Иммуногенность и аллергенность модифицированных и рекомбинантных форм аллергенов

Савченко, Елена Анатольевна

Диссертации по медицине → Аллергология и иммулология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуногенность и аллергенность модифицированных и рекомбинантных форм аллергенов

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Савченко, Елена Анатольевна 0 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.36

Автореферат диссертации по медицине на тему Иммуногенность и аллергенность модифицированных и рекомбинантных форм аллергенов

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХ

И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ 00305Т573 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ У1

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Савченко Елена Анатольевна

ИММУНОГЕННОСТЬ И АЛЛЕРГЕННОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ

АЛЛЕРГЕНОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Краснодар - 2007

003057573

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО КГМУ Росздрава).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Ханферян Роман Авакович.

Научный консультант:

кандидат медицинских наук Бабахин Александр Александрович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Ригер Николай Александрович;

доктор медицинских наук Беловолова Розалия Александровна.

Ведущая организация:

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук.

Защита состоится « 25 » апреля 2007 г. в //£^часов на заседании диссертационного совета К208.038.02 при ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861)262-73-75).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан марта 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор / ¿С^рСу И. И. Куценко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время проблема аллерги-зации населения выдвигается в ряд важнейших проблем современной медицины, так как число аллергических заболеваний и их осложнений постоянно растет [Ильина Н.И., 2004].

Аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ), применяемая для лечения аллергопатологии, на сегодняшний день является единственным методом противоаллергического лечения, обуславливающим воздействие на все патогенетические звенья аллергического процесса и обеспечивающим длительный клинический и профилактический эффект. Однако, АСИТ имеет определенные недостатки, одним из которых является большое количество побочных эффектов, что, в частности, объясняется содержанием в аллергенных экстрактах недостаточно охарактеризованных аллергенных и неаллергенных компонентов, а также большой длительностью терапии [Гущин И.С., Курбачева О.М., 2002; Akdis A.C., Blaser К., 2000].

В связи с этим особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение механизмов АСИТ, создание принципиально новых и модификацию существующих форм аллергенов, применяемых для специфической иммунотерапии [Райкис Б.Н., Казиев А.Х., 2001; Хаитов М.Р. 2004]. Все вышеизложенное обусловило необходимость проведения настоящего исследования.

Цель исследования состояла в изучении свойств модифицированных и рекомбинантных форм аллергенов, применяемых для диагностики аллергических заболеваний и аллерген-специфической иммунотерапии. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить иммуногенность и аллергенность сукцинилированного аллергена пыльцы амброзии (sWl) с различной степенью модификации (56%, 79%, 85%, 91%, 95%).

2. Провести сравнительный анализ аллергенных и иммуногенных

свойств нативных и новых рекомбинантных аллергенов тимофеевки (rPhl pi, rPhl р2, rPhl р5, rPhl рб) и полыни (rArt vl).

3. Исследовать IgE-специфичность различных рекомбинантных аллергенов тимофеевки (rPhl pi, rPhl р2, rPhl р5, rPhl рб) и полыни (rArt vl) у больных с соответствующим поллинозом.

4. В сравнительных исследованиях in vitro изучить влияние нативных и модифицированных полимеризацией аллергенов на продукцию IgE -регуляторных цитокинов (IL4, ylFN и IL13) мононуклеарами периферической крови сенсибилизированных больных.

Новизна результатов исследования.

1. Впервые в России проведено исследование новых диагностических рекомбинантных аллергенов тимофеевки rPhl pi, rPhl р2, rPhl р5, rPhl рб и полыни rArt vl и исследована их способность связываться со специфическими IgE пациентов с соответствующей сенсибилизацией.

2. Впервые исследованы механизмы подавления синтеза специфического IgE при использовании сукцинилированного аллергена пыльцы амброзии (sWl) со степенями модификации 56%, 79%, 85%, 91%, 95% и полимеризованного глютаральдегидом аллергена пыльцы амброзии.

3. Изучена динамика анти-Wl IgG-ответа при иммунизации модифицированным и немодифицированным аллергенами.

4. Получены данные, позволившие продемонстрировать новый вариант снижения аллергенности аллергена при сохранении его иммуноген-ности.

5. Проведен сравнительный анализ влияния нативных и полимеризо-ванных глютаральдегидом аллергенов пыльцы амброзии на продукцию IgE - регуляторных цитокинов (IL4, ylFN, IL13) мононуклеарами периферической крови больных амброзийным поллинозом.

Теоретическая значимость исследования.

Полученные факты углубляют представление о механизмах действия модифицированных аллергенов и возможности применения рекомбинант-ных форм аллергенов для специфической диагностики пыльцевой аллергии.

Практическая значимость исследования.

Практическое значение работы заключается в дальнейшем совершенствовании аллергенов, возможности применения модифицированных и рекомбинантных форм аллергенов для аллерген-специфической иммунотерапии, используемой для патогенетического лечения больных с аллерго-патологией.

Апробация материалов диссертации.

Результаты диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях врачей Юга России IX (г. Краснодар, 2003 г.), XII (г. Сочи, 2004 г.), XIII (г. Краснодар 2005 г.), XVI (г. Сочи, 2006 г.), Европейских конгрессах аллергологов и клинических иммунологов EAACI (Берлин, 2001 г., Неаполь 2002 г., Париж, 2003 г., Мюнхен, 2005г.). По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Библиография включает 198 литературных источников (37 отечественных и 161 иностранных авторов). Диссертация иллюстрирована 11 рисунками, содержит 9 таблиц и 3 приложения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В соответствии с целями и задачами настоящей работы были обследованы больные с весенне-летним (78 человек) и летне-осенним (134 человека) поллинозом, и круглогодичным (бытовая сенсибилизация) аллерги-

ческим ринитом (14 человек). При обследовании больных использовались клинические, аллергологические (прик- и скарификационные тесты) и ла-бораторно-инструментальные методы обследования.

Изучение специфичности рекомбинантных форм аллергенов* тимофеевки rPhl pi, rPhl р2, rPhl р5, rPhl рб и аллергена полыни rArt vi к аллер-генспецифическим IgE проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с регистрацией данных на приборе ANTHOS 2010 в соответствии с протоколами, разработанными фирмой «BIOMAY» (Австрия).

Химическая модификация хроматографически очищенного экстракта пыльцы амброзии (водно-солевой экстракт пыльцы амброзии W1 готовили по стандартной методике с применением раствора Кока) осуществлялась методом сукцинилирования (обработка янтарным ангидридом) с различной степенью модификации эпсилон-групп [Андреев С.М., Сидорова М.В.,

1987]. Были получены образцы сукцинилированного аллергена (sWl) со степенями модификации 56%, 79%, 85%, 91% и 95%. Полимеризация аллергенов пыльцы амброзии и домашней пыли глютаральдегидом проводилась в соответствии с методическими рекомендациями [Ханферян P.A.

1988].

Изучение аллергенности и иммуногенности модифицированных форм аллергенов пыльцы амброзии sWl со степенями модификации 56%, 79%, 85%, 91% и 95% и полимеризованных аллергенов пыльцы амброзии и домашней пыли выполнялось следующими лабораторно- инструментальными методами:

Определение высвобождения гистамина после стимуляции базофи-лов крови специфическим аллергеном проводили стекловолоконным методом [Nolte Н., 1990]. Уровень аллерген-специфического (анти-Wl) IgE определялся по стандартной иммуноферментной методике [Lew А.М, 1984].

* Рекомбинантные аллергены предоставлены проф. Р. Валента, Вена, Австрия, за что автор выражает проф. Р.Валента глубокую благодарность

Иммунологические и аллергологические исследования выполнены на 15-ти 8-12 недельных мышах линии (CBAxC57BL/6)Fl и трансгенных мышах HLA-DQ6 и HLA-DQ8 ( по 7 особей), которые были получены в лаборатории Immunology Research Institute of New England (Fitchburg, США). Иммунизация трансгенных мышей и выявление степени сенсибилизации в РБТЛ с нативным (W1) и сукцинилированным (sWl) аллергенами осуществлялись по стандартной методике. [C.J. Krco, T.G. Beito, 1992]. Через 7 дней после иммунизации выделялись лимфоузлы и были приготовлены культуры клеток [Т. Neeno, C.J. Krco, J.Harders, 1996]. В культуру лимфо-идных клеток in vitro добавляли как немодифицированный W1, так и сук-цинилированный sWl различной степени модификации, начиная с концентрации 1мкг/мл. Активацию лимфоцитов учитывали после добавления на заключительном этапе культивирования 3Н тимидина в дозе 1 мкг/мл. Результаты регистрировали на сцинтилляционном счетчике и выражали в Димп/мин [Hümme D.A., Weidemann MJ.1980].

Для определения иммуногенности образцов ;W1 и sWl, мышей (CBAxC57BL/6)Fl иммунизировали внутрибрюшинно 3 раза с интервалом 3 недели в дозе 10 мкг на мышь. На 12-й день первичной и через 1 и 3 недели после вторичной и третичной иммунизации получали кровь в объеме 200 мкп из ретроорбитального синуса. Полученную сыворотку до анализа хранили при -50 °С. Титры анти - W1- аллерген-специфических IgE и IgG-антител в сыворотках определяли соответственно с помощью реакции пассивной кожной анафилаксии (РПКА) [A.A. Babakhin, L.M. DuBuske, A.W. Weeler, с соавт., 1995] и иммуноферментным методом с использованием стандартных тест-наборов для определения специфических IgG ( FEIA, «Pharmacia»),

Для изучения влияния нативных и полимеризованных аллергенов на синтез IgE регуляторных цитокинов определяли концентрацию IL4, IL13, ylFN в супернатантах культур мононуклеаров периферической крови

(МПК), полученных от больных (п=30) с подтвержденной (методом скари-фикационных проб) сенсибилизацией к пыльце амброзии, после 72-часовой инкубации с различными концентрациями нативного и полимери-зованного глютаральдегидом аллергена пыльцы амброзии. Цитокины определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест систем производства «BioSource» (США).

Результаты исследования обработаны методами вариационной статистики с определением средней арифметической (М), стандартной ошибки (±ш) и показателя достоверности различий (р). Значения р<0,05 и менее принимались как статистически значимые. Подготовку данных для статистической обработки и построение графиков проводили в программе «ЕхеН 2002» (корпорация MS, США). Обработка полученных результатов проводилась с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (Stat Soft Inc., США, 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение аллергенности и иммуногенности сукцинилированного аллергена пыльцы амброзии.

В данном исследовании была изучена аллергенность и иммуногенности сукцинилированного аллергена пыльцы амброзии (sWl) со степенями модификации 56%, 79%, 85%, 91% и 95% в сравнении с нативным аллергеном пыльцы амброзии (W1).

В тесте высвобождения гистамина из базофилов крови больных пол-линозом с сенсибилизацией к пыльце амброзии в сравнении с немодифици-рованным аллергеном было установлено, что высвобождение гистамина (ВГ) из базофилов существенно (р<0,05) снижено (рис.1) в присутствии sWl со степенями модификации 79% и выше в сравнении с воздействием немодифицированного аллергена W1.

Было показано, что при степени сукцинилирования sWl 85%, 91% и 95% достигалось наибольшее снижение способности связываться с фикси-

рованными на базофилах аллергене пециф и чески ми антителам и, т.к. высвобождение гистамина из базофилов сенсибилизированных больных снижалось на 50% (р<0,05) по сравнению с действием на них нативного аллергена. При этом отмечался выраженный, прямо зависящий от степени модификации аллергена, эффект. Так, £Ш1 аллерген с модификацией 56% индуцировал такое же, как и в контроле высвобождение гистамина.

