Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующая активность производных оксиникатиновой кислоты

На л раки рукописи

БАЗАРНАЯ Татьяна Валентиновна

14.00.36. Аллергология и иммунология

АВТО РЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени .'.пмц^яатг медицинских наук

Курск - 1996

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете.

Научные руководители:

— доктор медицинских наук, профессор А. И. Конопля

— доктор медицинских наук, профессор В. В. Пичугин

Официальные оппоненты:

— доктор медицинских наук, профессор Г. А. Чалый

— доктор медицинских наук, профессор Л. А. Сернов

Ведущее учреждение:

Российский государственный медицинский университет им. Н. И. Пирогова (г. Москва)

Защита состоится «Л 6 » 996 г. в час,

на заседании диссертационного совета К 084.57.01. при Курском государственном медицинском университете (305033, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан « » 1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент В. В. Новиков

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ: В условиях патологии существенная роль в развитии и исходе заболевания принадлежит целостности клеточных мембран органов и тканей. Усиление свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов (ПОЛ), ускорение образования гидроперекисных радикалов приводит к нарушению клеточных мембран и повышению их проницаемости. Вследствие этого усиливается выход в сосудистое русло компонентов цитоплазмы, клеточных органелл и продуктов нарушения метаболизма клеток. Некоторые из этих соединений (протеолитические ферменты, антипроте-олитические белки, липопротеиды низкой и очень низкой плотности, глюкозаминогликаны, протеогликаны) обладают выраженной им-муномодулирующей активностью (Огурцов Р. П. и др., 1989; Прокопенко Л. Г. и др., 1994; Николаева И. Н., Яхонтов Ю. О., 1994; Ласкова И. Л., 1995; Рагопейо Б., 1986; ВгеуЫ а1., 1993). Особенностью взаимосвязи патологии внутренних органов с функционированием иммунной системы является накопление в крови одновременно субстанций, обладающих как иммуносупрессорным, так и иммуностимулирующим воздействием (Конопля А. И., 1989; Барт Е. В., 1994; Иванова А. П., 1995).

Исходя из этого, возникает необходимость комплексного подхода в лечении различных патологических состояний, воздействуя как на патогенетическое звено развития заболевания — нарушение процессов перекисного окисления липидов и, как следствие, нарушение целостности клеточных мембран, так и устраняя последствия срыва иммунологического гомеостаза организма. Известно, что антиоксиданты изменяют взаимодействие рецепторов иммунокомпетентных клеток с лигандом, этапы метаболической активации лимфоцитов, усиливают фагоцитоз, нарушают процессы кооперации Т- и В-лимфоцитов (Аши-ров М. Г., Гусейнова С. Ю., 1989; Гусель В. А., Маркова И. В., 1989; Смирнов Л. Д., Дюмаев К. М., 1994; Ве^п Апсае1а1., 1993). В зависимости от природы антиоксиданта и дозы введенного препарата конечные эффекты колеблются от иммуносупрессорных до иммуностимулирующих с преимущественным влиянием или на гуморальную или на клеточную формы иммунного ответа. В связи с этим изучение им-

мунотропной активности вновь синтезированных соединений анти-оксидантной направленности имеет большое значение.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение иммуномодулирующего действия производных оксиникотиновой кислоты (ПОНК) у здоровых животных и в условиях экспериментальной патологии.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ: 1. Установление закономерностей влияния оксиникотиновой кислоты (ОК) и ее производных: ЛБК—10, ЛБК—138 и ЛБК—149 (лабораторные шифры) на развитие гуморального иммунного ответа (ГИО) на эритроциты барана (ЭБ);

2. Изучение воздействия ПОНК на формирование реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), индуцированной ЭБ;

3. Изучение мембраностабилизирующей и антиоксидантной активности ПОНК в условиях острой токсической гепатопатии, ожоговой травмы, острого панкреатита и инфаркта миокарда;

4. Изучение влияния ПОНК на иммунологическую реактивность в условиях экспериментальной патологии, характеризующейся нарушением иммунологической реактивности на Т-зависимые антигены;

5. Выявление роли гуморальных факторов сыворотки крови и селезенки в реализации иммуномодулирующего эффекта ПОНК;

Научная новизна работы. Соединение ЛБК—138 стимулирует формирование ГИО и ГЗТ на ЭБ. Оксиникотиновая кислота, ЛБК—10 и ЛБК—149 аналогичной активностью не обладают. ЛБК—138 и ЛБК—149 повышают содержание и активность факторов неспецифической защиты организма как у здоровых животных, так и в условиях острой токсической гепатопатии.

ПОНК в условиях экспериментальной токсической гепатопатии, острого панкреатита, ожоговой травмы, инфаркта миокарда оказывают антиоксидантное и мембраностабилизирующее действие. Эффективность возрастает в последовательности: ЛБК—10 ->

ЛБК—149-> ЛБК—138.

В условиях нарушения иммунологической реактивности ПОНК проявляют иммунокорригирующее действие. Наиболее эффективным в этом отношении является соединение ЛБК—138, которое отменяет иммуномодулирующую активность сыворотки крови и надосадоч-

ной жидкости клеток селезенки у животных с экспериментальной патологией.

