Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное обоснование применения липидов 1-О-алкилглицериновой структуры из морских гидробионтов при алиментарной дислипидемии

юи^

На правах рукописи

□□30583Б2

КАР АМАН ЮЛИЯ КОНСТАНТИНОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ЛИПИДОВ 1-0-АЛКИЛГЛИЦЕРИНОВОЙ СТРУКТУРЫ ИЗ МОРСКИХ ГНДРОБИОНТОВ ПРИ АЛИМЕНТАРНОЙ ДИСЛИПИДЕМИИ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биоюгических наук

Владивосток - 2007

003058382

Работа выпочнена в НИИ медицинской климатологии и восстановительного печения -Владивостокском филиале ГУ Дальневосточный научный ценгр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

НОВГОРОДЦЕВ\ Татьяна Павловна

Официальные оппоненты- доктор биологических наук, доцент

КУШНЕРОВА Наталья Федоровна

доктор биологических наук, профессор ПАЛАГНН4 Марина Всеволодовна

Ведущая организация ГОУВПО «Ам>рская гос) дарственна»

медицинская академия»

Защита состоится " 18 " мая в40 часов на заседании Диссертационного совета К 208 007 02 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранение и социальном) развитию» по адресу 690002, г Владивосток, пр Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 690002, г Владивосток, пр Острякова, 2

Авторефераг разослан "1А" 2007 г

Учснын секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских па} к ШмыковаИИ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Липиды морских гидробионтов привлекают пристальное внимание медицины как источники биологически активных веществ, в первую очередь п-3 полиненасыщеиных жирных кислот (ПНЖК), известных своими антиатерогенным, гипотензивным, тромболитпческим эффектами (Погожева AB и др , 2000, Новгородцева Г П и др , 2006, Calder PC et al, 2003, Aguilera A A et al, 2004, Hulbert A J et al, 2005) В то же время в состав суммарной липидной фракции морских гидробионтов могут входить и другие липиды, разнообразный состав которых определяет специфичность действия используемых средств и не позволяет подходить к нх применению по принципу аналогии Так, жир печени полярной акулы, используемый во многих исследованиях как источник п-3 ПНЖК, содержит в своем составе свыше 20% уникальных липидов - 1-О-алкил-диацилглицеринов (АДГ) - соединений, образованных жирными кислотами и спиртами (батиловый, химиловый и селехиловый - 1 -О-алкил-глицерины) (Гаджиева 3 М и др , 2002, Bernhard Е , 2003) Большие количества АДГ обнаружены в тканях морских беспозвоночных дальневосточных морей - командорского кальмара (до 50% в липидах печени) (Попков А А и др , 1997), камчатского краба (около 10% в липидах гепатопанкреаса) (Новгородцева Т П и др , 2005, 2006), что делает их перспективным сырьем для создания фармпрепаратов

Анализ данных литературы показал, что АДГ обладают иммуностимулирующими, гемопоэтическими, антиоксидантными свойствами (Chemmade С et al, 2002, Brites Р et al, 2004, Fan Q L et al, 2006), явпяются предшественниками в биосинтезе фактора активации тромбоцитов (ФАТ), опосредованно втияют на функциональную активность клеток крови, сердечно-сосудистой, репродуктивной и центральной нервной систем (Куликов В И и др , 1998, Lewkowicz Р et al, 2005) Доказан ряд негативных эффектов АДГ (сокращение мнометрия, понижение давления, бронхоспазмы, ш-перкоагуляция, цитотоксичность), что требует ограничений в применении некоторых липидных препаратов с высоким их содержанием (Acevedo R et al, 2006)

Отсутствие сведений об ограничении применения многокомпонентных липидных препаратов, действующим началом которых являются липиды ачкилглнцерино-вой структуры н ПНЖК в качестве профилактических средств при липидзависимых забочеваниях, ставит вопрос о необходимости углубленных исследований новых ис-

точников биологически активных липидов, установлении их безопасной и, биотроп-ной дозы и оптимального соотношения в них липидных составляющих

Цель исследования: установить характер биологического действия липидных препаратов из печени командорского кальмара и гепатопанкреаса камчатского краба на липидный обмен, систему «перекисное окисление липидов - антиоксндантная защита», параметры периферической крови и морфофункциональное состояние печени крыс при алиментарной дислипидемии и обосновать возможность их применения для коррекции дислипидемии

Задачи•

1 Исследовать состав липидов, выделенных из печени командорского кальмара НеггучеШ/и^ тадг^ег и гепатопанкреаса камчатского краба Рага'и1ин1еь сат-(%скаПса, дать сравнительную характеристику содержащихся в них биологически активных липидных компонентов

2 Воспроизвести модель алиментарнои дислипидемии у крыс и изучить влияние исследуемых препаратов липидов из морских гидробионтов на морфофункциональное состояние печени, липидный обмен, систем} «перекисное окисление липидов - антиоксндантная защита», параметры периферической крови у крыс с алиментарной дислипидемией

3 Оценить эффект исследуемых препаратов, обусловленный различным соотношением биологически активных липидов алкилглицериновой структуры и п-З ПНЖК по основным этпозависимым системам и функциям организма крыс при алиментарной дислипидемии

4 Провести выделение 1-О-алкилглицериновых эфиров (АГЭ) из исследуемых природных источников и установить долю их влияния в общем комплексе изучаемых биологически активных липидов морских гидробионтов

5 Установить оптимальное соотношение веществ алкилглицериновой структуры и п-З ПНЖК в одном природном комплексе и биотропиую дозу липидных препаратов для коррекции дислипидемии

Научная новизна Впервые изучены биологические эффекты препаратов природных липидов из печени командорского кальмара и гепатопанкреаса камчатского краба в условиях экспериментальной дислипидемии Установлена зависимость биологического действия липидных препаратов от состава, соотношения и структуры

входящих в липидиую компоненту составляющих (АГЭ и п-3 ГШЖК) Впервые показано, что для разработки фармпрепаратов и биологически активных добавок к пише из липидов морских гидробиоитов значимым фактором является наличие веществ ] -О-алкилглицериновой структуры

Практическая значимость работы. Настоящее исследование позволяет дополнить и угт>бить представления о механизмах действия липидов из морских гидробиоитов, содержащих 1-О-алкил-диацилгшщерины и расширить область их применения в практической медицине На основании проведенного исследования установлено оптимальное соотношение веществ алкилглицериновой структуры и ПНЖК в одном природном комплексе и биотропная доза лшпщиыч препаратов для профилактики дислипидемии Даны рекомендации для технологическом разработки фармпрепаратов и биологически активных добавок к пище с заданным составом и соотношением входящих липидных компонентов

Положения, выносимые на защиту:

1 Липиды печени командорского кальмара, содержащие до 50% 1-О-алкил-диацилглицеринов и 10% п-3 ПНЖК, при использовании в дозе 2 г/кг массы тела крысы оказывают негативное действие в условиях алиментарной дислипидемии, что проявляется пшерхолестеринемиеи, гиперлипопероксидемией, стеатозом, эритро- и тромбоцитозом, гиперкоагутяцией