Данный факт свидетельствовал о том, что оставшихся немо инфицированных Е»Е-связывающих эпитопов аллергена было достаточно для индукции активации базофилов с последующим высвобождением гистамина.

и) 56% 79% 51л/183% 91% ¡¡и/195%

модификации модификации модификации нодифииции модификации

Рис, I. Высвобождение гистамина, индуцированное VI и с различной степенью модификации из базофилов крови пациентов, сенсибилизированных к пыльце амброзии.

При оценке аллергенной активности модифицированного аллергена с различным уровнем модификации методом иммуноферментного анализа (ИФА) (рис.2), были получены аналогичные результаты.

в К

к х

<и

120 100 ■ 80 ■ 60 40 -20 -0

56% 85% 957а

модификации модификации модификации модификации модификации

Рис.2. Сравнительные результаты реакции торможения ИФА с аллергенами Wl и с различной степенью модификации с сывороткой крови больных с сенсибилизацией к пыльце амброзии.

А именно, отмечалось прогрессивное снижение способности связываться с анти-\¥1 человеческим ^Е при степени модификации аллергена, составляющей 79% и выше, по сравнению с нативным аллергеном (р<0,05). Максимально низкий уровень связывающей активности был установлен при степени модификации 95% (р<0,01). В то же время модифицированный аллерген с модификацией 56% облапал практически такой же связывающей активностью с антиЛУ! человеческим 1§Е как и на-тивный аллерген. Таким образом на основании тестов с высвобождением гистамина и торможением ИФА можно сделать вывод, что снижение аллергенной активности наступает при степени модификации не ниже 79%.

Для изучения иммуногенности модифицированных аллергенов было проведено сравнение про л ифератив кого ответа по реакции БТЛ культуры клеток лимфатических узлов НЬА-Орб и НЬА-ОС>8 мышей, иммунизированных экстрактом XVI, в присутствии различных концентраций модифицированного sWl и ^модифицированного V/! аллергена пыльцы амброзии.

Было выявлено, что сукцинилированные аллергены со степенями модификации 56%, 79%, 85% и 91% сохраняли способность индуцировать in vitro Т-клеточный ответ у мышей линии HLA-DQ6 (рис.3), причем стимуляция in vitro культуры клеток лимфоузлов мышей различными концентрациями аллергена приводила к дозозависимому пролиферативному ответу. Максимальный пролиферативный ответ наблюдался при введении sWl и W1 в культуру лимфоидных клеток в концентрациях 200 и 100 мкг/мл, что говорило о большей эффективности высоких доз аллергена. Также было показано, что sWl со степенью модификации 95% индуцировал слабый, близкий к контролю пролиферативный ответ, т.е. обладал низкой иммуногенностью, Аналогичные результаты были получены при изучении in vitro пролиферативно-го ответа культуры клеток лимфатических узлов к различным концентрациям W1 hsWI иммунизированных W1 мышей линии HLA-DQ8.

Рис. 3. Пролиферативный ответ in vitro клеток лимфатических узлов HLA-DQ6 мышей на стимуляцию различными концентрациями W1 или sWl.

Таким образом, показано, что Т-реактивные эпитопы были сохранны в модифицированном сукцинилированием аллергене со степенями модификации 56%, 79%, 85% и 91%. Сохранность Т-клеточных эпитопов при данных степенях модификации sWl подтверждалась способностью модифицирован-

ного су кцилидированием аллергена при концентрациях 100 мкг/мл и меньше стимулировать аллерген-специфический Т-клеточный клон практически в той же степени (р>0,05 ), что -и наггивный аллерген.

Как известно, иммунологическая активность аллергенов реализуется посредством их способности индуцировать синтез в организме и антител. Для изучения возможности индукции синтеза в организме 1»Е антител при сравнительном воздействии модифицированных и нативных аллергенов нами использовалась реакция пассивной кожной анафилаксии (РПКА) на мышах, иммунизированных сукцинилированным аллергеном пыльцы амброзии с различными степенями модификации. Было показано, что иммунизация мышей (СБАхС57ВЬ/6)Р1 сукцинилированным аллергеном со степенями модификации 79%, 85% и 95% приводит к более низкому анти-ЧЛ1] антител »образованию в сравнении с контролем (иммунизация ^модифицированным причем наиболее существенное (р<0,01) понижение 1§Н ответа было выявлено при использовании 5\У1 с 85% и 95% модификацией (рис. 4).

7 6 5 4 3 2 1 О

12 3*5

М? диь V/. нцмуциодшл; ИАЯДОа ФПрой имч^эдздц»*', З-З-я тдемйтй^в иммунимивн: 4-1-я медепя 3-й имиуиизации; 5- 3-я коделя З н ммиуншации

а Л'1 (немодифицированный) О модификации)

И (79% модификации) 0 (9 ификации

Рис.

4 Анти-\У1 1е,Е ответ у мышей (СВАхС57ВЬ/6)Г1 после иммунизации \¥1 или различной степени модификации.

При изучении синтеза антител у этих же мышей методом имму-ноферментного анализа установлено, что динамика анти \У1 ^в-ответа (рис.5) отличалась от антиЛУ! Зе£ ответа. Было показано, что уже на третьей неделе после повторной иммунизации (79% и 85% модификации) Г§0 ответ практически (р>0,05) не отличался от такового, наблюдавшегося после иммунизации не модифицированным XV] аллергеном. Аналогичная картина наблюдалась и в исследованиях, проведенных на первой и третьей неделях после третьей иммунизации. Что касается ответа на sWl (95%), то в данном исследовании показано, что он индуцировал более низкий анти-\У 1 1^-Ответ после второй иммунизации как по сравнению с на-тивным, так и с 5X^4(79% и 85% модификации). К третьей неделе после третьей иммунизации титры анти-1^ ^С-антител снижались по сравнению с предыдущим исследованием почти в 2 раза и при этом во всех группах были идентичны.

1-12 день первой иммунизации; 2- 1-я неделя агорой иммунизации; 3 -3-я и ад ел я второй иммунизации; 4-1 -я недепя 3-й иммунизации; 5-3-я неделя 3-й иммунизации

В \М(немодифнцированный} в аИ1(79% модификации) о з\¥1{85% модификации) 0 sW1(95% модификации)

Рис. 5. Анти-УЛ [«в ответу мышей (С В Ах С57ВЬ/6)Р1 после иммунизации \У5 или бХУ] различной степени модификации.

Для изучения аллергенности модифицированного сукцинилирова-нием (sWl) с 91% модификации и немодифицированного аллергена пыльцы амброзии (Wl) in vivo были использованы прик-тесты у 20 пациентов с подтвержденной сенсибилизацией к данному аллергену. Положительные кожные реакции с цельными аллергенами W1 и sWl и с концентрацией аллергенов 10"1 были выявлены у всех пациентов. С концентрацией аллергенов 10'2 положительные прик-тесты выявлены у 11 (55%) пациентов с модифицированным аллергеном sWl и у всех пациентов с ^модифицированным аллергеном. Показано наличие положительных кожных реакций у 8 (40%) пациентов к W1 и только у 1-го (5%) пациентов к sWl при концентрации аллергенов 10"3.

Таким образом, установлена прогрессивная динамика уменьшения волдырной реакции при использовании модифицированного аллергена. Достоверные различия между модифицированным и немодифицирован-ным аллергенами в прик-тесте определены как с цельными аллергенами, так и в 10"', 10"2, 10'3, 10"4 разведениях. При вычислении кожного индекса были выявлены достоверные (р<0,05) различия в пробах с цельными аллергенами и с аллергенами в концентрациях 10"1, 1С2, 10"3 между W1 и sWl. В соответствии с полученными результатами, было показано, что для достижения эквивалентного кожного ответа требовалось 2-3-х кратное увеличение lg концентрации sWl относительно немодифицированного экстракта пыльцы амброзии, т.е сукцинилированный W1 аллерген был в 100 -1000 раз менее реактогенен, чем немодифицированный W1 и поэтому более безопасен.

Данные исследования в комплексе с другими доказательствами, продемонстрировали снижение аллергенности модифицированных сук-цинилированием аллергенов при сохранении их иммуногенности.

Изучение аллергенности и цитокин-продуцирующей активности полимеризованных глютаральдегидом аллергенов.

Методом проведения скарификационных проб было изучено влияние полимеризации глютаральдегидом на аллергенные свойства экстрак-

тов пыльцы амброзии и домашней пыли. Показано, что полимеризован-ный глютаральдегидом аллерген амброзии в конечной концентрации 1 PNU/мл проявлял аллергенную активность (табл.1) только в 14,3% случаев. В более низких концентрациях (от 0.1 и ниже) аллергенная активность в кожных тестах у модифицированного аллергена не проявлялась, в то время как у 2/3 больных в пробах с нативным аллергеном она была определяемой в концентрации 0.1 PNU/мл. 100% отсутствие кожной реакции определялось только в максимально исследованном разведении -0.0001 PNU/мл.

Таблица 1.

Сравнительная аллергенность нативных и полимеризованных глютаральдегидом аллергенов амброзии и домашней пыли

Количество положительных реакций в ска-

рификационных тестах при конечных кон-

№ Аллерген центрациях аллергенов (РРШ/мл)

10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001

1. Экстракт амброзии (ЭА) 14 14 9 4 3 ; 0

2. Модифицированный ЭА 14 2 0 0 0 0

3. Экстракт домашней пыли (ЭДП) 12 12 10 10 3 0

4. Модифицированный ЭДП 12 3 0 0 0 0

Аналогичные результаты были получены при исследовании поли-меризованного глютаральдегидом аллергена домашней пыли. Модификация аллергена домашней пыли приводила у 75% больных к отсутствию кожной гиперчувствительности к исследованному аллергену в концентрации 1 РКи/мл. В остальных концентрация реакция не была определена ни у одного из больных. В концентрациях от 1 до 0.01 РЫи/мл реакция на нативный аллерген была положительной почти у всех больных. Даже в концентрации 0.001 PNU/мл положительная кожная реакция на нативный аллерген определялась у 25% пациентов. Таким образом, в

данных исследованиях нами подтверждены полученные ранее данные [Р.А.Ханферян, 1998-2005 гг.] о резком снижении аллергенности экстрактов аллергенов после их полимеризации глютарал ьдег идо м.

При изучении влияния модифицированных полимеризацией аллергенов на синтез основных I ре гулятор ны х цитокинов установлено, что при инкубации мононуклеаров периферической крови (МПК), полученных от больных с сенсибилизацией к пыльце амброзии с нативным аллергеном пыльцы амброзяи в концентрации 10 РЫи/мл увеличивался по сравнению с контролем синтез всех исследованных 1^Е-регуляторных цитокинов (11,4, 1113, у1Ж), При этом синтез 1Ь4 повышался (рис.6) почти на 50% (р<0,01), - на 35% (р<0,05), 1ЫЗ - в 2 раза (р<0,01).

12тТ

Рис. 6. Продукция ^Е-регуляторных цитокинов (1Ь4,1ЫЗ и yIFN) культурой МНК периферической крови в присутствии наш вн о го аллергена

амброзии.

При инкубация мононуклеаров периферической крови (МПК) с полимер изо ванным аллергеном пыдьцы амброзии в аналогичной концентрации 10 РЫи/мл результат в значительной мере отличались от эффектов наш еш о го аллергена. Установлено, что инкубация МПК с поли-меризованным аллергеном (рис,7) приводила к увеличению синтеза

-yIFN более чем в 4 раза (р<0,001). В то же время отмечалось снижение синтеза 1Ь4 (р<0,05). Уровень синтеза 11ЛЗ не изменялся, (р>0,05).

