Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Окись азота в патогенезе диэтил-нитрозамин-индуцированного гепатоканцерогенеза

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ВТОРОЙ ТАШКЕНТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК: 616-006.6+616.36:541.451+546.17

МУХАМЕДОВА МУНИСА ТУРАЕВНА

ОКИСЬ АЗОТА В ПАТОГЕНЕЗЕ ДИЭТИЛ-НИТРОЗАМИН-ИНДУЦИРОВАННОГО ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕНЕЗА

14.00.16 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ташкент 2004

Работа выполнена во Втором Ташкентском Государственном медицинском институте.

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РУз,

доктор медицинских наук, профессор Х.Я. КАРИМОВ

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук,

профессор М.М. ХАКБЕРДИЕВ

Доктор медицинских наук, профессор А.Н. АРИПОВ

Ведущее учреждение: Первый Ташкентский Государст-

венный медицинский институт

Защита состоится «

//» ииа Я

2004 г. в

Л

аО

час

на заседании Специализированного Совета Д.087.09.02. при Второе ТашГосМИ (700109, Ташкент, ул. Фароби, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Второго ТашГосМИ.

Автореферат разослан « О

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук, профессор

2004 г.

БАТЫРБЕКОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается увеличение частоты развития опухолей в печени. Злокачественные опухоли печени составляют 2-3% в структуре онкологических заболеваний (А.А. Пономарев и соавт., 2000). Среди всех опухолей печени на первичное злокачественное перерождение приходится 8690,2%, а среди всех первичных злокачественных опухолей печени основная масса (около 90%) опухолей составляет гепатоцеллюляр-ный рак печени. Увеличение числа первичного рака печени за последнее десятилетие объясняют (G. Ballardini et al., 1994; В.А. Журавлев и соавт., 1996; В.П. Девичинский и соавт., 2000) повышением частоты цирроза печени и лучшей выявляемостью опухолевого процесса. Несмотря на достигнутые успехи в лечении данной патологии, смертность остается высокой. В её развитии ведущая роль принадлежит образованию эндогенных нитросоединений (Б.Л. Ру-бенчик, 1990; Б.Л. Рубенчик и соавт., 1990) под воздействием нит-ратсодержащих лекарственных препаратов и нитратов, поступающих с пищей.

В последнее время большое внимание уделяют изучению свободных радикалов, оксида азота и его производных в развитии бластомогенеза. Установлена их роль в развитии и прогрессирова-нии рака легкого (S. Ambs et al., 1998), молочной железы (L.L. Thomsens et al., 1995; A. Duenasgonsales et al., 1997; S. Reveneau,

1999), в опухолевом перерождении язв желудка и двенадцатиперстной кишки (С. Ambs et al., 1998; С. Doi et al., 1999; А.И. Гоженко,

2000), мочевого пузыря (L.C. Jadeski et al., 1999; A.A. Mohsen et al., 1999), центральной нервной системы (S. Iwata, 1999) и т.д. Большей частью это связано с их способностью повреждать ДНК и, таким образом, вызывать мутации.

Окись азота (N0 ), являющаяся универсальным биорегулятором гомеостаза в клетках и выполняющая многочисленные функции, в высоких концентрациях оказывает токсическое действие на клетки (S. Moneada et al., 1991; И.Д. Малышев, 1997; А.Ф. Ванин, 1998), в частности, пероксинитрит. Он легко проникает через ли-пидный бислой мембраны, ингибирует белки митохондриальной дыхательной цепи, снижает продукцию АТФ и нарушает кальцевый

гомеостаз; угнетает антиоксидантные ферменты, усиливает образование супероксидного аниона. Пероксинитрит модифицирует и разрывает цепи ДНК, одновременно ингибируя ДНК-лигазу, что вызывает ещё большее повреждение ДНК и клетки в целом (И.Ю. Малышев и соавт., 2000).

Хронические воспалительные реакции также сопровождаются образованием супероксидных радикалов (Г.А. Бабенко и соавт., 1985; Е.В. Ткаченко и соавт., 1996). По мнению X. Маеды (1998), в тканях многих солидных опухолей содержится повышенный уровень индуцибельной формы ЫО-синтазы (¿N08); образуемая этим ферментом N0° повышает проницаемость сосудов, что увеличивает приток питательных веществ к ткани опухоли и обеспечивает быстрый её рост. Д.А. Винк и соавт. (1998) показали, что ингибирование синтеза N0° в макрофагах снижало противоопухолевую сопротивляемость организма, а исследованиями Д.С. Женкинс (1995) показано, что N0° активизировала рост опухоли. Эта двойственность определяется тем, на какой стадии развития опухоли действует N0°, а также количеством синтезированного N0°. Таким образом, невыясненное до конца значение N0° в развитии бластомогенеза делает актуальной расшифровку некоторых механизмов злокачественного перерождения гепатоцитов.

