Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Комплексная оценка процессов формирования и поддержания иммунологической памяти на примере вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита

На правах рукописи

ТОПТЫГИНА АННА ПАВЛОВНА

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ПРОЦЕССОВ ФОРМИРОВАНИЯ И ПОДДЕРЖАНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ НА ПРИМЕРЕ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ КОРИ, КРАСНУХИ И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО

ПАРОТИТА.

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА-2015

1 3 Ш 2015

005568639

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор Алешкин Владимир Андрианович

Официальные оппоненты:

Пинегин Борис Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России. Тотолян Aper Артемович - член-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор, зам. директора по научной работе ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Продеус Андрей Петрович - доктор медицинских наук, профессор, заместитель главного врача по научно-практической работе ГБУЗ «ДГКБ № 9 им. Г.Н.Сперанского», заведующий кафедрой факультетской педиатрии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.

Ведущая организация: ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

Ярилин Александр Александрович

Защита диссертации состоится « 18 » июня 2015 г. в ¿0.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.02 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова,10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10 и на сайте: ЬйрДуту^аЬпсЬ.ги . Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук 06--^- Л.И.Новикова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Инфекционные заболевания остаются актуальной проблемой XXI века, и для многих вирусных заболеваний вакцинация является основным средством борьбы, позволяющим не только контролировать эти инфекции, но и ставить вопрос об их глобальной эрадикации. Это решение, в полной мере, относится к таким серьезным вирусным инфекциям как корь, краснуха и эпидемический паротит.

Корь - тяжелое инфекционное заболевание: контагиозность кори 9598%, и в допрививочную эру, по данным ВОЗ, в мире от ее последствий ежегодно умирало 2,6 млн. человек. Эпидемический паротит не отличается особой тяжестью течения или высокой смертностью, тем не менее, имея троп-ность к железистой ткани, вирус эпидемического паротита может поражать не только слюнные железы, но также вызывать панкреатит или орхит. Последний приводит к 100%-ному мужскому бесплодию и не поддается никакому лечению [Божедомова В.А. с соавт., 2013]. Краснуха является более лёгкой и менее контагиозной вирусной инфекцией, чем корь, тем не менее, имеет большое значение для общественного здравоохранения из-за тератогенного эффекта врождённой краснушной инфекции, который может приводить к прерыванию беременности или гибели плода, а также к рождению детей с синдромом врождённой краснухи (СВК). По данным J1.J1. Нисевич, краснуха является причиной врожденной патологии в 27-35% случаев [Нисевич Л.Л. с соавт., 1997]. Для профилактики этих инфекций в России были зарегистрированы отечественные моновакцины против кори и эпидемического паротита, а также отечественная дивакцина. Кроме того, с 2000 года зарегистрированы импортные тривакцины MMR (Мерк Шарп и Доум, США) и Приорикс (ГлаксоСмитКляйн, Бельгия) для профилактики кори, краснухи и эпидемического паротита.

ВОЗ поставила цель ликвидации кори в XXI веке к 2010 г. [Centers for Disease Control and Prevention., 2009]. В рамках общей стратегии, декларированной ВОЗ и направленной на полную ликвидацию кори в XXI веке, предполагается создать иммунную прослойку, достаточную для прерывания цепочек передачи инфекции. А в 2004 году было предложено также элиминировать краснуху к 2010 году. С учетом того, что краснуха является менее контагиозным заболеванием, чем корь, и большинство стран используют комбинированную вакцину против кори и краснухи, элиминация краснухи может быть достигнута в ходе работы по элиминации кори. Такой подход был одобрен на 55-ой сессии Регионального комитета ВОЗ как часть резолюции по укреплению национальных программ иммунизации, включающую ликвидацию кори, краснухи и профилактику врожденной краснушной инфекции. Западно-Тихоокеанский регион ВОЗ объявил о достижении уровня заболеваемости краснухой менее 10 на I млн. населения и СВК - менее 10 на 100 000 живых новорожденных к 2015 г. В остальных трёх регионах ВОЗ

идёт речь только о снижении смертности от краснухи и СВК [Strebel P.M. et al„ 2011].

Введение массовой вакцинации против кори дало первые обнадеживающие результаты. К 2000 г. смертность от кори снизилась до 733 тыс. человек, а к 2008 - до 164 тыс. человек. Предполагалось, что к 2015 г. цель будет достигнута [Van den Ent М. et а!., 2011]. Однако в 2008 г из многих стран стали поступать сообщения о вспышках кори. Даже в странах с высоким охватом прививками, таких как США [Sugerman D. Е. et al,. 2010], Австрия [Kasper S. et al,. 2009], Франция [Parent du Chätelet I. et al., 2009], Англия [Eaton L„ 2009], Германия [Bätzing-Feigenbaum J. et al., 2010], Израиль [Anis E. et al., 2009], Россия [Бичурина M.A. с соавт., 2013; Тихонова Н.Т. с соавт., 2013; Каира А.Н. с соавт., 2014] и других, регистрировались вспышки кори. Анализ прививочного статуса заболевших лиц показал, что одну часть составляют не привитые по разным причинам (медицинские отводы, религиозные или иные соображения родителей). Вторую часть составляют привитые лица. В эту группу следует отнести прививки вакциной с нарушением правил транспортировки и хранения препарата, а также привитых только один раз (вместо положенного по графику в 1 год и в 6 лет) [Сергеева Н.В. с соавт., 2013]. Однако существует еше две группы восприимчивых лиц - группа первичных вакцинальных неудач, когда, несмотря на правильное и своевременное проведение прививки, у человека не формируется защитного титра антител, и группа вторичных вакцинальных неудач, когда сформированный после прививки иммунитет быстро утрачивается и такой привитый человек вновь оказывается восприимчивым к кори. Количество первичных и вторичных вакцинальных неудач составляет 5-10% от общего количества привитых для каждой группы [Цвиркун О.В. с соавт., 2012; Orenstein W.A. et al., 2000]. Более того, после перенесенной инфекции формируется пожизненный иммунитет, а поствакцинальный иммунитет постепенно истощается и даже правильно привитой, хорошо ответивший на прививку, без каких-либо генетических недостатков человек со временем может утерять защитные уровни антител [Голева О.В. с соавт., 2012]. Целью любой вакцинации является формирование и длительное поддержание иммунологической памяти против инфекционных антигенов. Оценка формирования иммунного ответа у инфекционных больных сильно затруднена: это люди разного возраста, имеют различный преморбидный фон, нет возможности оценить состояние иммунной системы у конкретного больного до инфекции, в большинстве случаев неизвестно точно, когда человек был инфицирован и никогда неизвестно, каким количеством вирусных частиц. Наблюдение за развитием адаптивного иммунного ответа и формированием иммунологической памяти у привитых и ревакци-нированных лишено многих перечисленных недостатков. Благодаря этому мы можем расширить и детализировать фундаментальные представления о функциях иммунной системы, ее регуляции и поддержании иммунной защиты в течение продолжительного времени.

Таким образом, актуальной современной проблемой медицины является проведение научных исследований по комплексному изучению механиз-

мов формирования и поддержания иммунологической памяти в ответ на живую вирусную прививку и разработка на основе полученных знаний методов оценки иммунологической памяти и прогнозирования вакцинальных неудач.

Степень разработанности темы исследования

Хорошо известно, что коревая инфекция сопровождается иммуносупрес-сией, которая проявляется в виде лейко- и лимфопении, вызванной активацией механизмов клеточного апоптоза. При этом имеет место снижение численности основных субпопуляций лимфоцитов и нарушение их соотношений [Тихонова Н.Т., 1982; Okada H. et al., 2000; Ryon J.J. et al., 2002]. Кроме того, можно выявить такие функциональные дефекты иммунокомпетентных клеток как снижение индекса пролиферации, нарушение активности натуральных киллеров, дисбаланс синтеза основных цитокинов [Griffin D.E. et al., 1990]. Что касается воздействия на иммунную систему живых вирусных вакцин, то сформировать единое мнение по этому вопросу до сих пор не удалось. Некоторые авторы не обнаруживали ни лимфопении, ни существенных отклонений в иммунном статусе [Okada H. et al., 2001], тогда как, по данным других, имела место непродолжительная (2-4 недели) иммуносупрессия, выражавшаяся, в основном, в виде снижения количества лимфоцитов и торможения их пролиферативной активности [Буковская С.Н., 1989; Николаенко В.Н., 1990; Smedman L. et al., 1994].

Изучению механизмов формирования поствакцинального иммунитета против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита посвящено огромное количество работ, однако, целый ряд важных вопросов остается недостаточно исследованным. В частности, это касается проблемы распределения специфических IgG антител по субклассам. В литературе имеются лишь отдельные сообщения об исследовании спектра субклассов специфических противовирусных IgG (Isa М.В. et al., 2002; El Mubarak H.S et al., 2004). Другой серьезной проблемой является исследование специфического клеточного иммунитета. За рубежом этой теме уделяют огромное внимание практически все ведущие группы, занимающиеся проблемами вакцинации против кори и краснухи [Ovsyannikova I.G. et al.; 2003, Rager-Zisman В. et al., 2003]. Однако не существует общепринятого метода, способного однозначно оценить качество специфического клеточного иммунитета. Так, исследуют специфическую и митоген-индуцрованную пролиферацию лимфоцитов периферической крови [Bautista-Lopez N. et al., 2000], но этот метод связан, с одной стороны, с использованием радиоактивного Н1 тимидина, а, с другой стороны, очень зависит от выбранного антигена, так как известно, что, например, вирус кори способен размножаться в лимфоцитах человека и обладает выраженным цитопатическим действием. Используют также метод оценки секреторной активности клеток путем определения иммуноферментных пятен -EL1SPOT [Scheibenbogen С. et al., 2000]. Крупные лаборатории и зарубежные фирмы, разрабатывающие вакцины, пользуются этим методом. В научных целях применяют определение антигенспецифических Т-лимфоцитов с ис-пользовнаием МНС-пептидных тетрамеров [Altman J.D. et al., 1996 ] - недо-

статком метода является HLA-рестрикция, то есть необходимость совпадения HLA тетрамера и пациента, ввиду высокой степени полиморфизма системы HLA это весьма затруднительно.

Большое внимание уделяется изменениям цитокинового профиля в ответ на вакцинацию [Ward B.J. et al., 1993; Ovsyannikova I.G. et al., 2003]. Тем не менее, из-за различий в методах оценки, спектре изучаемых цитокинов, а также дизайна самих исследований, до сих пор нет четкого мнения даже о том, какой именно тип иммунного ответа (Thl или Th2) индуцирует вакцинация против кори или краснухи. Одни считают, что это Thl-ответ, с преимуществом клеточного компонента иммунного ответа, другие полагают, что лидирует ТИ2-тип, преимущественно гуморальный [Ward B.J. et al., 1993; Ovsyannikova I.G. et al., 2003]. Имеются работы, доказывающие, что по мере формирования иммунного ответа происходит переключение с Thl на Th2 [Dhirnan N. et al., 2005]. Все больше исследователей не ограничиваются традиционными IFN-y и IL-4 и включают в свои исследования некоторые другие цитокины, такие как IL-12 и 1L-15 [Gans H.A. et al., 2008], ИЛ-10 [Yu X.L.et al., 2008], и даже используют мультипараметрические методы исследования [Munier С.M. et al., 2009]. Однако количество одновременно исследованных параметров было невелико, что позволяет оценить каждый раз лишь одну из сторон иммунного ответа. Кроме того, однократные исследования пациентов не позволяют увидеть систему цитокинов в динамике.

Особый интерес вызывает исследование клеточных рецепторов, используемых вирусами для взаимодействия с клеткой. В последнее десятилетие было показано, что существуют, по крайней мере, два клеточных белка, осуществляющих функцию рецептора для вируса кори - это CD46 и CD 150 [Schneider U. et al., 2002]. Особенно интересны взаимодействия вируса кори с CD150, поскольку последний является необходимой молекулой для запуска иммунного ответа [Wang N. et al., 2004] и вполне возможно, что именно это взаимодействие опосредует нарушения иммунного ответа при кори.

Россия участвует в провозглашенной ВОЗ программе по элиминации кори и искоренению синдрома врожденной краснухи. Традиционно эффективность прививки оценивается по выработке специфических антител, однако известно, что при вирусных заболеваниях высока значимость специфического клеточного иммунитета. Кроме того, отмечено, что далеко не у всех вакцинированных удается обнаружить специфические антитела. При этом часть таких серонегативных привитых лиц заболевает при контакте с источником инфекции, тогда как другие, также серонегативные, не болеют. Очевидно, существует необходимость оценки специфического клеточного иммунитета, однако существующие методы либо недостаточно специфичны, либо слишком трудоемки. Также весьма важной проблемой является прогнозирование первичных и вторичных вакцинальных неудач, однако до сих пор эти случаи выявляются при скрининговых исследованиях уже после прививки, что не позволяет корректировать процесс формирования поствакцинального иммунного ответа.

Цель работы

Совершенствование подходов к повышению эффективности вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита на основании изучения клеточных и молекулярных механизмов формирования и поддержания иммунологической памяти на вирусные антигены с использованием стандартных и оригинальных методических подходов.

Задачи исследования

1. Провести оценку состояния иммунитета детей до вакцинации по основным показателям клеточного и гуморального иммунитета, в том числе по продукции основных цитокинов, характеризующих эффективность работы иммунной системы.

2. Оценить общие гуморальные и клеточные реакции иммунной системы в ответ на введение живой вирусной вакцины Приорикс.

3. Изучить особенности саморегуляции иммунной системы при формировании и поддержании специфического иммунного ответа на вакцину Приорикс.

4. Провести оценку динамики формирования и созревания специфического гуморального иммунного ответа после прививки против кори, краснухи и эпидемического паротита.

5. Исследовать формирование и поддержание специфического клеточного иммунного ответа на вакцинацию Приорикс.

6. Оценить возможность использования иммунокорректора полиоксидо-ния в качестве адъюванта при прививке Приорикс у часто болеющих детей.

7. Разработать математическую модель, позволяющую оценить формирование иммунологической памяти и прогнозировать ее дальнейшую эффективность.

Научная новизна

Установлено, что снижение количества основных субпопуляций лимфоцитов после вакцинации Приорикс связано с перераспределением лимфоцитов из крови в лимфоидные органы, вызванным начальными процессами ответа иммунной системы на введенную вакцину. Показано, что после вакцинации повышается экспрессия молекулы CDI50 (SLAM), являющейся рецептором для вируса кори, как на Т-лимфоцитах, так и, в большей степени, на В-клетках.