■ Инкубация без лолимериэовзнного аллергена

□ Инкубация с поп и мер изо ванным аллергеном

Рис. 7. Продукция 1дЕ-регуляторных цитокинов {1Ь4, ТЫЗ и уТБЫ) культурой МНК периферической крови в присутствии пол и мер изо ванного аллергена амброзии.

При анализе соотношения у1РГ4/1Ь4 в условиях инкубации соответственно с нативным и полимеризованным глютаральдегидом аллергеном амброзии, после инкубации с нативным аллергеном было выявлено снижение данного соотношения с ¡.35 до ¡.21 (р<0,05). В отличие от этого, в условиях инкубации с полимеризованным аллергеном показано, что соотношение у1Р>)/1Ь4 не только не снизилось, а увеличилось (р<0,0!) более чем в 5 раз (с 1.35 до 6.78), преимущественно за счет стимуляции синтеза уДТМ. Таким образом эффективность АСИТ полимери-зовашшми аллергенами в значительной мере может быть обусловлена их влиянием на продукцию ^Е-регуляторных цитокинов, главным образом стимуляцией синтеза уШМ.

Изучение частоты IgE-позитивных реакций к рекомбинантным аллергенам тимофеевки и полыни на Юге России.

Нами была изучена способность рекомбинантных аллергенов тимофеевки rPhl pi, rPhl р2, rPhl р5, rPhl рб и полыни rArt vl связываться со специфическими IgE, у лиц, с выявленной сенсибилизацией к нативным аллергенам соответственно тимофеевки и полыни на Юге России. Было установлено (рис.8) наличие сенсибилизация к рекомбинатным аллергенам тимофеевки у 54 пациентов из 78 пациентов с положительными прик-тестами к нативным аллергенам тимофеевки, что составило 69,2%. Специфические IgE к rPhl pi были выявлены в 30,7% случаев, к rPhl р5 в 23,1% случаев, к rPhl р2 в 7,7%, к rPhl рб в 7,7%. Специфические IgE ко всем главным аллергенам тимофеевки rPhlpl, rPhlp2, rPhlp5, гРЫрб бьши выявлены только в 7,7% случаев, специфические IgE к двум рекомбинантным аллергенам rPhlpl и rPhlp5 - в 15,4% случаев.

При изучении специфичности рекомбинантного аллергена полыни rArt vl сенсибилизация выявлена у 36 (31,6%) из 114 пациентов с подтвержденной сенсибилизацией к пыльце полыни. Отсутствие соответствия между частотой положительных кожных тестов к нативному экстракту пыльцы полыни и относительно низкой частотой IgE-связывающей активности рекомбинантного rArt vl позволяет говорить о том, что, по крайней мере, часть положительных реакций на нативный аллерген полыни является результатом реакции на другие антигены, вероятно, имеющие перекрестные свойства с антигенами других видов пыльцы.

ВЫВОДЫ

1. Сукцинилирование аллергена амброзии приводит к снижению анти-W1 IgE-антителообразования у иммунизированных мышей, причем наиболее существенное понижение IgE-ответа наблюдается при использовании максимально высоких степеней модификации.

2. Существуют отличия анти-Wl IgG-ответа от анти-Wl IgE-ответа. Так, после иммунизации мышей sWl(79% и 85% модификации) IgG-ответ, оставаясь пониженным после второй иммунизации, достигает уровня IgG-ответа немодифицированного W1 после третьей иммунизации. sWl (95%) индуцирует слабый анти-Wl IgG-ответ после второй иммунизации, однако, становится аналогичным контролю после 3-й иммунизации.

3. Высвобождение гистамина из базофилов крови больных с сенсибилизацией к пыльце амброзии было существенно подавлено при воздействии sWl со степенью модификации 79% и выше. То обстоятельство, что sWl (56%) индуцирует ВГ такое же как и в контроле, свидетельствует о сохранности некоторой части немодифицирован-ных IgE -связывающих эпитопов, достаточной для индукции гис-таминолиберации.

4. Стимуляция in vitro культуры клеток лимфоузлов иммунизированных W1 мышей линий HLA-DQ6 и HLA-DQ8 W1 или sWl различной степени модификации приводит к дозозависимому пролифера-тивному ответу. sWl с 56%, 79%, 85% и 91% степенью модификации сохраняет способность индуцировать in vitro Т-клеточный ответ, тогда, как sWl со степенью модификации 95% обладает слабым пролиферативным ответом, близким к контролю.

5. Модифицированный сукцинилированием аллерген sWl проявляет значительно менее выраженную аллергенность в прик-тесте по сравнению с нативным аллергеном.

6. У больных с подтвержденной сенсибилизацией к нативному аллергену пыльцы тимофеевки, наличие специфических ^Е антител к исследованным рекоМбинантым аллергенам тимофеевки было выявлено в 69,2% случаев. При этом к гРЫ р1 положительный ответ был получен у 30,7% всех обследуемых больных, к гРЫ р5 у 23,1%, к гРЬ р2 у 7,7%, к гРЫ рб у 7,7%. В 7,7% случаев была выявлена одновременная сенсибилизация к 4 рекомбинантным аллергенам и в 15,4% случаев одновременная сенсибилизация к двум рекомбинантным аллергенам.

7. У больных с подтвержденной сенсибилизацией к нативному аллергену пыльцы полыни, наличие специфических ^Е антител к реком-бинантному аллергену полыни г АЛ VI выявлено у 31,6% больных.

8. Полимеризация аллергенов пыльцы амброзии и домашней пыли глютаральдегидом резко снижает их аллергенность и изменяет их способность к продукции ^Е-регуляторных цитокинов (1Е4, ПЛЗ, уШЫ). Так, полимеризованный аллерген пыльцы амброзии, по-; сравнению с нативным, приводит к резкому повышению продукции уПРЫ и снижению уровня 1Ь4 мононуклеарными клетками больных амброзийным поллинозом.

9. Снижение аллергенности аллерговакцин при сохранении их имму-ногенности путем модификации сукцинилированием и полимеризации глютаральдегидом позволит избежать нежелательных местных и системных побочных реакций при проведении специфической иммунотерапии и значительно быстрее достигать высоких концентраций аллергенов, что повысит безопасность и сократит длительность аллерговакцинации.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Savchenko Е.A., Babakhin А.А., Dubuske L.M., Khanferyan R.A., Khaitov R.A, Nolte H. Immunological Features of Succinilated Ragweed Allergen. // The Journal of Allergy and Clinical Immunology - 1998,-Vol. 101, N 1, part 2.- P.202.

2. Бабахин А.А., Андреев C.M., Савченко E.A., Ханферян P.A., ДюБу-ске JI.M., Гущин И.С., Хаитов Р.М Изменение иммунологических свойств сукцинилированного аллергена. //Материалы конференции РААКИ,- Москва, 1998. - С.78.

3. Савченко Е.А. Бабахин А.А., Андреев С.М.. Петрухина А.О, Ханферян Р.А. Регуляция специфического иммунного ответа химически модифицированными аллергенами. //Медиаторы аллергии и астмы: материалы международной конференции. - Сочи, 2001.-С.67.

4. Савченко Е.А., Ханферян Р.А. Эффективность специфической иммунотерапии аллергоидом пьшьцы амброзии при пыльцевой астме. //Медиаторы аллергии и астмы: материалы международной конференции. - Сочи, 2001.-С.66.

5. Savchenko Е.А., Khanferyan R.A, Andreev S.M., Petrukhina А.О. Modulation of Allergic Response by Succinilated Ragweed Allergen. //XX Congress EAACI - Berlin, 2001. - P.128.

6. Савченко E.A., Ханферян Р.А. Эффективность специфической аллер-говакцинации в лечении больных аллергическим ринитом. //Аллерговакцинация: новые стратегии и перспективы: материалы симпозиума с международным участием. - Сочи, 2002. - С.31-33.

7. Savchenko Е. A., Khanferyan R.A. The Efficacy of the Immunotherapy by Polymerized Ragweed Allergens in Asthmatic Patients. //XXI Congress EAACI -Naples, 2002,- P.427.

8. Savchenko E.A., Khanferyan R.A., Babakhin A.A., Andreev S.M., DuBuske L.M. Immunological properties of chemically modified ragweed

allergens. //XXII Congress EAACI -Paris, 2003.- Allergy-2003.-Vol.58, Suppl.74. - P. 387.

9. Babakhin A.A., Andreev S.M., Chapoval S.A., Savchenko E.A., DuBuske L.M. Immunological activity of chemically modified allergens. //XXII Congress EAACI - Paris, 2003. - Allergy.-2003.-Vol.58, Suppl.74 - P. 213.

10. Savchenko E.A., Babakhin A.A., Andreev S.M., Khanfeiyan R.A. Immunological properties of complex chemically modified allergen and immunomodulator Polyoxidonium. //Word Allergy Congress-Munich, 2005 - J.Allergy and Clinical Immunology International - 2005. - Suppl. N.l -P.502.

11. Ханферян P.A., Савченко E.A., Бабахин A.A., Андреев C.M. Имму-ногенность и аллергенность модифицированных форм аллергенов. //Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. - №10 (91).-С.114-118.

Формат AS

Подписано в печать 16.03.2007 г. Набор компьютерный.

_Гарнитура Times. У.п.л. 1,25 Тираж 100 экз. Заказ № 012-07_

Отпечатано методом ризографии в типографии ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» г.Краснодар, ул. Седина, 4

Оглавление диссертации Савченко, Елена Анатольевна :: 0 ::

Введение (общая характеристика работы).

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Аллерген-специфическая иммунотерапия как основной метод лечения атопических заболеваний.

1.2. Современные представления о механизмах аллерген-специфической иммунотерапии.

1.3. Основные направления в разработке новых форм лечебных аллергенов.

1.4. Модифицированные аллергены.

1.5. Синтетические вакцины.

1.6. Модификация аллергенов методом сукцинилирования.

1. 7. Рекомбинантные аллергены.

1.7.1. Применение рекомбинантных аллергенов для диагностики аллергических заболеваний.

1.7.2. Применение аллергенов и генетическая иммунизация.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Приготовление химически модифицированного экстракта пыльцы амброзии методом сукцинилирования.

2.2. Определение аллергенности sWl.

2.2.1. Определение высвобождения гистамина после стимуляции базофилов крови специфическим аллергеном стекловолоконным методом.

2.2.2. Метод торможения ИФА.

2.2.3. Иммунизация трансгенных мышей и выявление степени сенсибилизации в РБТЛ с нативным (W1) и сукцинилированным s W1) аллергенами.

2.2.4. Иммунизация животных и определение сывороточных антител.

2.2.5. Определение аллергенности с помощью РПКА.

2.3. Приготовление химически модифицированного аллергена пыльцы амброзии и домашней пыли методом полимеризации глютаральдегидом.

2.4. Определение влияния нативного и полимеризованного глютаральдегидом аллергена пыльцы амброзии на синтез IgE-регуляторных цитокинов (IL-4, IL-13, IFN-y).

2.5. Проведение и оценка прик-тестов и скарификационных тестов.

2.6. Изучение аллергенспецифических IgE к рекомбинантным аллергенам.г.

2.6.1. Метод ферментного иммуносорбентного анализа с использованием рекомбинантных аллергенов.

2.7. Статистическая обработка материала.

Глава 3. Изучение иммуногенности и аллергенности модифицированных сукцинилированием аллергенов.

