Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующие и радиозащитные свойства транслама

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЬЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ИГНАТЕНКО ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВНА ИММУНОМОДУЛИРУЩИЕ И РАДИОЗАЩШШ СВОЙСТВА ТРАНСЛАМА (.00.36 - аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток - 19%

"Л

> <»• /.Л-

/ С. У о л

Работа выполнена в НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН-

и Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН

Научные руководители: член-корреспондент РАМН,

лауреат Государственной премил Н.Н.Беседнова

доктор медицинских наук,

профессор К.С.Чертков

Научный косультант -доктор хим. наук, профессор Л.А.Влякова

Официальные оппоненты: доктор мвд'. наук, профессор Б.М.Ковалев

канд. кед. наук, сг. научн. сотр. Т.С.Запорожец

Ведущее учреждение, давщее внешний отзыв о научно-практической ценности работы: Государственный научный центр по антибиотикам МЗ РФ, лаборатория фармакологии и патогистоло-гни, г.Москва.

Защита диссертации состоится "/и "фСуЬсАЛ 1994 г. на заседании специализированного Совета К 084,24.05 при Владивостокском Государственной медицинском институте по • адресу: 69С600 ГСП, г. Владивосток, пр. Острякова 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского института.

Автореферат разослан "/6* ^/¿¿¿^ 1994 г. ^ченкЯ секретарь специализированного Совета, кандидат медицинских наук /^/^¿^В.В.Власова.

СЕРАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время, несмотря на значительные достижения иммуно^армакологии в профилактике и лечении патологических состояния, сопровоздаюкихся иммунодефицитами, в тгм числе и связанных с облучением различной степени, поиск и апробирование новых иимуномодулп-рувщих препаратов остаотся актуальными задачами.

В современной литературе имеется достаточно'много сообщений о действии имиуномодуляторов различной природы на иммунную систему (Г .К.Закенфельд, 1990, А.В.Никитин и со-авт., 1983, tf.it.DiI.uzLo, 1985 и др.). В то же время мало информации относительно их действия на гемопозз ( М.Ь.Ра-Ь-сйва , 190б) и особенно на стволовой отдел. Представляет большой интерес и вопрос о тон, оказывают ли иммуномодуля-тори прямое или опосредованное действие на гемопоотические стволовые кяеткй и возмсткно ли их применение для стимуляции гемопоэза, нарушенного облучением.

Целый ряд полимерных соединений бактериального, растительного или животного происхождения оказывают благоприятное лечебное действие при экспериментальной острой лучэвоЯ болезни (М.С.Гордеева и соавт., 1971», В.Г.Рогозкин 'И соавт., 1977, К.С.Чертков и соавт., 1973, ЫЛ.ТаЪсЪеп , 19&6). Лечебное действие отих соединения основывается на стимуляции постлучевого восстановления кроветворения и иммунного статуса. Однако очень немногие лечебные полимеры обладают таким сочетанием свойств, которые позволяпт рекомендовать их в качестве лечебных препаратов.

В последние годы значительное внимание отечественных и зарубежных авторов (Н.П.Блинов, 1964', М.А.Кашкина и' соавт., 1960,ц.Е.в11иг1О,1985» Н.Ь.Ра'ЬсЬеп, 1986 ) привлечено к изученив биологической активности малотоксичных_у5-1,3;1,б-глюканов, выделенных из целого ряда природных объектов -грибов, лишайников, дрожжей. Однако многие полисахариды этой группы обладают недостатками - шсокой молекулярной массой, плохой растворкмостьп в воде, следствием чего-является развитее осложнения при их введении в организм,

- I -

Наряду с лечебным противолучевым и стимулирующим гемо-поэз действием полисахариды и, в частности глюканы, обладают имкуномсдулируюшкми свойствами. Это дает возможность' оказывать влияние на иммундаз процессы в организме и коррелировать иммунодефицитные состояния.

Исходя из вышеизложенного, представляется интересным и своевременным поиск и разработка новых препаратов имму-номодулирующого и радиозащитного действия.

Цель работы - экспериментальное обоснование возможности применения нового вещества (р-1,3;I,б-глюкана) -транслама в качестве средства раннего лечения острой лучевой болезни и иммунокорректора при иммунодефицитных состояниях. ■

Основные задачи исследования.

1. Изучить иммуномодулируюшее действие транслама в дозах широкого диапазона по основным показателям первого уровня.

2. Сравнить иммуномодулируюшее действие транслама с действием других, подобных по структуре _/3-глюканов и оценить их влияние на резистентность животных к экспериментальным инфекциям.

3. Изучить в эксперименте на мелких и крупных лабораторных животных эффективность транслама в качестве профилактического и лечебного средства при острой лучевой болезни t? определить оптимальные условия его применения.

Исследовать влияние транслама на кроветворение п шпактном и облученном организме.