Наиболее удобной моделью гепатоканцерогенеза, близкой к клинике, является диэтилнитрозамин (ДЭНА) индуцированный канцерогенез. Его важным аспектом является возможность проследить основные стадии неопластического перерождения клеток печени. С другой стороны, в организме человека в желудочном соке при применении нитритсодержащих препаратов могут образовываться нитрозосоединения, обладающие канцерогенным свойством (А.П. Ильницкий и соавт., 2000). Следует сказать, что канцерогенным действием обладают не сами нитрозамины, а их метаболиты, образующиеся в результате ферментативного окисления - диазоал-каны. Несмотря на детальные исследования канцерогенного действия нитрозаминов, данные о взаимосвязи ДЭНА-индуцированного бластомогенеза с окисью азота и перекисным окислением липидов (ПОЛ) в публикациях отсутствуют. Тем более это актуально с позиции современной онкологии: позволит переосмыслить некоторые стороны опухолевого перерождения печени и усовершенствовать

принципы её химиотерапии. Все вышеизложенное определило цель настоящего исследования.

Цель исследования: изучение значения окиси азота во взаимосвязи с процессами перекисного окисления липидов на различных стадиях гепатоканцерогенеза, индуцированного диэтилнитро-замином.

Для достижения цели определены следующие задачи:

1) изучить в динамике ДЭНА-индуцированного канцерогенеза содержание нитритов, Ь-аргинина в сыворотке крови и маркера МО-синтазы, в частности, НАДФН-диафоразы в ткани печени;

2) выявить особенности изменений интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови и ткани печени при ДЭНА-индуцированном канцерогенезе во взаимосвязи с системой Ь-аргинин-окись азота;

3) исследовать активность некоторых ферментов антиоксидант-ной защиты (АОЗ) в крови и ткани печени при гепатоканце-рогенезе, индуцированном ДЭНА, и сопоставить их с показателями системы Ь-аргинин-окись азота;

4) провести морфологическое исследование печени в процессе развития ДЭНА-индуцированного канцерогенеза. Научная новизна. Впервые на большом экспериментальном

материале показано значение N0° на всех стадиях развития ДЭНА-индуцированного гепатоканцерогенеза. На стадиях инициации и промоции отмечается индукция системы Ь-аргинин-окись азота (снижение содержания Ь-аргинина на фоне увеличения N02), подавление - на стадии прогрессирования и вновь её активизация на заключительной стадии гепатоканцерогенеза, направленная на инвазию и метастазирование опухолевых клеток. Установлено повышение уровня малонового диальдегида (МДА) в гомогенате печени через 3, 4, 5 и 6 мес. и прогрессивное его снижение в процессе развития метастазирования. Изменения активности супероксиддисму-тазы (СОД) в пораженном органе проявляется её активизацией на стадиях инициации и прогрессировании, глубоким угнетением на заключительных стадиях гепатоканцерогенеза. В отличие от гомо-гената печени, в крови активность СОД прогрессивно снижалась по мере прогрессирования опухолевого процесса.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На стадии инициации и промоции гепатоканцерогенеза система Ь-аргинин-окись азота активизируется, в период про-грессирования она ингибируется. Значение этой системы возрастает на заключительной стадии и направлено на васкуля-ризацию опухолевой ткани и метастазирование.

2. Действие окиси азота на начальных стадиях гепатоканцерогенеза проявляется через взаимодействие её с активными радикалами кислорода путем образования пероксинитрита. Это проявляется в увеличении уровня МДА на стадии инициации и промоции, резким снижением на стадии метастазирования. Научно-практическая значимость результатов исследования. Полученные результаты расширяют представление о патогенезе ДЭНА-индуцированного гепатоканцерогенеза. Выявленные изменения в системе Ь-аргинин-окись азота и МДА на различных этапах гепатоканцерогенеза свидетельствуют о сложных их взаимоотношениях в развитии опухолевого процесса, зависящих от стадии канцерогенеза. Это указывает на необходимость дифференцированного подхода в выборе химиотерапевтических средств. Определение в сыворотке крови уровня Ь-аргинина, N02, МДА и активности СОД могут служить диагностическими критериями определения стадий развития опухолевого процесса.

Реализация результатов. Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедр нормальной, патологической физиологии, биоорганической и биологической химии Второго ТашГос-МИ.

Апробация работы. Основные положения работы представлены на заседаниях ЦНИЛ И-ТашГосМИ (2001 г., 2003 г.); на межкафедральной конференции с участием кафедр патологической физиологии, нормальной физиологии, биохимии, гистологии и ЦНИЛ Н-ТашГосМИ (2003 г.); на межкафедральной конференции с участием кафедр патологической физиологии, биохимии, клинической фармакологии и ЦНИЛ 1-ТашГосМИ (2003 г.); на заседании научного семинара при Специализированном совете по специальности (2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ в зарубежных и республиканских научных журналах и сборниках; из них 5 журнальных статьей.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 119 машинописных страницах. Состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов. Иллюстрации: 9 таблиц и 16 рисунков. Указатель литературы включает 172 отечественных и зарубежных источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены на 126 крысах-самцах массой тела 100-120 г. Для индуцирования гепатоканцеро-генеза 96 крысам вводили ДЭНА, внутрижелудочно зондом 5 раз в неделю в дозе 10 мг/кг массы тела в течение 2 месяцев (JT.M. Ша-бад, 1970). Летальность к концу эксперимента составила 27,1%. Контрольную группу составили 30 интактных крыс, содержавшихся в тех же условиях в течение всего эксперимента. Животных декагш-тировали под легким эфирным наркозом через 3, 4, 5, 6, 7 и 8 мес. от начала эксперимента. Такая схема эксперимента была выбрана для детального изучения значения оксида азота во взаимосвязи с процессами ПОЛ на каждом этапе развития канцерогенеза: стадиях инициации (через 3 мес.), промоции (через 4 и 5 мес.), прогрессии (через 6 мес.) и метастазирования (через 7 и 8 мес.).

