Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические аспекты нарушения сперматогенеза у мужчин с бесплодием

На правах рукописи

003461221

ТАРАСОВА Марина Николаевна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НАРУШЕНИЯ СПЕРМАТОГЕНЕЗА У МУЖЧИН С БЕСПЛОДИЕМ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ФЕВ ?ппа

Челябинск - 2009

003461221

Работа выполнена в отделении иммунологии и микробиологии Федерального государственного учреждения «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (г. Екатеринбург).

Научный руководитель

доктор медицинских наук Чистякова Гузель Нуховна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Брюхин Геннадий Васильевич доктор медицинских наук Шабалдин Андрей Владимирович

Ведущая организация

ГУ Институт иммунологии и физиологии УрО РАН (г. Екатеринбург)

Защита диссертации состоится февраля 2009 года в /о£ часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава».

Автореферат разослан «_» января 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тенденция к росту мужского фактора в структуре бесплодного брака и ухудшению качества спермы диктует необходимость пристального изучения существующей проблемы (Артюхин А.А.,1999; 2007; Коган О.С. и соавт., 2002; Тер-Аванесов Г.В. и соавт., 1997; Федорова И.Д. и соавт., 2007; Черешнев В.А. и соавт., 2005; Agarwal A. et al., 2003).

Признанным интегральным критерием состояния мужской репродуктивной функции является рекомендованное ВОЗ спермиологическое исследование эякулята, включающее в себя оценку концентрации, подвижности и морфологии сперматозоида, результаты которого не всегда надежны, т.к. фертильность бывает сохранена даже при значительных отклонениях показателей спермограммы от нормы, в то время как бесплодие может наблюдаться и у мужчин с нормоспермией (Леонтьева О.А. и соавт., 2000; Alvarez С. et al., 2003).

Одним из перспективных направлений в исследовании нарушений репродуктивной функции мужчин является изучение аномалий структурной организации хроматина мужских гамет, которые могут быть обусловлены эндогенными разрывами молекулы в процессе компактизации хроматина ядер сперматозоидов, инициацией процесса апоптоза в ходе сперматогенеза, окислительным стрессом в результате действия избыточной концентрации активных форм кислорода (Воробьева О.А., 2005; Agarwal A. et al., 2003; Apedaile A. et al., 2004; Saleh R. et al., 2003). Другим механизмом нарушения фертильности считается развитие аутоиммунных реакций против собственных сперматозоидов (Галимов Ш.Н. и соавт., 2005; Николаева М.А. и соавт., 1997).

Регуляция мужской репродуктивной функции является многоуровневой, с вовлечением не только эндокринной, но и других систем, в частности иммунной. Нормальное протекание процессов гаметогенеза обеспечивается взаимодействием большого количества клеток различного типа, которое осуществляется не только при непосредственных межклеточных контактах, но и за счет сложной системы цитокинов (Коган М.И. и соавт., 2008; Останин А.А. и соавт., 2006).

На сегодняшний день отсутствует целостное представление о взаимодействии цитокиновых сигналов и процесса сперматогенеза. Ряд авторов придерживается точки зрения, что изменение уровня цитокинов ассоциируется не с эффективностью сперматогенеза, а, главным образом, с воспалительным процессом в мужском репродуктивном тракте, в других работах демонстрируется тесная корреляционная взаимосвязь уровня ци-

токинов с рутинными показателями спермограммы: концентрацией, подвижностью, морфологией (Комарова М.В., 2000; Останин A.A. и соавт., 2006; Appasamy М., 2007; Denison F. et al., 1999; Eggert-Krusse W., 2001).

Таким образом, исследование роли иммунной системы в сперматогенезе является перспективным, так как появление новых знаний в этой области позволяет усовершенствовать диагностику и предложить новые методические подходы к анализу причин нарушения репродуктивной функции мужчины (Галимов Ш.Н. и соавт., 2005; Корякин М.В. и соавт., 2000).

Цель работы: определить иммунологические факторы нарушения сперматогенеза у мужчин с бесплодием.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности структурной организации хроматина сперматозоидов у мужчин из супружеских пар с бесплодием.

2. Определить содержание цитокинов в сыворотке крови и эякуляте мужчин из бесплодных супружеских пар и здоровых фертильных мужчин.

3. Оценить взаимосвязь между иммунологическими параметрами и нарушением степени компактизации хроматина сперматозоидов мужчин из супружеских пар с бесплодием.

4. Разработать алгоритм обследования мужчин из числа бесплодных супружеских пар на основе наиболее информативных иммунологических показателей.

Научная новизна. Заключается в определении особенностей структурной организации хроматина половых клеток методом проточной цито-метрии у мужчин из бесплодных супружеских пар. Показано снижение степени компактизации хроматина сперматозоидов и повышение уровня дефектных клеток в эякуляте пациентов как при нормо-, так и при патос-пермии.

Установлено, что нарушение организации хроматина сперматозоидов сопровождается статистически значимым снижением концентрации ингибина В в сыворотке крови и повышением уровня антиспермальных антител в эякуляте.

В иммунологические события, сопровождающие процесс сперматогенеза, вовлечен ряд цитокинов. Ухудшение параметров структурной организации сперматозоидов и отклонение от нормы показателей спермограммы происходит на фоне запуска каскада провоспалительных реакций и активации иммунного ответа, более выраженного на локальном уровне по сравнению с общим системным.

Определены наиболее информативные показатели: степень компактизации хроматина сперматозоидов D/s, относительное содержание дефектных клеток HDS, концентрация ингибина В, вошедшие в основу но-

вой медицинской технологии (ФС № 208/248 от 19.11.2008), использование которых позволяет повысить эффективность диагностики нарушений репродуктивной функции у мужчин с нормоспермией.

Получен патент №2262107 на изобретение «Способ определения зрелости сперматозоидов» (авторы: Чистякова Г.Н., Беломестнов С.Р., Тарасова М.Н.) и приоритетная справка на изобретение «Способ диагностики мужского бесплодия» (авторы: Тарасова М.Н., Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Газиева И.А.) № 2008115047 от 16.04.2008.

Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане исследование расширяет представление о роли иммунной системы в сперматогенезе.

Обоснована необходимость включения информативных иммунологических тестов (степень компактизации хроматина сперматозоидов D/s, относительное содержание дефектных клеток в эякуляте HDS, концентрация ингибина В в сыворотке) в алгоритм лабораторного обследования мужчин из бесплодных супружеских пар при нормоспермии.

