Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические механизмы нарушения межклеточныхвзаимодействий при бластомогенезе

РГ6 од - 1 ЯНВ 1996

на правах рукописи

Глушков Андрей Николаевич

Иммунологические механизмы нарушения межклеточных взаимодействий при бластомогенезе.

14.00,36. - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск -1995

Работа выполнена в Лаборатории иммунохимии рака при Президиуме Кемеровского научного центра СО РАН и Кемеровской государственной медицинской -академии МЗ РФ.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Б Л/, Клячкин.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук К. В. Гайдуль

Доктор биологических наук. чл.-корр.АЕН РФ H.A. Зорин Доктор медицинских наук M.W. Менделенко

Ведущая организация - Российский государственный медицинский

университет

Защита диссертации состоится " " /-и<.а 199¿ г. е (I/ на заседании диссертационного совета Д 001.01.01. б Институте клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск'- 91, Ядрннцевская, 14.

С диссертацией мо;«но ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН

. г

Автореферат разослан '' '! " 199уг.

Ученый секретарь диссертационного совета л.б.н.

0.Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы На рубеже 70 годов было показано, что наряду с цитотокси-ческими реакциями, направленными на элиминацию опухолевых клеток, в организме появляются сывороточные блокирующие факторы и клетки - супрессоры, тормозящие иммуннное отторжение опухоли (Hellstrom J. et al,1969; Kirchner H. et al,1975).Более того, выяснилось, что иммунная система способна оказывать прямое • стимулирующее действие на рост опухоли (Prehn R., 1972). Таким образом, результатом активации иммунной системы при раке может быть как торможение, так и стимуляция роста опухоли.

Аналогичные явления наблюдаются и в предопухолевый период. Предварительная иммунизация химическими канцерогенами может приводить как к торможению, так и к стимуляции возникновения химически индуцированных опухолей (Peck R. et al, 1971; Curtis G._ et al, 1978).

Стало очевидно,что мы имеем дело не с противоопухолевым иммунитетом в классическом понимании Ф. Бернета (1971), а скорее со сложным явлением иммунорегуляции деления и дифференци-ровки клеток и его нарушениями при бластомогенезе. Поэтому в 80-90-е годы усилия многих ученых были сосредоточены на изучении различных механизмов иммунорегуляции в норме, при регенерации и при опухолевом росте (Нестеренко В.Г.,1980; Бабаева А.Г.,1985; Агеенко А.И., ЕрховВ.С. и др., 1984, 1994; Гувако-■ ваМ. А., Лавровский В. А., 1991; Труфакин В. А., Шмаков А. Н., 1991; Бережная Н.М.,1994; Зорин H.A. и др. 1994; Горлина Н.К. и др. 1995). Большое количество работ посвящено изучению имму-

нохимических механизмов адаптации к органическим ксенобиотикам окружающей среды у животных и человека, в т.ч. на популяционном уровне (Козлов В. А. и др. ,'1991; Ковалев И.Е. и др., 1992; Коненков В. И. и др., 1992; Santella R. et al., 1990; Chagnaud J. et.al., 1991,1993).

Однако, несмотря на значительные достижения в понимании тканевых, клеточных и молекулярных механизмов иммунорегуляции деления и дифференцировки клеток в норме и при бластомогенезе, роль центральных молекул иммунной системы - антител (AT)- осталась наименее изученной. Непонятно, каким образом AT к химическим канцерогенам могут стимулировать возникновение опухолей, неясно, за счет чего AT к опухолевым антигенам (АГ) могут стимулировать деление опухолевых клеток. Неизвестно, существуют ли какие-либо взаимосвязи в иммуногенности химических канцерогенов и опухолевых АГ.

Хорошо известно, что в основе бластомогенеза лежат те или иные нарушения взаимодействий трансформированной клетки с рос-торегулирующими факторами (Сейц И.Ф.,1990; Имянитов E.H. и др.,1992). Появились сообщения об образовании AT к рецепторам факторов роста,продуктам онкогенов и антионкогенов (Тер-Григо-ров B.C. и др.,1989; Angelopoulou К. et al.,1994). По-видимому, одним из механизмов иммуностимуляции бластомогенеза может быть дополнительное нарушение межклеточных взаимодействий AT, специфически конкурирующими с межклеточными лигандами за связывание с рецепторами трансформированных клеток.

Однако, в настоящее время нет целостной научной концепции о нарушениях межклеточных взаимодействий при бластомогенезе антителами. Не изучена или мало изучена иммуногенность молекул

- з -

основных типов межклеточных взаимодействий, имеющих прямое отношение к бластомогенезу у человека: химических канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов (ПАУ); рецепторов гуморальных факторов роста; молекул межклеточных контактов; молекул адгезии к внеклеточному матриксу. Разработка такой концепции необходима для углубления наших знаний о механизмах иммунорегуляции'межклеточных взаимодействий в норме, при регенерации и при бластомогенезе, а также для создания новых методов иммунодиагностики и иммунотерапии опухолевых заболеваний.

Цель работы .

Изучение иммуногенности молекул межклеточных взаимодействий и разработка концепции о нарушениях межклеточных взаимодействий антителами при бластомогенезе.

Задачи исследования

1. Изучить иммуногенность бензантрацена, представителя канцерогенов группы ПАУ, при бластомогенезе у человека по способности к образованию АТ к нему с учетом их изотипа у больных раком.

2. Исследовать иммуногенность опухолевых АГ по их способности к образованию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) с АТ у больных раком.

3. Установить, обладают ли иммуногенностью рецепторы гуморальных факторов роста (эпидермального и тромбоцитарного) у больных раком по их способности к образованию ЦИК с АТ.

4. Изучить иммуногенность раково-эмбрионального антигена (РЭА), представителя молекул межклеточных контактов, по его способности к образованию ЦИК с АТ у больных раком.

5. Установить, образуются ли у больных раком АТ, влияющие на адгезию опухолевых клеток к внеклеточному матриксу (стеклу, фибронектину). .

6. Исследовать взаимосвязи между иммуногенностью бензант-рацена и РЭА у больных раком.

7. Изучить особенности иммуногенности бензантрацена и РЭА у больных раком с разными формами течения болезни (прогресс и регресс опухоли).

8. Обосновать возможную роль АТ к молекулам межклеточных взаимодействий при бластомогенезе у человека.

Основные положения, -выносимые на защиту

1.Иммуногенность канцерогенов группы ПАУ различна у больных раком различного гистогенеза и разной формы течения болезни, что проявляется в разной частоте обнаружения отдельных, классов АТ к бензантрацену; соответствующие антиидиотипы могут как стимулировать, так и угнетать образование антител к ПАУ.

2. У некоторых больных раком рецептор эпидермального фактора роста (Р - ЭФР) становится иммуногенным. Это проявляется в образовании АТ к Р-ЭФР и формировании ЦИК, содержащих Р-ЭФР и специфичные к нему АТ.

3.Иммуногенность РЭА, как молекулы межклеточных контактов, различна у больных раком разного гистогенеза и разной формы

течения болезни, что проявляется в различной способности к образованию ЦИК с АТ.

4.У ряда больных раком молекулы адгезии клеток к внеклеточному матриксу приобретают иммуногенность, что выражается в образовании АТ, угнетающих адгезивность опухолевых клеток к стеклу и фибронектину.

5.Иммуногенность ПАУ и'иммуногенность РЭА у больных раком молочной железы взаимосвязаны. При образовании ^А АТ к ПАУ РЭА экспрессируётся в высокоиммуногенной форме,, а при образовании АТ к ПАУ РЭА экспрессируется в низкоиммуногенной форме.

6. При бластомогенезе у человека наряду с первичны™ возникают и вторичные (иммунные) нарушения взаимодействий опухолевых клеток с внеклеточными росторегулирующими факторами.

Научная новизна исследования

У больных раком повышена встречаемость АТ основных классов к аддуктам ПАУ-белок, по сравнению со здоровыми лицами. Впервые установлено, что у больных раком различного гистогенеза существуют характерные изотипические различия АТ-генеза к ПАУ. Кроме того, у больных раком имеет место образование анти-идиотипических АТ к ПАУ.

Впервые установлено, что в сыворотке крови больных раком различного происхождения имеются ЦИК, включающие в себя Р-ЭФР и специфичные к нему АТ.

При раке различного гистогенеза наблюдаются характерные особенности продукции АТ к РЭА, в результате чего РЭА приобретает различную способность к образованию ЦИК.

Впервые обнаружено, что у ряда больных раком имеются АТ, угнетающе адгезивность опухолевых клеток к внеклеточному мат-риксу. Разработаны охраноспособные методы культивирования и определения адгезивности клеток (A.c. N 1049536).

Установлено, что у больных раком иммуногенность РЭА связана с изотипическими свойствами АТ к ПАУ. При регрессивном и прогрессивном течении рака обнаружены различия в образовании АТ к ПАУ и иммуногенности РЭА.

Создана новая концепция о нарушениях межклеточных взаимодействий при бластомогенезе АТ, конкурирующими с внеклеточными росторегулирующими факторами за связывание с рецепторами опухолевых клеток.

Практическая значимость работы.

