Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические последствия индукции антител к IFN-γ и IL-4 их пептидными фрагментами

[к>1

На правах рукописи

Шевелев Сергей Владимирович

Иммунологические последствия индукции антител к ^N-7 и \l--4 их пептидными фрагментами.

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2008

003168658

Работа выполнена в ГП ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства »

Научные руководители доктор медицинских наук, профессор

Александр Александрович Ярилин

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Борис Владимирович Пинегин

доктор медицинских наук, профессор Иван Генрихович Козлов

Ведущая организация Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им И М Мечникова РАМН

заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017 01 в ГП ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп 2 Тел/факс +7(499)617-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГП ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА»

Защита состоится «

¿Я » ~1ссЗ- 2008 г в

часов на

Автореферат разослан

Ученый секретарь совета

по защите докторских и кандидатских

диссертаций, доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В конце 80-х годов прошлого столетия сложилась концепция о контроле иммунного ответа Т-хелперами двух типов, Thl и Th2, отличающимися спектром вырабатываемых цитокинов Согласно этой концепции Thl-клетки обеспечивают (за счет контактных взаимодействий и эффекта, соответствующих цитокинов) развитие иммунного ответа против внутриклеточных патогенов путем стимуляции бактерицидной активности макрофагов, а ТЬ2-клетки поддерживают развитие гуморального иммунного ответа, действенного в отношении внеклеточных патогенов и их токсинов, а также макропаразитов, путем стимуляции дифференцировки В-лимфоцитов в антителообразующие клетки Эти представления, разработаннные в экспериментальных моделях на мышах, с некоторыми оговорками были перенесены на иммунную систему человека При определенной схематичности концепции, она оказалась полезной теоретической основой для изучения указанных процессов

В связи с особенностями генетического контроля дифференцировки Т-хелперов и взаимным ингибирующим действием Thl- и Th2-клеток существует реальная вероятность поляризации развития Т-хелперов в направлении одного из рассматриваемых типов Возникающий при этом клеточный дисбаланс является условием, благоприятствующим развитию иммунопатологии Так, преобладание Thl-клеток повышает склонность организма к развитию аутоиммунных процессов клеточного типа (сахарного диабета 1-го типа, рассеянного склероза и тд), тогда как несбалансированное развитие Т-хелперов ТЬ2-типа повышает вероятность аллергических процессов Несмотря на то, что в реальности при заболеваниях названных групп нередко проявляется действие Т-хелперов обоих типов, в принципе указанная закономерность имеет место и должна учитываться при лечении заболеваний указанных групп

В последнее десятилетие предпринимаются активные поиски путей лечения аллергических и аутоиммунных заболеваний с учетом патогенетической роли Т-хелперов и продуцируемых ими цитокинов В этом контексте разрабатываются методы антицитокиновой терапии, направленной на ослабление влияния цитокинов, вырабатываемых Т-хелперами, причастными к патогенезу заболевания С этой целью применяют моноклональные антитела к цитокинам, растворимые рецепторы цитокинов, рецепторные антагонисты Вполне успешным явилось применение подобных подходов для лечения воспалительных заболеваний (наиболее известные примеры - препараты инфлексимаб на основе моноклональных антител к TNFcc и этернацепт на основе растворимого рецептора TNFRII, используемые для лечения ревматоидного артрита и ряда других хронических воспалительных заболеваний) Применение антицитокиновой терапии, в частности в форме моноклональных антител к цитокинам, для лечения аутоиммунных и аллергических процессов находится на стадиях разработки и испытания Хотя клинические испытания препаратов на основе моноклональных антител к IL-5, IL-13 и IL-4 при аллергических

заболеваниях не дали ожидаемых результатов, поиски в этом направлении продолжаются

Ограниченный успех антицитокиновых антител при аллергии обусловлен отсутствием исчерпывающей информации о патогенетической роли соответствующих цитокинов, избыточностью цитокинового контроля иммунологических функций, а также недостатком сведений о свойствах, биораспределении и других характеристиках испытуемых препаратов В этом отношении полезным источником информации могут служить результаты изучения свойств и биологических эффектов, естественных и индуцированных аутоантител к цитокинам у человека и животных Однако в имеющихся публикациях на эту тему недостаточно сведений о биологической активности антицитокиновых аутоантител, в частности, данных об их возможном вмешательстве в цитокиновую сеть и влиянии на баланс Thl - и Th2-цитокинов

Из вышесказанного вытекает необходимость экспериментального анализа и моделирования влияния антицитокиновых факторов, в особенности антител (как эндогенных аутоантител, так и экзогенных моноклональных антител) на иммунную систему в условиях физиологии и патологии

Цель исследования, положенного в основу данной диссертации, состояла в экспериментальном изучении условий индукции эндогенных сайт-специфичных антител к ключевым цитокинам Thl- и ТЬ2-клеток и их влияния на различные формы иммунного ответа, в том числе аллергического Задачи исследования

1 Синтезировать пептидные фрагменты молекул IFN-y и IL-4, воспроизводящие их иммунодоминантные эпитопы

2 Индуцировать образование антител, реагирующих с целыми молекулами цитокинов, путем иммунизации мышей конъюгатами, содержащими иммунодоминантные пептиды

3. Определить влияние накопления антител к цитокинам в организме мышей на способность Т-лимфоцитов, активированных in vitro в присутствии и в отсутствие аутологичных сывороток, секретировать IFN-y и IL-4 4 Оценить влияние индуцированных антител к цитокинам на гуморальный и клеточный иммунный ответ на тимусзависимый антиген (эритроциты барана)

6 Изучить особенности аллергического ответа мышей на овальбумин, развивающегося у мышей с различным уровнем антител к IFN-y и IL-4

Научная новизна. Впервые на основе теоретического анализа рассчитана локализация иммунодоминантных эпитопов молекул IFN-y и IL-4 мыши Синтезирован один пептид, воспроизводящий иммунодоминантный эпитоп IFN-y, и два пептида, соответствующие иммунодоминантным эпитопам IL-4 мыши Отработаны условия иммунизации, позволившие индуцировать антитела к пептидному фрагменту 99-113 из IFN-y, и антитела к пептидному фрагменту 21-40 из IL-4 у большинства иммунизированных мышей Впервые, путем иммунизации пептидными фрагментами цитокинов, удалось получить сайт-специфческие антитела, реагирующие с целой молекулой

