Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Иммуногистохимическое исследование кальций-связывающего белка CaBP 9kD в эпителиохориальных плацентах на протяжении беременности

г

?Г8 Ой 2 3 ИЮН ТО

На правах рукописи

Никитешсо Леонид Леонидович

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КАЛЫЩЙ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА СаВР 9кО В ЭПИТЕЛИОХОРИАЛЬНЫХ ПЛАЦЕНТАХ НА ПРОТЯЖЕНИИ БЕРЕМЕННОСТИ.

14.00.23 - гистология, цитология и эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск -1997

Работа выполнена в Институте педиатрии и репродукции человека ВСНЦ СО РАМН (директор - академик РАМН С.И.Колесников) и Бэбрахам Институт (Кембридж,Великобритания)

Научный руководитель: академик РАМН

С.И.Колесников Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Ф.Б.П.Вудинг (Великобритания)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущее учреждение: Новосибирский государственный медицинский институт

Диссертационного Совета Д.001.41.01 при ГУ "Восточно-Сибирский научный центр СО РАМН" (664003, Иркутск, ул.Тимирязева, 16).

Автореферат разослан мая 1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ "ВосточноСибирский научный центр СО РАМН" по адресу: 664003 Иркутск, ул.Тимирязева, 16.

Л.С. Васильева

кандидат биологических наук

И.В.Клименков

Защита состоится ¿¡Р июня 1997г. в

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного кандидат медицинских наук

Л.Ф.Шолохов

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Кальций является одним из главных минеральных веществ, необходимых плоду в процессе развития, в основном для роста и минерализации скелета (Pitkin R.M., et.al.,1979; Gross M., Kumar R., 1990; Schauberger C.W., Dunne F. ct.al.,1993). На протяжении гестационного срока количество переносимого через плаценту кальция возрастает (Grace N.D. et.al., 1986; Care A.D., 1991). В третьем триместре беременности у человека приблизительно 28 граммов кальция (Widdowson Е.М., 1981), у овцы - 3 грамма ( Grace et.al., 1986) потребляется плодом ежедневно. Однако, несмотря на значительный объем накопленных данных, механизм транспорта кальция через плацентарный барьер остается неясным. У всех изученных на данный момент видов животных (человек, жвачные животные, грызуны) концентрация кальция в сыворотке крови плода выше, чем в крови матери (Sibley С.P., Boyd R.D.H., 1988), что позволяет предположить существование механизма активного транспорта кальция от матери к плоду. Различными исследованиями показано, что активный транспорт кальция через эпителиальные клетки связан с содержанием витамин-D-зависимого кальций-связывающего белка молекулярной массой 9кД (calbindin Dyk или СаВР 9kD) (Bruns et.al, 1988; Wooding and Bruns 1991; Kumar et.al., 1995). В плаценте кальций-связьшающий белок СаВР 9kD был найден у грызунов (Bruns et.al., 1986, 1988; Warenbourg et.al., 1986), у жвачных (Wooding and Bruns, 1991; Reiswig J.D. et.al.1995) и у человека (Tuan R.S.,1985; Brun В. et.al., 1987).

Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению структуры и функций кальций-связывающего белка СаВР 9kD и выявлению его локализации в плаценте животных и человека, малоизученными остаются вопросы синтеза данного белка и его внутриклеточного распределения.

До настоящего времени в литературе нет четкого представления о том, какой именно участок эпителиохориальной плаценты и какие клеггки ответственны за синтез кальций-связывающего белка СаВР 9кД, а также как происходит транспорт кальция на клеточном уровне.

Настоящая работа посвящена детальному исследованию локализации кальций-связывающего белка СаВР 9Ш и мРНК данного белка в эпителиохориальной плаценте, поскольку последняя является удобным объектом для экспериментов (возможность перфузии, четкое разделение эпителия матки и трофобласта и т.д.)

