Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Иммунологические аспекты клинической разнородности и лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ Александр Геннадьевич

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КЛИНИЧЕСКОЙ РАЗНОРОДНОСТИ И ЛЕЧЕНИЯ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ

14.00.16 - патофизиология 14.00.05 - внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□□3174134

Новосибирск - 2007

003174134

Работа выполнена в ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научные руководители:

заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Пальцев Александр Иванович Черных Елена Рэмовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, доцент

Сафронов Игорь Дмитриевич Волошина Наталья Борисовна

Ведущая организация ГОУ ВПО Новосибирский Государственный ¿Медицинский Университет Росздрава

Защита состоится «30» Oc^JLtM 2007 г в и4 часов на заседании диссертационного совета Д 001 048 01 при ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу ул Академика Тимакова, 2, г Новосибирск, 630117 Тел/факс 8(3832)33-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НЦКЭМ СО РАМН

Автореферат разослан «£3» секТЧ^Ц1 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Пальчикова Н А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Необходимость исследований патогенеза язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки связана с высокой распространенностью этой патологии, недостаточной изученностью вопросов этиологии, патогенеза язвенной болезни, развитием осложнений, которые приводят к временной, а иногда и стойкой утрате трудоспособности и даже летальным исходам (Комаров Ф И, 1990, Ивашкин В Т, 2006) Так, например, только в США ежегодно регистрируется более 500 ООО первичных случаев и около 4 миллионов рецидивов заболевания (Луняков А С , 1998) В настоящее время известно, что развитие гастродуоденальной патологии в целом и пептических язв, в частности, четко ассоциируется с инфекцией, вызванной грамотрицательной бактерией Helicobacter pylori По данным Marshall (1994) 70 % и 92 % больных соответственно с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки инфицированы Helicobacter pylori Схожие эпидемиологические данные получены и в исследованиях, проведенных в Западно-Сибирском регионе (Решетников О В , 2001)

Открытие инфекционного агента в качестве причинного фактора язвенной болезни позволило совершенно с новых позиций подойти к патогенезу данного заболевания, в частности, высветило важную роль иммунной системы в развитии и исходе язв При этом одним из новых направлений исследований стало изучение механизмов формирования адекватного иммунного ответа и их нарушений, как причины развития и хронизации инфекции и неблагоприятного течения язвенной болезни

Действительно, несмотря на высокую инфицированность населения Н pylori, у большинства людей отмечается бессимптомное носительство, и только в 10 % случаев хеликобактерная инфекция приводит к развитию язвенного дефекта (В Marshall, 1994) Именно поэтому высказывается предположение, что патогенное действие Н pylori на слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки во многом определяется дополнительными факторами, среди которых особое значение придается иммунным нарушениям Изменения в иммунной системе могут существовать исходно и являться «предрасполагающим» фоном для клинического проявления инфекции Кроме того, иммунные дисфункции на фоне хронического течения инфекции, могут быть результатом как патогенного действия самого Н pylori, так и индуцированного бактерией воспалительного процесса

Несмотря на интенсивные исследования особенностей функционирования иммунной системы при индуцированной Н pylori инфекции, в имму-нопатогенезе язвенной болезни остается еще много нерешенных вопросов До настоящего времени не ясно, какие иммунологические дефекты на местном и системном уровнях приводят к ослаблению контроля над хелико-бактерной инфекцией и способствуют последующему язвообразованию

Показано, что при язвенной болезни и ее рецидивах выявляется снижение количества и функциональной активности лимфоидных клеток (Мягкова Л П, 1991, Луняков А С 1998, Циммерман Я С , 2000) Однако показатели иммунитета у больных язвенной болезнью характеризуются крайней неоднородностью При этом до сих пор не выявлено четких ассоциаций определенных параметров иммунитета с клиническими особенностями заболевания, что естественно затрудняет осмысление патогенетической значимости иммунной системы в ульцерогенезе Наконец, еще один важный аспект заключается в том, что поскольку при хеликобактерной инфекции наблюдается неадекватный иммунный ответ, методы иммунокоррекции должны быть неотъемлемой составляющей частью патогенетической терапии заболеваний желудочно-кишечного тракта, вызванных Н pylon Однако иммунотерапевтические подходы к лечению язвенной болезни и гастро-дуоденитов хеликобактерной этиологии разработаны недостаточно

Цель исследования. Исследование клеточно-молекулярных механизмов нарушения иммунитета при язвенной болезни для изучения взаимосвязи иммунологических и клинических параметров и оптимизации терапии

Задачи исследования:

1 Изучить взаимосвязь состояния иммунитета с особенностями клинического течения у пациентов с язвенной болезнью

2 Оценить показатели апоптоза и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью

3 Исследовать биологическую активность, спонтанную и индуцированную продукцию про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке и цельной крови у лиц с язвенной болезнью

4 Оценить влияние цитокин-с о держащих препаратов на функциональную реактивность Т-клеток больных язвенной болезнью, клиническое течение, частоту осложнений и рецидивирования

Научная новизна работы. Впервые выявлено, что у пациентов с обострением язвенной болезни выявляется усиление спонтанного апоптоза лимфоцитов и активационного апоптоза Т-клеток Программированная гибель циркулирующих лимфоцитов у больных является одним из механизмов иммуносупрессии, поскольку ассоциирована с угнетением пролифера-тивной активности Т-лимфоцитов и снижением количества лимфоцитов в периферической крови При этом выявлена взаимосвязь между усилением апоптоза и неблагоприятным характером течения заболевания

