Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические факторы нарушения репродуктивной функции у жителей г. Екатеринбурга

На правах рукописи

РЫБИНА Ирина Владимировна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ НАРУШЕНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ У ЖИТЕЛЕЙ Г. ЕКАТЕРИНБУРГА

14.00.36

Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск 2004

Работа выполнена в Институте иммунологии и физиологии Уральского Отделения Российской Академии Наук и в Муниципальном учреждении Диагностический центр (лабораторной диагностики ВИЧ, инфекционной патологии и болезней матери и ребенка), г. Екатеринбург

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Бейкин Яков Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Колесников Олег Леонидович доктор биологических наук Куклина Елена Михайловна

Ведущая организация:

ГНЦ Иммунологии МЗ РФ, г. Москва

Защитадиссертации состоится ;< у, „¿¿¿^О/п^ 2004 года в «1600 » часов на заседании диссертационного совета Д 20$. 117.03 при Челябинской Государственной Медицинской Академии по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской Государственной Медицинской Академии.

Автореферат разослан «. ^^ » „¿¿¿¿¿¿¿Л- 2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

По определению ВОЗ, репродуктивное здоровье — это состояние полного физического, умственного и социального благополучия, а не просто отсутствие болезней или недугов во всех сферах, касающихся репродуктивной системы, ее функций и процессов (Пшеничникова TJL, 1991).

В условиях экономической нестабильности, падения рождаемости и высокого уровня общей смертности, проблемы охраны репродуктивного здоровья населения приобретают особую значимость. Состояние репродуктивного здоровья населения является предметом интереса не только медицинской практики, но и общественности. Репродуктивное здоровье женщин выделяется своей общественно-политической значимостью, так как оно напрямую связано со здоровьем детей, а следовательно, с будущим государства и нации. Решение задачи сохранения репродуктивного здоровья определяет возможность воспроизводства вида и сохранение генофонда (Кулаков В.И., 2001).

Известно, что при частоте бесплодных браков, равной 1£% и выше (критический уровень), проблема бесплодия приобретает государственное значение. По данным многих исследователей, частота бесплодного брака в России составляет 15—17% и имеет тенденцию к росту (Кулаков В.И., 2001; Маргиани ФА., 2002).

Медико-социологические исследования показали, что у 93% женщин бесплодие приводит к психическому, социальному дискомфорту, снижает социальную адаптацию, профессиональную активность, повышает число разводов. Таким образом, нарушение репродукции имеет значение не только для индивидуумов, но оказывает влияние на общество в целом, снижая социальную и профессиональную активность этой группы населения.

Последние десятилетия ушедшего столетия характеризуются значительными достижениями в области диагностики и лечения, различных форм нарушения фертильности. Современный алгоритм исследования причин нарушения репродукции это обширное многокомпонентное обследование, включающее в себя исследование как женского, так и мужского фактора, поскольку вклад в формирование инфертильности могут вносить оба партнера супружеской пары.

Традиционно и вполне оправданно в структуре нарушений репродукции выделяют анатомические причины, действие инфекционных агентов, эндокринные факторы, генетические и иммунологические причины. Особенно большие успехи достигнуты в расшифровке эндокринных нарушений, лежащих в основе бесплодия и невынашивания, что явилось базой для разработки современных высокоэффективных диагностических и лечебных мероприятий. Многочисленные исследования, посвященные изучению роли бактериальной и вирусной инфекции в формировании нарушений фертильно-сти, привели к созданию алгоритма обследования и реабилитационных мероприятий у женщин с проблемами репродукции впг.пяп»пглтого генрчя

Но, несмотря на достигнутые успехи, проблег

511БЛМОТЕКА ] СП«тсрбу 09

Шл

вания беременности далеки от окончательного решения. Требуют уточнения данные по иммунологическим факторам нарушения фертильности. В последнее время многие исследователи пытаются осмыслить значение иммунной системы в процессах репродукции. Наши представления об иммунологическом взаимодействии организмов матери и плода все еще во многом остаются гипотетическими. Хотя установлено, что до 80 % такого варианта нарушения фертильности как спонтанные аборты неясного генеза обусловлено действием именно иммунологических факторов.

Кроме того, возникла потребность в уточнении структуры и создании классификации наследственной патологии репродуктивной системы для повышения возможностей проведения дифференциальной диагностики. Несмотря на возросший интерес к этой проблеме, при обсуждении принципов дифференциальной диагностики нарушений репродукции генетическим методам исследования по-прежнему отводится одно из последних мест в схеме обследования пациента либо оно вообще не предполагается.

Таким образом, в области нарушения фертильности открываются перспективы для продолжения исследований этой важной социальной и научной проблемы. Проблема не только не теряет своей актуальности, но становится все более социально значимой в условиях современной демографической катастрофы.

Цель работы

Изучить вклад иммунологических и иммуногенетических факторов в нарушение репродуктивной функции у жителей г. Екатеринбурга.

Задачи

1. Оценить роль иммуногенетических причин нарушения репродукции. Определить характер популяционного распределения НПА-антигенов у жителей г. Екатеринбурга.

2. Изучить участие антиспермальных антител в развитии разных форм нарушения фертильности (бесплодие и отягощенный акушерский анамнез).

3. Определить вклад антифосфолипидных антител в формирование нарушений репродукции.

4. Установить долю и структуру хромосомных нарушений, приводящих к инфёртильности у жителей г. Екатеринбурга.

Научная новизна работы

Определен характер популяционного распределения антигенов гисто: совместимости I класса у жителей г. Екатеринбурга, что является основой для использования полученных данных в исследованиях, посвященных поиску иммуногенетических маркеров наследственной-предрасположенности к различным заболеваниям, выполняемых в г. Екатеринбурге.

Дана оценка роли иммуногенетических факторов негативно влияющих на процессы-репродукции у жителей крупного промышленного центра Урала. В отличие, от ранее выполнявшихся работ, показано, что'только высокая

степень идентичности HLA-фенотипов супругов (3, 4 и более общих антигена) может приводить к нарушению фертильности.

Установлено, что у жителей г. Екатеринбурга циркуляция антиспер-мальных антител в 24.5% случаев является причиной бесплодия в супружеских парах, в 12.8% может выступать одним из факторов невынашивания беременности.

В отличие от ранее публиковавшихся работ, установлено, что присутствие в сыворотке женщин антител, направленных к фосфолипидам мембран' и комплексу «фосфолипид - белок-кофактор» является причиной не только невынашивания беременности, но и может рассматриваться/как одна из возможных причин бесплодия. Выявлены иммуногенетические маркеры наследственной предрасположенности к нарушению фертильности, связанному с продукцией антифосфолипидных антител у женщина

Впервые проведена оценка доли генетических факторов в нарушении репродуктивной функции у жителей г. Екатеринбурга. Описан широкий спектр хромосомных нарушений у лиц с репродуктивными проблемами. Дана оценка роли хромосомного полиморфизма, как неблагоприятного фактора для процессов репродукции..

Практическая значимость работы • •

Разработан алгоритм обследования лиц с нарушением репродуктивной функции с использованием иммунологических и генетических методов.

Определены иммуногенетические маркеры повышенного риска нарушений репродуктивной-функции. Присутствие в*НЬА-фенотипе женщины антигенов ИЬА-А29 или ИЬА-Б22 является < показателемs наследственной предрасположенности к развитию антифосфолипидного синдрома, связанного с циркуляцией антифосфолипидных антител, приводящего к осложнениям беременности или к бесплодию.

Установлено, что высокая степень совместимости фенотипов половых партнеров по антигенам главного комплекса гистосовместимости (3 и более общих антигена) приводит к осложнению репродуктивных процессов. Наряду с этим, наличие у супругов двух общих антигенов в определенном сочетании так же является фактором высокого риска развития нарушений репро-дукции:ИЬА-А1.Б18, А1.В35, А2.В18, АЗ,В12,А9,В40.

. Положения, выносимые на защиту

1. Высокая степень совместимости ИХА-фенотипов супругов (3, 4 и более общих антигенов) является фактором-повышенного риска развития, бесплодия или невынашивания беременности. Присутствие у женщины антител к ИХА-антигенам партнера в высоких концентрациях негативно сказывается на репродуктивных способностях.