Используя для оценки направленности дифференцировки Т-хелперов вторую производную от функции изменения соотношения lFN-y/IL-4 по времени, выявлено, что после прививки Приорикс половина детей реагировала преимущественно по типу ТЫ, тогда как другая половина - по типу ТИ2. У части детей, реагировавших по типу Th2, и у детей с атопическим дерматитом отмечалось транзиторное повышение общих IgE на 7-й день после прививки, самопроизвольно возвращавшееся к исходному уровню через 4 недели и не сопровождавшееся появлением или обострением клинических проявле-

ний аллергии и повышением других важных для аллергии цитокинов, например IL-5. Обнаружено, что наблюдающееся после прививки Приорикс тран-зиторное повышение уровня провоспалительной субпопуляции Thl7 и ее основного цитокина IL-17A в крови компенсируется последующим повышением количества Т-регуляторных клеток и их противовоспалительными цито-кинами IL-10 и TGF-p, что приводит к нормализации провоспалительных параметров.

Впервые установлено, что спектр субклассов специфических IgG к антигенам вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита зависит от вида антигена и срока, прошедшего с момента прививки. По мере формирования иммунологической памяти меняется спектр субклассов специфических IgG. Ранние специфические антитела принадлежат преимущественно к субклассу IgG3, а клетки памяти продуцируют, в основном, антитела IgGI. При формировании специфического гуморального иммунного ответа на вирус кори выявлена задержка процесса переключения с IgG3- на IgGl-субкласс специфичных к нему антител.

Впервые доказано, что реакция специфически индуцированной деграну-ляции цитотоксических CD8hl лимфоцитов может быть использована для оценки активности эффекторных Т-клеток памяти на антигены вирусов кори и краснухи. На основе этой реакции разработан метод оценки специфического клеточного иммунного ответа на антигены вирусов кори и краснухи, защищенный патентом «Способ определения специфического клеточного иммунного ответа к антигенам вируса кори и краснухи» (Патент на изобретение № 2464571). Показано, что цитотоксические клетки памяти, специфичные к вирусам кори и краснухи, способны сохраняться и отвечать на антиген спустя многие годы после прививки или перенесенного заболевания.

Выявлены обратные (отрицательные) корреляции между показателями специфического гуморального и клеточного иммунного ответа на антигены вирусов кори и краснухи у привитых вакциной Приорикс, что свидетельствует о разнонаправленных процессах формирования гуморального и клеточного звеньев иммунитета на соответствующие антигены.

Показана возрастная динамика нарастания количества центральных и эффекторных Т- и В-клеток памяти, а также их увеличение в ответ на прививку Приорикс. Обнаружено, что количество Т-фолликулярных хелперов транзиторно повышается после прививки, но общее их количество практически не подвержено возрастным изменениям. Выявлено, что по мере взросления и иммунологического созревания организма ответ на первичную вакцинацию имеет некоторые особенности, например, в спектре субклассов IgG против кори у детей 6-7 лет появляются специфические 1§С2-антитела, чего не наблюдается у детей в возрасте 1-2 лет. Первичный и вторичный иммунный ответ на прививку Приорикс различается по спектру субклассов специфических антител, активированных клеток и экспрессии поверхностных маркеров, вовлеченных в иммунный ответ, скорости и величине изменений различных параметров иммунного ответа

Впервые с помощью методов математического моделирования определены информативные показатели иммунного статуса, оказывающие значимое влияние на высоту специфического гуморального ответа на антигены вакцины Приорикс и на продолжительность поддержания защитных уровней соответствующих антител, позволяющие предсказать исход вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита у детей через 4 недели и I год после прививки.

Впервые, на основании разработанных математических моделей, предложен конструктивный алгоритм, позволяющий, используя значения определенных показателей иммунного статуса до вакцинации, прогнозировать формирование первичных и вторичных вакцинальных неудач через 1 месяц и через 1 год после вакцинации у детей, привитых против кори, краснухи и эпидемического паротита.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы заключается в получении новых данных, вносящих вклад в понимание механизмов формирования и поддержания иммунологической памяти, в частности, на вирусные антигены. Результаты проведенного исследования позволяют оценить вклад как гуморального, так и клеточного иммунитета в специфический противовирусный иммунный ответ. Обнаруженные закономерности, в свою очередь, углубляют научные представления о формировании, созревании и функционировании иммунного ответа в целом. В результате проведенной работы были получены новые сведения, обеспечивающие возможность оценки специфического клеточного иммунитета на современном клеточно-молекулярном уровне, что позволяет осуществлять контроль за эффективностью прививок против кори, краснухи и эпидемического паротита, как у здоровых, так и у детей группы риска.

Практическая значимость работы состоит в следующем.

Предложен способ оценки субклассов специфических IgG к антигенам вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита, рассчитаны значения порогового критерия cut off, позволяющие с вероятностью более 95% различить первичный и вторичный иммунный ответ на эти вирусы, при формировании поствакцинального и постинфекционного иммунитета.

Показано, что реакцию специфически индуцированного пролифератив-ного ответа мононуклеаров периферической крови на антигены вирусов кори и краснухи можно использовать для оценки Т-клеточной памяти. Рассчитаны значения порогового критерия cut off для оценки специфической пролиферации с помощью окрашивания CFSE, позволяющие с вероятностью более 99% выявить наличие специфически индуцированного пролиферативного ответа.

Разработан метод оценки специфического клеточного иммунного ответа цитотоксических лимфоцитов на антигены вирусов кори и краснухи на основе реакции специфически индуцированной дегрануляции цитотоксических CD8hl лимфоцитов, защищенный патентом № 2464571. Рассчитаны значения порогового критерия cut off, позволяющие с вероятностью более 98% вы-

явить наличие специфически индуцированной дегрануляции CD8hl лимфоцитов.

Показано, что индукция продукции цитокинов антигенами вирусов кори и краснухи может быть использована для оценки специфического Т-клеточного ответа, в особенности Т-хелперов памяти. Выявлены наиболее информативные цитокины для оценки первичного (IL-4, TNF-a и IFN-y) и вторичного (IL-1, IL-2, IL-4,1L-I0, TNF-a и IFN-y) иммунного ответа.

Рекомендовано использовать метод расчета второй производной для оценки динамически изменяющихся показателей, например для оценки направления и интенсивности дифференцировки Т-хелперов после вакцинации.

На основании математического моделирования, выделены маркеры-предикторы и разработан алгоритм, позволяющий по результатам иммунологических анализов периферической крови предсказать эффективность прививки через месяц и вероятность сохранения (или утери) защитных уровней антител в крови через год после нее. Применение предложенного алгоритма позволяет еще до вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита выявить когорту лиц, с угрозой развития первичных и вторичных вакцинальных неудач.

Рекомендовано однократное введение полиоксидония в дозе 3 мг одновременно с вакциной Приорикс часто болеющим детям и детям с исходно сниженными показателями иммунного статуса, входящим, по результатам прогнозирования, в группу риска по формированию первичных или вторичных вакцинальных неудач, для усиления синтеза специфических антител.

Методология и методы исследования.

Предметом настоящего исследования являлась иммунологическая память, механизмы ее формирования и поддержания в ответ на антигены вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита. Объектами исследования были дети, подлежащие вакцинации или ревакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита и получавшие прививку Приорикс и пробы крови, полученные от этих детей. Научная работа была организована и проведена согласно с «Российскими и международными требованиями по надлежащей клинической практике» - ГОСТ Р 52379-2005, GOOD CLINICAL PRACTICE (GCP), одобренными Российской академией медицинских наук.

Дизайн исследования: клиническое открытое сравнительное проспективное контролируемое рандомизированное групповое исследование. Работа была одобрена Комитетом по биомедицинской этике при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (протокол заседания от 05.07.2002), родители подписывали информированное согласие на участие детей в программе исследований.

Критериями включения в исследование были: возраст от 1 до 8 лет; отсутствие в анамнезе вакцинаций против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита для первично прививаемых и наличие такой вакцинации у ревакцинируемых; отсутствие в анамнезе указаний на перенесенные заболе-

вания корью, краснухой или эпидемическим паротитом; информированное письменное согласие родителей пациента на участие в исследовании. Критерии исключения из исследования: наличие в анамнезе тяжелых гнойно-септических и тяжелых инфекционных заболеваний; наличие тяжелых аллергических, аутоиммунных, эндокринных заболеваний, пороков развития и врожденных заболеваний; наличие поражений ЦНС, требующих лечения и не компенсированных к моменту вакцинации; участие в любом другом клиническом исследовании в последние 3 месяца.

В научном исследовании были использованы: формально-логические методы для анализа научной литературы, клинико-лабораторные, иммунологические, статистические методы, методы математического моделирования.

Клинико-лабораторные методы исследования выполнялись на базе КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и включали в себя: клинический осмотр детей с оценкой соматического статуса (при каждом визите); клинический анализ крови на гематологическом анализаторе и подсчет формулы крови в мазке (при каждом визите); общий анализ мочи на мочевом анализаторе (при первом визите). Результаты обследования детей заносились в специальную карту индивидуально для каждого ребенка. Карты использовались для анализа результатов.

Иммунологические методы исследования. Мембранные CD- маркеры на выделенных с помощью градиентного центрифугирования из периферической крови лимфоидных клетках определяли методом проточной цитофлюо-рометрии в реакции прямой иммунофлюоресценции (реактивы и технологии BD Bioscienses: цитометр FacsCalibur, программа сбора и обработки информации CelIQuest). Выделение лимфоидного региона проводилось с окрашиванием CD45 по графикам CD45/SSC и графикам светорассеяния FSC/SSC с контролем чистоты выделения лимфоцитов по экспрессии CD45 (95-98% CD45* клеток в регионе). Использовали следующие композиции многоцветного окрашивания: FITC/ РЕ / PerCP / АРС

1. CD45/CDI4 8. CD5/CDI9

2. IgGI FITC / lgG2 РЕ 9. CD45RA/CD45RO/CD8/CD62L

3. CD8/CD38/CD3/DR 10. С D45 R А/С D4 5 RO/C D4/C D62 L

4. CD8/CD122/CD3 11. CD3 / CD45RO / CD4 / CD161

5. CD3 /CD 16/56 12. CD25 / CD127/CD4

6. CD46 / CD 150 / CD3 / CD 19 13. CD57 / CD8 / CD4 / CXCR5

7. CD27 /CD20/CD19 14. CD25 / CD152 / CD4

Для подсчета малых субпопуляций лимфоцитов использовали метод последовательного гейтирования. Количество общих иммуноглобулинов классов А, М и G определяли с помощью метода турбидиметрии на биохимическом анализаторе Chem-7 («ЕгЬа», Германия), наборы фирмы («Human», Германия).

С помощью различных вариантов иммуноферментного метода в сыворотке крови были исследованы: количество общего IgE (тест-системы фирмы «Хема», Россия); количество IgG четырех субклассов (тест-системы фирмы ООО «Полигност», Россия); количество специфических антител классов М, G и А, а также авидность и количество специфических IgG четырех субклас-

сов к антигенам вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита («Human» или «Euroimmun» Германия); количество IL-17A и TGF-ß (тест-системы фирмы «Bender Medsystems», Австрия); содержание общего IL-10 и TNF-a (тест-системы фирмы «Cytimmune», США).

Содержание одиннадцати цитокинов: IL-lß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-IO, IL-12, IFN-y и TNF-a оценивали в сыворотки крови или культу-ральной жидкости, методом проточной флуориметрии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-plex Protein Assay System, «BioRad», США) с использованием коммерческих тест-систем 11-Р1ех (определяемый динамический диапазон 0,2-3200 пг/мл).

Оценка пролиферации мононуклеаров периферической крови осуществлялась методом прижизненной окраски лимфоцитов 5- и 6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром с последующей оценкой на проточном цитофлюориметре (FacsCalibur) количества пиков пролиферации и расчетом процента пролиферировавших клеток в ответ на митоген или антигены вирусов кори или краснухи.

Определение специфически индуцированной дегрануляции цитотокси-ческих CD84 Т-клеток оценивали по экспрессии на них молекулы CD 107а после индукции антигенами вирусов кори или краснухи с помощью проточного цитофлюориметра (FacsCalibur).

Статистическая обработка результатов проводилась методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±SE). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием параметрических (t-критерий Фишера-Стьюдента) и непараметрических (U-критерий Вилкоксона) методов. Значимыми считали различия при р < 0,05. Для оценки соответствия полученных результатов теоретической гипотезе использовали ^-критерий. Корреляции оценивали с помощью критерия Пирсона. Расчеты проводились с использованием компьютерных программ «Statgraf», «Microsoft Office Excel 2003» и «Statistica 6.0».

Анализ диагностической и прогностической значимости исследуемых параметров, а также оценку уровня пороговых значений показателей осуществляли методом характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-кривых). Для количественного сопоставления рассчитывали площади под ROC-кривыми (AUC). ROC-анализ проводили с использование программы SPSS 16.0

Для анализа динамически изменяющихся параметров был применен метод расчета второй производной.

Математическое моделирование процессов формирования и поддержания иммунологической памяти на антигены вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита осуществляли тремя методами.

Корреляционный анализ проводили методом многомерного корреляционного анализа с помощью пакета программ Statistics Toolbox MATLAB R2014a 8.3. Уровень значимости для выделения значимых корреляций составлял 0,05 (р < 0,05).

Метод главных компонент является вариантом факторного и регрессионного анализа. Анализ данных также проводили с помощью пакета программ MATLAB R2014a 8.3, пакета Statistics Toolbox, был воспроизведен РСА алгоритм.

Байесовские сети традиционно применяют для моделирования процессов, характеризующихся неопределенностью из-за неполных знаний или случайных событий, что часто встречается в медицинской практике [Lucas P.J. et al., 2004; Gevaert О. et al., 2006]. Байесовская сеть представляет собой графическую вероятностную модель, которая представлена в виде ациклического графа, каждой вершине которого соответствует одна таблица условных вероятностей. Для анализа байесовской сети были использованы программы NetGen, ANN и SiLVIA.

Положения, выносимые на защиту

1. Иммунная система реагирует на введение чужеродного антигена не отдельными звеньями, а как единое целое. При иммунизации вакциной Приорикс выявляются: транзиторное снижение количества лимфоцитов в периферической крови и уровня основных их субпопуляций, тогда как уровни активационных маркеров на этих субпопуляциях повышаются; временное увеличение общего IgE у лиц, реагирующих по типу Th2; динамическое повышение Th17 и IL-17A. По завершении процесса реагирования на антиген повышается уровень Treg и их основных цитокинов, все отклонения различных параметров иммунитета возвращаются к исходному состоянию без каких-либо клинических проявлений.

2. Показано, что введение вакцины Приорикс дает эффективную иммунную защиту не у всех привитых, что может выражаться в отсутствии специфических IgG или быстром их истощении, а также проявляться в низкой авидности антител или отсутствии клеточных реакций специфического иммунного ответа, что не исключает наличия высокого уровня специфических IgA. Центральные и эффекторные субпопуляции клеток памяти выполняют различные функции и не могут полностью заместить недостаточность какой-либо из них.