3.1. Сравнительное исследование высвобождения гистамина из базофилов при воздействии sWl с различной степенью модификации

3.2. Исследование аллергенности сукцинилированного аллергена методом иммуноферментного анализа (ИФА).

3.3. Изучение пролиферативной активности сукцинилированного аллергена sWl.

3.4. Оценка кожной чувствительности к модифицированному сукцинилированием аллергену, нативному аллергену и гистамину.

Глава 4 Сравнительная характеристика аллергенности и цитокин-продуцирующей активности полимеризованных глютаральдегидом аллергенов.

4.1. Аллергенность полимеризованных аллергенов.

4.2. Влияние нативных и полимеризованных аллергенов на синтез

IgE-регуляторных цитокинов.

Глава 5. Изучение распространенности IgE реактивности к рекомбинантным аллергенам тимофеевки и полыни на Юге

России.

5.1. Распространенность IgE реактивности к рекомбинантным аллергенам тимофеевки.

5.2 Распространенность IgE реактивности к рекомбинантным аллергенам полыни.

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Савченко, Елена Анатольевна, автореферат

В настоящее время проблема аллергизации населения выдвигается в ряд важнейших проблем современной медицины, так как число аллергических заболеваний и их осложнений постоянно растет [22].

Аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ), применяемая для лечения аллергопатологии, на сегодняшний день является единственным методом противоаллергического лечения, обусловливающим воздействие на все патогенетические звенья аллергического процесса и обеспечивающим длительный клинический и профилактический эффект. Несмотря на значительные успехи в области фармакотерапии аллергических заболеваний, позволяющие длительно контролировать состояние больных, различные антиаллергические препараты не могут остановить прогрессирование заболевания или полностью его прекратить. Только применение АСИТ способствует снижению развития более тяжелых форм заболевания на фоне уменьшения потребления антиаллергических фармакологических препаратов, сохранению длительного эффекта ремиссии после прекращения лечения, обеспечивает отсутствие расширения спектра аллергенов, к которым может развиться сенсибилизация [14,17].

В целом эффективность правильно подобранной аллерген-специфической иммунотерапии у больных превышает 80%, причем успешное проведение АСИТ ассоциируется как с уменьшением выраженности клинической симптоматики, так и с изменением ряда иммунологических показателей, среди которых снижение уровня аллерген-специфического IgE и увеличение уровня аллерген-специфического IgG, что свидетельствует о возможности фенотипической коррекции на конкретный антиген [14,83].

В течение последних лет частота применения АСИТ стала несколько снижаться, что связано с различными причинами, в том числе использованием для фармакотерапии новых эффективных антиаллергических средств второго и третьего поколения, а также наличием достаточно большого количества побочных эффектов при проведении АСИТ, что, в частности, объясняется содержанием в аллергенных экстрактах недостаточно охарактеризованных аллергенных и неаллергенных компонентов, а также большой длительностью терапии [16,50].

Все вышеизложенное и обусловило проведение настоящего исследования.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

2. Провести сравнительный анализ аллергенных и иммуногенных свойств нативных и новых рекомбинантных аллергенов тимофеевки (rPhl pi, гРЫ р2, rPhl р5, rPhl рб) и полыни (rArt vl).

4. В сравнительных исследованиях in vitro изучить влияние нативных и модифицированных полимеризацией аллергенов на продукцию IgE регуляторных цитокинов (IL-4, IFN-y и IL-13) мононуклеарами периферической крови сенсибилизированных больных.

Новизна результатов исследования.

1. Впервые в России проведено исследование новых диагностических рекомбинантных аллергенов тимофеевки rPhl pi, rPhl р2, rPhl р5, rPhl рб и полыни rArt vl и исследована их способность связываться со специфическими IgE-антителами пациентов с соответствующей сенсибилизацией.

3. Изучена динамика анти-Wl IgG-ответа при иммунизации модифицированным (sWl) и немодифицированным (W1) аллергенами.

4. Получены данные, позволившие продемонстрировать эффективность нового варианта снижения аллергенности аллергена при сохранении его иммуногенности.

5. Проведен сравнительный анализ влияния нативных и полимеризованных глютаральдегидом аллергенов пыльцы амброзии на продукцию IgE - регуляторных цитокинов (IL-4, IFN-y IL-13) мононуклеарами периферической крови больных амброзийным поллинозом.

Теоретическая значимость исследования.

Полученные факты углубляют представление о механизмах действия модифицированных аллергенов при АСИТ и возможности применения рекомбинантных форм аллергенов для специфической диагностики пыльцевой аллергии.

Практическая значимость исследования.

Практическое значение работы заключается в дальнейшем совершенствовании лечебных и диагностических аллергенов, возможности применения модифицированных и рекомбинантных форм аллергенов для аллерген-специфической иммунотерапии, используемой для патогенетического лечения больных с аллергопатологией.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Химическая модификация аллергена пыльцы амброзии методом сукцинилирования приводит к значительному снижению его аллергенности, особенно при использовании максимально высоких степеней модификации.

2. Модифицированный сукцинилированием аллерген пыльцы амброзии сохраняет способность взаимодействовать с аллергенспецифичными Т-клетками. sWl с 56%, 79%, 85% и 91% степенью модификации сохраняет способность индуцировать in vitro Т-клеточный ответ, причем он носит дозозависимый характер.

3. Эффективность АСИТ полимеризованными глютаральдегидом аллергенами в значительной мере обусловлена их влиянием на продукцию IgE-регуляторных цитокинов, главным образом стимуляцией синтеза IFN-y.

4. Достаточно высокий уровень сенсибилизации к рекомбинантным аллергенам тимофеевки у лиц с положительной реакцией на нативный аллерген делает возможным использование рекомбинатных аллергенов тимофеевки для in vitro и in vivo диагностики аллергии к пыльце злаковых трав.

5. Относительно низкая частота IgE-связывающей активности рекомбинантного rArt v 1 у лиц с достоверной сенсибилизацией к нативному аллергену пыльцы полыни говорит о необходимости проведения дополнительных исследований для выявления полного спектра рекомбинантных аллергенов полыни, характерных для данного региона.

Апробация материалов диссертации.

Результаты диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях врачей Юга России IX (г. Краснодар, 2003 г.), XII (г. Сочи, 2004 г.), XIII (г. Краснодар, 2005 г.), XVI (г. Сочи, 2006 г.), Европейских конгрессах аллергологов и клинических иммунологов EAACI (Берлин, 2001 г., Неаполь 2002 г., Париж, 2003 г., Мюнхен, 2005г.). По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Библиография включает 208 литературных источников (48 отечественных и 160 иностранных авторов). Диссертация иллюстрирована 11 рисунками, содержит 8 таблиц и 3 приложения.

Заключение диссертационного исследования на тему "Иммуногенность и аллергенность модифицированных и рекомбинантных форм аллергенов"

ВЫВОДЫ

3. Высвобождение гистамина (ВГ) из базофилов крови больных с сенсибилизацией к пыльце амброзии было существенно подавлено при воздействии sWl со степенью модификации 79% и выше. То обстоятельство, что sWl (56%) индуцирует ВГ такое же, как и в контроле (W1), свидетельствует о сохранности некоторой части немодифицированных IgE -связывающих эпитопов, достаточной для индукции гистаминолиберации.

4. Стимуляция in vitro культуры клеток лимфоузлов иммунизированных W1 мышей линий HLA-DQ6 и HLA-DQ8 W1 или sWl различной степени модификации приводит к зависимому от концентрации пролиферативному ответу. sWl с 56%, 79%, 85% и 91% степенью модификации сохраняет способность индуцировать in vitro Т-клеточный ответ, тогда, как sWl со степенью модификации 95% обладает слабым пролиферативным ответом, близким к контролю.

6. У больных с подтвержденной сенсибилизацией к нативному аллергену пыльцы тимофеевки, наличие специфических IgE-антител к исследованным рекомбинантым аллергенам тимофеевки было выявлено в 69,2% случаев. При этом к rPhl pi положительный ответ был получен у 30,7% всех обследуемых больных, к rPhl р5 у 23,1%, к rPh р2 у 7,7%, к rPhl рб у 7,7%. В 7,7% случаев была выявлена одновременная сенсибилизация к 4 рекомбинантным аллергенам и в 15,4% случаев одновременная сенсибилизация к двум рекомбинантным аллергенам.

7. У больных с подтвержденной сенсибилизацией к нативному аллергену пыльцы полыни, наличие специфических IgE-антител к рекомбинантному аллергену полыни rArt vl выявлено у 31,6% больных.

8. Полимеризация аллергенов пыльцы амброзии и домашней пыли глютаральдегидом резко снижает их аллергенность и изменяет их способность к продукции IgE-регуляторных цитокинов (IL-4, IL-13, IFN-y). Так, полимеризованный аллерген пыльцы амброзии, по-сравнению с нативным, приводит к резкому повышению продукции IFN-y и снижению уровня IL-4 мононуклеарными клетками больных амброзийным поллинозом.

9. Снижение аллергенности аллерговакцин при сохранении их иммуногенности путем модификации сукцинилированием и полимеризации глютаральдегидом позволит избежать нежелательных местных и системных побочных реакций при проведении специфической иммунотерапии и значительно быстрее достигать высоких доз аллергенов, что повысит безопасность и сократит длительность аллерговакцинации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Аллергические заболевания являются одной из серьезных проблем, привлекающей все более пристальное внимание врачей. В большинстве регионов мира неуклонно растет число больных бронхиальной астмой, аллергическим ринитом, конъюнктивитом, поллинозом, крапивницей, атопическим дерматитом. По данным ГНЦ Института иммунологии ФМБА России от 13 до 35% населения нашей страны страдают аллергическими заболеваниями [23,27].

Методы фармакологической терапии аллергопатологии не всегда являются достаточно эффективными, так как способствуют лишь устранению симптомов аллергии, но не влияют на механизмы формирования аллергического процесса. После отмены лекарственных препаратов при отсутствии элиминации причиннозначимого аллергена клинические проявления аллергического заболевания возобновляются.

Единственным эффективным патогенетическим методом лечения аллергических заболеваний атопической природы, воздействующим на все значимые звенья аллергического процесса является аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ) [27]. Данный метод лечения аллергопатологии применяется в медицинской практике за рубежом с 1911 года, начиная с работ английских врачей L.Noon и G. Freeman, в нашей стране - cl 961г. [153]. [200]. Применение АСИТ предупреждает развитие астмы у пациентов с аллергическим ринитом, ограничивает расширение спектра сенсибилизации, уменьшает потребность больных в лекарственных средствах, увеличивает срок ремиссии аллергических болезней [27].

К сожалению, АСИТ имеет ряд недостатков, в том числе наличие риска развития анафилактических реакций у больных с гипереактивностью к специфическим аллергенам, большая длительность терапии, применение инъекционных форм аллерговакцин. Эти проблемы, в частности, объясняются содержанием в аллергенных экстрактах, применяемых для лечения, недостаточно охарактеризованных аллергенных и неаллергенных компонентов, недостаточно полной химической очисткой и стандартизацией аллергенов.

Специфическая диагностика аллергии и успешное проведение АСИТ требует высококачественных препаратов с низкими анафилактогенными и выраженными иммуногенными свойствами.

Для повышения клинической эффективности АСИТ и уменьшения риска побочных эффектов современные исследования направлены на получение аллергенов со сниженной аллергенной и сохраненной иммуногенной активностью. Последнее достигается модификацией аллергенов полимеризацией (формальдегидом, глютаровым альдегидом и пр.), сукцинилированием, получением сорбированных форм (на L-тирозине, на гидроокиси алюминия), применением форм пролонгированного действия, использованием разнообразных природных и синтетических носителей, конъюгатов аллергических препаратов с иммуномодуляторами (аллерготропины), а также созданием рекомбинантных форм аллергенов, открывающих новые возможности в диагностике аллергопатологии и проведении иммунотерапии [26].