2. В 24,5% случаев бесплодие в супружеских парах является следствием циркуляции антиспермальных антител, вырабатываемых »как женщинами к антигенам спермы партнера, так и мужчинами к собственным сперматозои-

дам. Антиспермальные антитела могут вызывать не только бесплодие, но и невынашивание беременности.

3. В 10,1% случаев невынашивание беременности и, возможно, в 5,4% случаев бесплодие вызвано присутствием в сыворотке крови женщин анти-фосфолипидных антител. Иммуногенетическими маркерами высокой наследственной предрасположенности к развитию нарушений репродукции, вызванных антителами к отрицательно заряженным фосфолипидам мембран являются антигены НЬА-А29 и НЬА-Б22.

4. В 2,9% % случаев нарушение фертильности у супружеских пар в г. Екатеринбурге вызвано изменением в хромосомном аппарате клетки. Изменения затрагивают структуру хромосом. В структурных перестройках участвуют как половые хромосомы, так и аутосомы. Крайние варианты хромосомного полиморфизма оказывают негативное влияние на репродуктивную функцию.

Внедрение результатов исследования.

Методы исследования внедрены в практику работы Диагностического центра (лабораторной диагностики ВИЧ, инфекционной патологии и болезней матери и ребенка), г. Екатеринбург. Разработанный алгоритм обследования лиц с нарушением репродуктивной функции внедрен в практическую работу акушерского отделения и отделения репродукции городского Центра планирования семьи репродукции (ГКБ №35).

Личный вклад автора в выполнение данной работы

Основные идеи, тема и содержание работы разрабатывались автором на основании многолетних исследований в 1996-2003 гг. Во всех исследованиях по теме диссертации автор принимал непосредственное участие в их проведении, анализе и обобщении полученных результатов.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 132 страницах компьютерного текста, включая 13 таблиц, 7 рисунков, и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, четырех глав обсуждения собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 172 печатных работы (130 отечественных и 42 - зарубежных).

Формы внедрения и апробации диссертации

Материалы работы доложены на городской научно-практической конференции «Антифосфолипидный синдром в практике акушера-гинеколога» (Екатеринбург, 20 апреля 2000г.), Всероссийской научно-практической конференции «Продовольственная безопасность - XXI век: экологические аспекты» (Екатеринбург, 18-20 сентября 2000г.), II конференции иммунологов Урала (Пермь, 9-12 сентября 2002г.), Ш конференции иммунологов Урала

(Челябинск, 15-18 октября 2003г.), семинарах для врачей акушеров-гинекологов г. Екатеринбурга.

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Все исследования были выполнены на базе Диагностического центра лабораторной диагностики ВИЧ, инфекционной патологии и болезней матери и ребенка г. Екатеринбурга.

Для обследования были сформированы три группы пациентов:

L Супружеские пары с диагнозом бесплодие (отсутствие потомства при наличии регулярной половой жизни более одного года);

2. Супружеские пары с отягощенным акушерским анамнезом (выкидыши, регресс беременности, мертворождения в анамнезе);

3. В качестве контроля были обследованы 50 супружеских пар репродуктивного возраста, имевших в анамнезе физиологическую беременность, закончившуюся родами.

Были выполнены следующие виды исследований:

1. Иммуногенетическое исследование. Типирование по антигенам главного комплекса гистосовместимости I класса.

2. Постановка лимфоцитотоксического теста с целью определения активности сыворотки женщин к HLA-антигенам партнера.

3. Определение концентрации антиспермальных антител в сыворотке крови женщин и мужчин.

4. Определение суммарных антифосфолипидных антител (к кардиоли-пину, фосфатидил-серину, фосфатидил-инозитолу и фосфатидиловой кислоте) и антител к белку-кофактору бета-2-гликопротеину-1 в сыворотке крови женщин.

5. Цитогенетическое исследование - определение хромосомного набора обоих половых партнеров.

Метод иммуногенетического исследования

С целью установления особенностей распределения HLA-антигенов в популяции жителей г. Екатеринбурга было обследовано 2 856 человек.

Для определения степени совместимости HLA-фенотипов супругов было обследовано 715 супружеских пар, из них: 363 пары с диагнозом бесплодный брак, 302 пары с ОАА, 50 фертильных супружеских пар в качестве контрольной группы.

Типирование лимфоцитов периферической крови по антигенам главного комплекса гистосовместимости I класса проводилось на наборах анти-HLA-сывороток производства ЗАО «Гисанс» в стандартной лимфоцитоток-сическом тесте.

Определение активности сывороток женщин к HLA-антигенам партнера проводилось в лимфоцитотоксическом тесте.

Определение антиспермалъной активности сыворотки

Обследованию подлежали оба партнера в супружеских парах с бесплодием и женщины с диагнозом ОАА. Всего было обследовано: 208 супружеских пар с бесплодием (208 женщин и 208 мужчин) и 94 женщины с ОАА. В качестве контроля обследованы оба партнера 50 фертильных супружеских пар.

Определение концентрации антиспермальных антител в сыворотке крови проводилось методом иммуноферментного анализа на диагностических тест-системах «Spermatozoen-Antikorper», производства фирмы IBL (Германия). Определение оптической плотности проводилось на спектрофотометре «Multiscan-plus» (Labsystems), с фильтром 450 нм.

Определение концентрации антифосфолипидных антител

Было обследовано 508 женщин, из них 471 - с отягощенным акушерским анамнезом и 37 человек с диагнозом бесплодие. Для контроля была исследована сыворотка 50 фертильных женщин.

Антифосфолипидные антитела определялись в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа. Использовались два типа диагностических систем:

1) Набор «Антифосфолипид-скрин» производства фирмы Orgentec (Германия), предназначенный для определения суммарной концентрации антител к четырем видам фосфолипидов мембран: кардиолипину, фосфатидил-серину, фосфатидил-инозитолу и фосфатидиловой кислоте. Проводилось определение концентрации антител класса IgM и класса IgG.

2) Набор «Анти-бета2-гликопротеин-1» производства фирмы Orgentec (Германия), предназначенный для определения концентрации антител классов IgM и IgG к белку-кофактору бета-2-гликопротеину-1.

Определение оптической плотности проводилось на спектрофотометре «Multiscan-plus» (Labsystems), с фильтром 450 нм.

Метод цитогенетического исследования

Цитогенетическое исследование было проведено для 999 человек. В группу лиц с бесплодием вошли супружеские пары, состоящие в бесплодном браке — 278 человек. Кроме того, были обследованы супружеские пары с отягощенным акушерским анамнезом - 721 человек.

Постановка культуры лимфоцитов проводилась полумикрометодом. Приготовление хромосомных препаратов включало в себя стандартный набор процедур (колхинизацию, гипотонизацию, фиксацию, нанесение на стекла). Все препараты были подвергнуты дифференциальной G-окраске. При необходимости, в случаях структурных перестроек и вариантах хромосомного полиморфизма, дополнительно применялась дифференциальная С-окраска хромосомных препаратов.

Анализ хромосомных препаратов проводился на микроскопе «Биолам Р-15», под масляной иммерсией, 7x90.

Обозначение кариотипа проводилось в соответствии с Парижской номенклатурой хромосом 1985г (Кулешов Н.П.,1991).

Методы статистической обработки данных

Статистическая обработка данных, полученных в результате HLA-типирования, проводилась в соответствии с рекомендациями, предложенными для оценки частот Ш«Л-антигенов, HLA-геяов в «Клинической иммуно-генетике» (Зарецкая Ю.М., 1983)

Частота антигена высчитывалась как процентное соотношение индивидуумов, несущих антиген к общему числу обследованных, а частота гена по формуле, преобразованной из математического выражения закона Харди-Вайнберга.

Рх= 1 - V i-~aT~

Где Рх — частота гена, Ах- частота антигена.

Оценка статистической значимости различий частот антигенов в группе пациентов и в группе здоровых лиц проводилась с использованием критерия х2, прибегая к построению «сетки 2x2», с одной степенью свободы с поправкой Йейтса (для значений меньше 5), для уровня значимости 0,05 по следующей формуле (Бейли Н.,1964; Зарецкая Ю М.,1983):

Где а - больные носители антигена, b - здоровые носители антигена, с - больные, не несущие антигена, d - здоровые, не несущие антигена.

