в патогенезе воспалительного процесса в печени Кроме этого, у больных ХГС группы ФЗ обнаружена обратная сильная корреляция между абсолютным содержанием CD4 'CD25+ Т-лимфоцитов и уровнем вирусной нагрузки (г=-0,92, р=0,026), что позволяет предполагать участие позитивных по CD25 Т-хелперов в контроле репликации HCV Таким образом, настоящее исследование подтверждает литературные данные [Cabrera R et al, 2004, Kanto T et al, 2006] о важной роли CD41~CD25+ лимфоцитов в регуляции иммунного ответа при хронической HCV-инфькции

Корреляционный анализ выявил взаимосвязь увеличения количества активированных CD4+HLA-DR+ Т-хелперов с декомпенсацией цирроза печени (г=0,82, р=0,007) Медиана (Ме) относительного содержания CD4+HLA-DR+ Т-лимфоцитов у больных с компенсированным циррозом была равна Ме=1,37%, а с декомпенсированным - Ме=2,75% По-видимому, повышение числа Т-клеток, экспрессирующих маркер активации HLA-DR (CD4+HLA-DR+), наряду, с увеличением общего количества Т-хелперов (CD3+CD4+), отражают активность воспалительного и аутоиммунного процессов на стадии компенсированного цирроза

Исследование содержания активированных ЦГЛ показало, что у больных ХГС в группах с более высокой степенью фиброза (ФЗ и Ф4) увеличивается количество активированных CD8+CD25+ и CD8+HLA-DR+ цитотоксических Т-лимфоцитов, хотя это повышение не было статистически значимым Значения медианы (Ме) относительного содержания CD8+CD25+ Т-лимфоцитов в исследуемых группах составили Ф1 - Ме=0,84%, Ф2 - Ме=0,86%, ФЗ - Ме= 1,3 %,

Ф4 - Ме= 1,0%, а СБ8+НЬА-ПЯ+ Т-клеток Ф1 - Ме= 1,3%, Ф2 - Ме= 1,6%, ФЗ -Ме=1,4%, Ф4 — Ме=2,3% Необходимо отметить тот факт, что у больных с декомпенсированным циррозом, несмотря на резкое снижение в периферической крови содержания СОЗ+СБ8+ ЦТЛ, уровень активированных СВ81 С1)25+ и С08+НЬА-0Я+ Т-клеток не изменялся На основании полученных данных можно говорить о том, что с ростом степени фиброза в иммунной системе происходят процессы, связанные со снижением доли неактивированных ЦТЛ, обусловленные потребностью в достаточно большом количестве активированных ЦТЛ, в результате чего соотношение активированные/неактивированные ЦТЛ смещается в сторону преобладания активированных ЦТЛ

Известно, что ключевая роль в регуляции лимфоцитарного пула на стадиях созревания и активации лимфоидных клеток принадлежит апоптозу [Буеверов АО и соавт, 2006] В настоящем исследовании изучение содержания Т-лимфоцитов, несущих маркер апоптоза С1395 (СБЗ+С095+) показало следующие результаты Несмотря на отсутствие статистически значимых отличий в содержании СТ)3+С095+ клегок между больными и здоровыми, было выявлено статистически значимое (р<0,01) повышение их количества, характерное для всех групп больных ХГС Значения медианы (Ме) относительного содержания СБЗ+С095+ Т-лимфоцитов в исследуемых группах составили здоровые -Ме=5,35%, Ф1 - Ме= 15,9%, Ф2 - Ме=12,1%, ФЗ - Ме=17,1%, Ф4 - Ме=12,3% Увеличение иммунореактивных СОЗ+СБ95+ клеток, по-видимому, было обусловлено продолжительной антиген-специфической и неспецифической активацией Т-лимфоцитов, что приводюю к постоянной персистенции активированных лимфоцитов, причем процесс накопления преобладал над процессом их элиминации из периферической крови У больных ХГС не было выявлено корреляционных взаимосвязей между повышением количества СБ95+Т-лимфоцитов и степенью фиброза, а также ИГА. В то же время, у больных со слабым фиброзом (Ф1) была обнаружена прямая корреляция между содержанием СШ+СБ95+ лимфоцитов и ИГА (г=0,62, р=0,031), а также АлАТ (г=0,57, р=0,043) Интересен тот факт, что в общей выборке больных ХГС уровень С)Э95+ лимфоцитов прямо коррелировал с содержанием экспрессирующих антиген СЮ25 Т-хелперов (СВ4+С1325+, г=0,62, р=0,000) и цитотоксических Т-лимфоцитов (СБ8+СВ25+, г=0,57, р=0,000) Возможно, что активация С095' Т-лимфоцитов препятствовала процессам регулируемого апоптоза, происходящим в периферической крови, а персистирующие активированные Т-хелперы (СП4+СБ25+СВ95+), таким образом, могли принимать участие в реализации аутоиммунных механизмов патогенеза хронической НСУ-инфекции Одной из причин повышения экспрессии на ЛПК антигена СБ95+ при ХГС также может быть персистенция НСУ в клетках лимфоидной системы [Буеверов А О и соавт , 2000, ШвепЬетег А е! а1, 2003].

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о возрастании активности Т-клеточного звена иммунной системы у больных ХГС, обусловленной прогрессией заболевания и проявляющейся ростом степени фиброза печени, его важной роли в иммунопатогенезе хронической НСУ-инфекции Обнаружение в ПК повышенного содержания основных субпопуляций

Т-лимфоцитов, экспрессирующих различные маркеры активации (СБ25, НЬА-ОЯ, СП95), по-видимому, объясняется как ростом их образования, обусловленного продолжительной антиген-специфической или неспецифической активацией Т-лимфоцитов, так и нарушением процессов их элиминации из периферической крови Данные настоящего исследования подтверждают важную роль в иммунопатогенезе ХГС не только цитотоксических СБЗ+СБ8+ лимфоцитов, но и субпопуляций Т-киллеров и ЫКТ-клеток, экспрессирующих поверхностные антигены Ж-клеток (СБ16, С056), а также Т-хелперов (СОЗ,С1)4+; СП4 СП25", СТМ'НЪА-БК'), что, по-видимому, связано с реализацией аутоиммунных процессов на поздних стадиях заболевания (тяжелый фиброз, компенсированный цирроз) Известно, что увеличение экспрессии молекулы НЬАТЖ на СЭЗ+СВ4+ и СШ+С08 ' субпопуляциях лимфоцитов, происходящее под влиянием целого ряда цитокинов, свидетельствует о нарастании активности воспалительною процесса Обнаружение взаимосвязи повышенной экспрессии Баз-антигена (СВ95) с увеличением содержания С04+СВ25+ и СВ8"С13254 популяций активированных Т-клеток, может свидетельствовать о нарушении регулируемого апоптоза активированных Т-клеток, а также о непосредственном участии этих клеток в индукции аутоиммунных реакций В то же время, для начальных стадий ХГС (слабый фиброз, умеренный фиброз) характерно нормальное содержание активированных Т-клеток Отсутствие количественных изменений исследованных субпопуляций Т-клеток в периферической крови у больных ХГС на начальных стадиях болезни может быть связано с нарушением их активации, в том числе, с неадекватностью Т-клеточного ответа на НСУ В ряде исследований показано, что темпы прогрессирования фиброза надрастают с увеличением степени его выраженности [МагсеНш Р е( а!, 2002 , 8ееА: Ь В , 2002] В связи с этим, обнаруженное в настоящем исследовании повышение содержания в ПК активированных Т-лимфоцитов позволяет предположить патогенетически важную роль Т-клеточного ответа в реализации быстрого прогрессирования заболевания, в т ч трансформации фиброза в цирроз печени

Выявленные в настоящем исследовании связи между количеством Т-клеток в периферической крови и степенью фиброза, позволяют рассматривать изменения со стороны некоторы> субпоп /ляций Т-лимфоцитов как дополнительные лабораторные критерии прогрессирования заболевания и дифференциальной диагностики ХГС (таблица 2 и 3) Наиболее интересным в плане прогноза течения ХГС является изучение изменений относительного содержания в ПК следующих популяций лимфоцитов С03+С04", СШ+СВ8+, СОЗ+НЬА-БК+, СП8"СП25", СБ4+С025+, СВ8+Н1А-БК+, СВ4ЪЬА-ПЯ\ СВЗ+С016+56+ (таблица 3) Соотношение С03Х047С03+С08 ; меньше единицы является прогностически неблагоприятным признаком прогрессии на стадиях Ф1, Ф2, ФЗ, как и повышение данного показателя выше 2 у пациентов с компенсированным циррозом (таблица 3)

Таблица 2

Характеристика частоты изменений содержания субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания

Субпопуляции Т-лимфоцитов 1 стадия (слабый фибро г) II стация (умеренный фиброз) III стадия (тяжелый фиброз) IV стадия

Комп цирроз Декомп цирроз

CD3+CD4+ (%) N N Т Т ttt

CD3+CD8"r (%) N N N п ш

CD3+CD4+/CD3+CD8+ 4 U 4 ш ttt

CD3+CD16+56+ (%) N N N ttt

CD3+CD25+ (%) N N N t N

CD3+HLA-DR+ (%) N N t t tt

CD3+CD95+ (%) ttt tt1 ttt ttt ttt

Примечание N - норма в 90%-100% случаев, | - выше нормы в 15-30% случаев, ~~ выше нормы в 30-60% случаев, |ТТ ~ выше нормы в более чем 60% случаев, 4 — ниже нормы в 15-30% случаев, 44 - ниже нормы в 30-60% случаев, 141 — ниже нормы в более чем 60% случаев

Таблица 3

Изменения уровней субпопуляций Т-ламфоцитов периферической крови у _больных ХГС, как критерии прогрессирования заболевания__

Субпопуляции Т-лимфоцитов I стадия (слабый фиброз) II стадия (умеренный фиброз) III стадия (тяжелый фиброз) IV стадия (комп цирроз)

CD3+CD4' (%) - t t tt

CD3+CD8+ (%) - ttt 444

CD3+CD4+/CD3+CD8+ 4 44 444 t

CD3+CD16+56+ (%) - - ttt "N"

CD3+CD25+ (%) - - t "N"

CD3 +CD4+CD25+ (%) - - tt t.