Научная новизна работы.

Новизна настоящей работы определяется прежде всего тем. что в ней исследуется (?овый/-Т,3;1,6-глчкан - транслач, полученный в лаборатории химии ферментов ТКБОХ ДВО РАН иод руководством доктора химических наук, профессора Л.А.Еля-ковой путем ферментативного синтеза из ламинарина морской водоросли Laminaria psechroidea и принадлежащий к наиболее активной среди полисахаридов группе /4-глюкаяов. На способ получения этого глгканэ выдано авторское свидетел-сгво Государственного комитете CCCF по л?вам изобретений и открытая !,' [(115775.

Приоритетными являются исследования, касающиеся действия транслама на миграцию и пролиферацию стволовых кроветворных клеток. Впервые показана способность этого низкомолекулярного глюкана (И.м. 8 кДа) в малых дозах стимулировать восстановление кроветворения при введении его после облучения, вызывающего развитие костно-иозгового синдрома.

Показано, что стимулирующее влияние на кроветворение реализуется через активацию макрофагов и Г-лшфоцитов, которые для этого биополимера являются точками приложения.

Впервые показана способность транслана значительно увеличивать выживаемость животных при введении его в ранние сроки после облучения.

Практическая значимость.

1. Предложен и изучен в аксперименте новый мммуномоду-лятор для коррекции нммунодефицитних состояний.

2.На двух видах экспериментальных животных установлены противолучевые свойства транслама и условия его применения, позволяющие рекомендовать для человека путем экстраполяции эффективнее дозы и'режим назначения этого препарата в составе материалов для §армкомитета с целью получения разрешения на клиническое изучение.

3. Результаты изучения действия транслама на кроветворение, периферическую кровь и иммунологические показатели первого уровня необходимы также для включения в доклинические материалы, представляемые в ^армкомитет Минздрава Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Транслай - новиЯ /-1,3;1,6-глюкан - эффективное средство. раннего лечения острой лучевой болезни. Препарат стимулирует восстановление кроветворения в облученном организме и предотвращает или снижает тяжесть течения пострадиационных инфекционных осложнения.

2. Транслан обладает кммуноиодулируввшм действием: стимулирует гуморальный и клеточный иммунитет.

3. Одним из механизмов деГютым трансла.и является усиление функциональной активности клеток систем« моионуоеар-ннх фагоцитов.

.Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета 1 3 -

НШ эпидемиологии и микробиологии СО РАШ (Владивосток, 1993]). Материалы диссертации доложены на симпозиуме "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы" (Пущино, 1987), на Всесоюзной конференции с международным участием "Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии" (Томск, 1988), представлены на III Всесоюзном совещании "Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей" (Черноголовка, I967), на рабочем совещании "5ф$ектсрные и рёгуляторныв функции иммунной системы в облученном организме" (Суздаль, 1969).

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, , Структура и объем работы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,' описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографии. Работа содержит 15 таблиц и II рисунков. Библиография включает 202 наименования источников литературы, из которых 61 - на русском языке,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Эксперименты проведены на 79С неинбредных мышах, 902 мышах линии СБА и 29£4 гибридах (СВАхС^Вь^, 40 морских свинках и 27 собаках.

Основным объектом экспериментального изучения бил тран-слам - новый р-1,'Э;1,6-гямйН, имеющий молекулярную массу 8 кДа,, белый кристаллический порошок без запаха, нетоксич» ньй (проверен до 10000 мг/кг), хорошо растворимый в воде, полученный путем энзиматического синтеза из ламинарйна морской водоросли Ъат1паг1а раес11го1с1ез . Выделение указанного полисахарида, а также изучение химического состава и структуры препарата проведено в ТИЕ0Х Д80 РАН в лаборатории химии ферментов под руководством доктора химических наук, профессора X.А.Еляковой. Для сравнения биологической активности транслама с таковой некоторых подобных по химической структуре у4-глюканов были использованы: ламинарин - ^-глю-кан с молекулярной массой 5 кДа, являвшийся исходным сырьем для получения трансламп и другой продукт, сопутствующий трансламу при роакции ферментатаиного"синтеза - "тупиковый" 7,5,?

- ь -

с молекулярной массой 3 кДа, глюкакч"грибов - аубазидан и пахкман, а также лишайниковый глюкан - пусгулан. Изучаемые глюканы различаются молекулярными массами и соотношением и ,£-1,6-связанных остатков глюкозы в них. Указанные глюканы были получены и охарактеризованы в ТИБОХ ДЗО РАН.

Иммуномодулирувщее действие транслама изучали по основным показателям первого уровня (Методические материалы по экспериментальному и клиническому испытанию иммуномодули-рушсего действия фармакологических средств, М., 1964).