3. Предложен способ прогнозирования результатов вакцинации и выделения групп риска по низкому или нестойкому иммунному ответу на прививку Приорикс на основании выявленных предикторов (параметров иммунного статуса до прививки). Использование иммунокорреги-рующих препаратов одновременно с вакцинацией позволяет воздействовать на регуляторные функции иммунной системы и добиваться более высоких и продолжительных результатов специфической защиты.

Степень достоверности н апробация результатов исследования

О достоверности результатов исследования свидетельствует использование адекватных, современных методов, обладающих высокой чувствительностью и объективностью. Указанные методы были осуществлены с помощью современных автоматических диагностических приборов, обладающих системами автоматизированного сбора, учета и анализа данных. Были применены корректные методы статистической обработки материала и адекватные методы математического моделирования.

Основные результаты работы были доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» в 2012, 2013, 2014 гг; на 7-ми Международных конгрессах и конференциях по иммунологии: International conference "Immunopotentiators in Modern Vaccines" (Malaga, Spain, 2005); Is' Joint Meeting of European National Societies of Immunology (Paris, France, 2006); International congress "Immune-Mediated Diseases: from Theory to Therapy" (Moscow, Russia, 2007); 2nd Joint Meeting of European National Societies of Immunology (Berlin, Germany, 2009); 4lh International Conference "Measurement of Antigen Specific Immune Responses" (Mykonos, Greece, 2010); 3d Joint Meeting of European National Societies of Immunology (Glasgow, GB, 2012); 5,h international Conference "Measurement of Antigen Specific Immune Responses" (Dubrovnik, Croatia, 2013); и на 23-х Всероссийских конгрессах, форумах и конференциях, в том числе: 1-ом, 2-ом и 3-ем Объединенном Иммунологическом Форуме, (Екатеринбург, 2004; Санкт-Петербург, 2008 и г. Нижний Новгород, 2013); 5-ом, 10-ом и 14-ом конгрессах РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармаколо-гии» (Москва, 2002, 2007, 2011); VIII, IX, X, XI, XIII, XIV Всероссийских форумах им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006, 2007, 2009, 2011); 2-ом и 3-ем Конгрессе педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей» (Москва, 2003 и 2004); X, XI, XII Конгрессах педиатров России (Москва 2006, 2007, 2008); Научно-практической конференции с международным участием «Теоретические и практические аспекты элиминации кори в России», посвященной 145-летию со дня рождения Г.Н. Габричевского (Москва, 2005) и др.

Предложенный алгоритм прогнозирования первичных и вторичных вакцинальных неудач по результатам иммунологического обследования до введения вакцины против кори, краснухи и эпидемического паротита внедрен в работу Консультативно-диагностического центра ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Материалы диссертации включены в курс лекций по иммуноморфологии и клинической иммунологии кафедры иммунологии Биологического факультета ФГБО УВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; в курс лекций Всероссийской школы по клинической иммунологии «Иммунология для врачей» (Пушкинские Горы, Псковская область, 2011-2014); в курс лекций Всероссийской

школы по проточной цитометрнн «Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике» (Санкт-Петербург, 2012-2013; Челябинск, 20132014). Получен патент на изобретение «Способ определения специфического клеточного иммунного ответа к антигенам вируса кори и краснухи» № 2464571,20.10.2012.

Публикации по теме диссертации

По материалам исследования опубликовано 60 печатных работ, из них статей в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ для публикаций основных результатов диссертационных исследований с высоким индексом цитирования - 23; статей в зарубежных журналах, цитируемых в PubMed, Medline, Index Medicus - 3; статей вне перечня ВАК - 3; патентов на изобретение - 1 и материалов научных конгрессов и конференций -30.

Личный вклад соискателя

Автором самостоятельно проводился подбор, ведение и обследование детей, подлежащих вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита, обработка клинических данных; сбор и обработка биологического материала; выделение лимфоцитов периферической крови; пробоподготовка для определения поверхностных CD маркеров; культивирование лимфоцитов с митогенами и антигенами вирусов кори и краснухи для получения суперна-тантов, оценки пролиферативной активности и процента дегрануляции CD8' лимфоцитов (работа на проточном цитометре осуществлялась совместно с сотрудниками лаборатории по изучению клеточных и молекулярных основ иммунитета (зав. - д.м.н., профессор М.С. Бляхер) ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и централизованной клинико-диагностической лаборатории ФГБУ Научный центр здоровья детей РАМН (зав. - д.м.н. Е.Л.Семикина)). Также самостоятельно автором были выполнены все тесты по определению количества цитокинов мультиплексным методом и тесты, основанные на методе ИФА (раздел по изучению количества специфических антител у больных корью выполнен совместно с сотрудником лаборатории иммунохимии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского к.м.н. Т.А. Мамаевой), и осуществлена статистическая обработка полученных данных. Раздел работы по математическому моделированию выполнен совместно с ФГБУН «Институт вычислительной математики им. Г.И. Марчука» РАН (руководитель проекта - доктор физико-математических наук Г.А.Бочаров).

Объем н структура диссертации

Диссертация изложена на 343 страницах. Она состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», трех глав результатов собствен-

ных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 48 таблицами, 84 рисунками и 2 приложениями. Список литературы содержит 662 источника, из них работ отечественных авторов - 84, зарубежных авторов -578.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика когорты обследованных лиц, вакцины и лекарственного препарата.

Под наблюдением находилось 110 детей (57 мальчиков и 53 девочки) в возрасте от 1 до 3 лет (средний возраст 1 г 7 мес.) и 10 детей (7 мальчиков и 3 девочки) в возрасте от 4 до 7 лет (средний возраст 5 л 7 мес.), обращавшихся в кабинет вакцинопрофилактики КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского для проведения прививки против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита с 2002 по 2014 гг. Все дети были привиты, согласно инструкции, однократно подкожно 0,5 мл вакцины Приорикс® (корь, краснуха, эпидемический паротит; «С^хоБтМКПпе», Бельгия). Четырнадцать детей по разным причинам были исключены из дальнейшего исследования. Группу здоровых детей составили 48 человек, которые за свои 1-1,5 года жизни ни разу не болели и имели показатели иммунного статуса, соответствующие возрастной норме (группа 1). Все остальные (48 человек) были отнесены к группе с условным названием «иммунокомпрометированные дети» и были рандомизированно поделены на две группы. Группу 2 составили 26 «имму-нокомпрометированных» детей. Двадцать два «иммунокомпрометирован-ных» ребенка были отнесены в группу 3. Эти дети одновременно с вакцинацией Приорикс однократно получали 3 мг иммуномодулятора Полиоксидо-нии внутримышечно.

Согласно плану исследования дети находились под наблюдением в течение 5 лет. Обследования проводились до прививки, через I неделю после прививки, через 4 или 6 недель после прививки, через 1 год после прививки, через 5 лет после прививки (перед ревакцинацией), через неделю после ревакцинации и через 6 недель после ревакцинации. Группу ревакцинирован-ных составили 24 ребенка. Ревакцинация проводилась также однократно подкожно 0,5 мл вакцины Приорикс, согласно инструкции. Также был обследован: в качестве контрольной группы для выяснения возрастной динамики изменения некоторых показателей иммунитета, 161 здоровый ребенок (84 мальчика и 77 девочек), из них 11 новорожденных в возрасте 4-7 дней, 33 ребенка в возрасте 4-8 месяцев, 32 ребенка в возрасте 1-2 лет, 17 детей в возрасте 4-5 лет, 25 детей в возрасте 6-8 лет, 15 детей 9-11 лет и 28 детей 14-16 лет. Кроме того, были обследованы 69 больных корью, различавшихся по возрасту и стадии заболевания. В их состав входили 14 детей больных корью в возрасте до одного года на 5-7 день после появления сыпи, 18 ранее не привитых больных корью взрослых в активной фазе заболевания (5-7 день со дня

появления сыпи), средний возраст 28,3 года, 18 не привитых взрослых больных корью (средний возраст 27,5 лет) пациентов в стадии реконвапесценции (12-15 день со дня появления сыпи), 19 больных взрослых (средний возраст 30,7 лет) в активной фазе заболевания (4-7 день со дня появления сыпи), имевших достоверные сведения о прививках в детстве против кори. В качестве контрольных групп были обследованы 24 здоровых взрослых, дважды, согласно графику, привитых в детстве против кори (средний возраст 33,6 лет) и 27 здоровых взрослых, перенесших корь более 10 лет назад (средний возраст 45,4 года). Всего обследован 401 человек от одного до 7 раз.

В работе была использована вакцина Приорикс"' (вакцина против кори, эпидемического паротита и краснухи живая аттенуированная; «Glax-oSmithKline», Бельгия), содержащая вакцинные штаммы вирусов кори (Schwarz), краснухи (Wistar27/3) и эпидемического паротита (RIT 4385, производный Jeryl Lynn). Регистрационное удостоверение № 0678049 от 28.10.2011 Вакцина рекомендована ВОЗ. Вакцинация проводилась в дозе 0.5 мл подкожно (согласно инструкции).

В качестве иммунопотенциатора был использован полиоксидоний, входящий в качестве неспецифического компонента в вакцину Гриппол и некоторые современные аллерговакцины. Полиоксидоний - синтетический имму-номодулятор и детоксикант, сополимер N-окиси 1,4- этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этинилпиперазиния бромида. Полиоксидоний применяли однократно внутримышечно в дозе 3 мг, одновременно с вакцинацией.

Общие реакции иммунной системы в ответ на введение живой вирусной вакцины Приорикс

В группе первично привитых здоровых детей через 1 неделю после прививки отмечалось значимое (р < 0,05) снижение параметров клеточного иммунитета с последующим восстановлением количества клеток в субпопуляциях лимфоцитов периферической крови (Таблица 1 ). Характерные для второй группы сниженные показатели клеточного иммунитета через 1 неделю после вакцинации демонстрировали тенденцию к повышению, а через 4 недели это повышение становилось статистически значимым. Более того, через 4 недели после вакцинации исследованные показатели достоверно не отличались от соответствующих показателей группы здоровых. В группе 3, несмотря на исходно сниженные показатели клеточного иммунитета, через 1 неделю после вакцинации, тем не менее, отмечалось, хотя и не достоверное, но снижение показателей (как в группе 1). Различия между второй и третей группами через 1 неделю были высоко значимыми (р < 0,01). Через 4 недели в третьей группе отмечалось повышение исследованных показателей так же, как в группах 1 и 2.

При оценке распределения лимфоцитов по субпопуляциям не в абсолютном количестве клеток, а как процент лимфоцитов, экспрессирующих тот или иной маркер, ни в одной из исследованных групп не отмечалось значимых изменений в основных субпопуляциях лимфоцитов.

Таблица 1 Влияние вакцинации Приорикс на количество клеток в субпопуляциях лимфоцитов периферической крови (количество клеток в мм' крови М±5Е)___

Группа 1 Группа 2 Группа 3

До Череч 1 Череч 4 До Череч 1 Череч 4 До Череч Череч

вакци- неделю недели вак- неделю недели вак- 1 неде- 4 не-

нации цина- цина- лю дели

ции ции

Лим- 5113.7 3668 4855,2 3153.4 3652.9 4559.8 3264, 3016.7 3941.5

фо- ±273 ±318* ±349 ±254 ±311 ±337* 7 ± ±91** ±347

циты 283

CD3+ 3638.2 2550.8 3440.6 2140.4 2609.9 3032,1 2219, 2083.5 2616.7

±264 ±259* ±315 ±247 ±255 ±305* 2 ± ±243* ±271

256 *

CD 19+ 1039.3 688,5 ± 875.1 614,7 673,7 ± 797.5 ± 627,4 530.3 745.5

±98 57* ±86 ±59 63 76* ±59 ±49** ±66

CDI6+/ 510.5 485.7 ± 672,1 519,7 495,9 ± 709,7 ± 402.7 392.7 564.5

56+ ±61 43* ±63 ±45 48 69* ±39 ±35** ±53

CD4+ 2483.2 1732.3 2343.5 1437.9 1707.3± 2007.7 1495 1384.3 1758.3

±273 ±184* ±223 ± 110 157 ±218* ±123 ±128* * ±211

CD8+ 1173.6 816.2 ± 875.1 715.2 804.9 ± 1023.6 728.6 665.5 886.4

±113 65* ±115 ±61 79 ±97* ±71 ±62** ±88

* р < 0,05 по сравнению с исходными данными

** р < 0,01 по сравнению с группой 2, срок - через 1 неделю после прививки.

При оценке распределения лимфоцитов по субпопуляциям не в абсолютном количестве клеток, а как процент лимфоцитов, экспрессирующих тот или иной маркер, ни в одной из исследованных групп не отмечалось значимых изменений в основных субпопуляциях лимфоцитов. В когорте ревакци-нированных детей (возраст 6-8 лет) никаких значимых изменений, как в абсолютном количестве клеток, так и в проценте различных субпопуляций лимфоцитов после вакцинации Приорикс не наблюдалось.

Уровень центральных Т-клеток памяти (Tm) (CD45R0+CD62L+) при первичной вакцинации практически не менялся в течение 6 недель после прививки, тогда как повышение эффекторных Tm (CD45R0+CD62L ) как CD4\ так и CD8* отмечалось только через полтора месяца после вакцинации (р < 0,05) (Рисунок I). При ревакцинации детей через 5 лет после первичной вакцинации уже через неделю после введения вакцины отмечался подъем уровня Тт и центральных и эффекторных, как CD4\ так и CD8+ лимфоцитов и возвращение к исходному уровню через полтора месяца (р < 0,01).

Аналогичные тенденции были выявлены при исследовании эффекторных Т-клеток, экспрессирующих CD45RA. У первично привитых повышение этих клеток отмечалось через 6 недель, а у ревакцинированных наблю-

дался быстрый подъем на 7-ой день и снижение до исходного уровня через 6 недель после прививки (р <0,01).

Рисунок 1 Изменение количества Т-клеток памяти после прививки Приорикс (% от количества Т-лимфоцитов М±8Е).

Уровень пула В-клеток памяти (Вт) (СЭ20С027Т) не менялся как у впервые привитых, так и у ревакцинированных. Через неделю после прививки и в группе впервые привитых, и у ревакцинированных отмечалось значимое повышение количества плазмобластов (фенотип С03"НЬА"0РГС038ЬГ). Через 6 недель после вакцинации у впервые привитых процент плазмобластов в крови продолжал увеличиваться, а у ревакцинированных - снизился, приближаясь к исходному уровню.

При исследовании экспрессии маркеров СЭ46 и СО 150, являющихся рецепторами для вирусов кори, отмечено, что вакцинация существенно не повлияла на экспрессию СЭ464 ни на Т-, ни на В-лимфоцитах. Выявлено зна-

чимое повышение СО 150+ лимфоцитов как у впервые привитых, так и у ре-вакцинированных, как на Т-, так и на В-клетках: содержание СЭЗ'С0150+ лимфоцитов значимо повысилось в 2 раза, а количество С0150' В-клеток возросло в 4-5 раз (р < 0,001).