Использование разработанных критериев позволяет повысить эффективность диагностики нарушений репродуктивного потенциала у мужчин с нормоспермией.

Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушение организации хроматина сперматозоидов имеет место у пациентов из бесплодных супружеских пар не только при пато-, но и при нормоспермии.

2. Снижение концентрации ингибина В в сыворотке крови и повышение уровня антиспермальных антител у мужчин из супружеских пар с бесплодием сопровождается снижением степени компактизации хроматина сперматозоидов и повышением количества дефектных клеток в эякуляте.

3. В зависимости от выраженности степени нарушений организации мужских половых клеток наблюдается изменение продукции цитоки-нов на локальном и системном уровнях.

4. Особенности структурной организации хроматина, содержание дефектных клеток в эякуляте и концентрация ингибина В в сыворотке крови могут служить дополнительными иммунологическими маркерами оценки репродуктивной функции мужчин.

Внедрение результатов исследования в практику. Разработанный способ диагностики нарушений сперматогенеза у мужчин внедрен в практику научной поликлиники ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий» г. Екатеринбурга; Центра семейной медицины г. Екатеринбурга; поликлиники «Ваш семейный доктор», г. Екатеринбурга; Свердловского областного центра планирования семьи и репродукции г. Екатеринбурга.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях проблемной комиссии и Ученого Совета ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий», научно-практических конференциях ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий» (2007-2008г.г.). Материалы диссертации представлены на XIII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2004г.), III съезде физиологов Урала (г. Екатеринбург, 2006г.); Республиканской научно-практической конференции «Инновационные технологии в охране репродуктивного здоровья женщины» (г. Екатеринбург, 2007г.), VI конференции иммунологов Урала (г. Ижевск, 2007г.), национальных Днях лабораторной медицины России - 2008 (г. Москва, 2008г.), Международной научно-практической конференции «Репродуктивное здоровье населения Урала и Сибири» (г. Екатеринбург, 2008г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных сокращений и библиографического указателя, включающего 152 источника, в том числе 72 иностранных. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа основана на результатах клинико-лабораторного обследования 256 мужчин из числа бесплодных супружеских пар и 15 здоровых фертильных мужчин репродуктивного возраста. По результатам инфекционного и гормонального статусов 127 пациентов из бесплодных пар были исключены из дальнейшего исследования, 30 пациентов составили экзаменационную выборку для проверки эффективности способа диагностики нарушений сперматогенеза, 99 пациентов обследованы для выполнения поставленных в работе задач.

Мужчины из супружеских пар, обратившихся в научную поликлинику ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий» г. Екатеринбурга (руководитель отделения - к.м.н. Данькова И.В.) за период 2005-2008 г.г. по поводу бесплодного брака, проходили обследование на специализированном приеме уролога-андролога (к.м.н. Беломестное С.Р.).

На основании данных спермиологического анализа эякулята были сформированы следующие группы:

• 1-я основная группа (группа с нормоспермией) - 55 мужчин из числа бесплодных супружеских пар с показателями спермограммы, соответствующими нормам, рекомендованным ВОЗ (группа подразделена в ходе дальнейшего исследования на 3 подгруппы).

• 2-я основная группа (группа с патоспермией) - 44 мужчины из бесплодных супружеских пар с отклонением от рекомендованных норм одного или несколько показателей спермограммы.

• группа сравнения - 15 здоровых мужчин фертильного возраста с нормальной репродуктивной функцией.

Критерием исключения для пациентов, отобранных в основные группы, являлись: женский фактор бесплодия, а также гормональные нарушения и вирусно-бактериальные инфекции, верифицированные при обследовании супружеской пары.

Спермиологическое исследование эякулята проводили в соответствии со стандартным протоколом, рекомендованным ВОЗ (Руководство ВОЗ, 2001).

Уровни антиспермальных антител (АСАТ) класса IgG в эякуляте и состояние структуры хроматина сперматозоидов исследовали с использованием метода проточной цитофлуориметрии на анализаторе «FACSCali-bur» фирмы «Becton Dickinson» (США).

Оценку количества АСАТ проводили с использованием FITC меченых мышиных моноклональных антител к IgG человека.

Структурную организацию хроматина сперматозоидов оценивали методом SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) в нашей модификации (патент №2262107 от 10.10.2005г. на изобретение «Способ определения зрелости сперматозоидов») с применением красителя этидия бромид.

Флуоресценцию ДНК сперматозоидов измеряли на проточном ци-тофлуориметре в красной области спектра (\~620 нм), со скоростью сортировки 300 клеток в секунду.

При нормальном (компактизированном) состоянии хроматина гистограммы распределения клеток представляют собой правильные гаус-сианы. Нарушения компактизации хроматина отражаются отклонениями формы гауссианы от правильной, появлением на гистограммах дополнительных пиков (рис. 1).

Подвергая ядерное вещество клетки насильственной деконденсации и оценивая произошедшее изменение интенсивности флуоресценции, можно судить о степени изначальной компактизации хроматина. В норме почти все клетки окрашиваются одинаково и имеют низкую интенсив-

ность флуоресценции, которая после деконденсации увеличивается. В основе этого процесса лежит способность полиаминных соединений (например, гепарина) удалять белки молекулы ДНК, не связанные дисуль-фидными мостиками, и переводить хроматин в состояние, максимально доступное для взаимодействия с флуорохромом. Уровень интеркаляции красителя между парами азотистых оснований молекулы ДНК отражает эффективность компактизации хроматина. Сравнивая гистограммы распределения клеток до и после обработки гепарином с использованием статистического критерия Колмогорова-Смирнова, определяли индекс подобия двух кривых - D/s, характеризующий степень компактизации хроматина сперматозоидов.

о

FL2-Height

Рис. 1. Гистограммы распределения клеток до ( В ) и после ) обработки гепарином. М1 - количество дефектных клеток в эякуляте, М2 - доминирующая популяция клеток. М4 - дополнительный пик. |

При изначально максимальной компактизации хроматина, характерной для зрелых сперматозоидов, деконденсация гепарином приводила к существенным изменениям флуоресценции ДНК, гистограммы и кривые ( распределения клеток на графике значительно различались, показатель D/s имел высокое значение.

При нарушениях процесса компактизации хроматина насильственная деконденсация приводила к незначительным изменениям флуорес- i ценции и значение параметра D/s было снижено.

Нами установлено ранее, что значение степени компактизации хроматина D/s более 48,5 усл.ед. свидетельствует о зрелом состоянии сперматозоидов (норма), а значение D/s менее 48,5 усл.ед. характеризует незрелость сперматозоидов (патология).

