Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующее действие противовирусного препарата фоспренил в норме и при экспериментальной гриппозной инфекции

На правах рукописи

Григорьева Екатерина Анатольевна

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОТИВОВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА ФОСПРЕНИЛ В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.00.36. - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор А.В.Пронин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Носик доктор медицинских наук О.Н. Щегловитова

Ведущая организация:

ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Защита диссертации состоится «.-тТ.» апреля 2004 года в 11 час. на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан марта 2004 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор

Е.В.Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на достигнутые успехи в борьбе с некоторыми вирусными инфекциями, продолжает сохранять актуальность поиск различных, в том числе неспецифических, средств защиты от них. В отличие от специфических, последние, обладая иммуномодулирующими свойствами, могут найти более широкое применение. Одним из таких средств является фоспренил - препарат, некоторые свойства которого были исследованы в данной работе. Фоспренил представляет собой натриевую соль полипренилфосфата - соединения, получаемого из хвои сосны. Поли-пренолы и их производные синтезируются в клетке, играют важную роль в процессе гликозилирования гликопротеинов и являются промежуточным продуктом при биосинтезе природных соединений, содержащих длинные изопреновые цепи, например убихинона и витамина Е (Moody D.B.2001, Schenk В 2001, Kukuruzinska M 1998). Эндогенные полипренолы, долихолы, их жирнокислотные эфиры и фосфорилированные производные - интегральные компоненты биологических мембран, влияющие на многие свойства последних (Rip J.W.I985).

Как показали предварительные исследования, новый препарат обладает противовирусными свойствами и соответствует многим требованиям, предъявляемым к препаратам данного класса (Хаитов P.M. 2002). Фоспре-нил не обладает токсическими свойствами (превышение терапевтической дозы в 100 раз не приводило к гибели животных). При длительном применении препарат не обладает эмбриотоксическими свойствами, канцероген-ностью, не вызывает аллергии и привыкания.

Однако механизмы его противовирусного действия до конца не выявлены. Предполагается, что он влияет на сборку или на взаимодействие вирусной частицы с рецепторами клетки мишени, в результате чего инфекция либо не развивается, либо формируются дефектные частицы. Другой механизм противовирусного действия фоспренила может быть связан с его способностью повышать естествен!

Установлено, что фоспренил активирует макрофаги, вызывает выработку ИФН у, ФНОа (Sanin A.V, Danilov L.L. 1992,1993).

Цель работы: изучение влияния фоспренила на некоторые показатели иммунитета в норме и при гриппозной инфекции у экспериментальных животных.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние фоспренила на пролиферативную активность клеток лимфоидной системы мышей.

2. Определить влияние фоспренила на продукцию цитокинов in vivo и in vitro и оценить экспрессию рецепторов к ним.

3. Исследовать воздействие фоспренила на активность естественных кил-лерных клеток селезенки (ЕКК) мышей in vivo и in vitro.

4. Сравнить изменения в иммунной системе, вызванные фоспренилом, в условиях нормы у интактных животных и при экспериментальной гриппозной инфекции у мышей.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые установлено, что фоспренил не оказывает митогенного действия на лимфоциты селезенки мышей, но подавляет их пролиферацию, вызванную Кон А, а также снижает экспрессию рецепторного комплекса к ИЛ-2.

Впервые получены данные о том, что введение фоспренила экспериментальным животным кратковременно повышает активность ЕКК селезенок мышей, а затем снижает ее ниже исходного уровня через сутки после введения препарата, при этом снижение активности ЕК связано с повышением активности циклооксигеназы.

Впервые показано, что добавление фоспренила в культуру клеток селезенки снижает продукцию ИЛ-2 и ИЛ-10, вызываемую Кон А, тогда как введение фоспренила экспериментальным животным стимулирует продук-

цию ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ--5, ИЛ-12 и ФНОа, но не вызывает продукции ИЛ-2 и ИЛ-10.

Разработана экспериментальная схема профилактики гриппах помощью фоспренила. Впервые показано, что фоспренил оказывает выраженный протективный эффект при интраназальном заражении вирусом гриппа А (штамм Aichi/2/68) экспериментальных животных.

Полученные данные могут быть использованы в разработке нового профилактического противогриппозного средства, обладающего прямым противовирусным и иммуномодулирующим действием.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы апробированы на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ им. Гамалеи РАМН 26 декабря 2003 года. Фрагменты исследований были доложены на научных конференциях: 5-ой иммунологической школе им. Дж. Хамфри «Immunology in health and disease» (Пущино, 2000), 6-ой Международной школе им. Дж. Хамфри «Molecular basis of the immune response» (Пущино, 2002) и III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва 2004 год.

Структура и объем диссертации.

Работа написана по традиционному плану и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Собственные исследования», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы» (170 источников, в том числе 46 работ отечественных авторов). Общий объем диссертации составляет 122 страницы. Диссертация иллюстрирована 21 рисунками и 12 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Материалы и методы.

2. 1.1. Материалы.

Вирус гриппа А. Использовали вирус гриппа A /Aichi/2/68 H3N2 , прошедший 12 пассажей на мышах и 2 - на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Титр вируса определяли по формуле Рида-Менча и выражали в IgLDso В эксперименте была использована доза 2,5 LD50. Вирус получен из лаборатории индукторов интерферона ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Вирус ЕМС. Вирус энцефаломиокардита мышей, штамм Колумбия SK-Col-SK, с титром Ю7 ЦПДзо- Вирус пассировали 3 раза на культуре L-929 и хранили при -20°С. Вирус получен из лаборатории индукторов интерферона ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Животные. В работе использовали клинически здоровых беспородных мышей, мышей линии СВА и BALB/c весом 18-20 г, полученных из питомника «Столбовая» РАМН.

1.2.Основные методы работы.

Для постановки иммунологических реакций у животных забирали селезенку или тимус. Органы надрезали и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. Гомогенаты фильтровали через фильтры из нержавеющей стали с диаметром отверстий 50 - 100 мкм и затем дважды промывали в среде центрифугирования (СЦ) (среда RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки КРС) для освобождения от клеточного детрита. Суспензии клеток центрифугировали при 1500 об/мин, в течение 10 мин. двукратно. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева.

Цитотоксическая активность клеток. Цитотоксическую активность ЕК в суспензии спленоцитов мышей оценивали с использованием радиометрической методики в модификации (Рыкова М.П.1981) против меченых -уридином в дозе 3 мкКи/мл КМ стандартных длительно поддерживаемых в культуре in vitro клеточных линий.