Часть печени крыс гомогенизировали в среде выделения (0,05М раствора трис-НС1-буфера, рН 7,2) для определения активности ферментов антиоксидантной защиты: СОД (В.Г. Мхитарян и соавт.,1978), каталазы (М.А. Коралюк и соавт., 1988) и продукта ПОЛ - МДА (Л.И. Андреева и соавт., 1989). Определение НАДФН-диафоразы в печени проводили гистохимически (Д.Э. Коржевский, 1996). Аминокислотный состав сыворотки крови определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе DuPont (США), на колонке 250/8/4 Nucleosil 5 С18 (A. Steven et al., 1988; Т. Дэвени и соавт., 1994) в Институте биоорганической

химии АН РУз (совместно с с.н.с. Зиевитдиновым Ж). В сыворотке крови содержание конечного продукта оксида азота - N02 определяли с использованием реактива Грисса; активность ферментов АлАТ, АсАТ и щелочной фосфатазы, содержание общего белка и альбуминов - на автоматизированном биохимическом комбайне «Autohumolizer Fl» («Human», Германия) с помощью специальных наборов реактивов. Для общеморфологических исследований печень фиксировали в формалине, готовили тонкие срезы, окрашивали гематоксилин-эозином и визуализировали на световом микроскопе.

Результаты крыс опытной группы, в морфологической картине печени которых выявлялись специфические изменения, характерные для каждой стадии гепатоканцерогенеза, статически обрабатывали на компьютере Pentium-II NT с помощью пакета прикладных программ и вычислением t-критерия Стьюдента-Фишера и корреляционных взаимоотношений.

Результаты и их обсуждение

Результаты исследования показали, что введение ДЭНА приводит к постепенному повышению уровня N02 в сыворотке крови: на 28,5; 52,7 и 41,4%, соответственно, через 3, 4 и 5 мес. от начала опыта (табл.). Через 6 мес. его уровень снижался в 1,43 раза по сравнению с показателями предыдущего срока и приближался к норме, а в последующие сроки (через 7 и 8 мес.) - вновь повышался на 32,6 и 39,6%, соответственно.

Одним из показателей, отражающих процессы синтеза N0°, является содержание L-аргинина. Он является начальным продуктом этой цепи и в процессе его распада образуется метаболит N0°, который в дальнейшем при участии ферментных систем превращается в конечные продукты -N02 и N03. Окись азота синтезируется при участии фермента NO-синтазы и поэтому изменение содержания исходного продукта данного процесса будет в определенном смысле характеризовать состояние NO-системы.

Динамика изменения содержания N02 и L-аргиннна в сыворотке крови экспериментальных животных, М±т

Срок исследования, мес. Уровень L-аргинина, ммоль/л Содержание N02, мкмоль/л

Через 3 0,090±0,001* 0,130±0,001 11.64±0,076 9,065±0,033

Через 4 0.071±0,005* 0,129±0,001 13.97±0,024* 9,150±0,011

Через 5 0.068±0,001* 0,131±0,001 12.90±0,030* 9,126±0,009

Через 6 0.133±0,002 0,125±0,002 9.031±0.025 9,180±0,015

Через 7 0.108±0,001* 0,127±0,002 12.26±0.025* 9,240±0,015

Через 8 0.112±0,001* 0,126±0,001 12.91±0.031* 9,254±0,011

Примечание: 1. В числители представлены значения крыс с ДЭНА-индуцированным канцерогенезом; в знаменателе - интактной группы. 2. * - различия между показателями интактной и опытной групп достоверны, Р<0,05.

Учитывая вышеизложенное, мы исследовали аминокислотный состав сыворотки крови экспериментальных животных в динамике развития гепатоканцерогенеза. Содержание L-аргинина снижалось уже через 3 мес. от начала введения канцерогена в 1,4 раза по сравнению с параметрами интактных животных того же срока (табл.). Через 4 и 5 мес. это снижение было ещё более выраженным в 1,82 и 1,93 раза (Р<0,05). Такое снижение содержания L-аргинина в сыворотке крови экспериментальных животных в ранние сроки исследования может быть связано с повышенным его использованием вследствие экспрессии гена iNOS и направлено на обезвреживание перерождающихся опухолевых клеток. Однако в дальнейшем активизации индуцибельной формы NOS не наблюдалось. Подтверждением этому является достоверное повышение уровня L-ap-

гинина приблизительно в 2 раза по сравнению с показателями предыдущего срока и приближение его к значениям интактных животных через 6 мес. от начала эксперимента. На наш взгляд, 6-мес. является как бы переломным моментом в процессе опухолеобразова-ния, так как в дальнейшем (через 7 и 8 мес.) мы вновь наблюдали постепенное снижение содержания L-аргинина. Видимо, в этих условиях индукция N0° обусловливает возможность прикрепления отторгающихся опухолевых клеток к другим участкам, так как согласно Р. Edwards et al. (1996), в период метастазирования N0° создает условия для циркуляции отторгшихся опухолевых клеток, переноса в другие органы, системы и их прикрепления. Подтверждением этой мысли является наличие отрицательных коррелятивных связей между уровнем L-аргинина и N02.