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основная цель работы состояла в изучении локализации кальций-связывающего белка СаВР 9кО (на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях) и типов клеток эпителиохориальной плаценты, ответственных за синтез данного белка на протяжения беременности для определения механизмов и основных участков транспорта кальция к плоду.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1). Исследовать локализацию витамин-Б-зависимого кальций-связывающего белка СаВР 9Ы> в различных участках плаценты на тканевом и клеточном уровнях;

2). Изучить распределение кальций-связывающего белка СаВР 9кБ в эпителии различных учаспсов эпителиохориальной плаценты на протяжении беременности;

3) Выявить места синтеза кальций-связывающего белка СаВР 9кС путем изучения локализации его мРНК в эпителии различных отделов эпителиохориальной плаценты на протяжении беременности;

4). Провести сравнительный анализ полученных данных с результатами ранее проведенных исследований на других животных с эпителиохориальной ллацентацией (овцы, козы, антилопы, олени).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые проведен комплексный, и полный анализ распределен!« кальций-связывающего белка СаВР 9кЭ, принимающего участие в транспорте кальция через плаценту, и его мРНК в эпителии различных участков эпителиохориальной плаценты коров.

Выявлены детали механизма транспорта кальция через эпителиохориальную плаценту на клеточном и субклеточном уровнях.

На основе сравнительного анализа сформулирован вывод о существовании в эпителиохориальной плаценте специализированного участка (трофобласт межплацентомного отдела), ответственного за транспорт кальция через плацентарный барьер.

Получены данные по локализации кальций-связывающего белка СаВР 9кО и его мРНК в двуядерных клетках эпителиохориальной плаценты коров, что является уникальным для животных группы парнокопытных и связано, по-видимому, со спецификой метаболизма этих клеток у коров.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Определен период наиболее активного синтеза и накопления кальций-связывающего белка СаВР 9кО, принимающего участие в активном транспорте кальция через плаценту (начало второго триместра). Это позволит с помощью дополнительных комплексных физиологических, гистохимических и молекулярно-биологических исследований оценить участие данного белка в транспорте кальция через плаценту, а также даст возможность управлять этим важным для развития и роста плода процессом уже на начальных стадиях, и избежать таких патологий новорожденного, как нарушение развития опорно-двигательного аппарата.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1). Трофобласт межплацентомного участка эпителиохориальной плаценты является основным местом локализации витамин-Д-зависимого кальций-связывающего белка СаВР 9kD и мРНК данного белка.

2). Апикальная часть одноядерных, клеток трофобласта межплацентомного отдела плаценты коров играет активную роль в процессе связывания кальция, который затем транспортируется через цитоплазму не везикулярным способом, а в виде свободного комплексного соединения [кальций-(кальций-связывающий белок)].

3). Пик синтеза и накопления кальций-связывающего белка СаВР 9kD в межплацентомном отделе эпителиохориальной плаценты коров приходится на начало второго триместра беременности (100-150 дней стельности).

4). Наличие кальций-связывающего белка СаВР 9kD и его мРНК в двуядерных клетках плацентомного и межплацентомного отделов плаценты коров является уникальным для животных группы парнокопытных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации представлены на XXXÍ Международной студенческой конференции (Новосибирск, 1992), международной Ассамблее "Здоровье народов Восточной Сибири" (Иркутск, 1995), международной конференции The Anatomical Society of Great Britain and Ireland Winter Meeting (London, 1996), отчетном пленуме в Babraham Institute (Cambridge, 1997). По теме исследования опубликовано 5 работ.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок (63 фотографии, 5 рисунков-схем и 9 графиков) и 2

таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", двух глав собственных данных и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 183 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В настоящем исследовании были использованы плаценты 23 коров породы Friesian (3-нестельные, 2 животных на стадии 55, 3-100, 4-150, 1-155,3-219,1-248,2-270,4-280 дней стельности). После забоя животных, проведенного по международным стандартам, матку удаляли го брюшной полости матери и фиксировали методом перфузии через канюлированные артерии с использованием 3%-ного раствора иараформальдегида в 0.1 М какодилатном буфере (рН 7.2), с 5%-ным содержанием сахарозы и 1%-ным - глугаральдегида. Через 5 минут после начала фиксации, фиксатор также был перфузирован в артерии плода (Wooding, 1980; Wooding et al., 1996b).

От кавдого животного были забраны образцы четырех плацентой и четырех межплацентомных участков плаценты и дополнительно фиксированы 2-3 часа иммерсионным методом в фиксаторе того же состава. Образцы сохраняли в 0.1 М какодилатном буфере (рН 7.2) при температуре 4°С.

Образцы замороженной без предварительной фиксации ткани были приготовлены погружением кусочков тканив изопентан, охлажденный до -60°С в жидком азоте и затем помещены: часть в жидкий азот, а часть в холодильник при -70°С.