CD3+CD8+CD25+ (%) - tt t "N"

CD3+HLA-DR+ (%) - t tt ttt

CD3+CD4+HLA-DR+ (%) - tt "N" tt

CD3+CD8+HLA-DR+ (%) - t ttt tt

Примечание Прогностически неблагоприятные величины показателей — "N" — значения соответствуют "норме", "] - повышение значений показателя на 10% выше нормы, tt повышение значений показателя на 20% выше нормы, fTT — повышение значений показателя на 30% выше нормы, ,[ — уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы, ¿J, — уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы, 444 ~ уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы

Исследование субпопуляций естественных киллеров (CD3'CD16+56+, CD3" CD8+), выполняющих цитотоксическую функцию в противовирусном и

противоопухолевом иммунитете, показало, что изменение количества СОЗ" СТ>16+56* ЫК клеток в зависимости от стадий ХГС не носило закономерного характера По сравнению со здоровыми лицами, содержание СВЗ'СО!б+5б+ ИК клеток на начальных стадиях заболевания несколько снижалось, а затем повышалось у больных с тяжелым фиброзом У пациентов с циррозом печени (Ф4), в целом, наблюдалось уменьшение числа СВЗ"СВ16+56+ лимфоцитов В то же время, при проведении отдельного анализа у больных группы Ф4, с различной степенью компенсации цирроза, было выявлено снижение медианы относительного содержания СГ)3"С016+56+ МК клеток у больных с компенсированным циррозом {Ме-3,15) и увеличение значений количества 1ЧК клеток на стадии декомпенсированного цирроза (Ме-11,6) По мере прогрессирования заболевания, характеризующегося возрастанием степени фиброза печени, было обнаружено постепенное снижение содержания СГОСБ8! ЬГК-лимфоцитов, хотя достоверных отличий между группами в уровне этих клеток не было установлено По сравнению со здоровыми лицами зафиксировано статистически значимое (р<0,05) уменьшение абсолютного числа СОЗ"СВ8+ клеток практически на всех стадиях ХГС (Ф2, ФЗ, Ф4) Снижение в ПК количества МК-клеток, позитивных по СБ8-антигсну (СБЗХЛЭ8+), может быть использовано в качестве дополнительного критерия прогрессирования заболевания у больных ХГС В свою очередь, содержание в ПК СБЗТЛЭ16+56+ МК-клеток на разных стадиях хронического гепатита, изменялось у больных ХГС как в сторону снижения, так и повышения По-видимому, уменьшение уровня субпопуляций естественных киллеров (СБЗ"С08+, СОЗ"СВ16+56+), а также Т-киллеров (СШ+С016+56+) на начальных стадиях ХГС могло быть связано с дефицитом основного активатора МК-клеток - 1Ь-2, либо с миграцией МК-клеток в печень, со снижением их содержания в ПК В связи с этим, можно предположить, что у больных со слабым и умеренным фиброзом печени (Ф1, Ф2), ввиду снижения эффективности цитотоксического Т-клеточного ответа, обусловленного смещением иммунного баланса в сторону ТЪ2, основную роль в уничтожении инфицированных вирусом гепатоцитов играют МК-клетки и Т-киллеры Выявленная тенденция к увеличению числа МК-клеток (СЮЗ"СВ16+56+) на поздних стадиях заболевания (ФЗ, стадия декомпенсированного цирроза) совпадает с данными литературы, свидетельствующими об увеличении МК-клеток в ПК больных ХГС и наличии прямой корреляции между содержанием этих клеток й ИГА, а также фиброзом печени [Рапавшк А е! а!, 2003]. В связи с этим, возрастание уровня естественных киллеров (СБЗ"С016+56+) у пациентов с компенсированным циррозом печени может служить маркером прогрессирования болезни, характеризуя переход из компенсированного в декомпенсированный цирроз печени Обнаруженное увеличение в ПК СТО"СВ16+56+ МК клеток у больных с декомпенсированным циррозом, по-видимому, обусловлено активацией и увеличением, как в сыворотке крови, так и в ткани печени уровня цитокиноь ТЫ, в частности ГОЯ-у, являющегося, наряду с 1Ь-2, основным индуктором цитотоксической активности различных субпопуляций киллерных клет ок

Количественные изменения субпопуляций естественных киллеров могут служить дополнительными лабораторными критериями прогрессирования ХГС (таблица 4 и 5)

Таблица 4

Характеристика частоты изменений содержания субпопуляций МК-кпеток

Субпопуляции NK-клеток I стадия (слабый фиброз) II стадия (умеренный фиброз) III стадия (тяжелый фиброз) IV стадия

Комп цирроз Декомп цирроз

CD3'CD16+56+ (%) N N т и Î

CD3"CD8+ (%) N N 1 и 1

Примечание N - норма в 90%-100% случаев, f - выше нормы в 15-30% случаев, îf ~ выше нормы в 30-60% случаев, ÎÎÎ — выше нормы в более чем 60% случаев, J, - ниже нормы в 15-30% случаев, Ц - ниже нормы в 30-60% случаев, Щ — ниже нормы в более чем 60% случаев

Наиболее значимым для прогноза течения заболевания является снижение относительного количества субпопуляции NK-клеток с фенотипом CD3"CD8+ ХГС (таблица 5)

Таблица 5

Изменения уровней субпопуляций NK-клеток периферической крови у больных

ХГС, как критерии прогрессирования заболевания

Субпопуляции NK-клеток I стадия (слабый фиброз) II стадия (умеренный фиброз) III стадия (тяжелый фиброз) IV стадия (комп цирроз)

CD3 CD16+56+ (%) - Î ш "N"

CD3CD8+ (%) - il ш 1

Примечание Прогностически неблагоприятные величины показателей -"N'* - значения соответствуют "норме", t - повышение значений показателя на 10% выше нормы, I - уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы, J.J. -уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы, Щ — уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы

При изучении В-клеточного звена иммунной системы статистически значимые (р<0,05) различия, связанные с повышением относительного содержания CD 19' В-лимфоцитов в ПК больных ХГС, были обнаружены при сравнении групп Ф2-Ф4 со здоровыми лицами Это согласуется с исследованиями других авторов [Маммаев С H , 2001, Racanelli V et al, 2001, Ni J et al, 2003, Monta К et al, 2005] В то же время, достоверных отличий в количестве В-лимфоцитов между группами больных с ХГС не было зафиксировано При проведении сравнительного анализа между больными с компенсированным (Ме=8,8%) и декомпенсированным (Ме=12,8%) циррозом (группа Ф4) было выявлено статистически значимое (р<0,05) увеличение относительного числа CD19+ В-клеток у пациентов с декомпенсированным циррозом печени Кроме этого, у больных этой группы (Ф4) установлена прямая корреляция между процентным содержанием CD19+ клеток и степенью

компенсации цирроза (г=0,71, р=0,039) Считается, что повышение в ПК больных ХГС количества CD19' В-лимфоцитов свидетельствует о сдвиге иммунного ответа в сторону Th.2 [Ивашкин ВТ и соавт , 2001, Маммаев С H, 2001, Monta К et al, 2005] По данным ряда авторов, развитие Th2 ответа при ХГС (неэффективного для полной элиминации вируса) является неадекватной реакцией иммунной системы [Жукова С) Б , 2003, Рязанцева H В и соавт , 2006] В других работах активацию гуморального свена иммунитета при ХГС объясняют как реакцию организма, направленную' на снижение воспалительной активности и сдерживание развития цирроза [Racanelli V et al, 2001] По данным наших исследований, несмотря на некоторое повышение CD19+ В-лимфоцитов у больных ХГС, отмечалось постепенное снижение относительного числа CD3 CD25 ' активированных В-лимфоциюв У больных с тяжелым фиброзом (ФЗ) наблюдалось статистически значимое снижение (р<0,05) количества CD3"CD25+ клеток, как по сравнению с пациентами со слабым фиброзом (Ф1), так и со здоровыми лицами Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельств »тощими о том, что у больных ХГС с высокой степенью фиброза, несмотря на увеличение содержания В-клеток, число активированных В-лимфоцитов не повышается [Ni J et al, 2003] По-видимому, это связано с разобщением процессов пролиферации В-лимфоцитов и их активации антигенами HCV, в связи, с чем происходит накопление в периферической крови наивных неактивированных В-клеток При сравнительном анализе групп больных ХГС (Ф1-Ф4) по количеству В-лимфоцитов, экспрессирующих СП95-антиген (CD19+CD95+), статистически значимых различий выявлено не было В то лее время, относительное содержание CD19+CD95+ лимфоцитов у больных на всех стадиях ХГС было достоверно выше (р<0,05), чем у здоровых лиц Повышение CD19+CD95+ В-клеток в группах Ф1 и Ф2 наблюдалось в 46,2% случаев, ФЗ и Ф4 - в 30% и 22,2%, соответственно Эти данные свидетельствуют о том, что частота выявления увеличенного содержания С095-позигивных В-клеток понижается с ростом степени фиброза Также, как и в случае прямой взаимосвязи содержания CD95+ лимфоцитов с уровнем CD25+ Т-хелперов и ЦТЛ, с помощью корреляционного анализа была обнаружена положительная умеренная связь (г=0,48, р=0,001) между содержанием CD95+ лимфоцитов и активированных CD3"CD25+ В-клеток На основании этого, можно предположить, что повышенная экспрессия СП95-аитигена служит целям контроля субпопуляции активированных лимфоцитов

Таким образом, можно констатировать, что на начальных стадиях ХГС происходит смещение иммунного баланса в сторону ТЪ2-ответа, что является одной из составляющих механизма, препятствующего повреждению печени цитотоксическими лимфоцитами и сдерживающего развитие фиброза При низкой концентрации антигена В-клетки выполняют, главным образом, роль АПК, так как другие типы антигенпредставляющих клеток не могут захватить достаточное для представления количество антигенного материма [Ройт А , 2000] Поскольку в данном исследовании у больных ХГС со слабым (Ф1) и умеренным фиброзом (Ф2) низкая вирусная нагрузка наблюдалась в 52,9% и 40% случаев,

соответственно, можно предположить, что у этих пациентов роль АПК выполняли, главным образом, В-лимфоциты Представляя антиген, В-клетки стимулировали нулевые Т-хелперы к дифференгдаровке в ТЪ2-клетки, вырабатывающие цитокины необходимые для дальнейшей реализации В клеточного иммунитета В то же время, повышение количества В-лимфоцитов у больных с высокой степенью фиброза, по-видимому, происходило за счет аккумуляции наивных В-клеток, так как число активированных В-лимфоцигов не увеличивалось, а снижалось В этой связи, увеличение В-клеток на начальных стадиях болезни можно считать благоприятным, а на поздних стадиях -неблагоприятным признаком, характеризующим прогрессию заболевания В свою очередь, уменьшение относительного числа активированных В-лимфоцитов (С1)3" СВ25+) у больных ХГС, по-видимому, следует расценивать как прогностически неблагоприятный признак

Количественные изменения со стороны субпопуляций В-клеток могут служить дополнительными лабораторными критериями прогрессирования ХГС (таблица 6 и 7)

Таблица 6

Характеристика частоты изменений содержании субпопуляций В-лимфоцитов

периферической крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания

Субпопуляции В-лимфоцитов I стадия (слабый фиброз) II стадия (умеренный фиброз) III стадия (тяжелый фиброз) IV стадия

Комп цирроз Дет омп цирроз

СБ19+ (%) Т тт Т/4 N п

СБЗ С025+ (%) N 4 4 4 1"

С0!9*С095+ (%) П П Т Т тт

Примечание N - норма в 90%-100% случаев, | - выше нормы в 15-30% случаев, И ~ выше нормы в 30-60% случаев, ИТ ~~ выше нормы в более чем 60% случаев, 4 - ниже нормы в 15-30% случаев, 44 - ниже нормы в 30-60% случаев, 414 — ниже нормы в более чем 60% случаев

Таблица 7

Изменения уровней субпопуляций В-лимфоцитов периферической крови у

больных ХГС, как критерии прогрессирования заболевания

Субпопуляции В-лимфоцитов I стадия (слабый фиброз) II стадия (умеренный фиброз) 1П стадия (тяжелый фиброз) IV стадия (комп цирроз)