2 Установлена роль 1-О-алкилглицериновых эфиров в реализации биологических эффектов препаратов липидов из морских гидробионтов, проявляющаяся ингибнрованием утилизации атерогенных липидов в крови и печени, развитием гипергликемии, мембранодеструкцией гепатоцитов, повышением функциональной активности и количества клеток красной и белой крови

3 Оптимальный биотропный эффект на организм крыс в условиях алиментарной дислипидемии оказывают липиды из гепатошикреаса камчатского краба в дозе 1 г/кг массы тела, содержащие 10% 1-О-алкллглицеринов и 10% п-3 ПНЖК

Апробация материалов работы. Результаты исследовании представтены на V Региональной конференции по актуачьным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии студентов, аспирантов и молодых ученых Дальнего Востока России (Владивосток, 2002), 11-и Российской конференции «Гепаточогия сегодня» (Москва, 2006), 7-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых уче-

ных с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2006), 3-м международном Тихоокеанском Конгрессе по традиционной медицине (Владивосток, 2006), 3-м Дальневосточном региональном Конгрессе «Человек и лекарство» (Владивосток, 2006), V Международном конгрессе «Доказательная медицина - основа современного здравоохранения» (Хабаровск, 2006), 2-й региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2006)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения рез\ льтатов, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 109 источников отечественных и 121 иностранных авторов, приложения, иллюстрирована 23 таблицами и 37 рисунками

Диссертационная работа выполнялась в рамках плановой НИР института, № госрегистрации 0120 0408169

Автор выражает искреннюю признательность директору НИИ МКВЛ, заслуженному деятелю науки РФ, профессору, дмн ЕМ Иванову за органшацшо, всестороннюю помощь и поддержку исследований Автор благодарит за участие в работе заведующего сектором лилидов Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйст-венного центра, к б н СП Касьянова, сотрудников лаборатории биомедицинских исследовании д б н Т И Боткину, к м н Е Г Исаченко, а также коллег из других лабораторий НИИ МКВЛ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты исследования. Эксперимент выполнен на крысах-самцах линии Вистар, выведенных в питомнике лабораторных животных РАМН «Столбовая» (г Чехов, Московская обл) Модель алиментарной дислипидемии вызывали разбалапсированным по составу жиров рационом с включением свиного сала и холестерина в течение 30 дней (Кою1и А, 1987) После развития модели ДЛП опытным животным ежедневно интрага-стралъно вводили соответствующие дозы изучаемых препаратов в течение 30 дней Эвтаназию животных осуществляли путем декапитации под эфирным наркозом

Материалы исследования. Материалом исследования явились липиды, выделенные из печени командорского кальмара Berryteuthis magiiter и гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschatica, n-З полиненасыщенные жирные кислоты, выделенные из печени рыб семейства тресковых, 1-О-алкичглицериновые эфнры, полученные путем технологического гидролиза лиггадов печени командорского кальмара, биоматериал крыс (кровь, эритроциты, плазма, сыворотка, ткань печени)

Afemodbt исследования. Экстракцию липидов in тканей гидробионтов проводили по методу Фолча (Folch JA et al, 1957) Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) получат по метод}' Каре - Дубак (1978) Чистые АДГ получали посредством микропрепаративной тонкослойной хроматографии, затем подвергали гидролизу 10% раствором КОН в этаноле Получившиеся в результате гидролиза моноалкилгли-церины экстрагировали диэтиловым эфиром и чистили методом тонкослойной хроматографии Газожцдкостную хроматографию МЭЖК и АГЭ осуществляли на газовом хроматографе GC-14B («Shimadzu», Япония) Обработку хроматограмм проводили на 6aie обсчета данных Chromatopac CR4-A («Shimadzu», Япония) Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот осуществляли по индексам удерживания Ковача (ECL) и стандартным смесям МЭЖК, идентификацию силиловых АГЭ проводили по стандартным смесям 1-О-алкилглицеринов

У крыс оценивали внешний вид, активность, биометрические параметры Лабораторные методы исследования биоматериала крыс включали определение гематологических параметров периферической крови на анализаторе Abacus (США), определение в сыворотке крови уровня глюкозы, общего белка и белковых фракций (альбумин, ai-глобулины, «г-глобулины, ß-глобулины), липидов общего холестерина (ОХС), триацилглицеринов (ТАГ), холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП), активности аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) на биохимическом анализаторе FP-901M фирмы «Labsystem» (Финляндия) Индекс атерогенности рассчитывали по формуле Фридваль-да (Климов А Н , 1999)

В ткани печени крыс после экстракции липидов методом одномерной тонкослойной хроматографии проводили количественное определение нейтральных липидов (ОХС, этсрифицированный холестерин (ЭХС), этернфицированные жирные кислоты (ЭЖК), неэстерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), ТАГ) (КейтсМ , 1975)

Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах крови определяли по методу М С Гончаренко и А М Лапшовой (1985), гидроперекисей липидов (ГПЛ) в плазме крови - по методу Л П Галактионовой (1998) Интенсивность процессов ПОЛ в печени крыс изучали по уровню образования ГПЛ, диеновых конъюгатов (ДК) и МДА (Стальная И Д и др, 1997) О состоянии системы антиоксидантной защиты (АОЗ) судили по интегральному показателю антиоксидантной активности (АОА) плазмы крови (Клебанов Г И и др, 1988) В крови количество восстановленного глутатиона (ГЛ) определяли по методу Ell-man (1959), активность глутатпонредукгазы (ГР) - по скорости окисления НАДФН в присутствии окисленного ГЛ (Ramos-Martmes IL et al, 1995), глутатионпероксидазы (ГПО) - по изменению поглощения восстановленного ГЛ после инкубации в присутствии перекиси водорода (Mills Т С, 1985), катала¡u в эритроцитах - по скорости утилизации перекиси водорода в реакционной смеси (Медицинские лабораторные технологии и диагностика, 1999)

Морфологическое исследование печени крыс проводили на гистологических срезах, окрашенных гематоксилином-эозином (Токмакова Н П, 2001) Препараты фотографирован! на микроскопе «Axiol mager А» фирмы Carl Zeiss (Германия) с нспотьзо-ванием цифровой камеры Canon G-6 (Япония)

Для анализа полученных данных использовалась прикладная программа «Sta-tistika» версия 6,1 (серия 1203С для Windows) Вычислялись следующие стагшстические параметры средняя величина (М), ошибка средней (т), среднее квадратическое (стандартное) отклонение (а) и критерий значимости Стьюдента (t) Критерий значимости Сгьюденга был применен после проверки нормальности распределения изучаемых параметров

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика липлдпого состава печени командорского катьмара и геиатопанкреаса камчатского краба

Исследование липидного состава изучаемых морских гидробионтов методом газожидкостной хроматографии показало, что преобладающим липидным компонентом печени командорского кальмара являются 1-О-алкил-диацилглпцерины, на долю которых приходится 50% от суммарного количества липидов (табл 1) Количество п-3 ПНЖК, входящих в состав триацилглицеринов и 1-О-алкил-диацилглицеринов ли-