Обоснована необходимость и возможность комплексной оценки иммунного ответа на ПАУ с учетом специфичности и изотопической принадлежности АТ в иммунологическом мониторинге населения экологически неблагоприятных районов. Показана перспективность анализа изотопического состава АТ к ПАУ для доклинического прогнозирования возникновения опухолей, в т.ч. различного гистогенеза. Для определения АТ к 'ПАУ предложен общедоступный метод иммуноферментногс анализа, включающий в качестве гаптена инактивированную форму ПАУ. Отсутствие канцерогенного эффекта делает тест-системы экологически чистыми и безопасными для здоровья исследователя.

Методология получения аффинно очищенных АТ к ПАУ вполне применима для получения анти-идиотипических АТ к ПАУ, как потенциальных анти-ПАУ вакцин. • '

Методика определения АГ в составе ЦИК у онкологических больных может оказаться полезной для идентификации опухолевых АГ и оценки радикальности лечения.'

Обнаружение АТ к той или иной молекуле межклеточных взаимодействий указывает на конкретные звенья становления и прогрессии опухоли. С развитием патогенетически более тонких, методов лечения рака и других заболеваний (генной инженерии, специфической иммуносорбции), выявление таких АТ и сформированных ими ЦИК может стать диагностическим признаком, определяющим показания или противопоказания к проведению подобных лечебных процедур. Неизбежно применение таких методов иммуноанализа АТ при проведении иммунотерапии рака мАТ к рецепторам факторов роста.

Комплекс разработанных методов определения эдге^шюсти клеток может найти применение в цитологических исследованиях.

Внедрение результатов исследования

Методы анализа АТ к ПАУ. АГ компонентов и РЭА в ЦИК проходят клиническую апробацию в Кемеровском областном онкологическом диспансере и Центральной детской клинической больнице по заказу областной больничной кассы "Кузбасс". Кроме того, они используются при иммунологическом скрининге населения Кемеровской области в рамках научно-исследовательских программ по заказу администрации области ("Здоровье населения Кузбасса", "Качество жизни") и г. Кемерово ("Ранняя диагностика онкологических заболеваний с учетом экологической обстановки г. Кемерово"). На базе Кемеровского центра медицинской биотехно-

логии "БиоКем" организовано производство диагностических тест-систем для иммуноферментного анализа АТ человека классов М,в и А к канцерогенам группы ПАУ.

Материалы диссертации доложены на:

- Межреспубликанском симпозиуме "Неспецифические стимуляторы противоопухолевого иммунитета" (Рига, 1983)' ■

- Республиканском совещании "Новые подходы к вопросам иммунологии рака" (Кемерово, 1984)

- Межреспубликанском симпозиуме "Актуальные вопросы иммунотерапии опухолей" (Рига, 1988)

- Семинаре по иммунологии при Президиуме АН СССР (Москва,

1989)

- Региональной конференций "Экология человека и гигиена окружающей среды" (Новокузнецк, 1994)

- Втором междуйародном симпозиуме фонда медицинского обмена Японии, России и стран Северо-восточной Азии (Владивосток, 1994)

- Первом международном симпозиуме по иммунореабилитации (Дагомыс, 1994)

- Центральной научно-плановой комиссии Кемеровской государственной медицинской академии (Кемерово, 1995)

- Межлабораторном семинаре Института клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск,1995)

- Областной научно-практической конференции "Медико-биологические проблемы профилактики заболеваний промышленного региона Кузбасс" (Кемерово,1995).

Публикиции

По теме диссертации опубликовано 25 научных работ.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 231 странице машинописи, включая 18 таблиц, 17 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы,методы и объем исследования",6 глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография содержит 416 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.

- 10 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы.методы и объем исследований

Материалом послужили сыворотки здоровых лиц и больных раком органов желудочно-кишечного тракта и раком молочной железы. проживающих в Кемеровской области. Сыворотки здоровых лиц получены при выполнении региональной программы "Здоровье человека в Кузбассе", сыворотки больных - из отделений Кемеровского областного онкологического диспансера под контролем врачей диспансера и сотрудников кафедры онкологии Кемеровской медака-демии.

1. Исследование иммуногенности ПАУ.

AT к ПАУ исследованы в 730 образцах сыворотки, в том числе: igM - в 265; IgG - в 225; IgA - в 240. Кроме того, в 30 образцах сыворотки больных раком молочной железы исследовали ан-ти-идиотипические AT к ПАУ.

Для исследования AT использовали разработанный нами вариант иммуноферментного анализа (ИФА).

Для синтеза коньюгата ПАУ-белок использовали метод Моо1~ ten F. et al (1978) в небольшой модификации. С бычьим сывороточным альбумином (BSA) коныогировали 5-фтор-12-метилбензант-рил-7-уксусную кислоту (FMBA), предварительно получив смешанный ангидрид FMBA с изобутилхлоркарбонатом.

Коньюгат FMBA-BSA адсорбировали на стенках лунок полистироловых планшетов; блокировали незанятые участки поверхности раствором овальбумина; вносили в лунки исследуемую сыворотку в разведении 1:1000; несвязавшиеся с АГ AT отмывали фосфатным

буферным раствором с добавлением овальбумина и твина-20; связавшиеся AT проявляли с помощью коньюгатов пероксидазы хрена с AT козы, моноспецифическими к IgM,- IgG и IgA человека. Завершали анализ обычной процедурой с ортофенилендиамином в качестве хромогена и перекисью водорода в качестве субстрата (Т. Нго, 1980). В качестве контроля связывания AT с гаптеном (FMBA) использовали лунки с адсорбированным белком-носителем (BSA). Активность AT оценивали в баллах. Если оптическая плотность в опыте превышала контрольную в 2 раза, реакцию AT с гаптеном считали слабоположительной (1 балл); если в 4 раза -положительной (2 балла); если в 8 раз и более - резкоположи-тельной (3 балла).-

Для исследования анти-идиотипических AT (аАТ) получали аффинно очищенные AT к FMBA после иммунизации кролика ¡соньюгл-том FMBA-BSA и последовательных хрокатографиях сыворотки на колонках: Протеин А-сефароза, BSA-сефароза, Ig человека-сефа-роза, FMBA-Toyopearl. Полученные AT кролика адсорбировали на стенках лунок полистироловых планшетов. В качестве контроля использовали IgG того же кролика, истощенные по BSA, Ig человека и FMBA. ААТ определяли в ИФА как описано выше по бальной системе.

2. Исследование иммуногенности опухолевых АГ.

Материалом послужили 12 образцов плазмы крови больных плоскоклеточным раком легкого после плазмофереза; 11 образцов сыворотки крови больных раком толстой кишки; 14 образцов сыворотки крови больных раком желудка; 5 образцов сыворотки крови больных раком пищевода; 20 образцов асцитной жидкости больных раком яичника.

- 12 -

Выделение IgG-ЦИК выполняли по следующей схеме. Осаждали гамма-глобулиновую фракцию сульфатом аммония 40% насыщения и дважды осаждали ЦИК 2,5 и 2% раствором ПЭГ-6000 по Hudson L.. Hay F. (1980). Выполняли хроматографию осажденного материала на колонке Протеин А-сефароза. Элюировали связавшийся материал сначала 8М мочевиной, а затем дополнительно глицин-HCl буферным раствором (pH 2,5).

Электрофорез IgG-ЦИК выполняли в полиакриламидном-плоском геле (градиент 7,5 - 15%) с додецилсульфатом натрия в полном соответствии с руководством Такач Б. (1981). Окрашивание геля нитратом серебра выполняли в полном соответствии с руководством Ригетти П. (1986).

3. Исследование иммуногрнности рецепторов гуморальных факторов роста.'

Обследовано 220 образцов сыворотки крови больных раком (123 -желудочно-кишечного тракта, 78 - молочной железы, 10 -яичника, 9 - легкого).

ЦИК выделяли из сыворотки последовательным осаждением 2,5 и 2% раствором ПЭГ-6000.

Первичный скрининг ЦИК выполняли с помощью иммунос-пот-анализа (Stott D., 1989). На нитроцеллюлозную мембрану адсорбировали моноспецифические AT против Р-ЭФР (Институт им. Р.Е.Кавецкого АН Украины) или против рецептора фактора роста тромбоцитов (Ludvlg Institute of Cancer Research, Sweden). С ними инкубировали осажденные ЦИК. Связавшийся материал, проявляли с помощью коньюгатов пероксидазы хрена с AT козы к Ig человека, Н202 и 4-хлорнафтола.

- 13 -

Образцы ЦИК с положительной реакцией дополнительно исследовали с помощью иммуно б лот-анализа (Б1;ои Б., 1989). Клетки линии А-431 (экспрессирующие Р-ЭФР в большом количестве) лизи-ровали тритоном Х-100 и выполняли электрофорез в градиентном плоском полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Осуществляли электроперенос разделенного по мол. массе материала на нитроцеллюлозную мембрану. Инкубировали с ней ЦИК(+) образцы. Выявляли связавшиеся с Р-ЭФР АТ из ЦИК с помощью перокси-дазного коньюгата АТ _козы к ^ человека,, Н202 и 4-хлорнафтола.

4. Исследование иммуногенности РЭА. Материалом послужили

227 образцов сыворотки крови больных раком, из них 30 - раком желудка; 20 - толстой и прямой кишки; 3 - пищевода; 116 - молочной железы до лечения; 58 - на фон" лечения. Кроме того, исследованы сыворотки 51 здорового человека (12 мужчин и 39 женщин в возрасте 18 - 25 лет).