СШ9+ (%) ттт тт ТТТ

С03"С025+ (%) 4 44 444

Примечание Прогностически неблагоприятные величины показателей — "Ы" - значения соответствуют "норме", ТТ ~ повышение значений показателя на 20% выше нормы, ||| — повышение значений показателя на 30% выше нормы, 4 - уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы, 44 — уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы, 444 уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы

Из таблицы 7 видно, что наиболее значимым для прогноза течения заболевания является снижение относительного содержания субпопуляции активированных В-клеток с фенотипом С1)ЗЧИ)25+

Определение концентраций иммуноглобулинов классов М, А, О и подклассов (1§01-1«04) в сыворотке крови показало, что максимальные концентрации ^М, ^А и ígG отмечались у больных с циррозом печени Статистически значимые различия (р<0,05) в содержании и ^М у пациентов с циррозом (Ф4) были зафиксированы по сравнению с,прутами больными ХГС (Ф1-ФЗ) и группой здоровых лиц В результате корреляционного анализа были установлены прямые статистически значимые умеренной силы взаимосвязи между стадией заболевания и концентрацией IgA (г=0,26, р=0,018), а также 1^0 (г=0,24, р=0,027) Определение подклассов (^01-^04) в сыворотке крови проводилось только у больных на начальных стадиях ХГС (Ф1, Ф2) При сравнении этих групп было обнаружено достоверное различие (р<0,05), связанное с повышением концентрации подклассов иммуноглобулина в (1^02, ^ОЗ и 1§04) у пациентов с умеренным фиброзом (Ф2) Поиск корреляций между стадией заболевания и содержанием в сыворотке крови различных подклассов ^О позволил обнаружить прямую различной силы корреляционную зависимость концентраций %02, ^ОЗ и ^04 от выраженности фиброза в печени При этом наиболее сильная взаимосвязь наблюдалась между степенью фиброза печени и уровнем ^вЗ (г=0,43, р=0,000), а также были выявлены прямые умеренные статистически значимые корреляции содержания 1^02 (г=0,32, р=0,005) и 1«С4 (г=0,38, р=0,007) подклассов с фиброзом в печени Полученные в результате сравнительного и корреляционного анализов данные свидетельствовали о нарастающей активации В-клеточного иммунного ответа по мере прогрессирования НСУ-инфекции В то же время, статистически значимых корреляционных взаимосвязей между содержанием В-лимфоцитов (СШ.9+), активированных В-лимфоцитов (СВЗ'СОгб"^ с одной стороны и уровнями иммуноглобулинов основных классов ^А, и с другой, не было

обнаружено

Максимальные значения уровней ЦИК всех трех видов наблюдались у больных с циррозом печени (Ф4) Только у этих пациентов, по сравнению с другими группами больных ХГС (Ф1-ФЗ), отмечалось статистически значимое увеличение уровней как среднемолекулярных, так и низкомолекулярных ЦИК, которые превышали пределы нормы у больных группы Ф1 в 56,3%, Ф2 - в 47,8%, ФЗ - в 60%, а Ф4 - в 100% случаев При анализе взаимосвязи степени фиброза и содержания различных типов ЦИК в сыворотке крови были выявлены прямые умеренные корреляционные связи уровней среднемолекулярных (г=0,37, р=0,007) и низкомолекулярных (г=0,26; р=0,047) ЦИК и стадии заболевания Известно, что низкомолекулярные ИК могут избегать захвата фагоцитами, так как менее эффективно фиксируют комплемент и, за счет этого, хуже связываются с рецепторами для комплемента на мембранах эритроцитов В результате чего они способны циркулировать в крови более длительное время и образовывать депозиты под эндотелием сосудов, так как в отличие от высокомолекулярных ЦИК, могут проникать сквозь базальную мембрану [Фрейдлин И С и соавт,

1999] В связи с этим, выявленное повышение в сыворотке крови уровня низкомолекулярных РЖ у больных ХГС может быть одним из условий развития у этой категории больных иммунопатологических реакций, что согласуется с литературными данными об ассоциации Н СУ-инфекции с рядом аутоиммунных заболеваний [Лесняк О М и соавт, 1999]

Изменения гуморальных факторов В-клеточного звена иммунной системы также могут служить дополнительными лабораторными критериями прогрессирования ХГС (таблица 8 и 9) Из таблицы 9 видно, что наиболее значимым для прогноза заболевания у больных ХГС является нарастание в сыворотке крови концентраций иммуноглобулинов классов А, в, подклассов (%С2-1^04) и всех типов ЦИК (таблица 9)

Таблица 8

Характеристика частоты изменений концентраций иммуноглобулинов классов М, А, в, подклассов ^С (Тщ01 ^04) и ЦИК в сыворотке крови у больных ХГС на

различных стадиях заболевания

I стадия II стадия III сгадия IV стадия

Показатели (слабый (умеренный (тяжелый Комп Декомп

фиброз) фиброз) фиброз) цирроз цирроз

%М (г/л) Ч N N N ÎÎ

1ЙА (г/л) Ч N N t î

1йО (г/л) Ч N N î ÎÎ

1*01 (г/л) ч N - -

^2 (г/л) ч î - - -

1фЗ (г/л) ч ÎÎ - - -

%04 (г/л) N î - - -

ЦИК выс (отн ед ) N N N ÎÎ ÎÎÎ

ЦИК среди (отн ед ) Î t Г îtî îîî

ЦИК низ (отн ед ) Ч tt tt îîî îtî

Примечание N - норма в 90%-100% случаев, Î - выше нормы в 15-30% случаев, ft - выше нормы в 30-60% случаев, ТТТ — выше нормы в более чем 60% случаев, ]. — ниже нормы в 15-30% случаев, Ц - ниже нормы в 30-60%'Случаев, 141 — ниже нормы в более чем 60% случаев

В целом, полученные данные свидетельствуют об активации В-клеточного звена иммунной системы, связанной с прогрессированием ХГС, и тесной взаимосвязи изменений гуморального иммунитета, обусловленных иммунопатогенезом заболевания Они согласуются с данными большинства исследователей, подтверждая выводы об увеличении количества В-лимфоцитов (CD19+) в периферической крови и наличии обратной корреляции между содержанием всех циркулирующих В-клеток и частью В-клеток, экспрессирующих активационные маркеры [Лесняк ОМ и соавт , 1999, Racanelli V et aï, 2001, Ni J et al, 2003, Monta К et al, 2005] Этот рост общего числа В-лимфоцитов у больных ХГС связывают с активацией гуморальных факторов иммунной системы и сдвигом в сторону Th2 ответа [Маммаев СН, 2001, Ивашкин В Т и соавт, 2002, Наследникова И О и соавт, 2005, Monta К et al,

2005] Выявленные в процессе исследования снижение содержания активированных В-лимфоцитов (СОЗТЮ25+) в ПК, повышение концентраций ^А, Гдв, ^62, ^вЗ, ^04, а также уровней средне- и низкомолекулярных ЦИК в сыворотке крови, коррелирующие со степенью фиброза печени у больных ХГС, позволяет сделать вывод о возможности их использования в качестве иммунологических критериев прогрессирования хронической НСУ-инфекции

Таблица 9

Изменения концентраций иммуноглобулинов классов А, в, подклассов (\gG2-и ЦИК в сыворотке крови у больных ХГС как критерии прогрессирования

заболевания

I стадия II стадия III стадия IV стадия

Показатели (слабый (умеренный (тяжелый (комп

фиброз) фиброз) фиброз) цирроз)

1вА (г/л) - - ТТ ТТТ

ДО (г/л) - - ТТ ттт

дог (г/л) Т - - -

ДОЗ (г/л) тт - -

ДО4 (г/л) т - - -

ЦИКвыс (отн ед) - - ттт ТТ

ЦИК среди (отн ед) г t ТТ ттт

ЦИК низ (отн ед ) т Т ТТ ттт

Примечание Прогностически неблагоприятные величины показателей -Т - повышение значений показателя на 10% выше нормы, ТТ ~ повышение значений показателя на 20% выше нормы, ТТТ ~ повышение значений показателя на 30% выше нормы

Известно, что цитокины являются продуктами активированных клеток иммунной системы и действуют как растворимые медиаторы межклеточных взаимодействий Покоящиеся клетки практически не продуцируют цитокины В данном исследовании в сыворотке крови больных ХГС с различной степенью фиброза были изучены изменения следующих цитокинов IFN-a, IFN-y, IL-lfS, IL-4, IL-6, IL-10 и TNF-a В результате было установлено, что у больных ХГС по мере прогрессирования заболевания отмечалось повышение содержания в сыворотке крови IFN-y, IL-10 и TNF-a Увеличение концентрации IFN-y было характерно, в основном, для более поздних стадий заболевания (ФЗ, Ф4), что подтверждалось статистически значимыми различиями между группами больных ХГС Ф1 и Ф4 (р<0,05), а также Ф2 и Ф4 (р<0,05) Значения медианы (Me) уровня IFN-y в исследуемых группах составили здоровые - Ме=7,43 пг/мл, Ф1 - Ме=9,96 пг/мл, Ф2 - Ме= 11,86 пг/мл, ФЗ - Ме=12,1 пг/мл, Ф4 - Ме=21,02 пг/мл Была выявлена прямая статистически значимая связь (г=0,25, р=0,05) между степенью фиброза и содержанием IFN-y Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что уровень IFN-y в сыворотке крови при циррозе печени и ГЦК превышает таковой при ХГС [Дьяченко А А и соавт , 2001, Navas S , Martm J, 1998, Huang Y S et al, 1999, Kawakami Y et al, 2001] Также есть данные, что прогрессирующее повреждение печени при ХГС

коррелирует с увеличением уровня внутрипеченочных цитокинов ТЪ 1 -типа (1ИЧ-у) [Рязанцева Н В и соавт, 2006] Учитывая тот факт, что изменение баланса цитокинов ТМЛЪ2 на локальном и системном уровне носит однонаправленный характер, определение сывороточной концентрации 1РЫ-у в динамике у конкретного больного можно использовать как маркер прогрессирования ХГ С

Такие же закономерности были характерны для уровней 11.-10, концентрация которого в сыворотке крови увеличивалась с ростом степени фиброза Об этом свидетельствовали статистически значимые различия между группами Ф1 и Ф4 (р<0,05), а также достоверная прямая корреляционная взаимосвязь между содержанием 1Ь-10 и стадией заболевания (г=0,?5, р=0,048) Наряду с этим наблюдалась тенденция к возрастанию частоты случаев отклонения от нормы концентрации 1Ь-10 на поздних стадиях заболевания (Ф1 - в 9%, Ф2 - в 36,4%, ФЗ - в 35,7% и Ф4 - в 55,6% случаев) Полученные данные согласуются с результатами других авторов [Наследникова И О и соавт, 2005, Скляр Л Ф и соавт, 2005, Рязанцева Н В и соавт , 2006, АЬайу В е! а1, 2003] и позволяют рекомендовать определение сывороточной концентрации 1Ь-10 для дифференцирования стадий заболевания

