Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Иммуноэкспрессия маркеров ворсинчатого хориона при нормальной и неразвивающейся беременности с ретрохориальной гематомой.

Груздев Сергей Артурович

На правах рукописи

ИММУНОЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРОВ ВОРСИНЧАТОГО ХОРИОНА ПРИ НОРМАЛЬНОЙ И НЕРАЗВИВАЮЩЕЙСЯ БЕРЕМЕННОСТИ С РЕТРОХОРИАЛЬНОЙ ГЕМАТОМОЙ

14.03.02 - патологическая анатомия 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Ульяновск - 2013

2 б СЕН 2013

005533366

Работа выполнена на кафедре анатомии человека в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» Министерства образования и науки РФ

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Милованов Андрей Петрович

Официальные оппоненты:

Чаиркин Иван Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва» Министерства образования и науки РФ, кафедра нормальной анатомии с курсами судебной медицины и оперативной хирургии и топографической анатомии, заведующий кафедрой.

Муслимов Сагит Асхатович - доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Министерства здравоохранения РФ, заведующий отделом морфологии

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится 10 октября 2013 г. в 13.30 часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.06 при ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по адресу: Набережная реки Свияги, 106, корпус 1, аудитория 703

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Ульяновского | государственного университета, с авторефератом на сайте университета http://www.ulsu.ru и на сайте ВАК: http://www.vak.ed.gov.ru

Отзывы на автореферат можно присылать по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, УлГУ, Управление научных исследований

доктор медицинских наук, профессор, Хайруллин Радик Магзинурович

Автореферат разослан « сентября 2013 года

Учёный секретарь диссертационного совета, к.м.н., доцент

М.А. Визе-Хрипунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема привычного раннего невынашивания беременности или неразвивающейся беременности (далее - НБ) является актуальной для современного акушерства. Эта патология составляет от 1,5 до 2 % всех беременностей и до 15 % желанных беременностей [Доронина с соавт., 1996; Мещерякова, 2000; Серов с соавт., 2003; Сидельникова, 2005; Kaufmann and Castellucci, 1997]. Их патогенез сложен, поскольку прекращение беременности совпадает с периодом имплантации и плацентации, то есть с тем периодом, когда формируются тесные взаимоотношения развивающейся плаценты с материнской тканью эндометрия матки, В настоящее время известно около тридцати разнообразных состояний приводящих к НБ. К ним относятся эндо-кринопатии, эндометриты, хромосомная патология родителей и эмбриона, аутоиммунные причины и нарушения гемостаза, складывающиеся в системе «мать-плацента-плод» [Глуховец Б., Глуховец Н., 1999]. По данным разных авторов от 25 до 60% НБ происходят по неустановленным причинам [Сухих и соавт., 1997; Чернышев и соавт., 1995; Loke, 1991; Roberto et al. 1998; Stephenson, 1996].

Основной ультразвуковой находкой при нарушении гемостаза в плаценте является ретрохориальная гематома (далее - РХГ) различного объёма, которая, как правило, приводит к частичной или полной отслойке хориально-го мешка от эндометрия и, соответственно, к гибели эмбриона. Система гемостаза в плаценте регулируется сложными гуморальными механизмами [Баркаган, 1988], при которых процесс свёртывания, необходимый для остановки кровотечения, не переходит в полноценные формы даже при её нормальном функционировании. У беременных с антифосфолипидным синдромом в 1-ом триместре отмечается состояние умеренной гемокоагуляции в плазменном звене гемостаза, оно развивается раньше состояния гиперкоагуляции, связанного с адаптацией гемостаза [Сидельникова, 2005]. Существует

ряд генетически детерминированных форм тромбофилий [Макацария, 2001; Lefkowitz et al„ 1996; Ridker et al., 1997; Nelen et al„ 1997; Molloy et al„ 1997], которые сопровождают беременность тромбоэмболическими осложнениями и ведут к её потере на любом этапе. Причины развития РХГ на ранних стадиях беременности до настоящего момента полностью не установлены. Для изучения механизмов их патогенеза и полноценных клинико-морфологических сопоставлений важны не только показатели гемостаза материнской крови, но, в первую очередь, иммуногистохимические исследования синцитиотрофобласта (далее - СЦТ) ворсин хориона.

Цель исследования:

оптимизация патоморфологической диагностики неразвивающейся беременности с ретрохориальной гематомой на основе определения характера иммуноэкспрессии гистохимических маркёров ворсинчатого хориона.