Установлено, что нарушение функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью ассоциировано с изменением продукции Thl/провоспалительных и ТЬ2/противовоспалительных цитокинов В частности, впервые выявлено снижение уровня Thl и Th2 цитокинов в сыворотке крови и уровня их спонтанной продукции в культурах клеток цель-

ной крови, что является еще одним подтверждением нарушения функциональной активности Т-клеток С другой стороны, у исследуемых пациентов обнаружен повышенный уровень липополисахарид-индуцированной продукции IL-10, что сопровождается резким снижением индекса соотношения TNF-a/IL-10, характеризующего баланс про- и противовоспалительных цитокинов

Впервые изучены эффекты комплексного цитокин-содержащего препарата спленопид in vitro и in vivo у больных язвенной болезнью В результате экспериментально обоснована целесообразность применения препарата спленопид для коррекции иммунных дисфункций при язвенной болезни Показано, что применение спленопида в подгруппе больных с лабораторно подтвержденным снижением Т-клеточной реактивности оказывает заметный иммунокорригирующий эффект, который проявлялся 2-кратным усилением уровня пролиферации Т-клеток Кроме того, впервые установлено, что применение спленопида в комплексном лечении язвенной болезни оказывает иммуномодулирующий эффект на продукцию цитокинов и приводит к более быстрому купированию болевого синдрома и удлинению продолжительности ремиссии

Полученные данные о наличии иммунных дисфункций при язвенной болезни, сопряженности их с тяжестью заболевания, возможности коррекции нарушений иммунитета с помощью цитокинов и достижения при этом клинического эффекта в целом свидетельствуют о значимости иммунных нарушений в патогенезе язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки у пациентов с хеликобактерной инфекцией

Научно-практическая значимость работы. Выявленное развитие вторичной иммунной недостаточности у пациентов с длительным и осложненным течением язвенной болезни свидетельствует о необходимости проведения иммунокорригирующей терапии

Эффективность применения спленопида позволяет рекомендовать его для включения в схему лечения больных с длительным и тяжелым течением заболевания при наличии лабораторного подтверждения дисбаланса системного иммунного ответа

Показано, что применение цитокинотерапии фармакоэкономически оправданно, так как позволяет увеличить продолжительность безрецидивного периода

Внедрение результатов в практику. Полученные результаты исследования внедрены в лекционный курс для ординаторов и аспирантов ГУ НЦКЭМ СО РАМН, а также в практику работы клиники ГУ НЦКЭМ СО РАМН, Окружного военного госпиталя № 333

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 6-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург -

Гастро-2004» (Санкт-Петербург, 2004), на 5-ой Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием (Красноярск, 2005)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, 3 из которых в журналах, включенных в список периодических научных изданий, рекомендованных ВАК РФ для опубликования материалов кандидатских диссертаций

Положения, выносимые на защиту:

1 В патогенезе язвенной болезни большое значение имеет усиление апоптоза циркулирующих мононуклеарных клеток, а также выраженный сдвиг цитокинового баланса в сторону провоспалительных медиаторов (IFN-y, TNF-a) на местном и системном уровне Уровень IL-10 значительно повышается

2 У больных с длительным и осложненным течением заболевания выявлена взаимосвязь между функциональной недостаточностью Т-клеток иммунной системы и клинической картиной болезни

3 Включение в комплекс терапевтических мероприятий Спленопида позволяет ускорить процесс рубцевания язвенного дефекта, быстрее купировать болевой синдром и увеличить продолжительность ремиссии у пациентов

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы, состоящего из 71 работы отечественных и 117 иностранных авторов Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 23 таблицами

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая характеристика больных

Под нашим наблюдением находилось 55 больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, проходивших лечение в стационаре по поводу обострения заболевания Группа обследованных пациентов включала 74,5 % мужчин (41/55) и 25,5 % женщин (14/55) в возрасте от 16 до 81 лет (средний возраст 38 ± 6 лет) У 73 % язвенный дефект был локализован в области двенадцатиперстной кишки, тогда как язвенная болезнь желудка была диагностирована у 27 % пациентов В сформированной группе у 22 человек (40 %) язвенная болезнь была впервые выявлена, у оставшихся 33 (60 % случаев) заболевание имело хронический характер У 47 пациентов был выявлен Н pylon В 29 % случаев (16/55 больных) отмечалось осложненное течение язвенной болезни, сопровождавшееся развитием кровотечения (п = 10), перфорации (п = 2) или длительно не рубцующегося язвенного дефекта (п = 4)

Обследование всех пациентов проводилось при получении информированного согласия Комплексное лечение больных включало курс стандартной эрадикационной трехкомпонентной терапии (омепразол 40 мг/сут, амоксициллин 2 г/сут, метронидазол 1,5 г/сут или фуразолидон 400 мг/сут -7 дней) либо монотерапии ингибитором протонной помпы (омепразол 40 мг/сут) Контрольную группу составили 60 здоровых, сопоставимых по полу и возрасту доноров крови

Методы клинического исследования

Всем больным проводилось клиническое обследование в соответствии с медико-экономическим стандартом эзофагогастродуоденоскопия с оценкой изменений в слизистой оболочке и выявлением язвенных дефектов, прицельная биопсия слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки, выявление хеликобактерной инфекции в полученных биоптатах при помощи быстрого уреазного теста, рентгеноскопическое и рентгенологическое исследование желудка с бариевой взвесью Диспансерное наблюдение через 6 мес после лечения, включавшее анкетирование пациентов для оценки продолжительности периода ремиссии