Силу ассоциации между антигеном и болезнью рассчитывали через критерий относительного риска (RR), который указывает на риск развития заболевания у носителей антигена по сравнению с индивидами, не несущими данный антиген (Зарецкая Ю.М., 1983).

где fn- фракция носителей антигена среди больных,

fk - фракция носителей антигена в контрольной группе.

fn и fk выражаются в десятичных дробях или процентах. Показатели относительного риска более двух считаются значимыми.

Оценка статистической значимости различий полученных данных в группах пациентов и в группе здоровых лиц проводилась с использованием критерия Фишера для 5% уровня значимости.

Статистическую обработку материала проводили на IBM PC с использованием программы «Microsoft Excel».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенный анализ популяционного распределения антигенов гисто-совместимости I класса позволил охарактеризовать иммуногенетический профиль населения г. Екатеринбурга. Сравнение полученных частот антигенов и аллелей с аналогичными показателями для европеоидов (Шабалдин В.Н., 1996) дает основание говорить о сходстве названных групп.

У жителей г.Екатеринбурга в локусе А наиболее частым является антиген А2, встречающийся в 49.12% случаев, это полностью соответствует данным других авторов, приведенных для русской популяции и европеоидов в целом (Зарецкая Ю.М.,1983; Шабалдин В.Н., 1996). Можно отметить в качестве особенности исследуемой популяции низкую частоту антигенов группы А19 .

В локусе В самым часто встречающимся антигеном является В 7 (24.42%), следующие после него по распространенности - антигены В35 (22.13%), В12 (16.61%), В40 (16.25%). К достаточно редким антигенам относятся В14 (5.10%), В21 (4.12%), В22 (3.77%). В целом распределение частот встречаемости антигенов локуса HLA-B соответствует таковому для европеоидов.

В локусе Cw наиболее широко представленным антигеном является СЩ35.7%), за ним- Cw3 и Cw2 (31.71 и 31.44% соответственно).

Анализируя полученные результаты, следует отметить, что наиболее часто встречающимися сочетаниями антигенов локусов HLA-A и В являются - А2.В7, АЗ.В7, АЗ,В35; локусов А, В, Cw - A2,B35,Cw4 и A3,B35,Cw4. ' '

Полученные данные явились основой для поиска иммуногенетических маркеров наследственной предрасположенности к разным формам нарушения репродукции.

Иммуногенетические факторы. Было проведено исследование HLA-фенотипов супругов в трех группах. Первую группу составили супружеские пары с бесплодием неясного генеза (363 пары). Вторая группа была образована парами с отягощенным акушерским анамнезом (302 пары). И в качестве контроля была набрана группа из 50 фертильных пар. Максимальное количество выявленных антигенов у одного обследованного было равно шести («полный дом антигенов»), т.е. в каждом из трех исследуемых локусов HLA-А, В и Cw было выявлено по два антигена (один унаследован от матери, другой от отца).

Результаты показали, что варианты, когда муж и жена имеют общие HLA-антигены, встречались как в двух группах с нарушением репродукции, так и в контрольной группе. Причем, доля супружеских пар, имеющих одинаковые антигены, во всех трех выборках существенно не различалась. В группе с бесплодием частичная совместимость HLA-фенотипов супругов составила 29.08%, в группе с привычным невынашиванием этот показатель был равен 25.74%, фертильные пары имели совпадения в 24.0% случаев.

Различия были выявлены при анализе числа совпадающих антигенов у фертильных пар и в инфертильных группах.

Два общих антигена у супружеских пар с бесплодием и отягощенным акушерским анамнезом встречались в 19.98% и 19.2% соответственно. У фертильных пар Ш,у4-фенотипы супругов совпадали'по двум антигенам в 24% случаев. Поскольку варианты совместимости по двум БЬА -антигенам встречались не только в двух группах с репродуктивными проблемами, но и в контрольной группе, причем, в последней этот показатель даже был несколько выше, можно предположить, что идентичность мужа и жены по двум антигенам главного комплекса гистосовместимости не оказывает существенного негативного влияния на репродуктивные возможности супружеской пары.

Супруги с бесплодием и ОАА имели совпадения по трем, четырем и даже пяти из шести возможных антигенов. Ни одного из названных вариантов не было обнаружено в контрольной группе. Идентичность по трем и более антигенам у пар с отягощенным акушерским анамнезом присутствовала в 6.54% случаев. В группе с бесплодием аналогичный показатель был в 1.4 раза выше и составил 9.10% (различия недостоверны).

Рисунок 1. Степень совместимости супругов в разных группах

Совместимость по трем антигенам была выявлена у 5.30% супругов с ОАА. Во второй группе совпадение трех антигенов встречалось в 1.54 раза чаще (8.15%) (различия недостоверны). Идентичность по четырем антигенам, наоборот, в 1.4 раза чаще присутствовала в группе с ОАА (0.99% и 0.69% соответственно). Почти полная совместимость по БЬА -антигенам I класса (пять общих антигенов) в обеих группах встретилась с одинаковой частотой -0.26% для бесплодия и 0.25%ОАА.

4 общих

5 общих Чиию общих Н1А-ангигенов

Последние два десятилетия особенно интенсивно проводились исследования в направлении, которое сформулировано как «БЬА и болезни». Было замечено, что носительство определенных БЬА - антигенов значительно завышено при некоторых болезнях, что свидетельствует о генетически детерминированной предрасположенности, «запрограммированном риске» пора-жаемости человека той или иной формой заболевания. Поскольку антигены главного комплекса гистосовместимости рассматриваются, как маркеры наследственной предрасположенности к различным патологическим состояниям, интересным представлялось посмотреть, существуют ли различия в распределении ШЛ-антигенов в группах обследованных. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Частоты Н1А-антигенов в группах лиц с нарушением репродукции.

НЬА-антиген Частота антигена у жителей г. Екатеринбурга, % (п-2 856) Частота антигена у фертильных супружеских пар, % (п-100) Частота антигена в группе супружеских пар с бесплодием, % (п=725) Частота антигена в группе супружеских пар с ОАА, %(п=604)

1 2 3 4 5

А1 22,06 22,0 24,83 27,98

А2 49,12 54,0 53,38 51,49

АЗ 26,58 26,0 32,41 •33,61

А9 26,09 20,0 31,17«* 32,62**

А10 20,20 22,0 26,48 23,36

АН 12,01 13,0 16,69 . 16,56

А19 5,04 4,0 5,80 6,13

А28 5,15 6,0 5,93 5,96

А29 2,17 2,0 2,90 1,66

В5 12,74 12,0 10,91 13,23

В7 24,42 31,0 - 25,62 24,73

В8 11,79 • 11,0 10,39 12,97

В12 16,61 19,0 19,23 18,86

В13 10,84 9,0 11,63 ' 11,77

В14 5,10 5,0 5,76 4,28

В15 9,75 8,0 9,77 11,77

В16 11,79 12,0 14,61* 12,30

В17 10,20 7,0 10,29 8,95

В18 10,66 9,0 11,42 14,31

В21 4,12 3,0 5,67 4,82

В22 3,77 4,0 4,02 4,28

В27 12,39 9,0 10,19 11,23

В35 22,13 18,0 24,38 23,26

В40 16,25 20,0 14,41 ■ ' 14,98

В41 6,76 9,0 7,41 5,88

Примечание: * достоверные различия между исследуемой группой и популяционными данными (критерий х2> р<0Л5)

** достоверные различия между исследуемой группой и данными для контрольной фертильной группы и популяционными данными (критерий х\ р<0.05)

Сравнительный анализ распределения антигенов в контрольной группе, образованной фертильными супружескими парами с распределением, характерным для жителей Екатеринбурга не выявил достоверных различий.

В то же время при сравнении характера распределения в группе пациентов с бесплодием с популяционными данными и данными для фертильных пар было зарегистрировано достоверное различие в частоте встречаемости антигена НЬА-А9. Этот антиген достоверно чаще встречается у супругов с бесплодием. Полученные данные совпадают с аналогичными наблюдениями, сделанными Труновой Л.А.(1984). Помимо этого в группе с бесплодием достоверно чаще, чем у жителей Екатеринбурга встречается антиген НЬА-Б16, но при этом, его частота не имеет достоверных различий с контрольной фер-тильной группой.