Установлено, что Т-лимфоциты селезенки мышей, содержащие циркулирующие антитела к ключевым дитокинам Thl- и ТЬ2-клеток, сами по себе не отличаются от Т-клеток интактных и контрольных (введение адъюванта) мышей по способности к синтезу IFN-y и IL-4 в условиях активации m vitro Введение в культуру аутологичных сывороток, содержащих антитела к цитокинам, приводит к ослаблению продукции того цитокина, против которого были направлены антитела, не влияя на образование оппозитного цитокина

Накопление в циркуляции мышей антител к IFN-y вызывает ослабление как гиперчувствительности замедленного типа (клеточный иммунный ответ), так и формирования антителообразующих клеток (гуморальный иммунный ответ) при иммунизации эритроцитами барана Иммунизация пептидом к IL-4 не влияет на клеточный, но снижает гуморальный иммунный ответ при условии индукции антител, реагирующих с целой молекулой IL-4

Получены данные, свидетельствующие в пользу ингибирующего действия накопления антител к IL-4 на уровень аллергического ответа (титр реагинов в реакции пассивной кожной анафилаксии)

Практическая значимость работы. Диссертационная работа основана на экспериментальных исследованиях и ориентирована на получение фундаментально-научной информации Однако ее результаты могут быть учтены при разработке антицитокиновой терапии с помощью индукции эндогенных антител к цитокинам Показана действенность расчетов иммунодоминантных эпитопов, а также частичная сохранность структуры большинства линейных эпитопов в составе целой молекулы цитокина, поскольку два из трех апробированных пептидов, воспроизводящих структуру таких эпитопов, индуцировали достаточно высокий уровень антител, взаимодействующих с целой молекулой цитокина Отработанные схемы иммунизации пептидами или их конъюгатами с белком носителем могут быть использованы при экспериментальном моделировании аналогичного варианта антицитокиновой терапии Данные о влиянии антител к IFN-y и IL-4 на гуморальный и клеточный иммунный ответ должны учитываться при разработке методов антицитокиновой терапии Результаты, свидетельствующие в пользу ингибирующего влияния эндогенных антител к IL-4 на развитие аллергии, после расширенного воспроизведения могут послужить обоснованием возможности применения метода индукции эндогенных антител к цитокинам для воздействия на аллергические процессы

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в центральных научных изданиях Материалы диссертации доложены на VIII конгрессе РААКИ (Москва, 2007)

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 140 источников (8 отечественных и 132 зарубежных) Работа содержит 18 таблиц и 15 рисунков

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали мышей самцов весом 18-20 г линий F1 (СВА*С57В1/6), BALB/c и DBA2b из питомника «Столбовая» РАМН При постановке пассивной кожной анафилаксии (ПКА) использовали нелинейных белых крыс, весом 180-230 г из питомника Российского Онкологического Научного Центра им H H Блохина РАМН

Расчет иммунодоминантных эпитопов цитокинов Для предсказания четвертичной структуры белков и расчета иммуногенных В-эпитопов использованы следующие программы Peptide Companion v 1 231, A3-D Viewer for National Center for Biotechnology Information Databases Version 3 0 и Swiss-Pdb Viewer v 3 7Ь2 Учитывались несколько параметров молекул гидрофобность, антигенность, доступность больших сфер, гидропатичность, а также локализация сгибов р-слоев Основанием для определения локализации эпитопа являлось совпадение на определенном участке полипептидной цепи всех этих свойств Расчет иммунодоминантных эпитопов осуществлялся к х н С M Андреевым

Синтез пептидов и их конъюгатов с гемоцианином Синтез пептидов и получение конъюгатов осуществлялся в «Лаборатории пептидных иммуногено к х н С M Андреевым и его сотрудниками в ГНЦ "Институт иммунологии ФМБА"

Синтез осуществляли твердофазным методом, используя Fmoc-химию Протоколы работ включали очистку растворителей (диметилформамид, серный эфир, N-метилпирролидон), ТСХ-анализ Fmoc-аминокислот, их очистку и расчет загрузок Fmoc-аминокислот и реагентов В синтезе использовали стартовый Fmoc-Asn(Trt)-nojHMep (смола Wang) фирмы NovaBiochem (0 44 ммоль/г) и производные аминокислот, гидроксильные и карбоксильные группы защищались трет-бутильной группой (t-Bu), амидные функции — Trt, аминогруппа лизина - Вое, гуанидиновая группа аргинина — Mtr

Стандартный цикл включал промывку ДМФ (диметилформамид), удаление Fmoc-защиты (20% пиперидин в ДМФ), предварительное активирование Fmoc-аминокислоты (DCC/HOBt) и конденсацию в среде ДМФ/Ъ[-метилпирролидон при 4-кратном избытке карбоксильного компонента (~1 5 часа) Контроль над полнотой реакции проводили нингидриновым методом и при необходимости реакцию конденсации повторяли (0 5 часа). Промежуточные пептиды анализировали на аминокислотном анализаторе (Biotronik L5000) Отщепление пептида от смолы проводили трифторуксусной кислотой в присутствии скавенджеров (тиоанизол, этандитиол, фенол) Пептиды высаждали сухим серным эфиром, и экстрагировали водной уксусной кислотой, экстракт лиофилизировали

Первичную очистку пептидов проводили вначале гель-хроматографией на смоле Toypearl HW40 (колонка 2 5 х 78 см, элюент - 0 1% раствор NH3, 60 мл/час, детектор LKB Uvicord SU, 254 нм) (см рис 3) Выделенные фракции подвергали повторной очистке на этой же колонке Сырую фракцию,