Основной целью исследования новых форм аллергенов является создание иммунотерапевтических препаратов со сниженной аллергенностью, либо полностью лишенных данного свойства, однако с сохранением достаточно высокой иммуногенности. Необходимо, чтобы аллерген после модификации обладал двумя основными свойствами: максимально сниженной аллергенностью (неспособностью связывать специфические IgE за счет блокады В-клеточных эпитопов) и сохраненной иммуногенностью (способностью реагировать с Т-клетками за счет неизменных Т-клеточных эпитопов) [202]. Это в свою очередь создает возможность активации аллергенспецифичных Thl-клеточных клонов со сменой профиля интерлейкинов (с ТЬ2-типа на Thl-тип) и последующим «переключением» В-клеток с продукции аллерген-специфического IgE на продукцию аллерген-специфического IgG, что в конечном счете обеспечивает эффект гипосенсибилизации [203].

В проведенных нами исследованиях было показано, что модификация аллергена пыльцы амброзии сукцинилированием приводила к сохранению иммуногенных свойств и уменьшению IgE-ответа при введении препарата животным. Необходимо отметить, что данный эффект носил дозозависимый характер, а также был обусловлен степенью модификации аллергена. Так сукцинилированный аллерген (sWl) со степенью модификации 95% обладал слабым пролиферативным ответом, т.е. низкой иммуногенностью, a sWl со степенями модификации 56%, 79%, 85% и 91% сохранял способность индуцировать in vitro Т-клеточный ответ. Таким образом, Т-реактивные эпитопы были сохранны в модифицированном сукцинилированием аллергене с данными степенями модификации и их сохранность подтверждала способность модифицированного аллергена стимулировать аллерген-специфический Т-клеточный ответ практически в той же степени, что и нативный аллерген.

Кроме того, полученные нами данные позволяют предположить, что результаты исследования аллергенных свойств и, соответственно, в будущем лечебной активности сукцинилированного аллергена обусловлены как иммуногенностью препарата, так и снижением уровня IgE-анител, что было показано в тестах по снижению гистаминолиберации путем специфической активации базофилов к медиатору аллергии гистамину, а также методом иммуноферментного анализа. Этот эффект является одним из доказанных механизмов АСИТ [47,147].

Снижение IgE-индуцирующей способности сукцинилированного аллергена при сохранении иммуностимулирующей активности, оцениваемой по продукции IgG-антител, может быть объяснено блокадой IgE-связывающих ( В-клеточных) эпитопов [14].

Подтверждение снижения аллергенности модифицированного (sWl) в сравнении с ^модифицированным аллергеном пыльцы амброзии было получены in vivo при проведении прик-тестов у лиц с установленной сенсибилизацией к данному аллергену. В соответствии с полученными результатами требовалось 2-3-х кратное увеличение концентрации sWl относительно нативного аллергена для достижения эквивалентного ответа, что также свидетельствовало о том, что сукцинилированный W1 аллерген в 100 - 1000 раз менее реактогенен, чем немодифицированный и более безопасен. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что химическая модификация аллергена пыльцы амброзии путем сукцинилирования приводит к значительному снижению его аллергенности, вместе с тем сохраняется его способность взаимодействовать с аллергенспецифичными Т-клетками, что позволяет надеяться на возможность применения данного метода модификации для создания аллерговакцин.

Однако химическая модификация аллергенов путем сукцинилирования является не единственным способом снижения реактогенности лечебных аллергенов. Ранее были получены и эффективно используются аллергоиды, полимеризованные глютаральдегидом в традиционном варианте [32,44], индивидуальный антиген Е пыльцы амброзии [149, 150], обработанный глютаровым альдегидом, депигментированные полимеризованные аллергены пыльцы злаковых трав и другие аллергены [126].

Следует заметить, что механизмы подавления синтеза специфических IgE при использовании аллергенов, полимеризованных глютаральдегидом, не были достаточно изучены. Вероятно, наиболее важным, и это было показано в нашей работе, является стимуляция синтеза 4 i;

IFN-y и снижение продукции IL-4 мононуклеарными клетками больных амброзийным поллинозом. Полученные нами данные совпадают с результатами научных работ, выполненных ранее. [100,105,156].

Нами подтверждены полученные ранее данные [44,45,119] о резком снижении аллергенности экстрактов аллергенов пыльцы амброзии после их полимеризации глютаральдегидом. В исследованиях in vivo было показано, что полимеризованные глютаральдегидом аллергены пыльцы амброзии и домашней пыли проявляли значительно менее выраженную аллергенность в скарификационных тестах по сравнению с нативным аллергеном.

Одним из важнейших и перспективных направлений в создании аллерговакцин является получение рекомбинаитных аллергенов, поскольку именно специфичность ответа на причинно-значимый аллерген очень важна для диагностики и лечения аллергических заболеваний. В последнее время расшифрована нуклеотидная последовательность наиболее значимых аллергенов и появилась возможность получать их в виде рекомбинаитных молекул [33]. На сегодняшний день получено более 100 рекомбинаитных аллергенов из пыльцы растений (злаковых, сорных трав, деревьев), клещей, насекомых, плесени, животных и пищевых продуктов [14,33]. Основой создания рекомбинаитных аллергенов и их гипоаллерегенных производных является выявление наиболее значимых аллергенов и идентификация их основных В- и Т-клеточных эпитопов [33].

Следует отметить, что для оценки качества рекомбинатных аллергенов необходимо определять, прежде всего, их иммунологическую активность in vitro и in vivo, с целью выявления идентичности таких препаратов с натуральными аллергенами [53] в различных климатических регионах.

В нашей работе был выявлен достаточно высокий уровень сенсибилизации к рекомбинантным аллергенам тимофеевки у лиц с положительной реакцией на нативный аллерген, что коррелируют с результатами научных работ, в которых также отмечается высокий уровень сенсибилизации к рекомбинантным аллергенам тимофеевки в различных популяциях Европы, Японии, Канады [121,122,167].

Таким образом, можно констатировать, что данные рекомбинатные аллергены тимофеевки могут быть использованы для in vitro и in vivo диагностики аллергии к пыльце злаковых трав, а в дальнейшем возможно и для проведения аллерген-специфической иммунотерапии на Юге России с обеспечением низкого риска развития побочных анафилактоидных эффектов. Однако существует достаточное количество нерешенных вопросов. Согласно литературным данным, анализ Европейской и Африканской популяций больных аллергией с использованием рекомбинантых аллергенов, выявил значительные различия между профилями реактивности IgE у различных популяций, что не было выявлено при тестировании с цельными аллергенными экстрактами. [132,133].

Анализируя полученные нами при проведении исследований с рекомбинатным аллергеном полыни rArt vl результаты, можно предположить, что относительно низкая частота IgE-связывающей активности рекомбинантного rArt vl была обусловлена различиями в спектре аллерген-специфических антител, выявляемых в данной популяции. Это говорит о необходимости дополнительной характеристики местных аллергенных компонентов и на их основании применения соответствующей иммунотерапии в популяциях, проживающих в различных климато-географических регионах.

В качестве подтверждения данной концепции приведем результаты исследований, проведенных группой ученых Himly М., Jahn-Schmid В. и соавторы [106,112], которые выделили две группы пациентов, с сенсибилизацией к пыльце полыни: одна группа показала IgEсвязывающую активность к обоим аллергенам (nArt vl и rArt vl), другая -реагируя с nArt vl, но демонстрирует низкий уровень или отсутствие связывания с rArtvl, что объясняется, возможно, изменением пространственной углеводной структуры рекомбинантной молекулы, а также существованием различных изоформ в природном аллергене полыни.

Таким образом, необходимы дополнительные исследования, которые позволят более точно судить об истинной чувствительности к рекомбинантным аллергенам.

На наш взгляд особый интерес в генноинженерной технологии представляет возможность использование рекомбинантных аллергенов для более точной специфической диагностики аллергических заболеваний, стандартизации аллергенных препаратов и в дальнейшем разработке принципиально новых форм аллергенов со сниженными аллергенными свойствами, но сохранившими свою иммуногенность для аллерген-специфической иммунотерапии. Кроме того, использование рекомбинантных аллергенов для АСИТ позволит избежать формирования сенсибилизации к другим компонентам, входящим в состав цельных аллергенов.

Таким образом, в последние годы создано множество модификаций аллергенов, направленных на улучшение их свойств. Неоднозначность результатов, полученных при изучении рекомбинантных аллергенов, данные, полученные в экспериментальных условиях при изучении химически модифицированных аллергенов, говорят о необходимости продолжении дальнейших исследований с целью создания препаратов, приемлемых для безопасной и эффективной аллерген-специфической иммунотерапии.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 0 года, Савченко, Елена Анатольевна

1. Адо А.Д. Частная аллергология. М.: Медицина, 1976.- 512 с.

2. Адо В.А., Астафьева Н.Г. Поллинозы.- М.:Изд-во «Знание», 1991.224 с.

3. Андреев С.М., Сидорова М.В., Ракова О.А. и др. Синтез N-гидроксисукцинимид эфиров карбоксильных полимеров и органических кислот с помощью N- трифторацетосукцинимида // Биоорганическая химия. -1987. №13 - С.696-702.

4. Астафьева Н.Г., Адо В.А., Горячкина JI.A. Растения и аллергия.-Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1986.- 336 с.

5. Бабахин А.А., Хаитов P.M., Петров Р.В. Взаимодействие аллерген-полимерных комплексов с лимфоидными клетками и возможность специфической иммунотерапии этими комплексами. // Биотехнология. -1992. №6. - С.24-29.

6. Бабахин А.А., Андреев С.М., Савченко Е.А., Р.А. Ханферян, ДюБуске Л.М., Гущин И.С., Хаитов Р.М Изменение иммунологических свойств сукцинилированного аллергена. // Материалы конференции РААКИ.- Москва, 1998. С.78.

7. Бабахин А.А., Хаитов P.M., Петров Р.В., Андреев С.М. Новые подходы к получению аллерговакцин. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 1998.- №10. - С. 1 - 4.

8. Бабахин А.А., Гущин И.С., Андреев С.М. и др. Химическая модификация аллергена, ведущая к изменению его эпитопной активности. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- М.: Медицина, 1999 . Т. 1. - С. 17-22.

9. Ю.Бабахин А.А, Хаитов P.M., Петров Р.В. Экспериментальное обоснование аллерген-специфической иммунотерапии химически модифицированными аллергенами (аллерготропинами). //Физиология и патология иммунной системы. 2004,- №2.- С. 20-24.

10. И.Беклимишев Н.Д., Ермеков Р.К., Мошкевич B.C. Поллинозы. М.: Медицина, 1985.-240 с.

11. Горячкина JI.A., Астафьева Н.Г. Специфическая иммунотерапия атопических заболеваний // Брошюра Medland Systems.-1998.-c.34.

12. Горячкина JI.A., Астафьева Н.Г. Специфическая иммунотерапия атопических заболеваний. // Русский мед. журнал. 2000 - Т. 10, №16.-С. 33-48.

13. Гущин И.С. Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль.- М.: Фармус принт, 1998.-252 с.

14. Гущин И.С. Физиология иммуноглобулина Е (IgE). // Аллергология и иммунология.- М.: Медицина, 2000.- Т.1, №1.- С.76-87.