У больных ХГС обнаружено связанное с ростом степени фиброза печени повышение содержания ТЫГ-сх в сыворотке крови Так, статистически значимые различия в концентрации ТЫБ-а были установлены между группами больных ХГС Ф1 и Ф2 (р<0,01), Ф1 и ФЗ (р<0,05), Ф1 и Ф4 (р<0,01) При корреляционном анализе выявлена прямая сильная взаимосвязь между степенью фиброза и уровнем Т№-а (г=0,41, р=0,000) На основании этих данных, которые также согласуются с литературными [Логинов А С и соавт , 2003, Собчак Д М и соавт, 2004, Красавцев Е Л и соавт , 2005, Скляр Л Ф и соавт , 2005], можно сделать вывод, что определение в динамике содержания Т№-а в сыворотке крови больных ХГС может быть использовано как лабораторный критерий дифференциальной диагностики заболевания

При анализе содержания 1Ь-4 и 1Ь-1|3 в сыворотке крови больных ХГС статистически значимых отличий между различными группами больных ХГС не было выявлено В тоже время, у значительной части больных отмечалось увеличение концентрации этих цитокинов Так, в группах Ф1-Ф4 повышение содержания 1Ъ-4 наблюдалось у 63,6%, 30%, 57,1% и 25% больных ХГС, а з'ровня 1Ь-1(3 - в 22,2%, 23,5%), 50% и 28,6% случаев, соответственно Несмотря на отсутствие значимых отличий между больными ХГС групп Ф1-Ф4, установлена прямая корреляционная взаимосвязь между степенью фиброза и содержанием 1Ь-1(3 (г=0,25, р=0,041) На основании этих данных, согласующихся с литературными [Дьяченко А А и соавт, 2001, Логинов АС и соавт, 2003, Красавцев ЕЛ и соавт, 2005, Скляр ЛФ и соавт, 2005] можно предположить, что увеличение концентрации II,-1(3 в сыворотке крови больных (Ф1, Ф2) отражает прогрессию ХГС на начальных стадиях заболевания

Уровни цитокинов могут быть использованы в качестве дополнительных критериев дифференцирования стадий ХГС (таблица 10)

Таблица 10

Характеристика частоты изменений концентраций цитокинов в сыворотке крови у _больных ХГС на различных стадиях заболевания_

Цитокины I стадия (слабый фиброз) II стадия (умеренный фиброз) III стадия (тяжелый фиброз) IV стадия

Комп цирроз Декомп цирроз

IFN-y (пг/мл) N N N т Т

IFN-a (пг/мл) N N N N N

IL-4 (пг/мл) ТТ Т ТТ - -

IL-10 (пг/мл) N ГТ ТТ ТТ ттт

IL-1|3 (пг/мл) ! т ТТ т т

TNF-a (пг/мл) N N N т т

IL-6 (пг/мл) ! N N N N

Примечание N - норма в 90%-100% случаев, | - выше нормы в 15-30% случаев, ТТ ~ выше нормы в 30-60% случаев, - выше нормы в более чем 60% случаев, | - ниже нормы в 15-30% случаев, Ц - ниже нормы в 30-60% случаев, Ш - ниже нормы в более чем 60% случаев

Изменения концентраций 1Ь-10, 'ПЧР-а и №N-7 в сыворотке крови на любой стадии ХГС могут рассматриваться в качестве критериев прогноза заболевания (таблица 11)

Таблица И

Изменения концентраций цитокинов в сыворотке крови у больных ХГС, как

I стадия II стадия III стадия IV стадия

Цитокины (слабый (умеренный (тяжелый (комп

фиброз) фиброз) фиброз) цирроз)

IFN-y (пг/мл) - - ТТТ ТТТ

IL-4 (пг/мл) т ТТТ - -

IL-10 (пг/мл) т т ТТ ТТТ

IL-lp (пг/мл) т ТТ ТТ -

TNF-a (пг/мл) - - т ТТ

Примечание Прогностически неблагоприятные величины показателей — t - повышение значений показателя на 10% выше нормы, ft - повышение значений показателя на 20% выше нормы, ТТТ ~ повышение значений показателя на 30% выше нормы

Поскольку IL-4 и IL-10 являются цитокинами ТЬ2-типа и участвуют в реализации 33-клеточного иммунитета, можно сделать предположение о доминировании гуморального иммунного ответа у больных ХГС, имеющих повышенные концентрации этих цитокинов в сыворотке крови Полученные данные свидетельствуют о высокой продукции противовоспалительных цитокинов в условиях персистенции HCV, что согласуется с результатами других авторов [Логинов А С и соавт , 2001, Ивашкин В Т и соавт, 2002, Приймяги Л С и соавт, 2002, Царегородцева Т М и соавт, 2003, Fan X G et al, 1998] По-

видимому, на начальных этапах заболевания биологическое значение функциональных изменений в иммунной системе, обусловленных преобладанием продукции интерлейкинов ТЬ2-типа, состоит в сдерживании репликации вируса, а также ограничении интенсивности и распространенности воспаления в печени В свою очередь, на поздних стадиях ХГС, продолжающееся повышение уровней IL-4 и IL-10, вызванное постоянкой антигенной стимуляцией, реализуется активным фиброгенезом и прогрессироваяием заболевания Нарастание уровней цитокинов ТЪ2-типа (IL-4 и IL-10) часто было взаимосвязано с увеличением концентрации таких провоспалительных цитокинов как IL-lp и TNF-a Более выраженное повышение уровня провоспалительных цитокинов на поздних стадиях ХГС (у больных групп ФЗ, Ф4) отмечалось и другими исследователями, обнаружившими их увеличение у больных с циррозом печени и ГЦК [Дьяченко А А и соавт , 2001, Huang Y S et al, 1999]

Таким образом, рост концентраций IL-lp и TNF-a происходил в соответствии со степенью выраженности патологического процесса в печени и, вероятно, прогрессией ХГС, в целом Обнаруженное в результате исследования увеличение у больных ХГС концентрации в сыворотке крови цитокинов ТЬ2-типа (IL-4, IL-10), провоспалительных цитокинов (IL-lp, TNF-a), связанное с возрастанием степени фиброза, позволяет использовать их в качестве дополнительных лабораторных критериев прогноза заболевания Повышение IFN-у (цитокина Thl-типа) на поздних стадиях ХГС (ФЗ, компенсированный цирроз) свидетельствует о его возможном участии в патогенезе повреждений печени при хронической HCV-инфекции Необходимо еще раз отметить, что IFN-y, (также как и IL-2) является основным индуктором цито токсической активности различных субпопуляций кишерных клеток, среди которых, могут быть клоны аутореактивных эффекторных клеток, участвующих в реализации аутоиммунных реакций В связи с этим, определение концентрации IFN-y также может служить признаком прогрессирования болезни

Роль нейтрофилов в противовирусном иммунитете реализуется участием в модуляции иммунных реакций через синтез и продукцию иммуномодуляторных цитокинов Изучая изменения функциональной активности нейтрофилов, можно охарактеризовать воздействие вирусов и оценить устойчивость организма к бактериальной инфекции [Тотолян А А, Фрейдлин И С , 2000] Исследования показали, что по сравнению со здоровыми лицами для всех больных ХГС (группы Ф1-Ф4) было характерным незначительное повышение активности кислородзависимых систем бактерицидности (НСТ) и снижение переваривающей функции нейтрофилов (ПЗФ) Наиболее значимым было постепенное снижение значений лизосомально-катионного теста (JIKT) по мере прогрессирования фиброза печени у больных ХГС Это подтверждалось статистически достоверными различиями (р<0,05) между больными групп Ф1 и Ф4 Анализ показал, что с ростом степени фиброза ФЧ статистически значимо уменьшалось (г=-0,26, р=0,016), а ПЗФ - увеличивался (г=0,25, р=0,025) В результате корреляционного анализа были установлены статистически значимые обратные умеренные взаимосвязи между процентным содержанием в ПК нейтрофилов и

уровнем спонтанного НСТ теста (г=-0,27, р=0,018), и ЛКТ (г=-0,25, р=0,032) Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ХГС в ответ на снижение в ПК количества нейтрофилов происходит компенсаторное повышение активности кислородзависимых и кислороднезависимых систем бактерицидности фагоцитов Таким образом, при изучении активности систем бактерицидности нейтрофилов было установлено, что у больных ХГС наблюдается активация кислородзависимых систем бактерицидности фагоцитов На начальных стадиях заболевания (Ф1, Ф2) отмечается усиление активности кислороднезависимых систем бактерицидности и поглотительной способности нейтрофилов В дальнейшем, по мере прогрессирования фиброзного процесса происходит их постепенное снижение до нормы и затем ниже В тоже время, отмечалась прямая корреляция между уровнем ПЗФ и стадией заболевания Так, у больных с высокой степенью фиброза (ФЗ и Ф4) переваривающая способность нейтрофилов достоверно увеличивалась по сравнению с пациентами с начальными стадиями фиброза печени (Ф1, Ф2) По-видимому, это связано с компенсаторным повышением функциональной активности нейтрофилов на поздних стадиях заболевания

Настоящее исследование продемонстрировало, что расширенный вариант иммунологического обследования (таблица 12) позволяет использовать изменения иммунной системы для дифференцирования стадий ХГС Так, ключевыми иммунологическими показателями при дифференцировании I и II стадии ХГС являются ^вЗ, ЮНО, СОЗ"СП25+ (рисунок 1) Для дифференциальной диагностики III стадии ХГС и компенсированного цирроза печени необходимо определять содержание СБЗ+С08+, СОЗ+СШ6+56+, ТЫР-а, (рисунок 2) Для дифференциации степени компенсации цирроза печени у больных ХГС необходимо исследовать содержание СОЗ+СВ4+, СГЗЗ+СВ8+, СВЗчХ>16+56+, СБЗ СБ4+/СВЗ1СБ8+ (рисунок 3) На основании первичного иммунологического обследования можно определить преобладающий характер иммунного ответа (ТЫ- или ТЬ2-типа) и прогнозировать вероятный темп прогрессирования заболевания (рисунок 4) Выявленные в настоящем исследовании связи между факторами иммунной системы и степенью фиброза, позволяют использовать характерные изменения некоторых иммунологических показателей в качестве критериев прогрессирования заболевания (таблица 13)

Таблица 12

Характеристика частоты изменений наиболее информативных иммунологических

показателей у больных ХГС на различных стадиях заболевания _(расширенный вариант иммунологического обследования)___

Показатели иммунной системы ХГС

I стадия (слабый фиброз) II стадия (умеренный фиброз) III стадия (тяжелый фиброз) IV стадия