При изучении противоинфекционяой активности исследуемых препаратов в качестве экспериментальных моделей были' • использованы генерализованные инфекции, которые воспроизводили путем заражения мьшеПЕ.соИ иУ.pseudotuberculosis . Эффект препаратов оценивали по проценту вкживких животных в опытных и контрольной группах.

Изучение влияния транслама на функциональную активность макрофагов проводили в 3-х тест-системах: in vivo, in vitro и в смешанной тест-системе.

Действие транслама на макрофаги in vivo оценивали по скорости очищения брюшной полости мкшеЯ от введенных вну-трибрюпинно E.coli , меченных ^С.

МонослсЯные культуры макрофагов морских свикок готовили по методу Н.И.Ерауде (1964) к инфицировали 1.pseudotuberculosis в соотношении макрофаг-микроб 1:10. При этом в смешанной тест-системе транслам вводили морским свинкам подкожно за I сутки до взятия макрофагов. Б опытах in vitro транслам вносили непосредственно в культуру макрофагов.

Для оценки иммуномодулирупщих свойств транслама изучали количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей методом локальных зон гемолиза в агаре ( N. К. Jeme , A.A.irordin , 1563), титра геиагглптинкнов в сыворотке крови иммунизированных животных, спонтанную и индуцировзнную Т-клеточными митогенами пролиферацию спленоцитов in vitro с помоцьв 3Н-тимидина.

Оценку влияния транслама на кроветворение в интактном к облученном организме осуществляли путем подсчета количества лейкоцитов периферической крови, количества ядро-содеркасих ктеток в костном мозге бедренной кости мышей - 5 -

и лимфоидных органах (тимусе и селезенке) в разные сроки после введения глвкака по общепринятой методике (подсчет в камере Горяева).

Влияние транслБма на эндо- к экзоколониеобразование оценивали по общепринятому методу, описанному ;г,:е.!Г111 11 Е.А. МсСиПосЬ (1961).

Оценку лечебного действия транслама на течение и исход острой лучевой болезни проводили на мыиах и собаках, ценных в абсолютной минимально летальной дозе ¿-лучами Со, Эффективность препарата определяли по критерио ЗС-суточноЯ выживаемости животных контрольной и опытной групп.

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики, используя критерий достоверности Стыздента (Я.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 19(2), При обработке данных по титрам антител использовали среднее геометрическое.

Результата исследования и их обсуждение.

Сравнение близких по структуре ^-глвканов в отношении их способности повышать противоинфекционнув резистентность организма на модели экспериментального коли-селсиса показало, что различные ^-глюкани по защитному эффекту значительно отличаются друг-от друга (рис.1). По-видимому, решавщув роль в стимуляции глюканами различных звеньев иммунной системы играет первичная и вторичная структура отих биополимеров.

60

60 40

20

0

I 2 3 'I Рис. I. '-Злияние различных при экспериментальном коли-сепсисе. По оси абсцисс - глюканы:

1 - транс-гшм, 2 - пахичян, 3 - лустулан, - аубазидан, 5 -"тупиковый" 7,5%, б - ламинарии, 7 - контроль. По оси ординат - % выживших животных.

_с=Ь

5 6 7 . -глюканов на выживаемость мышей

.Дальнейшее изучение способности транслама повышать про-тивоинфекц'/.онную резистентность организма было проведено на годелях генерализованных инфекция, вызванных E.cola иУ.рпс-¡Kiotuberculosis . Установлено, что эффективность транслама зависит от дозы, кратности и пути введения препарата. Иаибо-лзе отчетливо защитное действие транслама было показано при внутривенном и внутрибрюшинном способах введения. С повынени-ем кратности введения увеличивается и выживаемость С табл.1).

Таблица I.

Влияние транслама на выживаемость мьт.ей при генерализованной инфекции, вызванной >5.coli.

Способ вввде- лоза мг/кг Кратность Ёрило тавотных % ния транслама введения I через 3 суток)

внутривенно 5ДО,2С,АО четырехкратно 66,^-5,3 нкутрибрюиигшо Ь6,С~г,7

подколчо -»_••- ?0,9Ч-С,9

внутривенно 10 однократно >^3,3-3,1

внутрпбрюшннно -"- 30,3*?, 5

подкожно -"- , б±1,7

контроль ' - .0

Примечание: р<0,С5, по сравнению с контролем.

Определение наиболее эффективной протективной дозы транслама, проведенное на модели псевдотуберкулезной инфекции, показало, что транслам при однократном подкожном введении за сутки до заражении муцгвЯ оказался наиболее эффективным в дозе 10 мг/кг (табл. 2).

Таблица 2.

Определение протективной дозы транслама при инфицировании иерсинией поевдотуберкулеза (50 Л/.^).