пид[гого комплекса га печени кальмара, не превышает 10% Липиды гепатопанкреаса краба богаты ТАГ (85% от общих липидных составляющих) и биологически активными липидами алкилглпцериновой структуры (10%) Общее содержание п-3 ПНЖК в липидах гепатопанкреаса камчатского краба - 10% В жире краба также присутствуют природные антиоксиданты а-токоферол в количестве 0,129 г/100 г липидов и Р-каротип - 0,003 г/100 г липидов В количественном составе жирных кислот печени кальмара обнаружено 33 компонента, в липидах гепатопанкреаса камчатского краба -54 В исследуемых препаратах содержание биологически активных спиртов следующее в печени кальмара уровень химилового спирта (С160) - 55,2%, батилового (С180) - 6,9%, селехилового (С181) - 17,3%, ъ гепатопанкреасе камчатского краба найдены спирты С16 о- 47,2%, С18 о - '5,5%, С18, - 23,6%

Таблица 1

Состав липидов печешт командорского кальмара и гепатопанкреаса камчатского краба

Компоненты, г/100 г Липиды печени командорского кальмара Липиды гепатопанкреаса камчатского краба

Триацилглицерины 13 85

Алкил-диацилглицерины 50 10

Общее содержание п-З ПНЖК 10 10

Эфиры стеринов 15 2

а-токоферол - 0,129

р-каротнн - 0,003

Другие - 12 -3

Изучение состава липидов внутренних органов морских гидробионтов позволило установить качественное и количественное различие липидных составляющих печени командорского кальмара и гепатопанкреаса камчатского краба, что предполагает разный биологический эффект изучаемых препаратов

Состояние основных этиозависнчых систем крыс при алиментарной дпслипидемни

Формирование алиментарной ДЛП у крыс сопровождалось интенсивным увеличением массы тела, печени и паранефралыюго жира (в 2 раза, р<0,001) Наруше-

HVte i-омеостаза липидов проявилось гиперхолистеринемией (р<0,001), гнпсртригли-церинемней (р<0.001). накоплением нейтральных липидов в клетках печени, развитием стеатозв (табл. 2). 1 1аблюдалось увеличение содержания продуктов липоперок-спдации: гидроперекисей лип идо в, малонового дкальдегида в кропи и печени, ДК в печени (jxO.OOJ), яри одновременном снижении активности ферментов рсдокс-системы глутатиона л катал азы (р <0,001).

Структурно-функциональное повреждение клеток печени подтверждается ги-терактивностью ферментов АЛТ (р<0,001), ACT (р<0,001). ЛДГ (р<0,01), дисприте и нем ней и гистологической картиной, на которой отчетливо видна дезорганизация печеночных балок, дистрофия генатощггов, жировая вакуолизация (рис, 1).

а) б)

Рис. 1. Г"и сто логическое строение печени крыс: а) ннтакгнзя гр> ппа,

б) опытная группа J (модель ДЛП)

Объект ив 40х. гематоксилин-эозин.

Развитие ДЛИ у крыс сопровождалось уменьшением количества эритроцитов (р<0,05) и гемоглобина в них (р<0,05), снижением числа иммунокомпетентных клеток (лейкоциты, pcO.OOl; лимфоциты, р<0,01). На фоне повышения числа тромбоцитов ip<0,05) снижалось время свертывания крови (р<0,00П.

Полученные результаты сопоставимы е лигерэтурными данными (Дибиров А .Д., 2000; Антопкж М.В. и др., 2004-, Susan М., 2004) и свидетельствуют о развитии алиментарной дислипидемии, сопровождающейся окислитель щлм сгрсссом, стеато-зом, анемией, ги пер коагуляцией. Принимая во внимание множественные органные и системные изменения, вызванные метаболическими и функциональными нарушениями при формировании ДЛП, её экспериментальная модель является идеальным инструментом для изучения новых лечебных технологий.

Таблица 2

Биометрические, биохимические и гематологические показатели v крыс с алиментарной дислипидемией (М ± т)

Показатель Интактная, Опытная 1 (ДЛП),

п=10 п=10

Масса тела г 168±4,1 ***324,5±8,7

Масса печени, г 8,16±0,23 ***16,75±0,64

Масса паранеф жира, г 5,91 ±0,68 ***15,71+0,96

Кровь

ОХС, ммоль/л 1 57+0 04 ***3 34+0,04

ТАГ, мчоль/л 1,12±0,04 ***1,95±0,06

ХС ЛПВП, ммоль/л 0,67±0,04 ***0,26±0,02

Индекс атерогенности, у е 1,43±0,15 ***11,87+1,55

Общий белок, г/л 63,21+0,88 ***54,81+0,79

Альбумин г/л 27,95+0,45 ***42,22+1,00

CCi — глобулин, г/т 16,16+0,65 **20,50±1,01

С(2 - глобулин, г/л 5,25±0,35 ***7,76±0,21

Р - глобулин, г/л 4,57±0,18 ***9,83+0,43

АЛТ, ммоль/л 52Д1±3,50 ***108,91±3,57

ACT, ммоль/л 118,61±6,10 ***243,91±9,10

ЛДГ, ммоль/л 936,61±133,08 **1799,01±176,86

АОА, % 23,91+0,19 ***41,71±3,09

МДА, мкмоль/rllb 5,12+0,22 ***9,01±0,20

МДА/АОА, у е 0,130+0,006 ***0,22±0,01

ГПЛ, у е 0,79±0,03 ***3 49+0,11

ГЛ, моль/1 гНЪ 5,41±0,30 3,41 ±0,94

ГПО, мкмольГЛ/1мгНЬ/ч 44,49+1,11 ***32,51+1,37

ГР, мкмольНАДФН/ 1гНЬ/мин 75 15+2,12 *68,04+1 52

Каталаза, % 85,35±0,58 ***73,21+1,01

Эритроциты, 10'2/л 22 95±0,91 *20,24±0,65

Гемоглобин, г/л 110,1 ±2,7 *93,9±4,9

Среднее содержание гемоглобина в эритроците, Пг 4,89+0,28 **3,66±0,17

Цветной показатель у е 1,46±0,08 **1 09+0,05

Тромбоциты, 10ч/л 315+9,68 *349±10,27

Время свертывания крови, сек 22,81+0,71 ***10,60±0,65

Лейкоциты, Г/л 7,16±0,14 ***8,48±0Д2

Лимфоциты, 9Ь 22,20±0,92 **18,01±0,34

Печень

ОХС, % 16,59+0,30 ***20,04±0,26

ЭХС,% 14,42±0,44 **16 58±0,49

ТАГ, % 19,89+0,33 ***23,91±0,47

НЭЖК, % 14,46±0,25 13,85±0,45

ЭЖК,% 15,09+0,08 ***16,92+0,22

МДА, нмоль/мг белка 1,12±0,07 ***4,05+0,1б

ГПЛ, ед опт пт /г ткани 0 12+0 01 ***0,33±0,02

ДК, нмоль/мг липидов 0,43+0,04 ***1,69+0,13

Примечание в табл (*) - статистическая значимость различий относительно ин-тактной группы * - р<0,05, **-р <0,01, ***-р <0,001

Клинике препаратов из лнпвдов морских тидри б пиитов на основные этиозавневмые системы крыс при ад им ситар но и днелнпндемвн

Биологические эффекты липидов печени командорского кальмара. Изучение влияния липидов печени командорского кальмара в дозе 2 г/кг, рассчитанной исходя из физиологической потребности организма в п-3 ПНЖК, на биометрические параметры, динамику показателей системы ПОЛ-ДОЗ, липидный обмен, морф о-функциональное состояние гепатобилиарной системы и параметры периферической крови в условиях алиментарной ДЛП, выявило ряд негативных эффектов. У животных, несмотря на снижение калорийности рациона, масса тела продолжала увеличиваться (на 15%, ¡)<0Т001 >. В крови наблюдалось сохранение высокой концентрации охс и незначительное снижение ГАГ (на 15%, р<0,05) (табл. 3). в печени, напротив, выявлено снижение ОХС (р<0,01), но уровень ТАГ не изменялся, IГ7>ЖК повысились па 17,2% (р<0,001), ЭЖК - на 7,8% (р<0,05) (рис. 2).