РЭА исследовали с помощью иммуноферментных • наборов "Диа Плюс" (г. Москва) в соответствии с методическими инструкциями. РЭА в составе ЦИК определяли параллельно, после осаждения ЦИК 2. 5. и 2% раствором ПЭГ-6000.

Для количественного выражения иммуногенности РЭА вычисляли молярное отношение:

РЭА в сыворотке РЭА в ЦИК ,

которое показывает,сколько молекул РЭА в сыворотке участвует в формировании ЦИК,содержащего одну молекулу РЭА. Чем меньше указанное отношение, тем больше иммуногенность РЭА.

- 14 -

5. Исследование AT, влияющих на адгезивность клеток .к внеклеточному матриксу.

На первом этапе, предварительном, изучали влияние сыво- 1 •ротки мышей с перевивными опухолями на адгезивность макрофагов мыши. На втором, основном, из асцитической жидкости больных I раком яичника выделяли опухоль-ассоциированные AT и изучали их влияние на адгезивность клеток рака яичника. j

Для определения адгезивности макрофагов использовали модифицированный метод Фоува-Декариса с применением камеры для "культивирования клеток собственной конструкции, которая позво- . ляла изучать одновременно десятки образцов сыворотки при небольшом расходе материала (A.C. N 1049536). Использовали мышей ! линии СЗН/Не, СЗН/f и С57В1/6 (Институт им. P.E. Кавецкого АН Украины) и линии опухолевых клеток: ММТ-1 (Институт цитологии и генетики СО РАН) и карциному'Льюис (ОНЦ РАМК). Исследовали j 237 образцов сыворотки мышей СЗН до перевивки и во время роста сингенной опухоли ММТ-1, а также 94 образца сыворотки мышей С57В1/6 до перевивки и во время роста сингенной карциномы Льюис. '

Для определения адгезивности опухолевых клеток карциномы яичника человека линии CaOv (ОНЦ РАМН) к стеклу разработали, флуориметрический метод, суть которого состоит в окрашивании прилипающих клеток акридиновым оранжевым и количественном учете клеток по интенсивности флуоресценции с помощью модифицированной фотометрической насадки ФМЭД-1 и люминесцентного микроскопа.

Для определения адгезивности клеток CaOv к фибронекгину разработали спектрофотометрический метод, суть которого состо-

ит в окрашивании прилипших к покрытому фибронектином плоскому дну полистиролового планшета клеток по Романовскому; экстракции красителя из клеток этанолом и измерении оптической плотности на вертикальном фотометре при длине волны 620 нм.

АТ-, ассоциированные с опухолью, выделяли из асцитной жидкости больных раком яичника и плазмы здоровых доноров осаждением гамма-глобулиновой фракции сульфатом аммония, выделением З^й на колонке "Протеин А - сефароза", аффинной -очистки искомых АТ на колонке "Белки опухолевых клеток - сефароза". Опухолевые клетки из асцита выделяли простым осаждением крупных конгломератов. Экстракцию белков из них выполняли с помощью 6 М мочевины. Для доказательства наличия искомых АТ потребовалось исследовать 5 образцов асцитной жидкости и 5 образцов плазмы здоровых доноров.

6. Исследование иммуногенности ПАУ и РЭА при различных клинических вариантах течения раковой болезни.

Материалом послужили сызоротки 70 больных раком молочнп! желез!I.находящихся в процессе комбинированного лечения (операция, химиотерапия, лучевая терапия). Выделяли два варианта течения болезни: регресс опухоли с положительным прогнозом (п=29) и прогресс опухоли с отрицательным прогнозом - продолжение роста первичного очага, рецидивы, метастазы (п=70). Иммуноген-ность ПАУ и РЭА исследовали как описано выше.

7. Статистическая обработка результатов. Достоверность

различий между сравниваемыми группами определяли по критериям ХгЛ, Г с вероятностью ошибки менее 5% (р<0.05).

- 16 -Результаты исследований

1. Иммуногенность ПАУ и AT к ним у больных раком.

Хорошо известно, что ПАУ образуют аддукты с макромолекулами в организме человека в естественных условиях (Михеев A.M.,1992; Skipper P. et al,l994). Однако,- результат приобретения иммуногенности остается совершенно неясным, т.к. почти не изучено образование AT к ПАУ у человека.

Нами исследованы основные классы AT к бензантрацену, представителю канцерогенов группы ПАУ, у здоровых лиц и больных раком различного гистогенеза ( табл. 1.).

Таблица 1.

Частота обнаружения антител к бензантрацену у здоровых лиц (ЗЛ), больных раком желудка (РЖ),

раком толстой и прямой кишки (РТПК), раком молочной железы до начала лечения (РМЖ)

1 1 1 | К | Группа | I i 1 1 IgM | IgG I 1 1 IgA | 1 I

1 1 1 11 | ЗЛ | 1/76 (1.3%) I 7/51 (13.7%) 1 1 I 9/63 (14.3%) |

I 2 | РЖ 1 7/48 (14.6%)| 13/38 (34.8%) 1 8/38 (21.1%) |

| 3 | РТПК | 1/22 (4.5%) | 3/19 (4.5%) 1 6/22 (27.2%) |

| 4 ! РМЖ | 1 1 1 7/119 (5.9%)| 9/117 (7.7%) I38/117 (32.5%)| 1 I

I Достоверность! 1-2, Р<0.01 I 1-2, Р<0. 05 1 1 1 1-4, РС0.01 |

I различий (Хг) | | | 2-4, Р<0. 01 1 1 | |

- 17 -

Как видно по таблице, во всех сравниваемых группах имеются лица с АТ к ПАУ всех 3 основных изотипов. Однако, число лиц с положительными и резкоположительными результатами анализа антител к ПАУ различаются с учетом изотипа.

Так, в группе здоровых лиц АТ встречаются реже.чем в каждой из групп больных раком. Максимально выражены различия с больными раком желудка,- вероятность ошибки по критерию X2 составляет меньше 1%. Здоровые лица отличаются от больных раком желудка. и достоверно меньшей .частотой обнаружения АТ к ПАУ: По сравнению с больными раком толстой кишки и раком молочной железы ^ АТ к ПАУ у здоровых лиц встречаются чаще, но эти различия малодостоверны. ]£А АТ к ПАУ у здоровых лиц обнаруживаются реже, чем у больных раком всех трех локализаций. Максимально выраженная и достоверная разница с больными раком молочной железы. Таким образом, здоровые липа и Сольные раком различаются по иммуногенности ПАУ, что выражается в различной частоте обнаружения АТ отдельных изотипов, специфичных к бен-зантрацену.

В свою очередь больные раком различной локализации отличаются между собой по изотипическим характеристикам АТ к ПАУ. Так, у больных раком желудка ^М и- АТ к бензантрацену встречаются чаще, чем у больных раком толстой и прямой кишки и больных-раком молочной железы. Наибольшие и достоверные различия выявлены у больных раком желудка по сравнению с больными раком молочной желе'зы по АТ. ^А АТ к- бензантрацену обнаруживаются чаще у больных раком молочной железы по сравнению с другими группами больных, однако эти различия недостоверны.

- 18 -

При исследовании антиидиотипов к ПАУ выяснилось, что аАТ класса М встречаются редко, всего в 4 случаях из 30, и во всех случаях связывание аАТ было слабоположительным. ААТ класса А обнаружены в 60% случаев, и в 40% реакция была положительной и резкоположительной. ААТ класс в обнаружены в 57%, и в 20% связывание было положительным или резкоположительным.

Какой-либо видимой корреляции в обнаружении АТ к бензант-рацену и соответствующих аАТ не прослеживалось ' (в том числе и между различными изотипами).

Обнаруженный нами анти-идиотипический ответ развивался по

I

вторичному типу, т. к. аАТ представлены ^ и изотипами, в | то время как 1£М аАТ встречались крайне редко. - I

В ряде случаев аАТ, очевидно, приводят к затуханию АТ ответа на ПАУ. Например, в случаях NN 4,7,11 наблюдалась малая выраженность или отсутствие АТ'ответа на бензантрацен при резко выраженной реакции ^А-аАТ.

Возможна и обратная ситуация, когда аАТ, несущие внутрен- | ний образ ксенобиотика, могут индуцировать (или поддерживать на высоком уровне) образование АТ к ПАУ. Например, в случае N 15 наряду с положительной и резкоположительной реакцией аАТ классов в и А наблюдалась и резкоположительная на бензантрацен 1ёА-АТ.

Таким образом, обнаружение АТ и их антиидиотипов к ПАУ, выявление изотипических1 различий между здоровыми людьми и больными раком, а также между больными раком различного гистогенеза отражают сложные взаимодействия внутри иммунохимическо-го механизма адаптации организма к окружающей химической среде и имеют непосредственное отношение к патогенезу опухолевых заболеваний у человека.

2. Характеристика опухолевых АГ в составе ЦИК у больных раком.

Многочисленные исследования ЦИК при бластомогенезе показывают, что в их состав входят опухолевые АГ и противоопухолевые АТ. Коль скоро мы предполагаем, что мишенью противоопухолевых АТ могут быть клеточные рецепторы, было бы логично сопоставить характеристики выявляемых в составе ЦИК опухолевых АГ .с характеристиками известных рецепторов.