Вариант опыта Доза транслама мг/кг Выживаемость через 14 оут. /о Средняя продолжительность жизни (дни)

Контроль _ С

Транслам I- С' 6,2±1,28

Транслам 10 40, Ji5,'fx П. ОН, "3х

Транслам IC0 С Ь cti 53

Примечание: х - р с Г, С 5, - 7 , по сравнению с контролем.

В последующих экспериментах мы попытались разложить на составные суммарный аффект транслама и показать какие зв&нья иммунной системы обеспечивают уменьшение летальности инфицированных животных.

Влияние транслама на клеточные факторы неспецифической резистентности и на иммунные реакции гуморального и клеточного типа. Одним из механизмов стимуляции неспецифической резистентности и специфического иммунитета при действии полисахаридов вообще и глюканов в частности является активация клеток системы мононуоеарных фагоцитов (В.А.Никитин, С.М. Навашин, 1983,Г.К.Закенфельд, I9S0j;.R.Diiuzio et al, 1576). Наиболее универсальным тестом для определения функциональной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов (Ciii) является изучение фагоцитоза и последующего внутриклеточного переваривания бактерий. Для выявления прямого влияния транс-льма на клетки СЫ-1 были проведены опыты на культурах периго-неальных макрофагов, инфицированныхY,pseudotuberculosis Показано, что парентеральное введение транслама значительно стимулирует* поглотительную и переваривающую активность макрофагов (табл.3). Так уже в первый час после заражения количество макрофагов, участвующих в фагоцитарном процессе, в 1,5 раза превышало контрольные величины (ФП), а количество микроорганизмов, поглощенных одним макрофагом ('54), в опытной группе было в 6,9 раза больше, чем в контрольной. Через 6 и 1?. часов микроорганизмы в макрофагах контрольной группы продолжали размножаться, что через, 24. часа приводило к разрушении клеток. В опытной же группе уже через 6 часов наблюдались процессы интенсивного переваривания и й'./чения макрофагов от микроорганизмов. Динамика изменение: фагоцитарной активности макрофагов in vitro была сходной с закономерностями таковой в смешанной тест-системе (табл.3).

Полученные нами в экспериментах in vitro данные позволяют сделать вывод о возможности прямого действия транслама на клетки СМ-]'. Усиление функциональной активности макрофагов под влиянием транслама может слукить одним из объяснений его способности повышать противоинфевд-юнную резистентность организма .

Известно, что макрофаги я.злявтся центральными клетками - 8 -

Таблица 3.

Функциональная активность культивируемых макрофагов морских свинок при введении транслама in vivo и in vitro по отношению к X.pseudotuberculosis.

Группа макрофагов Способ активации Время наблюдения (часы)

• I 6 12 24

т п ш I>4 ФП ФЧ РЛ | РЧ

Интактные 58,51 зД 0,5 75,3- 3,2± 0,1 92t 2,6 ЕЙ 0,2 Макрофаги разрушены

Активированные трансламом i_a vivo 68Í 3,3 Í5± 1,2 2,é iM 0,2 -Микроорганизмов нет

i л. vi tro 52,7Í 2,5 7,5- С.6 48Í 1,6 2,2Í Микрооргани змов нет

в индукции иммунного ответа и участвуют в распознавании антигена, а также контролируют пролиферацию, дифферзнциронку и кооперацию Т- и В-лкмфоцитов СР.В.Петров, 1963). С другой стороны, следует иметь в виду, что механизм действия транслама по-видимому многогранен и затрагивает ряд систем организма. 3 связи с этим следующая задача исследования состояла в изучении влияния транслама на гуморальный и клеточный иммунитет.

Показано, что введение транслама мышам одновременно с иммунизацией ЗБ в 1,55-3 раза стимулирует продукцию АОК в селезенке мь-иеЛ и повывает титры гемагглюттинов в сыворотке крови животных. Стимулирующий эффект проявлялся в диапазоне доз препарата от I до 100 мг/кг. (рис. 2).

Полученные данные свидетельствуют об активации трансла-мом иммунокомпетентннх клеток, участвующих в гуморальном иммунном ответе. Поскольку известно, что зрелые антителосек-ретирующие клетки синтезируют igM nlgG антитела, то более высокие титры антител в крови мьгпгеЯ могут быть связаны с увеличением количества АОК в селезенках.

Возможно, что усиление иммунного ответа трансламом осуществляется следующим образом: стимулированные макрофаги приводят Т-ликфоцкты в активное состояние. Активированные Т-лимфоциты, з свою очередь, секреткруют некоторые медиаторы (лимфоккны), которые запускают неспецифическую клеточную

_ о _

реакцию (-А.Н.Маянекил и иоавт., 1983). Ряд лимфокинов регулирует функцию макрофагов, кооперацию Т- и В-лпмфоцитов с макрофагами, способствует дифференциации В-клоток в плазматические (Б.В.Брондз, А.В.Рохлин, 1966). хГО3

30 25 20 Ъ 10

7

Nl mrfh

IB 16

14

12

10 б б

2 О

О

it 7 14

Рис. 2. Влияние транслама на гуморальный иммунный ответ мышей. По оси абсцисс - время после иммунизации (дни); ро оси ординат: слева - число АОК на селезенку (заштрихованные столбики - контроль, незаштрихованные - опыт); справа - ъо&2 титров ГА в сыворотке крови (I - контроль, 2 - опыт).