ДЛП+лнпиды ДЛИ+липиды ДЛП+липиды ДЛП+липиды кальмара в лозе 2 кальмара «дозе 0,6 кальмара в дозе 0.3 краба в доте 1 г/кг г/ш г/кг г/кг

s охс ш :>хс и таг еэ i гшк т эжк

Рис, 2. Состав нейтральных липидов печени у крыс, получавших Лйпиды морских гидробионтов

Примечание: (*) - статистическая значимость различий относительно группы с ДЛП: 4 - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.

Ответственными за проявление специфического действия жира кальмара могут быть лнпиды с алк ил-rpy н пой, которые в отличие от п-3 пол неновых кислот способны ингкбировать реакции этерификацин холестерина в крови, катализируемые лештш-холестерин-ацшггрансфераэой, и тормозить липолитический каскад в адипоцитах за

счет увеличения внутриклеточной концентрации Са2+ (Куликов В.И., 1998; Меньшиков И.В., 2004; Pedro no F., 2004).

Концентрация глюкозы в крови иод действием жира кальмара уменьшилась на 22,6% (р<0,0!). На гистологических с речах отмечен выраженный отек пространства Диссе, отсутствие меж дельтовой соединительной ткани, сохранялась жировая вакуолизация паренхимы (рис. 6а). Биохимический анализ показателей ферментативной активности и белоксинтеэирующей функция гепагобипиарной системы подтверждает мембран о деструкцию клеток печени (увеличивалась активность АЛТ (р<0,01), ACT (р<0,001) и ЛДГ (р<0,05); содержание общего белка в сыворотке крови повышалось (р<0,001), но уровень белковых фракций снижался) (рис. 3).

ДЛП+липиды ДЛП+липнды ДЛП+липиды ДЛП+лиииды ДЛП+i>-3 кальмара вдозе кальмара® дозе кальмара в дозе крабавдозе ! 11НЖК

2 г/кг 0,6 г/к г 0,3 г/кг г/кг

■ общий белок ЕЭ альбумин □ al- глобулин ЕЭа2-глобулин 0 b-i.io6y.imi

Рис. 3. Содержание общего белка и белковых фракций в крови у крыс, получавших липиды морских гидробионтов

Примечание: (*) - статистически значимость различий относительно группы с ДЛИ: *,"-р<0,01;"*-р<0,001.

Дополнительным цитотоксическим фактором явилось усиление процессов ли-ноиероксидации, В печени наблюдалось накопление ГПЛ и ДК (р<0,001), в эритроцитах - МДА (р<0,001) и сохранение высокого уровня гидроперекисей липидон в плазме крови (рис. 5), Вместе с тем, выявкено увеличение активности глутатиопероксида-зы на 49,9% (р<0,001 ), содержание глутатиона в крови возросло на 48,7% (р<0,01 ) (рис. 4). На клетки крови воздействие препарата проявилось эритро-, громбо- и лим-фоцитозом, гиперкоагуляцией. Повышение количества клеток крови ггод действием

жира кальмара, возможно, объясняется влиянием алкоксилипидов на поэзы клеток, через повышение концентрации ионов кальция в цитозоле, что в свою очередь служит пусковым моментом формирования вторичных посредников, обеспечивающих пролиферацию (Frishein R et al, 1999, Stephan S et al, 1999) Усиленная коагуляция после применения липидов кальмара связана со способностью АГЭ активировать фос-фолипазу А2, что приводит к увеличению высвобождения арахидоновой кислоты (АК) и биосинтезу тромбоксана А2, проявляющего эффекты вазоконстрикции и агрегации (Brash A R , 2001, Hirabayasht Т et al, 2000)

Биологические эффекты гидролизованных 1-О-алкил-глицериновых эфирое. Чтобы доказать ответственность липидов с алкил-группой за проявление негативных эффектов жира из печени кальмара, была проведена серия экспериментов по изучению влияния 1-О-алкил-глицериновых эфиров, полученных методом технологического гидролиза природных АДГ, на основные этиозависимые системы крыс при алиментарной дислииидемии Введение препарата осуществлялось в дозе 1 г/кг массы тела крысы В качестве сравнения использовалась группа крыс, получавших п-3 ПНЖК в той же дозе

Действие АГЭ на метаболические процессы организма крыс проявилось увеличением массы тела (на 6,9%, р<0,05) при одновременном снижении массы паранеф-рального жира (ira 78%) и неизменившейся массе печени, незначительным уменьшением уровня сывороточного триацилглицерина (24,1%, р<0,05), сохранением высокого содержания ОХС в крови и повышенной активности ферментов-маркеров цитолиза (AJIT и ЛДГ), гипергликемией (концентрация глюкозы крови повысилась на 17,5%, р<0,001) (табл 3)

Нивелирование негативных эффектов АГЭ компенсировалось усилением анти-оксидантной защиты организма за счет повышения каталазной активности (р<0,001), что способствовало элиминации гидроперекисей липидов в крови (р<0,001) и стимуляцией синтеза гемоглобина

Результаты исследования свидетельствуют о важной роли 1-О-алкил-глицериновых эфиров в реализации биологических эффектов липидов печени кальмара, характеризующихся ингибированием утилизации атерогенных липидов, развитием гипергликемии, мембранодеструкцией гепатоцитов, повышением функциональной активности и количества клеток красной и белой крови

Таблица 3

Биометрические, биохимические и гематологические показатели у крыс с алиментарной дислжшдемией, _ _ получавших лппиды морских гидробионтов (М ± ш)___

Показатель ДЛП+липиды кальмара в дозе 2 г/кг, п=10 ДЛП+липиды кальмара в дозе 0,6 г/кг, п=10 ДЛП+типиды кальмара в дозе 0 3 г/кг п=10 ДЛП+липиды краба в дозе 1 г/кг п=10 ДЛП+п-ЗПНЖК, п=10 ДЛП+АГЭ п=10

Масса тела, г 469,7±6 8*** 395,0±12,8* 423,5+4 7*** 402 1+9,7** 379,5+9,75 462,4±11,1*

Масса печени, г 13,38+0,27*** 16 38±0 65 15,91+0,78 13,14+0 28*** 13,54+0,70** 18,81+1,23

Масса параиеф жира г 8,93+0 90*** 12,23+0,85** 9,87±0,83*** 6,73+0,51*** 3,86±0,36*** 5,7+1,1***

Глюкоза ммоль/л 6,81+0,38** 7,45±0 22** 7,36±0,91 6,12+0 46*** 6,50±0 54** 10,65±0 29***