В качестве клеток-мишеней использовали монослой клеток L-929, меченых 3Н-уридином. Клетки вносили в лунки 96-луночного планшета, инкубировали в течение суток, отмывали, добавляли клетки-эффекторы в разных разведениях и вносили панкреатическую RNK-азу в дозе 5,0

мкг/мл. Инкубировали в среде культивирования в течение 14 часов при 31°С во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. По истечении срока инкубации содержимое лунок осаждали на стекловолокнистые фильтры (Whatman) 12-канальным харвестром (Флоу, Великобритания). Остаточную радиоактивность подсчитывали в толуольном сцинтилляторе (толуол с добавлением РРО и РОРОР) с использованием Р-ючетчика (Intertechnique).

Индекс цитотоксичности рассчитывали по формуле: ИЦ=( 1 -опыт/контроль) 100

Постановку цитотоксической реакции, РБТЛ и поддержание культур клеток in vitro осуществляли в среде культивирования (СК), приготовленной на основе среды RPMI-1640 (ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Н.П.Чумакова РАМН), дополненной 10% сыворотки эмбрионов коров (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) или сывороткой КРС, 200 мМ L- глютамина, 10 мкг/мл гентамицина и 1 М HEPES.

Реакция бласттрансформации (реакция пролиферации лимфоцитов). Для постановки РБТЛ готовили суспензию лимфоидных клеток в среде культивирования. Инкубацию осуществляли в 96-луночных планшетах. В каждую лунку вносили по 500 тысяч клеток. Время инкубации колебалось от 48 до 120 часов в зависимости от использованного стимулятора. При исследовании неспецифической пролиферации клеток под действием митогенов время инкубации составляло 48-65 часов. Инкубацию проводили в стандартных условиях. За 16 часов до окончания срока инкубации в каждую лунку вносили по 1 мкКи -тимидина с удельной активностью 1 Ки/мМ в объеме 5 мкл. Пролиферативную активность оценивали по включению радиоактивной метки в ДНК клеток, культивируемых с препаратом или (и) митогеном, по отношению к контролю.

В качестве неспецифических митогенных препаратов использовали конканавалин А (Кон А) в дозе 20 мкг/мл (Сигма, США) или фитогемагг-лютинин Р (ФГА Р) в дозе 0,5 мкг/мл (Дифко, США).

Функциональная оценка экспрессии рецепторов к ИЛ-1 и ИЛ-2. Для оценки экспрессии рецепторов к ИЛ-1 и ИЛ-2 исследовали ответ клеток-мишеней на стандартные рекомбинантные цитокины (Calbiochem, ICN).

Определение продукции ИЛ-1. Для получения супернатанта, содержащего ИЛ-1, клетки стимулировали в течение 16 часов митогеном (Кон А). Супернатанты хранили при -40°С. В качестве стандартного препарата использовали ИЛ-1 фирмы Calbiochem. Тестирование активности препарата осуществляли на тимоцитах.

500 тыс. тимоцитов инкубировали вместе с тестируемыми суперна-тантами и ФГА (0,5 мкг/мл) в 96 луночных планшетах. Время инкубации составляло трое суток. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку добавляли по 1 мкКи 3Н-тимидина. Подсчет радиоактивности проводили, как описано ранее.

Определение ИЛ-2.

Тестированные клетки стимулировали в течение 40 часов Кон А или другим препаратом, после чего собирали супернатант, который замораживали при —40° С. В качестве тест-системы использовали лимфоциты, активированные Кон А. В качестве контроля использовали рекомбинантный человеческий ИЛ-2 (ICN).

Определение цитокинов (ИЛ-4. ИЛ-5, ИЛ-6. ИЛ-10) в супернатантах спленоцитов и в сыворотке крови мышей методом ИФА. Цитокины исследовали в пробах супернатантов и в сыворотках крови мышей на разных сроках после введения фоспренила, методом ИФА согласно инструкции фирмы-производителя специфических тест систем (Ganzim). Учет результатов производится с помощью мультискана при длине волны 450 нм.

Реакция агглютинации лимфобластов с антителами к CD-25 в капиллярах. Конкурентное взаимодействие фоспренила и антител к CD25 за а-субъединицу рецептора к ИЛ-2 (CD25) в суспензии спленоцитов мышей оценивали с использованием реакции агглютинации в модификации (Severson CD. Thompson J.S.,1963)

Суспензии Кон А бластов с исследуемыми реагентами инкубировали в течение 10 минут. Заполняли суспензиями капилляры, запаивали их с одного конца и центрифугировали в течение 10 минут при 1,5 Tbic.g. Затем оставляли на 20 минут под углом в 45° запаянным концом вверх.

Капилляры просматривали под лупой и измеряли величину осадка. Длина осадка обратно пропорциональна степени агглютинации.

Определение ФНОа в сыворотке крови мышей. Уровень TNF определяли на чувствительной клеточной линии L-929. Исследуемые сыворотки в разных разведениях добавляли в лунки с монослоем фибробластов и инкубировали в течение 18 часов. Затем монослой отмывали от погибших клеток и прокрашивали в течение 10 минут 0,2% кристаллвиолетом на 2% этиловом спирте. Интенсивность окрашивания измеряли на мультискане при длине волны 595 нм против воздуха (Balkwill F.R, 1995).

Уровень интерферонов в супернатантах определяли по способности предотвращать поражение клеток - мишеней вирусом ЕМС. В качестве клеток - мишеней использовали клетки L-929. На суточном монослое клеток L-929 раститровывали вирус и супернатанты. Вносили вирус к клеткам, проинкубированным с супернатантами, и инкубировали в течение суток. Через сутки среду сливали и монослой прокрашивали в течение 10 минут 0,2% раствором кристаллвиолета на 2% этиловом спирте. Интенсивность окрашивания измеряли на мультискане при длине волны 595 нм. против воздуха (Balkwill F.R, 1995).

Статистическая обработка результатов. Достоверность полученных результатов оценивали с помощью критерия Стьюдента.

3. Результаты исследования и их обсуждение.

Влияние фоспренила на активацию спленоцитов Кон А.

В ходе исследования нами была поставлена задача изучить влияние фоспренила на пролиферативную активность лимфоидных клеток. Бвшо установлено, что самостоятельно фоспренил in vitro не вызывает митоген-

ного действия (Рис. 1). Более того, введенный одновременно с Кон А он достоверно снижает пролиферативную активность под действием последнего по сравнению с контролем.

Рисунок 1.

Изменение ответа на Кон А спленоцитов под действием фоспренила.