Комп цирроз Декомп цирроз

CD3+CD4+ (%) N N Т т ТТТ

CD3+CD8+ (%) N N N ТТ 444

CD3+CD4+/CD3+CD8+ 1 U 1 444 ТТТ

CD3+CD16+56+ (%) N N N ТТТ 44

CD3+CD25+ (%) N N N Т N

CD3+HIA-DR+ (%) N N т Т ТТ

CD3 CD8+ (%) N N 4 44 4

CD19+ (%) т ТТ Т/4 N ТТ

CD3'CD25" (%) N 4 1 4 444

IgM (г/л) N N N N ТТ

IgA(r/л) N N N т Т

IgG (г/л) N N N т ТТ

IgG2 (г/л) N N - - -

IgG3 (г/л) N ТТ - - -

IgG4 (г/л) N Т - - -

ДИК выс (отн ед ) N N N ТТ ТТТ

ЦИК среда (отн ед) t т т ТТТ ТТТ

ЦИК низ (отн ед ) ТТ ТТ ТТ ТТТ ТТТ

IFN-y (пг/мл) N N N т т

IL-4 (пг/мл) tt Т ТТ - -

IL-10 (.пг/мл) N ТТ ТТ ТТ ТТТ

TNF-a (пг/мл) N N N т т

Примечание N - норма в 90%-100% случаев, | - выше нормы в 15-30% случаев, ТТ - выше нормы в 30-60% случаев, ЦТ ~ выше нормы более 60% случаев, 4 - ниже нормы в 15-30% случаев, Ц - ниже нормы в 30-60% случаев, 4Д - ниже нормы более 60% случаев

Рисунок 1 Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на I и II стадии заболевания

Рисунок 2 Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии тяжелого фиброза и компенсированного цирроза печени

Рисунок 3 Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии компенсированного и декомпенсированного цирроза печени

Примечание N - норма; Т - выше нормы, | - ниже нормы

Рисунок 4 Доминирующие типы иммунного ответа и их связь с темпами прогрессирования заболевания у больных ХГС

Таблица 13

Перечень иммунологических критериев прогрессирования заболевания __у больных ХГС__

Показатели иммунной системы ХГС

I стадия (слабый II стадия (умеренный III стадия (тяжелый IV стадия (компенсир

фиброз) фиброз) фиброз) цирроз)

СБЗ+С04+ (%) - т т ТТ

СВЗ+С08+ (%) - - ттт 144

СОЗ+С04+/СБЗ+С08+ 4 44 444 Т

С03+С016+5б+ (%) - - ТТТ "Ы"

СБЗ'НЬА-т1 (%) - Т ТТ ГТТ

СОЗСТ>8+ (%) - 44 444 4

СБЗ'СВ25+, (%) 4 44 "И" 444

1§А (г/л) - - ТТ ГТТ

ДО (г/л) - - ТТ ГТТ

ДО2 (г/л) Т - - -

ДОЗ (г/л) ТТ - - -

ДО4 (г/л) т - - -

ЦИК средн (отн ед ) т Т ТТ ТТТ

ЦИК низк (отн ед ) ! Т ТТ ттт

ШЫ-у (пг/мл) - - ТТ ТТТ

1Ь-10 (пг/мл) ! т ТТ

ЮТ~а (пг/мл) ? - т ТТ

Примечание Прогностически неблагоприятные величины показателей — "Ы" — значения соответствуют "норме", | — повышение значений показателя на 10% выше нормы, ТТ - повышение значений показателя на 20% выше нормы, ЦТ - повышение значений показателя на 30%) выше нормы, 4 - уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы, 44 — уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы, — уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы

В настоящее время возраст в момент инфицирования рассматривается многими исследователями в качестве наиболее весомого предиктора течения НСУ-инфекции Установлено, что при заражении в возрасте старше 40 лет отмечаются более быстрые темпы прогрессии ХГС с реализацией в цирроз печени [Ильина Е Н и соавт , 2001, Царегородцева Т М и соавт, 2003; Роупагс! Т й а1, 1997] В настоящем исследовании у больных возрастной группы 40-60 лет были выявлены статистически значимые корреляции между возрастом пациента и содержанием СОЗ+СВ16+56+ Т-киллеров (г=0,41, р=0,000), активированных Т-хелперов СТ)4+СБ25+ (г=0,33, р=0,038), цитотоксических Т-лимфоцитов СВ8+НЬА-1Ж+ (г=0,31, р=0,049) ПК, а также уровнем в сыворотке крови низкомолекулярных ЦИК (г=0,33, р=0,023) Наряду с этим, повышение низкомолекулярных ЦИК также сочеталось с ростом активности АлАТ (г=0,30, р=0,039) и высокой вирусной нагрузкой (1=0,49, р=0,02) Эти данные свидетельствуют о том, что более быстрое прогрессирование заболевания у больных старше 40 лет связано с активацией Т-клеточного иммунитета

Помимо изучения изменений иммунной системы у больных ХГС с различной степенью фиброза проводилось иммунологическое исследование пациентов с генотипами НСУ За и 1Ь В литературе отсутствуют данные о взаимосвязи субтипа НСУ с исследованными в представленной работе иммунологическими параметрами В результате изучения Т-клеточного звена иммунной системы было установлено, что у больных ХГС с генотипом НСУ 1Ь по сравнению с пациентами, имеющими субтип НСУ За, отмечалось статистически значимое повышение содержания активированных СВЗ+НЬА-ОК." Т-лимфоцитов (р<0,05) и СВЗ+СБ16+56+ Т-киллеров (р<0,05) Этот факт был подтвержден данными корреляционного анализа, зафиксировавшим у пациентов с генотипом НСУ 1Ь наличие взаимосвязи с более высоким содержанием СБЗ: С016+56+ Т-киллеров (г=0,29, р=0,05) и СБЗ+НЬА-01Г Т-лимфоцитов (г=0,37, р=0,011), в отличие от больных с субтипом НСУ За Исследование В-клеточного звена иммунной системы показало, что по сравнению с больными с генотипом НСУ За у пациентов с субтипом НСУ 1Ь статистически значимо (р<0,05) увеличивалась концентрация среднемолекулярных ЦИК Поиск корреляций показал, что более высокие уровни всех типов ЦИК ассоциировались с генотипом НСУ 1Ь Таким образом, полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что у больных с генотипом НСУ 1Ь наблюдаются более выраженные изменения иммунной системы увеличение содержания СБЗ+СЮ16+56+ Г-киллеров, активированных СВЗ+НЬА-ВЯ+ Т-лимфоцитов, ЦИК всех типов, по сравнению с больными ХГС, имеющими субтип НСУ За Как уже было показано, именно, эти факторы иммунной системы были связаны со степенью выраженности фиброза и старшим возрастом Вполне вероятно, что выявленные в результате исследования изменения иммунной системы у болыных ХГС с генотипом НСУ 1Ь обусловлены большей степенью выраженности фиброза и возрастными особенностями, характерными для этой группы больных

ВЫВОДЫ

1 Изменения клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности у больных ХГС со слабой и умеренной степенью фиброза печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, снижением в периферической крови уровней CD3+CD16+56+ субпопуляций Т-лимфоцитов, а также CD3"CD16+56+, CD3"CD8+ естественных киллеров, повышением CD3+CD95+ субпопуляций Т- и CD19+, C'D 19+CD95+ субпопуляций В-лимфоцитов, содержания IgM, IgG, IgG3, IL-ip, TNF-a, IL-4, IL-6, IL-10, ЦИК всех типов и нарушениями функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющимися повышением уровней кислородзависимой бактерицидности, активности неферментных лизосомально-катионных белков, поглотительной способности и снижением завершенности фагоцитоза

2 Изменения иммунной системы у больных ХГС с тяжелой степенью фиброза печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, снижением в периферической крови уровней CD3CD25"1" субпопуляций В-лимфоцитов и CD3'CD8 естественных киллеров, повышением уровней CD3+CD95+ субпопуляции Т- и CD19+, CD19+CD95+ субпопуляций В-лимфоцитов, содержания IgA, ЦИК всех типов, IL-ip, TNF-a, IL-4, IL-10, а также нарушениями функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющимися повышением уровня кислородзависимой бактерицидности, поглотительной способности и снижением завершенности фагоцитоза

3 Изменения иммунной системы у больных ХГС с циррозом печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, повышением в периферической крови уровней CD3+CD4+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD95+ субпопуляций Т-лимфоцитов, CD19+ В-лимфоцитов, снижением CD3+CD8+, CD3" CD25+, CD3"CD8+ лимфоцитов, уровня спонтанного НСТ-теста, повышением содержания IgG, IgA, IgM, ЦИК всех типов, IL-ip, TNF-a, IFN-y, IL-10

4 Изменения иммунной системы у больных ХГС с субтипом HCV lb характеризуются достоверным, по сравнению с больными ХГС с генотипом HCV За, повышением количества CD3+CD16+56+ Т-киллеров, активированных CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов, высоко-, средне- и низкомолекулярных ЦИК

5 Особенностями иммунопатогенеза ХГС со слабой и умеренной степенями фиброза печени является доминирование гуморального типа иммунного ответа, проявляющегося ростом числа (CD19+) В-лимфоцитов, иммуноглобулинов М, G и его подклассов G2, G3, G4, ЦИК, цитокинов Th2 профиля (IL-4, IL-10), сопровождающееся снижением количества CD3+CD16+56+ Т-лимфоцитов и CD3" CD8+, CD3"CD16+56+ субпопуляций NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности

6 Особенностями иммунопатогенеза ХГС на стадии цирроза печени, по сравнению со стадией тяжелого фиброза, являются повышение содержания CD3+CD4+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, уровней

иммуноглобулинов М, в, ЦИК всех типов, Т№-а, 1ИЧ-у, а также снижение числа СОЗ+СЮ8+ Т-лимфоцитов и СБЗ'СШ4, СОЗ'СБ16+56+ субпопуляций ЫК-клеток

7 У больных ХГС на стадии развития декомпенсированного цирроза печени возникают достоверные, по сравнению с больными ХГС с компенсированным циррозом печени, дифференциально-диагностически шачимые изменения иммунной системы снижение уровня СОЗ+СВ8", СБЗ+С016+56+ и повышение уровня СВЗ+СТ>4+ субпопуляций Т-лимфоцитов

8 У больных ХГС отмечаются патогенетически значимые изменения иммунной системы, характеризующиеся взаимосвязью процессов активации, что отражается возрастанием уровней активированных С08:СТ)25+, СТ)4+С025+, С08+НЬА-ЕЖ+, С04'НЬА-ВК+ субпопуляций Т-лимфоцитов, и апоптоза яммунокомпетентных клеток, проявляющегося увеличением числа Т-пимфоцитов, экспрессирующих Рав-рецептор (СБЗ+С095+)

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 В целях дифференциальной диагностики между ХГС со слабым фиброзом и ХГС с умеренным фиброзом печени рекомендуется использовать «Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на I и II стадии заболевания», включающий определение в периферической крови содержания ^ОЗ, 1Ь-10, СОЗ" СБ25+ Для прогнозирования перехода ХГС со слабым фиброзом в ХГС с умеренным фиброзом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания СВЗ+С04+, СБЗ+С08+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения СБЗ+СВ4+/СОЗ+СВ8+, СВЗ"СП25+ субпопуляции В-лимфоцитов, 1^2, ^вЗ, 1^Сг4, ЦИК всех типов, ТОТ-а, 1Ь-10

2 Для прогнозирования перехода ХГС с умеренным фиброзом в ХГС с тяжелым фиброзом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания СОЗ+СБ4+, СПЗХП8+, СБЗ+Н1А-ВК+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения СВЗ+СП4+/СБЗ+С08+, СБЗ"СБ25+ субпопуляции В-лимфоцитов, СОЗ~СВ8+ №С-клеток, ЦИК всех типов, ГЬ-Ю