ОХС, ммоль/л 2,95+0,11 3,01±0,2 2,25+0 17*** 1 07±0,03*** 2,21±0,02*** 2,93±0,21

ТАГ, ммоль/л 1,бб±0 07* 1,61+0,10* 1,65+011* 1 81+0 17 1,31±0,04*** 1,48+0,14*

ХС ЛПВП, ммоль/л 0,42±0,03*** 0,71±0,04*** 1 01+0 03*** 0,41±0,03*** 0,83±0,026*** 0,71+0,02***

Индекс атерогенности, у е 5,89±0 47*** 3 40±0,31*** 1,25±0,19*** 1,83+0,20*** 2,54+0,14*"* 3,25+0,18***

АЛТ, ммоль/л 189 60±15,52** 43,60±2 07*** 131,01±4,58*** 54 90+3,47*** 41,10+1,78*** 144,51+12,22***

ACT, ммоль/л 683,60+62,12*** 264,9+15,7 252,70±13,72 115,10+6,75*** 108,81+4,03*"* 237,70±16,55

ЛДГ, мчочь/л 4039,20±470,41* 2349,1±126,9* 3414,03±220,74*** 1047,20±245,46** 1258,31+220,78 2599 10+249,75*

АО А, % 30,34±1,46** 24,75±2,52** 27,92+1,25** 39,22+2,53 22,54±1,92*** 37,41±2,20

Каталаза, % 72,79±0,83 67,48±0,60*** 68,14+4,05 83,41+1 43*** 84,91 ±2,50** 84,21+1,29***

МДА, мкмоль/гНЬ 11,82+0,40*** 9,38+0,18 6,82±0 1]*** 8,24+0,41 8,30+0,33 8,41+0,26

ГПЛ, v с 2,59+0,91 2,47+0,12*** 1,47+0,10*** 1,45+0,15*** 1,58+0,02*** 1,26+0,04***

Эритроциты, 10и/л 39,87+0,96*** 26,48±0,96*** 26,45+0,61*** 30.93+0,60*** 24,78+0 81** 28,86±0,52***

Тромбоциты, 10'/л 529,54+40,60*** 225,21±12,91«* 203,51±22,23*** 284,50±12,37** 333,21±15,88 455,01±19,22***

Лейкоциты, Г/л 8,19+0,26 10,01±0,42** 12,48+0,56*** 9,31+0,24* 9,78±0,09*** 8,13+0,50

Лимфоциты, % 36,51+2,30*** 37,44±1,16*** 29,90+2,29*** 28,1+1,4*** 19,21+0,99 31,41+1,64***

НЬ, г/л 187,7+8,9*** 131,6+4,2*** 206,5±10,2*** 149,4±4,6*** 128,1+4,0*** 150,7±2 4***

Ср содержание НЬ в эритроците, Пг 4,79±0 19*** 5,05±0,36** 7,84+0,42** 4 84±0 16*** 5,18+0,13*** 5,23±0,12***

Цветной показатель,у е 1,41+0,05*** 1,51±0,И** 2,35±0,12*** 1,45±0,05*** 1,55+0,03*** 1,57+0,03***

Bp св крови, сек 6,14±0,28*** 58,81±5,70*** 61,50±6,41*** 51,70+2,57*** 22,80±0,64*** 24,51±0,58***

Примечание (*)- статистическая значимоаь различий относительно опытной группы 1 (ДЛП) * - р < 0,05, ** - р <0,01, *** -р < 0,001

Дошшвисимый чффект липидов печени командорского кальмара. Учитывая установленное негативное действие липидов печени кальмара, обусловленное, как было доказано, действием веществ алк ил глицеринов ой структуры, актуальным вопросом стал обоснованный подбор доз препаратов с высоким содержанием I -О-алкил-диацилглицеринов.

ДЛП+липиды кальмара и ДЛП+липиды кальмара о ДЛП+липиды кальмара в дозе 2 г/кг дозе 0,6 [/кг дозе 0.3 г/кг

■ ГЛ. моль/1 гНЬ 0 ГР. мкмольНАДФ№ 1гНЬ/мнн В ГПО, мкмольГЛ/1мгНЪ/ч

Рис. 4. Содержание гл у тати она и активность ферментов гл утатиовового звена в крови крыс, получавших липиды морских шдробиомтов

Примечание: (*) -статистическая значимость различий относительно группы с ДЛИ: ** -р< 0,01; 0,001.

ДЛП+липнды кальмара в ДЛП+липиды кальмара в ДЛП+липиды краба н дозе I дозе 2 г/кг дозе 0,6 г/кг г/кг

О ГПЛ, едопт.пл-'г ткани ЕШ ДК, нмоль/мг липидов ¡3 МДД., нмоль/мг бейка

Рис. 5. Содержание лнпопероксидов в печени крыс, получавших липиды морских гидробионтОВ

Примечание: (*) - статистическая значимость различий относительно группы с ДЛП: * * - р < 0,01; **""-р< 0,001.

Дозозависимый эффект липидов кальмара проявился в сохранении высокой концентрации ОХС в крови и печени при использовании препарата в количестве 0,6 г/кг, уменьшение дозировки до 0,3 г/кг приводило к снижению уровня ОХС в крови на 32,5% (р<0,001) и в печени на 21,4% (р<0,001) Слабый гипотриглицеринемиче-скпи эффект наблюдался после использования обеих доз препарата

Введение препарата липидов кальмара приводило к улучшению структурно-функционального состояния печени, однако полной регрессии не выявлено (рис 66, 6г)

Включение в рацион питания крыс липидов кальмара в концентрации 0,6 г/ю восстанавливало исходной уровень АОА Вместе с тем, в условиях ДЛП такая анти-оксидантная активность являлась недостаточной для адекватной элиминации продуктов ПОЛ Сохранялся высокий уровень МДА (р<0,001) в крови и повышалась концентрация ГПЛ (на 39%, р<0,001) и ДК (на 43%, р<0,001) в печени (рис 5) Снижение дозы препарата до 0,3 г/кг способствовало детоксикацин МДА и ГПЛ в крови (р<0,001) Ферментативное звено АОЗ характеризовалось повышением активности ГПО, ГР (р<0,001) (рис 4) Наши результаты согласуются с немногочисленными ли тературными данными, в которых показана способность АГЭ, выделенных из акульего жира, проявтять антиоксидантное действие за счет восстановления активности ферментов мпгохондриальной дыхательной системы и увеличения количества глута тиона в цнтозоле клеток > крыс (Fan Q L et al, 2006)

Препарат липидов из печени кальмара в обеих дозах повышал количество эритроцитов, имч) некомпетентных клеток, содержание общего гемоглобина и среднего уровня гемоглобина в эритроците Число тромбоцитов снижалось, что в свою очередь противодействовало гиперкоагу ляции (табл 3)

Полученные результаты свидетельствуют о прямой зависимости интенсивности и специфичности действия препарата от используемой дозы С одной стороны, то количество АДГ, которое поступаю в организм, являлось достаточным для проявления гемоглобинсинтезнрующего действия и умеренного гепатопротекторного эффекта С другой, липиды кальмара в диапазоне доз 0,6-0,3 г/кг не могли полностью восполнить дефицит п-3 ПНЖК, что приводило к недостаточному терапевтическому эффекту