се X

ч 25000 - — -- - — — — -

К 20000 X к 15000 - 5

^^Фослренип безМонА

| 10000

а 5000л "^■"Фоспренил в присутствии КонА

£ 0¥ - -

а о 10 миг/мл Концентрация препарата (мкг/мп.) ЮОижг/мп

Такой эффект может наблюдаться в случае, если фоспренил действует на рецепторный комплекс, либо если он влияет на выработку цитоки-нов, поддерживающих данную реакцию. Для проверки первого предположения были проведены исследования с разновременным внесением и инкубацией фоспренила и Кон А.

Результаты показали, что фоспренил при его введении в среду культивирования (за час до или через час после Кон А) ингибирует пролифера-тивный ответ спленоцитов, вызванный Кон А. Таким образом предположение о влиянии фоспренила на рецепторы для Кон А подтверждается. В то же время взаимодействие с рецепторным комплексом к Кон А может, соответственно, вызвать и изменение выработки цитокинов под действием последнего.

Влияние фоспренила на продукцию цитокинов клетками селезенок под действием Кон А.

Следующим этапом работы было изучение выработки ИЛ-2 и ИЛ-10 при инкубации спленоцитов с Кон А в присутствии разных доз фоспренила. Супернатанты были исследованы методом ИФА. Добавление к клеткам селезенки 100 и 200 мкг/мл фоспренила одновременно с Кон А снижало продукцию ИЛ-2 и ИЛ-10 в 4,2 и 2 раза соответственно, по сравнению с спленоцитами, активированными только Кон А. Таким образом, введение фоспренила в культуру спленоцитов вместе с Кон А способствует снижению продукции цитокинов.

Влияние фоспренила на рецепторы для цитокинов.

Поскольку фоспренил влияет на рецепторы к Кон А, мы решили выяснить, влияет ли препарат и на рецепторы для цитокинов. Для этого мы исследовали ответ чувствительных клеток на рекомбинантные цитокины в присутствии фоспренила.

Полученные результаты показали, что присутствие фоспренила снижает ответ тимоцитов на ИЛ-1, однако эта ингибиция не связана с влиянием препарата на рецептор к ИЛ-1. При этом были получены некоторые данные, указывающие на то, что фоспренил снижает ответ на рекомбинантный ИЛ-2, что послужило поводом для проверки влияния фоспренила на рецептор-ный комплекс к ИЛ-2.

Из представленных на рис. 2 результатов видно, что при одновременном внесении ИЛ-2 и фоспренила в среду повышение количества фоспрени-ла от 10 до 200 мкг/мл приводит к снижению пролиферации клеток примерно в такой же степени, как и прединкубация бластов с фоспренилом в течение одного часа. В то же время прединкубация бластов с ИЛ-2 и последующее добавление фоспренила через час практически не блокировало пролиферации. Это указывает на то, что фоспренил влияет на рецепторный комплекс к ИЛ-2.

Рисунок 2.

Включение 3Н-тимидина в зависимости от порядка внесения фоспренила и ИЛ-2 в культуру клеток с часовой прединкубацией._

Для проверки этого предположения была проделана серия опытов по исследованию взаимодействия Кон А бластов с антителами к CD25. На рис. 3 видно, что антитела к CD25 агглютинируют бласты (величина осадка составила 5,5 мм).

Рисунок 3.

Реакция агглютинации Кон А-бластов в присутствии моноклональ-ных антител к СБ25 и фоспренила.

Фоспренил сам по себе практически не вызывает агглютинации клеток (7,5 мм) Агглютинирующая активность антител к CD25 сохраняется, если они были добавлены к бластам за 10 минут до фоспренила. Напротив, Кон А бласты, прединкубированные с фоспренилом, не агглютинирова-

лись антителами к CD25. На основании полученных данных можно сделать вывод, что фоспренил блокирует или видоизменяет CD25, что проявляется в снижении пролиферации бластов. Помимо этого, нами получены результаты, указывающие на то, что фоспренил не только блокирует CD25, но и снижает экспрессию рецепторного комплекса к ИЛ-2 in vitro.

Влияние фоспренила на продукцию цитокинов in vivo.

Как показали проведенные исследования, фоспренил вызывает изменение продукции цитокинов не только in vitro, но и in vivo. Однократное в/м введение фоспренила в дозе 100 мкг/мышь вызывало продукцию таких цитокинов, как ИЛ-4 и ИЛ-5 в течении 48 часов, а ИЛ-12 - в течении 72 часов после инъекции. (Таб.1)

Таблица 1.

Изменение продукции цитокинов под действием фоспренила in vivo в разные сроки после введения фоспренила-

Выявление цитокинов (пг/мл) в сыворотке крови мышей, обработанных фос-

пренилом.

Часы после введения фоспренила. ИЛ-4 ИЛ-5 ИЛ-10 ИЛ-12

контроль 0 0 0 0

24 часа 56±16 82±17 0 28±6

48 часов 98±19 14±3 0 12±3

72 часа 0 0 0 10±2

96 часов 0 0 0 0

120 часов 0 0 0 0

144 часа 0 0 0 0

168 часов 0 0 0 0

Однако, как видно из таблицы, фоспренил не способствовал продукции ИЛ-10. Кроме того, мы исследовали сывороточный ФНОа. Результаты, показали, что максимальная продукция ФНОа наблюдалась через два ча-

са после введения фоспренила в дозе 100 мкг/мышь, а через 6 часов эта продукция снижалась.

Влияние фоспренила на активность ЕКК.

Из ранее изученных свойств фоспренила известно, что он является стимулятором выработки интерферона (Sanin A.V., 1992,1993; Ожерелков СВ., 2000). Нами были получены данные о повышении продукции ФНОа и ИЛ-12, поэтому, представляло интерес, изучить влияние фоспренила на активность ЕКК in vitro и in vivo.

Оказалось, что in vitro фоспренил, добавленный в дозах 100 и 200 мкг/мл к клеткам-эффекторам за час до постановки реакции, подавляет активность ЕК по сравнению с интактными клетками на 57% и 89% соответственно (соотношение мишень/эффектор 1:5).

Рисунок 4.

Активность ЕК клеток после инкубации эффекторов с фоспренилом.

В то же время внутрибрюшинное введение фоспренила мышам способно повышать активность ЕК. Проведенные ранее исследования зафиксировали пик повышения активности ЕК через четыре часа после инъекции. Однако, как показали наши исследования, через сутки после однократного введения активность ЕК падает по сравнению с интактным контролем (Рис.5.) и повышается после повторной инъекции (через сутки после первого).

Рисунок 5.

Изменение ЕК активности спленоцитов в зависимости от кратности введения мышам фоспренила.