Анализ литературных данных показывает, что некоторые из описанных АГ в ЦИК совпадают по мол. массе с известными рецепторами. Например, АГ с мол. массой 25 и 26 кД при меланоме и саркоме (Cheng W.. et al,1985; Gropp С. et al,1979) сходны с малой субъединицей рецептора к фибронектину и цитоадгсзину. Рецептор к ламинину близок по мол. массе к АГ при меланоме и раке молочной железы (Cheng W. et al,1985; Papsldero et al,1978). При этих же опухолях выявляются АГ, схожие с субъединицей инсулиноподобного фактора роста ' II (Gllead Z. et al, 1981; Quay S. et al,1983). При раке легкого, меланоме, лейкозе, раке яичников, раке толстой кишки, раке предстательной железы, раке молочной железы в составе ЦИК выявлялись АГ компоненты, близкие по мол.массе с -различными субъединицами ин-тегринов (Havemann К. et al,1979; Quay S. et al,1983; Jaramil-lo S et al,1987; Chu M. et al,1984; Gllead Z. et al,1981).

Мы исследовали АГ компоненты в составе IgG-ЦИК с использованием более жестких методов очистки ЦИК и сопоставляли их с известными рецепторами по мол. массе.

У 3 (25%) больных раком легкого; у 10 (50%) - раком яичника; у 9 (81%) - раком толстой и прямой кишки; у 12 (86%) -

раком желудка, у 3 (60%) - раком пищевода в составе ^-ЦИК не выявлено каких-либо компонентов, не встречающихся у здоровых доноров. У остальных обнаружены полипептидные полосы, отсутствующие в норме (рис.1,табл.2).

Как видно по таблице, в составе ЦИК у больных раком встречаются опухолевые АГ, общие для группы пациентов с одной формой-рака - групповые, и уникальные - имеющие место лишь в единичных случаях. Причем, некоторые групповые АГ встречаются при различных раках (40 кД, 64 кД, 45 кД). По-видимому, уникальные АГ при раках желудочно-кишечного тракта при увеличении количества наблюдений могут оказаться групповыми.

Некоторые обнаруженные АГ совпадают по мол. массе с известными рецепторами. Так, при раке яичника выявлен АГ с молекулярной массой 95 кД,. очень сходный с рецептором а-субъедини-цы инсулинопсдобного фактора роста I (96 кД). Антигенные компоненты с мол. массой 29, 37, 95 кД при раке яичников близки к аЗ,а7,(52 субъединицам интегринов - 30, 35, 95 соответсвенно.

Описанные ранее и полученные нами данные являются косвенным подтверждением того, что клеточные рецепторы при опухолевой- трансформации могут претерпевать АГ преобразования и входить в состав ЦИК вместе со специфичными к ним АТ.

3. Иммуногенность рецепторов гуморальных факторов роста: образование ЦИК с АТ у больных раком.

Известно,что изменения рецепторов гуморальных факторов роста,в частности, Р-ЭФР, играют важную роль при опухолевом росте,в том числе при бластомогенезе у человека (Гарманчук Л.В. и др.,1991). Описаны структурные изменения Р-ЭФР,а также обнаружены опухоль-ассоциированные АГ детерминанты в составе

Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле ^-содержащих циркулирующих иммунных комплексов (ПИК) больной раком яичника.

1. ЦИК после осаждения сульфатом аммония и ПЭГ-6000

2. Материал,несвязавшийся с-"Протеин А - се-фарозой"

3. Материал,элюированный с "Протеин А - се-фарозы" 8 М мочевиной

4. Материал,элюированный с "Протеин А - се-фарозы" буферным .раствором глицин-НС1 (рН 2, 8)

Таблица 2.

Молекулярная масса опухолевых антигенов - в составе ^-ЦИК у больных раком (кД)

N 1 1 Группа | Уникальные компоненты i I Групповые компоненты

1. |Рак легкого 38, 43, 57. 61 | 40 (11=4), 64 (п=2)

2. 1 Рак яичника 1 1 29, 37, 39, 88, 95 73, 75, | 40 (п=8). 43 (п=2), \ | 64 (11=2)

3. 1 |Рак толстой |и прямой 1 кишки 1 45 | 40 (п=2)

4. 1 1 Рак желудка у 1 40 1 45 (П=2)

5. 1 1 Рак пищевода I 1 40 ! 45 (п=2) i

Р-ЭФР при карциномах у человека (Bujía J. et.al., 1993; Basu A. et.al..1987). Поэтому вполне уместно предположение о том,что у больных раком могут образовываться АТ к Р-ЭФР,экс-прессируемым опухолевыми клетками.

На первом этапе исследования с помощью иммуноспот-анализа выявляли ЦИК(+),содержащие Р-ЭФР и специфичные к нему АТ.

' Скрининг образцов сыворотки крови больных раком позволил выявить 21 случай с положительной реакцией на ЦИК, возможно содержащих Р-ЭФР и АТ к Р-ЭФР. Из них 7 из 123 больных раком желудочно-кишечного тракта,14 из 78 больных раком молочной железы. Не было обнаружено ЦИК, содержащих Р-ЭФР и соответствующие АТ,у больных раком яичника и раком легкого.

Ни в одном из исследуемых образцов сыворотки не удалось выявить ЦИК,содержащих рецептор фактора роста тромбоцитов.

На втором этапе выполняли иммуноблот-анализ для подтверждения того,что в составе ЦИК(+) содержался АТ,специфичные к Р-ЭФР (рис.2). Лизат клеток линии А-431 подвергали электрофорезу В"полиакриламидном геле. Окрашивание геля нитратом серебра позволило выявить более 30 пептидных полос. В их числа была типичная для Р-ЭФР раздвоенная полоса с мол. массой 1 СО--170 кД. После электропереноса разделенных в геле пептидов на нит-роцеллюлозную мембрану инкубировали с ней пул ЦИК(+). Связавшиеся с пептидами АТ больных раком выявляли с помощью конъвга-та пероксидазы хрена с АТ козы против ^ человека. Опыты повторяли 3 раза.

В результате выявили связывание АТ, входящих в состав ЦИК(+),с 6 пептидными полосами. Мол. масса распознаваемых АТ пептидов составляла: 160-170 кД; 130 кД; 75 кД; 67 кД; 55 кД и 45 кД.

Связывание с пептидом 160-170 кД убедительно подтверждает результат первого этапа исследования о наличии в составе ЦИК некоторых больных раком АТ,специфичных к Р-ЭФР.

Полоса 130 кД,вероятно,принадлежит большой субъединице рецептора инсулина (или инсулиноподобного фактора роста I).

23?

135 б?

УО

к'.

Н«4 =

¿бор-эярр Г

13О р-ц,р.ит ? 64- Р-Лн ?

1. 2. 3.

Рис. 2. Электрофорез лизата клеток линии А-431 в поли-акриламидном геле (ПААГ) и иммуноблот-анализ АТ больных раком в составе ШК(+).

1. Маркеры молекулярной массы

2. Пептидные полосы в ПААГ

3. Связывание АТ больных с пептидами после электропереноса на нитроцеллюлозную мембрану.

Полоса 67 кД очень напоминает .рецептор к ламинину. Коль скоро клетки линии А-431 являются инсулинозависимыми и высоко адгезивными, вероятность того,что полосы 130 и 67 кД принадлежат именно этим рецепторам,весьма высока. Поэтому вполне уместно предположение о том,что AT,прореагировавшие с этими пептидами, направлены против рецепторов инсулина (инсулиноподобного фактора роста I) и ламинина. Образование AT к рецептору инсулина описано при эндокринопатологии. Образование AT к рецептору ламинина вполне возможно,т.к. с помощью мАТ выявлены АГ различия рецептора ламинина у метастазирующих и неметастазиру-ющих опухолевых клеток (Vollmers Н. et.al.,1984; Takada j. et al.,1992).

Обнаружение нами AT к Р-ЭФР у больных раком в совокупности с известными данными о свойствах гетерологичных AT к рецепторам факторов роста (Кусень С.И.,Стойка Р.С..1985) говорит о том, что при бластомогенезе у человека возможны вторичные нарушения межклеточных взаимодействий AT к рецепторам факторов роста. При этом антитела могут выполнять роль агонистов или антагонистов факторов роста.

4. Иммуногенность молекул межклеточных контактов: образование ЦИК РЭА с AT у больных раком.

Тканевые дифференцировочные 'АГ, в частности, эмбриональные, рассматриваются в последнее время не только как опухолевые маркеры в диагностическом аспекте, но и как молекулы, играющие важную роль в межклеточном распознавании и формировании межклеточных контактов (Агеенко А.И., 1994). В частности, РЭА принимает участие в межклеточной, адгезии in vitro и in vivo,

стимулирует метастазирование и пролиферацию опухолевых клеток, причем, эта стимуляция блокируется анти-РЭА AT (Scurry J. et al., 1983; Benchimol A. et al., 1989; Jessup J. et al., 1990; Kiss R. et al., 1993).

Очевидно, что образование ЦИК является интегративным показателем иммуногенности РЭА. Однако, данные по иммуногенности РЭА немногочисленны и крайне противоречивы. Большому числу исследователей не удалось обнаружить РЭА в составе ЦИК. Сравнение иммуногенности РЭА при опухолях различного гистогенеза не проводилось. Не известно,взаимосвязаны ли иммуногенность -ПАУ и РЭА у больных раком.