На всех пациентов заполнялась специально разработанная нами анкета В НИИ Трансплантологии и Искусственных органов в 1996 году на основе спленоперфузата разработан новый иммуномодулятор сплено-пид (Splenopid) Per № р№ 001938/01-2002 Состав пептидная фракция, выделенная из ткани селезенки свиней Содержит IL-1, IL-2, ylFN, TNFa, GMCSF Фармакологическая группа иммуномодулятор Производитель НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗСР РФ Это послужило патогенетической основой включения спленопида в схему лечения ЯБ

Для оценки эффективности иммунотерапии с использованием препарата спленопид нами были проведены пилотные клинические исследования В исследование включались лица обоего пола в возрасте от 18 до 64 лет, с длительным (более 1 года) и часто рецидивирующим течением язвенной болезни желудка или двенадцатиперстной кишки в стадии обострения Критериями исключения являлись наличие сопутствующей аутоиммунной патологии, аллергические реакции на чужеродный белок в анамнезе, спле-нэктомия в анамнезе, прием иммуномодулирующих препаратов в течение 1 мес перед включением больного в исследование

С учетом критериев включения/исключения для клинического исследования были отобраны 21 человек (14 мужчин и 7 женщин, средний возраст 49 лет), которым проводилось комплексное лечение в условиях стационара по поводу обострения язвенной болезни желудка (п = 9) или 12-перстной кишки (п = 12) У всех пациентов была выявлена инвазия Helicobacter pylori Стандартное клиническое обследование больных было дополнено

2-кратным (до и через 10-14 дней от начала лечения) исследованием показателей иммунного и цитокинового статуса

Комплексное лечение больных, включенных в клиническое исследование, состояло из стандартной эрадикационной и антисекреторной терапии, дополненной внутримышечным введением Спленопида (140 мг, 1 р/день, в первые 4 дня)

При оценке эффективности предложенной схемы терапии оценивалось время купирования болевого синдрома, а также сроки рубцевания язвенного дефекта по данным контрольного ФГС-обследования, частота развития осложнений язвенной болезни и продолжительность ремиссии

Работы по протоколу проводились бесплатно для всех больных и с их информированного согласия

Исследования показателей имунной системы

Иммунологическое обследование больных осуществлялось совместно с сотрудниками лаборатории клеточной иммунотерапии ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН (руководитель лаборатории д м н, профессор Е Р Черных)

Из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяли стандартными методами лейковзвесь, сыворотку, мононуклеарные клетки (МНК) Проводилось определение интенсивности спонтанной и индуцированной пролиферации, рассчитывали индекс влияния (ИВк0на или НВ.,ПТ„ ( di), который представлял собой отношение уровня пролиферативного ответа клеток в стимулированных культурах к уровню спонтанной пролиферации

Уровень апоптоза оценивали среди свежевыделенных клеток лейков-звеси (апоптоз лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов), а также среди лимфоцитов, культивированных in vitro в течение 24 ч в безмитогенной среде (спонтанный апоптоз) или при стимуляции конканавалиномА (КонА) (активационно-индуцированный апоптоз) Относительное содержание апоптотических клеток определяли методом проточной цитофлуори-метрии по окрашиванию пропидиумом иодидом Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный ги-подиплоидный пик Содержание в сыворотке, а также в супернатантах цельной крови 9 цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, GM-CSF) оценивали методом проточной флюориметрии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США)

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 5 0» Таблицы и рисунки содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (SE), медианных зна-

чений, а также в отдельных случаях представлены диапазоны минимальных и максимальных значений Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического и критерия Манна-Уитни Достоверность различия частоты встречаемости признака определяли, используя точный критерий Фишера (Ртмф) Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмана

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование состояния иммунитета, выполненное в группе 27 больных ЯБ до проведения эрадикационной терапии показало, что развитие язв сопряжено с усилением апоптоза лимфоцитов и снижением их пролифера-тивной активности По сравнению со здоровыми донорами у больных отмечалось статистически достоверное увеличение процентного содержания апоптотических лимфоцитов в культурах интактных (нестимулированных) и КонА-активированных МНК

Был проведен сравнительный анализ больных, оппозитных по величине апоптоза лимфоцитов В первую подгруппу были выделены пациенты (п =16), у которых значения апоптоза сохранялись в пределах нормы (210 %) Во вторую подгруппу вошли 11 пациентов с высокими значениями апоптоза лимфоцитов (>10 %)

Значимость иммунных дисфункций в патогенезе язвенной болезни подтверждается результатами сравнительного анализа клинических особенностей заболевания у больных из разных подгрупп (таблица 1)

Таблица 1

Клинические особенности язвенной болезни в подгруппах больных оппозитных по уровню апоптоза лимфоцитов и выраженности иммунных

нарушений

Подгруппы больных ЯБ

Характеристика больных Подгруппа № 1 (п = 16) Подгруппа № 2 (п=11)

Поп (мужчины/женщины) (%) 81/19 73/27

Возраст (лет) 34 ±3 (17-56) 35 + 5 (17-67)

Локализация язвенных дефектов Двенадцатиперстная кишка (%) Желудок (%) 75 25 73 27