Сходные результаты получены и для группы супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом, у них, как и в группе с бесплодием достоверно чаще встречается антиген НЬА-А9, причем его частота повышена по сравнению с популяцией и фертильной группой.

Таким образом, установлено, что у жителей Екатеринбурга, имеющих репродуктивные нарушения в виде бесплодия неясного генеза или отягощенного акушерского анамнеза достоверно чаще, чем у лиц с сохранной репродуктивной функцией встречается антиген НЬА-А9. Тем не менее, показатель относительного риска, рассчитанный для указанного антигена, имеет значение меньше 2,0» Величина данного показателя не дает оснований рассматривать НЬА-А9 как маркер повышенной наследственной предрасположенности к нарушению репродукции.

Был проведен анализ наиболее частых гаплотипов в исследованных группах, полученные результаты были сопоставлены с аналогичными данными для жителей г. Екатеринбурга (таблица 2).

Из данных, приведенных в таблице видно, что для группы супружеских пар с привычным невынашиванием характерны 5 частых гаплотипов, которые, не смотря на широкую распространенность образующих их антигенов у жителей Екатеринбурга и представителей всех исследуемых категорий, редко встречаются в других группах, к ним относятся сочетания:,А 1,В 18, А1,В35, А2.В18, АЗ,В12, А9.В40.

В группе супружеских пар с бесплодием не выявлено вариантов гапло-типов, которые были бы не характерны для жителей Екатеринбурга или для контрольной группы.

На ряду с этим, есть комбинация антигенов, которая имеет высокую частоту встречаемости в популяции жителей г. Екатеринбурга и фертильной группе, но не характерна для лиц с инфертильностью, речь идет о гаплотипе А2,В40. В то же время у жителей Екатеринбурга имеются 2 варианта гапло-типических сочетаний антигенов, которые не характерны для всех трех исследованных групп, к ним относятся: А2,В1б и А9.В35.

Таблица 2.

Наиболее распространенные гаплотипы в исследованных группах_

Гаплотипы в попу- Гаплотипы в кон- Гаплотипы в группе Гаплотипы в груп-

ляции жителей трольной группе с бесплодным бра- пе с ОАА

г.Екатеринбурга фертильных пар ком

А1, В7 А1, В7

AI, В8 А1, В8 А1,В8

А1, В12 Al, В12

Al, В18 *

Al, B3S

А2, В7 А2. В7 А2.В7 А2.В7

А2, В12 А2, В12 А2, В12

А2, В13 А2, В13

А2, BIS А2, BIS

А2, В16

А2,В18>

А2, В27 А2, В27

А2, В35 А2, В35 А2, В35 А2, В35

А2, В40 А2, В40

АЗ.В7 АЗ, В7 АЗ.В7 A3, В7

A3, В12

A3. В35 АЗ, В35 АЗ, В35 A3, В35

АЗ, В40 A3, В40

А9, В7 А9.В7 А9,В7

А 9, В35

А9, В40

Дополнительно в обследованных группах была проведена оценка активности сывороток женщин к #1Л-антигенам партнера в лимфоцитотокси-ческом тесте. Были получены следующие результаты: у женщин с диагнозом бесплодие антитела к HLA -антигенам мужа были выявлены в 1.72% случаев, у женщин с отягощенным акушерским анамнезом они присутствовали в 2.5 раза чаще - в 4.56% случаев (различия достоверны). В контрольной группе антитела к лимфоцитам мужа не были зафиксированы.

Активность сывороток оценивалась по 4-балльной системе: 1 балл - до 25% лимфоцитов мужа погибают, 2 балла - 50% погибших клеток, 3 балла -75% и 4 балла - все лимфоцита мужа разрушены.

В двух исследуемых группах прослеживались противоположные тенденции. В группе женщин с бесплодием преобладали сыворотки с низкой ан-тилимфоцитарной активностью, в то время как у женщин с невынашиванием наблюдался крен в сторону высокой активности сывороток по отношению к #£Л-антигенам мужа.

Таким образом, половина сывороток у бесплодных женщин имеет низкую активность антилимфоцитарных антител, у женщин с невынашиванием, наоборот - высокую.

□ бесплодие ВОЛА

Рисунок 2. Активность сывороток женщин в лимфоцитотоксическом тесте

Если исходить из того, что в работах Говалло В.И.(1978), Вербицкого M.I1L (1980), Труновой Л.А (1984) говорилось, что концентрация лимфоци-тотоксических антител к антигенам отцовского происхождения нарастает во время беременности ко второму - третьему триместру, то обнаружение анти-ЯХЛ-антител у небеременных женщин, а тем более, антител в высоких концентрациях можно расценивать как неблагоприятный фактор для наступления и успешного протекания беременности.,

Антиспермальные антитела. Для изучения вклада антиспермальных антител в нарушение репродукции у жителей г. Екатеринбурга были проведены исследования, целью которых явилось определение концентрации ан-тиспермальных антител в сыворотке крови.

Были обследованы 208 бесплодных супружеских пар (208 женщин и 208 мужчин). В результате исследования антиспермальные антитела, в концентрации, превышающей верхнюю границу нормативных показателей для использованной тест-системы (75 Е/мл) были обнаружены у 24.5% всех супружеских пар с бесплодием. Антитела примерно в равном соотношении определялись как у женщин, так и у мужчин. В то же время антиспермальные антитела в высоких концентрациях у супругов из контрольной группы выявлены не были.

При обследовании женщин, состоящих в бесплодном браке, антитела были выявлены в 11,1% случаев. Антиспермальные антитела, присутствующие в генитальном тракте женщины могут явиться причиной нарушения оплодотворения. Кроме того, противоспермальные антитела могут препятствовать взаимодействию гамет из-за блокирования поверхностных рецепторов.

При обследовании мужчин, состоящих в бесплодном браке, антитела к собственным сперматозоидам были выявлены у 28 человек из 208, что составило 13.5%. Циркулирующие антитела могут стать у мужчины причиной на-

рушения сперматогенеза, приводя к существенному снижению качества спермы (азооспермии и олигоспермии).

Традиционно антиспермальный иммунитет рассматривается в связи с бесплодием. В данной работе, кроме уже описанных бесплодных пар, на антиспермальный иммунитет были обследованы 94 женщины, имевшие в анамнезе спонтанные аборты, мертворождения, ВПР у плода. В этой группе обследованных положительные результаты были получены в 12,8% случаев. Таким образом, было установлено, что антиспермальные антитела могут являться причиной не только бесплодия, но и одним из возможных факторов нарушения нормального развития беременности.

Развитие антиспермального иммунитета является следствием реагирования иммунной системы некоторых индивидов на антигены сперматозоидов, поступающих в репродуктивный тракт. Отсюда вполне оправдан интерес к поиску маркеров генетически запрограммированного риска повышенной продукции антиспермальных антител. Как уже ранее указывалось, в качестве показателей наследственной предрасположенности могут быть использованы антигены главного комплекса гистосовместимости.

Статистический анализ частот антигенов показал, что у лиц с нарушением репродуктивной функции, вызванным повышенной продукцией анти-спермальных антител достоверно реже, чем в фертильной группе и популяции жителей г. Екатеринбурга встречается антиген НЬА-А1. В то же время, сравнительный анализ характера распределения #1Л-антигенов не позволил выделить специфичности, частота которых достоверно выше в исследуемой группе и которые можно было бы использовать в качестве показателей повышенного риска наследственной предрасположенности к развитию анти-спермального иммунитета.

Антифосфолипидные антитела. Известно, что одной гиз иммунологических причин нарушения фертильности могут являться антифосфолипидные антитела, которые вызывают тромбоз плацентарных сосудов и могут оказывать прямое повреждающее действие на плод. Даже если удается сохранить беременность, чрезвычайно высок риск возникновения внутриутробной задержки развития плода, отслойки плаценты, преждевременных родов, мер-творождения.

Для исследования доли нарушений репродуктивной функции у жителей г. Екатеринбурга, вызванных наличием антифосфолипидных антител было проведено обследование 508 женщин, из них 471 - с отягощенным акушерским анамнезом и 37 человек с диагнозом бесплодие. Для контроля была исследована сыворотка 50 фертильных женщин.