идентифицированную по данным аминокислотного анализа, очищали затем методом ВЭЖХ (Градентные насосы Gilson, контроль - Data system, детектор Spectroflow 757 (Kratos), 254 nm, интегратор Shimadzu C-R3A) с использованием колонки с Zorbax ODS 0 94 х 25 cm (DuPont Chromatography) Дальнейший анализ проводили аналитической ВЭЖХ (Vydec С18, 0 4x25 см) в тех же условиях, а также на аминокислотном анализаторе Biotronik

Синтез конъюгатов пептидов с гемоцианином улитки (KLH) проводили по следующей методике 6,9 мг пептида NC-721 растворяли в 1000 мкл 0 1 М фосфатного буфера, pH 9 0, и раствор смешивали с 800 мкл раствора 18 мг KLH (Sigma) в фосфатном буфере Смесь перемешивали 30 мин и охлаждали до 4°С Добавляли 1 5 мкл охлажденого до 4°С раствора глутарового альдегида (Serva) в 250 мкл ФБ и реакционную смесь перемешивали 1 час и оставляли на 22 часа при 4 °С Затем добавляли охлажденный свежеполученный раствор 10 мг NaBH.4 (Sigma) в 400 мкл дистиллированной воды и оставляли 1 час при комнатной температуре Все содержимое переносили в диализную трубку (Servapore, 16 mm) и проводили исчерпывающий диализ против дистиллированной воды Полученный диализат замораживали и лиофилизовывали Выход - 12,6 мг белого порошка Иммунизация мышей пептидными фрагментами Для иммунизации против IFN-y использовали коньюгат пептида IFN-y(99-l 13) с гемоцианином Иммунизацию мышей к IL-4 осуществляли первоначално пептидом IL-4(60-70), затем пептидом IL-4(21-40), как коньюгированным, так и без коньюгации с белком-носителем Доза иммуногенов формировалась из расчета 30 мкг пептида на мышь Пептиды или коныогаты разводили в физиологическом растворе и смешивали в соотношении 1 1 с адьювантом Фрейнда Для первой иммунизации использовался полный адьювант, для двух последующих -неполный Всего проводили 3 иммунизации, с интервалом в 1 месяц, после первой иммунизации и 14 дней, после второй и третьей У части мышей, иммунизированных IFN-7(99-H3), через 6 месяцев проводили реиммунизацию, путем однократного введения дозы пептида в неполном адьюванте Фрейнда Контрольную группу составляли мыши, которым по той же схеме вводили адьювант Фрейнда (полный адьювант при первой инъекции и неполный при последующих инъекциях)

Тестирования иммунных сывороток Наличие антител в сыворотках иммунизированных мышей оценивали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) Для проведения ферментативной реакции, в качестве вторых антител были взяты козьи IgG-антитела, меченные пероксидазой хрена, а субстратом служил о - фенилендиамина содержащий 0,006%-ную перекись водорода Развитие окраски регистрировали в лунках на ИФА-ридере с использованием светофильтра с длиной волны 492 нм

Определение внутриклеточных цитокинов Выработку цитокинов IFN-y и IL-4 определяли в спленоцитах мышей с помощью общеприянтого метода Клетки активировали комбинацией ФМА (10 нг/мл) и иономицина (2 мкМ) в присутствии брефелдина-А (Golgi-Plug) Через 18 ч клетки отмывали средой, фиксировали 4% раствором параформальдегида при 4°С, отмывали средой,

пермеабилизировали в 0,1% растворе сапонина при комнатной температуре и обрабатывали моноклональными антителами к IFN-y и IL-4, меченными соответственно флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ), а также мАТ к CD3, (для определения принадлежности клеток к Т-лимфоцитам), в течение 20 мин при 4° С Если была необходима вторая метка, добавляли ее по методике к клеткам После окрашивания клетки отмывали физиологическим забуференным раствором (ФЗР), содержащим 2% сапонин и 10% сыворотку (раствор готовился непосредственно перед использованием) Данные концентрации использовали как конечные при добавлении в лунки планшета Оценку экспрессии цитокинов проводили методом проточной цитофлуориметрии на лазерном цитометре "FACSCahbur" с помощью программы CELLQuest

Приготовление клеточных суспензий Мышей забивали методом цервикальной дислокации Лимфоциты выделяли из селезенок мышей в гомогенизаторе Поттера с коническим пестиком осторожным выдавливанием из стромы органа Полученные клетки отмывали 3 раза в среде 199, центрифугировали (200g, 7 мин), лизировали эритроциты в растворе BD Pharm Lyse, после чего отмывали в среде 199 Жизнеспособность клетки определению по отсутствию окрашиваемости 0,05% эозина Обычно жизнеспособность составляла 95-97%

Оценка гуморального иммунного ответа на эритроциты барана Гуморальный иммунный ответ оценивали путем определения числа антителообразующих клеток в селезенке мышей на 5 сутки после их иммунизации эритроцитами барана в дозе 5х108 клеток в реакции бляшкообразования в жидкой фазе по Jeme в модификации Cunningham

Оценка клеточного иммунного ответа на эритроциты барана Моделью клеточного иммунного ответа служила реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) Мышей иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами барана в дозе 5х108 клеток на мышь (0 5 мл) На 5—6 сут после иммунизации животным в правую заднюю ногу субплантарно в объеме 0,05 мл вводили 1х108 эритроцитов барана, а в левую заднюю ногу субплантарно - ФЗР Через 24 часа после разрешающей инъекции антигена измеряли ширину опытной и контрольной лапки штангенциркулем

Реакция пассивной кожной анафилаксии В качестве модели немедленной аллергии использовали реакцию пассивной кожной анафилаксии (РПКА) на крысах, кожа которых пассивно сенсибилизирована сывороткой крови активно сенсибилизированных мышей, содержащей аллергенспецифический IgE

Статистическая обработка данных Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью программы Excel фирмы Microsoft и Statistica 6 фирмы StatSoft

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Схема экспериментов.

Решение поставленных задач по изучению иммунологических последствий накопления антител к ключевым цитокинам ТЫ- и ТЬ2-клеток (№N-7 и 1Ь-4) осуществлялось по следующей схеме.