Научно-практическое значение полученных результатов. Установлены особенности формирования ГИО и ГЗТ на Т-зависимый антиген под влиянием ПОНК у здоровых животных и в условиях экспериментальной патологии, характеризующейся нарушением иммунологической реактивности. Расшифрованы некоторые механизмы им-муномодулирующего действия изучаемых соединений. Расширены существующие представления о важной роли изменения стабильности клеточных мембран гепатоцитов и клеток других органов и тканей в нарушениях иммунологической реактивности и ее коррекции в условиях патологии. Полученные экспериментальные данные об иммунотропной и антиоксидантной активности ПОНК могут служить основой для клинических испытаний данных соединений. Экспериментально доказана целесообразность использования производных оксиникотиновой кислоты для иммунокоррекции при токсических поражениях печени, в условиях острого панкреатита, ожоговой травмы и экспериментального инфаркта миокарда. Материалы диссертации вошли в учебные программы, используются в лекционных курсах и на практических занятиях кафедр фармакологии, биохимии, клинической иммунологии, внутренних болезней N1 Курского государственного медицинского университета.

Апробация работы. Основные положения диссертации были обсуждены на научных конференциях КГМУ (1991—95); Международном симпозиуме по проблемам иммунологической реабилитации (Дагомыс, 1994); I съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995); II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995); юбилейной конференции, посвященной 60-летию КГМУ «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» (Курск, 1995); научной конференции «Современные вопросы дерматовенерологии» (Курск, 1995); совместном заседании кафедр биологической химии, фармакологии, пропедевтики внутренних болезней, патологической физиологии, спортивной медицины и медицинской реабилитологии, микробиологии,

фармацевтической химии и биоорганической химии КГМУ (1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1 и 2), описания материала и методов исследований (глава 3), изложения результатов собственных исследований (главы 4—9), заключения и выводов. Работа изложена на страницах машинописи и включает 34 таблицы, 6 рисунков, 6 фотографий, указатель литературы, содержащий ¿^источника отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 120—200 г и мышах-гибридах Б1 (СБА х С57ВЬ) массой 16—20 г. Все опыты проводили в одно и то же время суток, от животных получали сыворотку крови, ткань селезенки и печени.

Исследуемые соединения — оксиникотиновая кислота и ее производные ЛБК—10, ЛБК—138, ЛБК—149 (лабораторные шифры) синтезированы в лаборатории Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ (пос. Старая Купавна Московской обл.). ПОНК растворяли в бидистиллированной воде, вводили пятикратно с интервалом в 24 ч до или после иммунизации или сенсибилизации внутрибрюшинно, в дозах из расчета средних величин кардиотропного терапевтического эффекта по данным изготовителя: ОК и ЛБК—10 — 5, 50 и 500 мг/кг; ЛБК-138 и ЛБК—149 — 10, 100 и 1000 мг/кг массы тела животного.

Для оценки выраженности антиоксидантных и иммуномодули-рующих свойств ПОНК использовали ряд экспериментальных моделей. Острое токсическое поражение печени вызывали или пятикратным внутримышечным введением 50% раствора ССЦ в подсолнечном масле, из расчета 3 мл/кг массы тела в течение 5 дней подряд (Конопля А. И., 1989; Алексеева И. Н. и др., 1991) или однократным внутрибрюшинным введением солянокислого гидра-

зина из расчета 50 мг/кг массы тела (Майоре А. Я. и др., 1982; Горштейн Э. С. и др., 1989). Ожоговую травму моделировали под эфирным наркозом путем нанесения экспериментальным животным ожога 3 степени, охватывающего 30% поверхности тела. Ожог наносили на кожу спины с помощью устройства, поддерживающего температуру на уровне 100° С, при экспозиции 8 сек (Минухин В. В. и др., 1985). Острый панкреатит вызывали у крыс под гексена-ловым наркозом путем перевязки протока и сосудов поджелудочной железы и механической травмы селезеночного сегмента органа (Шалимов С. А. и др., 1989). Инфаркт миокарда моделировали под эфирным наркозом у животных, находящихся на искусственной вентиляции легких, при этом вскрывали грудную клетку и лигиро-вали переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии на 1,0—1,5 мм ниже ушка предсердия. После перевязки производили послойное ушивание раны (Коган А. X., 1979; Бе1уе Н. е1 а1., 1960). В эксперимент в качестве контроля были введены группы «ложно-оперированных» животных, объем операции у которых ограничивался вскрытием и послойным ушиванием раны.

Развитие ГИО индуцировали ЭБ, которые вводили внутрибрю-шинно, однократно из расчета 2х109 клеток на 1 кг массы тела. Выраженность ГИО оценивали на пятые сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа клеток, образующих антитела к ЭБ — АОК (Мальберг К., Зигль Э., 1987), числа клеток, формирующих розетки с ЭБ — РОК (Зауэр X., 1987), и титров антиэритроци-тарных антител (Ат) в сыворотке крови в реакции прямой гемагглю-тинации (Мальберг К., 1987).