Помимо оценки степени компактизации хроматина сперматозоидов применявшаяся методика позволяла определить уровень неспецифической флуоресценции HDS, отражающий процентное содержание дефектных клеток в исследуемом образце эякулята, в норме его значение не превышает 15%.

Для определения уровня медиаторов межклеточного взаимодействия (IL-lp, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-a, IFN-y, TGF-0, CRP, ингибин В) в сыворотке крови и семенной плазме использовали метод иммунофлуоресцентного анализа. Методика постановки реакции и оценка полученных результатов проводились в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей реагентов.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 7.0 для Windows 98, «Statistica 6.0». Данные представлены в виде средней величины и среднеквадратичного отклонения. Для оценки достоверности различий между группами использовали критерий Манна-Уитни, в случае множественных сравнений использовали поправку Бонферрони. Для определения информативности показателей и создания алгоритма диагностики нарушений применяли процедуру дискриминантного анализа, реализованного в прикладной программе «Statgraphics 2.1». Исследование взаимосвязи между параметрами проводили с помощью корреляционного анализа с вычислением коэффициентов корреляции Спирмена (г). Результаты считались достоверными при уровне значимости р<0,01.

Результаты исследования

Морфо-функциональные и количественные показатели эякулята пациентов 1-й группы из бесплодных супружеских пар и здоровых фертиль-ных мужчин соответствовали критериям ВОЗ [Руководство ВОЗ, 2001].

У мужчин 2-й группы в 65,22% случаев отмечали отклонение от нормы двух либо трех показателей спермограммы (олигоастенозооспер-мия, астенотератозооспермия, олигоастенотератозооспермия). В остальных случаях выявлено либо только изменение морфологических характеристик (тератозооспермия) либо только отклонение от нормы количества подвижных сперматозоидов категории А+В (астенозооспермия).

При исследовании структурной организации сперматозоидов отмечены значительные колебания параметров у пациентов 1-й группы с нор-моспермией, что позволило выделить три подгруппы. Критерием отбора

послужили параметры, характеризующие организацию мужских половых клеток - степень компактизации хроматина сперматозоидов D/s и количество дефектных клеток HDS:

1-я подгруппа включала 17 пациентов, показатели степени компактизации хроматина D/s и количества дефектных клеток HDS которых соответствовали установленной норме (D/s>48,5 усл.ед., HDS<15,0%);

2-я подгруппа объединила 19 пациентов, у которых один из показателей находился в пределах нормы, в то время как другой не соответствовал нормативному значению (D/s>48,5 усл.ед. и HDS>15,0% или D/s<48,5 усл.ед. и HDS<15,0%). Следует отметить, что у 63,1% пациентов этой подгруппы параметр HDS превышал допустимое значение, в то время как степень компактизации D/s была в норме, а у 36,8% только параметр D/s снижался относительно нормального значения.

3-я подгруппа включала 19 пациентов, степень компактизации хроматина D/s и количество дефектных клеток HDS которых не соответствовали норме (D/s<48,5 усл.ед.; HDS>15,0%).

Таблица 1

Показатели структурной организации сперматозоидов у мужчин из супружеских пар с бесплодием (М±о)

Показатель Группа сравнения (здоровые фертильные мужчины), (п=15) Мужчины из супружеских пар с бесплодием, (п=99)

1-я группа (нормоспермия), (п=55) 2-я группа (патоспермия), (п=44)

1-я подгруппа, (п=17) 2-я подгруппа, (п = 19) 3-я подгруппа, (п=19)

D/s, усл.ед. 59,84 ± 5,3 58,21 ±9,89 46,51± 12,62 * ** 32,16± 11,58 * 34,25±15,13 *

HDS,% 10,36 ±2,43 13,4 ± 1,92 23,64 ±11,21 * ** 53,33 ±27,35 * 45,68±23,53 *

Примечание: *р<0,01-статистически значимые различия с 1-й подгруппой, **р<0,01 -между 2-й и 3 подгруппами.

Степень компактизации хроматина сперматозоидов D/s у пациентов 1-й подгруппы соответствовала установленной норме и не отличалась от значений аналогичного параметра у фертильных мужчин. Среднее значение D/s у пациентов 2-й и 3-й подгрупп было снижено по сравнению со здоровыми мужчинами и пациентами 1-й подгруппы. Кроме того, степень компактизации хроматина пациентов 3-й подгруппы имела минимальное для данной группы значение, сопоставимое со значением этого показателя у пациентов с патоспермией.

Количество дефектных клеток HDS у пациентов 1-й подгруппы было минимальным и не отличалось от значения HDS у фертильных мужчин. Уровень аномальных клеток в эякуляте пациентов 2-й и 3-й подгрупп достоверно превышал аналогичный показатель здоровых мужчин и пациентов 1-й подгруппы, при этом количество дефектных клеток у пациентов 3-й подгруппы не отличалось от значения HDS в группе пациентов с па-тоспермией.

Нарушения структурной организации хроматина половых клеток у мужчин с нормоспермией, выявленные в ходе настоящего исследования, согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что маркеры нарушений ДНК сперматозоидов не имеют четкой корреляции с параметрами спермограммы, рекомендованными к исследованию ВОЗ, а сперматозоид, расцененный при цитоморфологическом анализе как «нормальный», может иметь повреждения в структуре ДНК (Alvarez, С., 2003).

Достоверное снижение параметра D/s при статистически значимом увеличении уровня HDS у пациентов из бесплодных пар с нормальными показателями спермограммы относительно фертильных мужчин, параметры спермиологического анализа которых также соответствуют нормативным значениям, свидетельствует об инициации патологических изменений в процессе сперматогенеза, не проявившихся на момент обследования качественно-количественными изменениями эякулята, но, вероятно, служащими одной из причин снижения мужского репродуктивного потенциала. Следовательно, для получения наиболее полной информации о фертилизационном потенциале эякулята, были выполнены исследования уровня антиспермальных антител.

Оценка антител класса IgG, вырабатываемых против собственных сперматозоидов, показала, что у пациентов из бесплодных супружеских пар как при пато-, так и в большинстве случаев при нормоспермии, наблюдалось достоверное повышение среднего уровня АСАТ в сравнении со здоровыми фертильными мужчинами.