Иммунизация: 30 мкг пептода на мышь в полном (1), затем (2,3) - в неполном здъюванте Фрейнда:

Кровь на АТкЦК

1-я 1

мес

2-я 14 сут 3-я 14суг

Контроле

Введение физ.раствора; Введение адъювантов Фрейнда,

Выявление цитокин-

продуцирующих клеток в присутствии аутологичной сыворотки

Клеточный иммунный ответ (ГЗТ)

Тестирования в ЯЖД-

Рисунок 1. Схема экспериментов (последовательность выполнения основных блоков исследования).

Поскольку иммунизация мышей цитокинами привела бы к значительным изменениям в цитокиновой сети, в качестве иммуногена использовали иммуногенные фрагменты молекул цитокинов Для этого рассчитывали локализацию иммунодоминантных эпитопов, пользуясь известными алгоритмами После иммунизации пептидами или их конъюгатами с гемоцианином убеждались в ее успешности Для этого сыворотки иммунизированных мышей тестировали в ИФА не только с пептидами, но и с целыми молекулами цитокинов После этого определяли, как влияет накопление антител на способность Т-клеток в условиях активации секретировать соответствующие цитокины Наконец, оценивали влияние присутствия в организме эндогенных антител к ИТЧ-у и 1Ь-4 на способность мышей к клеточному и гуморальному иммунному ответу, в том числе аллергическому Эта программа реализовалась аналогично в случае индукции антител к №N-7 и ГЬ-4 Она отражена на рисунке 1

Индукция антител к №N-7 и изучение последствий их присутствия в циркуляции.

Расчет иммунодоминантных эпитопов и синтез пептидов На основе учета соответствия участков молекулы №N-7 критериям иммуногенности в качестве кандидатов на роль доминантных эпитопов было отобрано 4 пептида ГУМШАУОЫЮВМК (33-45, последовательность представлена в однобуквенном коде, нумерация - для процессированной молекулы), иЕУЬЫЖО (58-66), Ю?ЕУШРС>У(31*(^ШЧ (99-113) и ЬЬРЕЗЯЬШЖ (122-131), отвечающих требованиям иммунодоминантности и достаточно далеко отстоящих друг от друга пространственно на поверхности фолдированной молекулы

Из этих участков для синтеза был выбран наиболее протяженный фрагмент с последовательностью КРЕ\ТЧ№С>У0К(}АР1Ч, соответствующей последовательности 99-113 в процессированной молекуле №N-7 мыши Для повышения иммуногенности пептида его коньюгировали с высокомолекулярным белком, гемоцианином улитки

Оценка эффективности иммунизации пептидом 99-113 из Результаты трехкратной иммунизации мышей конъюгатом пептида 99-113 с гемоцианином представлены в таблице 1 В ней отражены данные о реактивности ^в-антител в сыворотке мышей через 8-10 суток после окончания курса иммунизации в отношении как синтетического пептида, так и цельной молекулы №N-7 Антитела, связывающие свободный пептид ШР-7(99-113), обнаружены у 11 из 12 иммунизированных мышей Связывающая активность антител была достаточно высока при разведении сыворотки 1 100 ОП составляла в среднем (для всей группы, а не только для мышей, продуцирующих антитела) 1,92+0,09 (фоновый уровень ИФА при введении БФР составлял 0,10-0,15)

Таблица 1. Характеристика антител в сыворотке мышей, иммунизированных пептидным фрагментом №N-7 (99-113).

Группа мышей Лиганд в ИФА ОП (1:100) Доля ответивших Средний титр

Опыт (п=12) ШЫ-у ( 99-113) 1,92+0,09* (0,34-2,52) 11/12* 3,50+0,44

П^-у 0,90+0,08* (0,26-1,79) 10/12 2,58+0,26

Контроль-1 (п=5) т-у (99-113) о,п±о,оз 0/5 -

ШИ-у 0,20+0,05 0/5 -

Контроль- 2 (п=5) у(99-113) 0,36+0,08 2/5 2

ШЫ-у 0,34+0,07 1/5 2

*р < 0,05 относительно обоих контролей.

Здесь и далее представлены значения М+т. Контроля: 1- введение ФЗР. Контроль-2 - введение адъювантов Фрейнда. Ответившими считались мыши, чья сыворотка в разведении 1:100 реагировала с лигандом с ОП > 0,25.

.....♦.......С пептидом

а С 1Р1М, мах А С 1РЫ, среди

К1 с^ ■ К2 с 1РЫ

1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200

Рисунок 2. Кривые титрования в ИФА антител к №N-7 в сыворотке мышей, иммунизированных пептидом 99-113 из №N-7 мыши. По оси абсцисс - разведение сыворотки; по оси ординат - ОП. Обозначение групп: «С пептидом» - реакция сывороток иммунизированных мышей с пептидом 99-113, усредненные данные; «С №14-, мах» и «С ШЫ-,

среди» - реакция с целой молекулой ШИ-у, соответственно данные для сыворотки с максимальной активностью и усредненные данные для всех сывороток иммунизированных мышей, «К1 с ШЫ-» и «К2 с №>1-» - реакция с №N-7 сывороток мышей из контрольных групп (К1-введение ФЗР, К2 - введение адъюванта Фрейнда), усредненные данные

При оценке связывающей способности сывороток по отношению к целой молекуле №N-7 мыши установлено, что она определяется у 10 из 12 иммунизированных мышей, хотя ОП при этом в 2 раза ниже, чем при оценке связывания с пептидом (0,90+0,08) Даже максимальное значение ОП для связывания с 1Ш-у не достигает средних значений ОП для связывания свободного пептида Активность сохраняется при разведении сывороток в 100-400 раз (средний титр 1 380)

В контроле с введением адъюванта Фрейнда у 1 из 5 мышей выявлены антитела, слабо взаимодействующие с ШЫ-у в разведении 1 100 Результаты титрования сывороток в иммуноферментной тест-системе на связывание пептида 1МР-у(99-113) и целой молекулы №N-7 отражены на рисунке 2