Для морфологических и иммуногистохимических исследований кусочки ткани извлекали из какодилатного буфера и после соответствующей проводки заливали в смолу Lowicryl К4М при низкой температуре с целью максимального сохранения структуры антигена, соответственно методике, предложенной Wooding et.al. (1996b).

Иммуногистохимические методы с использованием коллоидного золота в качестве маркера применялись для выявления локализации кальций-связывающего белка СаВР 9kD и коровьего плацентарного лактогена. Для светомикроскопических исследований применяли интенсификацию серебром.

Проведены все необходимые контроли.

Результаты иммуногисго химической реакции подсчитывались полуколичественным методом с использованием шкалы оценки реакции от - до +++, пересчитывались по формуле для полуколичественного метода и результаты представлены в виде графиков. Количество частиц золота на 1 мкм2 было определено путем подсчета на электронном микроскопе по методике, предложенной Wooding et a/.(1996b). Для всех полученных значений были рассчитаны средняя и стандартная ошибка средней.

Авторадиографический метод гибридизации in situ с использованием олигонуклеотидного зонда (45 оснований) применялся с целью выявления мест синтеза кальций-связывающего белка СаВР 9kD. Зонды метали с З'-конца с помощью [ог358]дАТФ, используя при этом фермент терминальную деоксинуклеотидил трансферазу. Гибридизацию проводили в течении 12 часов при 42°С в гибридизационном буфере под покровными стеклами во влажной камере по методике, предложенной Sirinathsinghji etal.{ 1990).

Для определения специфичности реакции были проведены соответствующие контрольные реакции.

Количественная оценка содержания мРНК СаВР 9kD была проведена на цигоспектрофотометре Leitz MPY-3. Абсорбция (т.е. плотность гранул серебра и, следовательно, количественный параметр гибридизации) была измерена при увеличении х40 в двадцати произвольно выбранных полях зрения (площадь каждого - 20 мкм2) в клетках каждого

вида эпителия в плацентомном и межплацентомном отделах плаценты коров. Для каждого срока беременности было обсчитано по несколько срезов.

Для одновременного выявления белка (плацентарный лактоген коров bPL) и мРНК (кальций-связывающего белка СаВР 9kD) нами был проведен метод двойного мечения (иммуногистохимическая реакция и гибридизация in situ) на одном и том же срезе ткани, предложенный Brahic and Ozden (1992), с модификациями, разработанными нами.

Для проведения метода Nothern blotting общая РНК клеток была экстрагирована по методу Chomczynsky and Sacchi (1987) из ткани плацентомного и межплацентомного отделов плаценты коров с предварительным мануальным разделением матершгской и плодной частей. Олигонуклеотидный зонд для выявления мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD был помечен с [а-32Р]АТФ и гибридизован с блотом агарозного геля при 65°С в течение 16 часов в гибридизационном буфере, аналогичном применяемому в методе гибридизации in situ.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

Локализация кальций-связывающего белка СаВР 9kD и его мРНК в межплацентомном отделе.

Имиуногиапохимичесте результаты локализации СаВР 9kD в межплацентомном отделе.

В первом триместре беременности ( 50 -100 дней стельности), продолжающейся у коров 270-280 дней, высокий уровень содержания СаВР 9kD наблюдается в отдельных клетках трофобласга межплацентомного отдела плаценты. Данные клетки на серийных срезах были идентифицированы как характерные для плаценты жвачных животных двуядерт.1е клетки по морфологическим критериям (наличие двух ядер) и по данным иммуногасгохимии с использованием

поликлональных кроличьих антител против плацентарного лакгогена коров, содержащегося в гранулах данных клеток . Выявлено также, что данные клетки теряют СаВР 9kD по мере созревания и к началу их миграции через плотные межклеточные контакты апикальной части эпителия трофобласта по направлению к материнскому эпителию. Данное наблюдение справедливо по отношению к двуядерным клеткам межплацентомного отдела плаценты коровы на всем протяжении стельности. В то же время в I триместре только в некоторых одноядерных клетках трофобласта межплацентомного участка плаценты коров обнаруживается калыцш-связывающий белок СаВР 9kD. Ближе к середине стельности, па стадии 100-150 дней, локализация СаВР 9kD отмечается во всех одноядерных клетках (Таблица 1). Высокий уровень содержания данного белка в одноядерных клетках трофобласта поддерживается до конца беременности, при этом концентрация СаВР 9kD в данных клетках превышает содержание данного белка в клетках эпителия других участков плаценты коров в 8-10 раз (Таблица 2).