Биологические эффекты липидов гепатопанкреаса камчатского краба. Введение крысам препарата липидов кальмара в количестве 0,6-0,3 г/кг, учитывающем содержание в нем АДГ, оказалось малоэффективным в коррекции метаболических нарушений, сопровождающих дислипидемию Необходимо было найти такой источник природных биологически активных липидов, при использовании которых в организм поступало бы необходимое количество как АГЭ, так и n-З ГТНЖК для проявления общесистемного терапевтического воздействия на организм в целом и орган-мишень без побочных последствий Внимание привлекли липиды, выделенные из гепатопанкреаса камчатского краба, содержащие по 10% 1-О-алкил-глицеринов и n-З ПНЖК в соотношении 1 1 В исследовании использовали дозу 1 г/кг, способную восполнить суточную потребность организма в n-З ПНЖК и содержащую при этом такое количество АГЭ, которое, согласно ранее описанным результатам, не должно оказывать отрицательного воздействия

Результаты исследования показали гиполипидемическое и гипогликемическое действие липидов гепатопанкреаса краба, проявившееся снижением на 67,9% уровня ОХС (р<0,001) и глюкозы (на 30%, р<0,001) в крови (таи т 3), ТАГ, ОХС (р<0,001) и ЭХС (р<0,05) в печешх (рис 2) Липидные компоненты краба оказали гепатопротектор-ный эффект снижалась активность АЛТ, ACT (р<0,001), ЛДГ (р<0,01) и нормализовался уровень общего белка и белковых фракций в крови, наблюдалось восстановление архитектоники печеночных балок, процент некротических клеток значительно снижался, жировая инфильтрация печени уменьшалась (рис 6в)

Наличие в липидах гепатопанкреаса краба природных биоантиоксидантов (а-токоферот, p-каротин), осуществляющих противоокислительное действие на второй линии антиоксидантной защиты, приводило к нейтрализации продуктов липопероксидации в крови и печени Увеличение активности кататазы усиливало АОЗ

Липиды краба проявили противоанемическое, иммуномодулирующее, антикоагу-ляционное действие По-видимому, введение липидов краба приводит к балансу между проагрегационными медиаторами (тромбоксан А2, ФАТ), усиленный биосинтез которых происходит при действии веществ алкилглицериновой структуры, и антиагрегацггонньг-ми (простаглацдин Е3), образующимися га n-З ПНЖК, что способствует нормализации метаболических процессов в клетках крови и эндотелия Можно заключить, что соотношение АГЭ и n-З ПНЖК - 1 1, обнаруженное в липидах краба, является оптимальным для коррекции дислипидемии

с-.,-]

■ 'ЙИ^&г: » '■* < » >

Ж'!!* $ Ч'-* а- "Г,

'ЭЙ:

Рис. 6. Гистологической строение печени крыс, получавших липиды морских гидробионтов: а') липиды кальмара в дозе 2 г/кг, объектив 100х; б) липиды кальмара в доче 0,6 г/кг, объектив 100"; в) липиды краба в доче I г/кг, объектив 40х; г) .'¡и и иды кальмара в доче 0,3 г/кг, объектив 100\ гематоксидин-эозин

Таким образом, благодаря способности экзогенных «морских» липидов включаться в биосинтез различных классов медиаторов, оказывающих множественные ¡¡шзноЛогн-ческие воздействия, можно предопределять активное влияние адимещарных АГЭ и п-3 111-1ЖК на большинство жизненно-важных процессов. При этом необходимым условием является соотношение биологически активных начал в одном природном комплексе. Превалирование АГЭ; в препарате липидов кальмара приводит к ингнбированию многих полезных эффектов п-3 ПНЖК, в частности типолипидемических, цигопротекгивных и появлению гиперкоагуляции, мембрано деструкции. Отсюда следует, 'по при алиментарной дислипидемни применение препарата лнпидов командорского кальмара, содержащего 502 АД1', для коррекции параметров липшшого, белкового, углеводного обменов, ферме! ггативной активности теггаггобилиарной и аитиоксидантной систем не целесообразно. Считывая, что использование препарата липидов краба в доче 1 г/кг массы тела, содержащего по 10% АГ'О н Ш !ЖК, обеспечивало положительную динамику всех изучаемых метаболических процессов, можно рекомендовать соотношение яилвдных состав ляп чцих 1:I как оптимальное для разработки фармпрепаратов и Геологически акгик-ных добавок к пище из морских гщробионтов и применения их в клинической практике с целью профилакт ики и лечения липидчависимых заболеваний.

ВЫВОДЫ

1 Липпды, выделенные из печени командорского кальмара ВеггутпЫъ та$н(ег, содержат 50% 1-О-алкилглицеринов и 10% п-3 ПНЖК от общих липидов (соотношение 5 1), липиды, выделенные из гепатопанкреаса камчатского краба Рага1п1юс1е% < ат(\с!т(1са содержат по 10% 1-О-алкилглицеринов и п-3 ПНЖК от общих липидов (соотношение 1 1)

2 Липиды из печени командорского кальмара в дозе 2 г/кг оказывают нагрузочное действие на гомеостатические функции организма в условиях алиментарной дислипидемии, проявляющееся в повышении активности аминотрансфераз н лактаде-гадрогеназы в крови, мембранодеструкции и жировой инфильтрации клеток печени, нарушении белоксинтетической функции гепатобилиарной системы, сохранении высокого уровня общего холестерина в крови и триацилглицеринов в печени, усилении процессов липопероксидации, эритро- и тромбоцитоза, гиперкоагуляции

3 Установлен выраженный дозозависимый эффект препарата липидов из печени командорского кальмара, который в дозах 0,3-0,6 г/кг оказал противоанемический, иммуностимулирующий, антикоагуляционнын эффекты, однако при этом сохранялась гнпер1 ликемия, высокий уровень холестерина в крови и печени, повышенная активность лактатдегидрогеназы и аланиначинотрансферазы

4 Доказана роль 1-0-алкилглицериновых эфиров в реализации биологических эффектов препаратов липидов из морских гидробпонтов, проявляющаяся в ингибиро-вании утилизации атерогенных липидов, развитии гипергликемии, мембранодеструкции гепатоцитов, повышешш функциональной активности и количества клеток красной и белой крови

5 Липиды из гепатопанкреаса камчатского краба в дозе 1 г/кг проявляют гипо-холестерннемнческип, гипогликемнческий, протавоанемичесюш, антикоагуляцион-ный эффекты, снижают уровень холестерина и триацилглицеринов в печени, оказывают гепатопротекторное, антиоксидантное действие

6 Для разработки фармпрепаратов и биологически активных добавок к пище из морских гидробионгов оптимальным соотношением п-3 ПНЖК и 1-О-алкилглицеринов является 1 1, при этом количество веществ алкилглицериновой структуры не должно превышать 10% от суммы липидов Биотропная доза таких препаратов для коррекции метаболических нарушений, сопровождающих диелнпидемию - 1 г/кг массы тела

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Караман, Ю К Влияние жира командорского кальмара на систему неспецифической резистентности, гематологические параметры и липидный статус крыс при кардиова-зопатии / Ю К Караман, Т И Виткша // V Репюнатьная конференция по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии студентов, аспирантов и молодых ученых Дальнего Востока России сб материалов - Владивосток, 2002 — С 52-53