Сыворотку 8 из 12 иммунизированных мышей повторно тестировали на присутствие антител через 6 месяцев после завершения курса иммунизации без введения иммуногенов в этот период Установлено, что антитела, в том числе взаимодействующие с целой молекулой №N-7, продолжали выявляться, причем их активность в иммуноферментном тесте практически не изменилась: ОП составляла при связывании пептида 2,03+0,24, при связывании целой молекулы №N-7 - 0,85+0,12 Реиммунизация в этот срок неожиданно привела к более, чем двукратному снижению активности антител к молекуле ШЫ-у и пептиду (табл 2)

Таблица 2 Характеристика содержания антител к целой молекуле №N-7 в разные сроки, после иммунизации пептидом 99-113

Срок после иммунизаци ОП(1 100) Доля ответивших Средний титр

8-10 сут (п=8) 0,90+0,12 7/8 1 600

6 мес (п=5) 1,04+0,16 5/5 1 1750

6 мес + реиммунизация (п=8) 0,45+0,05 6/8 >1600

Таким образом, трехкратная иммунизация мышей иммунодоминантным пептидом из молекулы №N-7 мыши вызывала образование антител, реагирующих не только с пептидом, но и с целой молекулой цитокина у большинства мышей При этом связывающая способность антител с целой

молекулой №N-7 была в 2 раза слабее, чем их способность связывать пептид иммуноген. Индуцированные антитела длительно сохранялись в циркуляции.

Влияние иммунизации пептидом из ШИ-у на способность спленоцитов мышей синтезировать ШИ-у и II-4. У мышей из опытной и контрольной (введение адъюванта) групп цитофлуориметрически оценивали способность Т-клеток селезенки продуцировать ключевые цитокины ТЫ- и ТЬ2-клеток -ПТЧ-у и 1Ь-4 в ответ на стимуляцию ФМА и иономицином в условиях блокады секреторного процесса. Поскольку в организме иммунизированных мышей Т-клетки испытывают воздействие циркулирующих антител к №N-7, процент цитокин-продуцирующих клеток определялся также в присутствии аутологичной сыворотки.

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

-ь

гЬ -Т

1

щ

V

'й' "Л

Адъювант □ 1РЫд(99-113)

1РЫд+ 11.-4+ Без сыв-ки

1РЫд+ 11-4+ С аутол. сыв-кой

Рисунок 3. Влияние сыворотки мышей, иммунизированных конъюгатом, содержащим пептид из ШЧ-у, на выработку 1РК-у и 1Ь-4 активированными Т-клетками из их селезенки.

По оси ординат - процент клеток, продуцирующих цитокин. «Адъювант» - контрольные мыши, которым вводили полный, а затем неполный адъюванты Фрейнда; «№N-7(99-113)» - мыши, которых иммунизировали конъюгатом пептида 99-113 из 1РЫ-у мыши с гемоцианином в адъювантах Фрейнда. «Без сыв-ки» - сыворотка в культуры не добавлялась; «С аутол.сыв-кой» - в культуру вводилась аутологичная сыворотка (25%). Представлены средние от трех определений.

Сыворотки мышей опытной группы, испытанных в данной тест-системе, содержали антитела к IFN-y, соответствующие их среднему уровню по группе (ОП - около 1,0), в сыворотке мышей контрольной группы они отсутствовали Введение в культуры спленоцитов контрольной группы аутологичных сывороток не влияло на процент Т-клеток, образующих оба цитокина В культурах иммунизированных мышей ведение аутологичных сывороток не влияло на процент IL-4+ клеток, но более чем 10-кратно снижало процент Т-клеток, секретирующих IFN-y (рис 3)

Таким образом, иммунизация пептидным фрагментом IFN-y, приводила к образованию антител, реагирующих с целой молекулой этого цитокина Сама по себе иммунизация не влияла на способность Т-лимфоцитов, перенесенных в культуру, дифференцироваться в Thl- и ТЬ2-клетки Введение аутологичных сывороток в культуры спленоцитов контрольных мышей также не оказывала влияния Введение в культуру аутологичной сыворотки, содержащей антитела к IFN-y, резко подавляла дифференцировку этих клеток в IFN-у-продуценты, те в Thl-клетки, не влияя на IL-4-продуцирующую способность

Влияние иммунизации пептидом из IFN-y на иммунный ответ мышей Оценивали влияние накопления антител к IFN-y на гуморальный и клеточный иммунный ответ на один и тот же модельный антиген -эритроциты барана. Антителообразование оценивали по накоплению в селезенке клеток, секретирующих антитела (антителообразующих клеток -АОК) в ответ на внутрибрюшинное введение эритроцитов барана (табл 4)

Таблица 4. Численность антителообразующих клеток в селезенках мышей -гибридов Fl (CDA х C57BL/6), иммунизированных пептидным фрагментом к IFN-y

Группа мышей Число кариоцитов в селезенке, хЮ'6 Число АОК на селезенку, хЮ'3 Число АОК на 106 кариоцитов селезенки

Контроль-1, п=5 240+40 22,3 + 1,1 110,0 ± 14,5

Контроль-2, п=8 340+50 18,4 + 2,0 54,3 ± 5,0*

Опыт, п=8 480+50 7,8 +2,0*# 17,6 ±4,3*

Примечание р1 - относительно контроля 1(*р1 < 0,01), р2 -относительно контроля 2 (#р2 <0,01)

Таблица 5 Влияние индукции антител к ШИ-у у мышей гибридов (СВА х С57В176) на выраженность гиперчувствительности замедленного типа к

Группа мышей Ширина опытной лапки (мм) Ширина контрольной лапки (мм) Индекс ГЗТ

Контроль-1, п=5 5,1±0,3 р! <0,001 2,1±0,1 2,4

Контроль-2, п=8 4,2±0,3 р1 <0,001 р2 = 0,05 2,0±0,2 2,1

Опыт, п=8 2,9±0,2 р1 <0,05 р2 < 0,01 рЗ <0,01 2,0±0,2 1,45

Примечание р1 - относительно контрольной лапки, р2 - относительно контроля-1, рЗ - относительно контроля-2

Клеточный иммунный ответ оценивали по выраженности гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ определяли по утолщению лапки) при введении эритроцитов в стопу (табл 5) Учитывая, что преобладание ТЬ2-клеток в балансе ТЫЛЪ2 должно способствовать развитию аллергии, можно было предположить, что нейтрализация №N-7 индуцированными антителами может вызвать такое неблагоприятное последствие

Таблица 6 Влияние иммунизации доноров сыворотки пептидным фрагментом 1Р1Ч-у на образование реагиновых антител к овальбумину.