В эпителии желез эндометрия небеременных животных большинство клеток содержат СаВР 9kD. Такой уровень содержания СаВР 9kD поддерживается в клетках данного типа и на ранних стадиях стельности (55 дней), однако затем по мере увеличения размера желез в процессе роста плода количество клеток, в которых иммуногисто-химическими методами можно определить наличие СаВР 9kD, уменьшается. Начиная со второго триместра (срок 100 дней стельности) и до конца стельности железы межплацентомного отдела плаценты коров имеют неравномерное распределение СаВР 9kD в клетках эпителия; примерно 30% клеток содержат данный белок, в остальных он отсутствует

В эпителии эндометрия небеременных коров лишь отдельные клетки содержат небольшое количество СаВР 9kD, которое снижается в материнском эпителии до очень низкого уровня к середине стельности (150 дней

Таблица 2. Интенсивность метки коллоидное золото-антитело для выявления локализации кальций-связывающего белка СаВР 9кО ( частиц золота на 1 мкм2; М±гп ) в различных частях и органеллах эпителиальных клеток различных участков плаценты (срок беременности 270-280 дней; п = 6)

Отдел клетки Межплацентомный отдел плаценты Плацентомный отдел лаценты

Трофэктодерма Материнский эпителий20 Эпителий желез15 Трофэктодерма Материнский эпителий40

Одноядерные клетки 60 Двуядерные клетки20 Одноядерные клетки20 Двуядерные клетки40

митохондрии 0.5+0.1» 0+0» | 0+0"* 0+0"* 0.0"* 0.1+0.1» т 0.1+0.1»*

ядро/ эухроматин 26.0+1.0* 17.0+1.5* 0+0* 7.0+1.0 | 0.5+0.2 * 9.0+1.0 3.0+0.5 "Г

ядро/гетерохроматин 3.5+0.5" 2.5+0.5" 0+0ь * 0.5+0.3" * 0.1+0.10 ♦ 1.0+0.2»* 0.5+0.2Ь *

ядрышко 7.0+0.5" 6.0+1.0" 0+0ь * 1.0+0.5" * 0+0ь * 1.0+0.5-* 0.5+0.2" *

апикальный участок цитоплазмы 43.0+1.5 0+0"* 8.5+1.0| 0.5+0.2» * 2.0+0.51

перинуклеарный участок цитоплазмы 18.0+1.0* 16.9+1.5»* 0+0»* 6.5+1. 0.5+0.2ь * 6.0+0.5 <= 2.0+0.51

базальный участок цитоплазмы 29.0+1.5* 0+0"* 6.5+1.01 0.5+0.2а * 2.5+0.51

гранулы 0.5+0.2" | 0.5+0.1»!

Значения надстрочника обозначают число клеток, в которых число частиц коллоидного золота было подсчитало в 3 произвольно выбранных участках для каждого отдела клетки.

В каждой горизонтальной колонке только значения, содержащие аналогичные буквы надстрочника (а, Ь, с), статистически достоверно не отличаются по отношению друг к другу.

В каждом вертикальном ряду только значения имеющие аналогичные значки надстрочника или *) статистически достовджо не отличаются друг от друга (Р<0.05).

Таблица 1. Интенсивность метки антитело - коллоидное золото (с интенсификацией серебром для светомикроскопических наблюдений) для выявления кальций-связывающего белка СаВР 9кВ в эпителии различных участков эпителиохориальной плаценты коровы на протяжении беременности.

Дни стельности Межплацентомный отдел плаценты Плацентомный отдел плаценты

Трофэктодерма Материнский эпителий Эпителий желез эндометрия Трофэктодерма Материнский эпителий

Одноядерные клетки Двуядерные клетки Одноядерные клетки Двуядерные клетки

Небеременные3 о о +++ о о о

552 - от ++ до + +++ - ++ +

1003 - ОТ++ до -* + ++ или -*** - ++ +

150-155' +++ от ++ до -* - ++ или -*** - ++ +

220-2504 +++ от ++ до -* - ++ или -*** - ++ +

270-2806 +++ от ++ до -* - ++ИЛИ -*** - ++ +

Результаты оценены методом полуколичественного анализа: +++, высокая степень мечения; ++, средняя степень мечения; +, слабая степень мечения; очень слабая сгагень /отсутствие мечения.