Синтез NO0 (А.И. Гоженко и соавт., 2000) осуществляется с участием фермента NO-синтазы (НАДФН-диафоразы) и поэтому для более полной характеристики системы Ь-аргинин-ЫО0 целесообразно определять активность данного фермента в гепатоцитах. Проведенные в этом плане исследования показали, что у интактных животных в различных зонах ткани печени выявляются отдельные гепатоциты, содержащие небольшое количество, сливающихся между собой гранул формазана, которые в основном расположены по контурам купферовских клеток, перипортальной соединительной ткани и стенок сосудов, особенно межбалочных синусоидов. Результаты исследования печени крыс с ДЭНА-индуцированным ге-патоканцерогенезом через 3 мес. показали значительное увеличение гранул формазана, которые выявлялись во всех морфо-функцио-нальных зонах ткани печени, более интенсивно в перипортальной и централобулярной зонах и купферовских клетках. Через 4-5 мес. они более интенсивно концентрировались в зонах ткани печени с выраженными дистрофическими изменениями; через 6 мес. - в паренхиме печени они были менее выражены и выявлялись местами, имея очаговый характер скопления. Через 7 мес. - гепатоциты увеличены в размерах, цитоплазма их расширена, вакуолизирована, гранулы NO-синтетазы сконцентрированы по периферии клеток. В стромальных элементах формазан выявляется в виде сливающихся темно-серого или серо-коричневого цвета включений, что, по-видимому, связано с усилением процессов патологической регенерации

как паренхиматозных, так и стромальных элементов ткани печени в динамике гепатоканцерогенеза. Через 8 мес. фермент-положительные гранулы в печени расположены и распределены неравномерно и проявляются в виде более интенсивных окрашенных и сливающихся между собой мелких и крупных включений. В цитоплазме дистрофически измененных гепатоцитов они имеют гранулярный вид, а в стромальных элементах проявились в виде сливающихся темно-фиолетового цвета включений.

Одним из токсических проявлений окиси азота является образование пероксинитрита, оказывающее выраженное мембранодест-руктивное действие, связанное с интенсификацией ПОЛ. Связи с этим нами были исследованы содержание МДА и активность ферментов АОС - СОД и каталазы в крови и гомогенате печени у экспериментальных животных. Проведенные исследования показали, что на стадии инициации опухолевого процесса (через 3 мес.) уровень МДА в сыворотке крови слегка повышался; на стадии промоции - резко возрастал, превышая параметры интактных животных этого же срока исследования на 104,7% (Р<0,05); затем постепенно снижался и к концу исследования был на 42% (Р<0,05) ниже нормативных параметров.

Динамика и выраженность изменений МДА в гомогенате печени несколько отличались от параметров крови. Так, отмечено постепенное повышение уровня МДА до 5 мес. (на 145,9%; Р<0,05), сохранение его на том же уровне через 6 мес., а в дальнейшем - резкое снижение продуктов ПОЛ (ниже параметров нормы на 18,1%, Р<0,05).

Как было отмечено ранее, между системами L-аргинин-оксид азота и ПОЛ существует определенная корреляция. По мнению ряда исследователей (P.E. Григалевски, 1997; X. Маеда и соавт., 1998), цитотоксическое действие N0° проявляется через образование пероксинитрита в результате взаимодействия первого с кислородными радикалами. В связи с этим, представляло интерес исследование взаимосвязи между уровнем N0° и показателями ПОЛ. Установлено, что между уровнем N02 и МДА в плазме существует средняя положительная корреляция (г=0,57), тогда как с уровнем L-аргинина - средняя отрицательная (г=-0,41) связь. В процессе гепатоканцерогенеза эти коррелятивные связи существенно меняются.

Так, через 3 мес. эта положительная связь переходит в отрицательную, а через 4 мес. вновь приобретает среднюю положительную корреляцию. Эти процессы совпадают со снижением показателя соотношения МДА/Ы02 через 3 мес. и повышением - через 4 мес. от начала эксперимента. В последующие сроки, видимо, в результате увеличения массы опухолевых клеток эти связи вновь становятся отрицательными, причем в период метастазирования они исчезают. На наш взгляд, это можно объяснить двояким действием N0° на процессы неопластического перерождения. Так, в частности, на стадии инициации появляются отрицательные связи, обусловленные существенным увеличением N0° по сравнению с уровнем МДА, которое, видимо, связано с её действием на структуру генома и образованием мутаций. Однако через 4 мес. в плазме резко интенсифицируется ПОЛ на фоне менее выраженного изменения N0°. На наш взгляд, в этот момент начинает проявляться дестабилизирующее действие пероксинитрита на биологические мембраны. Последующий переход положительной корреляционной связи в отрицательную (г=-0,38, через 7 мес.), видимо, обусловлен ролью N0° в процессах отторжения опухолевых клеток от основного очага, циркуляции их в лимфе и крови, адгезии их в других тканях, что не противоречит литературным данным. Для этого периода характерно резкое снижение показателя МДА/Ж)2.