Общее количество иммуноглобулинов классов А, М, в и Е во всех группах детей достоверно не менялось в течение месяца после прививки по сравнению с исходным уровнем, как у впервые привитых, так и после ревакцинации. Однако при анализе изменений количества общего ^Е индивидуально для каждого ребенка оказалось, что практически у всех детей с атопическим дерматитом имеется повышение этого показателя в крови через 7 дней после вакцинации, тогда как у детей в контрольной группе отмечается как повышение, так и понижение 1§Е, которое в любом случае возвращается к исходному уровню через месяц после вакцинации. Следует отметить, что ни у одного ребенка как в контрольной группе, так и среди детей с атопическим дерматитом, не было отмечено никаких аллергических реакций на прививку против кори, краснухи и эпидемического паротита.

При анализе уровня цитокинов сыворотки крови (1Ь-1, 1Ь-2 , 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 11.-8,1Ь-10,1И2,1Р1М-у и ТЫР-а.) изменения средних концентраций исследованных цитокинов после вакцинации были незначимы, так как наблюдался значительный разброс индивидуальных показателей, и у разных детей встречались разнонаправленные изменения. Важно, что после вакцинации Приорикс не отмечалось значимого подъема цитокинов, отвечающих за аллергию, например 1Ь-5, а также провоспалительных цитокинов 1Ь-1, 1Ь-8, ТТМР-а. В группе первично привитых наблюдалась отрицательная корреляция 1Ь-7 и 1Ь -10 практически со всеми другими изученными цитокинами. Тогда как другие исследованные цитокины демонстрировали тесные положительные связи. Для характеристики сдвигов баланса ТЫ/Т112 применен метод расчета второй производной от функции соотношения концентрации 1ЯМ-у к 1Ь-4 по времени. Такой подход позволил выявить, что половина впервые привитых детей ответила на вирусные антигены дифференцировкой преимущественно в сторону ТЫ, тогда как другая половина - в сторону ТИ2. Применив метод расчета второй производной для анализа сдвигов в про- и противовоспалительной системе цитокинов (отношение общего количества Т№-а и 1Ь -10) в ответ на введение вакцины Приорикс, мы обнаружили, что три четверти впервые привитых детей отвечает на вакцинацию с преимуществом -10, а ответ с преимуществом ТЫР-а встретился лишь у четверти детей.

Исследование Т-лимфоцитов с фенотипом фолликулярных хелперов (С04+С057+СХСЯ5+) показало, что до прививки их уровень не зависел от возраста и составлял около 0,5% от лимфоидного региона, а после прививки достоверно повышался до !,16±0,17%у впервые привитых и 1,33±0,!7% после ревакцинации.

Динамика поствакцинальных изменений другой альтернативной пары С03'С04* лимфоцитов (ТЫ7 и Тге§) различалась (Рисунок 2). Если на 7 день после прививки у впервые привитых и ревакцинированных детей отмечено

повышение ТЫ7 и соответствующее повышение концентрации 1Ь-17А, которые вернулись к исходному уровню через 6 недель, то количество Тге§ начинало повышаться только после повышения уровня ТЫ 7 и у впервые привитых и у ревакцинированных, что с нашей точки зрения отражает наличие контроля со стороны Т^, основная функция которых состоит именно в подавлении аутоагрессивных реакций. Динамика изменения концентраций ТОР-Р и 1Ь-10 в сыворотке крови у впервые привитых детей совпадала с таковой для Т^, тогда как у ревакцинированных количество 1Ь-10 и ТвР-р через 1 неделю после ревакцинации значимо возросло и снизилось через 6 недель до исходного уровня.

а в

5.0 4,0

О

О

со30 □

^ 2.0 о

^ 1.0

Впервые привитые

-ТИ17 пг/мл ► -И-17!т 18

До вакцинации Через 1 недепо Через 6 недель

Впервые привитые

Е 8.0 ■■

□ 6.0 О

« 4.0 О

о 2.0 -

0.0

-о—Тгед -»-1Ы0

' А - ТСР-В

иг/мл

90 80 70 60 50 40 30 20 10 о

До вакцинации Через 1 неделоЧерезб недегъ

+ 10,0

■ч-

О

О 8,0

3 6.0

О

5 ".о

£ * 2.0

0.0

Ревакцинированные* —о—Т1И7 —» - И-17

'Х4

—I-1—

До вакцинации Через 1 неделюЧерез 6 недель

пг/мл

30 25 20 15 10 5 0

8.0 --

с 6.0

□

О 2.0 о ^0.0

Ревакцинированные

* 1 »

-о— Тгед -♦-11-10 - к • ТвР-в

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

До вакцинации Через 1 неделю Через 6 неде/ъ

Рисунок 2 Изменение количества ТЫ7 (% от СЭЗ+СЭ4 лимфоцитов) и концентрации \L-\1 (пг/мл) (а и б) и количества Тге§ (% от СОЗ'СЭ4" лимфоцитов) и концентраций 1Ь-10 (пг/мл) и ТвР-р (нг/мл) (в и г) в крови детей после прививки Приорикс.

По левой оси ординат - количество ТЫ 7 (%, М±БЕ) (а и б) или количество Тге§ (%, М±5Е) и концентрация 1Ь-10 (пг/мл, М±БЕ) (в и г). По правой оси ординат - концентрация 1И7 в сыворотке крови (пг/мл, М±БЕ) (а и б) и концентрация ТОР-Р в сыворотке крови (нг/мл, М±БЕ) (в и г).

При исследовании маркеров активации показано, что у впервые привитых детей через семь дней после вакцинации отмечалось значимое увеличение количества активированных хелперов (С03+С04'С025ЧЮ127Ь') и лимфоцитов с фенотипом поздней активации С03"НЬА-01*\ экспрессия СЭ38 и СЭ122 значимо повышалась на субпопуляции Т-хелперов и снижалась на цитотоксических лимфоцитах СЭЗ+С08\ а через 6 недель показатели возвращались к исходному уровню (Таблица 2). В группе ревакцинированных детей также через неделю после прививки отмечалось значимое повышение С03*С04*С025*СШ27'11 и снижение экспрессии СЭ122 на С03'С08\ возвращающиеся к исходному уровню через 6 недель.

Таблица 2 Экспрессия маркеров активации на различных субпопуляциях Т-клеток у детей, привитых и ревакцинированных Приорикс (%)_

Впервые привитые Ревакцинированные

До вакцинации Череч 1 неделю Череч 6 недель До вакцинации Череч 1 неделю До вакцинации

СОЗ+СБ4+ СЭ25+ С0127|" 2.00± 0.12 3.64± 0.18* 0.99±0,13 2.47±0,14 4.61 ±0,29* 2.01± 0.16

СЭ8+38+3+ 14,01 ± 0.68 12.34 ± 0.68* 13,82 ± 0,71 11,51 ± 1.04 11.48 ± 0,93 10,44 ± 0.82

С0838+3+ 32.45 ± 1.21 39.04 ± 1.17* 28.47 ±1.71 36,10 ± 1.55 35,30 ± 2.09 36.95 ± 2.32

СБЗ+ОК+ 0.43 ± 0.07 0.60 ± 0.09* 0,95 ± 0.08* 0.68 ± 0.09 0.67 ± 0.12 0.62 ± 0,11

СО!22+3+ 4.44 ± 0.46 5.17 ± 0.50* 4.31 ± 0,93 3,76 ± 0.47 3.22 ± 0.39 4.30 ± 0,81

С08+122+ 3.86 ± 0.33 4.74 ± 0.69* 3.92 ± 0.34 4.42 ± 0.49 4.91 ±0.62 4.54 ± 0.40

С08+122+3+ 1.05 ± 0.12 0.74 ± 0.11* 1.23 ± 0.25 0.61 ± 0.09 0,63 ± 0.08 0.52 ± 0.10

С08 122+3+ 3.41 ± 0.36 4.86 ± 0.34* 3.91 ± 0.43 3,43 ± 0.26 2.56 ± 0.41* 3.98 ± 0.32

С08'°122+3' 2,17 ± 0.20 3.70 ± 0.33* 2,59 ± 0.26 3,36 ± 0.27 5.20 ± 0.55* 3,14 ± 0.34

*р < 0,05 по сравнению с исходным уровнем

Использование полиоксидония одновременно с вакцинацией у детей с перенесенными вирусными инфекциями в анамнезе показало, что через месяц после прививки происходит нормализация исходно сниженных показателей иммунного статуса, сдвиг дифференцировки хелперов в сторону ТЬ2, а баланса про- и противовоспалительных цитокинов в сторону Т^-а. В целом это свидетельствует об активизации процессов иммунного ответа.

Специфический иммунный ответ на вакцинацию Прнорикс

Все дети до вакцинации были серонегативны, через 1 неделю специфических антител к кори, краснухе и паротиту выявлено не было. Спустя 4 недели после прививки специфические 1§М- антитела против краснухи определялись у 71% , против кори - у 52%, а против паротита - только у 36% детей. Специфические ^в-антитела к вирусам кори, краснухи и эпидемического паротита наблюдали, соответственно, в 99%, 95,8% и 80,2% случаев. Тем не менее, не у всех детей был обнаружен защитный уровень антител: у 3% детей не было защитного уровня антител к вирусу кори, у 17,6% - к вирусу краснухи и у 29,4% - к вирусу паротита. Через 1 год специфических ^М-антител не было выявлено ни у одного ребенка, а специфические антитела против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита были выявлены у 96,85%, 100% и 87,5% детей, соответственно. Таким образом, через год у большинства детей отмечалось повышение абсолютного количества специфических антител, в большей степени это было характерно для краснухи, и в наименьшей - для эпидемического паротита. И, напротив, понижение напряженности специфического иммунитета было более характерно для эпидемического паротита и в наименьшей степени - для краснухи. В группе «иммунокомпрометированных» детей (группа 2) количество специфических 1§С-антител через 4 недели после вакцинации оказалось ниже, а для кори и паротита - значимо ниже, чем в группе здоровых детей (р < 0,05). В третьей группе специфический гуморальный ответ на все три компонента вакцины был достоверно выше, нежели во второй (р < 0,05). Через год после прививки количество специфических антител к вирусам кори и краснухи повысилось у всех групп обследованных детей, а уровень антител к антигенам эпидемического паротита значимых изменений не показал.

При исследовании уровня специфических антител класса ^А через 4 недели и через 6 недель после вакцинации в сыворотке крови было выявлено повышение их уровня (против всех трех компонентов вакцины), однако отмечены значительные индивидуальные колебания. Специфические 1§А-антитела также были обнаружены и через 1 год.

В процессе созревания менялась авидность 1§С-антител. Авидность антител к кори и краснухе через 4 недели после прививки составила 29% и 25%, соответственно, через 6 недель существенных изменений не было, через год эти показатели увеличились до 72% и 70%, соответственно. Авидность антител к паротиту через 4 недели была очень низкой - около 5%, и осталась неизменной через 1 год.

Выявлены значительные различия в спектре субклассов иммуноглобулинов у детей разного возраста при первичном ответе и при ревакцинации, а также в ответе на разные компоненты вакцины (Рисунок 3). В первичном ответе (через 4 недели после вакцинации) у детей младше 3 лет в составе противокоревых ^С преобладали антитела ^вЗ субкласса, доля (цй I и ^С4 была значительно меньше, не обнаружено. Специфические антитела к краснухе и эпидемическому паротиту были представлены в основном

1 и 1§03 субклассами, уровень ^04 было значительно меньше, ^02 не обнаружено. В группе детей старше 4 лет в специфическом противокоревом ответе участвовали 1§С2-антитела. которые в спектре субклассов занимали второе место после ^СЗ. Спектр 1§0-субклассов антител против краснухи и эпидемического паротита у детей младше 3 лет и старше 4 лет существенных различий не имел. Через год после прививки в группе детей моложе 3 лет и старше 4 лет основным субклассом антител ко всем компонентам вакцины был 1§С 1. У детей старше 4 лет среди противокоревых антител на втором месте были 1§02 антитела. Выделенные нами группы 1, 2 и 3 не различались по спектру субклассов ни через 4 недели после прививки, ни через год после нее, что позволяет говорить о том, что исходное состояние иммунной системы не влияло на спектр субклассов специфических антител, образующихся в ответ на прививку.

Возраст

Через 4 недели после прививки Приорикс

Через 1 год после прививки Приорикс

1-3 года

Корь Краснуха Паротат

£ 90

I 80

£ 70

О)

5 60

50 40

30

О №1

□ 1д(В2 и 1дСЗ

□ 1дС4

181ВЯЯВ!

Корь

Краснуха

Паротат

4-7

лет

60 50 40 30 20 10 о

><•

-

1 1

ЙЕ

Корь Краснуха Паротит

£ 100 I 90 о 80

70 60

50 -40 -30 20 ■10 о

Корь

Краснуха Паротит

Рисунок 3 Спектр субклассов специфических антител.

Через 5 лет после вакцинации в сыворотке крови обследованных детей 1§М антитела не обнаруживались, уровень снизился, однако защитные

титры IgG антител к кори и краснухе сохранили все наблюдаемые дети, а к эпидемическому паротиту - только 86% детей.

После ревакцинации специфические антитела класса IgM не выявлялись. Специфические IgA-антитела сохранились в небольшом количестве после прививки, и при ревакцинации наблюдался бустер-эффект (различия недостоверны из-за значительного разброса показателей). Специфические IgG-антитела при ревакцинации повышались, особенно значительно - у детей с исходно более низким уровнем.

Через 5 лет после первичной вакцинации - перед ревакцинацией -спектр субклассов специфических IgG-антител практически не изменился: основным субклассом оставался IgGl, антитела субклассов IgG3 и IgG4 составляли минорные фракции. При иммунном ответе на ревакцинацию также преобладал IgGl субкласс, хотя отмечена некоторая тенденция к увеличению IgG3 и IgG4 субклассов, особенно при ответе на вирус эпидемического паротита.

Проведение ROC-анапиза подтвердило высокую диагностическую значимость определения количества специфических IgGl и IgG3 для разделения первичного и вторичного иммунного ответа на все компоненты вакцины Приорикс. Для противокоревых антител значение cut-off для IgGl-субкласса составляет 0,359 Me/мл, а для IgG3-cy6miacca - 0,324 Me/мл. Для противо-краснушных антител пороговые показатели составили 44,7 Me/мл IgGl и 12,15 Me/мл IgG3. Для гуморального иммунного ответа на вирус эпидемического паротита соответствующие значения составили для IgGl-субкласса -19,7 Me/мл и для IgG3-cy6miacca — 10,05 Me/мл. Уровень IgGl ниже уровня cut-off, a IgG3 выше обозначенного уровня соответствуют первичному иммунному ответу, обратное соотношение - IgGl выше, a IgG3 ниже уровня cut-off- характеризует вторичный иммунный ответ.