Доля больных с длительным течением ЯБ (%) 50 73

Доля больных с тяжелым, осложненным течением ЯБ (%) 31 45,5

Нами было установлено, что высокий уровень апоптоза циркулирующих лимфоцитов и ассоциированные с ним иммунные дисфункции встречаются в 1,5 раза чаще у больных с длительным и осложненным течением заболевания

Оценка содержания цитокинов в сыворотке крови больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки и здоровых доноров показала, что по сравнению со здоровыми донорами в целом по группе больных концентрация большинства исследуемых цитокинов находится ниже границы чувствительности используемого метода У пациентов с Ж в фазе обострения в 62,5 % случаев был выявлен высокий уровень ТОТ-а

Анализ содержания цитокинов в 24-часовых супернатантах цельной крови больных язвенной болезнью, обследованных до начала терапии, показал, что по сравнению со здоровыми донорами в группе больных регистрируется критически низкий уровень спонтанной продукции 1Ь-2, 1Ь-12, 1Ь-4, 1Ь-13, ОМ-СЗБ Исключением являлись только ТИБ-а и 1Ь-10, первый из которых спонтанно продуцировался в количествах, сопоставимых с нормативными значениями, а второй - в значимо больших концентрациях (ри < 0,01) (таблица 2)

Таблица 2

Сравнительная оценка уровня спонтанной и ЛПС-стимулнрованной продукции цитокинов в цельной крови здоровых доноров и больных ЯБ

Цитокины Цитокины в цельной крови (пкг/мл)

0 ЛПС (10 мкг/л)

Доноры (п = 11) Больные (п = 21) Доноры (п=11) Больные (п = 21)

18,4+4,7 2,1+0,4** 177 + 15,5 260 ±55

1Ь2 3,6 ±1,5 2,0 ± 0,7 * 9,0 ± 1,9 18 ±4,7

"ШБ-а 19,2 + 4,9 22,5 ±4,5 1494 ±251 3026 ± 739

1Ы2 (р70) 3,2 ±0,6 1,4 + 0,2** 8,2 ± 1,2 10,5 ± 3,9

1Ь4 5,6 ±0,8 0,85 ± 0,07 ** 13,9 ± 1,0 12,0 ±2,9

1Ь5 1,0 + 0,05 0,5 ±0,03 ** 1,1 ±0,07 1,0 ±0,07

ПЛО 1,7 ±0,2 7,5 ± 1,6 ** 92 ±62 1220 ±227 **

1ЫЗ 6,9 ± 1,8 1,0 ±0,12 ** 9,8 ± 1,6 3,4 + 0,6 **

ОМ-СЭР 30,8+7,8 3,5 + 0,3 ** 112+12,6 29,0 + 6,7 **

Примечание * р<0,05 ** р<0,01 - достоверность различия уровня спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции цитокинов в группе больных по сравнению с донорами (С-критерий Мана-Уитни)

Достоверно высокий уровень 1Ь-10 обнаруживался в спонтанных культурах и еще больше увеличивался в ответ на стимуляцию бактериальным эндотоксином (таблица 2) Выявлен выраженный дисбаланс в системе про-и противовоспалительных цитокинов, что подтверждено 3-хкратным снижением индекса соотношения ТОТ-аЛЬ-Шв культурах интактных нестимулированных клеток крови больных ЯБ (таблица 3)

Таблица 3

Индексы соотношения Т111/ТЬ2 и про-/противовоспалительных цитокинов,

продуцируемых в спонтанных и ЛПС-стимулнрованных культурах цельной крови здоровых доноров (п = 11) и больных ЯБ (п = 21)

Индексы Стимул Группы М + в Е МесЪап Мт - тах

ЮТ-аЯЬ-Ю 0 Доноры 11,0 ±2,7 7,4 2,8-33

Больные 3,4 ±0,6 ** 2,5 0,1-12,2

лпс Доноры 149 ± 64 74 2,0-660

Больные 2,8 ±0,6 ** 1,9 0,2-12,8

1Ш-у/1Ь4 0 Доноры 3,4 ±0,7 2,6 0,9 - 7,4

Больные 5,1 ±2,2 1,6 1,0-43,6

лпс Доноры 12,9 ± 0,7 13,2 9,3-17

Больные 55 + 27 ** 21,0 7,2 - 568

Примечание ** р<0,01 - достоверность различия показателей по сравнению с донорами (и-критерий Мана-Уитни)

Проведенные исследования показали, что угнетение пролиферативной активности Т-клеток у больных в период обострения язвенной болезни ассоциируется с более выраженным дисбалансом ТЫ/провоспалительных и ТЬ2/противовоспалительных цитокинов

Результаты иммунологического обследования продемонстрировали целесообразность включения в комплекс терапевтических мероприятий, проводимый у больных ЯБ, иммунотропных препаратов с целью своевременной коррекции иммунных нарушений Патогенетически обоснованным подходом в этом случае является использование спленопида

В рамках клинических исследований у 21 больного курс стандартной эрадикационной (антисекреторной) терапии был дополнен введением спленопида (в/м, по 140 мг, 1 р/день, в первые 4 дня) Иммунологическое обследование этих больных проводилось в динамике терапии, т е до и через 10-14 дней от начала лечения

Рубцевание язвенного дефекта было достигнуто в 82 % случаев (28 из 34) в группе стандартной терапии и в 95 % (20 больных из 21) на фоне лечения, дополненного спленопидом (ри = 0,016)