Интересные данные получены при изучении коррелятивных связей между уровнем МДА и Ь-аргинина. Динамика их была аналогичной связям Ь-аргинин-МО0. В норме установлена средняя отрицательная коррелятивная связь, на стадии инициации - она терялась, через 4 мес. - вновь становилась средней отрицательной (г= -0,43), а в дальнейшем (через 5 мес.) положительной (г=0,52). Постепенно эта связь ослабевала к концу эксперимента, переходила в отрицательную связь (г=-0,38), что мы объясняем значением N0° в метастазировании опухолевых клеток.

Таким образом, можно сказать, что для первого срока эксперимента (через 3 мес.) характерно некоторое преобладание деструктивных процессов, видимо, вследствие взаимодействия окиси азота с радикалами пероксинитрита с макромолекулами, приводящими к нарушению регуляторной роли гистоновых и негистоновых ядерных белков в процессах синтеза нуклеиновых кислот. В после-

дующие сроки (через 4, 5 и 6 месяцев) в результате резкого усиления деструктивных процессов в гепатоцитах происходит их замещение неопластической пролиферацией, что на наш взгляд, можно рассматривать как стадию пролиферации. Лишь преобладание выработки N02 над процессами ПОЛ через 7 и 8 мес. от начала эксперимента, характерное, видимо, для стадии метастазирования, обусловливает снижение соотношения МДА/1Ч02. Это согласуется с данными С.Я. Проскурякова и соавт. (2001), которые указывают на роль NO0 в откреплении опухолевых клеток от очага поражения, циркуляции их в кровеносном русле и прикреплении их в органы метастазирования.

Учитывая, что интенсивность гиперлипопероксидации зависит от активности АОЗ, нами были исследованы активности СОД и каталазы в крови и печени экспериментальных животных в динамике развития гепатоканцерогенеза. Выявлено, что активность СОД эритроцитов по мере развития опухолей печени прогрессивно снижалась: на 34,8; 50,3; 53,1; 50,5; 72,9 и 82,4%, соответственно, через 3, 4, 5, 6, 7 и 8 мес.

Между процессами ПОЛ и активностью ферментов антиокси-дантной защиты наблюдается коррелятивная связь (В.Е. Рябинин и соавт., 1995; Ю.А. Владимиров, 1998). Именно дисбаланс в системе ПОЛ-АОЗ свидетельствует о развитии деструктивных процессов. Вместе с тем, согласно опубликованным данным (P.E. Григалевски, 1997; A.A. Недоспасов, 1998; В.П. Реутов, 2000), СОД hNO° конкурируют за захват свободных радикалов. Учитывая, что в клетках ткани преобладает СОД, токсического действия пероксинитрита не наблюдается. Ингибирование активности СОД в ткани приводит к взаимодействию N0° со свободными радикалами, образуя промежуточный продукт, обладающий выраженным токсическим действием. Исследование коррелятивных связей выявило между активностью СОД и уровнем МДА, СОД и N02 слабую и среднюю отрицательную корреляционную связь (г=-0,28, г=-0,61), соответственно. Эти связи в процессе гепатоканцерогенеза существенно меняются: на стадии инициации они переходят в положительную связь, что свидетельствует о повышение активности СОД, на стадии промоции отмечается отрицательная коррелятивная связь, которая обусловлена резким угнетением активности СОД. Видимо, это усили-

вает взаимодействие N0° с кислородными радикалами образуя пе-роксинитрит, который оказывает цитотоксическое действие и вследствие этого, существенно повышает образование МДА и N02. Характерным для данного эксперимента было то, что связь между N02 и СОД через 5 мес. резко изменялась в противоположную сторону, переходя в положительную, обусловленное как снижением активности СОД, так и N02 по сравнению с предыдущим сроком. В то же время связи между активностью СОД и МДА сохраняли слабо отрицательное значение. Видимо, последнее связано с продолжающимся ингибированием СОД в эритроцитах крови экспериментальных животных. Переход этих отрицательных связей в положительные к концу опыта, возможно, связан с существенным снижением МДА (вследствие уменьшения содержания субстратов окисления) на фоне продолжающегося увеличения N02 в сыворотке крови, что создает условия для метастазирования опухолевых клеток.

В процессе гепатоканцерогенеза мы выявили некие критические моменты, обусловленные стадийностью развития опухолевого процесса. На наш взгляд, они проявляются через 4, 6 и 8 мес. от начала эксперимента. Через 4 мес. наблюдаются самые высокие значения N02 и МДА на фоне снижения СОД, через 6 мес. - самые низкие значения N02 и нормализация МДА, через 8 мес. - вновь высокие показатели N02, но снижение МДА и активности СОД. Эти изменения совпадают с такими же изменениями Ь-аргинина: низкими показателями - через 4 мес., наибольшими - через 6 мес. и повторным снижением - к концу эксперимента.