15. Гущин И.С. Аллерген-специфическая иммунотерапия (гипосенсибилизация) // Лечащий врач. 2001. - №3. - С. 10 -27.

16. Гущин И.С., Курбачева О.М. Аллерген-специфическая иммунотерапия атопических заболеваний. // Пособие для врачей -М.: ГЭОТАР-пресс, 2002.- С.1-32.

17. Гущин И.С., Читаева В.Г. Аллергия к насекомым. Клиника, диагностика и лечение. М.: Фармарус Принт, 2003. - 165 с.

18. Емельянов А.В. Специфическая иммунотерапия // Общая аллергология / Под ред. Федосеева Г.Б. С.-Пб.: Нормед-Издат., 2001.-Т.1 -686 с.

19. Ениин И.П., Карпов В.П., Сивоволова Н.А. Сезонные аллергические риносинуситы. // Методич. пособие.- Ставрополь.- 1999.- 48 с.

20. Иллютович Н.А. Экспериментальное обоснование иммуногенных свойств аллергоида из пыльцы амброзии // Семинар молодых ученых по медицинской микробиологии и инфекционной иммунологии: тез. докл. М., 1981- С.89-90.

21. Ильина Н.И. Эпидемия аллергии в чем причины. // Рос. аллергологический журнал. - 2004.- №1.- С.37-42.23 .Ильина Н.И., Богова А.В. Эпидемиология аллергии.//Физиология и патология иммунной системы.-,2004.-№2.-С.4-10.

22. Клаус Д. Лимфоциты. Методы.- М.: Мир., 1990.- 395 с.

23. Кошель В.И. Хронические риносинуситы в районе Юга России. Этиологические, патогенетические, эпидемиологические аспекты, комплексные методы профилактики и лечения: автореф. дисс. . .д-ра мед. наук.( 14.00.04).- СПб: мед.университет, 1999.-35 с.

24. Курбачева О.М. Прошлое и будущее аллерген-специфической иммунотерапии. // Российский аллергологический журнал.-2005.-№4.-С. 17-24.

25. Лусс Л.В. Аллерген-специфическая иммунотерапия основной эффективный метод лечения атопических заболеваний. // Аллергология и иммунология в педиатрии. -2004. -№1.-С.70-78.

26. Петров Р.В Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины.- М.: Медицина, 1988. 288 с.

27. Петров Р.В., Хаитов P.M., Федосеева В.Н., и др. Применение для специфической иммунотерапии конъюгированных аллергополимерных вакцин (пыльцевых аллерготропинов новой генерации). // Терапевтический архив.- 2002- №10.- С. 37-40.

28. Райкис Б.Н., Иллютович Н.А. Иммунохимическая характеристика аллергоида из растительной пыльцы. // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1981.-№1.- С.74-75.

29. Райкис Б.Н., Воронкин Н.И., Гервазиева В.Б. Перспективы использования новых модифицированных аллергенов в лечении атопических аллергических заболеваний // Иммунология. 1984.-№4.- С. 12-17.

30. Райкис Б.Н., Казиев А.Х. Настоящее и будущее лечебных аллергенов. М.: «Триада-Х», 2001. - 248 с.

31. Райкис Б.Н. Пожарская В.О., Казиев А.Х. Перспективы разработки рекомбинантных аллергенов // Аллергология. 2002. -№2.-С.45-49.

32. Садовничая JI.T. Поллинозы у детей Ставропольского края (клиника, диагностика, лечение): автореф. дис. канд. мед. наук. (14.00.36).-Москва: ММИ им.Сеченова, 1997.-24 с.

33. Сандлер Б.Б. К вопросу о поллинозах у детей в Кузбассе. // Педиатрия.- 1980.- №9 С.6.

34. Трофименко С.Л., Волков А.Г. Аллергические заболевания носа и околоносовых пазух.- Ростов/Дон: Изд-во «Юпитер», 2001.-352 с.

35. Фрадкин В.А., Рашаль Н.И, Райкис Б.Н. Методические указания к проведению диагностики тестом укола (прик-тест).- М.: Медицина, 1983.-c.34.

36. Хаитов М.Р. Рекомбинантные аллергены. Стратегия создания аллерговакцин нового поколения. //Рос. аллергологический журнал. -2004.-№1.- С.73-76.

37. Хаитов P.M. Конструирование аллерговакцин-антиаллергических препаратов нового поколения // В сб.: Соврем, проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии. — 1997. С. 106-112.

38. Хаитов P.M., Гущин С.И., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов //Ведомости фармакологического комитета 1999. - №1. - С. 31 - 36.

39. Хаитов P.M., Федосеева В.Н., Некрасов А.В., и др., Создание аллерговакцин на основе аллергоидов из пыльцы тимофеевки, березы, полыни и иммуностимулятора полиоксидония. //Аллергия, астма и клиническая аллергология.- 2001.- № 1.-С. 24.

40. Хаитов P.M., Федосеева В.Н., Некрасов A.M., Камышова В.А. Создание аллерговакцин на основе аллергоидов из пыльцы тимофеевки, березы, полыни и иммуностимулятора полиоксидония. // Аллергология и иммунология.- 2000.- Т.1, №2, с. 112.

41. Ханферян Р.А. Полимеризованные аллергены пыльцы растений для специфической иммунотерапии: Методические рекомендации.-Краснодар: КМИ, 1988.- 16 с.

42. Ханферян Р. А. Структура атопических аллергенов ииммунорегуляция IgE-антителообразования: дис.д-ра мед.наук.612017.1-06:582.998.2; 616-056.43-022.854:582.998.2).-Краснодар: Кубанский гос. мед. институт.- 1991.-325с.

43. Хутеева С.Х., Федосеева В.Н. Аллерген-специфическая иммунотерапия бронхиальной астмы. — М.: Изд-во «Экон», 2000. -252 с.

44. Читаева В.Г., Гущин И.С., Полсачев О.В. и др.//Иммунология. -1988.-№5. -С.54-58.

45. Читаева В.Г., Гущин И.С., Порошина Ю.А., и др. Динамика иммунологических показателей при специфической иммунотерапии поллиноза. //Иммунология.- 1988.- №5.- С. 54-58.

46. Akdis С.А., Blaser К. 11-10 induced anergy in peripheral T-cell and reactivation by microenvironmental cytokines. Two key steps in specific immunotherapy // FASEB.- 1999. N 13. - P.603-609.

47. Akdis C.A., Blaser K. Mechanisms of allergen-specific immunotherapy // Allergy. 2000. - Vol. 55, N6. - P. 522-530.

48. Akdis CA, Blesken T, Wymann D, Akdis M, Blaser K: Differential regulation of human T-cell cytokine patterns and IgE and IgG4 responses by conformational antigen variants //Eur. J. Immunol.- 1998.- Vol. 28.- P. 914-925.

49. Akdis M., Schmidt-Weber C., Jutel M., Akdiic Cezmi A. & Blaser K. Mechanisms of Allergen Immunotherapy // Allergy Clin. Immunol. International. 2004. - Vol. 16, N2. - P. 65 - 69.

50. Akdis M, Trautmann A, Klunker S, Daigle I, Kucuksezer UC, Deglmann W et al T helper (Th) 2 predominance in atopic disease is due to preferential apoptosis of circulating memory/effector Thl cells. // Faseb J.- 2003. Vol. 17. P. 1026-1035.

51. Ameal. A, Vega-Chicote J Fernandez S et al. Double-blind and placebo-controlled study to assess efficacy and D/ Pteronissinus in allergic asthma // Allergy.- 2005/ Vol.60, N. 9,- P. 1178-1183.

52. Babu K.S., Arshad S.H., Holgate S.T. Anti IgE treatment: an update //Allergy.- 2001.-Vol. 56, N12. - P. 1121-1128.

53. Balda B.R., Wolf H., Baumgarten C., et al. Tree-pollen allergy is efficiently treated by short-term immunotherapy (STI) with seven preseasonal injections of molecular standardized allergens. // Allergy.-1998.-Vol. 53.-P. 740-748.

54. Ball Т., Vrtala S., Sperr W.R., Valent P., Susani M., Kraft D., Valenta R. Isolation of an immunodominant IgE-hapten from an epitope expression cDNA library; dissection of the allergic effector reaction // J. Biol. Chem.- 1994.- Vol. 269.- P. 323-328.

55. Ball T, Sperr WR, Valenta P. et al. Induction of antibody response to new B-cell epitopes indicate vaccination character of allergen immunotherapy // Eur. J.Immunol.-1999.- Vol. 17.- P.l 178-1189.

56. Bellighausen I., Knop J., Saloga J. Role of Interleukin 10- Producing T Cells in Specific (Allergen) Immunotherapy //Allergy Clin. Immunol. International. 2000. - Vol. 12, N1. - P. 20-25.

57. Bodtger U., Poulsen L. K., Jacobi H. H., Mailing H.-J. The safety and efficacy of subcutaneous birch pollen immunotherapy a one-year, randomized, double-blind, placebo-controlled study. // Allergy.- 2002.-Vol. 57.-P. 297-305.

58. Bousquet J., Valenta R. In vivo use of recombinant allergens //ACI News. 1994.-N6.-P. 54-59.

59. Campbell D., DeKruyff R.H., Umetsu D.T. Allergen immunotherapy: Novel approaches in the management of allergic diseases and asthma // Clin. Immunol.- 2000.- Vol. 97.- P. 193-202.

60. Casanovas M., Gomez M., Carnes E., Fernandez-Caldas E. Skin tests with native, depigmented and glutaraldehyde polymerized allergen extracts // J.Invest. Allergol. Clin. Immunol.-2005.-Vol. 15(1).- P. 30-36.

61. Casari G, Sander C, Valencia A: A method to predict functional residuesin proteins. Nat Struct Biol 1995.- N2.- P. 171-178. ь

62. Cezmi A., Akdis M, Blaser К IL-10-induced anergy in peripherial T cell and reactivation by microenvironmental cytokines: two key steps in >. specific immunotherapy// FASEB Journal.-1999.-Vol. 13.-P.603-609.

63. Chapman M.D., Smith A.M., Vailes L.D., Arruda L.K. Recombinant mite ^ allergens // Allergy. 1997.- Vol. 52. - P. 374-379.

64. Cheng S., Baisch J., Krco C., Savarirayan S., Hanson J., Hodgson K., Smart M., David C. Expression and function of HLA-Dq8 (DQA1 *0301/DQB1 *0302) genes in transgenic mice //Eur. J. Immunogenet. 1996.- Vol. 23.- P. 15 - 18.

65. Circovic T.D., Bucilica M.N., Gavrovic M.D., Vujcic Z., Petrovic S., Jankov R.M. Physicochemical and immunologic characterization of low-molecular weight allergoides of Dactylis glomerata pollen proteins. // Allergy.-1999.- Vol. 54- P. 128-134.

66. Colombo P., Kennedy D., Ramsdale Т., Costa M.A., Duro G., Izzo V., Salvadori S., Guerrini R., Cocchiara R., Mirisola M.G., Wood S., Geraci

67. D. Identification of an immunodominant IgE epitope of the Parietaria judaica major allergen. // J. Immunol.-1998.- Vol. 160.- P. 2780-2785.

68. Crameri R., Blaser K. Herstellung and Anwendung rekombinantes Allergene // Allergologie. 1998. - Bd. 21, N9. - S. 434-440.

69. D'Amato G., Holgate S.T. The impact of air pollution on respiratory health//European Respiratory Monograph.- 2002.- N.21.-P.125 -138.