2500

X

| 2000

о. >*

X

г. о

1500 1000 500 0

1;10 1:20 1:40 1;80

соотношение мишень-эффектор

"Контроль

"■■Я"» од некратное введение фоспренила

* двукратное введение фоспренила

Такое возможно как в результате прямого снижения активности ЕК под действием фоспренила (например, при блокировке рецепторов), так и под влиянием других механизмов, например, активации циклооксигеназы, которая повышает продукцию просгагландинов и способствует экспрессии цитокинов, подавляющих ЕК (известно, что ПГЕ2 является сильным ингибитором продукции ИЛ-2 и ИЛ-12) (Грачева Л.А.1996 г.). Для проверки последнего предположения были поставлены опыты с добавлением индо-метацина - блокатора циклооксигеназы - в среду культивирования (конечная концентрация 10-5 моль/мл).

Рисунок 6.

Влияние индометацина на изменение ИЦ у мышей через сутки после введения фоспренила.

—♦—контроль

■ контроль с индометацином

^"■ФослренилЮОмкг /мышь

* Ф. 100 мкг/мышь ♦индометацин

1:10 1:20 1:50

соотношение мишень/эффектор

Из представленных на рис.6 результатов видно, что индометацин восстанавливает активность ЕК в пробе после однократного введения фоспренила за сутки до постановки эксперимента, практически не влияя на контрольные клетки-эффекторы. Таким образом, фоспренил является активным модулятором активности ЕКК. Снижение активности ЕК связано, по-видимому, с повышением активности циклооксигеназы.

Влияние фоспренила на течение гриппозной инфекции Для определения влияния фоспренила на гриппозную инфекцию сравнивали среднюю продолжительность жизни и процент выживших животных в разных группах мышей после заражения вирусом гриппа в сочетании с фоспренилом. Контрольной группе был введен интраназально вирус гриппа А в дозе 2,5 LD50- Мышам опытных групп одновременно с вирусом (в одной суспензии) был введен фоспренил в разных дозах от 0,1 мкг/кг до 200 мкг/кг. Результаты исследования представлены в таблице №2.

Таблица № 2.

Изменение выживаемости в группах мышей, интраназально зараженных суспензией вируса гриппа с фоспренилом (в концентрациях от 0,1

ло 200 мкг/мыттть).___

Динамика выживаемости по срокам (сутки)

Группы животны: 7 8 9 10 11 12 13 14 Средняя продолжи тельность жизни % выживших

Вирус 10 6 3 2 2 2 2 2 6,2±1,0* 20%

+ фоспренил 200мкг/кг 10 10 8 6 6 5 5 5 8,5±0,6 50%

+ фоспренил 20 мкг/кг 10 8 8 8 8 8 8 8 9,1 ±0,3 80%

+ фоспренил 2 мкг\кг 10 10 10 9 9 9 9 8 9,7±0,1* 80%

+ фоспренил 0,: мкг\кг 10 8 7 6 6 6 6 6 8,5±0,3 60%

+ фоспренил 0,1 мкг\кг 10 9 9 6 6 5 5 4 8,5±0,1 40%

* - разница между соответствующими показателями в группах статистически достоверна при р< 0,003

Фоспренил во всех дозах повышал процент выживших животных и среднюю продолжительность их жизни. Наибольшая продолжительность

жизни (9,7±0,1) наблюдается в группе, которой вводили фоспренил в дозе 2мкг/кг.

Как правило, именно первые сутки заболевания являются решающими в формировании иммунного ответа на патоген. Для исследования механизмов влияния препарата на течение гриппозной инфекции были изучены параметры, наиболее важные для начального периода заболевания.

Чтобы исследовать возможные звенья иммунитета, на которые в данном случае влияет фоспренил, были исследованы следующие показатели: продукция ФНОа, активность ЕК, спонтанная и индуцированная Кон А продукция ИЛ-1 и ИЛ-2-подобных факторов. Исследования проводили на четырех группах мышей: интактный контроль; группа мышей, получивших интраназально фоспренил; группа мышей, зараженных вирусом; группа мышей, зараженных вирусом с фоспренилом в одной смеси.

Сравнение уровней функциональной активности ЕК клеток селезенки показало, что активность ЕК была выше в группе животных, которым был введен вирус гриппа с фоспренилом 51,8% при соотношении КЭ/КМ 1:100. (Рис.7)

Рисунок 7.

Влияние фоспреннла на изменение ИЦ при гриппозной инфекции.

В тоже время, в группе мышей, зараженных только вирусом максимальный ИЦ равен 45% при том же соотношении КМ/КЭ. При меньших соотношениях значения ИЦ в обеих группах практически равны. Фоспренил, самостоятельно, не способствовал повышению ИЦ (35%) который был приблизительно равен контролю при данном соотношении клеток мишеней и эффекторов. Таким образом, введенный в одной смеси с вирусом, фоспренил не снижает активность ЕК, как это происходит, когда он вводится отдельно.

В то же время, наивысшая продукция ФНОа была отмечена в группе мышей, зараженных гриппом. (Рис.8).

Рисунок 8.

Сравнение уровня сывороточного ФНОа, вырабатываемого мышами разных групп черед сутки после начала опыта._

■контроль

■фоспренил

-вирус

■вирус+фос пренил

1.02

1:04 1:08

разведения сыворотки

1:16

Ъолее низкий уровень ФНОа был зарегистрирован в сыворотке крови животных, зараженных вирусом гриппа и получившим фоспренил. В контроле и в группе мышей, получивших интерназально фоспренил, уровень ФНОа, был самым низким.

Факторы с активностью ИЛ-1 и ИЛ-2 исследовали в супернатантах спленоцитов, культивированных в присутствии КонА и без него (спонтанная продукция). Самая низкая спонтанная продукция факторов с активностью ИЛ-1 и ИЛ-2 спленоцитами мышей (как и при исследовании

продукции ФНОа) в группе интактных мышей и в группе животных, получивших фоспренил. (Рис.9)

Рисунок 9.

Влияние фоспренила на спонтанную продукцию цитокинов спленоци-тами мышей, зараженных вирусом гриппа.

Самая высокая продукция фактора с активностью ИЛ-1 зарегистрирована в группе мышей, зараженных вирусом с фоспренилом. Наивысшая продукция фактора с активностью ИЛ-2 была в группе мышей, зараженных вирусом гриппом, но она достоверно не отличается от уровня данного цитокина в группе мышей, зараженных вирусом с фоспренилом.

Иная картина наблюдается при стимуляции клеток селезенки тех же групп животных Кон А. Наивысшая продукция фактора с активностью ИЛ-1 наблюдается в супернатантах, полученных от спленоцитов мышей, которым вводили фоспренил. (Рис 10) В группе мышей, зараженных вирусом гриппа и вирусом с фоспренилом, продукция фактора с активностью ИЛ-1 была значительно ниже (приблизительно в 3 раза)

Рисунок 10.