Пролиферация иммунокомпетентных клеток лежит в основе практически любого проявления активности иммунной системы (Л.В.Ковальчук и ооавг., 1990).

В связи с этим представляет интерес соотношение иммуно-модулирувщей активности препарата и его способности влиять на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток, в частности, на изменение пролифератквной активности лимфоцитов. В прямых опытах vitro показано, что трепелам стимулирует спонтанную и индуцированную Т-клеточными митогенами (конканавалином А и фитогемагглюгкшном) пролиферацию сплено-цитов.

Таблица А.

Влияние транвлвма на спонтанную и индуцированную мито-геками пролиферацию спленоцитов мышей (СЗЛхС^!^ ^ ^

Содержание транслама в среде мкг/мл Содержание ми-тогена в среде • мкг/мл .....ч- Включение Н-тшидина имп./кин. Индекс стимуляции

10 100 КонА/5 ФГА/50

+ + - - 2951^,0 386146,6 41(1137,3х ■1.3 1.5

+ + - + + + 1Г731Г13,7 22651233,2ХХ 35051333,2ХХ 1.9 2,9

+ + + + - твз!165,1. 279721581,2х • 367201466,6ХХ 1,6 2,1

Примечание. Достоверность отличий от контроля: х - р<-0,05, хх - р<С,01.

Следовательно, Т-лимф>оциты, наряду с макрофагами, также являются точкой приложения действия транслама. Выявленное нами увеличение массы и клеточности тимуса и селезенки можно рассматривать как. показатель стимулиру^цего действия транслама на пролиферацию;и дифференцировку лимфоцитов.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что транслам является выраженным иммуностимулятором, позволяющим посредством активации различных звеньев иммунной системы усиливать иммунобиологическую реактивность организма.

Влияние транолама на последствия лучевых воздействий.

Гемопоэтическая и иммунная депрессия является широко известными феноменами, сопровождающими лучевую болезнь. В связи о отич поиск путей коррекции иммунной и генепоэтической депрессии имеет первостепенное значение в клинике лучевой болезни. В настоящее время самые разнообразные природные полисахариды (ПС) изучаются в.плаце установления их радиозакит-

ного действия ( К.й.1)11,и:21о,1985, '.¡.Г,.Ра1;Ы1ег1 а а1,1986 Несомненный интерес в этом ряду представляют а-глюканы.

- II - ]

Ня первых этапах исследования мы оценивали радиопротек-тивное и терапевтическое действие транслама в дозах от I до КО мг/кг у мыией, облученных в минимальной абсолютно летальной дозе. Результаты экспериментов представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5.

Влияние транслама на выживаемость мышей, облученных на аппарате РОКУС-М в дозе 7,7 Гр, при однократном подкожном введении за 24 часа до облучения.__

Зарканг опыта Доза в-ва мг/кг Выживаемость t h Средняя продолжительность жизни (дни]

Контроль Транслам Транслам 100 10 0 20,5^-5,56х 25l5,8Ix IC,5tl,8 I9,5l2,6х 19,71:3,3х

Примечание: х - р«=0,05 по сравнению с контролем. Таблица б. Влияние транслама на выживаемость мышей, облученных на аппарате ИГУР в дозе 8 Гр, при однократном подкожном введении через 4 часа после облучения.

Вариант опыта Доза в-ва мг/кг Выживаемость % Средняя продолжи- , тельность яизни (дни.

Контроль Транслам Транслам Транслам I0G 10 I 36,0i8 16,618,46 75ll3,52x 25i7,43 IS.3H.4 1712,5 I9,6l2,6.

Примечание: х - р-сО,С5 по сравнению с контролем.

Таким образом, транслам в дозе 1С мг/кг, применяемый в качествё средства профилактики или раннего лечения ОЛБ, оказался достаточно эффективным.

Дальнейшие эксперименты были направлены на разработку эффективных доз препарата, а также путей и сроков его введения после облучения.

Наши исследования, проведенные в опыт&х на мышах, выявили отчетливое лечебное дейсрие транслама, введенного в ранние сроки после экспозиции Со ( рис. 3). Постоянно воспроизводимая лечебная эффективность проявлялась при использова-нки гранслама в дозах 15-бС мг/кг. Не выявлено явных разли-

- 12 -

чиЯ в зависимости от ксползованного пути и времени введения тюкана. Показатели вкливаемости били близкими, если введение осуществляли внутриьгчшо или подкожно, через I или. часа после лучевого воздействия.