Отмечено статистически значимое повышение уровня АСАТ у мужчин с нормоспермией при снижении степени компактизации хроматина и повышении количества дефектных клеток в эякуляте (3-я подгруппа), или при изменении одного из перечисленных показателей (2-я подгруппа): уровень АСАТ у пациентов 2-й и 3-й подгрупп был в 2,69 и 3,96 раза выше аналогичного показателя у пациентов 1-й подгруппы, параметры, характеризующие организацию мужских половых клеток (D/s, HDS) которых не отличались от значений нормы.

Наиболее выраженное повышение уровня АСАТ зарегистрировано в группе пациентов с патоспермией: разница с аналогичным показателем фертильных мужчин и пациентов 1-й подгруппы составила 3,8 и 4,1 раза соответственно.

Статистически значимая тенденция к повышению уровня АСАТ у пациентов из бесплодных супружеских пар с нормоспермией в зависимости от степени выраженности изменений структуры хроматина и пациентов с патоспермией, свидетельствует о развитии аутоиммунных реакций против собственных сперматозоидов и позволяет предполагать существование нарушений на уровне гематотестикулярного барьера (ГТБ), основу которого составляют клетки Сертоли.

На патологические процессы в ГТБ косвенно указывает и снижение концентрации синтезируемого клетками Сертоли ингибина В у пациентов из бесплодных супружеских пар 2-й и 3-й подгрупп с нормоспермией и пациентов с патоспермией по сравнению с фертильными мужчинами. Следует отметить обратную взаимозависимость выработки антител против сперматозоидов и концентрации ингибина В в системном кровотоке пациентов сравниваемых групп, продемонстрированную на рисунке 2.

Ш] АСАТ,усл.ед. —*-ИнгибинВ,пг/мл

группа норм. норм. норм, гигоспермия сравнения 1годгрупт2шдгрупгЕаЗподфупга

Рис. 2 Уровни АСАТ и ингибина В у пациентов из бесплодных супружеских пар

Максимальная концентрация ингибина В и минимальный уровень АСАТ выявлены в группе фертильных мужчин и подгруппе пациентов с нормальными характеристиками структуры ДНК сперматозоидов.

Таким образом, постепенное снижение уровня ингибина В в сыворотке крови и нарастание содержания антител против собственных сперматозоидов свидетельствуют об инициации аутоиммунных процессов, которые считаются одним из патогенетических механизмов нарушения мужской репродуктивной функции (Божедомов В.А., 2000).

Анализ результатов исследования уровня цитокинов в сыворотке крови показал, что усиление синтеза иммунорегуляторного 1L-1RA и про-воспалительного IL-8 является общим признаком в цитокиновом статусе пациентов из бесплодных супружеских пар как при пато-, так и при нор-моспермии, позволяющим дифференцировать их от группы здоровых фертильных мужчин (табл. 2).

Таблица 2

Содержание цитокинов и С-реактивного белка в сыворотке крови мужчин из супружеских пар с бесплодием (М±а)

Показатели Группа сравнения, (п=15) Мужчины из супружеских пар с бесплодием, (п=99)

1-я группа (нормоспермия), (п=55) 2-я группа (патоспермия), (п=44)

1 -я подгруппа, (п=17) 2-я подгруппа, (п=19) 3-я подгруппа, (п=19)

Провоспалительные

IL-1р,пг/мл 14,49*22,97 17,46 ±19,11 9,9 0± 17,40 9,67± 11,49 10,96± 16,71

IL-2, пг/мл 14,32 ± 1,57 22,1 ± 16,89 13,57±4,52 * 14,49±5,3 * 15,76 ±5,23

IL-6, пг/мл 6,23 ± 4,07 6,3 7 ± 1,19 7,268 ± 2,305 5,97 ±3,43 6,83 ± 1,76

IL-8, пг/мл 9,63 ± 3,75 41,3±33,53* 26,3 ±18,9* 38,3 ±33,8 * 140,8 ±197,04*

IFN-y, пг/мл 6,77 ±2,50 7,53 ± 4,94 11,34 ±4,87* 12,2±5,67 * 10,99 ±6,65 *

TNF-tt,iir/M;i 56,07± 30,67 47,65 ±22,17 62,35 ±41,13 100,4±53,59* 148,23±162,93*

CRP, нг/л 4,42 ±0,65 5,11±1,98 5,10± 1,04 6,54±4,07 8,01 ±4,87

Иммунорегуляторные

IL- IRA, пг/мл 43,55± 30,75 163,5±86,43* 121,2± 38,2* 95,6±31,64 ♦ 105,34±37,14 *

IL-4, пг/мл 2,71 ±1,76 1,89 ±0,21 2,61 ± 1,89 2,17 ± 1,02 2,81 ± 1,88

IL-10, пг/мл 1,43 ±0,60 4,46 ± 4,92 * 1,10 ±0,64 1,17 ±0,55 1,97 ±2,47

TGF-P,пг/мл 41360±3263 35775±23028 36623±18425 47767 ± 9699 45114± 15840

Примечание: *р<0,01 в сравнении с группой здоровых мужчин.

Установлено, что повышение уровней IL-1RA и IL-8 на фоне усиленного синтеза IL-10, отмеченное у мужчин 1-й подгруппы, является ключевым моментом изменения цитокинового баланса, приводящее к нарушению сперматогенеза.

Определено, что нарушение организации половых клеток сопровождается повышением уровней IFN-y и TNF-a, которые, потенциируя эффекты друг друга, способствуют прогрессированию патологического процесса, на что указывают максимальные значения вышеназванных цитоки-нов, зафиксированные в сыворотке крови пациентов с выраженными нарушениями организации хроматина сперматозоидов (3-я подгруппы, группа патоспермии).

При исследовании уровня спермальных цитокинов было обнаружено, что отличительными признаками в продукции цитокинов, характерными для пациентов с нарушением репродуктивной функции, является усиление локального синтеза как медиаторов воспаления IL-1[3, IL-8, TNF-a, так и иммунорегулятора IL-10, который играет важную роль в реализации противовоспалительных реакций (табл.3).