Влияние фоспренила на индуцированную Кон А продукцию цитоки-нов спленоцитами мышей, зараженных вирусом гриппа.

Приблизительно та же картина наблюдается при исследовании фактора с активностью ИЛ-2, индуцированного Кон А. На рисунке 10 видно, что наивысший пик продукции фактора с активностью ИЛ-2 наблюдается в супернатантах спленоцитов, полученных от мышей, которым был введен фоспренил. Однако, мы полагаем, что в данном случае наивысшая пролиферация получена в результате ответа спленоцитов, активированных Кон А, на ИЛ-1, а не на ИЛ-2.

На основании изложенного можно сделать вывод, что фоспренил является активным иммуномодулирующим агентом, который значительно влияет на ответ организма на вирусную инфекцию, в результате чего увеличивается средняя продолжительность жизни экспериментальных животных. Наши исследования показали, что препарат в первую очередь действует на продукцию цитокинов, вырабатываемых как макрофагами, а также, возможно, и другими антигенопредставляющими клетками.

21

ВЫВОДЫ.

1.Фоспренил не оказывает митогенного действия на лимфоциты селезенки мышей, но подавляет их пролиферацию, вызванную Кон А.

2. Добавление фоспренила к культуре клеток селезенки мышей снижает продукцию ИЛ-2 и ИЛ-10, вызываемую Кон А. Снижение пролиферации Т лимфоцитов не связано с супрессорными взаимоотношениями Т-хелперов первого и второго типов.

3. Впервые показано, что фоспренил взаимодействует с CD-25 и снижает экспрессию рецепторного комплекса к ИЛ-2, что проявляется в снижении ответа на рекомбинантный ИЛ-2.

4. Введение фоспренила экспериментальным животным стимулирует продукцию ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-12 и ФНОа, но не вызывает продукции ИЛ-2 и ИЛ-10..

5. Введение фоспренила мышам кратковременно повышает активность естественных киллерных (ЕК) клеток селезенок мышей, а затем снижает ее ниже исходного уровня. Снижение активности ЕК отменяется в присутствии индометацина.

6. Фоспренил оказывает протективный эффект при гриппозной инфекции у мышей, увеличивая выживаемость (с 20 % до 80%) и среднюю продолжительность жизни экспериментальных животных (с 6,2 до 9,7 суток).

7. Одним из механизмов противовирусного действия фоспренила является его способность стимулировать систему естественной резистентности организма, вызывая продукцию таких факторов как ИЛ-1, ФНОа и ИФНу.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Пронин А.В., Ожерелков СВ., Наровлянский СВ., Деева А.В., Данилов Л.Л., Мальцев СД. Григорьева Е.А. Санин А.В. Иммуномодулирующие свойства полипренолфосфата натрия и его роль в защите организма от вирусной инфекции. 3 конгресс РААКИ. Современные проблемы аллергологии и им-мунофармакологии. 2000, с.5ОЗ

2. Pronin A.V., Ozerelkov S.V., Narovlansky A.N., Danilov L.L.,Maltsev S.D., Deyeva A.V., Grigorieva EA., Sanin A.V. Role of cytokines in immunomodula-tory effects of polyprenyl phosphate: new generation of antiviral drug. Russian Journal of Immunology, v.5,2, 2000 p. 156-164.

3. Grigorieva E.A. Polyprenols elevate TNF-alpha, IFN-gamma in the serum and reduce morality from tick-borne encephalitis. 5th John Hamphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Abstracts. Pushchino, 2000 p.31.

4. Pronin A.V., Grigorieva EA, Sanin A.V., Narovlansky A.N., Ozerelkov S.V., Deyeva A.V., Danilov L.L., Maltsev S.D., Najid A. Polyprenols as possible factors that determine an instructive role of the innate immunity in the acquired immune response. Russian Journal of Immunology, v.7,2,2002 p. 135-142

5. Grigorieva EA. The influence of polyprenyl, a new antiviral agent, on NK cells and TNFa production. 6th John Hamphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Abstracts. Pushchino, 2002 p.41.

6. Григорьева Е.А., Пронин А.В. Изменение уровня цитокинов под действием противовирусного препарата фоспренил при гриппозной инфекции у мышей. Материалы III конференции молодых ученых России с международным участием. Москва.2004 г. стр105

7. Григорьева ЕА., Пронин А.В. Изменение активности NK клеток под действием нового противовирусного препарата фоспренил. Материалы III конференции молодых ученых России с международным участием. Москва 2004 г. стр105.

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД № 00595

Подписано в печать 03.03.2004 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 70 экз. Бумага «Снегурочка» 0,8 л. Заказ № 144

»-б*)?/:

Фоспренил - новейший противовирусный препарат, применяемый в настоящее время, в ветеринарии при лечении таких заболеваний как: чума плотоядных, инфекционный гепатит собак, ринотрахеит, инфекционный перитонит кошек др. Экспериментально доказано, что он эффективен при вирусных заболеваниях человека - а именно при гепатитах, гриппе, клещевом энцефалите, ВИЧ-инфекции и др. (23,24,124) Основным действующим началом фоспренила - является полипренилфосфат натрия. Полипренолы и их производные синтезируются в клетке и играют важную роль в процессе гликозилирования белков, а так же они являются интегральными компонентами для биологических мембран и влияют на многие свойства последних (9,127).

На основании результатов, полученных при проведении доклинических исследований препарата, можно заключить, что фоспренил обладает прямой противовирусной активностью против целого ряда ДНК- и РНК-содержащих вирусов (32,125,131). Одним из таких вирусов является вирус гриппа (124). Грипп, до сих пор, является наиболее массовым инфекционным заболеванием, неподдающимся ни эффективной профилактике, ни этиа£(йропной терапии, главным образом из-за высокой изменчивости ан- i/ тигенной структуры вируса и недостаточной эффективности применяемых средств лечения (14). Несмотря на постоянный поиск лекарственных средств в практике современной медицины и ветеринарии используется сравнительно небольшой набор препаратов, обладающих широким спектром антивирусного действия (14,35). Это связано с целым рядом обстоятельств, наиболее существенные из которых: токсичность, аллергенность или другими побочными эффектами для организма животных и человека. В связи с этим наибольший интерес вызывает поиск и внедрение в практику иммуномодуляторов естественного происхождения, соответствующих требованиям, перечисленных выше.