Задачи исследования:

1. Определение иммуноэкспрессии плацентарных маркёров PLAP, 0-hCG и VEGF-3 на ранних этапах физиологической беременности и сопоставление её со структурными особенностями развивающихся ворсин хориона.

2. Выявление особенностей иммуноэкспрессии плацентарных маркёров PLAP, P-hCG и VEGF-3 при неразвивающейся беременности с ретрохориальной гематомой и их отличий от аналогичных показателей при физиологической беременности.

3. Сопоставление иммуноэкспрессии плацентарных маркёров PLAP , 0-hCG и VEGF-3 при неразвивающейся беременности с ретрохориальной гематомой с патоморфологическими реакциями в плаценте и процессами васку-логенеза и ангиогенеза ворсин хориона.

Научная новизна

В работе впервые установлены сроки начала и количественная динамика экспрессии рецепторов к маркёрам, отражающим физиологический морфогенез плаценты: P-hCG и VEGF-3 с 5-й, a PLAP в щёточной кайме СЦТ с 7-

й недели гестации. Выявлено, что уровень продукции P-hCG синхронизирован с началом васкуляризации ворсин, интенсивным ангиогенезом и формированием полноценной капиллярной сети ворсин хориона. При сопоставлении иммуноэкспрессии PLAP, P-hCG и VEGF-3 с развивающимися патомор-фологическими реакциями и процессами васкуляризации ворсин хориона в образцах плацентарной ткани, полученных в случаях неразвивающейся беременности с РХГ, установлено, что возникновение РХГ связано с недостаточностью инвазии цитотрофобласта, что приводит к преждевременному началу кровотока в межворсинчатом пространстве. Развитие РХГ сопровождается критическим дефицитом уровня PLAP в щёточной кайме СЦТ и снижением или мозаичной иммуноэкспрессией P-hCG в ворсинах хориона ранней плаценты.

Научно-практическая значимость

Результаты проведённых исследований позволяют патоморфологиче-ски обосновать гестационно ранние (5-7 недель) и гестационно поздние (911 недель) РХГ. Полученные данные по элементам патогенеза РХГ при неразвивающейся беременности могут послужить базой для разработки подходов к лечению ранних потерь беременности и, в частности, перспективы использования препаратов с антиоксидантными свойствами для профилактики невынашивания беременности и предупреждения развития РХГ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Неразвивающаяся беременность с ретрохориальной гематомой по сравнению с физиологической, сопровождается статистически значимыми изменениями уровней иммуноэкспрессии плацентарных маркёров PLAP, P-hCG и VEGF-3.

2. Возникновение и развитие РХГ на ранних стадиях гестации патоморфоло-гически проявляется недостаточностью инвазии цитотрофобласта и преждевременным началом кровотока в межворсинчатом пространстве плаценты.

Апробация результатов исследования

Основные результаты и положения диссертации были представлены, доложены и обсуждены на V Съезде Российского общества детских патологов (Санкт-Петербург, Зеленогорск, 2012); VI Пленуме Российского общества патологоанатомов (Нижний Новгород, 2012); Первом национальном форуме «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации» (Ростов-на-Дону, 2012); расширенном межкафедральном совещании ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» Минобрнауки РФ (Ульяновск, 2013).

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры морфологии, кафедры акушерства и гинекологии по курсам патологической анатомии, акушерства, гинекологии в подготовке студентов медицинского факультета специальностей «лечебное дело» и «педиатрия» ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» Минобрнауки РФ, а также в практику работы патологоанатомического отделения ФГБУЗ «Клиническая больница № 172» ФМБА России.

Публикации по теме диссертации

По результатам диссертационного исследования опубликовано 10 научных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК РФ для опубликования результатов диссертаций на соискание учёной степени доктора и кандидата наук.

Объем и структура диссертации

Диссертационное исследование изложено на 116 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Диссертация содержит 3 таблицы и 49 рисунков. Библиографический указатель включает 83 работы отечественных и 99 работ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Материалом для исследования послужили образцы плацентарной ткани, полученные при искусственном прерывании физиологически протекавшей беременности на 6-10 неделях развития (20 случаев, контрольная группа), и соскобы из полости матки 39 женщин с НБ, у которых при ультразвуковой сонографии на сроках гестации от 4 до 11,5 недель было констатировано наличие РХГ различного объема в маточно-плацентарной области (основная группа). В 30 случаях из них был выявлен эмбрион без признаков сердцебиения, в 9 случаях эмбрион отсутствовал. Средний возраст женщин контрольной группы составил 26,1+1,3 лет, основной 29,0+1,3 лет, распределение в группах по возрасту представлено в табл. 1. Материал был получен от пациенток, находившихся на обследовании и лечении в гинекологическом отделении ФГБУЗ «Клиническая больница № 172» ФМБА России г. Димит-ровграда в 2010-2011 году.