о - Эпителий на данной стадии стельности отсутствует.

Значения надярочника для каждой стадии беременности обозначают количество исследованных животных в данной группе. * Двуядерные клетки теряют СаВР 9ГО по мере созревания.

"Только некоторые клетки материнского эпителия СаВР 9Ш -иммуно-положнтедьны. ♦♦•Некоторые клетки эпителия желез эндометрия СаВР 9кВ-иммуноположнтельны, другие-нет.

беременности), и остается неизменным вплоть до ее конца.

Результаты in situ гибридизации в межплацентомном отделе.

Количественный анализ мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD показал увеличение количества указанной мРНК на протяжении стельности только в эпителии трофобласта и постоянную шикую концентрацию её в материнском эпителии (Рис.1). Количество мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD в одноядерных клетках резко увеличивается в середине стельности на стадии 150 дней и затем остается достаточно высоким до конца стельности.

Эпителий желез эндометрия показывает относительно низкое содержание мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD на протяжении стельности (за исключением ранних стадий) с неравномерным распределением в различных клетках, одни из которых мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD- положительны, другие-отрицательны.

Результаты комбинированного метода шшуногистохимии и гибридизации in situ на одном срезе для межплаиентомного отдела.

На светомикроскопическом уровне результаты проведения данного метода, модифицированного нами, показали наличие мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD в одноядерных клетках, двуядерных клетках до начала миграции, а также практически полное отсутствие данной мРНК в двуядерных клетках межплацентомного отдела по мере миграции в сторону матери.

Результаты иммуногистохимии па электронно-микроскопическом уровне в клетках межплаиентомного отдела.

Иммуногистохимический анализ локализации СаВР 9kD на залитых в смолу Lowicryl К4М ультратонких срезах показал распределение метки коллоидного золота в цитоплазме и нуклеоплазме, и ее отсутствие в органеллах - митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, лизосомах, аппарате Гольджи и везикулах. Количественный подсчет частиц золота на

з1 ю а о и ю

Межплацентомный отдел

100 150-155 220-250 270-280

дни стельности

Материнский эпителий Трех}) облает Железы эндометрия

Рисунок 1.

Количественная оценка сигнала гибрвдизации w j/'/и с использованием олигонуклеотидного зовда, меченного Р55]дАТФ, в межплацентомном участке плаценты коровы на протяжении беременности. Значение абсорбции - средняя ± стандартная ошибка средней.

Для каждой линии графика только значения, обозначенные одинаковыми буквами над линией (для линии, демонстрирующей значения для материнского эпителия, буквы расположены под линией), статистически достоверно не отличаются одно от другого (Р<0.01).

единицу площади различтшх отделов клетки помог выявить особенности распределения кальций-связывающего белка СаВР 9kD в клетках различных видов эпителия из различных участков плаценты коров (Таблица 2). В эпителии желез эндометрия метка распределена равномерно по всей клетке. В одноядерных клетках трофобласта межплацентомного отдела плаценты концентрация СаВР 9kD примерно в 4-5 раз выше чем в клетках эпителия желез эндометрия, также было отмечено повышенное содержание метки в апикальной части этих клеток, у основания микроворсинок. Несмотря на это, в многочисленных пиноцитозных пузырьках СаВР 9kD полностью отсутствует.

Локализация кальций-связывающего белка СаВР 9kD и его мРНК в плацентомном отделе.

Имиуиогистохимия плацентомного отдела.

Уровень содержания кальций-связывающего белка СаВР 9kD в плацентомах оказался значительно ниже такового в межплацентомных участках на протяжении беременности. В одноядерных клетках плацентомного отдела метка практически полностью отсутствует, в то время как двуядерные клетки содержат значительное количество кальций-связывающего белка СаВР 9kD непосредственно с момента своего появления в плаценте. Кубический материнский эпителий плацентомного отдела плаценты коров содержит кальций-связывающий белок СаВР 9kD на всем протяжении беременности и концентрация данного белка в клетках этого эпителия примерно в 2 раза ниже чем в двуядерных клетках (Таблица 2). Уровень содержания кальций-связывающего белка СаВР 9kD в клетках материнского эпителия плацентомного отдела увеличивается незначительно с середины до конца стельности по сравнению с первым триместром.