В настоящее время исследования механизмов действия фоспренила далеки от завершения. Получены первые результаты, позволяющие говорить о том, что механизмы антивирусного действия препарата имеют двоякую природу. Предполагается, что он влияет на сборку или на взаимодействие вирусной частицы с рецепторами клетки мишени, в результате чего инфекция либо не развивается, либо формируются дефектные частицы. Другой механизм противовирусного действия фоспренила может быть связан с его способностью повышать естественную резистентность организма. Установлено, что фоспренил активирует макрофаги, вызывает выработку ИФН у, ФНОа (32,125,131). Однако этот механизм мало изучен и поэтому

Цель работы: изучение влияния фоспренила на некоторые показатели иммунитета в норме и при гриппозной инфекции у экспериментальных животных.

Для выполнения заданной цели были поставлены следующие задачи

1. Изучить влияние фоспренила на пролиферативную активность клеток лимфоидной системы мышей.

2. Определить влияние фоспренила на продукцию цитокинов in vivo и in vitro и оценить экспрессию рецепторов к ним.

3. Исследовать воздействие фоспренила на активность естественных кил-лерных клеток селезенки (ЕКК) мышей in vivo и in vitro.

4. Сравнить изменения в иммунной системе, вызванные фоспренил ом, в условиях нормы у интактных животных и при экспериментальной гриппозной инфекции у мышей.

Научная новизна исследования.

Впервые установлено, что фоспренил не оказывает митогенного действия на лимфоциты селезенки мышей, но подавляет их пролиферацию, вызванную КонА, а также снижает экспрессию рецепторного комплекса к ИЛ-2.

Впервые получены данные о том, что введение фоспренила экспериментальным животным кратковременно повышает активность ЕКК селезенок мышей, а затем снижает ее ниже исходного уровня через сутки после введения препарата, при этом снижение активности ЕК связано с повышением активности циклооксигеназы.

Впервые показано, что добавление фоспренила в культуру клеток селезенки снижает продукцию ИЛ-2 и ИЛ-10, вызываемую КонА, тогда как введение фоспренила экспериментальным животным стимулирует продукцию ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-12 и ФНОа, но не вызывает продукции ИЛ-2 и ИЛ-10.

Разработана экспериментальная схема профилактики гриппа с помощью фоспренила. Впервые показано, что фоспренил оказывает выраженный протективный эффект при интраназальном заражении вирусом гриппа А (штамм Aichi/2/68) экспериментальных животных.

Полученные данные могут быть использованы в разработке нового профилактического противогриппозного средства, обладающего прямым противовирусным и иммуномодулирующим действием.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1 .Фоспренил не оказывает митогенного действия на лимфоциты селезенки мышей но подавляет их пролиферацию, вызванную Кон А.

2. Добавление фоспренила к культуре клеток селезенки мышей снижает продукцию ИЛ-2 и ИЛ-10, вызываемую Кон А. Снижение пролиферации Т лимфоцитов не связано с супрессорными взаимоотношениями Т-хелперов первого и второго типов.

3. Впервые показано, что фоспренил взаимодействует с CD25 и снижает экспрессию рецепторного комплекса к ИЛ-2, что проявляется в снижении ответа на рекомбинантный ИЛ-2.

4. Введение фоспренила экспериментальным животным стимулирует продукцию ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-12 и ФНОа, но не вызывает продукции ИЛ

2 и ИЛ-10.

5. Введение фоспренила мышам кратковременно повышает активность естественных киллерных (ЕК) клеток селезенок мышей, а затем снижает ее ниже исходного уровня. Снижение активности ЕК отменяется в присутствии индометацина.

6. Фоспренил оказывает протективный эффект при гриппозной инфекции у мышей, увеличивая выживаемость (с 20 % до 80%) и среднюю продолжительность жизни экспериментальных животных (с 6,2 до 9,7 суток).

7. Одним из механизмов противовирусного действия фоспренила является его способность модулировать систему естественной резистентности организма, влияя на продукцию таких факторов как ИЛ-1, ФНОа и ИФН.

102

ЗАКЛЮЧЕНИЕ К ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ.

Несмотря на то, что в современной клинической и экспериментальной практике широко используются десятки природных и синтетических имму-номодуляторов (олексин, ридостин, иммунофан, полиоксидоний, неовир, лейкинферон, циклоферон, ронколейкин - рекомбинантный ИЛ-2, беталейкин - рекомбинантный ИЛ-lb, гликопин, вилон, тимоген. и др.), их применение ограничено по ряду причин (14,35,13). К таким ограничениям относятся, например, избирательное стимулирующее действие того или иного препарата на одно из звеньев иммунной системы, отсутствие данных о механизмах действия в организме на фоне инфекционного процесса, достаточно высокая ал-лергенность и токсичность.

В данной работе были исследованы механизмы противовирусного действия препарата фоспренил, в частности его влияние на систему цитокинов. Фоспренил имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими препаратами: не токсичен; не аллергенен; не является антигеном; действует на организм комплексно, не стимулируя избирательно какое-либо одно из звеньев гуморального или клеточного иммунитета, и, тем самым, способствует нормальному функционированию клеток иммунной системы организма в целом (32).

Вместе с тем, к моменту начала работы механизмы противовирусного действия фоспренила, как при иммуномодуляции, так и на уровне взаимодействия вирус-клетка были недостаточно изучены. В связи этим в настоящей работе была поставлена задача, исследовать механизмы противовирусного эффекта фоспренила при экспериментальной гриппозной инфекции.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 5. Материалы и методы.

1) Лабораторные животные.

В работе использовали клинически здоровых беспородных мышей, мышей линии СВА и BALB/c весом 18-20 г, полученных из питомника «Столбовая» РАМН.

2) Клеточные линии.

В работе использована клеточная линия мышиных фибробластов L-929, чувствительная к ИФНу, ФНОа. Линия получена из лаборатории индукторов интерферона ГУ НИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН.

3) Вирусы.

Вирус гриппа. Использовали вирус гриппа A /Aichi/2/68 H3N2, прошедший 12 пассажей на мышах и 2 на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Жиь вотных заражали вируссодержащеи аллантоиснои жидкостю, полученную путем культивирования вируса гриппа на 9-11-суточных РКЭ с биологической концентрацией вируса108-109 50% эмбриональных инфицирующих доз (ЭИД50) в 1 мл. Вирус оттитрован на мышах линии СВА массой 18-20г. методом интраназального введения серийных разведений, полученного вируса в объеме 0,05 мл/мышь. Титр вируса определялся по формуле Рида-Менча выражался в lgLD5o(21). В экспериментах была использована доза 2,5 LD5o. Вирус получен из лаборатории индукторов интерферона ГУ НРШЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Заражение мышей вирусом гриппа производили под эфирным наркозом. Среднюю продолжительность жизни за 14 суток наблюдения подсчитывали по формуле: У А.