3 В целях дифференциальной диагностики между ХГС с тяжелым фиброзом и ХГС с компенсированным циррозом печени рекомендуется использовать «Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии тяжелого фиброза и компенсированного цирроза печени», включающий определение в периферической крови содержания СБЗ+СБ8+, СБЗ+СИ16+5б+, ТОТ-а, 1НЧ у, Для прогнозирования перехода ХГС с тяжелым фиброзом в ХГС с компенсированным циррозом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания СВЗ+СВ4+, СБЗ+СБ8+, СБЗ+СБ16+56+, СБЗ+Н1_А-1Ж+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения СОЗ+СВ4+/СВЗ+СБ8+, СОЗОЭ25+ субпопуляции В-лимфоцитов, СИЗ"СВ8+ №С-клеток, ^А, ^О, ЦИК всех типов, ТИБ-а, ШИ-у, 1Ь-10

4 В целях дифференциальной диагностики ХГС с различной степенью компенсации цирроза печени рекомендуется использовать «Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии компенсированного и

декомпенсированного цирроза печени», включающий исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+ Для прогнозирования перехода стадии компенсированного цирроза в стадию декомпенсированного цирроза печени у больных ХГС рекомендуется исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, CD3" HLA-DR*cy бпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD3'CD25+ субпопуляции В-лимфоцитов, CD3~CD8+ NK-клеток, IgA, IgG, ЦИК всех типов, TNF-a, IFN-y, IL-10

5 Первичное иммунологическое обследование больных ХГС рекомендуется проводить по расширенному варианту обследования В целях установления доминирующего типа иммунного ответа у таких больных, достаточно использования сокращенного варианта иммунологического обследования

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Жданов К В Некоторые клинико-иммунологические изменения у бессимптомных носителей вирусов гепатитов В и С / К В Жданов, О И Кошиль, Ю В Лобзин, С Л Мукомолов, К Д Жоголев, В Ю Никитин // Новые направления в гепатологии. Тез Фальк симп №92 - СПб , 1996 - С 202

2 Лобзин Ю В Некоторые клинико-лабораторные и морфологические изменения у бессимптомных носителей вирусов гепатитов В и С/ Ю В Лобзин, К В Жданов, С Л Мукомолов, О И Кошиль, К Д Жоголев, С С Бацков, В С Чирский, В Ю Никитин, Н В Бельгесов, П П Коршунов // Инфектология Достижения и перспективы Тез докл юбил науч конф, посвящ 100-летию первой в России кафедры инфекционных болезней - СПб , 1996 -С 81-82

3 Жданов К В Маркеры активной вирусной репликации у больных со скрыто протекающими формами вирусных гепатитов В и С / К В Жданов, Ю В Лобзин, С Л Мукомолов, О И Кошиль, К Д Жоголев, С С Бацков, В С Чирский, В Ю Никитин, Н В Бельгесов, П П Коршунов // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 1997 - Т 7, №5, Прилож 4 - С 145

4 Никитин В Ю Состояние системы иммунитета и интерфероновый стагус у больных хроническими вирусными гепатитами В и С / В Ю Никитин, К Д Жоголев, К В Жданов, Е Г Богданова // Вирусные инфекции на пороге XXI века эпидемиология и профилактика Материалы науч конф с междунар участием — СПб, 1999 -С 90

5 Новик А А Состояние иммунной системы у больных хроническими вирусными гепатитами В и С / А А Новик, В Н Цыган, В Ю Никитин, К Д Жоголев, К В Жданов, Н X Дулатова // Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней Тез докл науч конф - СПб, 1999 - С 214216

6 Цыган В Н Оценка иммунного статуса у больных хроническими гепатитами В и С / В Н Цыган, В Ю Никитин, К Д Жоголев, К В Жданов, Н X Дулатова//Russian J Immunol -1999 - Vol 4, Suppl 1 -P160.

7 Цыган В Н Кпинико-иммунологическая характеристика больных хроническими вирусными гепатитами В и С / В.Н Цыган, В Ю Никитин, К В Жданов, К Д Жоголев, И А Сухина // Мед иммунология - 2000 - Т 2, №2 -С 202

8 Никитин В Ю Изучение особенностей иммунопатогенеза латентных форм хронических вирусных гепатитов В и С / ВЮ Никитин, К В Жданов, И А Сухина //Мед иммунология -2001 -Т3,№2 - С 229-230

9 Никитин ВЮ Изучение клиаико-иммуяологических особенностей латентных форм хронических вирусных гепатитов В и С / В Ю Никитин, К В Жданов, И А Сухина // Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении Тез докл V Всерос науч -практ конф -СПб, 2001 -С 101

10 Никитин В Ю Динамическое наблюдение за течением инфекционного процесса при латентных формах вирусных гепатитов В и С / В Ю Никитин, К В Жданов, И А Сухина // Клинические перспективы в инфектологии Тез докл Всерос науч конф, посвящ 125-летию со рожд проф И К Розенберга и 105-летию кафедры инфекц болезней Воен-мед акад - СПб, 2001 -С 141-142

11 Новик А А Принципы проточной цитометрии в иммунологии и онкогематологии / А А Новик, В Ю Никитин, В Н Цыган // Вестн Рос Воен -мед акад - 2001 - №2(6) - С 34-40

12. Жданов К В Латентные формы вирусных гепатитов В, С и D диагностика, лечение и профилактика Методические рекомендации / К В Жданов, О И Кошиль, Ю.В Лобзин, В Ю Никитин, П И Огарков, В А Ратников, В С Чирский - М ГВМУ МО РФ, 2002 - 47с

13 Жданов К В. Иммунологическая характеристика хронического гепатита С у лиц молодого возраста / К В Жданов, Д А Гусев, Д М Шахманов, В Ю Никитин, И А Сухина, М В Яременко // Проблема инфекции в клинической медицине Тез докл науч конф и VIII съезда Итало-Рос об-ва по инфекц болезням - СПб, 2002 - С 113

14 Никитин В Ю Особенности гуморального ответа и состояния системы комплемента у больных хроническим гепатитом С / В Ю Никитин, К В Жданов, И А Сухина // Мед иммунология - 2002 - Т 4, №2 - С 247

15 Никитин В Ю Уровень иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента в сыворотке крови при хронической HCV-инфекции / В Ю Никитин, К В Жданов, И А Сухина, В Н Цыган // Военно-профилактическая медицина Проблемы и перспективы Тр I съезда воен врачей мед -профилакт профиля - СПб , 2002 - С 278

16 Никитин В Ю Изучение маркеров активации лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С / В Ю. Никитин, И А Сухина, К В Жданов, Д А Гусев, В Н Цыган, Д М. Шахманов // Проблема инфекции в клинической медицине Тез докл науч конф и VIII съезда Итало-Рос об-ва по инфекц болезням - СПб, 2002 - С 228-229

17 Новик А А Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов Методические рекомендации / А А Новик, В Н Цыган, В Ю Никитин,

ЕД Соколова, KB Жданов ПИ Огарков, ЮВ Лобзин, КД Жоголев, В В Малышев, В С Токмаков, И А Сухина - М ГВМУ МО РФ, 2002 - 78с

18 Жданов К В Состояние иммунной системы при хроническом гепатите С / К В Жданов, Д А Гусев, В Ю Никитин, И А Сухина, Д М Шахманов// Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики Тез докл V Рос науч -практ конф - М, 2003 ■ С 99-100

19 Никитин В Ю Экспрессия активапионных маркеров лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С / В Ю Никитин, И А Сухина, Д А Гусев, К В Жданов, В Н Цыган // Мед иммуноло1 ия - 2003 - Т 5, №3/4 - С 311

20 Никитин В Ю Проточная цш ометрия в диагностике заболеваний внутренних органов / В Ю Никитин, В Н Цыган, А Б Смолянинов, Ю Ю Преснякова // Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении Тез докл VI Всерос науч -практ конф , посвящ 300-летию Санкт-Петербурга и 205-летию Воен -мед акад - СПб , 2003 -С 347-348

21 Никитин В Ю Изучение показателей Т-клеточного и B-клеточного звеньев иммунитета у больных с хроническим гепатитом С / В Ю Никитин, К В Жданов, Д А Гусев, И А Сухина, В И Цыган // TERRA MEDICA Лаб диагностика -2004, №1 -С 14-16

22 Никитин В Ю Состояние иммунной системы больных ХГС в зависимости от степени фиброза / В Ю Никитин, И А Сухина, Д А Гусев, К В Жданов, В Н Цыган//Мед иммунология -2004 -Т6, №3-5 - С 322

23 Никитин В Ю Иммунитет у больных с латентной формой хронического гепатита С в I и II стадии заболевания / В Ю Никитин, И А Сухина, К В Жданов, Д А Гусев, В Н Цыган // Клинико-лабораторный консилиум - 2004 - №5 - С 4346

24 Никитин В Ю Противовирусный иммунитет при гепатите С Предпосылки для фармакологической коррекции нарушений / В Ю Никитин, И А Сухина, В Н Цыган // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии - 2004. -Т 3, №1 -С 34-55

25 Лобзин Ю В Иммунный статус больных хроническим гепатитом С со слабовыраженным и умеренным фиброзом / Ю В Лобзин, В Ю Никитин, В Н. Цыган, И А Сухина, К В Жданов, Д А Гусев // Мед акад журн - 2005 - Т 5, №3 -С 68-73

26 Никитин В Ю Состояние иммунной системы больных хроническим гепатитом С в зависимости от генотипа вируса / В Ю Никитин, И А Сухина, Д А Гусев, К В Жданов, В Н Цьпан // Мед иммунология - 2005 - Т 7, №2-3 - С 167168

27 Никитин В Ю Изучение поверхностных активационных маркеров Т-лимфоцитов у больных ХГС с различной степенью фиброза / В Ю Никитин, И А Сухина, В Н Цыган//Мед иммунология -2006 - Т 8, №2-3 - С 278

28 Жданов К В Клинико-иммунологические, вирусологические и морфологические взаимосвязи при хроническом гепатите С / К В Жданов, Д А Гусев, В С Чирский, В Ю Никитин, И А Сухина, Д М Шахманов // Вестн Рос Воен -мед акад - 2007 - №2(18) - С 78-82.