Результаты гибридизации in situ на срезах плацентомного отдела.

Двуядерные клетки плацентомного отдела показывают самый

высокий уровень содержания мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD в середине стельности (на стадии 100-150 дней) (Рис.2). Затем к концу беременности этот уровень снижается до уровня содержания мРНК кальций-связыывающего белка СаВР 9kD в трофобластс межплацентомного отдела. Очень незначительное количество мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD найдено в одноядерных клетках (сравнимое с неспецифическим связыванием зонда с тканью) и постоянное низкое (но статистически выше несиецифического связывания) содержание мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD выявлено в материнском эпителии плацентомного отдела.

Результаты метода Nothern blotting.

Олигонуклеотидный зонд был гибридизован с транскрипгом (500 оснований) плацентомных и межхшацентомных блотов мРНК.

Максимальный уровень содержания мРНК кальций-связывающего белка СаВР 9kD был выявлен в плодной части плацентомного отдела, более низкий в плодной части межплацентомного отдела, незначительный в материнской части плацентомного отдела и практически полное отсутствие гибридизации наблюдалось в материнской части межплацентомного отдела. Таким образом, данные, полученные при проведении метода Nothern blotting, полностью соответствуют результатам гибридизации in situ.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

В настоящем исследовании впервые показано, что в плаценте коров значительное увеличение количества кальций-связывающего белка СаВР 9kD и его мРНК на протяжении беременности наблюдается только в трофобласге межплацентомного отдела эпителиохориальной плаценты коров. Способность трофобласта межплацентомного отдела эпителиохориальной плаценты к поглощению и транспорту кальция была также продемонстрирована в опытах, проведенных с использованием раз-

Ппацентомный отдел

...--L

..I

"Г"

55

100

1ЕО-155

-1--1

220-250 270-280

дни стельности

Двуядерные клетки . Соединительная ткань Материнский эпителий

7

5

Рисунок 2.

Количественная оценка сигнала гибридизации in situ с использованием олигонуклеотидного зонда, меченного [35SJoAT<I>, в гшацентомном участке плаценты коровы на протяжении беременности. Значение абсорбции - средняя ± стандартная ошибка средней.

Для каждой линии графика только значения, обозначенные од инаковыми буквами над линией, статистически достоверно не отличаются одно от другого (Р<0.01).

личных физиологических моделей, в частности с применением полупронецаемых мембран Ussing chambers (Abbas et al., 1993) и экспериментах с трофобластическимим дисками (Jones et al., 1997).

И хотя максимум содержания кальций-связывающего белка СаВР 9kD в трофобласте межплацентомного отдела коррелирует с пиком потребности плода в кальции как у овец так и у коров, отсутствие каких-либо значительных изменений и без того низкого содержания этого белка в клетках эпителия желез эндометрия у коров сильно различается с таковым у овец, где выявлено значительное увеличение содержания данного белка в конце беременности (Morgan et al., 1997).

Поскольку функция контроля транспорта кальция через плаценту лежит прежде всего на плоде, наиболее важным звеном в системе транспорта кальция является уровень и контроль синтеза кальций-связывшощего белка СаВР 9kD. Транспорт же кальция из материнской крови осуществляется, по-видимому, путем пассивного транспорта через эпителий желез эндометрия, обусловленного возрастанием потребностей плода в кальции.

Данные настоящей работы по исследованию количественного распределения этого белка в клетках трофобласта указывают также на то, что данный процесс является процессом переноса через цитоплазму не везикулярным путем, поскольку нами не было найдено кальщгй-связывающего белка СаВР 9kD в клеточных структурах, окруженных мембранами, способными к везикулярному транспорту, как это показано Nemere при исследовании локализации СВР 28kD в энтероцитах цыпленка (Nemere et al., 1991; Nemere, 1992). В отличие от плаценты овец, где кальций-связывающий белок СаВР 9kD распределен равномерно среди одноядерных клеток межплацентомного отдела (Wooding et al., 1996b), при проведении иммуногистохимии на электротто-микроскопическом уровне нами показана достоверно более высокая