Определяли суммарную концентрацию антител к кардиолипину, фос-фатидил-серину, фосфатидил-инозитолу, фосфатидиловой г кислоте класса ^М и класса Так же определяли концентрацию антител к белку-

кофактору ргбР! двух классов IgM и IgG.

У фертильных женщин антифосфолипидные антитела в высоких концентрациях выявлены не были.

Спектр антифосфолипидных антител, выявленных у женщин с отягощенным акушерским анамнезом представлен на рисунке 3.

. /70 ' 6% | 5% | 4% I 3% | 2% . 1% I 0%

Из рисунка видно, что антифосфолипидные антитела могут встречаться в разнообразных сочетаниях. Первый столбец рисунка отражает антифосфолипидные антитела класса IgM, которые, вероятнее всего, не связаны с анти-фосфолипидным синдромом. Суммарные кофактор-независимые антитела к фосфолипидам класса IgM у женщин с отягощенным акушерским анамнезом были выявлены в 31 случае (6.6%).

Все остальные варианты являются проявлением антифосфолипидного синдрома. Таким образом, в 10.1% случаев у женщин с отягощенным акушерским анамнезом был диагностирован антифосфолипидный синдром (АФС).

В 2.1% случаев женщины с АФС имели антитела класса IgM к фосфо-липидам и белку-кофактору. В 2.3% одновременно присутствовали иммуноглобулины М и G к фосфолипидам. В 3.4% обнаружены только IgG-антитела к фосфолипидам (3.4%). В 0.4% были выявлены все четыревида антител. В 1.9% женщины с привычным невынашиванием имели антитела к фосфолипидам и бета-2-гликопротеину-1 класса IgG.

Обычно в литературе антифосфолипидный синдром упоминается в связи с повторяющимися антенатальными потерями, но не приводятся данные по связи АФС с бесплодием.

При обследовании женщин, состоящих в бесплодном браке, в 5.4% случаев были выявлены антитела к фосфолипидам и белку-кофактору классов IgM и IgG, что дает основание подтвердить диагноз АФС.

В 24% случаев у женщин с бесплодием присутствовали только кофактор-независимые иммуноглобулины класса М к фосфолипидам, не позволяющие подтвердить диагноз АФС.

Таким образом, есть основание утверждать, что антифосфолипидный синдром может служить иммунологической причиной не только невынашивания беременности, но и, возможно, одним из факторов иммунологического бесплодия.

Щ''1

2,1% аду« 1,9%

г' ¡л »«л;. ' 1 ^ .' - 1- Л г ; * 1 ч }

АФА(1вМ) АФА+Ь2СР1 АФА АФА (ТгС.) АФА+Ь20Р1 АФА+Ь2СР1 ОвМ) ОеМ+вд (ГЁМ+^О СеР)

Рисунок 3 Спектр антифосфолипидных антител у женщин с ОАА

С целью поиска иммуногенетических маркеров наследственной предрасположенности к нарушению репродуктивной функции, связанной с анти-фосфолипидным синдромом у женщин было проведено сравнение НЬА-антигенного состава женщин, имеющих антитела с популяционным распределением антигенов.

Статистический анализ частот антигенов выявил достоверные различия в распределении #£/1-антигенов у женщин с нарушением фертильности, вызванным антифосфолипидным синдромом от такового в общей массе жителей г. Екатеринбурга.

Достоверно чаще (р<0.05) встречались антигены А29, В22. Антиген НЬА-А29 относится к редко встречаемым у жителей Екатеринбурга. Его частота составляет 2.17%. У женщин с АФА он встречался в 4 раза чаще, его частота в этой группе составила 8.16%. Для того чтобы оценить силу ассоциации антигена НЬА-А29 с заболеванием был проведен расчет величины относительного риска. Показатель RR в данном случае был равен 4.0, что указывает на положительную ассоциативную связь, т.к. показатель относительного риска более 2.0 считается значимым. Следовательно, женщины, несущие в своем ШЛ-фенотипе антиген А29 имеют в 4 раза выше риск развития данной формы нарушения репродукции по сравнению с женщинами, не имеющими названного антигена.

Аналогичная ситуация сложилась для антигена НЬА-Б22, который также принадлежит к редким для жителей Екатеринбурга. Его частота в популяции составила 3.77%, в то время как у женщин с антифосфолипидными антителами он выявлялся в 3 раза чаще, его частота 12.24%. Величина относительного риска для НЬА-Б22 составила 3.56, что также является значимым.

Таким образом, есть основание говорить о положительной ассоциации между антигенами НЬА-А29, НЬА-Б22 и нарушением репродуктивной функции, связанной с циркуляцией антифосфолипидных антител. Иначе говоря, данные антигены можно рассматривать как показатель высокого риска наследственной предрасположенности к АФС, сопряженному с репродуктивными нарушениями.

Наследственные факторы. Для изучения роли хромосомных изменений в нарушении репродуктивной функции у жителей г. Екатеринбурга было проведено цитогенетическое обследование 999 человек. В группу лиц с бесплодием вошли супружеские пары, состоящие в бесплодном браке - 278 человек. Кроме того, были обследованы супружеские пары с отягощенным акушерским анамнезом - 721 человек.

В 2,9% случаев нарушение репродуктивной функции у супружеских пар с бесплодием и отягощенным акушерским анамнезом в г. Екатеринбурге вызвано разными вариантами изменения хромосомного набора клетки.

Инфертильность в названных группах явилась следствием структурных аномалий хромосом.

Подавляющее большинство случаев нарушения репродуктивной функции у супружеских пар с бесплодием вызвано нарушениями в системе ауто-

сом - 83,3%, в то время как доля аномалий кариотипа, с вовлечением половых хромосом составила - 16,7%. Следует отметить, что у супругов с ОАА были выявлены варианты, касающиеся изменения только аутосом (сбалансированные транслокации и инверсии) и не затрагивающие половые хромосомы.

При обследовании супружеских пар с бесплодием (278 человек, из них 160 женщин, 118 мужчин) хромосомные нарушения обнаружены в 2.2%. В подавляющем большинстве случаев в данной группе выявленные аномалии относятся к сбалансированным структурным перестройкам кариотипа. При сбалансированных структурных перестройках не происходит потери или приобретения дополнительного генетического материала, он лишь меняет свое местоположение. Обычно носители таких сбалансированных вариантов хромосомных перестроек не имеют ярких фенотипических проявлений, хотя могут быть небольшие стигмы. Но в процессе гаметогенеза у таких лиц могут возникать варианты несбалансированных гамет, что приводит либо к бесплодию, либо к спонтанному аборту, мертворождению или рождению ребенка с врожденными пороками развития.

Нарушения описаны и у мужчин и у женщин (таблица 3). Описаны разные варианты транслокаций (обмен участками между негомологичными хромосомами) и перицентрических инверсий (поворот участка хромосомы на 180°).

Таблица 3 .

Аномальный кариотип Число случаев

Мужчины (118чел.)

46,X,del(Yq) 1

47,XY,+mar 1

46,XY,t(10;15)(10pl5p;10ql5q) 1

46,XY,inv(9)(pl;ql3) 1

Женщины (160чел.) е

46,XX,inv(9)(pl;ql3) 1

46JOC,inv(JO)(pll;q21) 1

Были обследованы 721 человек (400 женщин, 321 мужчина) из супружеских пар с диагнозом отягощенный акушерский анамнез. Хромосомные нарушения выявлены в 23 случаях, что составило 3.2% (таблица 4). В 100% обнаруженные нарушения относились к структурным аномалиям хромосом.

Из 400 обследованных женщин 12 имели структурные перестройки хромосом (3%). Выявлен достаточно широкий спектр транслокаций. Во всех случаях в межхромосомных обменах участвовали аутосомы.

Были обследованы 321 мужчина из супружеских пар с ОАА, в И случаях выявлены хромосомные нарушения (3.4%).

Таблица 4.

Аномальный кариотип Число случаев

Женщины (400чел.)

46,ХХ,1(12;18)(р13;ц12) 1

46,XX, !(8;9) (8р9р;8с/9д) 1 ,

46,XX, 1(9; 17) (9р17(};9с/17р) 1

45,XX, йег(13;14)(цЮ;ц№) 2

45,XX, екг(14; 15) (я 10;ц10) 1

4б,ХХат(9)(р1;я13) 6

Му ж ч ины (321 чел.)