ГЗТ у крыс индуцировали внутрибрюшинным введением 108 ЭБ (сенсибилизирующая доза). Через 4 сут. в подушечку стопы правой лапки вводили 10б ЭБ (разрешающая доза). Спустя 24 ч животных умерщвляли и выделяли регионарный (по месту введения ЭБ) и контрлатеральный подколенный лимфоузлы. О выраженности ГЗТ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов и разнице количества в них ядросодержащих клеток (Черно-усов А. Д. и др., 1979).

Влияние ПОНК на факторы неспецифической защиты организма оценивали по концентрации лизоцима (Федосеева В. Н. и др., 1993) и комплемента в сыворотке крови (Бухарин О. В., 1971), фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови (Белокри-ницкий Д. В., 1987) и функциональной активности нейтрофилов (Кор-нева М. С., Штернова В. В., 1991).

Надосадочную жидкость клеток селезенки (НЖКС) получали по разработанному ранее в нашей лаборатории методу (Прокопенко Л. Г., Конопля А. И., 1982). Количество жизнеспособных клеток, оцениваемое в тесте поглощения трипанового синего, до инкубации составляло 90—95%, после — 80—85%. Готовили пул НЖКС, объединяя для этого надосадочные жидкости 5—6 однородных по опыту животных. Для поддержания стерильных условий использовался ла-минарбокс ЛБВ. Иммуномодулирующую активность НЖКС определяли путем однократного внутрибрюшинного введения интактным аллогенным реципиентам из расчета 5 мг белка на 1 кг массы тела, с одновременной иммунизацией ЭБ. Спленоцитарные белки, находящиеся в НЖКС после концентрирования и диализа против 50-кратного объема 0,05 М трис—НС1-буфера (рН=8,0), приготовленного на 0,15 М хлористом натрии, фракционировали на сефадексе С—150 (Конопля А. И. и др., 1985). Для оценки М.М. белков хроматографи-ческих фракций определяли объемы выхода из этой же колонки белков с известной М.М. (Остерман Л. А., 1985). Степень влияния фракций НЖКС на формирование ГИО к ЭБ определяли путем внутрибрюшинного, одновременно с антигеном, введения интактным животным в объеме, содержащем 2 мг/кг массы тела животных.

Донорами сыворотки крови служили животные опытных и контрольных групп. Кровь получали из яремной вены под эфирным наркозом через 24 ч после последнего воздействия или введения соединения. Собирали пул сыворотки от 5—6 однородных по опыту животных. Для изучения иммуномодулирующей активности цельной сыворотки ее однократно внутрибрюшинно вводили одновременно с антигеном интактным аллогенным реципиентам из расчета 5 мл/кг массы тела.

Разделение белков сыворотки крови первоначально осуществлялось солевым методом, для чего использовалось 50% насыщение сернокислым аммонием. Выпавшие в осадок (ОБ) и остающиеся в над-осадке (НБ) белки диализировали против 50-кратного объема 0,05 М фосфатного буфера (рН=7,2), приготовленного на 0,15 М хлористом натрии, и фракционировали на сефадексах 0—150 и О—75 (Конопля А. И., Прокопенко Л. Г., 1988). Для исследований влияния ОБ, НБ и их гель-хроматограф ических фракций на формирование ГИО на ЭБ их вводили внутрибрюшинно, одновременно с антигеном в объеме, содержащем 0,2 г/кг массы тела лабораторных животных,

В сыворотке крови определяли содержание первичных продуктов ПОЛ — ацилгидроперекисей (Гаврилов В. Н., Мишкоруд-ная М. И., 1983) и вторичных — малоновый диальдегид (Мирон-чик В. В., 1983; Когс1епеЬпшс1 А., 1972).

В сыворотке крови здоровых крыс и с различными формами патологии печени определяли активность аспартат- и аланинами-нотрансфераз, щелочной фосфатазы, концентрацию билирубина по Ендрашеку, холестерина по Ильку, бета-липопротеидов по Бур штейну, общего белка. Кроме этого ставили тимоловую пробу. Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами (Меньшиков В. В., 1987).

Статистическую обработку материала проводили путем вычисления средней арифметической (М) и средней ошибки средней (ш). Существенность различий средних величин оценивали с помощью критерия Вилкоксона—Манна—Уитни при Р<0,05 и по критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Закономерности влияния производных оксиникотиновой кислоты на развитие иммунного ответа. В первоначальных исследованиях на крысах Вистар изучено влияние ОК и ее производных ЛБК—10, ЛБК—138 и ЛБК—149 на развитие ГИО, индуцированного ЭБ.

Установлено, что внутрибрюшннное введение ОК, ЛБК—10 или ЛБК—149, независимо от времени их поступления относительно иммунизации и вводимых доз, не оказывает влияния на иммунологическую реактивность, индуцированную ЭБ. Об этом свидетельствуют практически одинаковые показатели количества иммунных АОК и РОК в селезенке крыс и титров антиэритроцитарных антител в сыворотке крови в группах опытных и контрольных животных. В то же время соединение ЛБК—138 проявляет иммуностимулирующий эффект в дозе 100 мг/кг и более выраженно в дозе 1000 мг/кг независимо от времени введения антигена (таблица 1).