Результаты исследования специфического гуморального иммунного ответа у больных корью хорошо согласуются с современными взглядами на физиологию иммунного ответа (Таблица 3). В сыворотках здоровых людей (группа взрослых, получивших полноценную вакцинацию, и группа давно переболевших корью) не было обнаружено специфических противокоревых IgM-антител. Все больные, не имевшие в анамнезе прививки против кори, независимо от возраста, имели высокий уровень противокоревых IgM. Высокий уровень противокоревых IgA-антител был обнаружен во всех исследованных группах, причем самый высокий уровень был обнаружен в группе больных, имевших в анамнезе вакцинацию. Противокоревые IgG-антитела были обнаружены во всех исследованных группах. У здоровых лиц, переболевших корью ранее, обнаружены специфические IgG в защитных титрах, в то время как в группе здоровых привитых встречались показатели ниже защитного уровня. Значимое нарастание уровня специфических IgG-антител отмечалось у больных в динамике от острого периода до стадии реконвалес-ценции. В группе вакцинированных в детстве заболевших корью взрослых отмечен крайне высокий уровень высокоавидных противокоревых IgG.

Таблица 3 Специфический гуморальный иммунный ответ на вирус кори.

Средний возраст Коревой статус ^М (Ед. Он.пл.) ^А(МЕ/мл) |£С(МК/мл) Авидность (%)

До 1 года Больные 3,3 ± 4,009 ± 0,435 ± 10,15 ±

не привитые в острой фазе 0,044 0,647 0,087 0,615

28,3 года Больные 3,2 ± 9,862 ± 0,926 ± 11,42 ±

не привитые 0,061 0,671 0,089 0,739

в острой фазе

27,5 лет Больные 3,1 ± 8,135 ± 1,738 ± 18,86 ±

не привитые 0,071 0,653 0,123 1,134

реконвалесценты

30,7 лет Больные 1,3 44,441 ± 42,479 ± 97,16 ±

привитые в острой фазе ±0,457 4,186 4,162 1,006

33,6 лет Здоровые 0 1,822 ± 1,248 ± 70,64 ±

привитые 0,624 0,156 1,098

45,4 года Здоровые 0 4,423 ± 2,923 ± 96,31 ±

переболевшие 0,821 0,137 1,136

Антитела с низкой степенью авидности были выявлены в сыворотках больных, не вакцинированных против кори, независимо от возраста. У здоровых взрослых (группа вакцинированных и группа переболевших) противокоре-вые ^в-антитела были высокоавидными, однако степень авидности у привитых была значимо ниже по сравнению с показателем в группе переболевших ранее.

Преобладающим субклассом специфических ^О у не привитых больных разного возраста в активной фазе заболевания оказался ^вЗ, ^в! представлены в меньшем проценте; специфические антитела 1§02 и ^04 субклассов отсутствовали. У пациентов в стадии реконвалесценции противокоревой иммунный ответ был представлен всеми субклассами в соотношении 26,9% -1£С1, 36,9%-^02, 29,1%-1§СЗ и 7,1%-^С4. В сыворотках взрослых (группы больных с вакцинацией в анамнезе, здоровых вакцинированных и здоровых переболевших) преобладали специфические антитела субкласса которые составили 80,7%, 69,8% и 41,3% от всего количества противо-коревых соответственно. Показатели содержания ^йЗ субкласса в этих трех группах практически не различались - 15,1%, 17,3% и 17,6%, соответственно. Уровень антител 1§в4 субкласса был незначительным, однако у переболевших ранее он в 1,8 раза превышал среднее значение в группе здоровых привитых. Существенные различия в концентрации специфических антител субкласса ^02 были выявлены в перечисленных группах взрослых: минимальный уровень отмечен у привитых больных, выше у привитых здоровых, и максимальный у взрослых, переболевших ранее. Различия в спектре субклассов специфических антител у не привитых взрослых пациентов в ак-

тивной фазе заболевания, отвечающих на инфекцию первичным иммунным ответом, и у привитых взрослых пациентов также в активной фазе заболевания, но отвечающих на инфекцию вторичным иммунным ответом, оказались высоко значимы (X = 278,716; р « 0,0001).

При анализе динамики показателей содержания антител разных классов и субклассов в активной фазе заболевания по сравнению со стадией реконва-лесценции (13 парных сывороток, полученных на 5 и 14 день после появления сыпи), показано, что количество специфических IgM-антител увеличилось незначительно. Уровень противокоревых IgA снизился, а концентрация IgG статистически значимо увеличилась; прирост специфических IgG-антител осуществлялся как за счет IgGl-, так и за счет lgG3-cy6miacca. При этом на ранних сроках преобладали антитела субкласса !gG3, значимо превосходя показатель IgGl-субкласса, а на позднем сроке преимущество явно осталось за антителами субкласса IgGl. Антитела субклассов IgG2 и IgG4 у данных пациентов выявлены не были.

Для разграничения первичного и вторичного гуморального ответа на вирус кори у больных этой инфекцией получены значения cut-off для IgGl-субкласса - 48,06%, а для IgG3-cyomiacca - 40,9%. Количество противокоревых антител IgGl-субкласса ниже 48,06% и количество антител IgG3-субкласса больше 40,9% позволяет с вероятностью более 99% оценить гуморальный иммунный ответ обследуемого человека как первичный; соответственно количество противокоревых антител IgGl-субкласса выше 48,06%, а количество антител IgG3-cy6miacca ниже 40,9% характеризует иммунный ответ как вторичный. При вычислении cut-off для общего количества противокоревых IgG-антител у больных оказалось, что при общем количестве специфических IgG выше 11,583 Me/мл с вероятностью более 99% иммунный ответ соответствует вторичному типу.

При оценке антиген-индуцированного пролиферативного ответа установлено, что лимфоциты впервые привитых детей до вакцинации не отвечали пролиферативной реакцией на добавление в культуру антигенов вирусов кори или краснухи; через неделю после вакцинации также не отмечалось пролиферации в ответ на внесение антигенов; хорошо выраженная пролиферация получена через 6 недель после вакцинации (Рисунок 4). Перед ревакцинацией (через 5-6 лет после первичной вакцинации) исходно отмечалась отчетливая пролиферация на оба антигена, уровень которой был значимо ниже уровня впервые привитых детей через 6 недель после вакцинации (р < 0,01). Через неделю после ревакцинации обнаружено значимое снижение, по сравнению с исходным, пролиферативного ответа как на ФГА, так и на антигены вируса кори и вируса краснухи; и через 6 недель после ревакцинации выявлено значимое, по сравнению с исходным, повышение уровня пролиферации на оба применявшихся антигена (р < 0,05). При проведении ROC-анализа для оценки специфичности и чувствительности этого метода установлено, что для впервые привитых уровень cut-off на антигены краснухи составил 12,5%. В группе ревакцинированных cut-off на антигены кори составил 14%, а для

антигенов вирусов краснухи cut-off оказался равен 13,5%. При оценке специфически индуцированной пролиферации лимфоцитов на антигены вирусов кори и краснухи независимо от прививочного анамнеза cut-off для антигенов кори составил 12%, а для антигенов краснухи - 12,5%.

m

* 50

Э

m 40

s

с

>* 30

m

20

о i-

ш 10 S? о

Ревакцинированные

и До прививки □ Через 1 неделю Д Через 6 недель

Аг корь Аг краснуха

Рисунок 4 Антиген-индуцированная пролиферация лимфоцитов периферической крови детей, привитых вакциной Приорикс (М±5Е).

Впервые привитые

И До прививки

□ Через 1 неделю

□ Через 6 недель

Аг корь

Аг краснуха

Исследование спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови привитых детей выявило, что через 1 неделю после вакцинации продукция 1L-1 повышается, a IL-2, IL-4 и 1L-12 снижается. Спонтанная продукция IL-10, TNF-a и IFN-y повышается на 7-ой день после вакцинации, а индуцированная - падает через 1 неделю и повышается через 6 недель после прививки. В группе ревакцинированных детей также наблюдался подъем спонтанной и индуцированной продукции 1L -1 и IL -4; спонтанная продукция TNF-a и IFN-y повышалась через 1 неделю и оставалась повышенной через 6 недель после ревакцинации. При оценке ан-тиген-индуцированной продукции цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови привитых детей установлено (Рисунок 5), что у впервые привитых детей добавление антигенов вирусов кори или краснухи не вызывали значимого синтеза цитокинов ни до вакцинации, ни через 1 неделю после нее; через 6 недель отмечалось значимое повышение продукции IL-4, TNF-a и IFN-y в ответ на антигены вирусов кори, а для краснухи - только IFN-y.

В группе ревакцинированных детей антиген-индуцированный синтез цитокинов отмечался еще до ревакцинации, что свидетельствует в пользу присутствия в организме раннее привитых детей антигенспецифичеких Т-клеток памяти. Через 1 неделю, а тем более через 6 недель после ревакцинации, синтез цитокинов в ответ на антигены вирусов кори и краснухи усиливался в несколько раз. Уровень продукции цитокинов лимфоцитами периферической крови при стимуляции антигенами вирусов кори и краснухи у впервые привитых и ревакцинированных детей различался на порядок, и в группе ревакцинированных детей спектр цитокинов, отвечающих на вирусные антигены,

был значительно шире, чем у впервые привитых; это свидетельствует в пользу синтеза цитокинов именно антигенспецифическими Т-клетками памяти.

а

Впервые привитые

пг/мп

14.0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0

Индукция антигенами вируса кори

И До прививки в Через 1 недело □ Через 6 недель

IL-1 IL-2 IL-4 IL-10 TNF-a IFN-y

Впервые привитые

пг/мп

14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 • 2,0 0,0 ■

Индукция антигенами вируса краснухи

В До прививки В Через 1 недело □ Через 6 недегь

IL-1 IL-2 IL-4 IL-10 TNF-a IFN-y

в Ревакцинированные

пг/мл

зоо.о

250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0

Индукция антигенами вируса кори

а До прививки В Через 1 недело □ Через 6 недель

-rtn . вяуП _ЛГП Ш

I I 1 1

ш

IL-1 IL-2 IL-4 IL-10 TNF-a IFN-y

Ревакцинированные

пг/мп

300,0 250,0 200,0 150.0 100,0 50,0 0,0

Индукция антигенами вируса краснухи

И До прививки

□ Через 1 недело

□ Через 6 недел>

япгГ\ . ВЫ I __сО

IL-1 IL-2 IL-4 IL-10 TNF-a IFN-y

Рисунок 5 Антиген-индуцированная продукция цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови детей, привитых вакциной Приорикс. * - р < 0,05 по сравнению со спонтанным уровнем продукции.

При оценке специфически индуцированной дегрануляции цитотоксиче-ских клеток у впервые привитых и ревакцинированных детей отмечено, что спонтанный уровень дегрануляции CD8hlgh лимфоцитов во всех группах детей не превышал 1% (Рисунок 6). Антиген-индуцированная дегрануляция CD8h'8h клеток у впервые привитых детей как до вакцинации, так и через неделю после нее не отличалась от спонтанного уровня; через 6 недель после вакцинации было обнаружено значимое (р < 0,001) повышение количества дегранулировавших CD8h'sh лимфоцитов как при добавлении антигенов вируса кори, так и вируса краснухи. Перед ревакцинацией уровень специфической дегрануляции CD8hl!!h клеток был значимо ниже, чем у первично привитых детей через 6 недель после прививки (р < 0,01). Через 7 дней после ревакцинации обнаружено статистически значимое (р < 0,05) повышение процента дегранулировавших CD8hll!h клеток как в ответ на антигены вируса кори, так и краснухи, через 6 недель после ревакцинации выявлена тенденция к снижению дегрануляции.

Впервые привитые

0 До прививки В Через 1 неделю □ Через 6 недель

Fib

Среда

Аг корь Аг краснуха

Ревакцинированные

ИДо прививки а Через 1 неделю □ Через 6 недель

Среда Аг корь Аг краснуха

Рисунок 6 Антиген-индуцированная дегрануляция CD8h'8h лимфоцитов периферической крови детей, привитых вакциной Приорикс.

В группе давно переболевших корью и краснухой взрослых обнаружено значимое количество CD8hlsl1 клеток, отвечающих дегрануляцией на добавление в культуру лимфоцитов антигенов кори или краснухи. Для оценки специфичности и чувствительности метода специфической дегрануляции CD8h'8h клеток на антигены вирусов кори или краснухи был проведен ROC-анализ полученных данных (Рисунок 7). По результатам теста дегрануляции CD8h,gh клеток можно с вероятностью 98,2% для антигенов кори и 99,7% для антигенов краснухи прогнозировать наличие специфического клеточного иммунного ответа на антигены указанных вирусов при превышении процента дегрануляции 2,005% при стимуляции антигенами вирусов кори и 1,77% для вирусов краснухи.

1 - Специфичность

Площадь под ROC-кривой АИС(С1), р<0,05 Пороговое значение дегрануляции CD8high клеток. % Чув-стви-тель-ность Спсци цифич фич- ность

Аг кори 0,982 (0,9581,006) 2,005 90% 100%

Аг краснухи 0,997 (0,9921,001) 1,77 95,7 % 98,6%

Рисунок 7 ЯОС-анализ результатов теста дегрануляции С08Н1В'' клеток на антигены вирусов кори или краснухи.

Математическое моделирование процессов формирования и поддержания иммунологической памяти у детей, привитых Приорикс

Исходя из концепции о связи различных параметров иммунной системы с результатами вакцинации, на первом этапе наших исследований в качестве потенциальных маркеров-предикторов результативности прививки Приорикс были выбраны параметры, входящие в классический иммунный статус (количество лейкоцитов и лимфоцитов, абсолютные и относительные количества субпопуляций CD3\ CD3+CD4\ CD3+CD8+, CD3"CD19+ CD3"CD16/56\ и общее количество IgM, IgG и IgA), а также содержание в сыворотке трех наиболее часто исследуемых цитокинов-маркеров Thl- и ТЬ2-типа иммунного ответа IFN-y, IL-4 и провоспалительного цитокина TNF-a. Всего было проанализировано 19 параметров до вакцинации, через I неделю и через 4 недели после прививки. Для оценки результата вакцинации были использованы данные о количестве специфических сывороточных антител против антигенов вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита класса IgG и субклассов специфических антител: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, измеренные через 4 недели и через 1 год после вакцинации. Используя метод прогнозирования с помощью байесовских сетей, были выявлены 7 предикторов для предсказания формирования защитного уровня специфических антител через 4 недели после прививки Приорикс против вирусов краснухи [IFN-y], [CD3+], [лимфоциты%], [CD19+%], [TNF-a], [IgM] и [IL-4], 7 предикторов для аналогичного прогнозирования для иммунного ответа на вирусы эпидемического паротита [IFN-y], [CD3+], [лимфоциты], [CD19+%], [CD3+CD8*%], [CD3+CD4*%] и [CD3+%] и 4 предиктора для вирусов кори [CD3+CD4+], [CD3"CD16/56+], [IgA] и [IL-4], Оценка качества прогнозирования методом jf продемонстрировала высокий уровень значимости (р < 0,05) на независимой выборке привитых. Предложенный метод оценки эффективности прививки позволяет еще до вакцинации из общего контингента привитых выделить когорту лиц, попадающих в группу риска, то есть угрожаемых по отсутствию защитных уровней специфических антител через месяц после прививки (первичные вакцинальные неудачи). Таких людей, по статистике, 5-10%.