Показатель титров (М+ш) Степень усиления по сравнению с контролем

Сыворотка сенсибилизированных мышей с предварительным введением Опыт (№N-7 99113 с адъювантом), п=8 3,89+0,42* 9,5

контроль-2 (адъю ванта) п=5 4,47+0,40 10,9

Сыворотка интактных мышей отрицательный контроль, п=5 0,41+0,02 1,0

*р > 0,05. Примечание Приведенные цифры - двоичные логарифмы

В связи с этим мы сравнили в реакции пассивной кожной анафилаксии реагиновый ответ на овальбумин у мышей с эндогенными антителами к ПТЯ-7 и у контрольных животных Из данных таблицы 6 следует, что титры реагинов (по данным РПКА) в группе опыта была даже ниже, чем в группе контроль-2 (различия статистически не значимы) Таким образом, накопление в организме мышей антител к №N-7 не сопровождается усилением выработки реагиновых антител титров антител в РПКА

Таким образом, иммунизация мышей конъюгатом, содержащим пептидный фрагмент №N-7, приводящая к накоплению антител к этому цитокину, вызывает ослабление как гуморального, так и клеточного иммунного ответа на тимусзависимый корпускулярный антиген - эритроциты барана При этом не наблюдается усиления аллергического (реагинового) ответа на овальбумин

Индукция антител к 1Ь-4 и изучение последствий их присутствия в циркуляции.

Расчет иммунодоминантных эпитопов 1Ь-4 и синтез пептидов Как и в случае индукции антител к №N7 вначале проводили расчет иммунодоминантных эпитопов молекулы 1Ь-4, необходимый для синтеза пептидных фрагментов, которыми иммунизировали мышей Оценка таких параметров как гидропатичность, «доступность больших сфер», локализации сгибов [3-слоев, позволила локализовать три иммунодоминантных эпитопа 1Ь-4 21-40 (ТСЕСТРСТЕМБУРГЧУЬТАТК), 60-70 (ЬЮЮКТРСЬКК) и 90-105 (8818СТ]ШЕ8К8Т8ЬК) Было синтезировано два пептида -и 21-40

Оценка эффективности иммунизации пептидами из 1Ь-4 Иммунизация мышей-гибридов Р1 (СВА х С57ВЬ/6) конъюгатом пептида 60-70 с гемоцианином оказалась неэффективной Из 8 иммунизированных мышей лишь у двух определялись анти-пептидные антитела, взаимодействующие с пептидом в ИФА с уровнем ОП выше 0,25 (фоновый уровень - 0,10-0,15) Слабо выраженная избирательность связывания целой молекулы 1Ь-4 наблюдалась только в одном случае (табл 7)

Далее был синтезирован и апробирован пептид 21-40 Половину мышей иммунизировали конъюгатом пептида 21-40 с гемоцианином, другую -свободным пептидом В таблице 8 отражены данные о наличии ^й-антител к свободному пептиду и целой молекуле 1Ь-4 в сыворотке мышей через 8-10 сут после окончания курса иммунизации После введения одного адъюванта в одном случае обнаружено пограничное значение связывающей активности сыворотки по отношению к свободному пептиду (но не к целой молекуле 1Ь-4) При иммунизации конъюгатом пептида с гемоцианином, антитела с уровнем связывания пептида, превышающим заданный порог (ОП > 0,25), обнаружены у всех иммунизированных животных

Таблица 7 Характеристика антител в сыворотке мышей, иммунизированных пептидным фрагментом 1Ь-4

Иммуноген Группа мышей Лиганд в ИФА ОП (М±т) Доля ответивших

Контроль (адъговант), п=5 Пептид 60-70 0,29+0,05 1/5

Конъюгат 1Ь-4 (60-70) с гемоцианином 1Ь-4 0,15+0,03 0/5

Опыт (конъюгат), п=8 Пептид 60-70 0,29+0,06 2/8

1Ь-4 0,26+0,04 1/8

Таблица 8 Характеристика антител в сыворотке мышей, иммунизированных пептидным фрагментом 1Ь-4

Номер иммунизации Группа мышей Лиганд в ИФА ОП (М+ш) Доля ответивших

Контроль (адъювант), п=4 Пептид 21-40 0,23+0,02 1/4

1Ь-4 0,16+0,03 0/4

Первая Опыт (конъюгат), п_4 Пептид 21-40 0,84+0,14^ 5/4

1Ь-4 0,67+0,13 4/4

Опыт Пептид 21-40 0,62+0,13+ 4/4

(пептид), п=4 1Ь-4 0,37+0,06 4/4

Вторая Контроль (адъювант), п=8 Пептид 21-40 '0,16+0,03 1/8

1Ь-4 0,13+0,02 0/8

Опыт (конъюгат), п=8 Пептид 21-40 1,08+0,24 8/8

1Ь-4 0,68+0,15 7/8

Опыт (пептид), п=7 Пептид 0,53+0,16 3/7

21-40

IL-4 0,47+0,14 3/7

ОП при взаимодействии сывороток в разведении 1 100 с пептидом составлял в среднем 0,84, превышая уровень контроля в 3,7 раз (р < 0, 01) Для сравнения отметим, что после иммунизации мышей пептидным фрагментом из IFN-y ОП составлял 1,98, те был более чем в 2 раза выше Способность связывать целую молекулу IL-4, обнаружена у сывороток половины иммунизированных мышей. Она была также в 2 раза ниже, чем при индукции антител к IFN-7 При иммунизации свободным пептидом антитела к нему выявлены также у всех мышей, но уровень связывания был ниже ОП превышала контроль в 2,7 раза (р < 0,05) С целой молекулой IL-4 реагировало 2 сыворотки с более низким уровнем связывания, чем у мышей, иммунизированных конъюгатом