20 1С

о _______

К Г 10 15 30 60 ICO' Рис. 3„ Влияние транслама на выживаемость мыией, облученных в дозе 8 Гр и леченых а) через I час после облучения, б) через 4 часа после облучения. По осям ибсцисс - дозы транслама мг/кг; rio осям ординат - % выживших животных, {(-контроль, заштрихованные столбики-подкожнкй способ введения транслама, незаштрихопанныо - внутривенный.

- ГЗ _

Подтверждение лечебного действия транслама мы получили и в экспериментах на собаках, облученных в минимальной абсолютно летальной дозе: при введении препарата через ^ часа после облучения выжило 60$, а через 12 часов - собак при гибели всех животных в контрольной группе.

Полученные результаты позволяют отметить практически значимые свойства транслама: широкий диапазон действующих дез, сохранность -эффекта при отсроченных сроках введения и воз- -можность использования более доступного по сравнению с внутривенным - подкожного способа его введения в организм.

Исходя из вышеизложенного, мы можем утверждать, что тран-слак представляет несомненный практический интерес для дальнейшего изучения в эксперименте с целью лечения лучевой болезни .

Влияние транслама на систему кроветворения облученных мышей. Согласно данным литературы С и.Ь.гаЬсЬеп,19гА-, М.Ь., РаЪсЪеа е-ь' а1,198б,К.Е.011иг1о> лечебное действие глвканов проявляется лишь в диапазоне таких доз облучения, когда основным и определяющим фактором в генезе лучевой болезни является поражение системы кроветворения, и дозы радиационного воздействия не настолько велики, чтобы вызвать тотальную гибель всех клеточных элементов костного мозга. В таких условиях исход лучевой болезни во многом зависит от способности применяемых средств ограничить механизмы, приводящие к опустошению кроветворной ткани, что способствовало бы сохранению большего числа кроветворных элементов и более быстрому восстановлению кроветворения за счет неповрежденных или нелетально поврежденных стволовых клеток.

Исследование количественного состава клеточных элементов периферической крови, костного мозга, селезенки и тимуса у мышей показало, что введение транелвма после облучения способствует более раннему и полному восстановлению кроветворения (рис. 4).

Одним из косвенных доказательств ускорения восстановления кроветворения под влиянием _^-глюканов, введенных после облучения, могут служить и данные, показывавшие, что у животных после . облучения в смертельных дозах обнаруживаетеч больиее колгчзетто эндогенных колоний на селезенках.

- 14 -

.Рис. . Влияние транслама на изменение количества лелкоцитов периферической крови (а), клеток костного мозга Озд-ра .(б), селезенки С в) и тимуса (г) у мишеЯ, облученных в дозе 7,5 Гр ^-лучами Со на установке РОКУС-М. По осям абсцисс - время наблюдонил ср сут.) после облучения; по осям ординат - содержание клеток в Ъ по отношению к пнтактному контролю. 1-опыт, 2-кинтрсль.

Показано, что введение транслаиа в различные сроки относительно облучения вызывает увеличение числа эндогенных колоний на селезенках облученных мышей. Эффект препарата зависел как от дозы, так и от сроков введения (рис. 5).

О

II

III

ifi

i

№

1

К 12 3 4 5 6 123456 123456 Рис. 5. Влияние транслама на количество эндогенных НОЕ в селезенке мысей на 9-е сутки после облучения в дозе 7 Гр. I - группа мышей, получивших транслам в дозе I мг/кг, II -10 мг/кг, III - 100 мг/кг. По оси абсцисс - индекс экспериментальной группы: K-контроль; I-транслам, введенный за 7 суток до облучения; 2-за I сутки; 3-за I час; '¡-через I час; 5-через I сутки; 6-через 7 суток после облучения мысей. По оси ординат - число Энд-КОЕ на селезенку.

Известно, что для повышения выживаемости облученных и леченых животных важное место имеет увеличение численности полустволовых клеток, 4ормирушсих, в основном, эндогеннне колонии (К.С.Чертков и соавт., 1973). Показанное нами увеличение их числа в селезенках, леченых трансламом животных, в свою очередь отражается ня показателях подъема миелоидных и других элементов в костном мозге, селезенке, тимусе и периферической крови и, соответственно, повышает вероятность переживания животными критического периода аграну-;оцитоза, способствуя завериенив восстановления числеш лети стволо--в ого пула.

I

■

Методом селезеночных экзоколоний проверяли предположение о связи повышения выхода кроветворных колоний а селезенке с увеличением пула стволовой фракции кроветворения.