Нами установлено,что определение РЭА в сыворотке с помощью общепринятого метода дает результаты, схожие с данными большинства исследователей. Так,при раке органов желудочно-кишечного тракта у 11% больных значение РЭА превышает 40 нг/мл. При раке молочной'железы это превышение имеет место только у

у

1% больных,а у здоровых лиц такового вообще не наблюдалось. Обычно за границу "нормы" принимают 10 нг/мл. В нашем исследовании содержание РЭА в сыворотке более 10 нг/мл наблюдалось у больных раком органов желудочно-кишечного тракта в 23% случаев, у больных раком молочной железы - в 28%, у здоровых лиц - в 18%.

В настоящем исследовании нас больше интересовало не содержание РЭА в сыворотке, а различия РЭА в составе ЦИК. Выяснилось, что при раке органов желудочно-кишечного тракта всего в 1 случае из 53 содержание РЭА в ЦИК превышало границу 5 нг/мл, что составило 2%. При раке молочной железы содержание РЭА в ЦИК превышало 5 нг/мл у 44 больных из 116,что составляло

38%. Разница достоверна по критерию 1г. У здоровых лиц превышение этой границы наблюдалось у 6 из 51 обследованных (12%).

В таблице 3 представлены различия между больными раком органов желудочно-кишечного тракта и раком молочной железы по молярному соотношению свободного РЭА к РЭА в ЦИК. Видно,что индивидуальные соотношения РЭА в сыворотке и РЭА в составе ЦИК у больных раком желудочно-кишечного тракта значительно больше такового у больных раком молочной железы. Различия по 1г высокодостоверны (Р < 0.01).

У 18% больных раком молочной железы РЭА циркулирует в основном составе иммунных комплексов (первая колонка в табл. 3). При определении РЭА в сыворотке с помощью общепринятого метода у этих больных показатели оказались меньше, чем при определении РЭА в составе ЦИК. Поэтому молярное соотношение меныпр цы. -АТ больных "экранируют" РЭА и делают его недоступным для АТ в аналитической тест-системе. Зато в таких образцах РЭА хорошо осаждается с помощью ПЭГ-6000,т.к. находится в составе ЦИК. После ресуспендирования осадка ЦИК диссоциирует,и кроме этого процедурой осаждения достигается освобождение от АТ пациентов в сыворотке. Поэтому РЭА становится более доступным для АТ в аналитической тест-системе. При раке органов желудочно-кишечного тракта,в отличие от рака молочной железы,гораздо больше больных с соотношением РЭА в сыворотке/РЭА в ЦИК более 4 (41% и 11% соответственно). Это означает.что РЭА циркулирует в свободном виде и не образует иммунных комплексов,коль скоро только 1 молекула РЭА осаждается ПЭГ-6000 с ЦИК из 4-8 молекул сыворотки.

Таблица 3.

Распределение больных по молярному соотношению РЭА в сыворотке и РЭА в составе ЦИК при раке органов желудочно-кишечного тракта (РЖКТ) и раке молочной железы (РМЖ)

1 N 1 Группа 1 1 I Соотношение РЭА в сыворотке/РЭА в ЦИК

1 1 1 III 1 г I < 1 | >1 - 2 I >2 - 4 | >4 - 8 | II 1 1 1 > 8

! 1. | РЖКТ;N=53 II 1 1 1 I1(2%)| 18(34%)I 12(23%)| И | 11

I (100%) II 1 1 (20, 5%) I (20,5%)

2. | РМЖ; N=116' I ' 21 161(53%) | 21(18%)| 8(7%) | 5(4%)

I (100%) 1 1(18%)I | „1 | || 1 1 1

1 Достоверность

1 различий -ОС2) 1 ......■ ... .. ... | Р< 0,01 1

Наши наблюдения соответствуют данным Б1:оз1с С. ег.а1.,(1993) о том,что связывающая РЭА активность сыворотки, превышающая показатели здоровых лиц,определялась у 18% больных раком молочной железы и лишь у 7%, больных раком толстой кишки.

Таким образом,иммуногенность РЭА, как молекулы межклеточных контактов,различна при опухолях разных тканей. Это означает. что АТ к РЭА могут по-разному участвовать в иммунологических механизмах нарушения межклеточных взаимодействий у больных раком различного гистогенеза.

- 29 -

В таблице 4 представлено распределение больных раком различного гистогенеза по иммуногенности РЭА в соответствии с выраженностью реакции на ПАУ ^ и ^А АТ. В случае с молярным отношением РЭА в сыворотке/РЭА в ЦИК, составляющим менее 2, считали,что РЭА обладает высокой иммуногенностью. При молярном отношении более 2.считали.что РЭА обладает низкой иммуногенностью.

Отчетливых ассоциаций иммуногенности РЭА с реакцией АТ на ПАУ при раке желудка и раке' толстой и прямой кишки не прослеживается.

Не выявлено и взаимосвязи между иммуногенностью РЭА и выраженностью реакции ^М-АТ на ПАУ у больных раком молочной железы. Вместе с тем, у этих же больных обнаружена прямая ассоциация ^А-АТ и обратная ассоциация ^й-АТ на ПАУ с иммуноген ностью РЭА. Высокая иммуногенность РЭА взаимосвязана с сильной реакцией-на ПАУ 1яА-АТ и со слабой реакцией 1§С-АТ. Эти ассоциации достоверны по критерию X2 для ^ при 2+3 стадиях и для ^А при 3 стадии рака молочной железы.

Это подтверждается при сопоставлении иммуногенности РЭА с индивидуальными комбинациями и- ^ АТ к ПАУ (табл. 5).

Всего возможны 4 комбинации двух классов АТ по двум степеням выраженности их реакции на ПАУ. У- обследованных нами больных выявлены все возможные комбинации.

У 68 больных из 113 (60%) обнаружена слабая реакция как ^А,так и АТ на ПАУ. В этом случае высокоиммуногенная форма РЭА встречается у 68% больных.

У 36 больных (32%) обнаружена сильная реакция ^А АТ к ПАУ при одновременной слабой реакции № АТ. В этом случае высокоиммуногенная форма РЭА встречается у 80% больных.

Таблица 4.

Распределение больных раком молочной железы (РМЖ),раком желудка (РЖ) и раком толстой и прямой кишки (РТПК) по иммуногенности РЭА в соответствии с выраженностью реакции антител на ПАУ

N 1 1 1 Группа | Изотип,выражен- 1 1 Молярное соотношение РЭА в

1 1 ность реакции I сыворотке к РЭА в ЦИК

1 1 AT к ПАУ 1-

1 1 I<2 Высокоим- >2 ^изкоим-

1 1 1 | |муногенный I муногенный

•1. 1 I I РМЖ | IgM слабая 1 | 32 (68) 14 (30)

1 II 1 сильная 1 0 (0) 1 (2)

2. 1 стадия | IgG слабая 1 31 (66) 13 (28)

Г J сильная 1 1 (2) 2 (4)

3. 1 у 1 IgA слабая 1 19 (40) 9 (19)

1 1 1 1 сильная 1 13 1 (28) ~ 6 (13)

4. 1 1 1 РМЖ | IgM слабая 1 1 47 (70) • 15 (22)

1 III 1 сильная 1 4 (6) 1 (1)

5. I стадия | IgG слабая | 50 (72) 13 (19)

1 1 сильная 1 3 (4) 3 (4)

6. 1 1 IgA слабая 1 31 (47) 16 (24)

1 1 сильная I 18 1 (27) | 1 (1)

Достоверность различий (X2): 1 1 (2 + 5) ; Р< 0,05

1 I 6 , ; Р< 0,05

Таблица 5.

Распределение больных раком молочной железы по иммуно-генности РЭА в соответствии с индивидуальными комбинациями и ^ антител к ПАУ

1 N | Индивидуальные 1 1 Молярное соотношение РЭА в сыворотке

I реакции антител Г к РЭА в ЦИК

I к ПАУ 1

1 1 1 1 1 ! <2 | > 2

1 1Высокоиммуногенный| Низкоиммуногенный

1 I РЭА | 1 | РЭА

1 1. 1 З^А - слабая 1 1 1 1

1 - слабая I 46 (68%) | 22 (32%)

2. I ^А - сильная 1 1

1 НС - слабая 1 - 29 (80%) | 7 (20%)

3. 1 ^А - слабая Г '1

1 1& - сильная I 2 (33%) | 4 (67%)

4. 1 1вА - сильная

1 ^ ______ 1..... - сильная I 2 (67%) | I : 1 (33%)

Достоверность I 2 - 3; Р< 0,05

различий (X2): I 2 - (3+4); Р< 0,05 -

У 6 больных из ИЗ (5%) обнаружена сильная реакция ]^-АТ при одновременном отсутствии 1ёА-к1 к ПАУ. В этом случае высо-коиммуногенная форма РЭА встречается у 33% больных.

(Кеппе1 Б. е1 а1,1989). Альфа-2 субъединица интегрина оказалась идентичной АГ прогрессии меланомы (Shi.ro Л. е1 а1,19Э1). Ассоциированный с трансформацией гликопротеин Сар идентичен альфа-3 субъединице интегрина (Тзи;Ц Т. е1 а1,1991). Напомним, что в составе ЦИК при некоторых опухолях обнаружены АГ компоненты, схожие по мол. массе с интегринами, в т. ч. и с альфа-3 субъединицей (Науетапп К. е1 а1,1979; С1ш М. а1, 1984).

Известно, что сыворотка крови опухоленосителя способна угнетать адгезию опухолевых или нормальных клеток к субстрату (Ровенский Ю.А., Бухман В.М.,1965; Ьуко Н. е1а1,1984), однако неясно с какими именно компонентами сыворотки это связано.