Достоверные отличия получены при оценке скорости купирования болевого синдрома В группе больных, получавших спленопид, боли купированы на 3,0 ±0,1 день лечения, в группе стандартной терапии - на 7,0±0,2

(ри< 0,001)

Несмотря на то, что в группу пациентов, получавших спленопид, были включены пациенты с длительным и тяжелым течением заболевания, развития осложнений ЯБ у них не отмечалось Все указанные выше осложнения развились у пациентов, получавших стандартную терапию

Восстановление баланса про- и противовоспалительных цитокинов позволило значительно увеличить период ремиссии у больных, получавших цитокинотерапию В среднем безрецидивный период у таких пациентов продолжался 8,1 ±0,2 месяцев, по сравнению с 5,9 ±0,2 месяцев без цито-кинотерапии (рц < 0,001)

Дополнительно была проведена серия экспериментов по изучению влияния гЫЬ-2 (ронколейкина) на уровень пролиферации Т-клеток больных ЯБ в анти-СОЗ-стимулированных культурах Добавление в культуры МНК больных ЯБ гЫЬ-2 в оптимальной дозе (100МЕ/мл) не оказывало заметного влияния на уровень анти-СОЗ-индуцированного ответа Т-клеток (таблица 4)

Таблица 4

Влияние rhIL-2 (Ронколейкина) на функциональную реактивность Т-клеток больных ЯБ в культуре in vitro

Группы больных Анти-СБЗ, рассч ед Анти-СВЗ + IL-2, рассч ед

В целом по группе п = 21 Анергии Т-клеток НЕТ п = 14 Анергия Т-клеток ЕСТЬ п = 7 24770 + 2750 30850 + 3120 12110 ±1310 23370 + 2290 27790 + 2600 13140±1580

Для оценки влияния Спленопида на функциональную реактивность Т-клеток в клинических условиях, мы исследовали уровень анти-СБЗ-стимулированной пролиферации в культурах МНК больных ЯБ в динамике проводимой комплексной терапии, т е до и через 10-14 дней после курса цитокинотерапии Спленопидом

В подгруппе больных (п = 7) с лабораторно подтвержденной Т-клеточной ареактивностью комплексное лечение с использованием Спленопида оказывало заметный иммунокорригирующий эффект на функциональную реактивность Т-клеток В 100 % случаев у больных при повторном обследовании обнаруживалось усиление анти-СОЗ-индуцированного пролиферативного ответа, что в целом по группе сопровождалось 2-кратным увеличением уровня пролиферации Т-клеток (с 12110 + 1310 до 26940 ± 3700 имп/мин, ри < 0,01) Важно отметить, что у всех обследован-

ных больных индивидуальные значения CD3-стимулированной пролиферации превышали 16000 имп/мин принятого в качестве пограничного уровня, позволяющего диагностировать развитие феномена Т-клеточной анергии При этом у 3 из 7 больных (в 43 % случаев) к сроку контрольного иммунологического обследования отмечалось полное восстановление функциональной реактивности Т-клеток, пролиферативный ответ которых достигал среднего уровня здоровых доноров (34720 ± 1950 имп/мин)

Таким образом, оценка уровня пролиферативного ответа Т-клеток у больных ЯБ в динамике комплексного лечения свидетельствует о том, что препарат Спленопид, используемый по разработанному протоколу, характеризуется отчетливым иммунокорригирующим эффектом и восстанавливает функциональную реактивность Т-клеток не только в культуре in vitro, но также и в условиях in vivo при его клиническом применении

Модулирующий эффект Спленопида отчетливо проявлялся у 12 из 16 пациентов (т е в 75 % случаев) При этом у части больных (8/12, подгруппа 1) на фоне комплексной терапии происходило снижение и нормализация исходно высокого уровня продукции TNF-a в ЛПС-стимулированных культурах, тогда как у 4 из 12 пациентов (подгруппа 2) - увеличение и нормализация исходно низкого уровня TNF-a

Следует отметить, что вследствие иммунокорригирующего влияния Спленопида на характер продукции IL-10 и TNF-a у 9 из 16 больных ЯБ (в 56,2 % случаев) после проведенного курса комплексной терапии в 2,6 раза увеличился индекс соотношения TNF-o/IL-IOb среднем с 3,3 ± 0,7 (Median = = 3,1) до 9,0 ±0,7 (Median = 8,0)расч ед

Нами показано, что использование Спленопида позволило в 75 % случаев эффективно модулировать продукцию TNF-a - либо снижая исходно высокий уровень его стимулированной секреции до диапазона нормативных значений, либо повышая и нормализуя исходно низкий, недостаточный уровень его продукции Очень важно, что при этом в 50 % случаев отмечалась также и нормализация/снижение продукции IL-10, которая до начала иммунотерапии Спленопидом у подавляющего большинства больных ЯБ находилась на критически высоком уровне, что, является одним из механизмов развития иммунных дисфункций в период обострения ЯБ Особенно ярко это проявлялось в группе больных с Т-клеточной ареактивностью, где корригирующий эффект Спленопида на продукцию TNF-a и/или IL-10 выявлялся в 86,7 % случаев

В результате иммуномодулирующего действия Спленопида на характер продукции TNF-a и IL-10y больных ЯБ в динамике проводимой терапии менялся баланс про- и противовоспалительных цитокинов У 56,2 % пациентов, которым назначался Спленопид, регистрировалась отчетливая тенденция к увеличению индекса соотношения TNF-a/IL-10 Такие ранние