29 Лобзин Ю В Иммунопатогенез вирусного гепатита С Иммунологические маркеры прогрессирования заболевания / Ю В Лобзин, В Ю Никитин, И А Сухина, В Н Цыган, Ю А Митин // Журн микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2007 - №6 - С 75-84

30. Никитин В Ю Маркеры активации на Т-хелперах и цитотоксических Т-лимфоцитах на различных стадиях хронического вирусного гепатита С / В Ю Никитин, И А Сухина, В Н Цыган, Д А Гусев, К В Жданов // Вестн Рос Воен -мед акад -2007 -№1(17) - С 65-71

31 Никитин В Ю Спектр цитокинов в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С на различных стадиях заболевания / ВЮ Никитин, И А Сухина, В Н Цыган, Д А Гусев, Д М Шахманов, Е А Малахова // Мед иммунология -2007 - Т 9, №2-3 - С 236-237

32 Сухина И А МК и ИКТ клетки как иммунологические маркеры прогрессирования хронического гепатита С / И А Сухина, В Ю Никитин, В Н Цыган, Д А Гусев, Д М Шахманов, И В Ширина // Мед иммунология - 2007 -Т 9, №¡2-3 - С 247-249

Подписано в печать 05 12 07

Объем 2 п л_Тираж 100 экз

Формат 60x84 '/16 Заказ № 927

Типография ВМедА, ~

194044, СПб , ул Академика Лебедева, б

Актуальность исследования. По данным ВОЗ в настоящее время в мире насчитывается более 170 млн. больных хроническим вирусным гепатитом С, а количество инфицированных HCV (вирус гепатита С) достигает 500 млн. человек [Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999; Радченко В.Г. и соавт., 2004; Lauer G.M. et al., 2001; Afdhal N., Nunes D., 2004]. Вирусный гепатит С занимает лидирующее место среди гепатотропных инфекций в развитых странах, где инфицировано 1-2% населения [Aller H.J., Seeff.L.B., 2000; Afdhal N., Nunes D., 2004]. В России больных хроническими формами и носителей HCV не менее 2 млн. человек [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., 2003]. Характерной особенностью вирусного гепатита С является высокая частота хронизации инфекции (>85%), развития цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (48%) [Соринсон С.Н., 1998; Miailhes P. et al., 2000; Marcellin P. et al., 2002; Ahmad A., Alvares F., 2004]. Различное течение и исходы заболевания обусловлены гетерогенностью иммунного ответа, определенного как иммуногенетическим своеобразием организма-хозяина, так и биологическими особенностями HCV.

Считается, что главным фактором, обуславливающим персистенцию HCV, является высокая скорость мутаций вируса. Благодаря высокой генетической вариабельности, HCV у каждого инфицированного лица существует в виде комплекса генетически близких постоянно изменяющихся вариантов (квазивидов) [Соринсон С.Н. и соавт., 1998; Blum H. Е., 1995; Kanto T., 1995; Alter H. J., Seeff L.B., 2000]. Другим механизмом, реализующим возможность персистенции, может быть подавление иммунного ответа под действием белков HCV [Фридлянд И.Ф. и соавт., 2002; Sarobe P. et al., 2003]. Третьим фактором, способствующим персистенции HCV, считается инфицирование этим вирусом лимфоидных клеток [Соринсон С.Н. и соавт., 1997; Lauer G.M. et al., 2001; Kanto T., Hayashi N., 2006]. Резервуаром инфекции в периферической крови и других тканях организма могут служить В- и Тлимфоциты, моноциты/макрофаги, гранулоциты и другие клетки. Кроме названных механизмов персистенции, имеется предположение о том, что важнейшую роль в хронизации и прогрессировании гепатита С играют дисбаланс между Thl- и Th2-лимфоцитами и секретируемыми ими цитокинами [Приймяги JI.C. и соавт., 2002; Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003; Наследникова И.О. и соавт., 2005; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006; Antonaci S. et al., 1998; Fan X. et al., 1998; Cramp M. et al., 1999; Boyer N. et al., 2000].

Наличие хронического инфекционного процесса, безусловно, является следствием недостаточности противовирусного иммунитета. Как продемонстрировали многочисленные исследования, главную роль в элиминации HCV играет Т-клеточный ответ, так как действие нейтрализующих антител зачастую оказывается неэффективным. Спонтанное прекращение острой HCV-инфекции ассоциируется с сильным продолжительным мультиспецифическим С04+-Т-клеточным пролиферативным и IFN-y-ответом, направленным одновременно на множество вирусных эпитопов-мишеней [Cramp М. et al., 1999; Day C.L. et al., 2002; Rosen H.R. et al., 2002; Chang К. M. et al., 2003; Wertheimer A.M. et al., 2003; Wollard D.J. et al., 2003]. При хроническом течении болезни наблюдается утрата способности CD4+- и CD8-Т-клеток к пролиферации и к секреции IFN-y [Wedemeyer Н. et al., 2002; Ulsinheimer A. et al., 2003]. В ряде исследований было показано, что HCV способен снижать С08+-Т-клеточный ответ [Wedemeyer Н. et al., 2002; Sugimoto К. et al., 2003; Boettler Т. et al., 2005]. Этот факт может объяснять частую клиническую ассимптоматичность острой HCV-инфекции и слабую степень повреждения печени у большинства пациентов [Wedemeyer Н. et al., 2002; Accapezzato D. et al., 2004; Kanto Т., Hayashi N., 2006].

Предполагается, что и острое и хроническое повреждение печени при гепатите С происходит, в основном, за счет реализации иммунного ответа на HCV, а не его цитопатического действия [Racanelli V. et al., 2001; Chang К. M. et al., 2003; Ahmad A., Alvares F., 2004; Kanto Т., Hayashi N., 2006]. Клеточный иммунный ответ играет ключевую роль не только в элиминации вируса, но и в патологии печени при хронической HCV-инфекции. Однако, в настоящее время об изменениях субпопуляционного состава Т-лимфоцитов, других, участвующих в иммунном ответе факторах, связанных с повреждением печени при хронической HCV-инфекции, известно немного.

Особое внимание уделяется изучению роли в иммунопатогенезе ХГС регуляторных Т-клеток с иммунофенотипом CD3+CD4+CD25+ (Tregs) [Sugimoto К. et al., 2003; Cabrera R. et al., 2004; Sakaguchi S., 2004; Boettler T. et al., 2005]. В большинстве работ сообщается о повышении содержания CD4+CD25h'sh Tregs (популяция с высокой степенью экспрессии антигена CD25) в периферической крови HCV-инфицированных пациентов по сравнению с выздоровевшими больными или неинфицированным контролем [Sugimoto К. et al., 2003; Cabrera R. et al., 2004]. Тем не менее, до сих пор не ясна причина повышения Tregs при HCV-инфекции [Kanto T., Hayashi N., 2006]. Большой интерес представляет исследование Т-клеток с экспрессией маркеров NK-клеток (CD16, CD56, CD161), включающих CD3+CD16+56+ Т-киллеры и регуляторные NKT-клетки, несущие на своей поверхности инвариантный Т-клеточный рецептор (ТКР), также участвующие в механизме повреждения печени при ХГС за счет выработки профибротических цитокинов (IL-4 и IL-13) 2 типа [Kawarabayashi N. et al., 2000; Ahmad A., Alvares F., 2004; De Lalla С. et al., 2004].

В последнее время интенсивно изучается характер CD4+- и CD8+-T-клеточного ответа на белки HCV как в печени, так и в других компартментах (периферическая кровь, костный мозг и др.) [Shirren С.А. et al., 2000; Penna A. et al., 2002; Leroy V. et al., 2003; Watson M.W.et al., 2003; Morita К. et al, 2005]. Было выявлено, что IFN-y-ответ мононуклеаров периферической крови (МНПК) на С-соге-антиген HCV может быть маркером тяжести заболевания при ХГС [Watson M.W. et al., 2003]. Важное прогностическое значение при хронических заболеваниях печени могут иметь исследования цитокинового спектра. Как показано в большинстве работ, повышение содержания некоторых цитокинов связано с изменением активности и прогрессией ХГС [Логинов А.С. и соавт., 2001; Приймяги Л.С. и соавт., 2003; Наследникова И.О. и соавт., 2005;

Скляр Л.Ф. и соавт., 2005; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006; Zilberberg Н. et al., 1999]. Появились публикации о связи В-клеточного фенотипа со степенью фиброза у пациентов с хронической HCV-инфекцией [Racanelli V. et al., 2001; Ni J. et al., 2003; Sansonno D. et al., 2004; Morita K. et al, 2005].

В то же время, многие аспекты иммунопатогенеза HCV-инфекции остаются неясными и требуют более глубокого изучения. Так, практически отсутствуют сведения об экспрессии активационных маркеров (CD25, HLA-DR, CD95) на поверхности основных субпопуляций Т-, В-лимфоцитов и натуральных киллеров (NK-клеток) у больных с различной степенью фиброза печени. Важной представляется оценка роли Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD25 и HLA-DR, а также Т-киллеров (CD3+CD16+56+) в иммунопатогенезе ХГС и прогрессировании заболевания на стадии формирования цирроза печени. Мало изучена диагностическая значимость изменений провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, которые могли бы выступать в качестве иммунологических маркеров прогрессирования и дифференцирования стадий ХГС. До сих пор не установлены взаимосвязи между факторами гуморального, врожденного иммунитета и темпами прогрессирования фиброза печени у больных ХГС.

Особое значение приобретает создание дифференциально-диагностических и прогностических алгоритмов при ХГС, разработанных на основе анализа изменений клеточного и гуморального звена иммунной системы для случаев, когда отсутствует возможность проведения пункционной биопсии печени. В настоящее время их практически нет, поэтому разработка и практическое внедрение таких алгоритмов поможет клиницисту дифференцировать стадии, тип иммунного ответа при ХГС, оценить прогноз и выбрать рациональную лечебную тактику у конкретного больного.

Таким образом, дальнейшее уточнение иммунопатогенеза хронической HCV-инфекции и идентификация иммунологических критериев, ассоциированных с прогрессией ХГС, нарастанием степени фиброза печени и благоприятным ответом на лечение, является актуальной медицинской проблемой.

Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.

Цель исследования. Изучить иммунопатогенез хронической НСУ-инфекции при различных степенях фиброза печени и генотипах НСУ, разработать дифференциально-диагностические и прогностические критерии заболевания.

Задачи исследования.

1. Дать характеристику изменений клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и неспецифической резистентности у больных ХГС на различных стадиях заболевания.

2. Исследовать изменения клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и неспецифической резистентности у больных ХГС с циррозом печени.

3. Оценить роль клеточных и гуморальных факторов иммунной системы в иммунопатогенезе хронической НСУ-инфекции.

4. Выявить особенности изменений иммунной системы при хронической НСУ-инфекции, вызванной За и 1Ь генотипами вируса.

5. Разработать иммунологические критерии дифференциальной диагностики и прогноза течения хронической НСУ-инфекции.

Научная новизна исследования. У больных ХГС со слабой, умеренной, тяжелой степенями фиброза и циррозом печени впервые выявлены обусловленные прогрессией заболевания достоверные различия в содержании субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, ЦИК, иммуноглобулинов, интерлейкинов и функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов.

Впервые выявлены особенности иммунопатогенеза ХГС со слабой и умеренной степенью фиброза печени и сформулированы положения о доминировании гуморального иммунного ответа по ТЬ2 типу и снижении субпопуляций Т- и 1ЧК-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности.

Впервые выявлены прогностические и дифференциально-диагностические иммунологические критерии, позволяющие проводить иммунологический мониторинг и прогнозировать течение ХГС у больных с различными степенями фиброза и компенсации цирроза печени.

Впервые выявлены закономерности и взаимосвязь процессов активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток у больных ХГС.

На основе изученных у больных ХГС закономерностей изменений клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности для практического здравоохранения впервые разработаны расширенный и сокращенный варианты обследования больных и алгоритмы дифференциальной иммунодиагностики ХГС на различных стадиях заболевания.