Поскольку ГЗТ играет важную роль в развитии различных заболеваний, важно было выяснить, как влияет ОК и ее производные на развитие реакции ГЗТ, индуцированной ЭБ. Установлено, что введение ОК, ЛБК—10, ЛБК—149 как перед сенсибилизацией ЭБ, так и в период между введением сенсибилизирующей и разрешающей инъекциями ЭБ, не влияет на развитие реакции ГЗТ, в то же время, ЛБК—138 стимулирует формирование реакции ГЗТ, индуцированной ЭБ.

Выявленный иммуностимулирующий эффект на формирование ГИО и ГЗТ на Т-зависимый антиген ЛБК—138 в отличие от ОК, ЛБК—10 и ЛБК—149, вероятно, связан с особенностями химической структуры и прямым воздействием ЛБК—138 на клеточные мембраны иммунокомпетентных клеток. Не исключено, что данное соединение стимулирует образование или выделение цитокинов.

Изучение воздействия ПОНК на неспецифические факторы защиты организма. В настоящее время состоянию неспецифической реактивности организма придается большое значение в развитии ряда физиологических и патологических состояний (Йегер А., 1987; Беляков И. М., Земсков В. М., 1992).

Исходя из этого, изучено влияние ПОНК на факторы неспецифической защиты организма. Выявлено, что ОК и ЛБК—10 не оказывают влияния на содержание лизоцима и комплемента в сыворотке крови, фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови и функциональную активность нейтрофилов. ЛБК—138 и

Влияние ПОНК на развитие ГИО, индуцированного на ЭБ(М±т).

№ группы Условия опыта Однократная доза соединения, мг/кг АОК, тыс./орган РОК, млн./орган At, log 2

1. Контроль (иммунизация) — 19,3±4,3 94,1±9,3 2,4+0,1

2. Введение физиологического раствора — 21,5±3,9 103,3+10,1 2,2±0,09

3. Введение ОК. 5 17,5±5,1 112,7± 12,5 2,3±0,1

4. Введение ОК 50 20,1±3,3 99,5+8,8 2,2±0,1

5. Введение ОК 500 21,7±2,9 96,3±8,2 2,3±0,2

6. Введение Л Б К-10 5 22,5±5,5 93,9+8,0 2,2+0,1

7. Введение Л Б К-10 50 24,1±6,1 111,5+11,1 2,3+0,2

8. Введение ЛБК—10 500 26,0+8,1 107,4+10,5 2,4+0,2

9. Введение ЛБК-138 . 10 24,5±5,1 112,6± 10,0 2,2±0,1

10. Введение ЛБК-138 100 37,1±8,8 Ри<0,05 201,3±17,7 Р12<0,05 3,1+0,2 Р12<0,05

11. Введение ЛБК-138 1000 48,2±9,2 Р12<0,05 243,1±20,5 ^ю<0,05 3,3+0,2 Р12<0,05

12. Введение ЛБК-149 10 20,7±5,5 93,5+10,2 2,3+0,1

13. Введение ЛБК-149 100 18,8±4,7 90,9±9,4 2,0±0,1

14. Введение ЛБК-149 1000 24,1±6,3 94,7±9,3 2,1±0,09

Примечание. На этой и табл. 2: 1. Каждая средняя получена в опытах на 8—10 крысах;

2. Р — достоверность различий средних, цифры рядом с Р указывают, по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны.

ЛБК—149 в дозах 100 и 1000 мг/кг повышают концентрацию лизоци-ма в 1,7—2,3 раза, комплемента в 2,1—2,6 раза. Активность фагоцитов увеличивается на 5—11%, фагоцитарное число — на 5—14%, функциональная активность нейтрофилов — на 65—104%.

Учитывая большую роль печени в функционировании всех компонентов неспецифической защиты организма, изучено влияние ПОНК на факторы неспецифической защиты в условиях токсического поражения печени, которое вызывали солянокислым гидразином. Введение данного токсиканта снижает все показатели неспецифической защиты организма. В этих условиях введение ОК или ЛБК—10 не нормализует, ЛБК—138 существенно повышает концентрацию лизоцима и комплемента, а ЛБК—149 корригирует изменение всех исследуемых показателей.

Таким образом, проведенные исследования показали, что наиболее эффективным действием на факторы неспецифической защиты организма обладают ЛБК—138 и ЛБК—149 как в условиях нормы, так и в условиях токсического поражения печени.

Состояние клеточных мембран и коррекция нарушений в условиях патологии производными оксиникотиновой кислоты. При биохимическом исследовании сыворотки крови крыс, отравленных ССЬ4, обнаружены параллельно протекающие цитолитический и холестати-ческий процессы, а также развитие мезенхимально-воспалительного синдрома, при введении солянокислого гидразина развивается цитолитический и холестатический синдромы.

Введение ЛБК—138 и гепатотропного яда: ССЬ4 или солянокислого гидразина, препятствует развитию острой токсической гепатопа-тии, о чем свидетельствуют одинаковые биохимические показатели сыворотки крови опытной и контрольной групп крыс (таблица 2).

Подобное влияние при введении с гепатотропным ядом оказывает соединение ЛБК—149, однако при этом проявляется менее выраженный гепатопротекторный эффект данного соединения. В то же время совместное введение ССЦ или гидразина с ЛБК—10 не нормализует функцию поврежденных гепатоцитов.