сдвиги цитокинового баланса, происходившие на фоне иммунотерапии Спленопидом, четко ассоциировались с восстановлением функциональной (пролиферативной) реактивности Т-лимфоцитов у больных с документированной Т-клеточной анергией

В наших исследованиях показано, что у трети обследованных больных наблюдалось выраженное угнетение пролиферации Т-клеток при стимуляции антиСОЗ антителами Поэтому особый интерес представляло выяснение вопроса, имеется ли связь между угнетением пролиферативной активности Т-клеток и цитокиновым дисбалансом и можно ли коригировать состояние функциональной аре акт ив ноет и Т-клеток с помощью цитокинсо-держащих препаратов Полученные результаты исследований показали, что угнетение пролиферации Т-клеток было сопряжено со снижением продукции TNF-a и индекса соотношения IFN-y/IL-4 в нестимулированных культурах При этом интенсивность антиСОЗ-стимулированной пролиферации обратно коррелировала с уровнем IL-10 и IL-4, что явно указывало на важную роль 1Ъ2/противовоспалительных цитокинов в угнетении Т-кле-точного ответа Добавление в культуры ш vitro rhIL-2 (ронколейкина) не восстанавливало ответ у больных с функциональной реактивностью Т-клеток Добавление в культуру in vitro комплексного цитокинсодержащего препарата Спленопид достоверно повышало уровень пролиферации Т-клеток у больных ЯБ Причем наиболее выраженный эффект регистрировался в группе пациентов с Т-клеточной ареактивностью Усиление пролиферации было сопряжено с изменением продукции цитокинов Спленопид усиливал уровень спонтанной продукции TNF-a и в то же время ингибировал уровень индуцированной продукции TNF-a в среднем на 25 %, оказывая, таким образом, иммуномодулирующий эффект Действие Спленопида воспроизводилось также при его использовании in vivo Так, проведенные нами клинические испытания Спленопида в комплексном лечении больных язвенной болезнью показали, что назначение препарата уже через 10-14 дней приводило к усилению пролиферативной реактивности лимфоцитов у больных ЯБ с угнетением Т-клеточного ответа Оценка продукции цитокинов на фоне применения спленопида выявила его иммуномодулирующий эффект на продукцию TNF-a и IL-10

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о развитии иммунных дисфункций циркулирующих Т-лимфоцитов и возможности их коррекции с использованием препарата Спленопид

выводы

1 У больных с длительным и осложненным течением язвенной болезни в 1,5 раза чаще наблюдается усиление апоптоза циркулирующих лимфоцитов и ассоциированные с ним иммунные дисфункции

2 Дефицит ТЫ- и Т112/противовоспалительных цитокинов в сыворотке и снижение уровня их спонтанной продукции в культурах клеток цельной крови свидетельствует об угнетении функций Т-хелперных клеток при обострении язвенной болезни

3 Нарушение функциональной активности Т-хелперных клеток у больных ЯБ сопряжено с дисбалансом про- и противовоспалительных цитокинов, поскольку снижение продукции ТЬ1/ТЬ2 цитокинов (ПТЧ-у, 1Ь-2, 1Ь-4) в культурах клеток цельной крови происходит на фоне значительного усиления ЛПС-индуцированной продукции 1Ь-10 и снижения индекса соотношения Т№-а/1Ь-10

4 Характерной особенностью продукции цитокинов у больных с Т-кле-точной ареактивностью является снижение продукции Т№-а и изменения индекса соотношения 1РМ-у/1Ь-4 в нестимулированных культурах

5 Применение Спленопида в комплексном лечении больных ЯБ характеризуется усилением пролиферативной активности Т-клеток, модуляцией у 75 % больных продукции Т№-а и снижением у 50 % больных исходно высокого уровня продукции 1Ь-10, что сопровождается более быстрым купированием болевого синдрома и позволяет увеличить продолжительность безрецидивного периода

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При обследовании пациентов с обострением ЯБ целесообразно использовать методики оценки иммунитета с целью определения степени иммунокомпроментации, что позволяет прогнозировать возможность развития осложнений и сроки рецидивирования

2 Включение в комплекс лечебных мероприятий при обострении ЯБ цитокинов позволяет быстрее купировать болевой синдром и увеличить продолжительность безрецидивного периода

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Пальцев А И Иммунологические нарушения при обострении язвенной болезни / А И Пальцев, Е Р Черных, А Г Лебедев // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга - 2004 - № 2-3 - С 109

Пальцев А И Иммунные дисфункции при длительном и осложненном течении язвенной болезни / А И Пальцев, Е Р Черных, А Г Лебедев //

Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения / Материалы 5-ой Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием - Красноярск, 2005 - С 158

2 Клинико-иммунологические характеристики впервые выявленной и длительно текущей язвенной болезни / А И Пальцев, А А Останин, Е Р Черных, А Г Лебедев, Е И Мигуськина // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология -2004 -№ 1 —С 171

3 Пальцев А И Нарушения иммунорегуляции при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки / А И Пальцев, Е Р Черных, А Г Лебедев // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология -2005 -№ 5 -С 34-38

4 Характеристика апоптоза и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью / А И Пальцев, А А Останин, Е Р Черных, С Д Никонов, А В Васильченков, А Г Лебедев // Бюллетень СО РАМН -2004 -№ 1 -С 129-134