Таблица 3

Содержание цитокинов и С-реактивного белка в спермальной плазме мужчин из супружеских пар с бесплодием (М±о)

Показатели Группа сравнения, (п=15) Мужчины из супружеских пар с бесплодием, (п=99)

1-я группа (нормоспермия), (п=55) 2-я группа (патоспермия), (п=44)

1-я подгруппа, (п=17) 2-я подгруппа, (п=19) 3-я подгруппа, (п=19)

Провоспалительные

IL-lp,пг/мл 2,14 ±0,03 4,7 ±2,29 * 2,69 ±0,89 * 3,35 ±0,57 * 5,03 ±5,45 *

IL-2,пг/мл 24,16± 0,65 24,20±1,68 ** 24,55 ±2,3 ** 28,24 ± 8,67 46,3±39,48*

IL-6,пг/мл 8,2 ±0,21 11,25± 2,75 ** 8,4 ±3,68 ** 10,4 ±6,06** 6,3 ±1,37 *

IL-8,пг/мл 40,6 ±1,91 269,03±255,9 * ** 232,4±210,9 * ** 383,3±290,2 * ** 101,7±54,3*

IFN-y,пг/мл 5,58 ±0,66 3,71 ±4,42 ** 5,44 ±5,07 ** 3,9 ±5,45 ** 11,01±6,65 *

TNF-a,пг/мл 32,04± 1,93 35,29±2,21* ** 37,54 ±7,3* ** 36,3±5,1* ** 101,6±68,9*

CRP.Hr/л 0,25 ±0,19 0,26 ± 0,01 ** 0,33 ±0,04 ** 0,4±0,03 * ** 0,62 ±0,04 *

Иммунорегуляторные

IL-4, пг/мл 3,14 ±0,37 3,27 ± 0,74 4,05 ± 1,58 4,12 ±2,57 4,14 ±1,48 *

IL-10, пг/мл 2,21 ±0,09 2,6 ±0,21* ** 2,96 ±1,29 * 5,9± 2,3 * ** 3,1 ±0,92 *

TGF-p, пг/мл 12380± 314 11249 ±727 12955 ±2565 23163 ±1000 * 24213±2465*

Примечание: *р<0,01 в сравнении с группой здоровых мужчин;

**р<0,01 в сравнении с группой патоспермии.

На фоне выявленных в цитокиновом звене отличительных признаков, характерных для мужчин с бесплодием, у пациентов 3-й подгруппы и группы патоспермии при нарушении степени компактизации хроматина и увеличении относительного числа дефектных клеток, отмечалась повышенная продукция в спермальной плазме ростового фактора ТСБ-Р и увеличение концентрации С11Р.

У мужчин 1-й подгруппы, имеющих нормативные значения показателей Б/б и НО8 и 2-й подгруппы с отклонением от нормы одного из показателей, были выявлены общие в цитокиновом статусе признаки, дифференцирующие здоровых фертильных мужчин от пациентов из числа супружеских пар с бесплодием.

Сопоставление результатов исследования системной и локальной продукции медиаторов межклеточного взаимодействия выявило однонаправленность синтеза хемоаттрактанта 1Ь-8, концентрация которого относительно здоровых фертильных мужчин достоверно повышалась как в сыворотке крови, так и в спермоплазме у пациентов из числа бесплодных супружеских пар при нормо- и патоспермии (табл.4).

Вместе с тем, усиление продукции 1Ь-1р наблюдалось только локально (в спермоплазме), при неизмененном синтезе на системном уровне (в сыворотке крови). Поскольку 1Ь-1р является главным медиатором развития воспалительной реакции на локальном уровне, ответственным за все последовательные этапы адекватного ответа на внедрение патогена, то увеличение спермального 1Ь-1р свидетельствует о развитии местной воспалительной реакции, а также о состоятельности локальных защитных реакций.

Увеличение уровня ТОТ-а в сыворотке крови отмечалось у пациентов с нарушением организации хроматина сперматозоидов (3-я подгруппа и группа патоспермии). Повышение концентрации ТЫР-а в спермоплазме было зарегистрировано у всех пациентов из супружеских пар с бесплодием.

Выявлены наиболее информативные при оценке нарушений мужской репродуктивной функции медиаторы межклеточного взаимодействия - 1Ш-у и ТЫР-а. Повышение концентрации сывороточного ШЧ-у начинает проявляться у пациентов с нормоспермией с отклонением от нормы хотя бы одного из показателей структурной организации сперматозоидов (2-я подгруппа). При усугублении нарушений организации половых клеток (3-я подгруппа и патоспермия) повышение уровня Ш^-у наблюдается в спермоплазме.

Таблица 4

Направленность изменений содержания цитокинов и С-реактивного белка в сыворотке крови и спермальной плазме мужчин __из бесплодных супружеских пар_

Показатели Локализация Мужчины из супружеских игр с бесплодием, (п=99)

1-я группа (нормоспермия), (п=55) 2-я группа (патоспермия), (n=44)

1-я подгруппа, (п=17) 2-я подгруппа, (п=19) 3-я подгруппа, (n=19)

Провоспалительные

IL-lß сыв.крови -> -> ->

спер.плазма т t t t

IL-2 сыв.крови -» ->

спер.плазма -> t

IL-6 сыв.крови —> -»

спер.плазма -* >1

IL-8 сыв.крови т t t t

спер.плазма tt tt tt t

IFN-y сыв.крови t t t

спер.плазма -> -> tt

TNF-a сыв.крови -> —> t t

спер.плазма т t t t

CRP сыв.крови -» ->

спер.плазма -> -> t tt

Иммунорегуляторные

IL-4 сыв.крови -> ->

спер.плазма ~> -> -> t

IL-10 сыв.крови г ->

спер.плазма t t tt t

TGF-ß сыв.крови ->

спер.плазма t t

Примечание: —»- концентрация медиаторов на уровне группы сравнения; t- статистически значимое превышение, 4- - статистически значимое снижение показателей по сравнению со здоровыми фертилышми мужчинами; tt - наиболее выраженное повышение (в 2 и более раза). Увеличение концентрации сывороточного TNF-a обнаруживается у пациентов из бесплодных пар с нормоспермией с нарушением структурной организации сперматозоидов (3-я подгруппа), тогда как повышение TNF-a на локальном уровне начинает проявляться при менее выраженных нарушениях (группы нормо- и патоспермии).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что в иммунологические события, сопровождающие процесс сперматогенеза, вовлечен ряд цитокинов. Ухудшение параметров структурной организации сперматозоидов и в последующем отклонение от нормы показателей спермограммы, происходит на фоне запуска каскада провоспали-тельных реакций и активации иммунного ответа на локальном и системном уровне.