В основе поражения клеточных мембран гепатоцитов как основ-

Выраженность мембраностабилизирующих и антиоксидантных свойств соединения ЛБК—138 в условиях патологии (М±т).

№ п/п Условия опыта Показатели цитолиза Показатели ПОЛ

АсАТ, ммоль/ч•л АлАТ, ммоль/ч•л Диеновые конъюгаты, Д/233 Малоновый диальдегид, Д/533

1 Контроль (интакгные животные) 0,65±0,08 0,5110,07 2,8410,1 2,3110,2

2 Введение ЛБК-138 . 0,6410,06 0,5510,04 2,7710,3 2,4310,3

3 Введение ССЬ4 2,17±0,17 Р, <0,05 3,2310,3 Р; <0,05 4,9110,2 Р, <0,05 6,8310,3 Р, <0,05

4 Введение ССЬ4 и ЛБК-138 0,58±0,08 Р3 <0,05 0,4910,07 Р3 <0,05 3,110,09 Р3 <0,05 3,0110,2 Р3 <0,05

5 Введение солянокислого гидразина 2,39+0,2 Ц <0,05 3,0910,27 Р, <0,05 3,4410,1 Р, <0,05 5,3910,4 Р, <0,05

6 Введение солянокислого гидразина и ЛБК—138 0,7210,03 Р5 <0,05 0,6210,1 Р5 <0,05 2,8510,2 Р5 <0,05 2,4810,25 Р5 <0,05

7 Ожоговая травма 1,93±0,05 Р! <0,05 2,0510,04 Р! <0,05 4,2510,4 Р! <0,05 5,0310,4 Р; <0,05

8 Ожоговая травма и введение ЛБК-138 1,0110,04 Р7 <0,05 1,2310,03 Р7 <0,05 3,210,3 Р7 <0,05 3,5110,3 Р7 <0,05

9 Острый панкреатит 2,2410,04 Р, <0,05 3,1710,2 Р! <0,05 6,2510,9 Р, <0,05 7,1210,8 Р, <0,05

10 Острый панкреатит и введение ЛБК-138 0,9910,02 Р, <0,05 1,2910,04 Р9 <0,05 3,4710,4 Р„ <0,05 4,2510,2 Р, <0,05

11 Инфаркт миокарда 4,3910,21 Р1 <0,05 3,0510,25 Р! <0,05 9,9610,61 Р! <0,05 6,7510,9 Р! <0,05

12 Инфаркт миокарда и введение ЛБК-138 0,7310,07 Рп <0,05 0,610,03 Р„<0,05 2,8510,09 Рп <0,05 3,710,8 Р„ <0,05

ного патогенетического звена всех биохимических синдромов печени лежит нарушение процессов ПОЛ. В наших опытах установлено повышение концентрации первичных (диеновые конъюгаты) и вторичных (малоновый диальдегид) продуктов ПОЛ в сыворотке крови крыс, отравленных ССЦ или солянокислым гидразином. ПОНК в условиях экспериментальной гепатопатии проявили различное ан-тиоксидантное действие. Наиболее эффективно в этом отношении оказалось соединение ЛБК—138, которое нормализует показатели ПОЛ отравленных крыс до уровня контрольных животных (таблица 2). Принципиально важным является тот факт, что введение исследуемых соединений здоровым животным не влияет на показатели цитолиза и перекисного окисления липидов. Данные биохимии о различной гепатопротекгорной активности ПОНК были подтверждены морфологически.

Экспериментальные модели ожоговой травмы (ОТ), острого панкреатита (ОП) и инфаркта миокарда (ИМ) характеризуются развитием цитолитического поражения тканей (увеличение активности сывороточных аминотрансфераз в 3,0—6,2 раза). Параллельно повышается содержание продуктов ПОЛ. Следует отметить, что в группах «ложнооперированных» животных не наблюдается отклонения показателей цитолиза и уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ от контрольных животных.

ЛБК—10 в условиях экспериментальной ОТ, ОП и ИМ не проявляет мембраностабилизирующего и антиоксидантного действия, так как активность ферментов и продукты перекисного окисления липидов практически не отличаются от таковых в группах животных с патологией. ЛБК—149 при его введении животным в условиях ОТ также оказалось неэффективным, в то же время в условиях ОП и ИМ снижает показатели цитолиза и концентрацию первичных и вторичных продуктов ПОЛ.

Наиболее эффективным мембраностабилизирующим и антиок-сидантным действием обладает ЛБК—138, практически нормализуя все соответствующие показатели до уровня здоровых животных (таблица 2).

Таким образом, проведя экспериментальную оценку антиокси-дантной активности ПОНК на моделях острого токсического поражения печени, острого панкреатита, инфаркта миокарда и ожоговой травмы, показано, что исследуемые соединения обладают различными по степени выраженности антиоксидантными и мембраностаби-лизирующими свойствами. Наиболее значимый эффект проявляют соединения ЛБК—138 и ЛБК—149.

Производные оксиникотиновой кислоты и иммунологическая реактивность в условиях патологии. Введение ССЦ повышает иммунологическую реактивность на ЭБ, наоборот, токсическое поражение печени, вызываемое солянокислым гидразином, сопровождается супрессией формирования ГИО на ЭБ.