Интересные данные были получены при исследовании активности СОД в пораженном органе: через 3 мес. от начала опыта она превышала норму на 26,6% (Р<0,05), а через 4 мес. - резко снижалась. Видимо, это было связано с развитием опухолевого процесса под воздействием ДЭНА. В дальнейшем (через 5 мес.), фермент резко активизировался: превышал показатели 4 мес. и интактных крыс на 125,9 и 110,4%, соответственно. Высокая активность СОД сохранялась и через 6 мес., превышая нормативные параметры на 69,2% (Р<0,05), но затем - прогрессивно снижалась, что, на наш взгляд, связано с увеличением площади печени, вовлеченной в патологический процесс.

Если активность СОД участвует в обезвреживании свободных радикалов кислорода, то каталаза — перекисей и гидроперекисей. Активность каталазы в крови через 3 и 4 мес. была достоверно ниже параметров интактных крыс на 43,3 и 46%, соответственно; через 5-6 мес. она постепенно повышалась, а на стадии метастазиро-вания патологического процесса активность каталазы в крови прогрессивно снижалась.

В гомогенате печени экспериментальных животных активность каталазы через 3 мес. от начала эксперимента была ниже нормы, в последующие сроки она постепенно повышалась. По мере прогрессирования и метастазирования опухолевого процесса активность каталазы в гомогенате печени имела тенденцию к снижению, но всё ещё превышала параметры интактных крыс.

Особый интерес представлял анализ показателей ПОЛ и АОЗ в пораженном органе. В гомогенате печени интактных животных нами выявлена средняя положительная связь между уровнем МДА и активностью СОД (г=0,61); отрицательные связи средней и слабой зависимости между уровнями МДА - КАТ и СОД - КАТ (г= -0,60, г=-0,21), соответственно. Через 3 и 4 мес. развития гепатокан-церогенеза положительные связи между МДА и СОД сохраняются, причем, наибольшего значения они достигают через 4 мес., что, на наш взгляд, обусловлено резким повышением содержания МДА и активности СОД. В дальнейшем эти связи ослабевают и к концу эксперимента мы наблюдали сильную отрицательную связь между ними, видимо, вследствие снижения уровня МДА и, особенно, активности СОД, по отношению к значениям нормативных показателей. Отрицательная корреляция между МДА и КАТ в процессе развития гепатоканцерогенеза, через 4, 5, 6 и 7 мес. от начала эксперимента постепенно переходит в сильную положительную (г=0,50; 0,75; 0,60; 0,93), соответственно, что связано с повышением активности КАТ и МДА. Однако, к концу эксперимента (стадия метастазирования) эта связь полностью исчезает, что, видимо, связано с переходом на опухолевый метаболизм.

Для выяснения особенности нарушений печени нами были изучены такие показатели сыворотки крови, как активность АлАТ, АсАТ, щелочной фосфатазы, содержание общего белка и альбумина в динамике ДЭНА-индуцированного канцерогенеза. Результаты

показали, что ДЭНА-индуцированный канцерогенез проявляется развитием цитолитического синдрома, печеночно-клеточной недостаточностью и холестатическим синдромом. Если выраженность цитолитического и холестатического синдромов приходятся на стадии инициации и промоции, то развитие печеночно-клеточной недостаточности - на стадии прогрессирования и метастазирования опухолевого процесса.

Морфологические исследования показали, что через 3 мес. от начала эксперимента выявляется картина гепатоканцерогенеза, проявляющаяся ранними признаками клеточного атипизма, с появлением неправильной округло-полигональной формы гепатоцитов с крупными гиперхромными ядрами, многоядерных клеток с бледно окрашенной цитоплазмой. В дальнейшем (через 4 мес.) активизируются процессы васкуляризации с выраженными признаками тканевого и клеточного атипизма. Очаги гепатоцеллюлярного рака появляются через 5 мес. от начала опыта. В последующие сроки усиливаются явные признаки злокачественной опухоли с разрастанием очагов гепатоцеллюлярной карциномы и гиперваскуляризацией паренхимы.

Таким образом, выявлена важная роль оксида азота в развитии гепатоканцерогенеза, значение которой зависит от стадии патологического процесса: выраженная её активизация на стадиях инициации и промоции, снижение - в прогрессировании опухолевого процесса и повторная активизация на стадии метастазирования опухолевых клеток.

выводы

1. В зависимости от стадии диэтилнитрозамин-индуцирован-ного гепатоканцерогеиеза изменяется содержание нитритов и Ь-аргинина в сыворотке крови экспериментальных животных. На стадиях инициации и промоции уровень нитритов повышается на фоне снижения Ь-аргинина; на стадии прогрессирования - уровень первого - снижается, второго - увеличивается; на стадии метастазиро-вания - система Ь-аргинин-окись азота активизируется. Адекватно этому изменяется активность НАДФН-диафоразы в ткани печени.

2. При диэтилнитрозамин-индуцированном канцерогенезе установлено прогрессирующее повышение уровня малонового диаль-дегида на стадиях инициации и промоции в плазме и гомогенате печени, а на стадиях прогрессии и метастазирования - постепенно снижается в обеих биопробах. Выявлены коррелятивные связи между показателями системы Ь-аргинин-окись азота и перекисного окисления липидов: активизация перекисного окисления липидов на стадии прогрессирования и системы Ь-аргинин-окись азота - на стадиях инициации, промоции и метастазирования.