Практическая значимость. В целях дифференциальной диагностики и прогнозирования течения ХГС при слабой, умеренной и тяжелой степени фиброза, компенсированном и декомпенсированном циррозе печени предложен перечень иммунологических критериев и алгоритмы дифференциальной иммунодиагностики заболевания.

Определен объем первичного иммунологического обследования больных ХГС, включающий изучение показателей Т-, В-систем иммунитета, факторов неспецифической резистентности. Разработаны расширенный и сокращенный варианты углубленного иммунологического обследования больных ХГС, позволяющие установить доминирующий тип иммунного ответа.

Предложена система иммунологического мониторинга у больных ХГС, включающая изучение в динамике определенных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, в том числе, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза. На основании изучения соотношений активированных и неактивированных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, разработаны иммунологические критерии прогноза ХГС.

Личное участие автора в получении результатов. Автором уточнены особенности иммунопатогенеза начальных и поздних стадий НСУ-инфекции, проанализированы иммунологические, клинико-лабораторные и морфологические проявления заболевания на различных его этапах, созданы алгоритмы дифференцирования начальных и поздних стадий ХГС, а также оценки характера иммунного ответа, разработаны иммунологические критерии прогрессирования ХГС на основе анализа изменений иммунной системы у больных с различной степенью выраженности фиброза печени.

Автор осуществлял планирование и принимал непосредственное участие в иммунологическом обследовании больных, организации всех лабораторно-инструментальных и гистологических исследований, самостоятельно проводил анализ количественного состава субпопуляций лимфоцитов периферической крови на проточном цитометре с использованием тройных комбинаций прямых моноклональных антител, а также осуществлял определение содержания различных цитокинов в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа. Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Изменения иммунной системы у больных ХГС при слабой и умеренной степенях фиброза печени проявляются снижением уровня клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксической активности, доминированием гуморального иммунного ответа с преобладанием цитокинов ТЬ2-профиля, высоким уровнем В-лимфоцитов, иммуноглобулинов и ЦИК, нарушением функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов.

2. При тяжелой степени фиброза и компенсированном циррозе печени у больных ХГС наряду с сохраняющимся превалированием В-клеточного иммунного ответа при прогрессии заболевания еще более снижается уровень С03"С08+, С03"С016+56+ естественных киллеров и усиливается активность Т-клеточного звена иммунной системы, проявляющаяся повышением содержания СЭЗ+С04+, СОЗ+СЭ16+56+, СОЗ+НЬА-ОЯ+, СЭЗ+СЭ95+ субпопуляций Тлимфоцитов.

3. Прогрессирование ХГС сопровождается патогенетически значимыми изменениями Т-клеточного звена иммунной системы, характеризующимися взаимосвязью процессов активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток.

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу НИЛ общей иммунологии и иммуногенетики НИО передовых медико-биологических технологий НИЦ ВМедА им. С.М. Кирова, кафедр и клиник инфекционных болезней, факультетской терапии, клинической биохимии и лабораторной диагностики, микробиологии ВМедА им. С.М. Кирова, инфекционных центров и отделений госпиталей МО РФ. На основании полученных данных изданы методические рекомендации ГВМУ МО РФ: «Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов» (М., 2002), «Латентные формы вирусных гепатитов В, С и О: диагностика, лечение и профилактика» (М., 2002), подготовлены к изданию методические рекомендации «Иммунологическое обследование больных вирусными гепатитами» (2006).

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции с международным участием «Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика» (Санкт-Петербург, 1999); Научной конференции «Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней» (Санкт-Петербург, 1999); 4 научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000» (Санкт-Петербург, 2000); 5 Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2001); 5 научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001); Всероссийской научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения профессора Н.К. Розенберга и 105-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2001); 6 Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург, 2002); 1 съезде военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ (Санкт-Петербург, 2002); Научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002); VII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003); VI Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2003); VIII, IX, X, XI Всероссийских научных Форумах с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004-2007).

По материалам исследования опубликовано 32 печатные работы, в том числе 2 методических рекомендаций, 16 научных публикаций, в журналах реферируемых ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 318 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 8 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, шести глав результатов собственных исследований), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 265 источников, в том числе 76 отечественных и 189 зарубежных. Текст содержит 92 таблицы, 20 рисунков и 8 приложений.

ВЫВОДЫ

1. Изменения клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности у больных ХГС со слабой и умеренной степенью фиброза печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, снижением в периферической крови уровней СВЗ+СБ16+56+ субпопуляций Т-лимфоцитов, а также естественных киллеров, повышением СВЗ+СЭ95+ субпопуляций Т- и СЭ19+, С019+СБ95+ субпопуляций В-лимфоцитов, содержания ^М, ДО, ДОЗ, 1Ь-1[3, ТОТ-а, 1Ь-4,1Ь-6, 1Ь-10, ЦИК всех типов и нарушениями функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющимися повышением уровней кислородзависимой бактерицидности, активности неферментных лизосомально-катионных белков, поглотительной способности и снижением завершенности фагоцитоза.

2. Изменения иммунной системы у больных ХГС с тяжелой степенью фиброза печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, снижением в периферической крови уровней СВЗ"СБ25+ субпопуляций В-лимфоцитов и СОЗ"СБ8+ естественных киллеров, повышением уровней СЭЗ+СВ95^ субпопуляции Т- и С019+, СБ19+СБ95+ субпопуляций В-лимфоцитов, содержания ^А, ЦИК всех типов, 1Ь-1(3, ТОТ-а, 1Ь-4, 1Ь-10, а также нарушениями функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющимися повышением уровня кислородзависимой бактерицидности, поглотительной способности и снижением завершенности фагоцитоза.

3. Изменения иммунной системы у больных ХГС с циррозом печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, повышением в периферической крови уровней

СЪЗ С04+, СОЗ НЬА-ОТГ, СБЗ+СБ95+ субпопуляций Т-лимфоцитов, С019+ В-лимфоцитов, снижением СБЗ+СБ8+, С03'С025+, СВЗ"СБ8+ лимфоцитов, уровня спонтанного НСТ-теста, повышением содержания ^О, 1§А, ЦИК всех типов, 1Ь-1|3, ТКБ-а, 1ИЧ-у, 1Ь-10.

4. Изменения иммунной системы у больных ХГС с субтипом HCV Ib характеризуются достоверным, по сравнению с больными ХГС с генотипом HCV За, повышением количества CD3+CD16+56+ Т-киллеров, активированных CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов, высоко-, средне- и низкомолекулярных ЦИК.

5. Особенностями иммунопатогенеза ХГС со слабой и умеренной степенями фиброза печени является доминирование гуморального типа иммунного ответа, проявляющегося ростом числа (CD19H) В-лимфоцитов, иммуноглобулинов М, G и его подклассов G2, G3, G4, ЦИК, цитокинов Th2 профиля (IL-4, IL-10), сопровождающееся снижением количества CD3+CD16+56+ Т-лимфоцитов и CD3"CD8+, CD3'CD16+56+ субпопуляций NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности.

6. Особенностями иммунопатогенеза ХГС на стадии цирроза печени, по сравнению со стадией тяжелого фиброза, являются повышение содержания CD3+CD4+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, уровней иммуноглобулинов М, G, ЦИК всех типов, TNF-a, IFN-y, а также снижение числа CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и CD3"CD8+, CD3"CD16+56+ субпопуляций NK-клеток.

7. У больных ХГС на стадии развития декомпенсированного цирроза печени возникают достоверные, по сравнению с больными ХГС с компенсированным циррозом печени, дифференциально-диагностически значимые изменения иммунной системы: снижение уровня CD3+CD8+, CD3+CD16+56+и повышение уровня CD3+CD4+субпопуляций Т-лимфоцитов.

8. У больных ХГС отмечаются патогенетически значимые изменения иммунной системы, характеризующиеся взаимосвязью процессов активации, что отражается возрастанием уровней активированных CD8+CD25 , CD4+CD25+, CD8+HLA-DR+, CD4+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, и апоптоза иммунокомпетентных клеток, проявляющегося увеличением числа Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas- рецептор (CD3+CD95+).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В целях дифференциальной диагностики между ХГС со слабым фиброзом и ХГС с умеренным фиброзом печени рекомендуется использовать «Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на I и II стадии заболевания», включающий определение в периферической крови содержания ^СЗ, 1Ь-10, С03"С025+. Для прогнозирования перехода ХГС со слабым фиброзом в ХГС с умеренным фиброзом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания СОЗ+СЭ4+, СОЗ+СЭ8+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения СВЗ+С04+/С03+С08+, СОЗТЮ25+ субпопуляции В-лимфоцитов, ^ОЗ, ЦИК всех типов, ТИР-а, 1Ь-10.

2. Для прогнозирования перехода ХГС с умеренным фиброзом в ХГС с тяжелым фиброзом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания СВЗ+СЭ4+, СЭЗ+С08+, СОЗ+НЬА-ОК+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения СОЗ С04 /СИЗ СЭ8 , СОЗ"СЭ25+ субпопуляции В-лимфоцитов, СОЗТЮ8+ ]ч1К-клеток, ЦИК всех типов, 1Ь-10.

3. В целях дифференциальной диагностики между ХГС с тяжелым фиброзом и ХГС с компенсированным циррозом печени рекомендуется использовать «Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии тяжелого фиброза и компенсированного цирроза печени», включающий определение в периферической крови содержания СБЗ СЭ8 , СИЗ СЭ16+56 , ТИР-а, №N-7, ^М, 1§0. Для прогнозирования перехода ХГС с тяжелым фиброзом в ХГС с компенсированным циррозом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания СБЗ+С04+, СОЗ+СЭ8+, СЭЗ+С016+56+, С03+НЬА-011+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения СИЗ СЭ4 /СБЗ СБ8 , СОЗ"СЭ25 субпопуляции В-лимфоцитов, СОЗ"СЭ8+ Ж-клеток, ^А, ЦИК всех типов, ТОТ-а, №N-7,1Ь-10.

4. В целях дифференциальной диагностики ХГС с различной степенью компенсации цирроза печени рекомендуется использовать «Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии компенсированного и декомпенсированного цирроза печени», включающий исследование в периферической крови содержания СБЗС04+, СБЗ+СБ8+, СБЗ+СБ16+56+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения СБЗ СБ4 /СБЗ СБ8 . Для прогнозирования перехода стадии компенсированного цирроза в стадию декомпенсированного цирроза печени у больных ХГС рекомендуется исследование в периферической крови содержания СБЗ+СБ4+, СБЗ+СБ8+, СБЗ СБ16+56 , СОЗ НЬЛ-БЯ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения С03+С04+/С03 'С08+, СБЗО)25+ субпопуляции В-лимфоцитов, СВЗ"СБ8+ ЫК-клеток, 1ёА, ДО, ЦИК всех типов, ТОТ-а, №N-7,1Ь-10.

5. Первичное иммунологическое обследование больных ХГС рекомендуется проводить по расширенному варианту обследования. В целях установления доминирующего типа иммунного ответа у таких больных, достаточно использования сокращенного варианта иммунологического обследования.