47МУЛт(9)(р1;я13) 1

46,ХУ, 1(7; ]0) 1

46,ХУ,«3;14)(р24;я32) 1

46,ХХ,1т(9)(р1м13) 6

46,ХХЛт(10)(р11;ц21) 1

4б,ХХ,1т(10)(р12;д11) 1

Важным аспектом цитогенетического обследования лиц с нарушением репродуктивной функции является изучение тонких структур организации хромосом - гетерохроматиновых районов хромосом. Накапливается информация о том, что экстремальные варианты С-гетерохроматина хромосом встречаются с повышенной частотой при некоторых заболеваниях, в том числе при нарушении репродукции.

У супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом и бесплодием кроме аномальных кариотипов встречаются варианты хромосомного полиморфизма, доля которых составляет 2,3% и 5,4% соответственно для невынашивания и бесплодия (различия достоверны), которые, в свою очередь, так же могут оказывать негативное воздействие на способность к репродукции.

В супружеских парах доля полиморфизма хромосом у женщин и у мужчин различна (различия достоверны) (рисунок 4).

Интересно отметить, что крайние варианты хромосом отмечались у женщин из обеих групп почти с одинаково низкой частотой: 1.25% у женщин с бесплодием' и 1.5% у женщин с невынашиванием. В то время как у мужчин величина этого показателя значительно выше и различается в двух описываемых группах (различия достоверны). У мужчин с бесплодием С-полиморфизм выявлен в 11%, причем, варианты, связанные с изменением величины гетерохроматинового блока длинного плеча Г-хромосомы были отмечены в 8.5% случаев. У мужчин, жены которых страдают привычным невынашиванием частота хромосомного полиморфизма в 2.5 раза ниже и составляет 4.4%, доля вариантов У-хромосомы равна 2.2%.

мужчины (ОАА)

женщины (ОАА)

мужчины (беспл.)

женщины (беспл)

1 1

4,40

1 1 1

«0| 1

1 1 !.

4,40

! 1 1

- 1,501 | ,

1 1 1

0,00

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00

Рисунок 4. Процент хромосомного полиморфизма в супружеских парах

ВЫВОДЫ

1. Высокая степень совместимости супругов по антигенам главного комплекса гистосовместимости (три и более общих антигена) негативно влияет на репродуктивные возможности. Идентичность по 3 и более антигенам в 6.54% случаев присутствовала у супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом и в 9.10% случаев у супружеских пар с бесплодием В случае совпадений фенотипов супругов по двум антигенам I класса неблагоприятными для репродуктивных событий являются следующие общие для супругов сочетания антигенов: И£Л-Л1,Б18, А1.В35, А2,В18, АЗ.В12, А9,В40.

2. Высокие концентрации анти-ШЛ-антител у небеременных женщин, можно расценивать как неблагоприятный фактор для наступления и успешного протекания беременности. У женщин с бесплодием антитела к ИЬЛ-антигенам мужа в высоких концентрациях были выявлены в 0.69% случаев, у женщин с невынашиванием беременности они присутствовали в 4.5 раза чаще - в 3.09% случаев.

3. Антиспермальный иммунитет является одним из важных иммунологических факторов, ведущих к бесплодию. В 24.5% случаев антиспермальные антитела явились причиной либо женского,-либо мужского иммунологического бесплодия у бездетных супружеских пар. Установлено, что антиспер-мальные антитела являются причиной не только бесплодия, но и могут быть одной из возможных причин нарушения нормального развития беременности, т.к. в 12.8% случаев антитела были выявлены у женщин с отягощенным акушерским анамнезом.

4. Показано, что антифосфолшгадные антитела, циркулирующие в сыворотке крови женщин, являются иммунологической причиной не только

такого нарушения репродуктивной функции как невынашивание беременности, но и, вполне вероятно, их можно рассматривать как один из факторов иммунологического бесплодия. У женщин с отягощенным акушерским анамнезом в ЛЕкатеринбурге антифосфолипидные антитела в высоких концентрациях присутствовали в 10.1% случаев. В 5.4% случаев антитела выявлены у женщин с бесплодием.

Иммуногенетическими маркерами наследственной предрасположенности к АФС, сопряженному с репродуктивными нарушениями у жительниц г. Екатеринбурга являются антигены ИЬА-А29, ИЬА-Б22

5. В 2,9% случаев нарушение репродуктивной функции у супружеских пар с бесплодием и отягощенным акушерским анамнезом в г. Екатеринбурге вызвано разными вариантами изменения хромосомного набора клетки.

У супружеских пар с бесплодием и невынашиванием беременности кроме аномалий кариотипа встречаются варианты хромосомного полиморфизма, доля которых составляет 2.3% и 514% соответственно для невынашивания и бесплодия, которые, в свою очередь, так же могут оказывать негативное воздействие на способность к репродукции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуется в алгоритм обследования супружеских пар с диагнозами бесплодие или отягощенный акушерский анамнез (выкидыши, мертворожде-ния, рождение детей с ВПР) неясного генеза включить следующие виды лабораторных исследований:

1. Иммуногенетическое исследование: определение степени совместимости ИЬА-фенотипов партнеров супружеской пары.

2. Определение антител к ИЬА-антигенам лимфоцитов партнера в лимфоцитотоксическом тесте.

3. Определение концентрации антиспермалъных антител в сыворотке крови. Обследованию подлежат оба партнера супружеской пары.

4. Определение концентрации антител к фосфолипидам и белку-кофактору р2-гликопротеину-1 в сыворотке крови женщин. '

5. Определение хромосомного набора. Обследованию подлежат муж и

жена.

Использование перечисленных методов лабораторной диагностики позволяет повысить эффективность расшифровки причин бесплодия или невынашивания беременности у супружеских пар, которые ранее относили к случаям нарушения фертильности неясной этиологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Данькова И.В. Скрининг ИЬА-антигенов супружеских пар с нарушенной репродуктивной функцией для прогноза и профилактики осложнений течения беременности/ И.В. Данькова, Н.В. Башмакова,, Л. П. Терешина,

И.В. Рыбина // Перинатальная кардиология: Материалы республиканской научно-практической конференции с международным участием. - Екатеринбург, 1998.- С.133-141.

2. Данькова И.В. Скрининг антифосфолипидных антител для формирования групп риска у пациенток с привычным невынашиванием/ И.В. Данькова, Н.В. Башмакова, Л.П. Терешина, И.В. Рыбина, Я.Б. Бейкин // Информационные базы данных в медицине. Мониторинг здоровья населения и окружающая среда - 99: Международный симпозиум. Тезисы докладов. - Египет, Хургада 17-24 апреля 1999г. - СП 1-112. . . .

3. Данькова И.В. Математическое прогнозирование привычного невынашивания в супружеской паре/ И.В. Данькова, Н.В. Башмакова, И.В. Рыбина // Здоровый новорожденный: перинатальные проблемы и прогноз: Сборник научных трудов. Республиканская научно-практическая конференция. -Екатеринбург, 2000. - С. 181-186. (Данькова И.В., Башмакова Н.В.).

4. Рыбина И.В. Распределение антигенов системы HLAI и П классов в популяции жителей г. Екатеринбурга/И.В.Рыбина, Л.В. Пономарева, А.А. Лившиц, Е.П. Неволина // Внедрение лабораторно-диагностических технологий в практику здравоохранения: Сборник научных трудов. - Екатеринбург, 2000.-С.132-135.

5. Рыбина И.В. Скрининг антифосфолипидных антител в ИФА у женщин группы высокого риска/ И.В., Рыбина, И.В. Данькова, Л.П. Терешина // Внедрение лабораторно-диагностических технологий в практику здравоохранения: Сборник научных трудов. - Екатеринбург, 2000. - С. 136-138.

6. Рыбина И.В. Результаты цитогенетических исследований, проведенных лабораторией генетики в 1992-1999гг/ И.В. Рыбина, Е.В. Рыбакова, Л.В. Пономарева, В.А. Пермяков // Внедрение лабораторно-диагностических технологий в практику здравоохранения: Сборник научных трудов. -Екатеринбург, 2000. - С.139-142.