концентрация данного белка в апикальной части одноядерных клеток трофобласта межплацентомного отдела плаценты коров. Видимо на этапе поглощения кальция клеткой данный белок связывается каким-то образом с фибриллярными компонентами апикального участка клетки (Sweiry J.H., Yudilevich D.L.,1984; Sweiry J.H. et.al.,1986). Ассиметричное распределение кальций-связывающего белка СаВР 9kD внутри клеток трофобласта сходно с распределением кальций-связывающего белка СаВР 28kD в энтероцитах цыпленка, продемонстрированным методом ионной микроскопии начального поглощения Ca47 клеткой (Fullmer et al, 1996), исследованиями локализации вышеуказанного белка СаВР D28k с использованием иммунофлюоресцентного метода (Nemere et al., 1991) и иммуногистохимическим методом с использованием коллоидного золота в качестве маркера (Thorens et al., 1982).

Ассиметричное распределение кальций-связывающего белка Ca BP 9kD внутри клеток трофобласта межплацентомного отдела плаценты позволяет предположить, что данный белок являет собой потенциальный запас с целью позволить клетке при резко меняющейся концентрации кальция в пространстве между двумя эпителиальными слоями (материнского эпителия и трофобласта) извлечь кальций в максимальной степени. Это, может бьпь особым способом управления процессом диффузии связанного кальций-связываюгцим белком кальция через клетку путем повышения градиента кальция в базальной (более близкой по отношению к плоду) части клетки трофобласта или же свидетельством того, что при переносе кальция через клетки трофобласта кальций меняет своего переносчика.

Как уже было замечено, высокий уровень содержания кальций-связывающего белка СаВР 9kD в одноядерных клетках межплацентомного отдела плаценты является характерным для всех изученных на данный момент жвачных животных (Wooding et al., 1996b и совместные не

опубликованные данные). В тоже время полученные нами результаты совершенно отчетливо показывают, что двуядерные клетки также содержат кальщш-связывающий белок СаВР 9кО и его мРНК, т.е. являются источником небольших количеств кальций-связывающего белка и местом его синтеза. Это является первым известным в литературе свидетельством содержания кальщто-связывающего белка СаВР 9кЕ> в клетках, напрямую не участвующих в процессах активного транспорта кальция. Таким образом, кальций-связывающий белок СаВР 9к£> может играть какую-то специфическую роль в метаболизме и дифференциации двуядерных клеток плаценты коровы.

Количественный анализ содержания кальций-связывающего белка СаВР 9кО путем подсчета депозиции гранул серебра после интенсификации мест протекания иммуногистохимичеких реакций подтвердили наблюдение Яекмд а а1. (1995) о небольшом, но достоверном увеличении самого по себе низкого уровня содержания кальций-связывающего белка СаВР 9кЕ) в материнском эпителии плацентомного отдела, однако увеличения содержания СаВР 9кй в двуядерных клетках плацентомного отдела во второй половине беременности у коров не наблюдается. Тем не менее, проведенное нами количественное исследование распределения метки коллоидного золота (при проведении иммуногисгохимичесжой реакции по выявлению локализации кальций-связывающего белка СаВР 9кЕ>) на электронно-микроскопическом уровне отчетливо продемонстрировало, насколько небольшим является содержание кальций-связывающего бедка СаВР 9кО в материнском эпителии плацентомного отдела по сравнению с содержанием данного белка в одноядерных клетках трофобласта межплацентомного отдела плаценты коров в конце беременности.

Эти различия в распределении кальций-связывающего белка СаВР 9кО и в его количестве имеют важное значение для выявления места

предполагаемого активного транспорта кальция через плаценту коров. Потребность в кальции возрастает па протяжении второй половины беременности и только трофобласт межплацентомного отдела плаценты коров показывает сколько-нибудь значительное увеличение содержания кальций-связывающего белка СаВР 9кС, а, следовательно, корреляцию с возрастанием потребности плода в кальции. В плацентомах изменения концентрации калыцш-связывающего белка СаВР 9кО минимальны, двуядерные клетки двигаются в "неправильном для осуществления транспорта кальция направлении", и низкий уровень кальций-связывающего белка СаВР 9Ш в клетках материнского эпителия может помочь осуществить перенос незначительного количества кальция, да и то лишь половину пути по направлению к кровеносному руслу плода, так как одноядерные клетки трофобласта содержат очень мало или совсем не содержат кальций-связывающего белка СаВР 9Ю.