Анализ корреляционных взаимоотношений при нормо- и патоспер-мии у мужчин из бесплодных супружеских пар позволил выделить стадии нарушения мужской фертильности:

Первая стадия — при нормоспермии и зрелом состоянии сперматозоидов (1-я подгруппа) в эякуляте имеет место превалирование функциональных зависимостей между первичными и вторичными медиаторами межклеточного взаимодействия - корреляции между IL-lß, IL-2,1L-4,1L-6 и CRP, а также CRP и параметрами организации сперматозоидов, уровнем АСАТ. Усиленная продукция показателей первичной активности иммуно-компетентных клеток - провоспалительных цитокинов способствует в дальнейшем увеличению синтеза вторичных медиаторов (CRP) и свидетельствует о развитии оксидативного стресса, выработке свободных радикалов, избыточная концентрация которых оказывает повреждающее воздействие на все клетки организма, в том числе клетки Сертоли, следствием чего может быть снижение синтеза ингибина В, повреждение ГТБ и выработка большого количества антител против сперматозоидов, появление разрывов в ДНК половых клеток. Активация иммунной системы на локальном уровне в ответ на патологическое экзо- или эндогенное воздействие может служить пусковым фактором развития нарушений сперматогенеза.

Вторая стадия - нарушение структурной организации половых клеток и развитие аутоиммунных реакций происходит в результате потенцирующего действия провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов, оксидативного стресса на фоне снижения секреции ингибина В.

Выявленные корреляционные связи указывают на участие ингибина В и IL-lß, IL-6, IL-4, IL-8, IL-10 в снижении степени компактизации хроматина сперматозоидов, TNF-a и IFN-y - в увеличении количества ан-тиспермальных антител, TGF-ß и АСАТ - в повышении числа дефектных клеток в эякуляте.

Третья стадия - развитие степени нарушения механизмов регуляции сперматогенеза. Включение в каскад провоспалительных реакций CRP и фактора TGF-ß, образование функциональных зависимостей между CRP и морфологией, подвижностью, концентрацией сперматозоидов свидетельствуют о выходе регуляции за рамки первичных медиаторов и вовлечении вторичных медиаторов. Образование тесных взаимосвязей цитокинов как с показателями организации половых клеток, так и с количественно-качественными характеристиками эякулята (морфологией, подвижностью и концентрацией сперматозоидов), отражает участие данных медиаторов в посттестикулярных этапах созревания сперматозоидов. Прогрессирование патологического процесса приводит к патоспермии.

На основании статистической обработки результатов обследования мужчин из супружеских пар с бесплодием был выявлен комплекс наиболее информативных параметров и выведена формула определения диагностического индекса (В1), отражающего нарушения сперматогенеза у мужчин с нормоспермией:

= п х 0,037 + М х (-0,014) + 1В х 0,005 - 2,402 , где

п - степень компактизации хроматина сперматозоидов й/э (усл.ед.);

М - относительное содержание дефектных клеток НЬБ (%);

1В - концентрация ингибина В (пг/мл).

При значении Б1 менее 0 делают заключение о нарушении сперматогенеза, при более 0 диагностируют отсутствие данных нарушений.

Чувствительность предложенного способа диагностики нарушения сперматогенеза у мужчин составила 93,3%, специфичность - 81,4%, эффективность - 84,5%.

Разработанный способ диагностики нарушений сперматогенеза позволил построить алгоритм обследования мужчин из бесплодных супружеских пар при нормоспермии (рис. 3).

Рис. 3. Алгоритм диагностики нарушений сперматогенеза при нормоспермии у мужчин из числа бесплодных супружеских пар.

Таким образом, на основании вышеизложенного, можно заключить, что пусковым фактором нарушения фертильности у мужчин из супружеских пар с бесплодием при нормо- и патоспермии является изменение баланса цитокинов на локальном уровне (повышение синтеза IL-ф, IL-8, TNF-a, IL-10 в спермоплазме), приводящее к нарушению структурной организации хроматина половых клеток, развитию аутоиммунных реакций против сперматозоидов, снижению концентрации ингибина В в сыворотке крови.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено снижение степени компактизации хроматина сперматозоидов и повышение уровня дефектных клеток в эякуляте у большинства (70% случаев) пациентов из бесплодных супружеских пар при нормос-пермии.

2. Нарушение организации хроматина сперматозоидов у мужчин из супружеских пар с бесплодием сопровождается статистически значимым снижением концентрации ингибина В в сыворотке крови и повышением уровня антиспермальных антител в эякуляте.

3. Установлено повышение синтеза IL-ip, IL-8, TNF-a, IL-10 в спермоплазме и возрастание концентрации IL-IRA и IL-8 в сыворотке крови у мужчин из супружеских пар с бесплодием при нормо- и патоспермии.

4. При нарушении структурной организации сперматозоидов у пациентов с нормоспермией повышается концентрация IFN-y и TNF-a в сыворотке крови и концентрация CRP и TGF-(3 в спермоплазме. Патос-пермия сопровождается усилением локальной продукции IL-2, IL-4 и IFN-у на фоне снижения концентрации IL-6.

5. Степень компактизации хроматина сперматозоидов, содержание дефектных клеток в эякуляте и концентрация ингибина В в сыворотке крови служат маркерами, позволяющими повысить эффективность диагностики нарушений репродуктивной функции мужчин.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки риска развития нарушений сперматогенеза у мужчин из супружеских пар с бесплодным браком рекомендуется определение уровня IL-ip, IL-8, TNF-a, IL-10 в спермальной плазме и IL-IRA, IL-8 в сыворотке крови.

2. При диагностике мужского бесплодия рекомендуется включить в лабораторное обследование мужчин из супружеских пар с бесплодным браком следующие диагностические тесты: оценку зрелости сперматозои-

дов методом проточной цитометрии с определением показателя D/s, характеризующего степень компактизации хроматина сперматозоидов и относительного содержания дефектных клеток HDS и определение концентрации ингибина В в сыворотке крови методом ИФА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Беломестнов, С.Р. Антиспермальные антитела (Ig G) при физиологическом течении беременности и угрозе самопроизвольного прерывания в первом триместре / С.Р. Беломестнов, Г.Н. Чистякова, Г.Б. Мальгина, М.Н. Тарасова // Медицинская иммунология. - 2004. - № 3 - 5. - С. 375.

2. Способ определения зрелости сперматозоидов / Г.Н. Чистякова, С.Р. Беломестнов, М.Н. Тарасова // Патент на изобретение № 2262107 от 10.10.2005 г.

3. Тарасова, М.Н. Оценка состояния зрелости сперматозоидов у мужчин с нарушением репродуктивной функции / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, В.И. Токарь, С.Р. Беломестнов, И.А. Газиева // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - № 9. - С. 47 - 48.

4. Тарасова, М.Н. Характеристика бактериальной микрофлоры эякулята у мужчин с различной степенью конденсации хроматина сперматозоидов / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, В.И. Токарь, И.А. Газиева // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - № 9. - С. 48.