7. Данькова И.В. Иммунологические и иммуногенетические аспекты перинатальной патологии/ И.В. Данькова, Н.В. Башмакова, И.В. Рыбина// Роль новых перинатальных технологий в снижении репродуктивных потерь: Сборник научных трудов. - Екатеринбург, 2001. - С.30-35.

8. Рыбина И.В. Роль антиспермальных антител в нарушении репродуктивной функции / И.В. Рыбина, Е.В. Рыбакова, Е.П. Неволина//Иммунология Урала: Материалы I конференции иммунологов Урала. - Екатеринбург, 4-6декабря2001.-С.85.

9. Рыбина И.В. Диагностика антифосфолипидного синдрома в акушерской практике методом иммуноферментного анализа/ И.В. Рыбина, Е.В. Рыбакова, Е.П. Неволина // Иммунология Урала: Материалы I конференции иммунологов Урала. — Екатеринбург, 4-6декабря 2001.- С.85-86. (Рыбакова Е.В., Неволина Е.П.).

10. Рыбина И.В. Антигены гистосовместимости в супружеских парах с нарушением репродукции/ И.В. Рыбина, Е.В. Рыбакова, Е.П. Неволина // Иммунология Урала: Материалы II конференции иммунологов Урала. -Пермь, 9-12 сентября 2002.- С.83. (Рыбакова Е.В., Неволина Е.П.).

11. Рыбина И.В. Опыт работы лаборатории генетики в г. Екатеринбурге/ И.В. Рыбина, Е.В. Рыбакова, Е.П. Неволина, М.М. Фадеева, Н.Н. Сбитне-ва // Генетика человека и патология: Сборник научных трудов. — Томск, 2002. -С. 336-339.

12.Рыбина И.В. Цитогенетическое обследование супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом/ И.В. Рыбина, Е.В. Рыбакова, Е.П. Неволина // Актуальные проблемы теоретической медицины: Сборник научных трудов. - Екатеринбург, 2003. - С. 147-155.

13. РыбинаИ.В. Иммуногенетические маркеры предрасположенности к нарушению репродуктивной функции, связанной с циркуляцией антифосфо-липидных антител/И.В. Рыбина, Е.В. Рыбакова, Е.П. Неволина, Я.Б. Бейкин// Иммунология Урала: Материалы III конференции иммунологов Урала. -Челябинск, 16-17 октября 2003. - С.56

I-315Ê

Актуальность проблемы

В условиях экономической нестабильности, падения рождаемости и высокого уровня общей смертности, проблемы охраны репродуктивного здоровья населения приобретают особую значимость. По определению ВОЗ, репродуктивное здоровье — это состояние полного физического, умственного и социального благополучия, а не просто отсутствие болезней или недугов во всех сферах, касающихся репродуктивной системы, ее функций и процессов.

Состояние репродуктивного здоровья населения является предметом интереса не только медицинской практики, но и общественности. Репродуктивное здоровье женщин выделяется своей общественно-политической значимостью, так как оно напрямую связано со здоровьем детей, а следовательно, с будущим государства и нации. Решение задачи сохранения репродуктивного здоровья определяет возможность воспроизводства вида и сохранение генофонда [62].

Известно, что при частоте бесплодных браков, равной 15% и выше (критический уровень), проблема бесплодия приобретает государственное значение. По данным многих исследователей, частота бесплодного брака в России составляет 15—17% и имеет тенденцию к росту [61,62,63,64,77].

Медико-социологические исследования показали, что у 93% женщин бесплодие приводит к психическому, социальному дискомфорту, снижает социальную адаптацию, профессиональную активность, повышает число разводов [63].

Таким образом, нарушение репродукции имеет значение не только для индивидуумов, но оказывает влияние на общество в целом, снижая социальную и профессиональную активность этой группы населения.

Большинство исследований в области проблем репродукции касается невынашивания. Однако известно, что большой процент случаев бесплодия является ни чем иным, как очень ранним невынашиванием беременности. Часть выкидышей остаются незамеченными, потому что они происходят до или во время срока ожидаемой менструации. При тщательном обследовании больных с бесплодием неясного генеза в 15% менструальных циклов была обнаружена беременность, прервавшаяся в ранние сроки [63, 64,144].

От 15 до 20% всех регистрируемых беременностей оканчиваются выкидышем. С каждым последующим выкидышем риск невынашивания беременности повышается [98].

Последние десятилетия ушедшего столетия характеризуются значительными достижениями в области диагностики и лечения различных форм нарушения фертильности. Современный алгоритм исследования причин нарушения репродукции это обширное многокомпонентное обследование, включающее в себя исследование как женского, так и мужского фактора, поскольку вклад в формирование инфертильности могут вносить оба партнера супружеской пары. До 40% приходится на долю мужского фактора, до 80% - женского, причем нередки случаи, когда у супружеской пары имеется сочетание как мужских, так и женских причин, вызывающих нарушение репродукции [26,27,62,64,111].

Традиционно и вполне оправданно в структуре нарушений репродукции выделяют анатомические причины, действие инфекционных агентов, эндокринные факторы, иммунологические и генетические причины. Несмотря на достигнутые успехи, проблемы бесплодия и невынашивания далеки от окончательного решения. Требуют уточнения данные по иммунологическим факторам нарушения фертильности. В последнее время многие исследователи пытаются осмыслить значение иммунной системы в процессах репродукции. Наши представления об иммунологическом взаимодействии организмов матери и плода все еще во многом остаются гипотетическими. Хотя установлено, что до 80 % такого варианта нарушения фертильности как спонтанные аборты неясного генеза обусловлено действием именно иммунологических факторов.

Считается установленным факт участия в репродукции генов главного комплекса гистосовместимости. Имеются ссылки на то, что наличие у партнеров супружеской пары общих HLA-антигенов является одной из причин невынашивания беременности, так как слабое распознавание материнским организмом антигенных детерминант плода препятствует нормальной имплантации. Актуальным остается вопрос о степени совместимости фенотипов партнеров, т. е. наличие какого числа общих антигенов является критическим для наступления беременности.

Исследования последних лет уделяют большое внимание изучению роли антифосфолипидного синдрома (АФС) в патологии репродукции. Но в большинстве работ рассматривается вариант АФС, связанный с обнаружением волчаночного антикоагулянта, в то же время имеются данные, что циркулирующие антифосфолипидные антитела могут являться фактором невынашивания беременности.

Противоречивые сведения приводятся об участии в нарушении фер-тильности антиспермальных антител, выявляемых в сыворотке крови.

Недостаточное внимание при анализе причин, лежащих в основе нарушения репродуктивной функции уделяется исследованию генетических отклонений, хотя известно, что в подавляющем большинстве случаев изменение хромосомного аппарата клетки приводит к нарушению функционирования многих систем органов, в том числе и репродуктивной системы.

Таким образом, в области нарушения фертильности открываются перспективы для продолжения исследований этой важной социальной и научной проблемы. Проблема не только не теряет своей актуальности, но становится все более социально значимой в условиях современной демографической катастрофы.

Цель работы

Изучить вклад иммунологических и иммуногенетических факторов в нарушение репродуктивной функции (бесплодие и невынашивание беременности) у жителей г. Екатеринбурга. 8

Задачи

1. Оценить роль иммуногенетических причин нарушения репродукции. Определить характер популяционного распределения HLA-антигенов у жителей г. Екатеринбурга.

2. Изучить участие антиспермальных антител в развитии разных форм нарушения фертильности (бесплодие и отягощенный акушерский анамнез).

3. Определить вклад антифосфолипидных антител в формирование нарушений репродукции.

4. Установить долю и структуру хромосомных нарушений, приводящих к инфертильности у жителей г. Екатеринбурга.

Научная новизна работы

Определен характер популяционного распределения антигенов гисто-совместимости I класса у жителей г. Екатеринбурга, что является основой для использования полученных данных в исследованиях, посвященных поиску иммуногенетических маркеров наследственной предрасположенности к различным заболеваниям.

Дана оценка роли иммуногенетических факторов негативно влияющих на процессы репродукции у жителей крупного центра Урала. В отличие от ранее выполнявшихся работ, показано, что только высокая степень идентичности HLA-фенотипов супругов (3, 4 и более общих антигена) может приводить к нарушению фертильности.