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

икк

ивКонА

ИВА

ИСА

КонА

ЛПС

МНК

ЯБ, ЯБЖ, ЯБДПК

Anti-CD3 CD

HLA-DR

Hp

NK-клетки IL-lß, IL-2, и др IFN-y

G-CSF, GM-CSF

TNF-а

ThO, Thl и Th2

Иммунокомпетентные клетки

Индекс влияния КонА

Индекс воспалительной активности

Индекс супрессорной активности

Конканавалин А

Липополисахарид Е coli

Мононуклеарные клетки

Язвенная болезнь, язвенная болезнь желудка,

язвенная болезнь 12-перстной кишки

Моноклональные anra-CD3 антитела Кластер дифференцировки

DR антигены главного комплекса гистосовместимости

Helicobacter pylon

Натуральные киллерные клетки

Интерлейкин-lß, интер-1ейкин-2 и др

Интерферон- у

Гранулоцит арный

и гранулоцитарно-макрофагальный

колониестимулируюшие факторы

Фактор некроза опухолей-а

Субпопуляции Т-хелперных клеток

Соискатель

i}к/ Лебедев А Г

Подписано в печать 26 09 07 г Формат 60 х 84/16 Уел печ л 1,0 Тираж 120 экз Изд №40п/07 Заказ № 305п

Оригинал-макет изготовлен издательством «Сибмедиздат» НГМУ г Новосибирск, ул Залесского, 4 Тел (383)225-24-29 E-mail sibmedisdat@rambler ru

Отпечатано в типографии НГМУ г Новосибирск, ул Залесского, 4 Тел (383) 225-24-29

Актуальность темы.

Необходимость исследований патогенеза язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (ЯБ) связана с высокой распространенностью этой патологии, недостаточной изученностью вопросов этиологии, патогенеза ЯБ, развитием осложнений, которые приводят к временной, а иногда и стойкой утрате трудоспособности и даже летальным исходам [23, 28, 158]. Так, например, только в США ежегодно регистрируется более 500 ООО первичных случаев и около 4 миллионов рецидивов ЯБ [36].

В настоящее время известно, что развитие гастродуоденальной патологии в целом и пептических язв, в частности, четко ассоциируется с инфекцией, вызванной грамотрицательной бактерией Helicobacter pylori [139, 160]. По данным Marshall 70% и 92% больных соответственно с язвенной болезнью желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) инфицированы Helicobacter pylori (Hp) [139]. Схожие эпидемиологические данные получены и в исследованиях, проведенных в Западно-Сибирском регионе [158].

Открытие инфекционного агента в качестве причинного фактора ЯБ позволило совершенно с новых позиций подойти к патогенезу данного заболевания, в частности высветило важную роль иммунной системы в развитии и исходе ЯБ. При этом одним из новых направлений исследований стало изучение механизмов формирования адекватного иммунного ответа и их нарушений, как причины развития и хронизации инфекции и неблагоприятного течения ЯБ [153].

Действительно, несмотря на высокую инфицированность населения Н. pylori, у большинства людей отмечается бессимптомное носительство, и только в 10% случаев хеликобактерная инфекция приводит к развитию язвенного дефекта [139]. Именно поэтому высказывается предположение, что патогенное действие Н.ру1оп на слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки во многом определяется дополнительными факторами, среди которых особое значение придается иммунным нарушениям. Изменения в иммунной системе могут существовать исходно и являться «предрасполагающим» фоном для клинического проявления инфекции. Кроме того, иммунные дисфункции на фоне хронического течения инфекции, могут быть результатом как патогенного действия самого Н.ру1оп, так и индуцированного бактерией воспалительного процесса.

Несмотря на интенсивные исследования особенностей функционирования иммунной системы при индуцированной Н.ру1оп-инфекции, в иммунопатогенезе язвенной болезни остается еще много нерешенных вопросов. До настоящего времени не ясно, какие иммунологические дефекты на местном и системном уровнях приводят к ослаблению контроля над хеликобактерной инфекцией и способствуют последующему язвообразованию. Исследователями показано, что при ЯБ и ее рецидивах выявляется снижение количества и функциональной активности лимфоидных клеток [28, 36, 37, 39, 40, 49]. Однако показатели иммунитета у больных ЯБ характеризуются крайней неоднородностью. При этом до сих пор не выявлено четких ассоциаций определенных параметров иммунитета с клиническими особенностями заболевания, что естественно затрудняет осмысление патогенетической значимости иммунной системы в ульцерогенезе.

Наконец, еще один важный аспект заключается в том, что поскольку при хеликобактерной инфекции наблюдается неадекватный иммунный ответ, методы иммунокоррекции должны быть неотъемлемой составляющей патогенетической терапии заболеваний ЖКТ, вызванных Н.ру1оп. Однако иммунотерапевтические подходы к лечению ЯБ и гастродуоденитов хеликобактерной этиологии разработаны недостаточно.

Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель исследования:

Цель исследования.

Исследование клеточно-молекулярных механизмов нарушения иммунитета при язвенной болезни для изучения взаимосвязи иммунологических и клинических параметров и оптимизации терапии. Задачи исследования:

1. Изучить взаимосвязь состояния иммунитета с особенностями клинического течения у пациентов с язвенной болезнью.

2. Оценить показатели апоптоза и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью.

3. Исследовать биологическую активность, спонтанную и индуцированную продукцию про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке и цельной крови у лиц с язвенной болезнью.

4. Оценить влияние цитокин-содержащих препаратов на функциональную реактивность Т-клеток больных язвенной болезнью, клиническое течение, частоту осложнений и рецидивирования.