С помощью многомерного корреляционного анализа были выявлены 3 предиктора поддержания защитного уровня антител через 1 год после прививки для вирусов эпидемического паротита [IL-4], [TNF-a] и [IgA] и 2 предиктора для вирусов кори [IL-4] и [лимфоциты]. Для вирусов краснухи такие расчеты не проводили, т.к. ни один ребенок из исследованной когорты не продемонстрировал снижения противокраснушных антител ниже защитного уровня через 1 год после прививки. Для каждого из предикторов был определен пороговый критерий cut off. Для вирусов эпидемического паротита имеем следующую классификацию:

• Если [IgA] < 0,45 мг/мл, [IL-4] < 1,5 пг/мл, [TNF-a] < 0,6 пг/мл, то, скорее всего, через 1 год антитела к эпидемическому паротиту будут ниже защитного уровня.

• Если [IgA] > 0,65 мг/мл или [IL-4] > 3 пг/мл или [TNF-a] > 0,7 пг/мл, то, скорее всего, через 1 год антитела к эпидемическому паротиту будут выше защитного уровня.

• Если 0,45 мг/мл < [IgA] < 0,65 мг/мл, 1,5 пг/мл < [IL-4] < 3 пг/мл, 0,6 пг/мл < [TNF-a] < 0,7 пг/мл, то результат вакцинации через 1 год попадет в "серую зону".

Для вирусов кори значения cut off выглядят следующим образом:

• Если [IL-4] < 2,0 пг/мл и [лимфоциты] < 5000 в мм5 то, скорее всего, через 1 год после вакцинации будет снижение противокоревых IgG.

• Если [IL-4] > 2,0 пг/мл или [лимфоциты] > 5000 в мм3, то, скорее всего, через 1 год после вакцинации будет отмечаться стабильный результат или подъем количества специфических IgG против кори.

Предложенный метод позволяет еще до прививки выделить когорту лиц (группу риска), угрожаемых по быстрому снижению уровней антител в крови ниже защитного (вторичные вакцинальные неудачи). Такие люди составляют примерно 10% от общего количества привитых.

Качество прогноза, оцененное методом jf на независимой выборке привитых, также было значимым (р < 0,05).

Попытка спрогнозировать абсолютное количество специфических антител, образовавшихся через 4 недели и 1 год после прививки, методом главных компонент оказалась неудачной, поскольку было выявлено, что параметры иммунного статуса связаны между собой и иммунная система реагирует как целостная система, а не как некая сумма отдельных параметров. Тем не менее, применив регрессионный анализ, нам удалось выделить 6 параметров для прогнозирования количества специфических противокоревых IgG через 4 недели после прививки, 2 параметра для прогнозирования количества антител против краснухи и 5 параметров для прогнозирования уровня специфических IgG против вируса эпидемического паротита. Используя коэффициенты, рассчитанные для этих параметров в результате регрессионного анализа, были предложены 3 формулы, позволяющие по исходным значениям выбранных показателей иммунного статуса рассчитать количества специфических IgG антител против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита, которые образуются через 4 недели после прививки.

[IgG корь] = -2,25 + 0,031 [CD3+%] + 0,064[CD3"CDI6/56+%] + 0,244[TNF-a] -0,417[IgM] + 0,042[IgG] + 0,008[лимфоциты%]

[IgG краснуха] = 66,443 - 5,412[IgG] + 23,834[IgM]

[IgG паротит] = - 9,537 - 3,812[CD3+8+%] - 0,041 [CD3"CD16/56+] + 5,105[CD3"CD 16/56+%] + 2,374[CD3+%] - l,363[CD3+4+%]

Качество прогнозирования, оцененное на независимой выборке привитых детей, оказалось вполне удовлетворительным. Расчет прогнозируемого

количества специфических антител к антигенам вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита предложено использовать как вспомогательный к методу оценки вероятности результатов вакцинации с помощью Байесовской сети, особенно в тех случаях, когда прогнозируемая вероятность неудачной вакцинации (нет защитных уровней специфических антител) близка к 50:50.

Спрогнозированные с помощью разработанных моделей результаты вакцинации для детей группы 3, привитых одновременно с инъекцией иммуно-корректора полиоксидоний были сопоставлены с реально полученными у этих детей значениями уровней специфических IgG против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита как через 4 недели, так и через год после прививки. Проверка гипотезы о неслучайном распределении реальных и предсказанных результатов вакцинации дала значимые результаты (р < 0,05).

На основании проведенного математического анализа был предложен конструктивный алгоритм прогнозирования и выявления первичных и вторичных вакцинальных неудач, а также принятия решений проведения специфической иммунопрофилактики у детей из групп риска (Рисунок 8). Для реализации алгоритма следует:

1. Перед вакцинацией провести лабораторное исследование иммунного статуса, включающее в себя определение абсолютного и относительного количества лимфоцитов, их субпопуляций CD3\ CD3+CD4+, CD3+CD8\ CD 19", общих иммуноглобулинов классов М, G, А и концентрации сывороточных цитокинов TNF-a, IL-4 и IFN-y.

2. Опрашивая байесовскую сеть по результатам анализа, выделить лиц, прогнозируемых как первичные вакцинальные неудачи (прогнозируемый уровень специфических антител через 4 недели после прививки ниже защитного).

3. Выделенную когорту «вероятных первичных вакцинальных неудач» необходимо привить и вызвать на контроль через 1-2 месяца после прививки для оценки реального уровня специфических антител. Такая тактика существенно облегчает поиск незащищенных в результате прививки людей и снижает нагрузку на лабораторию.

4. Если лабораторно подтверждена реальная вакцинальная неудача - повторить обследование через 1 год, если специфические антитела так и не появились, решить вопрос о дополнительной ревакцинации индивидуально.

5. Среди лиц, способных выработать, согласно прогнозу, защитные уровни специфических антител через 4 недели после прививки, на основании значений порогового критерия cut off следует выделить лиц, относящихся к группе риска, то есть угрожаемых по быстрой потере защитных уровней антител (вторичные вакцинальные неудачи).

6. Всех, для кого оба прогноза оказались удачными - привить и отпустить на 5 лет до срока положенной по графику ревакцинации.

7. Когорту людей, для которых спрогнозирован риск вторичных вакцинальных неудач, необходимо привить и пригласить для оценки эффек-

тивности прививки через 1 год для контроля наличия защитных уровней специфических антител.

8. В случае наличия защитного уровня антител - повторить контроль через 2 года.

9. В случае утери защитных уровней антител - решить вопрос о дополнительной ревакцинации индивидуально.

Рисунок 8 Блок-схема алгоритма прогнозирования и принятия решений при первичных и вторичных вакцинальных неудачах

Своевременное выявление когорты лиц, угрожаемых по первичной или вторичной вакцинальной неудаче, позволяет рассматривать вопрос об индивидуальном подходе к вакцинации для этих людей. Одним из вариантов решения проблемы невысокого или нестойкого иммунного ответа на прививку может быть использование иммунокорректора, например полиоксидония, одновременно с вакцинацией. В нашей работе было показано, что у детей, привитых одновременно с инъекцией полиоксидония, количество антител было значимо более высоким, чем у группы сравнения. Другой вариант - составление индивидуального графика ревакцинаций. Сроки и количество ре-

вакцинаций - это некая средняя по популяции, однако, возможно людям, относящимся к группам риска, то есть склонным давать низкий или нестойкий антительный ответ на прививку, необходима дополнительная, закрепляющая (или поддерживающая) ревакцинация. Третий немаловажный момент, таким людям нужно проверять специфический клеточный иммунитет.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенных нами исследований было показано, что на введение антигенов вакцины Приорикс иммунная система реагирует именно как целостная система. Несмотря на то, что не было отмечено каких-либо осложнений от прививки у наблюдаемой нами когорты детей, результаты исследований свидетельствуют, что при вакцинации вся иммунная система приходит в движение. Иммунная система - саморегулирующаяся, хорошо сбалансированная и многократно защищенная от возможных нарушений система. Тем не менее, при введении антигенов происходят, да и должны происходить, отклонения ее параметров от состояния «нормы покоя» к состоянию «нормы реакции» иммунной системы на прививку. Так, мы наблюдали снижение или, напротив, повышение количества лимфоцитов некоторых субпопуляций, провоспалительных цитокинов, общего ^Е в крови привитых детей. За счет механизмов контроля и саморегуляции эти отклонения самопроизвольно возвращались к исходному уровню через месяц-полтора после прививки. Но любое исследование включает лишь малую выборку из всех прививаемых детей. На уровне генеральной совокупности начинают работать законы больших чисел, следовательно, можно предположить, что обязательно найдется некое количество людей, у которых, по разным причинам, механизмы контроля и саморегуляции могут оказаться несостоятельными. В этом случае отклонения, которые мы наблюдаем как «норму реакции» иммунитета на прививку, могут трансформироваться в «норму патологии» развившихся осложнений после прививки. Транзиторное снижение количества лимфоцитов основных субпопуляций в крови привитых может обернуться повышенной чувствительностью к интеркурентным заболеваниям. Излишнее повышение продукции провоспалительных или снижение противовоспалительных цитокинов может реализоваться в температурную реакцию на прививку. Слишком интенсивное повышение ТЫ7 или недостаточная активность Treg и других супрессорных субпопуляций может развернуться в аутоиммунную патологию, а дисбаланс в регуляции ТЫ/ТЬ2 хел-перов может привести к реализации аллергической реакции, особенно у лиц с соответствующей предрасположенностью. Различия в реакциях отдельных индивидуумов могут быть связаны как с генетической составляющей, так и с действием факторов окружающей среды. Из всего вышесказанного можно сделать вывод, что даже если нам удастся сделать идеальную вакцину, а к этому, конечно, нужно стремиться, то и такая вакцина не даст 100% гарантии безопасности вакцинации. Если мы вводим вакцину, то иммунная система должна ответить на нее, а значит должны возникнуть отклонения, та самая

«норма реакции» иммунитета. Как бы хороша ни была вакцина, всегда найдутся организмы, в которых, по ряду вышеперечисленных причин, возникнут нарушения саморегуляции и проявятся нежелательные явления, трактуемые как осложнения. Если какое-то нежелательное событие может случиться, то есть вероятность его более 0, то, с одной стороны, мы должны минимизировать риски наступления этого события (сюда следует отнести более ответственный подход врача к оценке состояния ребенка до прививки), а с другой стороны, быть готовым к тому, что такое может случиться (сюда бы я отнесла более тщательное наблюдение за привитым не только в первые минуты, но и месяц-полтора после вакцинации).

В результате проведенных нами исследований было показано, что вакцина Приорикс высокоэффективна, так как дает высокий процент серокон-версий в ответ на все три вируса, входящие в ее состав. Несмотря на это, были выявлены отдельные дети, не развившие защитных антител на тот или иной вирус вакцины. Так, были дети, дающие высокий ответ на все три компонента, хорошо ответившие на два, или один из трех вирусов, тогда как на остальные вирусы ответ либо вовсе отсутствовал, либо определялись следы специфических антител ниже защитного уровня. Сходные результаты были получены и при оценке специфического клеточного иммунного ответа. У некоторых детей результаты тестирования практически не отличались от значений cut off, тогда как у других превышали пороговый уровень в несколько раз. У отдельных детей наблюдалось превалирование специфического гуморального или клеточного ответа, но подавляющее большинство имело в равной степени и тот и другой тип ответа. Следовательно, можно предполагать, что даже если нам удастся создать идеальную вакцину, даже она не сможет обеспечить на 100% эффективную защиту. Всегда найдутся индивидуумы, у которых в силу генетической предрасположенности или воздействий факторов среды не разовьется защитный иммунитет на прививку. Формирующаяся в результате работы адаптивного иммунного ответа иммунологическая память включает в себя Т- и В-клеточное звено. Каждое из этих звеньев состоит из центральных и эффекторных клеток памяти. Так, Т-эффекторы находятся преимущественно в тканях и при повторном попадании антигена в организм любая антигенпрезентирующая клетка, находящаяся рядом, способна быстро представить им антиген и активизировать их цитотоксическую и цитокин-продуцирующую функцию. Если антигена попало в организм немного, то этим все и заканчивается, если же это массированное инфицирование, или за долгие годы после прививки количество специфических к данному антигену Т-эффекторов памяти истощилось, то в дело включаются центральные клетки памяти. Сами они практически не обладают цитотоксическими свойствами, но активно пролиферируют в ответ на антиген и формируют новый пул Т-эффекторов, способных выполнять цитотоксическую функцию в ответ на данный антиген. Подобным образом работает и В-клеточное звено иммунной памяти. В этом случае клетками-эффекторами являются плазмоциты (PC), синтезирующие антитела. Долгие годы PC способны выживать в костном мозге и селезенке, продуцируя защитные антитела. Однако, поскольку ниша

для гомеостатической поддержки РС ограничена, все новые РС, образующиеся на последующие инфекционные атаки, постепенно вытесняют ранее образовавшиеся РС. Постепенно уровень антител снижается и может упасть ниже защитных титров, что мы наблюдали у вакцинированных в детстве взрослых, заболевших корью. В этой ситуации очень важна роль сформированных при вакцинации Вт - центрального звена В-клеточной памяти. До тех пор, пока в организме присутствовали защитные антитела, Вт не активизировались, но как только при повторном попадании антигена в иммунный организм сниженного уровня антител не хватило для блокировки всех внедрившихся вирусов, Вт активизируются, бурно пролиферируют и образуют новые плазмоциты, синтезирующие новые антитела. Этот процесс при вторичном иммунном ответе идет намного быстрее, чем при первичном, однако все-таки требует некоторого времени. За это время вирус успевает внедриться и размножиться. Конечно, быстрый и сильный прирост высокоавидных антител прерывает возможность вирусов выходить в жидкие среды организма и таким путем заражать новые клетки, но нужно помнить, что на поверхности зараженных клеток остались оболочки внедрившихся вирусов, содержащие, кроме всего прочего, и белок слияния (Р-протеин). Этот белок способен осуществить слияние инфицированной и интактной клетки организма. Таким образом, вирус имеет возможность, пусть намного медленнее, чем при выходе в жидкие среды организма, но продолжать развиваться. Для остановки этого пути развития заболевания необходимо подключение специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, которые избирательно уничтожают зараженные клетки организма вместе со всеми находящимися в них вирусами. Таким образом, можно утверждать, что разные звенья иммунологической памяти не просто дублируют друг друга, а выполняют разные функции. Задачи эффекторных Т- и В-клеток различаются. Так, специфические антитела связывают вирус даже еще до внедрения в организм, например, секреторные 1§А в слизи, или сразу при инфицировании, не давая ему внедриться в клетки организма-хозяина. В то же время, Т-эффекторы осуществляют свою активность уже после внедрения вируса в клетки хозяина, т.к. способны распознать и уничтожить такие зараженные клетки. Центральные Т- и В-лимфоциты памяти являются своеобразным резервом адаптивного иммунитета. Если по каким-либо причинам Т- и В-эффекторы не справляются - подключаются центральные резервы и продуцируют пополнение Т-эффекторов и плазмоцитов. В результате, привитой человек даже утерявший в процессе жизни защитный титр антител, хотя и заболевает при повторном контакте с вирусом, но болеет чаще нетяжелыми, атипичными и даже стертыми формами, поскольку имеющиеся в его организме центральные Т- и В-клетки памяти способны в короткие сроки наладить адекватную защиту.