В настоящем разделе представлены доказательства того, что у некоторых больных раком действительно обнаруживаются АТ, угнетающие адгезивность клеток к внеклеточному матриксу.

В предварительных экспериментах на мышах линии СЗН установили, что пра росте опухоли ММТ-1 сыворотка крови приобретает способность угнетать распластывание макрофагов. Причем,чем больше размер опухоли,тем больше угнетающее действие сыворотки. Установили обратную линейную зависимость между количеством метастазов в легкие карциномы Льюис у мышей линии С57 В1/6 и количеством распластанных макрофагов в присутствии сыворотки опухоленосителя (г = - 0,7; га = 0,27; р < 0,01).

Эти эксперименты подтвердили известные данные о наличии в сыворотке опухоленосителей субстанций, способных'угнетать адгезивность клеток. Входят ли в число этих субстанций противоопухолевые АТ? Подтверждение этого предположения мы получили в экспериментах с опухолевыми клетками человека.

- На рис. 3 и 4 показано влияние различных белков на адгезивность клеток линии СаОу к стеклу и к фибронектину. Испытуе-"

- У 3 больных из 113 (3%) обнаружены сильные реакции как 1ЯА,так и ^б-АТ к ПАУ. В этом случае высокоиммуногенная форма РЭА встречается у 67% больных.

Различия между 2 и 3 группами,а также между 2 и (3+4) группами достоверны по критерию X2.

Очевидно,что существует внутренняя взаимосвязь между реакцией на ПАУ и реакцией на РЭА. Однако,учитывая сложность этих реакций,установить точный • характер этих взаимосвязей и представить их в математической форме пока не представляется возможным. Для этого понадобится больший объем материала с использованием полного набора методов анализа АТ к ПАУ и РЭА с учетом их изотипических и анти-идиотипических характеристик, способности формировать ЦИК и других особенностей.

'5. Иммуногенность молекул адгезии к внеклеточному матрик-су: образование АТ,изменяющих адгезивность опухолевых клеток,у больных раком.

Известно, что опухолевые клетки с различной адгезив-ностью, злокачественностью и метастатической активностью различаются также и по АГ свойствам (НосПшап >1. ег а1,1981; 011-, боп Ь. et а1, 1984; Уагап1 I. е! а1,1985). Описаны структурные изменения в некоторых молекулах адгезии ( в частности, ламини-на) при злокачественной трансформации (ОЬпо М. е1 а1,1985; Та-кас!а СТ. е1 а1, 1992). Более того, оказалось, что некоторые описанные ранее опухолевые АГ представляют собой рецепторы к молекулам внеклеточного матрикса. Опухоль-ассоциированньм АГ меланомы ТБР-180 представляет собой субъединицу интегрина

-ъч-

Рис 3. Взаимосвязь количества прилипших к стеклу клеток линии CaOv (MB) и концентрации (С):

1 - бычьего сывороточного альбумина

2 - общего пула IgG

3 - афинно очищенных антител класса G больной раком яичника Ц-ой.

Рис. 4. Взаимосвязь прилипших к фибронектину клеток линии CaOv (OD) и концентрации (С) :

1 - бычьего сывороточного альбумина

2 - общего пула IgG

3 - аффинно очищенных антител класса G больной раком яичника Л-ой

4 - аффинно очищенных антител класса G здорового донора К-ва

мыми белками были: 1) противоопухолевые АТ класса Б (опыт); 2) да из этого же образца сыворотки без противоопухолевых АТ (контроль); 3) бычий сывороточный альбумин (контроль).

С помощью флуоресцентного метода установили,что контрольные белки не влияют на адгезивность клеток СаОу. да-АТ из асцитов 4 больных раком яичника также не оказывали никакого действия на количество прилипающих клеток. В то же время, да-АТ больной Ц-ой дозозависимо угнетали адгезивность клеток карциномы яичника к стеклу.

Схожие результаты получили с помощью спектрофотометричес-кого метода определения адгезивности клеток к фибронектину. Ни бычий сывороточный альбумин, ни общий пул да из асцитов 4 больных не влияли на количество прилипающих клеток. Дозозави-симое угнетение адгезивности наблюдали лишь при инкубации клеток СаОу с да-АТ больной Л-ой.

Полученные результаты хорошо ассоциируются с данными о наличии в составе ЦИК АГ,совпадающих по мол. массе с некоторыми матричными рецепторами (раздел 2),а также с данными о нали--чии в составе ЦИК/ АТ, реагирующих с клеточными компонентами, совпадающими по мол.' массе с некоторыми матричными рецепторами ' (раздел 3).

6. Особенности АТ к ПАУ и иммуногенности РЭА у больных с прогрессивной и регрессивной формами течения рака.

При сравнении иммуногенности РЭА и ПАУ у больных раком молочной железы до начала лечения с этими показателями на фоне комбинированного лечения с разными формами течения болезни установлено следующее.

- 36 -

По таблице' 6 видно, что различия по частоте обнаружения АТ к ПАУ всех трех сравниваемых изотипов между II и III стадиями рака до начала лечения отсутствуют.

Таблица 6.

Частота обнаружения АТ к ПАУ у больных раком молочной железы с регрессивной и прогрессивной формами течения болезни

Группа

I Частота обнаружения антител

1 1 IgM 1 IgG IgA

1 I До лечения: I 1

1. 1II стадия |2/48 (4.2%) 3/48 (6.3%) 19/48 (39.6%)

2.|III стадия 15/71 (7.0%)' 6/69 (8.7%) 19/69 (27.6%)

¡При лечении: 1

3.|Регресс 14/29 (13.8%) 7/28 (25.0%) 5/26 (19.2%)

4.|Прогресс 1 Ц/41 1 (2.4%) 1/36 [z.m 5/39 (12.8%)

Достоверность различий (X2) 1 1 1 (1+2)-3;р<0.05 • 3 -4;.р<0.01

Частота обнаружения АТ к ПАУ у больных с регрессом опухоли больше, чем у больных до начала лечения и больше, чем у больных.с прогрессом опухоли, в 3-4 раза.Однако, эта разница малодостоверна по критерию X2. Частота обнаружения ^М АТ к ПАУ у больных с прогрессом опухоли не отличалась от таковой у больных до начала лечения.

- 37 -

Частота обнаружения IgG AT к ПАУ у больных с регрессом опухоли больше, чем у больных до начала лечения и больше, чем у больных с прогрессом опухоли в 3-4 раза. Причем эта разница статистически достоверна. Частота обнаружения IgG антител к ПАУ у больных с прогрессом опухоли меньше, чем у больных до начала лечения в 2-3 раза, однако эти различия малодостоверны.

Прослеживается отчетливая тенденция к снижению частоты обнаружения IgA антител к ПАУ от II стадии к III стадии рака до начала лечения и к прогрессирующей форме рака на фоне комбинированного лечения (показатели соответственно 39,6%; 27,6%; 12,8%). При этом, хотя частота обнаружения IgA антител при регрессе несколько выше, чем при прогрессе опухоли, все же она ниже, чем до начала лечения.

Таким образом, налицо изотипические различия в образовании AT к ПАУ у больных с разными формами клинического течения рака. При регрессивном течении с положительным прогнозом частота обнаружения IgM и IgG AT выше, а IgA AT - ниже, чем до начала лечения. Это указывает на разнонаправленный характер взаимосвязи с патогенезом опухолевой болезни у IgM и IgG AT к ПАУ, с одной стороны, и у IgA AT - с другой.

При сравнении выделенных четырех групп больных по содержанию РЭА в сыворотке установлено следующее (табл. 7). Развитие опухолевого процесса от II стадии к III до лечения и далее - к прогрессивному росту на фоне комбинированного лечения сопровождается отчетливым ростом доли больных, у которых количество РЭА превышает 10 нг в 1 кл сыворотки. Показатели составляли соответственно 25.5; 33,3 и 42 %. (Разница между первым и последним из них достоверна по критерию 1г). Напротив,

при регрессии опухоли доля таких больных составляла всего 8 %, что достоверно меньше, чем у больных до начала лечения и у больных с прогрессом опухоли на фоне лечения. Полученные результаты соответствуют данным Высоцкой И.В. с соавт. (1993) и других исследователей о взаимосвязи количества РЭА в сыворотке со степенью распространенности опухолевого процесса и характером его течения при комбинированном лечении.

Иммуногенность РЭА в этом аспекте ранее не изучалась ни -при раке молочной железы, ни при других опухолевых заболеваниях. По таблице 7 видно, что распределение больных по содержанию РЭА в составе ЦИК примерно одинаково во всех четырех сравниваемых группах. Однако, само по себе количество РЭА, осаждаемого в сыворотке в виде ЦИК, не полностью характеризует его иммуногенность. В таблице 8 показано распределение больных раком молочной железы по молярному соотношению РЭА в сыворотке к РЭА в составе ЦИК. Видно, что больные раком II и III стадии почти не.различаются по иммуногенности РЭА. Вместе с тем, имеются резко выраженные различия между больными до начала лечения и больными в. процессе комбинированного лечения. Иммуногенность РЭА у последних, резко снижена. Так, доля больных с молярным соотношением РЭА в сыворотке / РЭА в ЦИК, не превышающим 2, у больных до лечения составляет 71,5%, а у больных в процессе лечения - 36,2%. Эти различия'высоко достоверны по критерию X2.