3. Для начального периода промоции и метастазирования гепатоканцерогеиеза характерно ингибирование супероксиддисмута-зы в гомогенате печени, для более позднего периода промоции с переходом в прогрессирование - индукция фермента. В эритроцитах крови она угнетена во все сроки исследования и степень выраженности этого угнетения совпадает с прогрессированием опухолевого процесса.

4. Морфологические признаки атипизма гепатоцитов (появление гипертрофированных многоядерных клеток) проявляются на стадиях инициации и промоции рака. Поздние стадии гепатоканцерогеиеза характеризуемся формированием и укрупнением очагов гепатоцеллюлярной карциномы и гиперваскуляризацией паренхимы органа.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Журнальные статьи:

1. Иноятова Ф.Х., Каримова М.Х., Мухамедова М.Т. К биологической роли оксида азота. // Патология. 2001. №2. С.3-10.

2. Иноятова Ф.Х., Каримова М.Х., Мухамедова М.Т. К биологической роли оксида азота. Значение его в развитии патологических состояний. // Патология. 2001. №3. С.3-14.

3. Каримов Х.Я., Иноятова Ф.Х., Мухамедова М.Т. Изменения некоторых показателей синтеза окиси азота в ранние периоды развития гепатоканцерогенеза. // Врачебное дело. 2002. №7. С.90-92.

4. Мухамедова М.Т. Динамика изменения оксида азота и процессов ПОЛ при гепатоканцерогенезе. // ДАН РУз. 2002. №5. С.58-60.

5. Karimov Kh.Ya., Inoyatova F.Kh., Mukhamedova М.Т. Changes in some indices of the synthesis of nitric oxide during the early stages of hepatocarcinogenesis. // Experim. and toxicol. pathology. 2003. V.55. №.1. P. 17-19.

Тезисы:

6. Мухамедова М.Т. Особенности изменения активности ферментов антиоксидантной системы в крови и печени при гепатоканцерогенезе. //Материалы Пироговской студенческой научной конференции. 2002. №1(22). С.143.

7. Мухамедова М.Т. Патофизиологические аспекты роли оксида азота в развитии гепатоканцерогенеза. //Тез. докл. межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Санкт-Петербургские научные чтения»,- Санкт-Петербург, 2002. С.70.

8. Каримов Х.Я., Мухамедова М.Т. Особенности изменения в системе окись азота L-аргинин в динамике диэтилнитрозамин индуцированного канцерогенеза. //Материалы научно-практической конференции «Значение экологической ситуации и образа жизни для здоровья подрастающего поколения». - Фергана, 2001. С.53-54.

РЕЗЮМЕ

диссертации Мухамедовой М.Т. на тему: «Окись азота в патогенезе диэтилнитрозамин-индуцированного гепатоканцерогенеза» на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.00.16-патологическая физиология

Ключевые слова: гепатоканцерогенез, диэтилнитрозамин, окись азота, перекисное окисление липидов, антиоксидантная защита.

Объекты исследования: печень и кровь экспериментальных крыс с диэтилнитрозамин-индуцированным гепатоканцерогенезом.

Цель работы: изучение значения окиси азота во взаимосвязи с процессами перекисного окисления липидов на различных стадиях гепатоканцерогенеза, индуцированного диэтилнитрозамином.

Методы исследования: биохимические методы определения нитритов, малонового диальдегида, активности ферментов, высокоэффективная жидкостная хроматография, гистохимия и световая микроскопия печени.

Полученные результаты н их новизна: впервые на большом экспериментальном материале показано значение окиси азота в развитии ДЭНА-индуцированного гепатоканцерогенеза. В стадиях инициации и промоции отмечается индукция системы Ь-аргинин-окись азота, проявляющееся снижением содержания Ь-аргинина на фоне увеличения нитритов; подавление в стадии прогрессирования и активизация на заключительной стадии гепатоканцерогенеза. Установлено повышение уровня малонового диальдегида в гомогенате печени через 3, 4, 5 и 6 мес. и прогрессивное его снижение в процессе развития метастазирования. Активность супероксиддис-мутазы в пораженном органе проявляется активизацией на стадиях инициации и прогрессирования, значительным угнетением на заключительных стадиях гепатоканцерогенеза. В крови её активность прогрессивно снижалась по мере развития опухолевого процесса.

Практическая значимость работы: результаты расширяют представление о патогенезе ДЭНА-индуцированного гепатоканцерогенеза. Выявленные изменения в системе Ь-аргинин-окись азота и малонового диальдегида на различных стадиях гепатоканцерогенеза свидетельствуют о сложных их взаимоотношениях в развитии опухолевого процесса. Это указывает на необходимость дифференцированного подхода в выборе химио-терапевтических средств. Определение в сыворотке крови уровня Ь-аргинина, нитритов, малонового диальдегида и супероксиддисмутазы могут служить диагностическими критериями определения стадий развития опухолевого процесса.

Степень внедрения и экономическая эффективность: основные положения диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий по биохимии, нормальн ой и патологической физиологии Второго ТашГосМИ.

Область применения: медицина.