Изучен вклад в развитие инфертильности таких иммунологических факторов как циркуляция антиспермальных антител и антител, направленных к фосфолипидам мембран и комплексу «фосфолипид - белок-кофактор». Выявлены иммуногенетические маркеры наследственной предрасположенности к нарушению фертильности, связанному с продукцией антифосфолипидных антител у женщин.

Оценен вклад генетических факторов в нарушение репродуктивной функции у супружеских пар диагнозами бесплодие и отягощенный акушерский анамнез в г. Екатеринбурге. Описан спектр хромосомных нарушений у лиц с нарушением фертильности. Определена частота численных и структурных нарушений кариотипа. Дана оценка роли хромосомного полиморфизма, как неблагоприятного фактора для процессов репродукции.

Практическая значимость работы

Получена оценка роли иммуногенетических, иммунологических и генетических факторов, приводящих к нарушениям репродуктивных процессов у жителей г. Екатеринбурга. На основе полученных результатов разработан алгоритм обследования лиц с нарушением репродуктивной функции.

Определены иммуногенетические маркеры, указывающие на повышенный риск нарушений репродуктивной функции. Так присутствие в HLA-фенотипе женщины антигенов HLA-A29 или HLA-B22 является показателем наследственной предрасположенности к развитию антифосфолипидного синдрома, связанного с циркуляцией антител к фосфолипидам мембран, приводящего к нарушению фертильности.

Установлено, что высокая степень совместимости фенотипов половых партнеров по антигенам главного комплекса гистосовместимости (3 и более общих антигена) приводит к осложнению репродуктивных процессов. В то же время наличие у супругов двух общих антигенов в определенном сочетании так же указывает на высокий риск ОАА: А1,В18, А1,В35, А2.В18, АЗ,В12, А9.В40.

Положения, выносимые на защиту

1. Высокая степень совместимости Ш,Л-фенотипов супругов (3, 4 и более общих антигенов) является фактором повышенного риска развития бесплодия или невынашивания беременности. Присутствие у женщины антител к HLA-антигенам партнера в высоких концентрациях негативно сказывается на репродуктивных способностях.

2. В 24,5% случаев бесплодие в супружеских парах является следствием циркуляции антиспермальных антител, вырабатываемых как женщинами к антигенам спермы партнера, так и мужчинами к собственным сперматозоидам. Антиспермальные антитела могут вызывать не только бесплодие, но и невынашивание беременности.

3. В 10,1% случаев невынашивание беременности и, возможно, в 5,4% случаев бесплодие вызвано присутствием в сыворотке крови женщин анти-фосфолипидных антител. Иммуногенетическими маркерами высокой наследственной предрасположенности к развитию нарушений репродукции, вызванных антителами к отрицательно заряженным фосфолипидам мембран, являются антигены HLA-A29 и HLA-B22 .

4. В 2,9% % случаев нарушение фертильности у супружеских пар в г. Екатеринбурге вызвано изменением в хромосомном аппарате клетки. Изменения затрагивают структуру хромосом. В структурных перестройках участвуют как половые хромосомы, так и аутосомы. Крайние варианты хромосомного полиморфизма оказывают негативное влияние на репродуктивную функцию.

Внедрение результатов исследования

Методы исследования внедрены в практику работы лаборатории клинической генетики Диагностического центра лабораторной диагностики ВИЧ, инфекционной патологии и болезней матери и ребенка (г. Екатеринбург). Разработанный алгоритм обследования лиц с нарушением репродуктивной функции внедрен в практическую работу акушерского отделения и отделения репродукции городского Центра планирования семьи и репродукции (ГКБ №35).

Личный вклад автора в выполнение данной работы

Основные идеи, тема и содержание работы разрабатывались автором на основании многолетних исследований в 1996 - 2003 гг. Во всех исследованиях по теме диссертации автор принимал непосредственное участие в их проведении, анализе и обобщении полученных результатов.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 132 страницах компьютерного текста, включая 13 таблиц, 7 рисунков, и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, четырех глав обсуждения собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 172 печатных работы (130 отечественных и 42 - зарубежных).

Формы внедрения и апробации диссертации

Материалы работы доложены на городской научно-практической конференции «Антифосфолипидный синдром в практике акушера-гинеколога» (Екатеринбург, 20 апреля 2000г.), Всероссийской научно-практической конференции «Продовольственная безопасность - XXI век: экологические аспекты» (Екатеринбург, 18-20 сентября 2000г.), II конференции иммунологов Урала (Пермь, 9-12 сентября 2002г.), III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 16-17 октября 2003г.), семинарах для врачей акушеров-гинекологов г. Екатеринбурга.

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

ВЫВОДЫ

1. Высокая степень совместимости супругов по антигенам главного комплекса гистосовместимости (три и более общих антигена) негативно влияет на репродуктивные возможности. Идентичность по 3 и более антигенам в 6.54% случаев присутствовала у супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом и в 9.10% случаев у супружеских пар с бесплодием В случае совпадений фенотипов супругов по двум антигенам I класса неблагоприятными для репродуктивных событий являются следующие общие для супругов сочетания антигенов: HLA-A1,B18, А1,В35, А2,В18, АЗ,В12, А9,В40.

2. Высокие концентрации анти-HLA-антител у небеременных женщин, можно расценивать как неблагоприятный фактор для наступления и успешного протекания беременности. У женщин с бесплодием антитела к HLA-антигенам мужа в высоких концентрациях были выявлены в 0.69% случаев, у женщин с невынашиванием беременности они присутствовали в 4.5 раза чаще - в 3.09% случаев.

3. Антиспермальный иммунитет является одним из важных иммунологических факторов, ведущих к бесплодию. В 24.5% случаев антиспермальные антитела явились причиной либо женского, либо мужского иммунологического бесплодия у бездетных супружеских пар. Установлено, что антиспермальные антитела являются причиной не только бесплодия, но и могут быть одной из возможных причин нарушения нормального развития беременности, т.к. в 12.8% случаев антитела были выявлены у женщин с отягощенным акушерским анамнезом.

4. Показано, что антифосфолипидные антитела, циркулирующие в сыворотке крови женщин, являются иммунологической причиной не только такого нарушения репродуктивной функции как невынашивание беременности, но и, вполне вероятно, их можно рассматривать как один из факторов иммунологического бесплодия. У женщин с отягощенным акушерским анамнезом в г.Екатеринбурге антифосфолипидные антитела в высоких концентрациях присутствовали в 10.1% случаев. В 5.4% случаев антитела выявлены у женщин с бесплодием.

Иммуногенетическими маркерами наследственной предрасположенности к АФС, сопряженному с репродуктивными нарушениями у жительниц г. Екатеринбурга являются антигены HLA-A29, HLA-B22

5. В 2,9% случаев нарушение репродуктивной функции у супружеских пар с бесплодием и отягощенным акушерским анамнезом в г. Екатеринбурге вызвано разными вариантами изменения хромосомного набора клетки.

У супружеских пар с бесплодием и невынашиванием беременности кроме аномалий кариотипа встречаются варианты хромосомного полиморфизма, доля которых составляет 2.3% и 5.4% соответственно для невынашивания и бесплодия, которые, в свою очередь, так же могут оказывать негативное воздействие на способность к репродукции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуется в алгоритм обследования супружеских пар с диагнозами бесплодие или отягощенный акушерский анамнез (выкидыши, мертворожде-ния, рождение детей с ВПР) неясного генеза включить следующие виды лабораторных исследований:

1. Иммуногенетическое исследование: определение степени совместимости HLA-фенотипов партнеров супружеской пары.

2. Определение антител к HLA-антигенам лимфоцитов партнера в лимфоцитотоксическом тесте.

3. Определение концентрации антиспермальных антител в сыворотке крови. Обследованию подлежат оба партнера супружеской пары.

4. Определение концентрации антител к фосфолипидам и белку-кофактору (32-гликопротеину-1 в сыворотке крови женщин.

5. Определение хромосомного набора. Обследованию подлежат муж и жена.

Использование перечисленных методов лабораторной диагностики позволяет повысить эффективность расшифровки причин бесплодия или невынашивания беременности у супружеских пар, которые ранее относили к случаям нарушения фертильности неясной этиологии.

Алгоритм проведения исследований