Соединение ЛБК—10 не оказывает существенного влияния на показатели ГИО крыс, отравленных ССЦ. Введение производных оксиникотиновой кислоты ЛБК—138 или ЛБК—149 отравленным крысам корригирует нарушения ГИО, вызванные введением гепатотропного яда, об этом свидетельствует отсутствие различий между показателями иммунного ответа у животных с экспериментальной острой гепа-топатией, получавших антиоксид анты, и интактных животных.

Введение ЛБК—10 и ЛБК—149 животным с острой токсической ге-патопатией, вызванной солянокислым гидразином, корригирует показатели ГИО, так как при их введении показатели ГИО опытных животных не отличаются от уровня контрольной группы. ЛБК—138 не только корригирует показатели ГИО, сниженные данным гепатотропным ядом, но и вызывает выраженный иммуностимулирующий эффект.

Термическая травма и острый панкреатит сопровождаются развитием выраженного вторичного иммунодефицита, при этом число им-мувных АОК в селезенке обожженных крыс и животных с ОП снижается соответственно в 2,7 и 2,6 раза, а РОК в 1,6 и 1,8 раза, по сравнению с контрольной группой. Введение животным с ОТ или ОП ЛБК—138 и ЛБК—149 нормализует показатели ГИО, по сравнению с обожженными животными и крысами с ОП. Соединение ЛБК—10 в условиях ОТ нормализует, а в условиях ОП незначительно повышает показатели ГИО, индуцированного Т-зависимым антигеном.

Развитие экспериментального ИМ также сопровождается резким снижением показателей ГИО. Введение ЛБК—138 животным с экспериментальным ИМ практически устраняет развивающуюся имму-носупрессию, а ЛБК—10 и ЛБК—149 в группах крыс с ИМ проявляют только незначительное иммунокорригирующес действие.

Таким образом, как в условиях экспериментального вторичного иммунодефицита, так и в условиях повышенной иммунологической реактивности на Т-зависимый антиген ПОНК корригируют показатели ГИО, проявляя иммуномодулирующие свойства. Следует отметить, что в этом отношении исследуемые соединения проявили неодинаковую активность — от слабовыраженной у ЛБК—10 и ЛБК—149 до выраженной у ЛБК—138. Полученные результаты открывают перспективу для дальнейшего исследования и клинической апробации ЛБК—138 в качестве иммуномодулятора.

Роль гуморальных факторов сыворотки крови в реализации имму-номодулирующего эффекта ЛБК—138 в условиях патологии. Из литературы известно, что при различных видах патологии в крови накапливаются соединения, обладающие иммуномодулирующими свойствами (Быстрова Н. А., Безгина С. В., 1989; Конопля А. И., 1989; Кузнецов И. А., 1994).

Учитывая, что при избранных моделях патологии нарушается иммунологическая реактивность на Т-зависимый антиген, важно было выяснить роль иммуномодулирующих факторов сыворотки крови в условиях патологии под влиянием наиболее эффективного по проведенным исследованиям ПОНК — ЛБК—138.

Выявлено, что цельная сыворотка крыс, отравленных ССЬ4, обладает выраженным иммуностимулирующим эффектом, а сыворотка животных, отравленных гидразином при ее пассивном переносе атшо-генным реципиентам, проявляет иммуносупрессирующий эффект. Сыворотка животных с ОТ, ОП или ИМ также обладает выраженным иммуносупрессорным действием на Т-зависимый антиген при пассивном переносе интактным аллогенным реципиентам.

Сыворотка животных, отравленных ССЬ4 или солянокислым гидразином, а также с экспериментальными ОТ, ОП или ИМ, и одно-

временно получавших ЛБК—138, не проявляет иммуномодулирую-щих свойств, так как аллогенный пассивный перенос ее интактным реципиентам не влияет на формирование у последних ГИО на ЭБ.

Учитывая, что в цельной сыворотке животных в состоянии патологии зачастую происходит одновременное накопление и иммуностимулирующих, и иммуносупрессирующих соединений (Конопля Е. Н., 1991; Иванова А. П., 1995), особый интерес представляет изучение свойств отдельных компонентов такой сыворотки.

Белки сыворотки крови крыс, отравленых ССЬ4, выпадающие в осадок при 50%-ом насыщении сернокислым аммонием (ОБ), обладают выраженными иммуносупрессирующими свойствами; надоса-дочные белки (НБ), наоборот, оказывают иммуностимулирующий эффект. Осадочные и надосадочные белки сыворотки крыс, которым одновременно вводили ССЦ и ЛБК—138, такими свойствами не обладают, так как их введение интактным реципиентам не влияет на показатели ГИО.

Относительно низкомолекулярные белки НБ разделяли на сефа-дексг О—75. При разделении получено две фракции: 1-я фракция выходила в объеме 55—80 мл (около 80% белков) с белками М.М., превышающей 75 кД; П-я фракция выходила в объеме 160—180 мл (около 20% белков) и содержала белки М.М. 15—30 кД. Установлено, что 1-я и П-я фракции НБ обладают иммуностимулирующим действием по сравнению с контролем (введение соответствующих фракций здоровых крыс или только иммунизация).