СПЖ = ^-1- , где СПЖ - средняя продолжительность жизни, Ai - время п в сутках от момента заражения до гибели для каждого животного, включенного в группу, за 14 суток наблюдения.

Выживаемость (индекс защиты) в разных группах животных просчитывали по формуле:

Индекс защиты = %гибели животных в контроле - %гибели мышей в опыте Л00 гибели мышей в контроле

Вирус ЕМС. Использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС) штамм Колумбия SK-Col-SK, с титром 107 ЦПД50 .Вирус пассировали 3 раза на культуре L-929 и хранили при -20°С. Вирус получен из лаборатории индукторов интерферона ГУ НИИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи РАМН.

4) Фоспренил.

В работе использовали стандартный коммерческий препарат фоспренил (производство ЗАО «Микро-плюс» при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, г. Москва), содержащий 0,4 % динатриевой соли полипренолов в комплексном растворителе. Для инъекций животным фоспренил разводили раствором плацебо до концентрации фоспренила 10, 20, 50, 100, 200 мкг/мл. Раствор плацебо использовали для инъекций контрольным животным и обработки контрольных клеток.

5) Получение клеток.

Для постановки иммунологических реакций у животных выделяли селезенку или тимус. Органы надрезали и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. Гомогенаты фильтровали через фильтры из нержавеющей стали диаметром отверстий 50 — 100 мкм и затем дважды промывали в среде центрифугирования (СЦ) (среда RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки КРС) для освобождения от клеточного детрита. Суспензии клеток центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин двукратно. Затем клетки ресус-пензировали в среде культивирования (СК). Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. (1,20,109.)

6) Поддержание L-929.

Клетки линии L-929 поддерживали на RPMI-1640 или на 199 среде (в зависимости от целей исследования) с добавлением 5% телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мкг/мл гентамицина и 1 М буфера HEPES, 5x10"5 2-меркаптоэтанола. Пересев производился раз в 3 суток после предварительного снятия клеточного монослоя с помощью растворов трипсина и Версена.

Для исследования клетки помещали в лунки 96-луночного планшета по 30-40 тысяч клеток на лунку и культивировали при стандартных условиях до образования монослоя (50,109).

7) Получение сыворотки крови.

Мышам за 1, 2, 3, 5, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 часов до забоя вводили в/м фоспренил в концентрации 10 мкг. на мышь. По истечении указанного времени у мышей забирали кровь и получали сыворотку, которую использовали для определения ФНОа на чувствительной клеточной линии мышиных фибробластов L-929 или для определения цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, Р1П-12) методом ИФА.

Методы исследования.

8) Цитотоксическая активность клеток.

Цитотоксическую активность ЕК в суспензии спленоцитов мышей оценивали с использованием радиометрической методики в модификации (30) против меченных 3Н-уридином в дозе 3 мкКи/мл клеток мишеней (КМ), стандартных, длительно поддерживаемых в культуре in vitro линий мышей.

Для постановки цитотоксического теста готовили исходную суспензию спленоцитов, содержащую 10 млн. клеток/мл и метили монослой клеток мишеней. Раскапывали суспензию клеток селезенки по 0,1 мл в ячейки круг-лодонного 96-луночного планшета и, вносили панкреатическую РНК-азу в дозе 5,0 мкг/мл. Инкубировали в среде культивирования в течении 14 часов при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа.

Постановку цитотоксической реакции, как и РБТЛ (2.2.2) и длительно поддерживающихся культур in vitro осуществляли в среде культивирования (СК), приготовленной на основе RPMI-1640 (Московский институт полиомиелита и вирусного энцефалита, РАМН, ПанЭко), дополненной 10% сыворотки эмбрионов коров (НИИЭМ им.Н,Ф.Гамалеи, ПанЭко) или сыворотки КРС, 200 мМ L- глютамина, 2-меркаптоэтанола, 10 мкг/мл гентамицина и 1 М HEPES (1,20).

По истечении срока инкубации содержимое лунок осаждали на стекло-волокнисные фильтры. (Whatman) 12-канальным харвестром (фирма Флоу, Великобритания). После просушивания проб остаточную радиоактивность подсчитывали в толуольном сцинтилляторе (толуол с добавлением РРО и РОРОР) с использованием Р-спектра (Intertechnique, Франция). Просчет пробы осуществляли в течение минуты. Индекс цитотоксичности рассчитывали по формуле:

ИЦ = (1-опыт /контроль) 100

9) Реакция бласттрансформации лимфоцитов.

Для постановки РБТЛ готовили суспензию лимфоидных клеток в среде культивирования. Инкубацию производили в 96-луночных планшетах. В каждую лунку вносили по 500 тысяч клеток. Время инкубации колебалось от 48 до 120 часов в зависимости от использованного стимулятора. При исследовании неспецифической пролиферации клеток под действием митогенов время инкубации составляло 48-65 часов. Инкубацию проводили в стандартных условиях. За 16 часов до окончания срока инкубации в каждую лунку вносили по 1 мкКи 3Н -тимидина с удельной активностью 1 Ки/мМ в объеме 5 мкл. Пролиферативную активность оценивали по включению радиоактивной метки в ДНК клеток, культивируемых с препаратом или (и) митогеном по отношению к контролю.

В качестве неспецифических митогенных препаратов использовали конканавалин А (КонА) в конечной концентрации 4 мкг/мл (Сигма, США) или фитогемагглютинин Р (ФГА Р) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл (Дифко, США).

10) Получение КонА бластов.

Спленоциты мышей стимулировали КонА в течение 3 суток. Культивирование осуществляли в пластиковых культуральных флаконах на 50 мл. (Nunc, Дания) в которые вносили 50 млн. клеток в 5 мл. среды культивирования и добавляли митоген. После окончания срока культивирования клетки отмывали от митогена двукратным центрифугированием при 1,5 тыс. об./ мин, после чего убирали надосадок (1, 20).

КонА бласты ресуспензировали в 1 мл. СК, подсчитывали количество жизнеспособных клеток, разводили их СК до конечной концентрации и разливали суспензию по лункам 96-луночных планшетов по 40 тыс./лунку. К клеткам добавляли тестируемый супернатант и а-метилманнозид (окончательная концентрация 0,1М) для блокирования оставшегося КонА. Окончательный объем реагентов в одной лунке равен 0,2 мл.

Планшеты с КонА бластами инкубировали в СО2 - инкубаторе в течении 20 часов. За 4 часа до культивирования в каждую лунку вносили 2-4 мкКи 3Н -тимидина. Подсчет радиоактивности осуществляли, как и при постановке РБТЛ.