В заключение необходимо отметить, что кальций-связывающий белок СаВР 9кО и его мРНК найдены в плаценте коров в особых популяциях клеток, причем его содержание увеличивается во второй половине беременности только в одноядерных клетках межплацентомного отдела. Кальций-связывающий белок СаВР 9Ш локализован в цитоплазме, а не в клеточных структурах, имеющих собственную мембрану. Данный факт свидетельствует о том, что СаВР 9кО-зависимый активный транспорт кальция через плацентарный барьер у коров происходит путем диффузии комплекса [кальций-связывающий белок СаВР 9кО-кальций] через цитоплазму и протекает в одноядерных клетках трофобласта межплацентомного отдела плаценты, что является общим для всех жвачных животных. Наличие кальций-связывающего белка СаВР 9ЫЭ в двуядерных клетках является уникальным для животных данной систематической группы млекопитающих, участие же данных клеток и

клеток материнского эпителия межплацентомного отдела в процессах транспорта кальция через плаценту коров представляется маловероятным.

ВЫВОДЫ

1. Трофобласт межплацентомного отдела является основным участком локализации кальций-связывающего белка СаВР 9кО в эпитеяиохориальной плаценте коров.

2. Содержание кальций-связывающего белка СаВР 9кО в трофобдасте межплацентомного отдела по сравнению с эпителием других отделов эпителио-хориальной плаценты увеличивается во втором и третьем триместрах беременности.

3. На ультраструктурном уровне выявлено неравномерное распределение кальций-связывающего белка СаВР 9кО в цитоплазме одноядерных клеток трофобласта межплацентомного отдела эпителио-хориальной плаценты коров; максимальное количество белка содержится в апикальной части данных клеток.

4. Активный транспорт кальция через трофобласт межплацентомного отдела эпителиохориальной плаценты коров с помощью кальций-связывающего белка СаВР 9кО осуществляется трансцитоплазменным, а не везикулярным способом.

5. Выявлена корреляция основных мест локализации кальций-связывающего белка СаВР 9кЭ и мРНК данного белка в эпителиохориальной плаценте коров (трофобласт межплацентомного отдела, часть клеток эпителия желез эндометрия и двуядерные клетки межплацентомного и плацентомного отделов).

6. Установлена корреляция периода увеличения количества кальций-связывающего белка СаВР 9кБ и его мРНК в одноядерных клетках межплацентомного отдела с периодом беременности у коров, во время которого происходит значительное увеличение массы плода (второй триместр беременности).

7. Выявленное наличие кальций-связывающего белка СаВР 9kD и его мРНК в двуядерных клетках плацентомного и межллацентомного отделов плаценты коров является уникальным для эпителио-хориальной плаценты парнокопытных животных.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. КНикитенко Л.Л Маркерно-гистохимическое выявление локализации ферментов, катализирующих реакции с окисленным глутатионом, в плаценте человека на светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях.// Материалы XXXI Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс".-Новосибирск,-1993.-Стр.25-30.

2. Никитенко Л.Л., Машак С.В., Глазырин A.JI., Гладышев Ю.В., Колесников С.И. Новые методы выявления и количественной оценки миогоядерных структур плаценты человека и некоторых млекопитающих. // Сборник тезисов докладов региональной ассамблеи "Здоровье населения Восточной Сибири". -Иркутск.-1995,-Стр.217-218.

3. Nikitenko L., Morgan G., Wooding F.B.P. Calbindin D9K protein and mRNA localization in bovine placenta.// Proceedings of Winter meeting of the Anatomical Society of Great Britain and Ireland, St.George's Hospital Medical School, University of London, 17-19 December 1996,- P.25

4. Nikitenko L., Morgan G., Wooding F.B.P. Calbindin D9K protein and mRNA localization in bovine placenta.// Journal of Anatomy.-1997.-(in press).

5. Nikitenko L., Morgan G., Kolesnikov S., Wooding F.B.P. Immuno-cytochemical and in situ hybridisation studies of the distribution of calbindin D9k in the bovine placenta throughout pregnancy.// Journal of Histochemistry and Cytochemistry.-1997.-(in press).