Для решения задачи повышения эффективности прививки весьма перспективным представляется стратегия выявления когорты лиц, угрожаемых по развитию первичной или вторичной вакцинальной неудачи еще до проведения вакцинации на основании анализа иммунологического статуса ребенка. Имея четкие критерии такого выделения, можно стандартно прививать не

попавших в группы риска, а тех, у кого была спрогнозирована потенциальная первичная или вторичная вакцинальная неудача, следует прививать по индивидуальному графику с обязательным мониторированием количества образовавшихся после прививки специфических антител. В результате нашей работы удалось выделить показатели иммунного статуса детей до вакцинации в качестве прогностических критериев, позволяющих предсказать первичные или вторичные вакцинальные неудачи. Предложенный нами алгоритм позволяет своевременно выявлять детей, угрожаемых по низкому и непродолжительному иммунному ответу на прививки. На основании проведенных нами исследований результатов однократного введения полиоксидония одновременно с прививкой было выявлено, что у детей с исходно сниженными показателями иммунного статуса использование иммунокорректора приводило к повышению количества специфических антител на антигены вакцины. Основываясь на этом наблюдении, предложено использовать полиоксидоний одновременно с вакцинацией для группы детей, спрогнозированных как возможные первичные или вторичные вакцинальные неудачи. Другим возможным вариантом коррекции низкого или нестойкого иммунного ответа на прививку является введение для таких детей дополнительной бустирующей дозы вакцины. Оба предложенных варианта требуют дополнительного исследования и наблюдения. Разработанный нами алгоритм прогнозирования первичных и вторичных вакцинальных неудач позволит выделить когорту угрожаемых лиц из общей массы прививаемых детей до вакцинации и оценить влияние той или другой тактики ведения на высоту и длительность поддержания защитного иммунитета. Другой более фундаментальной задачей является изучение регуляторной функции иммунной системы и возможности воздействия на нее. Полученные в результате новые знания позволят разработать новые физиологичные методы повышения эффективности и безопасности вакцинации.

ВЫВОДЫ:

1. В группе здоровых детей показатели иммунного статуса соответствовали возрастной норме, а в группе «иммунокомпрометированных» детей были значимо снижены. Направленность количественных изменений в составе основных субпопуляций лимфоцитов после вакцинации определяется исходным состоянием иммунной системы и обусловлена либо перераспределением лимфоцитов из крови в лимфоидные органы, либо активацией лимфоцитов в ответ на антиген и формированием иммунологической памяти.

2. Вакцинация Приорикс не сопровождается аллергизацией детей, не имевших ранее аллергических реакций, что подтверждается отсутствием повышения у них 1Ь-5, транзиторное повышение общих 1§Е у детей с атопическим дерматитом и ответивших на вакцинацию по типу ТИ2

нормализуется через месяц после вакцинации без клинических проявлений обострения аллергии.

3. Транзиторное повышение количества Th 17 и их основного цитокина 1L-17А в крови привитых возвращается к исходному уровню через 6 недель после прививки без каких-либо клинических проявлений, вероятно, благодаря своевременному включению регуляторных механизмов иммунного ответа.

4. При вакцинации Приориксом, гуморальный иммунный ответ формируется неравномерно на компоненты вакцины. Максимальный ответ наблюдался на антигены вируса краснухи, среднее положение занимал ответ на вирус кори, наихудшие параметры продемонстрировал гуморальный иммунный ответ на вирус эпидемического паротита. Это выражалось в проценте сероконверсий, количестве специфических IgG-антител, их авидности и продолжительности сохранения защитных уровней антител во времени.

5. В процессе созревания специфического гуморального иммунного ответа происходит переключение субклассов специфических антител с IgG3 на IgGI. Клетки памяти продуцируют, в основном, антитела IgGl. Вирус кори способен тормозить процесс переключения субклассов специфичных к нему антител. Доказано, что по спектру субклассов с вероятностью более 95% можно разделить первичный и вторичный иммунный ответ, независимо от способа его индукции (инфекция или вакцинация). Спектр субклассов специфических IgG зависит от вида антигена, возраста прививаемого и срока, прошедшего с момента прививки.

6. При потере защитных уровней антител активация сохранившихся специфических В клеток памяти способна быстро, но не мгновенно, произвести большое количество высокоавидных антител преимущественно IgGl-субкласса. Это приводит к тому, что ранее привитой человек может заболеть при контакте с диким вирусом, но, благодаря быстрой реакции клеток иммунной памяти, будет болеть нетяжелыми, стертыми формами заболевания.

7. Оценка количества и функциональной активности Т-клеток памяти в реакции антиген-индуцированного пролиферативного ответа на антигены вирусов кори и краснухи, индукции продукции цитокинов антигенами этих вирусов (функция Т-хелперов памяти) и реакции специфически индуцированной дегрануляции цитотоксических CD8hl лимфоцитов (эф-фекторные Т-клетки памяти) позволила с вероятностью более 98% определить наличие или отсутствие специфического клеточного иммунного ответа. Эти специфические Т-клетки памяти способны длительно сохраняться в иммунном организме.

8. Выявлены прямые корреляции между отдельными звеньями специфического гуморального ответа на три составных вируса вакцины, а также между различными звеньями специфического клеточного иммунного ответа, и обратные (отрицательные) корреляционные связи между звеньями специфического гуморального и клеточного иммунного ответа.

9. Применение полиоксидония одновременно с вакцинацией в группе «им-мунокомпрометированных» детей увеличивает количество специфических антител на все три компонента вакцины до уровня группы здоровых детей без нарушения их состояния здоровья.

10.Методами математического моделирования выявлены предикторы (параметры иммунного статуса), позволяющие с 95% вероятностью прогнозировать полноценность формирования гуморального иммунного ответа через 4 недели после прививки и поддержание в течение 1 года защитных уровней специфических lgG-антител на вакцину Приорикс. Предложены формулы для расчета абсолютного количество специфических IgG-антител, образующихся через 4 недели после прививки против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита.

11. Разработан алгоритм, позволяющий до проведения вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита прогнозировать формирование первичных (отсутствие защитных уровней антител через 4 недели после прививки) и вторичных (истощение уровня специфических антител через 1 год после вакцинации) вакцинальных неудач для подбора индивидуальных схем вакцинации детям из этих групп риска.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ

На основании проведенных исследований можно предложить следующие практические рекомендации:

1. Рекомендовать использовать метод оценки соотношения IgGl- и IgG3-субклассов специфических антител к антигенам вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита для разделения первичного и вторичного иммунного ответа у привитых или больных этими инфекциями. Для этого следует использовать значения порогового критерия cut off, представленные в Таблице. Это позволит четко определить, был ли данный больной с неясным прививочным анамнезом действительно привит в детстве и со временем утерял защитные антитела (такой больной отвечает на инфекцию по типу вторичного иммунного ответа), либо он не был реально привит и отвечает на инфекцию первичным иммунным ответом, что важно для анализа структуры заболеваемости.

Таблица 4 Значения порогового критерия cut off IgGl- и IgG3-cy6icnaccoB специфических антител к вирусам кори, краснухи и эпидемического паротита для разделения на первичный и вторичный тип иммунного ответа_

Субклассы IgG Пороговое значение количества IgGl (cut off)% Пороговое значение количества lgG3 (cut off) %

Корь 48,06 43,3

Краснуха 62,76 18,63

Эпидемический паротит 55,0 37,3

Если процент специфических антител субкласса IgGl от общего количества антител на данный антиген составляет менее значения cut off, а процент антител субкласса IgG3 - более значения cut off, то с вероятностью более 99% -это первичный иммунный ответ. Если, напротив, процент специфических IgGl больше значения cut off, а для lgG3 - меньше cut off, то это - вторичный тип иммунного ответа.

2. Рекомендовать использовать для оценки специфического клеточного иммунного ответа на антигены кори и краснухи тест специфически индуцированной дегрануляции CD8h' лимфоцитов. Этот тест не рестрикти-рован по HLA, прост в использовании и дает результат на следующий день после постановки. Для интерпретации результатов следует использовать значения порогового критерия cut off и «серой зоны», которые составили для антигенов вирусов кори, 2,005% (1,17-2,035%) и для антигенов вирусов краснухи 1,77% (1,305-2,015%). Если полученные результаты теста превышают значение cut off, то с вероятностью 98% это свидетельствует о наличии специфического клеточного иммунного ответа на данный антиген, тем более сильного, чем выше процент дегранулирую-щих лимфоцитов. При превышении границы серой зоны правильность предсказания доходит до 100%.

3. Рекомендовать использовать разработанный нами конструктивный алгоритм, позволяющий на основании значений показателей иммунного статуса, определенных до вакцинации, выявить лиц группы риска, предрасположенных к низкому или непродолжительному гуморальному иммунному ответу на прививку против кори, краснухи и эпидемического паротита, с целью подбора для них индивидуальных схем вакцинации и ревакцинации.

4. Рекомендовать использовать иммунокорректор полиоксидоний в дозе 3 мг в/м однократно одновременно с введением вакцины Приорикс у детей со сниженными показателями иммунного статуса из групп риска с целью повышения уровня специфических антител на антигены вакцины.

В качестве перспектив проведенного исследования мы предполагаем на основе разработанного алгоритма выявить до прививки лиц, угрожаемых по развитию первичной или вторичной вакцинальной неудачи, и привить этих людей с использованием различных иммунокорректоров с целью получить более высокий (защитный) и продолжительный уровень специфических антител на антигены вакцины. Предполагается также прицельно исследовать у таких людей их специфический клеточный иммунный ответ на антигены вакцины, а также исследовать перспективу введения дополнительной бусти-рующей ревакцинации для лиц с вторичными вакцинальными неудачами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Топтыгина, А.П. Влияние вакцинации детей живыми вирусными вакцинами на дифференцировку Т- хелперов. Изменение соотношений

Thl/Th2. / А.П. Топтыгина, Н.А. Солдатенкова, Т.А. Мамаева, С.Н. Ко-каровцева, В.А. Алешкин, A.J1. Пухапьский // 5 конгресс РААКИ «Современные пробемы аллергологии, иммунологии и иммунофармаколо-гии»: сб. тр. - М. 2002. - С. 602.

2. Pukhalsky, A.L. Cytokine profile after rubella vaccine inoculation: evidence of the immunosuppressive effect of vaccination. / A.L. Pukhalsky, G.V. Shmarina, M.S. Bliacher, I.M. Fedorova, A. P. Toptygina. J.J. Fisenko, V.A. Alioshkin //. Médiat. Inflamm. - 2003. -V.12(4). — P.203-207.

3. Топтыгина, А.П. Особенности гуморального ответа на коревые антигены у детей, привитых вакциной «Приорикс» /А.П. Топтыгина, Н.А. Солдатенкова, Т.А. Мамаева, В.А. Алешкин, А.Л. Пухапьский// 2 Конгресс педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей»: сб. тр. - М., 2003. - С. 195.

4. Топтыгина. А.П. Спектр субклассов протевокоревых иммуноглобулинов G у лиц, перенесших корь / А.П. Топтыгина, А.Л. Пухальский, Т.А. Мамаева, В.А. Алешкин // Бюлл. экспер. биол. - 2004. - Т. 137(3).-С. 293-295.

5. Топтыгина, А.П. Иммуномодулирующие эффекты живой вирусной вакцины «Приорикс» / А.П. Топтыгина, А.Л. Пухальский, М.С. Бляхер, Н.А. Солдатенкова, В.А. Алешкин // 3-й конгресс педиатров-инфекционистов России: сб. тр. М., 2004 г. - С. 229.

6. Топтыгина. А.П. Отсутствие специфических антител, относящихся к субклассу IgG2, у детей моложе 3 лет, привитых живыми вирусными вакцинами. / А.П. Топтыгина, Т.А. Мамаева, В.А. Алешкин, А.Л. Пухальский // Тезисы. Объединенный Иммунологический Форум, г. Екатеринбург, 31.05-04.06 2004 r.Russian Journal of Immunology. - 2004. - V. 9,- Suppl. l.-P. 339.

7. Топтыгина, А.П. Оценка изменения соотношения Thl/Th2 в процессе формирования первичного иммунного ответа на вирусные антигены у детей. / А.П. Топтыгина, Н.А. Солдатенкова, А.Л. Пухальский, В.А. Алешкин //Тезисы. VIII Всероссийский форум им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» г. С-Петербург 27-30 сентября 2004 г. Медицинская иммунология. - 2004. - Т.6(3-5). - С. 341.

8. Toptygina. А.Р. IgG subclass profile of antimeasles response in vaccinated children and adults with measles history. / A.P. Toptygina, A.L. Pukhalsky, V.A. Alioshkin // Clin. Diag. Lab. Immunol. - 2005. - V.12 (7). -P. 845-847.

9. Топтыгина, А.П. Сравнительные изменения показателей иммунного статуса у здоровых и иммунокомпрометированных детей после введения живой вирусной вакцины «Приорикс». / А.П. Топтыгина, АЛ. Пухальский, М.С. Бляхер, Н.А. Солдатенкова, В.А. Алешкин // Иммунология - 2005. - Т.26(5). - С. 317-318.

Ю.Топтыгина. А.П. Использование иммунокорректора полиоксидония при иммунизации детей вакциной «Приорикс». / А.П. Топтыгина,

H.A. Солдатенкова, B.A. Алешкин // Иммунология - 2005. - Т. 26(5). -С. 308-311.

I 1 .Toptygina, А.P. A poly ion immunostimulant Polioxidonium in children vaccination with Priorix. / A.P. Toptygina, A.L. Pukhalsky, V.A. Alioshkin //Extended abstract Internationa! conference "Immunopotentiators in Modern Vaccines" Malaga, Spain, 18-20 may 2005. - P. 234.

12.Топтыгина. А.П. Влияние полиоксидония на формирование первичного ответа у детей. / А.П. Топтыгина, H.A. Солдатенкова, А.Л. Пухапьский, В.А. Алешкин // Медицинская иммунология - 2005. - Т. 7(2-3). - С.327-328.