11) Определение ИЛ-2.

Тестированные клетки стимулировали в течение 40 часов КонА или другим препаратом, после чего собирали супернатант, который замораживали при -40° С. В качестве тест-системы использовали КонА-бласты. В качестве контроля использовали рекомбинантный человеческий ИЛ-2 конечная концентрация 5 ЕД/мл (фирма ICN)(109). Продукцию ИЛ-2 определяли по уровню включения 3Н-тимидина КонА-бластами.

12) Функциональная оценка экспрессии рецепторов к ИЛ-2.

Для оценки экспрессии рецепторов к ИЛ-2 исследовали ответ клеток, стимулированных КонА и КонА с фоспренилом в течении трех суток. Затем клетки промывали СЦ, разводили суспензию в СК и разливали по лункам 96 луночных планшетов по 40 тыс. клеток на лунку. В лунки вносили стандартный препарат ИЛ-2 (рекомбинантный человеческий фирмы ICN).

Время инкубации составляло 20 часов. Уровень пролиферации определяли так же, как и при тестировании активности ИЛ-2.

13) Определение продукции ИЛ-1.

Для получения супернатанта, содержащего ИЛ-1, клетки стимулировали в течение 16 часов митогеном (КонА). Супернатанты хранили при -40°С. В качестве стандартного препарата использовали ИЛ-1 фирмы Calbio-chem. Тестирование активности препарата осуществляли на тимоцитах (1,20).

500 тыс. тимоцитов инкубировали вместе с тестируемыми супернатан-тами и ФГА (конечная концентрация 0,5 мкг/мл) в 96 луночных планшетах. Общий объем среды был равен 0,2 мл. Время инкубации составляло трое суток. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку добавляли по 1 мкКи3Н тимидина в объеме 5 мкл. (удельная активность 1 кИ/мМ). Подсчет радиоактивности проводили, как описано ранее.

14) Определение цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12) в су-пернатантах спленоцитов и в сыворотке крови мышей методом ИФА.

При исследовании синтеза цитокинов в присутствии фоспренила и /или КонА спленоциты культивировали обычным способом. Отбирали пробы культуральной жидкости и тестировали в них содержание цитокинов методом ИФА (1,20).Содержание цитокинов определяли так же, в сыворотках крови мышей на разных сроках после введения фоспренила.

Определение цитокинов проводили на специфических тест-системах фирмы Granzim (согласно предписанию фирмы производителя). Для этого на планшете раститровывали стандартные образцы цитокинов и исследуемые образцы сывороток или супернатантов, которые инкубировали в течение часа при 37° С при постоянном встряхивании. Затем удаляли жидкость из лунок и трижды промывали их буфером и дистиллятом. Далее в осушенные лунки вносили раствор антител и инкубировали в течение 2-х часов при комнатной температуре при непрерывном встряхивании. После чего повторно отмывали лунки и добавляли конъюгат с пероксидазой хрена. Инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С. Затем, удаляли жидкость, промывали планшет буфером и струей дистиллированной воды. Осушали планшет и добавляли раствор субстрата с красителем на 10-20 мин. Останавливали реакцию добавлением серной кислоты в каждую лунку. Учет результатов производили с помощью мультискана при длине волны 450 нм. Тестирование каждой пробы проводили в трех повторах.

15) Реакция агглютинации лимфобластов с антителами к CD25 в капиллярах.

Конкурентное взаимодействие фоспренила и антител к CD25 за а-субъединицу рецептора к ИЛ-2 (CD25) в суспензии спленоцитов мышей оценивали с использованием реакции агглютинации КонА бластов в модификации (141). Получали суспензию КонА бластов. В суспензию клеток вносили в разных последовательностях исследуемые реагенты. Инкубировали в течение 10 минут, после чего заполняли ими капилляры, которые запаивали с одной стороны, и, центрифугировали в течение 0,5-1 минуты при 1,5 тыс. оборотов в минуту. Затем оставляли на 20 минут под углом в 45° запаянным конусом вверх.

Капилляры просматривали под лупой и по величине осадка определяли скорость оседания, зависящую от того, произошла агглютинация или нет. Величина осадка обратно пропорциональна степени агглютинации.

16. Определение ФИО а в сыворотке крови мышей после введения фоспренила.

Уровень ФНОа в сыворотке крови определяли на чувствительной клеточной линии L-929. Для этого, исследуемые сыворотки в разных разведениях раскапывали в лунки с монослоем фибробластов и в присутствии актино-мицина D (Serva) в концентрации 2 мг/мл (109) инкубировали в течение 18 часов, после чего монослой отмывали от погибших клеток и прокрашивали в течение 10 минут 0,2% кристалл виол етом на 2% этиловом спирте. Излишек краски удаляли и планшет высушивали. Интенсивность окрашивания измеряли на мультискане при длине волны 595 нм. против воздуха (50,109). Титрование каждой пробы проводили в трех повторах.

17.Определение ИФН.

Уровень интерферонов в супернатантах определяли по способности предотвращать поражение клеток мишеней вирусом. В качестве клеток -мишеней использовали клетки L-929. В качестве вируса - вирус ЕМС, полученный из лаборатории индукторов интерферонов ГУ НИИЭМ Гамалеи РАМН.

На суточном монослое клеток L-929 раститровывали вирус и суперна-танты. Через сутки из всех лунок убирали среду культивирования и определяли разведение вируса, при котором все еще наблюдалось цитотоксическое ^ действие. Вносили к клеткам, проинкубированным с супернатантами, вирус в этом разведении и инкубировали в течение суток. Через сутки культивирования среду сливали и монослой прокрашивали в течение 10 минут 0,2% раствором кристаллвиолета на 2% этиловом спирте. Интенсивность окрашивания измеряли на мультискане при длине волны 595 нм. против воздуха (50,109). Титрование каждой пробы проводили в трех повторах.

18. Статистическая обработка результатов.

Достоверность полученных результатов оценивали с помощью критерия Стьюдента.

С этой целью рассчитывали среднее арифметическое каждого из исследованных вариантов по формуле:

П2 и стандартную ошибку среднего: п(п-1) где: п количество опытов, ап - значения, полученные в каждом отдельном опыте.

Две величины Mi и М2 рассматривали как достоверно отличающиеся если величина р превышала коэффициент t при 95% вероятности и числе степеней свободы k = (nrl)+(n2-l) где ni и П2 - число опытов, поставленное соответственно при определении Mi и Мг.

На рисунках и в таблицах отложены средние арифметические величины (М) и стандартные ошибки ш.