Цикл иммунизации повторили через 6 месяцев При иммунизации конъюгатом пептида с гемоцианином был выявлен более высокий уровень антителообразования, чем после первого курса иммунизации. Антитела, связывающие пептид, обнаружены у всех 8 иммунизированных мышей ОП при разведении 1 100 превосходил уровень контроля в 11 раз

Антитела к целой молекуле IL-4 присутствовали в сыворотке 6 из 8 мышей этой группы Их связывающая способность была почти в 2 раза выше, чем после первой иммунизации, но титр оставался невысоким. В группе мышей, повторно иммунизированных свободным пептидом, антитела, связывающие пептид и целую молекулу IL-4, выявлены лишь у 3 из 7 мышей Связывающая способность и титры антител у этих мышей были близки таковым в группе с иммунизацией конъюгатом Корреляционный анализ способности связывать пептид у антител, обнаруженных у индивидуальных мышей после 1-го и 2-го циклов иммунизации, выявил очень высокий уровень корреляции (r=0,94, р < 0,001) Корреляция связывающей способности антител в отношении пептида и целой молекулы IL-4 было не столь высока, но также значима (r=0,82, р < 0,01) Таким образом, пептидные фрагменты молекулы IL-4 даже при их конъюгации с белком-носителем обладают значительно меньшей иммуногенностью, чем иммунодоминантный пептид из IFN-y В свободной форме пептидные фрагменты к IL-4 еще менее иммуногены Соотношение способности секретировать анти-пептидные антитела сохраняется при повторных курсах иммунизации При этом связывающая способность антител в отношении пептида и IL-4 коррелирует

Влияние иммунизации пептидом из IL-4 на способность спленоцитов мышей синтезировать IFN-y и IL-4 У мышей опытной и контрольной (введение адъюванта) групп извлекали селезенку и цитофлуориметрически оценивали способность их Т-клеток продуцировать ключевые цитокины Thl-

и ТЬ2-клеток IFN-y и IL-4 в ответ на стимуляцию ФМА и иономицином в условиях блокады секреторного процесса in vitro. Результаты отражены на рисунке 4.

Влияние аутологичной сыворотки на выроботку IL-4 in vitro клетками селезенки мыши

20

Д

15

10

0

5

йШЖЖи

SJ контроль

□ пептид IL-4

без аутосыв-и

с аутосыв-ои

Рисунок 4. Влияние аутологичной сыворотки на выработку IL-4 in vitro клетками селезенки мыши, иммунизированной пептидным фрагментом IL-4(21-40). Данные одного цитофлуоримтерического определения.

Процент Т-клеток, продуцирующих IFN-y и IL-4, а также их соотношение было одинаковым у мышей, иммунизированных пептидом и получавших только адъювант. Поскольку в организме Т-клетки испытывают воздействие антител к IL-4, процент цитокин-продуцирующих клеток определялся также в присутствии 25% аутологичной сыворотки. Сыворотки мышей опытной группы содержали антитела к IL-4, соответствующие их среднему уровню по группе (ОП 0,5-0,7); в сыворотке мышей контрольной группы они отсутствовали. В отсутствие аутологичных сывороток различий в способности спленоцитов продуцировать IFNy и IL-4 не выявлено. Введение в культуры спленоцитов контрольной группы соответствующих сывороток не влияло на процент Т-клеток, образующих оба цитокина. Введение аутологичных сывороток в культуры спленоцитов мышей опытной группы подавляло выработку IL-4, не влияя на образовнаие IFNy. Таким образом, эффективная иммунизация пептидом из IL-4, сама по себе не влияет на способность Т-клеток вырабатывать цитокины, однако образующиеся при этом антитела к IL-4 подавляют синтез IL-4 in vitro, не влияя на число Т-клеток, продуцирующих IFN-y.

Влияние иммунизации пептидом из IL-4 на иммунный ответ мышей. Влияние антител к IL-4, индуцированных иммунизацией пептидными фрагментами этого цитокина, на гуморальный и клеточный иммунный ответ

оценивали в реакциях бляшкообразования и ГЗТ с использованием в качестве антигена эритроцитов барана Оценку осуществляли после первого цикла иммунизации Какого-либо влияния на выраженность ГЗТ не было обнаружено ни после иммунизации пептидом 60-70, ни после более эффективной иммунизации пептидом 21-40

При оценке гуморального иммунного ответа у мышей установлено, что введение полного адъюванта Фрейнда (в процессе иммунизации пептидами, а не эритроцитами барана) само по себе снижало число АОК в селезенке (при пересчете на 1 млн кариоцитов снижение было значимым) Иммунизация пептидами 60-70 и 21-40 не привела к значимым изменениям ответа по сравнению с адъювантным контролем, хотя и вызывала значимое снижение числа АОК по сравнению с контролем-1 (введение физиологического раствора)

Таблица 9 Влияние иммунизации пептидным фрагментом 1Ь-4 на выраженность антителообразования при иммунизации мышей эритроцитами барана в зависимости от присутствия антител к 1Ь-4__

Группа Число кариоцитов в селезенке, х 106 Число АОК на селезенку, хЮ"3 Число АОК на 106 кариоцитов селезенки

Контроль-1 Ведение физ раствора), п=5 240+40 22,3 +.1,1 И 0,0 ±14,5

Контроль-2 Ведение адъюванта Фрейнда), п=8 340+50 18,4 + 2,0 54,3 ± 5,0 р1 <0,05

Опыт Имунизация пептидом (2140) из 1Ь-4), п=8 350+30 14,2 + 2,3 р1 <0,05 41,8 ±3,4 р1 < 0,05

Опыт Безуспешная иммунизация 1Ь-4(21-40), п=4 320+25 17,6+1,8 р1 < 0,05 56,4+6,2 р1 < 0,05

Опыт Успешная иммунизация 1Ь-4(21-40), п=4 380+31 9,4+2,1 р! <0,01 р2 < 0,05 рЗ < 0,05 24,5+5,7 р1 <0,01 р2 < 0,05 рЗ <0,01