Если-сопоставить данные по иммуногенности ПАУ и РЭА при разных формах течения рака молочной железы на фоне комбинированного лечения, можно увидеть отчетливые закономерности. При успешном лечении опухоли наблюдается более выраженная реакция IgM и IgG AT на ПАУ, чем при прогрессе,' хотя воздействие на

Таблица 7.

Распределение больных раком молочной железы по содержанию РЭА в сыворотке и в составе ЦИК

N 1 Группа i 1 Частота обнаружения РЭА (нг/мл) в интервалах:

10-5 i 5-10 i 10 - 20| 20 - 30 30 - 40 > 40

сыворотка

До лечения:

1 1 II стадия 118/47 17/47 8/47 I 3/47 1/47 -

| (38.3%) (36.2%) (17.0%)| (6.4%) (2. 1%)

1 2 III стадия I28/69 20/69 19/69 | - 1/69 1/69

I(40.6% (30.0%) (27.5%)| (1.4%) (1.4%)

При лечении:

1 3 Регресс 113/25 10/25 2/25 ! - - -

|(52.0%) (40.0%) (8.0%) |

1 4 Прогресс | 6/33 13/33 7/33 | 2/33 - 5/33

| (18.0%) (39.0%) (21.0%)1 (6.0%) (15.0%)

ЦИК

До лечения:

2. 1 II стадия I29/47 13/47 4/47 I - 1/47 -

1(61.7) (27.7%) (8.5%) | (2. 1%)

2. 2 III стадия 143/69 12/69 13/69 | 1/69 - -

I(62.3%) (17.4%) (18.8%)| (1.4%)

При лечении:

2. 3 Регресс 119/25 5/25 1/25 I - - -

1(76.0%) (20.0%) (4.0%) I

2. 4 Прогресс 128/33 2/33 2/33 | 1/33 - -

1(85.0%) i (6.0%) i (6.0%).| i (3. 0%) 1 i

Достоверность различий (X2) 1.1 - 1.4; р<0.01 (1.1+1.2) - 1.3; р<0.05 1.3 - 1.4; р<0.01

Таблица 8'.

Распределение больных раком-молочной железы по молярному соотноыению РЭА в сыворотке к РЭА в составе ЦИК

1 N| Группа г I Соотношение РЭА в сыворотке / РЭА в ЦИК

1 1 1 < 1 1 >1-2 1 >2 - 4 | 1 >4 - 8 | > 8

До лечения: |

11 II стадия 1 10/47 | 22/47 8/47 | 4/47 | 3/47

1 (21.3%)| (46.8%) (17.0%)| (8.5%) | (6.4%)

2| III стадия 123/69 | 28/69 13/69 . I 3/69 I 2/69

I (33.3%)| (40'. 6%) (18.8%)i (4.3%) | (2.9%)

Пои лечении: - ■

31 Регресс 1 2/25 | 11/25 7/25 | 4/25 | 1/25

1(8.0%) I (44.0%) (28.0%)| (16.0%)I (4.0%)

4| Прогресс 1 1/33 | 7/33 9/33 .1 7/33 | 9/33

1 1(3.0%) | 1 1 (21.2%) 1 (27.3%) | 1 (21.2%)| 1 (27.3%)

Достоверность различий (X2) (1+2) - (3+4); р < 0.001

3-4 ; р < 0.05

больных ПАУ окружающей среды продолжалось и в том, и в другом случае. При регрессе опухоли наблюдается более высокая иммуно-генность РЭА, хотя опухолевая ткань в организме не определяется и количество РЭА в сыворотке резко сокращается. Более того, усиление образования АТ к ПАУ и иммуногенности РЭА при регрессе опухоли происходит на фоне иммуносупрессивного лечения. Это

говорит о том, что характер течения опухолевого заболевания определяется индивидуальными особенностями организма, определяющими иммуногенность ПАУ и РЭА, при прочих равных условиях (воздействие ПАУ окружающей среды и влияние иммунотоксического лечения).

7. Концепция о нарушениях межклеточных взаимодействий антителами при бластомогенезе.

Концепция о возможном участии АТ в нарушениях межклеточных взаимодействий при бластомогенезе основана на двух группах данных. С одной стороны, известно, что иммунная реакция на химические канцерогены и трансформированные клетки может как тормозить', так и стимулировать возникновение и прогрессию опухолей. С другой стороны, установлена способность искусственных гетероАТ к различным рецепторам и лигандам имитировать или блокировать действие соответствующих лигандов ln vi tro и 1п vivo, в т.ч. при опухолевом росте. Причем, агонистическое или антагонистическое действие АТ зависит от их количества (т. е. от соотношения АГ-АТ) и от валентности (т. е. от изотипа и степени фрагментации).

На наш взгляд, вполне уместно допущение того, что в естественных условиях имеются АТ, специфичные к рецепторам клеток и внеклеточным лигандам. Иммунорегулирующее действие таких АТ обусловлено не только цитотоксическим или блокирующим эффектом, но и способностью имитировать или блокировать действие внеклеточных лигандов при связывании с клеточными рецепторами. Т.е. лимфоидная система рассматривается нами как эволюционно вторичный, надстроечный механизм регуляции межклеточных взаимодействий.

- 42 -

С этих позиций, нарушения межклеточных взаимодействий при различных патологиях, в т.ч. под воздействием антропогенных факторов окружающей среды, представляются в виде следующей ин-тегративной схемы (рис.5)

Химически инертные водонерастворимые органические ксенобиотики (КБ), попадая в организм, подвергаются метаболической функционализации, главную роль в которой играет система цитох-ромов Р -450 (1). В результате появляются химически активные, водорастворимые производные КБ, которые выводятся из организма обычными путями. Вместе с тем, некоторые из них образуют стойкие аддукты с нуклеиновыми кислотами и белками (2,3). Образуя аддукты.с макромолекулами, КБ становятся типичными гаптенами и способны индуцировать синтез специфических АТ (4). Секреторные АТ связывают КБ на границе с внешней средой, препятствуют его проникновению во внутренние среды организма и тем самым снижают риск возникновения тех или иных заболеваний (5).

Однако, образование аддуктов с макромолекулами приводит и к негативным последствиям. Реакции с ДНК индуцируют мутации, в т. ч. в генах, контролирующих деление и дифференцировку клеток (6). Следствием этого являются структурные изменения белков, участвующих в межклеточных взаимодействиях (7). Первичные нарушения межклеточных взаимодействий усугубляются, очевидно, непосредственным повреждением белков и мембранных липидных структур клеток КБ и их метаболитами. (Естественно, на уровень и характер первичных нарушений под действием КБ оказывают существенное влияние и другие факторы окружающей среды, например, радионуклиды) .•

В зависимости от того, какие именно молекулы подверглись структурной перестройке, наблюдаются те или иные нарушения межклеточных взаимодействий.

индукция АТ к К/Б

ч I

образование аддуктов К/Б с ДНК

ОРГ К/Б

I

-Я

тт

Метаболическая функционализа-ция К/Б

Образование аддуктов К/Б с белками

Индукция АТ к К/Б

ЖЕ

Индукция АИТ АТ к К/Б

Мутации в генах и структурные изменения в белках, контролирующих межклеточные взаимодействия.

Первичные нарушения межклеточных взаимодействий

?

1. Факторы роста и их рецепторы

2. молекулы межклеточных контактов

3. Молекулы адгезии к матриксу

4. Гормоны, их рецепторы и транспортные белки

5. Другие

хо

Интеграция

реакций

организма

%1,

Патологические состояния: канцерогенез и другие

I

оо I

13

Вторичные (иммунные) нарушения межклеточных взаимодействий

. и

Рис. ЧЛ. Первичные и вторичные (иммунные) нарушения межклеточных взаимодействий под действием органических ксенобиотиков окружающей среды. ОРГ К/Б - органические ксенобиотики; АТ - антитела; АИТ - антиидиотипические АТ; Э/Б -эндобиотики.

. - 44 -

Наряду с первичными, возможны и вторичные, иммунные, нарушения межклеточных взаимодействий. Структурные изменения белков вследствие мутаций индуцируют образование АТ, специфичных к вновь появившимся АГ детерминантам (8). Образование ад-дуктов КБ с макромолекулами индуцирует появление АТ не только к гаптену, но и к носителю - ДНК (9) и белку (10). Если носителем является фермент, метаболизирующий КБ, то появляются АТ к ферменту (11), способные вмешиваться в процесс метаболической функционализации КБ (12). В ответ на появление АТ на носители и гаптены происходит образование соответствующих ан-ти-идиотипических АТ (13,14).

АТ к макромолекулам организма и их антиидиотипы, вступая в сетевые взаимоотношения друг с другом и конкурируя с внеклеточными лигандами за связывание с рецепторами, индуцируют дополнительные вторичные нарушения межклеточных взаимодействий (15,16,19).

АТ к КБ и их метаболитам/ имеющим структурное сходство с эндобиотиками и их метаболитами,а также соответствующие антиидиотипы привносят свой вклад в нарушение межклеточных взаимодействий (17,18,19). Наиболее очевидным'и важным типом таких взаимодействий представляется система ПАУ - с-тероиды - рецепторы - АТ.

Сложность и неоднозначность функционирования каждого из указанных звеньев предполагает интеграцию различных нарушений межклеточных взаимодействий в общую реакцию организма на весь комплекс внешних воздействий (20). Результатом интегративной реакции является либо адаптация, либо развитие того или иного патологического состояния (21).