70. De Garcia-Robaina J.C., la Torre-Morin F., Vazquez-Moncholi C., Fierro J., Bonnet-Moreno C. The natural history of v4/ws-specific IgG and IgG4 in beekeepers. // Clin. Exp. Allergy.- 1997.- Vol.27.- P. 418-423.

71. De la Hoz, F., F. Polo, J. Moscoso del Prado, J. G. Selles, M. Lombardero, J. Carreira. 1990. Purification of Art v I, a relevant allergen of Artemisia vulgaris pollen // Mol. Immunol.- Vol. 27.- P. 651.

72. Devey M.E., Wilson D.V., and Wheeler A. W. The IgG subclasses of antibodies to grass pollen allergens produced in hay fever patients during hyposensitization // Clin. Allergy. -1976.- Vol. 6.- P. 227.

73. Deviller P. Le repertoire des allergens recombinents // Rev. Fr. allergol. et. Immunol. Clin. 1997. - Vol. 37, N 8. - P. 1083-1092.

74. Du Buske L.M., Ling C.J., Sheffer A.L. // Immunol. Allergy Clin.N. Amer.-1992.-Vol. 12.-P. 145-175.

75. Durham S., Varney V.A., Gaga M. Immunotherapy and allergic inflammation // Clin. Exp. Allergy. 1991.-Vol.21. - P. 206-210.

76. Durham SR, PA Wachholz, N Kristensen Soni, SJ Till Inhibition of allergen-IgE binding to B-cells by IgG antibodies following grass pollen immunotherapy // J Allergy Clin Immunol. 2003. -Vol. 112. - P. 915922.

77. Durham S.R., Walker S.M., Varga E.-M., M.D., Jacobson M.R., O'Brien F., Noble W., Till J.S., Hamid Q.A., Nouri-Aria T. Long-term clinicalefficacy of grass-pollen immunotherapy. // N. Engl. J. Med. -1999. -Vol.341.-P. 468-475.

78. E1 Biaze M., Boniface S., Koscher V., Mamessier E., Dupuy P., Milhe F. et al. T-cell activation, from atopy to asthma: more a paradox than a paradigm // Allergy.- 2003.- Vol. 58.- P. 844-853.

79. Emberlin J., Savage M., Jones S. Annual variations in grass pollen seasons in London 1961-1990, trends and forecast models // Clin. Exp. Allergy.- 1993.- Vol. 3.- P. 911-918.

80. Eroberts Т., Pearson D. Epidemiology of allergic diseases // J. Allergy today.-1990.- N5.- P. 2.

81. Febig H. T-cell reactivity of modified allergens //Allergy. 1999.- Vol. 54. (Supl.56). - P. 31 - 32.

82. Feltquate D.M., Heaney S., Webster R.G., Robinson H.L. Different T-helper cell types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization. // J. Immunol.- 1997.- Vol. 158.- P. 2278-2284.

83. Ferreira F., Wallner M., Breiteneder H., Hartl A., Thalhamer J., Ebner C. Genetic Engineering of Pollen and Fungal Allergens: Future Therapeutic Products // Abstracts 58 AAAAI Meeting.- March, 2002.- New York.- P. 245-247.

84. Ferreira F., Ebner C., Kramer B.et all. Modulation of IgE reactivity of allergens by site-directed mutagenesis: Potential use of hypoallergenic variants for immunotherapy // FASEB J.- 1998.- N12.- P. 231-242.

85. Ferreira F., Hirthenlehner K., Briza P et al. Isoforms of atopic allergens with reduced allergenicity but conserved T cell antigenicity: Possible use for specific immunotherapy // Int. Arch. Allergy Immunol.- 1997.- Vol. 113.-P. 125-127.

86. Ferreira F., Rohlfs A., Hoffmann-Sommergruber K. et all. Modulation of IgE-binding properties of tree pollen allergens by site-directed mutagenesis // Adv. Exp. Med. Biol.- 1996.- Vol. 409.- P. 127-135.

87. Fox D.A., Choilazzi N., Katz D.H. Hapten-specific IgE antibody responses in mice. Differential resistance of IgE and IgG B-lymphocytes to X-radiation. //J. Immunol.- 1976.- Vol. 117/- P. 1622-1628.

88. Gieni R. S., X. Yang, К. T. Hay Glass Allergen-specific modulation of cytokine synthesis patterns and IgE responses in vivo withchemically modified allergen // J. Immunol.- 1993 Vol. 150.- P. 302.310.

89. Hamelmann E., Rolinck-Werninghaus, Wahn U. From IgE to Anti-IgE: Where do we stand? // Allergy. 2002. - Vol. 57, N11. - P. 983-994.

90. Hauswirth A.W., Natter S, Valenta R. Recombinant allergens promote expression of CD 203c on basophils in sensitized individuals // Allergy Clin. Immunol.- 1999. N104. - P. 1223-1230.

91. HayGlass, К. T. and Stefura, B. P. 1991. Anti-IFN-y treatment blocks the ability of glutaraldehyde-polymerized allergens to inhibit specific IgE responses // J. Exp. Med.- 2002.- Vol. 173.- P. 279.

92. Himly M., Jahn-Schmid В., Dedic A. et al. Art v 1, the major allergen of mugwort pollen is a modular glycoprotein with a defensin-like and a hydroxyproline-rich domain // FASEB J. -2003. N14. - P. 123127.

93. Hirschwehr R., Heppner C., Spitzauer S. et al. Identification of common allergenic structures in mugwort and ragweed pollen // J Allergy Clin.Immunol.-1998. Vol. 101 (2Pt).- P. 196-206.

94. Hsu C.H., Chua K.Y., Tao M.H., Huang S.K., Hsieh K.H. Inhibition of specific IgE response in vivo by allergen-gene transfer // Int. Immunol. 1996.-N8.-P. 1405-1411.

95. Humme D.A., Weidemann M.J.(eds) Mitogenic Lymphoccyte Transformation.- North Holland, Amsterdam: Elsevier, 1980.- 280 p.

96. Ishizaka K., Okudaira H., King T.P. Immunogenic properties of modified antigen E. II. Ability of urea denaturated antigen and polypeptide chain to prime T-cells specific for antigen E. // Eur. J. Immunol.- 1975.-Vol. 114.-P. 110-115.

97. Juniper E.F., O'Connor J., Roberts R.S., Hargreave F.E. A two year study of Pegalgen (a polyethylene glycol modified ragweed extract) in ragweed rhinoconjunctivitis // J. Allergy Clin. Immunol.- 1983.- Vol. 71.-P. 119.

98. Jutel M., Akdis M., Blaser К., Akdis С. A. Mechanisms of allergen specific immunotherapy- T-cell tolerance and more // Allergy.- 2006. -Vol.61,N7.-P. 796-807.

99. Jutel M., Akdis M., Budak F. et al. 11-10 and TGF-b cooperate in the regulation T cell response to mucosal allergens in normal immunity and specific immunotherapy // Eur. J. Immunol.- 2003. Vol. 33 - P. 1205-1214.

100. Kay A.B. (Ed) Allergy and Allergic Diseases. Oxford: Blackwell Sci., 1997.-Vol. 1.-127 p.

101. Krco C.J.,.Beito T.G, David C.S. Determination of tolerance to self Ea peptides by clonal elimination of H-2E reactive T cells and antigen presentation by H-2A molecules // Transplantation. -1992.- Vol. 54.-P. 920.

102. Khanferyan R.A. N.A.Riger, N.V.Kotova, A.Kotlyarenko Regulation of IgE synthesis in atopy and non-atopic diseases// Int.J. of Immunorehabilitation.-2001.-Vol.3, N3,- P. 179.

103. Kunzmann S., Wohlfahrt J.G., Itoh S., Asao H., Komada M. et al. SARA and Hgs attenuate susceptibility to TGF-b 1-mediated T-cell suppression // FASEB J.-2003. N17. - P. 194-202.

104. Laffer S., Duchene M., Reimitzer I., Susani M., Mannhalter C., Kraft D., Valenta R. Common IgE-epitopes of recombinant Phi p I, themajor timothy grass pollen allergen and natural group I grass pollen isoallergens // Mol. Immunol. 1996. N 3-4. - P. 33.

105. Laffer S., Spitzauer S., Susani M. et al. Comparison of recombinant timothy grass pollen allergens with natural extract for diagnosis of grass pollen allergy in different populations // J. Allergy Clin. Immunol.- 1996. -Vol. 98(3).-P. 625-658.

106. Laffer S., Vrtala S., Duchene M. et al. IgE binding capacity of recombinant timothy grass (Pleum pretense) pollen allergens // J. Allergy Clin.Immunol.-1994.- Vol. 94.- P. 88-94.

107. Lee W.Y., Sehon A.H. Abrogation of reagenic antibodies with modified proteins // Nature.- 1977.- Vol. 267.- P. 618-620.

108. Levine B.B., Vaz N.M. Effect of combination of imbred strai, antigen, and antigen dose on immune responsiveness and regain production in the mouse // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1970. -Vol. 39.-P. 156-171.

109. Levy F., Kristofoc C., Heusser C., Brinkmann V. Role of IL-13 and CD4 T-cell-dependent IgE-production in atopy // Int. Arch. Allergy Immunol.- 1997.- Vol. 112.- P. 49-58.

110. Lew A.M. //J. Immunol. Meth.- 1984.-Vol.72.- P. 171.

111. Lewkowich Ian P., Julia D. Rempel and Kent T. HayGlass Prevention of Allergen-Specific, Th2-Biased Immune Responses In Vivo: Role of Increased IL-12 and IL-18 Responsiveness // J. Immun.- 2005.-Vol. 175.- P. 496-4962.

112. Lockey R.F. "ARIA": global guidelines and new forms of allergen immunotherapy // J. Allergy Clin. Immunol.- 2001.- Vol. 108.- P. 497499.

113. Mailing H-J. Allergen Immunotherapy Efficacy in Rhinitis and Asthma. Allergy Clin. Immunol. Int., J. World Allergy Org., 2004, v. 16, p.92-95.

114. Multer U., Dudler Т., Schneider T. et al. Type I skin reactivity to native and recombinant phospholipase A2 from honeybee venom is similar // J. Allergy Clin. Imuunology. 1995. - Vol. 96. - P. 395 - 402.

115. Multer U., Fricker M., Wymann D. et al. Increased specificity of diagnostic tests with recombinant major bee venom allergen phospholipase A2 // Clin. Exp. Allergy. 1997.- Vol. 27.- P. 915 - 920.

116. Nasser S.M., Ying S., Meng O., Kay A.B., Ewan P.W. Interleukin-10 levels increase in cutaneous biopsies of patients undergoing wasp venom immunotherapy // Eur. J. Immunol.- 2001.- Vol. 31.- P. 37043713.

117. Nasser SM, Ying S, Meng O, Kay AB, Ewan PW. Interleukin-10 levels increase in cutaneous biopsies of patients undergoing wasp venom immunotherapy // Eur J Immunol.- 2001.-Vol.31. P. 3704-3713.

118. Neeno Т., Krco C.J., Harders J., Baisch J., Cheng S., David C.S. HLA-DQ8 transgenic mice lacking endogenous class II molecules respond to house dust mite allergens; identification of antigenic epitopes //J. Immunol.- 1996.-Vol. 156.-P.3191.

119. Nilsen, В. M., Paulsen B. S. Isolation and characterization of a glycoprotein allergen, Art v II, from pollen of mugwort (Artemisia vulgaris L.) // Mol. Immunol.-1990.-N2.- P. 1047.

120. Nilsen, B.M., A. Grimsoen, B.S. Paulsen. Identification and characterization of important allergens from mugwort pollen by IEF, SDS-PAGE and immunoblotting // Mol. Immunol. 1991.- N28.- P. 733.