Установлено, что введение гранслама летально облученным реципиентам за сутки до пересадки им клеток костного мозга интактных сингенных доноров, приводит к увеличению числа селезеночных колоний. Так, при использовании транслама в дозе 10 мг/кг число окзоколоний возрастало в I.f'i раза (15, Г-1,1. в контроле - р<гС,С5), а в дозе 100 мг/кг - в

1,59 раза (14,6^1,4, p<t-,l.b). Анализ изменения числа окзоколоний в зависимости от разных путей введения транслама не выявил существенной разницы между внутривенным и подкожным способах. Таким образом, введение транслама летально облученным реципиентам приводит к увеличению экзоколониеобразования. Этот феномен очевидно связан с интенсификацией репродукции трансплантированных НОЕ у мшюД, получивших транслам.

Результаты, полученные при введении'транслама донорам кроветворных, клеток,неоднозначны. Так, введение транслама в дозе 100 мг/кг увеличивает через I сутки содержание КОЕ в селезенке в 1,6 раза (17,6-3,07, в контроле - 1С,9^2,56, р«г0,05). Через 5 суток наблюдалось значительное снижение числа КОЕ в селезенке р«с0,05). Стот эффект мо-

жет быть обусловлен включением регуляторных механизмов, ограничивающих процессы пролИ'ф0Ричик, возникающие в ответ на введение большой дозы транслама и направленных на ограничение дестабилизации дуфференцировки клеточных злементов лимфоге-мопозтической системы и иммунологического гомеостаза организма.

Введение транслама в дозе 10 мг/кг не отражалось заметным образом на репопуляционных свойствах донорских клеток селезенки и костного мозга.

Следовательно, полученные нами результаты, позволяют утверждать, что способность транслама активно воздействовать на стволовы? кроветворные клетки, их пролиферацию и миграцию определяет эффектишюсть его при лечебном применении, когда восстановдзнио происходит за счет неповрежденных или полностью репопулировав'лих стьоловых клеток.

К настоящие вреля установлено (Л.В.Санин, ¡Ш*, А.Н./ш-

гай и соавт., 19Ь8), что в регуляции кодониеобразующей функции стволовых кроветворных клеток (КОЕс) участвуют как Т-клет-ки и продуцируемые ими факторы, так и система мононуклеарных фагоцитов. По всей вероятности, именно способность транслама оказывать прямое влияние на клетки СМ£ и пролиферативную активность Т-лкмфоцитов и обеспечивает в конечном итоге суммарный аффект - повышение выживаемости облученных животных.

Влияниз транслака на показатели естественной резистентности облученного организма. Одним из главных проявлений иммунодефицита при лучевой болезни является снижение естественной резистентности организма, в том числе устойчивости к андоген-ной инфекции. К числу факторов, обусловливающих снижение естественной резистентности облученного организма, относится нарушение функциональной активности фагоцитирующих клетокСВ.Н. Мальцев и соавт., 1976). 3 связи с' зтим нами была изучена возможность применения транслама в условиях облучения и дополнительного инфицирования животных культурой е. coli . как типичным представителем кишечной микрофлоры и основным возбудителем постлучевой эндогенной инфекции.

Показано, что введение транслама облученным и зараженным мышам вызывало снижение показателей высеваемости живых бактерий из селезенки. Так, среднее число бактериальных колоний в контрольной группе было максимальным через I час после заражения и составило 19,8^3,I, а к 24 часам снижалось втрое. При введении транслама до- или после облучения показатели высеваемости через I час были в 1,4 и 1,5 раза ниже таковлх в контрольной группе (р«;С,05). В последующие сроки показатели высеваемости в опытных группах были также ниже, чем в контрольной.

Результаты изучения фагоцитарных процессов по уровню поглощения и выведения меченой ^С культуры е.coli позволили выявить ряд различий у облученных., интактных и облученных, и получивших транслам, животных (табл. 7). Через I час после заражения фагоцитарный индекс в группе облученных мышей был в 2,'1 раза ниже (р^О.СЗ) по сравнению с группой интактных животных. Под влиянием транслама способность макрофагов сблу-чевных мывей к поглощению бактерии была в 1,7 раза выве (р^О.СЬ) чем в облученном контроле, но несколько нижа в сравнении с

_ Ii. -

группой интактных животных. Через б и 21 часа скорость выведения метки'в группе мышей, получивших транслам, была значительно вьчие, чем в облученном контроле и практически не отличалась от показателей интпктного контроля, что свидетельствует об ускорении катаболизма ккорчной над очки под в.тт-ен транслама.

Таблица 7.

Злияние транслама на поглощение и выведение' печеной культуры Е'СоН перитонеальными макрофагами облученных мышей.