Научная новизна. Впервые выявлено, что у пациентов с обострением ЯБ выявляется усиление спонтанного апоптоза лимфоцитов и активационного апоптоза Т-клеток. Программированная гибель циркулирующих лимфоцитов у больных ЯБ является одним из механизмов иммуносупрессии, поскольку ассоциирована с угнетением пролиферативной активности Т-лимфоцитов и снижением количества лимфоцитов в периферической крови. При этом выявлена взаимосвязь между усилением апоптоза и неблагоприятным характером течения заболевания.

Установлено, что нарушение функциональной активности лимфоцитов у больных ЯБ ассоциировано с изменением продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. В частности, впервые выявлено снижение уровня ТЫ и ТЪ2 цитокинов в сыворотке крови и уровня их спонтанной продукции в культурах клеток цельной крови, что является еще одним подтверждением нарушения функциональной активности Т-клеток. С другой стороны, у больных ЯБ обнаружен повышенный уровень ЛПС-стимулированной продукции IL-10, что сопровождается резким снижением индекса соотношения TNF-a/IL-10, характеризующего баланс про- и противовоспалительных цитокинов.

Впервые изучены эффекты комплексного цитокин-содержащего препарата Спленопид in vitro и in vivo у больных ЯБ. В результате экспериментально обоснована целесообразность применения препарата Спленопид для коррекции иммунных дисфункций при ЯБ. Показано, что применение Спленопида в подгруппе больных с лабораторно подтвержденной Т-клеточной ареактивностью оказывает заметный иммунокорригирующий эффект, который проявлялся 2-кратным усилением уровня пролиферации Т-клеток. Кроме того, впервые установлено, что применение Спленопида в комплексном лечении ЯБ оказывает иммуномодулирующий эффект на продукцию цитокинов и приводит к более быстрому купированию болевого синдрома и удлинению продолжительности ремиссии.

Полученные данные о наличии иммунных дисфункций при ЯБ, сопряженности их с тяжестью заболевания, возможности коррекции нарушений иммунитета с помощью цитокинов и достижения при этом клинического эффекта в целом свидетельствуют о значимости иммунных нарушений в патогенезе язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки у пациентов с хеликобактерной инфекцией.

Практическая значимость. Выявленное развитие вторичной иммунной недостаточности у пациентов с длительным и осложненным течением ЯБ свидетельствует о необходимости проведения иммунокорригирующей терапии.

Эффективность применения Спленопида позволяет рекомендовать его для включения в схему лечения больных с длительным и тяжелым течением заболевания при наличии лабораторного подтверждения дисбаланса системного иммунного ответа.

Показано, что применение цитокинотерапии фармакоэкономически оправданно, так как позволяет увеличить продолжительность безрецидивного периода.

Полученные результаты исследования внедрены в лекционный курс для ординаторов и аспирантов ГУ НЦКЭМ СО РАМН, а также в практику работы клиники ГУ НЦКЭМ СО РАМН, Окружного военного госпиталя №333.

Положения, выносимые на защиту:

1. В патогенезе язвенной болезни большое значение имеет усиление апоптоза циркулирующих мононуклеарных клеток, а также выраженный сдвиг цитокинового баланса в сторону провоспалительных медиаторов (ШЫ-у, ТЫГ-а) на местном и системном уровне. Уровень 1Ь-10 значительно повышается.

2. У больных с длительным и осложненным течением заболевания выявлена взаимосвязь между функциональной недостаточностью Т-клеток иммунной системы и клинической картиной болезни.

3. Включение в комплекс терапевтических мероприятий Спленопида позволяет ускорить процесс рубцевания язвенного дефекта, быстрее купировать болевой синдром и увеличить продолжительность ремиссии у пациентов.

ВЫВОДЫ

1. У больных с длительным и осложненным течением язвенной болезни в 1,5 раза чаще наблюдается усиление апоптоза циркулирующих лимфоцитов и ассоциированные с ним иммунные дисфункции.

2. Дефицит ТЫ-и ТЬ2/противовоспалительных цитокинов в сыворотке и снижение уровня их спонтанной продукции в культурах клеток цельной крови свидетельствует об угнетении функций Т-хелперных клеток при обострении язвенной болезни.

3. Нарушение функциональной активности Т-хелперных клеток у больных ЯБ сопряжено с дисбалансом про- и противовоспалительных цитокинов, поскольку снижение продукции ТЫ/Т112 цитокинов (П^Ы-у, 1Ь-2, 1Ь-4) в культурах клеток цельной крови происходит на фоне значительного усиления ЛПС-индуцированной продукции 1Ь-10 и соответственно снижения индекса соотношения ТЫР-а/ХЬ-Ю.

4. Характерной особенностью продукции цитокинов у больных с Т-клеточной ареактивностью является снижение продукции ТЫБ-а и изменения индекса соотношения 1РЫ-у/1Ь-4 в нестимулированных культурах, что свидетельствует о доминировании ТЬ2 цитокинов у больных с дефектом пролиферативного ответа Т-клеток.

5. Применение Спленопида в комплексном лечении больных ЯБ характеризуется выраженным иммунокорригирующим эффектом, на что указывает усиление пролиферативной активности Т-клеток; модуляция у 75% больных продукции ТЫР-а и снижение у 50% больных исходно высокого уровня продукции 1Ь-10; что сопровождается более быстрым купированием болевого синдрома и позволяет увеличить продолжительность безрецидивного периода.