ОБ, содержащие высокомолекулярные белки, разделяли гель-хроматографией на сефадексе С~150 и получили при этом 2 белковые фракции: 1-я выходила в объеме -10—80 мл (около 60% белка). И-я — в объеме 190—240 мл (около 40% белка). 1-я фракция содержала в основном белки с М.М. более 150 кД, Н-я фракция — белки с М.М. 70- 80 кД. Введение 1-й фракции ОБ крыс, отравленных ССЬ4, алло-генньш реципиентам супрессирует у последних формирование ГИО на ЭБ. П-я фракция ОБ в то же время не влияет на иммунологическую реактивность, индуцированную ЭБ.

Гель-хроматографические фракции ОБ и НБ сыворотки крови

крыс, отравленных ССЬ4 и получавших ЛБК—138, не содержат им-муномодулирующих субстанций, так как их введение аллогенным интактным реципиентам не приводит к изменению иммунологической реактивности на ЭБ.

Белки сыворотки крови крыс, отравленных гидразином, выпадающие в осадок при 50% насыщении сернокислым аммонием, а также их гель-хроматографические фракции (1-я содержала в основном белки М.М. более 150 кД и Н-я — белки М.М. 70—80 кД) при введении интактным животным супрессируют развитие ГИО.

Белки сыворотки крови крыс, отравленных гидразином, остающиеся в надосадочной жидкости при 50% насыщении сернокислым аммонием, не влияют на формирование ГИО на ЭБ при их введении интактным животным. В НБ животных, отравленных гидразином, содержатся одновременно белки, обладающие иммуностимулирующими (П-я фракция — М. М. 15—30 кД) и иммуносупрессирующими . свойствами (1-я фракция — М. М. более 75 кД). ..

Введение всех солевых и гель-хроматографических фракций оса- ( дочных и надосадочных белков крыс, отравленных гидразином и полу- > чавших антиоксидантное соединение ЛБК—138, не влияет на формирование ГИО у здоровых рецшшенток, что подтверждает отсутствие г., такой сыворотке иммуномодулирующих субстанций.

Таким образом, нами подтвержден факт наличия в кровотоке им-, муномодулирукяцих субстанций при различных формах эксперимен- , тальной патологии, оказывающих как иммуносупрессирующее, так и иммуностимулирующее влияние на формирование ГИО, по-видимому, за счет «просачивания» их в кровь из клеток поврежденных орга- , нов и тканей или индукции активности иммунокомпетентных клеток. Соединение ЛБК—138, обладая антиоксидантными и мембране- > стабилизирующими свойствами, способствует сохранению целостно -; сти клеточных мембран в условиях патологии, что предотвращает от ■ выделения и попадания в кровоток субстанций, изменяющих имму-,; нологическую реактивность на Т-зависимый антиген.

Роль гуморальных факторов селезенки в реализации иммуномоду-лирующего эффекта ЛБК—138 в условиях патологии. Введение НЖКС .

крыс, получавших ССЦ или солянокислый гидразин, интакгным аллогенным реципиентам соответственно стимулирует или супрес-сирует развитие у них ГИО на ЭБ, по сравнению с контрольными животными. НЖКС крыс с экспериментальными ОП, ОТ или ИМ обладает иммуносупрессирующим эффектом. В НЖКС животных со всеми экспериментальными патологиями и получавших ЛБК—138 не обнаружено иммуномодулирующей активности, так как аллогенный пассивный перенос соответствующей НЖКС интакгным реципиентам не влияет на формирование ГИО на ЭБ.

С учетом того, что в цельной НЖКС могут быть как иммуносу-прессирующие, так и иммуностимулирующие соединения, были проведены опыты по гель-хроматографическому разделению белков НЖКС. Разделение спленоцитарных белков, находящихся в НЖКС, проводили, используя колоночную гель-хроматографию на сефадек-се О—150. Основная масса белка с М.М. более 150 кД (около 70%) выходит в свободном объеме (60—80 мл) (1-я фракция), фракции И-я и Ш-я (20 и 10% белков соответственно с М.М. 60—80 и 10—30 кД) выходят в объеме соответственно 90—110 и 180—200 мл.

Изучение влияния гель-хроматографических фракций НЖКС крыс, отравленных ССЬ4, на формирование ГИО у интактных алло-генных реципиентов, позволило выявить следующие факты: 1-я и Н-я фракции НЖКС не оказывают влияния на развитие ГИО, индуцированного ЭБ; в то же время введение Ш-й фракции НЖКС оказывает иммуностимулирующее влияние на ГИО.

При токсической гепатопатии, вызванной введением животным солянокислого гидразина, иммуносупрессирующей активностью обладают субстанции, выходящие в составе П-й фракции. Введение Ш-й фракции НЖКС тех же крыс, наоборот, стимулирует развитие ГИО на ЭБ у интактных алло генных реципиентов. Введение 1-й фракции НЖКС опытных и всех фракций НЖКС интактных крыс не влияет на-показатели иммунологической реакшвности. Таким образом, НЖКС крыс, отравленных солянокислым гидразином, содержит и иммуностимулирующие, и иммуносупрессирующие белки соответственно с М.М. 10—30 кД и 60—80 кД.