I З.Топтыгина. А.П.. Влияние полиоксидония на прививку Приорикс. / А.П. Топтыгина, H.A. Солдатенкова, В.А Алешкин //Тезисы Международного конгресса "Иммунитет и болезни: от теории к терапии" - 2005. - С. 126.

Н.Топтыгина. А.П. Формирование гуморального ответа на прививку Приорикс. / А.П. Топтыгина, В.А Алешкин //Материалы Научно-практической конференции с международным участием «Теоретические и практические аспекты элиминации кори в России», посвященной 145-летию со дня рождения Г.Н. Габричевского: сб. тр. - М.,2005. - С. 135-139.

15.Топтыгина. А.П. Специфический иммунный ответ на прививку живой вирусной вакциной «Приорикс». / А.П. Топтыгина, В.А Алешкин // Вопросы современной педиатрии - 2006. - Т.5( I). - С. 578-579.

16.Топтыгина. А.П. Формирование специфического гуморального ответа на вирусные антигены у детей. / А.П. Топтыгина, В.А Алешкин // Медицинская иммунология - 2006. - Т. 8(2-3). - С. 293-294.

17. Toptygina. A. Immunoglobulin G subclass maturation in children vaccinated with Priorix. / A. Toptygina, V. Alioshkin //Abstract Is1 Joint Meeting of European National Societies of Immunology, Paris, France. - 2006. - P. 97.

18.Топтыгина. А.П. Цитокиновый профиль сыворотки крови детей. / А.П. Топтыгина, А.Ю. Николаева, В.А. Алешкин // Аллергология и Иммунология в Педиатрии - 2006. - Т.9(2-3). - С. 89-90.

19.Топтыгина. А.П. Созревание специфического гуморального иммунитета у детей первых лет жизни. / А.П. Топтыгина, В.А Алешкин // Тезисы V Международного симпозиума «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний». - М., 2006. — С. 63-64.

20.Топтыгина. А.П. Коррекция иммунного ответа на вакцину Приорикс с помощью Полиоксидония. / А.П. Топтыгина, H.A. Солдатенкова, В.А. Алешкин // Аллергология и Иммунология в Педиатрии. - 2006. -Т.8(1). - С.35-38.

21.Топтыгина. А.П. Влияние типа вакцины на направление дифференци-ровки Т-хелперов в процессе иммунного ответа на вакцинацию. / А.П. Топтыгина, В.А Алешкин //Тезисы. Сборник материалов XI Конгресса педиатров России. - М., 2007. - С. 671.

22.Топтыгина, А.П. Влияние вакцинации против гриппа на уровень цито-кинов в сыворотке крови у детей. / А.П. Топтыгина, А.Ю. Николаева,

В.А. Алешкин // Медицинская иммунология - 2007. - Т.9(2-3). - С.251-252.

23.Топтыгина. А.П. Тип вакцины влияет на направление дифференцировки Т-хелперов у привитых детей. / А.П. Топтыгина, В.А Алешкин // Российский аплергологический журнал - 2007. - № 3. - С. 314.

24.Топтыгина. А.П. Тактика проведения профилактических прививок у детей с дерматитами и кишечными дисбактериозами. / А.П. Топтыгина, Н.А. Солдатенкова, Ю.А. Копанев, В.А. Алешкин // Аллергология и Иммунология в Педиатрии.-2007.-Т. 11(2).-С.10-12.

25.Toptygina. А.P. Evaluation of the spécifié immune response to measles and rubella viruses antigens. / A.P. Toptygina, E.L. Semikina, V.A. Alioshkin //Abstracts of the Congress "Immune-Mediated Diseases: from Theory to Therapy" - 2007. - Moscow, Russia. - P. 57.

26.Топтыгина. А.П. Оценка специфического иммунного ответа на антигены вирусов кори и краснухи / А.П. Топтыгина, E.J1. Семикина, В.А. Алешкин // Аллергология и Иммунология в Педиатрии - 2007. - T.l 1, приложение 2. - С. 97.

27.Топтыгина. А.П. Различные способы оценки специфического клеточного иммунного ответа на антигены кори и краснухи. / А.П. Топтыгина, Е.Л. Семикина, В.А. Алешкин // XII Конгресс педиатров России: сб. тр. - М., 2008. - С. 335.

28.Семикина, Е.Л. Экспрессия рецепторов к вирусу кори CD46 и CD150 на лимфоцитах пуповинной крови. / Е.Л. Семикина, А.П. Топтыгина // XII Конгресс педиатров России: сб. тр. - М., 2008. - С. 301-302.

29.Топтыгина. А.П. Анализ иммунофенотипических маркеров Т-регуляторных клеток у детей. / А.П. Топтыгина, Е.Л. Семикина, В.А. Алешкин // Российский иммунологический журнал - 2008. - Т. 2 (11 ). -№2-3.-С. 334.

30.Топтыгина. А.П. Соотношение общих и местных реакций иммунитета у детей первого года жизни. / А.П. Топтыгина, Г.В. Бобылева, В.А Алешкин // Российский иммунологический журнал - 2008. - Т. 2 (II).- № 4. - С. 449-453.

31 • Топтыгина. А.П. Созревание специфического гуморального ответа у детей, привитых вакциной «Приорикс». / А.П. Топтыгина, В.А. Алешкин // Иммунология - 2008. - Т. 29(6). - С.353-356.

32.Топтыгина. А.П. Т-клетки памяти. / А.П. Топтыгина // Иммунология - 2008. - Т. 29(5). - С. 311 -317.

33.Шарова, Н.И. Экспрессия цитокиновых генов и секркция цитоки-нов эпителиальными и лимфоидными клетками тимуса человека. / Н.И. Шарова, А.Д. Донецкова, А.П. Топтыгина. А.Н. Митнн, М.М. Литвинова, О.В. Бурменская, Д.Ю. Трофимов, Г.Т. Сухих, Л.П. Алексеев, А.А. Ярилин // Иммунология - 2008. - Т. 29(6). - С.329-334.

34.Топтыгина. А.П. Формирование клеток памяти на антигены вирусов кори и краснухи у детей, привитых вакциной «Приорикс». / А.П. Топтыги-

на, ЕЛ. Семикина, В.А. Алешкин и Медицинская иммунология - 2009. -Т. 11(4-5).-С. 398.

35.Toptygina. А.Р. Т- cell specific immune response to measles and rubella viruses antigens. / A.P. Toptygina, E.L.Semikina, V.A.Alioshkin // Eur. J. Immunol. -2009. - V. 39.- SI. - P. 256.

36.Toptygina. A.P. Evaluation of the T-cell specific immune response in children vaccinated with priorix. / A.P. Toptygina, E.L.Semikina, V.A.Alioshkin //Abstract 4lh International Conference "Measurement of Antigen Specific Immune Responses" - Mykonos, Greece. - 2010-P.102.

37.Топтыгнна, А.П. Продукция цитокииов у интактных детей и привитых вакциной «Приорикс» в ответ на стимуляцию антигенами вирусов кори и краснухи. / А.П. Топтыгина, В.А Алешкин // Иммунология - 2011. - Т. 32(4). - С. 200-205.

38.Топтыгина, А.П. Экспрессия рецепторов к вирусу кори CD46 и CD150 на лимфоцитах периферической крови детей, привитых Приорикс. / А.П. Топтыгина, ЕЛ. Семикина, В.А. Алешкин // Российский иммунологический журнал-2011.-Т. 5 (14) № 1.-С. 34-38.

39.Топтыгина. А.П. Возрастные особенности фенотипа В-клеток памяти у детей. / А.П. Топтыгина, Е.Л. Семикина, В.А. Алешкин // Медицинская Иммунология - 2011. - Т. 13(4-5). - С. 512.

40.Топтыгина. А.П. Методы оценки специфического Т-клеточного иммунного ответа. / А.П. Топтыгина // Российский аллергологический журнал - 2011. - № 4, вып. I. - С. 382-383.

41 .Топтыгина, А.П. Возрастные особенности формирования гуморального звена иммунного ответа у детей. / А.П. Топтыгина, ЕЛ. Семикина, В.А. Алешкин // Медицинская Иммунология - 2012. - Т. 14(4-5). - С. 289-294.

42.Топтыгнна, А.П. Лимфоидный фолликул - территория иммунного ответа. / А.П. Топтыгина // Иммунология - 2012. - Т.33(3). - С. 162169.

43.Топтыгнна, А.П. Изменение количества Т клеток памяти в ответ на вакцинацию «Приорикс». / А.П. Топтыгина, ЕЛ. Семикина, В.А. Алешкин // Российский иммунологический журнал - 2012. - Т. 6 (15), № 3. - С.253-258.

44.Toptygina, A.P. Influence of an immunopotentiator Polyoxidonium on cytokine profile and antibody production in children vaccinated with Priorix. /А.Р. Toptygina, E.L.Semikina, V.A.Alioshkin // Archives of physiology and biochemistry - 2012. - V. 118(4). - P. 197-203.

45.Топтыгина. А.П. Регуляция иммунного ответа у детей, привитых против кори, краснухи и эпидемического паротита. /А.П. Топтыгина, ЕЛ. Семикина, В.А. Алешкин // Иммунология - 2012. - Т.33(4). -С. 175-179.

46.Toptygina. A. Specific immunoglobulin G subclass spectrum in previously vaccinated and unvaccinated measles convalescents / A. Toptygina, T. Mamaeva, E. Semikina, V. Alioshkin // Abstract 3th Joint Meeting of Europe-

an National Societies of Immunology, Glasgow, GB Immunology. - 2012. -V. 137,- Sappl. 1.-P.645.

47.Топтыгина. А.П. Способ определения специфического клеточного иммунного ответа к антигенам вируса кори и краснухи /А.П. Топтыгина, В. А Алеш кип //Патент на изобретение № 2464571, 20.10.2012.

48.Топтыгина. А.П. Специфический Т-клеточный иммунный ответ. Методы оценки. / А.П. Топтыгина // Вопросы диагностики в педиатрии - 2012. - Т. 4(6). - С. 5-10.

49.Топтыгина. А.П. Неканонические функции В-клеток. / А.П. Топтыгина // Российский иммунологический журнал - 2013. - Т.7 (16). -№1.-С. 17-26.

50.Топтыгина. А.П. Гуморальный иммунный ответ на вирусы кори и краснухи как отражение общих закономерностей формирования специфического иммунного ответа. / А.П. Топтыгина, Т.А. Мамаева, Е.Л. Семикина, В.А. Алешкин // Российский иммунологический журнал - 2013. Т.7 (16).-№2-3.-С. 154-155.

51.Семикина, Е.Л. Возрастные изменения состава субпопуляций В-лимфоцитов крови: анализ абсолютных показателей. / Семикина Е.Л., Копыльцова Е.А., Закиров Р.Ш., Топтыгина А.П. // Российский иммунологический журнал - 2013. - Т.7 (16). -№ 2-3. - С. 134.

52.Топтыгина. А.П. Формирование и поддержание специфического клеточного ответа на вакцинацию «Приорикс». / А.П. Топтыгина, ЕЛ. Семикина, В.А. Алешкин И Иммунология - 2013. - Т. 34(5). - С. 257-261.

53.Топтыгина. А.П. Влияние прививки Приорикс на цитокиновын профиль и уровень сывороточного IgE у здоровых детей и пациентов с атопическим дерматитом. / А.П. Топтыгина, В.А Алешкин // Российский аллергологический журнал - 2013. - № 3. - С. 30-34.

54.Toptygina. А.Р. Specific immunoglobulin G subclass profile for characterization of measles virusinfection in previously vaccinated and unvaccinated persons. / A. Toptygina, T. Mamaeva, E.Semikina, V.AIioshkin // Abstract 5th International Conference "Measurement of Antigen Specific Immune Responses" - Dubrovnik, Croatia - 2013. - P. 42-43.

55.Топтыгина. А.П. Особенности специфического гуморального иммунного ответа против вируса кори. / А.П. Топтыгина, Т.А. Мамаева, В.А. Алешкин // Инфекция и иммунитет - 2013. - Т. 3(3). - С. 243250.

56.Топтыгина. А.П. Сопоставление первичного и вторичного гуморального иммунного ответа на вакцинацию «Приорикс». / А.П. Топтыгина, В.А. Алешкин // Инфекция и иммунитет - 2013. - Т.3(4). - С. 359-364.

57.Топтыгина. А.П. Общие закономерности формирования и поддержания специфического гуморального иммунного ответа на примере

ответа на вирусы кори и краснухи. / А.П. Топтыгина // Инфекция и иммунитет - 2014. - Т. 4(1). — С. 7-14.

58.Тоитыгина, А.П. Возрастная динамика экспрессии изоформ CD45 Т-хелперами и Т-цитотоксическнмн лимфоцитами крови здоровых детей. / А.П. Топтыгина, ЕЛ. Семикина, Е.А. Копыльцова, В.А. Алеш-кин // Иммунология - 2014. - Т.35(4). - С. 229-232.

59.Топтыгина, А.П. Отчего вакцинация не приводит к элиминации корн. / А.П. Топтыгина, Т.А. Мамаева, В.А. Алешкин // Российский нммунологнческий журнал - 2014. - Т.8(17). - № 3. - С.880-883.

60.Топтыгнна, А.П. Прогнозирование специфического гуморального иммунного ответа на основании исходных параметров иммунного статуса детей, привитых против кори, краснухи и эпидемического паротита. / А.П. Топтыгина, В.В. Азиатцева, И.А. Савкин, A.A. Кис-лицин, E.J1. Семикина, Д.С. Гребенников, В.А. Алешкин, A.B. Сули-мов, В.Б. Сулимов, Г.А. Бочаров // Иммунология - 2015. - Т. 36(1). -С. 22-30.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ат - Антитела

Ме - Международные единицы

ОП - Оптическая плотность

свк - Синдром врожденной краснухи

ФГА - Фитогемагглютинин.

AUC - Площадь под кривой.

Вт - В-клетки памяти

CD3.4 ... - Кластеры дифференцировки клеток.

Cut off - Пороговый критерий

FITC - Фенилизотиоцианат (люминофор).

FSC - Прямое светорассеяние

HLA - Антигены главного комплекса гистосовместимости

человека

lFNy - Интерферон у

IgA, D, E, G, M - Иммуноглобулины класса А, О, Е, С, М

lgGl,2,3,4 - Субклассы 1,2,3,4 иммуноглобулинов С

IL-1,2... - Интерлейкин 1,2...

PC - Плазматические клетки

PE - Фикоэритрин

PerCP - Перидинин-хлорофилл-протеин

ROC - Метод характеристических кривых

SSC - Боковое светорассеяние

TGF-ß - Трансформирующий фактор роста Р

Thl,2,17... -Т-хелперы типа 1,2,17...

T 1 m - Т-клетки памяти

TNFot - Фактор некроза опухолей а

Treg - Регуляторные Т-клетки