Время после зараге Опыт (транслан+ облучения; Контроль I (облучение) Контроль II (шггактный)

ния макрофагов (часы) уровень радиоактивности скорость выведения метки уровень ради овктив-ностг скорость шве -дения метки уровень радиоактивности скорость выведения метки

I 103221365х 6С7С17','6 1297512792х

б 1769130 5,6 2*16^-710 2,1 26111355 4,9

24 938189 II 1133*103 5,1 121С120 10,7

Примечание: х - р«=0,С5; уровень радиоактивности внражеи в имп./мин. на единицу оптической плотности.

Таким образом,транслам оказывает стийулиругщее влияние на фагоцитоз, приближая его показатели у облученных мышей к уровню интактного контроля, В целом, действие транслама на функциональную активность перктонеальннх макрофагов облученных животных проявлялось усилением захвата и выведения . бактерия. Способность транслама стимулировать восстановление факторов неспецифичебкой защита облученного организма игр яет.яаунув роль а анткккф'екционнбя резистентности, а та те в регуляции иммуногенеза и гемопогэа.

ВЫВОДИ

1. Установлено, что транслам - новий уз-Т,3;1,б-глюкан -обладает выраженной биологической активностью.

2. Транслам оказывает значительный лечебный эффект при экспериментальной острой лучевой болезни. Устойчивое лечебное действие в опытах на мысах наблюдаете'' при введении тран-елчча в дозах от 15 до 6С иг/кг через I-'1 часа псслр облучения.

- 19 -

3, Лечебные свойстве транслама проявляются и в опытах на крупных лабораторных животных (собаках). Внутримышечное однократное.введение транслама в дозе 10 мг/кг через 4 и 12 часов после тотального ¿-облучения в минимальной абсолютно летальной лозо спасаот от гибели 60 и собак соответственно.

h . Гранолам оказывает превентивное действие при зкспе-риментальных бактериальных инфекциях, что открывает' перспективы ого использования при различных инфекционных болезнях, а также для повышения естественной резистентности облученного организма.

5. Ведущим фактором в механизме лечебного действия транслама является влияние его на систему кроветворения. Транс-лам способствует восстановлений после облучения эндо- и экзогенных КОЕ, числа лейкоцитов в периферической крови, клеточ-ности лимфоидных органов - тимуса, и селезенки, и клвточности костного мбзга. Стимулирующее действие транслама на кроветворение может быть опосредовано активированными макрофагами и Т-лимфоцитами, которые являются точками приложения этого биополимера .

6. Транслам оказывает выраженное влияние на гуморальный и клеточный иммунитет: повышает число АОК в селезенках мыией к ЭБ и титры гемагглютининов в сыворотке крови, а также увеличивает спонтанную и стимулированную Т-клеточными митогеиа-Ми пролиферацию спленоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПШИКОВАНШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Звягинцева Т.Н., ß-ирокова Н.К., Сундукова Е.В. к др. JI-1,3;1,6-глшканы и продукты их ферментативной трансформации в качестве иммуномодулируюпих агентов. - В кн.: Тезисы докладов симпозиума "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы". Пушиио, 1987, с.47.

2, Игнатенко Л.А,, Крапевский C.B. Влияние глюканов противоопухолевого действия на миграцию стволовых клеток из костного мозга. - В кн.: Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей. Материалы Iii всесоюзного «овевания. Черноголовка, I9Ö7, т.II, с.124-127.

- 20 -

3. Игнатенко Jl.А», Беседнова h.h., Звягинцева Т.Н., Еля-кова Л.А. Кммунонодулирувщая активность /-Л.З; 1,6--глюк.ана, обладающего противоопухолевым действием» Гам же, с.137-1''С.

Игнатенко Л.А., Блякова Л.А., Оводова Р.Г. Влияние биогликпнов природного происхождения на популяцию стволовой фракции кроветворения. -В кн.: "Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии". Тезисы докладов Всесоюзной конференции с международным участием, Томск, 1988, 'с .'16-47.

-5. Игнатенко JI.;y., Звягинцева Т.Н., Беседнова h.h., Кра-шевский C.B., Влякова Л.А. Стимуляция регенерации гемспозза мышей под действием /-1,3;1,б-глюкана - транслана. - Ï.Радиобиология, 1990, т.30, вып.4, с.555-556.

б. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Озерецкойскпя О.Л.,-Васюкова h.h., Беседнова h.h., Игнатенко Л.А. Способ полуя-ния глюкана, обладающего иммуностимулирующей активностью. -Авторское свидетельство Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий №1415775, 1986.

ИГНШНСО ЛВД'ША АЛЕКСАВДРОВНА:

шуюмодулирущие. и радйващтше. свойства трашлама;

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано к печати 10.01.1994г.Формат бйх84/1В. Печать офсетная. Усл.п.л. 1,4.Уч«,-изд.л. 0,9. Тираж 100 экз. Заказ 9.

Отпечатано участком оперативной полиграфии издательства " ДАЛЬНАУКА " 690041. Владивосток, Радио, 7.