5. Тарасова, М.Н. Прогностические критерии нарушения репродуктивной функции мужчин / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова // Иммунология Урала: материалы V конференции иммунологов Урала (30 октября - 1 ноября 2006г.). - 2006. - № ] (5). _ с. 177 - 178.

6. Тарасова, М.Н. К вопросу о возможных причинах нарушений структурной организации хроматина сперматозоидов / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.А. Газиева, И.И. Ремизова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006.-№ 2 -3 (15). — С. 122- 123.

7. Методы диагностики и коррекции мужского фактора риска потери беременности в первом триместре / С.Р. Беломестнов, Г.Б. Мальгина, Г.Н. Чистякова, В.И. Токарь, Л.Д. Шейко, М.Н. Тарасова, С.И. Билимова, И.И. Ремизова // Медицинская технология № ФС-2006/363 от 20.12.2006г.

8. Тарасова, М.Н. Уровень ингибина В и TNF-a у мужчин с нарушением репродуктивной функции / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, И.А. Газиева // Russian Journal of Immunology. - 2007. - Vol. 9 (4). - P. 140.

9. Тарасова, М.Н. Содержание ингибина В у мужчин с нарушением репродуктивной функции / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.А. Газиева, И.И. Ремизова, В.И. Токарь // Клиническая лабораторная диагностика. -

2007.-№9.-С. 77.

10. Тарасова, М.Н. Оценка влияния иммунологических факторов на структурную организацию хроматина сперматозоидов / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, И.А. Газиева // Иммунология Урала: материалы VI конференции иммунологов Урала (28 - 31 октября 2007 г.). -

2007.-№ 1 (6).-С. 165-167.

И. Тарасова, М.Н. Диагностическая значимость исследования структуры хроматина сперматозоидов для оценки фертильности мужчин / М.Н. Тарасова, И.А. Газиева, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова // Инновационные технологии в охране репродуктивного здоровья женщины: материалы республиканской научно-практической конференции. - Екатеринбург, 2007. -С. 237-239.

12. Тарасова, М.Н. Оценка уровня АСАТ и ингибина В у мужчин с различной степенью зрелости сперматозоидов / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, И.А. Газиева // Омский научный вестник. - 2007. - № 3 (61).-С. 49-50.

13. Тарасова, М.Н. Содержание маркеров воспалительного процесса при нарушениях организации геномного материала сперматозоидов / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.А. Газиева, И.И. Ремизова // Иммунологические аспекты репродукции человека: материалы международной научно-практической конференции. - Новосибирск, 2008. - С. 50 - 51.

14. Тарасова, М.Н. Диагностика нарушений сперматогенеза при нормозо-оспермии у мужчин / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, И.А. Газиева // Российский иммунологический журнал. - 2008. - № 2-3, Т.2 (11).-С. 298.

15. Тарасова, М.Н. Современные диагностические подходы к оценке репродуктивной функции мужчин / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, И.А. Газиева // Вестник Уральской медицинской академической науки (материалы Международной научно-практической конференции «Репродуктивное здоровье населения Урала и Сибири»), - 2008. - № 2 (20).-С. 78-80.

16. Тарасова, М.Н. Критерий диагностики нарушений репродуктивной функции у мужчин с нормоспермией / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, И.А. Газиева // Клиническая лабораторная диагностика. -

2008. -№ 9. - С.6.

17. Тарасова, М.Н. К диагностике нарушений репродуктивной функции мужчин / М.Н. Тарасова, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, И.А. Газиева // Проблемы репродукции. - 2008. - №5. - С.52-55.

18. Тарасова, М.Н. Роль цитокинов в патогенезе мужского бесплодия / М.Н. Тарасова, Т.Н. Чистякова, И.А. Газиева, И.И. Ремизова. // Уральский медицинский журнал. - 2008. -№12. - С. 44-49.

ТАРАСОВА Марина Николаевна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НАРУШЕНИЯ СПЕРМАТОГЕНЕЗА У МУЖЧИН С БЕСПЛОДИЕМ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 28.11.2008г. Формат 60><84 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №. 8/2009. Отпечатано в типографии ГОУ ВПО УГМА Росздрава, г. Екатеринбург, ул. Репина, д.З.

В структуре бесплодного брака тенденция к росту мужского фактора и ухудшению качества спермы диктует необходимость пристального изучения существующей проблемы [6, 7,45, 71, 77, 78, 81].

Признанным интегральным критерием состояния мужской репродуктивной функции является исследование эякулята, включающее в себя оценку концентрации, подвижности и морфологии сперматозоида. Результаты исследования, рекомендованного ВОЗ, не всегда надежны т.к. фертильность бывает сохранена даже при значительных отклонениях показателей спермограммы от нормы, в то время как бесплодие может наблюдаться и у мужчин с нормоспермией [52, 67, 84].

В настоящее время одним из наиболее перспективных направлений в исследовании нарушений репродуктивной функции мужчин является изучение аномалий структурной организации хроматина мужских гамет, которые могут быть обусловлены эндогенными разрывами молекулы в процессе компактизации хроматина ядер сперматозоидов, инициацией процесса апоптоза в ходе сперматогенеза, окислительным стрессом в результате действия избыточной концентрации активных форм кислорода [28, 81, 86, 139]. Другим механизмом нарушения фертильности считается развитие аутоиммунных реакций против собственных сперматозоидов [31, 57].

Регуляция мужской репродуктивной функции является многоуровневой, с вовлечением не только эндокринной, но и других систем, в частности иммунной. Нормальное протекание процессов гаметогенеза обеспечивается взаимодействием большого количества клеток различного типа, которое осуществляется не только при непосредственных межклеточных контактах, но и за счет сложной системы цитокинов [44, 62].

На сегодняшний день отсутствует целостное представление о взаимодействии цитокиновых сигналов и процесса сперматогенеза. Ряд авторов придерживается точки зрения, что изменение уровня цитокинов ассоциируется не с эффективностью сперматогенеза, а, главным образом, с воспалительным процессом в мужском репродуктивном тракте, в других работах демонстрируется тесная корреляционная взаимосвязь уровня цитокинов с рутинными показателями спермограммы: концентрацией, подвижностью, морфологией [46, 62, 87, 95, 98].

Таким образом, определение роли иммунной системы в сперматогенезе является перспективной, так как появление новых знаний в этой области позволяет усовершенствовать диагностику и предложить новые методические подходы к анализу причин нарушения репродуктивной функции мужчины [31, 48].

Цель исследования: определить иммунологические факторы нарушения сперматогенеза у мужчин с бесплодием.