Введение НЖКС крыс, отравленных ССЬ4 или солянокислым гидразином и получавших ЛБК—138, интактным крысам не влияет .на формирование ГИО на ЭБ, так как показатели ГИО данных групп не отличаются от аналогичных в группе контрольных животных, что свидетельствует, по-видимому, об отсутствии в НЖКС иммуномоду-лирующих субстанций.

Таким образом, в условиях различных патологических состояний спленоциты продуцируют как иммуносупрессирующие, так и иммуностимулирующие цитокины. При этом необходимо подчеркнуть, что производное оксиникотиновой кислоты — ЛБК—138, проявляя антиокси-дантные свойства и обладая мембраностабилизирующим действием, предотвращает выделение спленоцитарных гуморальных факторов, а также выделение в кровоток при различных натологическж состояниях иммуномодулирующих субстанций, оказывающих влияние на ГИО к ЭБ. В связи с этим, следует продолжить изучение соединения ЛБК—138 для создания на его основе высокоэффективного препарата, обладающего иммуномодулирующими свойствами, в условиях патологии,' характеризующейся нарушением целостности клеточных мембран.

ВЫВОДЫ

1. Производное оксиникотиновой кислоты ЛБК—138 дозоза'ви-симо стимулирует формирование ГИО и ГЗТ на ЭБ. Оксиникотино-вая кислота и соединения ЛБК—10 и ЛБК—149 аналогичной активностью не обладают.

2. Соединения ЛБК—138 и ЛБК—149 повышают концентрацию лизоцима и комплемента в сыворотке крови, фагоцитарную активность лейкоцитов и функциональную активность нейтрофилов периферической крови как у здоровых животных, так и в условиях острого токсического поражения печени.

3. Экспериментальная острая токсическая гепатопатия при введении ССЬ4 или солянокислого гидразина, ожоговая травма, острый панкреатит, инфаркт миокарда характеризуются развитием циголи-1 тического синдрома и повышением перекисного окисления липи-

дов. Производные оксиникотиновой кислоты в этих условиях оказывают мембраностабилизирующее и антиоксидантное действие, их

эффективность возрастает в последовательности ЛБК—10 ->

ЛБК-149-> ЛБК-138.

4. В условиях экспериментального вторичного иммунодефицита или повышенной иммунологической реактивности на ЭБ производные оксиникотиновой кислоты оказывают иммуномодулирующее действие. Наиболее эффективно в этом отношении соединение ЛБК-138.

5. Введение ЛБК-138 отменяет иммуномодулируклцую активность сыворотки крови и надосадочной жидкости клеток селезенки животных с острой токсической гепатопатией, инфарктом миокарда, острым панкреатитом или ожоговой травмой.

6. ЛБК—138 отменяет появление в сыворотке крови животных с токсической гепатопатией, вызванной CCL4, иммуностимулирующих соединений М.М. более 75 кД и 15—30 кД и иммуносупрессорного фактора М.М. более 150 кД.

7. В сыворотке животных с токсическим поражением печени, получавших одновременно солянокислый гидразин и ЛБК-138, не обнаружено иммуносупрессорных соединений М.М. более 150 кД и 70— 80 кД и иммуностимулирующих цитокинов М.М. 15—30 кД по сравнению с животными, которым вводили только гепатотропный яд.

8. Клетки селезенки крыс с токсической гепатопатией, вызванной введением CCL4 или солянокислым гидразином, выделяют в надосадочную жидкость иммуностимулирующие (М.М. 15—30 кД) и иммуносупрессирующие соединения (М.М. 60—80 кД). Введение ЛБК-138 отменяет данный эффект.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. I m m i; n о m о d u 1 a t i n g activity of oxynicotinic acid derivatives in toxic liver affection // International Journal of immunorehabilitation. — 1994. - N1. -- S. 49-50. (Konoplya A. I.).

2. Изучение иммуномодулирующей активности оксиникотино-вой кислоты и ее производных // Тез. докл. II Российского национального конгресса «Человек и лекарство» 10—15 апреля 1995 года, Москва. — М.: РЦ «Фармединфо», 1995. — С. 137-138 (соавт. Конопля Е. Н., Авдеева Е. В.).

3. Иммуномодулирующая активность оксиникотиновой кислоты и ее производных в условиях токсического поражения печени // Тез. докл. 1-го съезда Российского научного общества фармакологов 1995 года, Волгоград. — М., 1995. — С. 32-32.

4. Иммуномодулирующая активность производных оксиникотиновой кислоты // Материалы юбилейной конф., посвящ. 60-летию КГМУ. - Курск, 1995. - С. 4-5.

5. Производные оксиникотиновой кислоты как иммуномодуля-торы в условиях патологии // Соврем, вопр. дерматовенерологии. Юбилейный сб. науч. трудов. — Курск, 1995. — С. 72—73 (соавт. Конопля А. И., Быстрова Н. А.).

6. Иммуномодулирующая активность некоторых производных оксиникотиновой кислоты // Соврем, вопр. дерматовенерологии. Юбилейный сб. науч. трудов. — Курск, 1995. — С. 12—12 (соавт. Конопля А. И., Пичугин В. В.).