2 Караман, Ю К Действие биологически активной добавки «Магистр-ойл» на систему неспецнфнческой резистентности и гематологические параметры крыс при кардиопа-тии / Ю К Караман, Т И Виткина, С П Касьянов // Полигика здорового питания сб материалов VII Всерос конгр -М,2003 - С 56

3 Караман, Ю К Воздействие отгпидной вытяжки из командорского кальмара на систему неспецифической резистентности крыс при экспериментальной кардиопатш / Ю К Караман, Т И Виткина //1 Всероссийская конференция по иммунотерапии с между нар участием сб материалов - Сочи, 2003 - С 134

4 Караман, ЮК Влияние жира командорского кальмара на липидный статус и систему «перекисное окисление липцдов - шггиоксидантггая защита» крыс при экспериментальной кардиопатии / Ю К Караман // Актуальные проблемы кардиологии сб материатов Xюбилейнойнауч-практ конф смевдунар участием -Тюмень,2003 -С 79

5 Караман, Ю.К Гепатопротекторный эффект липидов из печени командорского кальмара при алиментарной гиперлипидемии / Ю К Караман // Рос журнал гастроэнтерологии, гепатололш, колопроктолопш Приложение № 27 материалы 11 Рос конф «Гепа-тология сегодня» -2006 -Т 16,№1 -С 61

6 Караман Ю К Влияние БАД «Эйколан» на липидный статус и систему «перекис-ное окисление липидов - антиоксидантная защита» крыс при экспериментальной кардиопатии / ЮК Караман // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины сб материалов 7-й Тихоокеанской науч -практ конф студентов и молодых ученых с между нар участием -Владивосток, 2006 - С 216

7 Караман, Ю К Антиоксндантный эффект липидов гепатопанкреаса камчатского краба при экспериментальной алиментарной птерлнпидемии / Ю К Караман, И С Батци-кова // 3-й между народный Тихоокеанский конгресс по традиционной медицине сб материалов - Владивосток, 2006 С 171

8 Караман, Ю К Влияние препарата липидов гепатопатжреаса камчатского краба на иммунолетические показатели крыс при алиментарной гиперлигащемии / ЮК Караман, Е Г Исаченко, С П Касьянов // Человек и лекарство сб материалов 3-й Дальневос регион конгр -Владивосток,2006 -С 63

9 Караман, ЮК Негативное дозозависимое действие липидов из морских гидро-бионтов, содержащих алкилдиацилгшщериды при экспериментальной кардиопатии / ЮК Караман, С П Касьянов // Доказательная медицина - основа современного здравоохранения сб материалов V Мезвдунар контр - Хабаровск, 2006 - С 53

10 Караман, КЖ Влияние 1-О-алшл-глицериновых эфиров печени командорского кальмара на гематологические параметры крови крыс линии Впстар / ЮК Караман, С П Касьянов // Исследования в области физико-химической биолопш и биотехнологии тезисы докладов 2-й регион науч конф - Владивосток, 2006 - С 111

И Караман ЮК Экспериментальное обоснование применения липидов морских пэдробионтов при алиментарной гиперлшшдемии / ЮК Караман, СП Касьянов // Здоровье Мед экология Наука -2006 -№ 1(25) - С 84-87

12 Дозозависимый эффект биологически активной добавки к пище «Магпстр-ойл» при экспериментальной сердечно-сосудистой патологии / ТП Новгородцева, ЮК Караман, Т А Гвозденко и др // Бюл физиологии и патологии дыхашм - 2007 - Вып 25 - С 63-67

13 Эндотелиальная дисфункция церебральных сосудов при артериальной пгпертен-зии/БИ Гельцер, ВН Котельников ИГ Агафонова и др //Бюл физиологии и патологии дыхания -2007 -Вып 25 - С 22-25

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ АГЭ - 1-О-алкил-глицериновые эфиры АДГ - 1-0-алкил-диацилглицерины АК - арахидоновая кислота АЛТ - аланинаминотрансфераза АОА - антиоксидантная активность АОЗ - антиоксидантная защита А СТ - аспартат аминотрансфераза ГЛ - глутатпон ГПЛ - гидроперекись липидов

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

ДК - диеновые коньки аты

ДЛП - дислипидемия

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МДА - малоновый диальдегпд

МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот

Н Л ДФ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат

НЭЖК - неэстерпфицированные жирные кислоты

ОХС - общий холестерин

ПНЖК — полипенасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ТАГ - триацилглицерины

ФАГ - фактор активации тромбоцитов

ХС ЛТТВП - холестерин липопротеинов высокой плотности

ЭЖК - зтерифицировапные жиргтые кислоты

ЭХС - этерифицированный холестерин

НЬ - гемоглобин

Подписано в печагь 12 04 2007 г Формаг 60x90/16 1 уч -изд л Тираж 100 лез Заказ Л';; 66 Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «1 ИНРО-Центр» г Владивосток, ул Западная, 10

Актуальность исследования

Липиды морских гидробионтов привлекают пристальное внимание медицины как источники биологически активных веществ (БАВ), в первую очередь n-З полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) известных своими гиполипидемическими, антиатерогенными, гипотензивными, тромболи-тическими эффектами [47, 58, 70, 85, 93, 212]. Однако преобладающая часть липидных компонентов многих гидробионтов помимо ПНЖК содержит необычные липиды - 1-О-алкил-диацилглицерины (АДГ), обладающие высокой биологической активностью, отличной от полиеновых кислот семейства п-3 [14, 71, 87,123,159, 178].

В мировой медицинской практике более 40 лет находит применение жир печени акулы, содержащий свыше 20% 1-<9-алкил-диацилглицеринов [14, 57, 80, 87, 170, 182, 194, 208]. Наиболее хорошо изучено влияние акульего жира при онкологических заболеваниях, что обусловлено анти-пролиферативными [170, 182, 205], гемопоэтическими [152, 171, 197], радиопротекторными свойствами липидов с алкил-связыо [80]. Вместе с тем анализ данных литературы показал, что АДГ обладают иммуностимулирующими [172], антиоксидантными свойствами [148, 170, 195], являются предшественниками в биосинтезе фактора активации тромбоцитов (ФАТ) [51, 126], опосредованно влияют на функциональную активность клеток крови, сердечно-сосудистую, иммунную, репродуктивную системы [179, 180, 192]. Доказан ряд негативных эффектов АДГ, что требуют ограничений в применении некоторых липидных препаратов с высоким их содержанием [71,110].

Большие количества АДГ обнаружены в тканях морских беспозвоночных дальневосточных морей - командорском кальмаре (до 50% в липи-дах пищеварительной железы) [77, 159], камчатском крабе (около 10% в липидах гепатопанкреаса) [72]. Разрабатываемые на основе внутренних органов этих гидробионтов биологически активные добавки (БАД) рекомендуются исключительно как источники ПНЖК для лечения и профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы, присутствие липидов с алкил-группой не учитывается, что с одной стороны суживает терапевтические возможности данных препаратов, а с другой делает необоснованным подход к их использованию.