Тиббиёт фанлари номзоди илмий даражасига талабгор М.Т. Мухамедованинг 14.00.16-патологик физиология ихтисосли-ги буйича «Диэтилнитрозамин билан ча^ирилган гепатоканцеро-геиез патогенезида азот оксидининг а^амияти» мавзусидаги дис-

сертациясининг

КИС^АЧА МАЗМУНИ

Калитли сузлар: гепатоканцерогенез, диэтилнитрозамин, азот оксиди, ёгларнинг пероксидланиши, антиоксидант ^имоя.

Тадцицот объектлари: гепатоканцерогенезли каламушлар-нинг жигар ту^имаси ва ^они.

Ишнинг ма^сади: диэтилнитрозамин билан ча^ирилган гепатоканцерогенез барча бос^ичларида азот оксидининг агамия -тини ёглар пероксидданиш жараёни билан боглигдикда урганиш.

Текшириш усуллари: сую к, му^итли ю^ори самарадорли хроматография, нитрит, ёглар пероксидданиш махсулотлари ва ферментлар фаоллигини биокимёвий усулда аншушш, жигар тук,имаси гистокимёси ва морфологияси.

Олинган натижалар ва уларнинг янгилиги: биринчи маро-таба ДЭНА билан ча^ирилган гепатоканцерогенез бос^ичларида азот оксидининг а^амияти ёритилди. Инициация ва промоция бос^ичлари Ь-аргининниг камайиши ва 1М02 нинг ошиши билан кечиб, тизимнинг фаолланишидан далолат беради; прогрессияда - сусайиши, метастазланишда фаолланиши кузатилди. Тажриба-нинг 3,4,5 ва 6 ойларида жигар гомогенатида МДА мивдорининг ортиши, сунгги бос^ичида эса камайиши кузатилди. Инициация ва прогрессия бос^ичларида шикастланган аъзода СОДнинг фаолланиши, метастазланишда эса ингибирланиши кузатилди. Кон-да СОД фаоллиги жараён жадаллашиши билан пасайди.

Амалий а^амияти: натижалар ДЭНА билан ча^ирилган ге-патоканцерогенезнинг патогенезини янада чу^ур ёритади. Усма ривожланиши жараёнида Ь-аргинин-азот оксиди тизими ва ёглар пероксидланиши орасидаги богланишлар канцерогенез бо-с^ичларига боьлиц равишда узгаришини курсатди. Бу усма дав-рига 1$араб кимёвий даволаш воситаларини дифференциал ^ул-лашни талаб этади. К|он зардобида Ь-аргинин, Ы02, МДА мивдо-ри ва СОД фаоллигини ани1$лаш усма жараёни бос^ичларини ани1ушшнинг диагностик меъзони ^исобланиши мумкин.

Татбиц этиш даражаси ва ицтисодий самарадорлиги: ишнинг натижалари 2-ТошДавТИ биокимё, нормал ва патологик физиология кафедралари маъруза ва амалий машгулот режала-рига киритилган.

Татбш$ этиш соз^аси: тиббиёт.

RESUME

Thesis of Mukhamedova M.T. on the academic degree competition of the candidate of medical sciences, speciality 14.00.16- pathologic physiology: «Nitrogen oxide in pathogenesis of diethylnitrosamine-induced hepatocarcinogenesis»

Key words: hepatocarcinogenesis, diethylnitrosamine, nitrogen oxide, lipid peroxidation, antioxidant defense.

Objects of research: liver and blood of experimental rats with diethylnitrosamine-induced hepatocarcinogenesis.

Purpose of research: studying a value of N0° in interrelation with LPO processes in difference stage of hepatocarcinogenesis induced by DENA.

Methods of research: biochemical methods of determination of N02, xnalone dialdehyde, enzymes' activity, high-effective fluid chromatography, histochemistry and light microscopy of the liver.

Results obtained and their novelty: For the first time a value of N0° for development of DENA-induced hepatocarcinogenesis manifesting in all stages of its development on a great experimental material was shown. An induction of this system was noted to be in the stages of initiation and promotion manifesting in reducing a content of L-arginin against a background of increasing N02; its depression in progression process and activation of this system in the final stage of hepatocarcinogenesis directed to an invasion and metastasition of tumorous cells. It was established an increase in MDA level in hepatic homogenate in 3, 4, 5 and 6 months and its advancing decrease in process of developing metastasition. SOD activity in the disturbed organ were manifesting in activation in periods of initiation and progression, advancing in depression on the final stages of hepatocarcinogenesis. SOD activity in blood was progressively reducing as progressing tumorous process.

Practical value of research: Results obtained are broadening understanding pathogenesis of DENA-induced hepatocarcinogenesis. Changes revealed in a system L-arginin-nitrogen oxide and MDA on different stages of hepatocarcinogenesis evidence their complicated interrelations in development of tumorous process depending upon carcinogenesis stages. That demonstrated a necessity of differential approach to a choice of chemio-therapeutic remedies. Determination of L-arginin level,, N02, MDA and SOD activity in blood serum may serve diagnostical criteria for determination stages in development of tumorous process.

Implementation degree and economic effectiveness: Principal statements of the thesis are implemented into a course of lectures and practical lessons in Biochemistry, Normal & Pathologic Physiology at the Second Tashkent State Medical Institute.

Sphere of usage: Medicine