121. Nolte H., Storm K., Schiotz P.O. Diagnostic value of a glass fiber-based histamine analysis for allergy testing in children // Allergy. 1990. -Vol. 45.-P. 213-223.

122. Norman P.S., Winkenwerder W.L., D'Lugoff B.C. Controlled evaluations of repository therapy in ragweed hay fever // J. Allergy.-1967.-Vol. 39.-P. 82-88.

123. Norman P.S., Winkenwerder W.L., Lichtenstein L.M. Trials of alum-precipitated pollen extracts in the treatment of hay fever // J. Allergy Clin. Immunol.- 1972.- Vol. 59.- P. 31-36.

124. Ohashi Y., Nakai H., Okamoto H. et al., Significant correlation between symptom score and IgG4 antibody titer following long-term immunotherapy for perennial allergic rhinitis. // Ann Oto. Rhinol. Laryngol. 1997.- Vol.106. - P.483-493.

125. Okada Т., Swoboda I., Bhalla P.L., Toriyama K., Singh M.B. Engineering of hypoallergenic mutants of the Brassica pollen allergen, Bra r 1, for immunotherapy // FEBS Lett.- 1998.- Vol. 43.- P. 255-260.

126. Okuda M. et al. //Int.Arch. Allergy. 1985.-Vol.76., N1.-P.79-81.

127. Patterson R., Suszko I.M., Grammer I.C. Polymerization of individual species of tree pollen allergens // Int. Arch. Allergy appl. Immunol.-1984.- Vol. 73, N31.- P. 1-4.

128. Patterson R., Suszko I.M., Grammer L.G., Shaughnessy M.A. Poymerization of individual species of grass pollen allergens//J.Allergy Clin. Immunol. 1983. - Vol. 72, №2 - P. 129-133.

129. Patterson R., Suszko I.M., Zeiss C.R., Pruzansky J.I. Development and evaluation of polymerized allergens for immunotherapy.// Int. Arch. Allergy appl.Immunol.-1981.- 66, №1- P.293-296.

130. Pauli G. Interet diagnostigue der allergens recombinants // Rev.fr. Allergol. J Immuol.Clin.- 1997. Vol. 37, N8.- P. 1093-1101.

131. Perelmutter L.L. In vitro allergy testing // Clin. Rev. Allergy. -1994.-Vol. 12.-P. 151-165.

132. Petrov R., Khaitov R., Babakhin A., Nekrasov A., Fedoseeva V., Illyina N. Conjugated allergotropins for specific immunotherapy // Asthma.- 2001.- N2.- P. 18-23.

133. Raz E., Tighe H., Sato Y. et al. Preferential induction of a Thl immune response and inhibition of specific IgE antibody formation by plasmid DNA immunization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.- Vol. 93.- P. 5141-5145.

134. Rempell Julia D., MingDong Wang and Kent T. HayGlass Failure of rIL-12 administration to inhibit established IgE responses in vivo is associated with enhanced IL-4 synthesis by non-B/non-T cells // Int. Immun.- 2000.- Vol. 12, N7.- P. 1025-1034.

135. Rogers B.L., Morgenstern G.P., Garman R.D., Bond J.F., Kuo M.C. Recombinant Fel d 1: Expression, purification, IgE binding and reaction with cat-allergic human T cells // Mol. Immunol.- 1993.- Vol. 30,- P. 559568.

136. Romagnani S. Development of type 2 T-helper cells in allergy // Curr. Opin. Immunol.- 1994.- N6.- P. 838-845.

137. Romagnani S. The "Th2 hypothesis" in allergy // Progress in Allergy and Clinical Immunology /Eds.A.K.Oehling, J.G. Huerta.- 1997.-P. 12-16.

138. Rossi R.E., Monasterolo G. Evaluation of Recombinant and Native Timothy Pollen (rPhl pi,2,3,5,6,7,11,12 and nPhl p4)- Specific IgG4

139. Antibodies Induced by Subcutaneous Immunotherapy with Timothy Pollen Extract in Allergic Patients // Allergy and Immunology. 2004.-Vol. 135.-P. 44-53.

140. Royer В., Varadaradjalou S., Saas .P, Guillosson J.J., Kantelip J.P., Arock M. Inhibition of IgE-induced activation of human mast cells by IL-10 // Clin. Exp. Allergy.- 2001.- Vol. 31.- P. 694-704.

141. Savchenko E.A., Khanferyan R.A., Babakhin A.A., Andreev S.M., DuBuske L.M. Immunological properties of chemically modified ragweed allergens // XXII Congress EAACI-Paris, 2003 / Allergy.-2003.-Vol. 58, Suppl. 74. P. 387.

142. Schramm G., Kahlert H., Suck R. et al. Variants of the timothy grass pollen allergen Phi p 5b with reduced IgE-binding capacity but conserved T-cell reactivity // J. Immunol.-1999.- Vol. 162.- P. 2406-2414.

143. Schwartz R.H. T-lymphocyte recognition of antigen in association with gene products of the major histocompatibility complex // Annu Rev. Immunol.- 1985.- N3.- P. 237-261.

144. Secrisit H., Chelen C.J., Wen et al. статья // J. Exp. Med. 1993. -Vol. 178.-P. 2130-2133.

145. Slater J.E., Paupore E., Zhang Y.T., Colberg-Poley A.M. The latex allergen Hev b 5 transcript is widely distributed after subcutaneous injection in BALB/c mice of its DNA vaccine // J. Allergy Clin. Immunol.-1998.- Vol. 102.- P. 469-475.

146. Stuck B. A., Schneider-Gene S., Schafer D., Klimek L., Hormann K. Short-term preseasonal immunotherapy with birch pollen allergoid plus monophoryl lipid A (MPL) // Allergy Clin. Immunol. Int. Org.-2004.- N16.- P. 60-64.

147. Swoboda I., De Weerd N., Bhalla P.L. et all. Mutants of the major ryegrass pollen allergen, Lol p 5, with reduced IgE-binding capacity: Candidates for grass pollen-specific immunotherapy // Eur. J. Immunol.-2002.- Vol. 32.- P. 270-280.

148. Takanaski S., Nonaka R., Xing Z., O'Byrne P., Dolovich J., Jordana M. Interleukin 10 inhibits lipopolysaccharide-induced survival and cytokine production by human peripheral blood eosinophils // J. Exp. Med.- 1994.- Vol. 180.- P. 715-722. fe

149. Tamborini E., Faccini S., Lidholm J., Svensson M., Brandazza A., Longhi R., Groenlund H., Sidoli A., Arosio P. Biochemical and immunological characterization of recombinant allergen Lol pi// Eur. J. Biochem.-1997.- Vol. 249.- P. 886-894.

150. Taylor А.1. Verhagen J., Blaser K., Akdis M., Akdis C. Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-p: the role of T regulatory cells // Immunology.- 2006.-Vol. 117, Issue 4.-P. 433.

151. Valenta R. From allergen structure to new forms of allergens-specific IT //

152. Valenta R., Duchene M., Ebner C., Valent P., Sillaber C., Deviller P., Ferreira F., Tejkl M., Edelmann H., Kraft D., Scheiner O. Profilins constitute a novel family of functional plant pan-allergens // J. Exp. Med.-1992.- Vol. 175.- P.377-385.

153. Valenta R., Duchene M., Vrtala S. et al. Recombinant allergens for immunoblot diagnosis of tree-pollen allergy // J. Allergy Clin. Immunol.-1991.-Vol. 88.-P. 889-894.

154. Valenta R., Kraft D. From allergen structure to new forms of allergen-specific immunotherapy // Current Opinion in Immunology.-2002.-N14-P. 718-727.

155. Valenta R., Kraft D. Recombinant allergens for diagnosis and therapy of allergic diseases // Curr. Opin. Immunol.- 1995.-N7- P. 751756.

156. Valenta R., Lidholm J., Niederberger V., Hayek В., Kraft D., ; Gronlund H. The recombinant allergen-based concept of component-resolved diagnostics and immunotherapy (CRD and CRIT) // Clin. Exp. Allergy.- 1999.- Vol. 29.- P. 896-904.

157. Valenta R., Steinberger P., Duchene M., Kraft D. Immunological and structural similarities among allergens: prerequisite for a specific and component-based therapy of allergy // Immunol. Cell Biol.- 1996.- Vol. 74.-P. 187-194.

158. Valenta R., Vrtala S. Recombinant allergens for specific immunotherapy // Allergy 1999. - Vol. 54, Suippl.56. - P. 43-44.

159. Valenta R., Vrtala S., Ebner C., Kraft D., Scheiner O. Diagnosis of grass pollen allergy with recombinant timothy grass (Phleum pretense) pollen allergens // Int. Arch. Allergy Immunol.- 1992.- Vol. 97.- P. 287294.

160. Valenta R., Vrtala S., Laffer S., Spitzauer S., Kraft D. Recombinant allergens // Allergy.- 1998.- Vol. 53.- P. 552-61.

161. Van Hage-Hamsten M., Kronqvist M., Zetterstrom O., Johansson E., Niederberger V., Vrtala S., Gronlund H., Gronneberg R., Valenta R.

162. Van Neerven R.J., Ebner C., Yssel H., Kapsenberg M.L., Lamb J.R. T-cell responses to allergens: Epitope-specificity and clinical relevance // Immunol. Today.- 1996.- Vol. 17.- P. 526-532.

163. Van Ree R., Van Leeuwen Wa., Bulder I., Bond J., Aalberse R.C. Purified natural and recombinant Fel dl and cat albumin in vitro diagnostic for cat allergy // J. Allergy Clin. Immunol. 1999. - N104. - P. 1223-1230. *

164. Varney V.A, Hamid Q.A., Gaga M. et al. // J.Clin.Invest. 1993. -Vol. 92.-P. 644-651. v,

165. Walker S. M., PhD, Pajno G.B., MD, Lima M.T., MD, Wilson D.R., MD, and Durham S.R., MD. Grass pollen immunotherapy for seasonal rhinitis and asthma: a randomized, controlled trial // J. Allergy Clin. Immunol.- 2001.- Vol.107.- P. 87-93.

166. Westritschnig K., Sibanda E., Thomas W., Auer H. Aspoeck H., Pittner G., Vrtala S., Spitzauer S., Kraft D., Valenta R. Analysis of the allergen profile in Central Africa // Clin. Exp. Allergy.- 2002.- N4.-P. 271-298.

167. Wheeler A.W., Drachenberg K.J. New routs and formulation for allergen-specific immunotherapy // Allergy. 1997. - Vol. 52. - P. 602612.

168. WHO Position Paper. Allergen IT: therapeutic vaccines for allergic diseases // Allergy. 1998. - Vol. 53, N44. - P. 1- 42.

169. Yang X., Gieni R., Mosmann T. R. and HayGlass К. T. Chemically modified antigen preferentially elicits induction of Thl-like cytokine synthesis patterns in vivo // J. Exp. Med.- 1993.- Vol. 178.- P. 349.

170. Yasue M, Yokota T, Suko M, Okudaira H, Okumura Y. Comparison of sensitization to crude and purified house dust mite allergens in inbred mice. // Lab Anim Sci. -1998.-Vol.48(4). P. 346-352.

171. Yssel H, Groux H. Characterization of T cell subpopulations involved in the pathogenesis of asthma and allergic diseases // Int. Arch. Allergy Immunol. 2000.- Vol. 121.- P.10-18.

172. Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory T cells and allergic asthma // Microbes Infect. 2001 .-N3(11). - P. 899-904.