- 45 -

Появление и прогресс опухоли свидетельствуют о том, что совокупность индивидуальных особенностей иммунной реакции на канцерогены окружающей среды и эндобиотики направлена, в целом, на усугубление первичных нарушений межклеточных взаимодействий.

ВЫВОДЫ'

1. У здоровых лиц и больных раком, проживающих в условиях интенсивного загрязнения окружающей среды полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), образуются и

к ПАУ.

2. Между здоровыми людьми и больными раком имеются изотопические различия в образовании антител к ПАУ. 1ёУ1 и ^ чаще встречаются у"больных раком желудка, а антитела - у больных раком молочной железы, по сравнению со здоровыми людьми.

3. Между больными раком различного гистогенеза имеются изотопические различия в образовании антител к ПАУ. антитела у больных раком желудка встречается чаще, чем у больных раком молочной железы.

4. У больных раком молочной железы образуются 1£М,и 1сЛ анти-идиотипические антитела к ПАУ. Наличие анти-идиотипи-ческих антител может сопровождаться как отсутствием, так и резко выраженным образованием прямых антител к ПАУ.

5. В составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) у некоторых больных раком имеются антигенные компоненты 29, 37. 95 КД, схожие по мол.массе с аз, а7,р2 субъединицами интегринов и с малой субъединицей рецептора инсулиноподобного фактора роста I.

6. В составе ЦИК у некоторых больных раком желудочно-кишечного тракта и раком молочной железы имеются антитела, реагирующие с рецептором эпидермального фактора роста, а также с клеточными пептидами, схожими по мол. массе с большой субъединицей рецепторов инсулина и инсулиноподобного фактора роста I и с рецептором к ламинину.

7. Иммуногенность раково-эмбрионального антигена (РЭА), проявляемая в способности образовывать ЦИК с антителами,различна у больных раком различного гистогенеза. У больных раком молочной железы РЭА находится в основном з высокоиммуногенной форме, а у больных раком желудка и раком толстой и прямой кишки - в низкоиммуногенной форме.

8. У некоторых больных раком образуются антитела класса й, угнетающие адгезивность опухолевых клеток к внеклеточному мат-риксу (стеклу и фибронектину).

9. Иммуногенность ПАУ и РЭА взаимосвязаны у больных раком молочной железы. Образование 1яА - АТ к ПАУ взаимосвязано с высокой, а--АТ к ПАУ - с низкой иммуногенностью РЭА.

10.При регрессе рака молочной железы на фоне комбинированного лечения и положительном прогнозе заболевания чаще выявляются 1&С-АТ к ПАУ и высокоиммуногенная форма РЭА, чем при прогрессе опухоли и отрицательном нрогнозе.

И.Установлен неизвестный ранее механизм нарушений межклеточных взаимодействий при бластомогенезе у человека.. В основе этого механизма лежит образование антител к молекулам основных типов межклеточных взаимодействий: рецепторам гуморальных факторов роста, молекул,межклеточных контактов, молекул адгезии к внеклеточному матриксу, а также к химическим канцерогенам группы ПАУ.

- 47 -

Список работ.опубликованных по теме диссертации

1. Теоретические и экспериментальные основы антиблокирующей иммунотерапии рака. // Изд-во Томского ун-та, Томск, 1982, 128с. (соавт. Клячкин Б.М., Басаргин С.т.)

2. Результаты промежуточных этапов экспериментальных и клинических исследований антиблокирующей иммунотерапии при раке. // Тез.докл. межреспубликанского симпозиума "Неоспецифические стимуляторы противоопухолевого иммунитета. Юрмала 19-31 марта 1983г." Рига, 1983, с.145-146 (соавт. Клячкин Б.М., Басаргин С.Т., Климов И.А. и др.)

3. Влияние мембраностабилизирующих препаратов и ингибиторов протеаз на блокирующую активность сыворотки и рост экспериментальной опухоли // В кн. "Новые подходы к вопросам иммунологии рака. Протокол и материалы республиканского совещания. Кемерово 10-11 декабря 1984г." Кем. книжн. изд-во,1986, с.47-93. (соавт. Клячкин Б.М., Басаргин С.Т., Климов И.А. и др.)

4.*- О механизме образования блокирующих факторов и методе антиблокирующей терапии // Вопр.онкологии, 1985, N 2, с.78-84 (соавт. Клячкин Б. М., Басаргин С.Т., Коростелев А. А. и др.)

5. К вопросу о сывороточных блокирующих факторах // В сб.:Актуальные вопросы иммунотерапии опухолей. Юрмала, 19-21 апреля 1988 г., часть 1. Рига,1988, с.139-140 (соавт. Клячкин Б.М., Басаргин С.Т., Железнова Л.Я. и др)

6. Иммунные комплексы у больных раком молочной железы // Там же часть 2, с.91-92 (соавт. Паутова Л.В., Трунова Т.Б. и др.)

- 48 - |

7. Иммунорегуляция межклеточных взаимодействий // Иммунология, 1989, N 4, с. 10-13.

8. Автоматизированный спектрально-вычислительный комплекс и его применение в биологии и медицине // Препринт N 134 Б, Инст. биофизики СО РАН, Красноярск, 1990. с. (соавт. Аксенов А.А., Климов И.А., Трунова Т.Б. и др.)

9. Immunological aspects of the autonomous behavior of tumors// Biomedical Science, 1990, v.l, p.565-570.

10. Флюориметрический метод определения адгезивности клеток // I Эксперим.онкология, 1991, N 1, с.34-37 (соавт. Аксенов- ; А.А., Трунова Т.Б.)

11. Иммунология автономного поведения опухоли // Иммунология,- j 1991, N 5, с. 11-15 ~ '

12. Состав циркулирующих иммунных комплексов при раке легкого j и раке яичников // Эксперим.онкология, 1993, N 2, с.60-62. j (соавт. Аносова Т.П., Аносов И.П.)

13. Получение антител против фторметилбензантрацена // Экспе- ■ [

I

рим. онкология, 1994, N 4-6, с.437-440. (соавт. Климов И. А., Костянко М. В.. Кузнецов Л. В.)

14. Тест-системы для анализа специфической иммунореактивности

I

человека к канцерогенам // В сб.: Экология человека и ги-

I

гиена окружающей среды. Новокузнецк, СО РАМН, 1994, с.66 (соавт. Климов И. А., Аносова Т.П.)

15. Method and test-systems for Immunoassay of human antibodies to-chemical carcinogens // Int. J. of Immunorehabilitation, 1994, N 1 - Suppl., p. 123 (With Anosova T.P., Kli'mov I. A.)

16. The environmental pollytion by the carcinogens and mechanisms of the human Immunochemical reactivity // ICQNE -95. International Conference Neurolmmune Interactions and Environment. St.Petersburg. Russia, 17-24 July, 1995. (With Anosova T.P.. Shabaldln A.V.,Shjukina M.L. et al.)

17. Перспективы применения иммуноанализа антител к химическим канцерогенам в ранней диагностике онкозаболеваний // В сб.: 7 Республиканская конференция "Онкология - 95" Казань, 7-9 июня-1995. (соавт. Громов К.Г., Курилов К.С., Аносова Т.П. и др.)

18. A new approach to Investigation of interrelations between oncological diseases and industrial and ecological influences // The II nd international Symposium of Japan-Russia Medical exchange foundation and the NFA Region Sept. 19-21.6. 1994, Vladivostok, Russia, p.93 (With Gromov . K. G.. Larln S. A., Klimov I. A. et. al)

19. Торможение адгезии опухолевых клеток под влиянием антител, выделенных из асцитической жидкости больных раком яичника //Эксперим. онкология, 1995, N3, (соавт. Аносова Т.П., Овчарук И. Н.)

20. Гаптен-специфические иммунные . реакции на канцерогены у больных раКом // В сб.: Экологическая патология: вопросы-биохимии. фармакологии, клиники. Чита. 1995, с.94. (соавт. Климов И. А., Аносова Т. П., Щукина М. Л.)

21. Новые иммунологические методы оценки канцерогенного воздействия на организм человека // П-й Международный симпозиум по проблемам саногенного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма. Чол-пон-Ата:, 5-8 сент.', 1995г. (соавт. Аносова Т.П., Щукина М. Л., Аносов М. П. и др.)

- 50 - -

22. Антитела к полициклическим ароматическим углеводородам (ПАУ) у больных раком молочной железы // В сб.: 12 Республиканская конференция "Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояний". Челябинск, 1995, с. 33. (соавт. Аносова Т.П..,

. Климов И.А., Костянко М. В.)

23. Система оценки иммунотропного влияния окружающей среды Кемеровской области на организм человека /В сб.: Окружающая среда и здоровье населения. Материалы конференции "Современные проблемы охраны окружающей среды в Сибири" СО РАМН, 1995. Новокузнецк 1995. с.40 (соавт. Аносова Т.П., Шабал-дин A.B., Аносов М.П.).

24. Новые перспективы иммунодиагностики и иммунопрофилактики рака // Областная научно-практическая конференция "Медико-биологические проблемы профилактики заболеваний промышленного региона Кузбасс",Кемерово,1995,с.23.

25. Камера для культивирования клеток// АС N 1049536 (соавт. Климов И. А., Окунев И. М.).

Зжхяг 565. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Обьеы 3 п.л. Формат 60X84/ 1/16 Типография Кузбасского государственного технического университета. 650026 Номеров», ул. Весенняя, 28