Задачи исследования

1. Выявить особенности структурной организации хроматина сперматозоидов у мужчин из супружеских пар с бесплодием.

2. Определить содержание цитокинов в сыворотке крови и эякуляте мужчин из бесплодных супружеских пар и здоровых фертильных мужчин.

3. Оценить взаимосвязь между иммунологическими параметрами и нарушением степени компактизации хроматина сперматозоидов мужчин из супружеских пар с бесплодием.

4. Разработать алгоритм обследования мужчин из числа бесплодных супружеских пар на основе наиболее информативных иммунологических показателей.

Научная новизна Определены особенности структурной организации хроматина половых клеток методом проточной цитометрии у мужчин из бесплодных супружеских пар. Установлено снижение степени компактизации хроматина сперматозоидов и повышение уровня дефектных клеток в эякуляте пациентов как при нормо-, так и при патоспермии.

Показано, что нарушение организации хроматина сперматозоидов сопровождается статистически значимым снижением концентрации ингибина В в сыворотке крови и повышением уровня антиспермальных антител в эякуляте.

Выявлена общая направленность ряда цитокиновых сигналов: повышение синтеза IL-ip, IL-8, TNF-a, IL-10 в спермальной плазме и возрастание концентрации IL-1RA и IL-8 в сыворотке крови, что позволяет дифференцировать пациентов из супружеских пар с бесплодием и фертильных мужчин.

Установлено, что у пациентов с нормоспермией при снижении степени компактизации хроматина сперматозоидов и/или повышении уровня дефектных клеток в эякуляте, наряду с выявленными общими признаками в продукции цитокинов, имеет место повышение концентраций IFN-y и TNF-a в сыворотке крови, а также концентрации CRP и ростового фактора TGF-(3 в спермоплазме.

Развитие патоспермии сопровождается усилением локальной продукции IL-2, IL-4 и IFN-y на фоне снижения концентрации IL-6.

Выявлены наиболее информативные показатели: степень компактизации хроматина сперматозоидов D/s, относительное содержание дефектных клеток HDS, концентрация ингибина В, на основании которых выведена формула определения диагностического индекса для оценки нарушений сперматогенеза у мужчин с нормоспермией, вошедшая в основу новой медицинской технологии (ФС № 208/248 от 19.11.2008).

Получен патент №2262107 на изобретение «Способ определения зрелости сперматозоидов» и приоритетная справка на изобретение «Способ диагностики мужского бесплодия» №2008115047.

Практическая значимость

Установлены наиболее информативные параметры для оценки нарушений сперматогенеза - степень компактизации хроматина сперматозоидов D/s, относительное содержание дефектных клеток HDS, концентрация ингибина В.

Разработан алгоритм лабораторного обследования пациентов из бесплодных супружеских пар при нормоспермии.

Использование разработанных критериев позволяет повысить эффективность диагностики нарушений мужского репродуктивного потенциала.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Нарушение организации хроматина сперматозоидов имеет место у пациентов из бесплодных супружеских пар не только при пато-, но и при нормоспермии.

2. Снижение концентрации ингибина В в сыворотке крови и повышение уровня антиспермальных антител у мужчин из супружеских пар с бесплодием сопровождается снижением степени компактизации хроматина сперматозоидов и повышением относительного количества дефектных клеток в эякуляте.

3. В зависимости от выраженности степени нарушений организации мужских половых клеток наблюдается изменение продукции цитокинов на локальном и системном уровнях.

4. Особенности структурной организации хроматина, содержание дефектных клеток в эякуляте и концентрация ингибина В в сыворотке крови могут служить дополнительными иммунологическими маркерами оценки репродуктивной функции мужчин.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий», научно-практических конференциях ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий» (2007-2008г.г.). Материалы диссертации представлены на III съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006г.); Республиканской научно-практической конференции «Инновационные технологии в охране репродуктивного здоровья женщины» (Екатеринбург, 2007г.), VI конференции иммунологов Урала (Ижевск, 2007г.), Международной научно-практической конференции «Репродуктивное здоровье населения Урала и Сибири» (Екатеринбург, 2008г.).

Публикации и внедрение

По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 6 публикаций в печатных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Результаты исследований, представленные в диссертации, внедрены в практику научной поликлиники ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий» г. Екатеринбурга; Центра семейной медицины г. Екатеринбурга; поликлиники «Ваш семейный доктор» г. Екатеринбурга; Свердловского областного центра планирования семьи и репродукции г. Екатеринбурга.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных сокращений и библиографического указателя, включающего 152 источника, в том числе 72 иностранных. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками.

выводы

1. Выявлено снижение степени компактизации хроматина сперматозоидов и повышение уровня дефектных клеток в эякуляте у большинства (70% случаев) пациентов из бесплодных супружеских пар при нормоспермии.

2. Нарушение организации хроматина сперматозоидов у мужчин из супружеских пар с бесплодием сопровождается статистически значимым снижением концентрации ингибина В в сыворотке крови и повышением уровня антиспермальных антител в эякуляте.

3. Установлено повышение синтеза IL-1J3, IL-8, TNF-a, IL-10 в спермоплазме и возрастание концентрации IL-1RA и IL-8 в сыворотке крови у мужчин из супружеских пар с бесплодием при нормо- и патоспермии.

4. При нарушении структурной организации сперматозоидов у пациентов с нормоспермией повышается концентрация IFN-y и TNF-a в сыворотке крови и концентрация CRP и TGF-P в спермоплазме. Патоспермия сопровождается усилением локальной продукции IL-2, IL-4 и IFN-y на фоне снижения концентрации IL-6.

5. Степень компактизации хроматина сперматозоидов, содержание дефектных клеток в эякуляте и концентрация ингибина В в сыворотке крови могут служить дополнительными иммунологическими маркерами, позволяющими повысить эффективность диагностики нарушений репродуктивной функции мужчин.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки риска развития нарушений сперматогенеза у мужчин из супружеских пар с бесплодным браком рекомендуется определение уровня IL-ip, IL-8, TNF-a, IL-10 в спермальной плазме и IL-1RA, IL-8 в сыворотке крови.

2. При диагностике мужского бесплодия рекомендуется включить в лабораторное обследование мужчин из супружеских пар с бесплодным браком следующие диагностические тесты: оценку зрелости сперматозоидов методом проточной цитометрии с определением показателя D/s, характеризующего степень компактизации хроматина сперматозоидов и относительного содержания дефектных клеток HDS и определение концентрации ингибина В в сыворотке крови методом ИФА.