Примечание р1 - относительно контроля-1, р2 - относительно контроля-2, рЗ - относительно опыта с безуспешной иммунизацией

Однако когда уровень гуморального иммунного ответа оценивали отдельно у мышей, ответивших и не ответивших на иммунизацию пептидом образованием антител к 1Ь-4, было обнаружен более значительное влияние предшествующей иммунизации против 1Ь-4 на гуморальный иммунный ответ У тех мышей, у которых иммунизация вызывала образование антител, реагирующих с целой молекулой 1Ь-4, число АОК достоверно снижалось как по сравнению с адъювантным контролем (снижение общего числа АОК в селезенке в 2 раза, числа АОК на 1 млн кариоцитов - в 2,2 раза, р < 0,05), так и по сравнению с подгруппой опыта с неэффективной иммунизаций (снижение числа АОК на селезенку и на 1 млн кариоцитов соответственно в 1,9 и 2,3 раза, р < 0,05 и р < 0,01)

Таким образом, иммунизация пептидом из 1Ь-4 подавляет гуморальный иммунный ответ при условии индукции антител к целой молекуле 1Ь-4 Эффект иммунизации в зависимости от ее эффективности отражен в таблице 9

Влияние иммунизации пептидом га 11.-4 на аллергический ответ мышей При сопоставлении титров реагиновых антител к овальбумину, определявшихся в реакции пассивной кожной анафилаксии (РПКА), со связывающей способностью тех же сывороток по отношению к 1Ь-4 во всех группе иммунизированных мышей не было выявлено различий и корреляционной взаимосвязи_

БсайегрЫ (8(а1з 10у*10с) Уаг2 = 4,742-2,4277*х

Анти-1Ь-4, ОД

Рисунок 5 Обратная корреляционная зависимость содержания антител к пептиду из ИЛ-4 в сыворотке мышей с высоким уровнем этих антител и их способности вырабатывать реагины при иммунизации овальбумином

По оси абсцисс - оптическая плотность по данным иммуноферментного анализа на связывание с пептидом из IL-4 (разведение сывороток 1 100, в качестве антигена использован пептид 21-40), по оси ординат - титр реагинов в РПКА Линия регрессии описываются уравнением у = 4,742 - 2,427 х, где х - значения оптической плотности в ИФА с пептидом из IL-4, у - титры антител антител к овальбумину в РПКА

Однако анализ коррелятивных взаимосвязей между реагиновым ответом (титром антител в РПКА) и связывающей активностью антител к IL-4 в подгруппе мышей с выраженным ответом на пептид из IL-4 (ОП > 1,0 при разведении сывороток 1 100) позволил выявить высоко достоверную отрицательную корреляцию (коэффицент корреляции по Спирману г= -0,90, р < 0 05) между титрами антител к IL-4 и реагиновых антител к овальбумину На рисунке 5 представлен график корреляционной зависимости этих показателей

ВЫВОДЫ

1 Теоретический расчет с использованием известных алгоритмов, основанных на оценке физико-химических параметров макромолекул, позволяет вычленить в молекуле IFN-y мыши четыре, а в молекуле IL-4 - три потенциально иммунодоминантных В-эпитопа

2 Иммунизация мышей пептидными фрагментами, соответствующими иммунодоминантным эпитопами молекул мышиных цитокинов - IFN-y (позиции 99-113) и IL-4 (21-40), конъюгированных с гемоцианином, индуцирует образование IgG-антител, взаимодействующих не только с пептидом-иммуногеном, но и с целой молекулой соответствующего цитокина Активность антител выявляется в сыворотках мышей в течение нескольких месяцев после завершения иммунизации

3 Накопление в сыворотке крови мышей антител к IFN-y и IL-4 не влияет на способность их Т-лимфоцитов при стимуляции т vitro вырабатывать указанные цитокины Введение в культуру аутологичных сывороток, содержащих антитела к тому или другому цитокину, подавляет его синтез Т-клетками, не влияя на образование оппозитного цитокина

4 Следствием иммунизации против IFN-y является подавление как гуморального, так и клеточного иммунного ответа на тимусзависимый антиген (эритроциты барана) Иммунизация против IL-4 подавляет гуморальный, но не клеточный иммунный ответ

5 При высоком уровне индуцированных антител к IL-4 в сыворотке мышей, реагиновый ответ на сенсибилизацию овальбумином, оценивавшийся в реакции пассивной кожной анафилаксии, снижается пропорционально активности антител к IL-4

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Соискатель имеет 5 печатные работы Основные результаты диссертационной работы отражены в следующих

публикациях

1 Шарова Н И, Литвина М М, Шевелев С В , Дзуцев А X, Ярилин А А Выработка интерферона у и интерлейкина 4 тимоцитами человека т \itro. Цитокины и воспаление 2002 №4 С. 10-15.

2 Шарова Н И, Литвина М М, Шевелев С В , Сухих С Т, Ярилин А А. Активация эпителиальных клеток тимуса в совместной культуре с тимоцитами Иммунология 2005, т 26, №3, с 138-145

3 Шевелев С В , Харченко Т Ю , Митин А Н, Андреев С М, Никонова М Ф , Ярилин А А Индукция антител к 1РМ-у мыши путем иммунизации пептидом, воспроизводящим иммунодоминантный эпитоп 1РМ-у Влияние на дифференцировку ТЬ1-и ТЬ2-клеток Иммунология 2006 Т 27 № 5 С 288-292

4. Шевелев С В , Харченко Т Ю , Митин А Н, Ярилин А А Влияние эндогенных (индуцированных) антител к ШМ-у на различные проявления иммунного ответа мышей Иммунология 2007.Т. 27 №3 С 138-142

5 Шевелев С В , Митин А Н, Андреев С М, Никонова М Ф, Бабахин А А, Ярилин А А Последствия индукции у мышей антител к интерлейкину-4 (ИЛ-4) путем иммунизации иммунодоминантным пептидным фрагментом ИЛ-4 Иммунология 2007 Т 28 №4 С. 217223

Подписано в печать 0з од Формат 60x84/16 Бумага офсетная

_ Тираж 100 экз Заказ № 271_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш, 24