Отсутствие сведений об ограничении применения многокомпонентных липидных препаратов, действующим началом которых являются ли-пиды алкилглицериновой структуры и ПНЖК, в качестве профилактических средств липидзависимых заболеваний ставит вопрос о необходимости исследований новых источников биологически активных липидов, установлении их безопасности, биотропной дозы и оптимального соотношения в них липидных составляющих.

Цель: установить характер биологического действия липидных препаратов из печени командорского кальмара и гепатопанкреаса камчатского краба на липвдный обмен, систему «перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита», параметры периферической крови и морфофунк-ционалыюе состояние печени крыс при алиментарной дислипидемии и обосновать возможность их применения для коррекции дислипидемии.

Задачи нсслсдованпп:

1. Исследовать состав липидов, выделенных из печени командорского кальмара Berryteuthis magister и гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschatica; дать сравнительную характеристику содержащихся в них биологически активных липидных компонентов.

2. Воспроизвести модель алиментарной дислипидемии у крыс и изучить влияние исследуемых препаратов липидов из морских гидробио-нтов на морфофункциональное состояние печени, липидный обмен, систему «перекисное окисление липидов — антиоксидантная защита», параметры периферической крови у крыс с алиментарной дислипидемией.

3. Оценить эффект исследуемых препаратов, обусловленный различным соотношением биологически активных липидов алкилглицериновой струетуры и п-3 ПНЖК по основным этнозависимым системам и функциям организма крыс при алиментарной дислипидемии.

4. Провести выделение ЬО-алкилглицериновых эфиров (АГЭ) из исследуемых природных источников и установить долю их влияния в общем комплексе изучаемых биологически активных липидов морских гидробионтов.

5. Установить оптимальное соотношение веществ алкилглицери-новой структуры и п-3 ПНЖК в одном природном комплексе и биотроп-ную дозу липидных препаратов для коррекции дислипидемии.

Научная новизна работы

Впервые изучены биологические эффекты препаратов природных липидов из печени командорского кальмара и гепатопанкреаса камчатского краба в условиях экспериментальной дислипидемии. Установлена зависи-. мость биологического действия липидных препаратов от состава, соотношения и структуры входящих в липидную компоненту составляющих (АГЭ и п-3 ПНЖК). Впервые показано, что для разработки фармпрепаратов и биологически активных добавок к пище из липидов морских гидробионтов значимым фактором является наличие веществ 1-0-ал кил глицериновой структуры.

Практическое значение работы

Настоящее исследование позволяет дополнить и углубить представления о механизмах действия липидов из морских гидробионтов, содержащих 1-О-алкил-диацилглицерины и расширить область их применения в практической медицине. На основании проведенного исследования установлено оптимальное соотношение веществ алкилглицериновой структуры и ПНЖК в одном природном комплексе и биотропная доза липидных препаратов для профилактики дислипидемии.-Даны рекомендации для технологической разработки фармпрепаратов и биологически активных добавок к пище с заданным составом и соотношением входящих липидных компонентов.

Положения, выносимые на защиту:

1. , Липиды печени командорского кальмара, содержащие до 50% 1-0-алкил-диацилглицеринов и 10% n-З ПНЖК, при использовании в дозе 2 г/кг массы тела крысы оказывают негативное действие в условиях алиментарной дислипидемии, что проявляется гиперхолестеринемией, гиперлипопероксидемией, стеатозом, эритро- и тромбоцитозом, гиперкоагуляцией.

2. Установлена роль 1-О-ал кил глицериновых эфиров в реализации биологических эффектов препаратов липидов из морских гидробио-нтов, характеризующаяся ингибированием утилизации атерогенных липидов в крови и печени, развитием гипергликемии, мембранодеструкцией ге-патоцитов, повышением функциональной активности и количества клеток красной и белой крови. ,

3. Оптимальный биотропный эффект на организм крыс в условиях алиментарной дислипидемии оказывают липиды из гепатопанкреаса камчатского краба в дозе 1 г/кг массы тела, содержащие 10% 1-0-алкилглицеринов и 10% n-З ПНЖК.

Апробация работы у

Результаты исследований представлены на V Региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии студентов, аспирантов и молодых ученых Дальнего Востока России (Владивосток, 2002), VII Всероссийском конгрессе «Политика здорового питания» (Москва, 2003), I Всероссийской конференции по иммунотерапии с международным участием (Сочи, 2003), X юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы кардиологии» (Тюмень, 2003), 11-й Российской конференции «Ге-патология сегодня» (Москва, 2006), 7-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2006), 3-м международном

Тихоокеанском Конгрессе по традиционной медицине (Владивосток, 2006), 3-м Дальневосточном региональном Конгрессе «Человек и лекарство» (Владивосток, 2006), V Международном конгрессе «Доказательная медицина — основа современного здравоохранения» (Хабаровск, 2006), 2-й региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2006).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, содержащего 109 источников отечественных и 121 иностранных авторов, приложения, иллюстрирована 23 таблицами и 37 рисунками.

102 ВЫВОДЫ

1. Липиды, выделенные из печени командорского кальмара Berryteuthis magister, содержат 50% 1-Оалкил-диацилглицеринов и 10% п-3 ПНЖК от общих липидов (соотношение 5:1); липиды, выделенные из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschatica содержат по 10% 1-О-алкил-диацилглицеринов и п-3 ПНЖК от общих липидов (соотношение 1:1).

2. Липиды из печени командорского кальмара в дозе 2 г/кг оказывают нагрузочное действие на гомеостатические функции организма в условиях алиментарной дислипидемии, проявляющееся в повышении активности аминотрансфераз и лактадегидрогеназы в крови, мембранодеструкции и жировой инфильтрации клеток печени, нарушении белоксинтетической функции гепатобилиарной системы, сохранении высокого уровня общего холестерина в крови и триацилглицеринов в печени, усилении процессов лнпопероксидации, эритро- и тромбоцитоза, гиперкоагуляции.

3. Установлен выраженный дозозависимый эффект препарата липидов из печени командорского кальмара, который в дозах 0,3-0,6 г/кг оказал противоанемический, иммуностимулирующий, антикоагуляционный эффекты, однако при этом сохранялась гипергликемия, высокий уровень холестерина в крови и печени, повышенная активность лактатдегидрогеназы и ала-нинаминотрансферазы.

4. Доказана роль 1-Оалкилглицериновых эфиров в реализации биологических эффектов препаратов липидов из морских гидробионтов, проявляющаяся в ингибировании утилизации'атерогенных липидов, развитии гипергликемии, мембранодеструкции гепатоцитов, повышении функциональной активности и количества клеток красной и белой крови.

5. Липиды из гепатопанкреаса камчатского краба в дозе 1 г/кг проявляют гипохолестеринемический, гипогликемический, противоанемический, антикоагуляционный эффекты, снижают уровень холестерина и триацилглицеринов в печени, оказывают гепатопротекторное, антиоксидантное действие.

6. Для разработки фармпрепаратов и биологически активных добавок к пище из морских гидробионтов оптимальным соотношением n-З ПНЖК и 1-0-алкил-диацилглицеринов является 1:1, при этом количество веществ алкил-глицериновой структуры не должно превышать 10% от суммы липидов. Биотропная доза таких препаратов для коррекции метаболических нарушений, сопровождающих дислипидемию не более 1 г/кг массы тела.