Таблица 1

Распределение пациенток основной и контрольной групп по возрасту

Возраст в годах Основная группа (п=39) Контрольная группа (п=20)

абс. число % абс. число %

18-19 2 5,1 1 5

20-30 20 51,3 10 50

31-35 10 25,6 6 30

36-40 4 10,3 3 15

>40 лет 3 7,7 0 0

Всего 39 100% 20 100%

Из соскобов после промывки водой были выбраны ворсины плаценты из зон межворсинчатого тромбоза и более плотные фрагменты (париетальный эндометрий и ткани маточно-плацентарной области). 5-6 выбранных кусочков тканей фиксировали в 10%- нейтральном буферном растворе формалина 24-48 часов и обрабатывали по стандартной гистологической технике. Срезы толщиной 3-5 микрон, окрашивали гематоксилином и эозином. На полученных срезах исследовали морфологию развивающейся плаценты. Для

иммуногистохимических исследований срезы толщиной 3-5 микрон депара-финировали, монтировали на высоко адгезивные стекла (Polysine Slides, Menzel GmbH&Co KG; Germany). Далее выявляли иммуноэкспрессию: 1) ß-субъединиц человеческого хорионического гонадотропного гормона ß-hCG (поликлональные антитела), как основному гормону, синтезируемому СЦТ;

2) рецепторов 3-типа сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF-3 (антитела clone KLT9 Р), как маркёра ангиобластов и эндотелиальных клеток;

3) плацентарную щелочную фосфатазу PLAP (антитела clone 8А9 Р) - как маркёра щёточной каймы СЦТ. В дальнейшем срезы регидратировали через спирты снижающейся концентрации, выдерживали в 1% растворе перекиси водорода и метанола в течение 10 минут для погашения активности эндогенной пероксидазы, затем промывали в 0,15 M трис-буфере. Маркёры были детектированы с помощью пероксидаза-авидин-биотинового метода. Конечный продукт реакции определяли раствором 3,3'-диаминобензидина (DAB, Sigma Chemical Со), содержащим 0,01% перекиси водорода в течение 2-3 мин. Срезы контрастировали гематоксилином Майера в течение 30 сек, дегидратировали, просветляли в ксилоле. Постоянный положительный и отрицательный контроли были включены в каждую серию исследования. Препараты исследовали и фотодокументировали под световым микроскопом Leica DM500 и Leica DM4000 с использованием системы Leica Application Suite 8.0 и цифровой фотокамеры высокого разрешения.

Интенсивность иммуноэкспрессии определяли стандартным полуколичественным методом с учётом интенсивности окрашивания: негативная реакция - 0; слабое окрашивание цитоплазмы клеток -1; умеренно выраженная, несомненная экспрессия - 2 и максимальные экспрессия и значения процента положительных клеток - 3 балла. Гистохимический коэффициент определяли по формуле: HS (Histochemical score) = £ P<i)Xi, в которой i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3-х, P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Результат подсчёта HS трактовали следу-

ющим образом: от 0 до 10 - отрицательный; от 10 до 100 - слабоположительный; от 100 до 300 - положительный. Давность образования РХГ определяли полуколичественным методом, используя морфологические признаки [Ми-лованов, 1999]. Статистический анализ полученных результатов производили с использованием программы с «Statistica v6.0» фирмы StatSoft Inc. (USA) с помощью параметрических и непараметрических критериев для двух независимых групп данных. Уровень значимости достоверных различий принимали равным р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Морфогенез ворсин и последовательная экспрессия исследованных иммуногистохимических маркеров свидетельствуют о четкой последовательности структурной перестройки щеточной каймы СЦТ, васкуло- и ангиогене-за в условиях гипоксического окружения и начала маточно-плацентарного кровотока. Гистохимический коэффициент экспрессии рецепторов к VEGF-3 статистически значимо растёт в течение эмбрионального периода развития от 210,0+62,5 до 235,5+53,8 баллов, составляя в среднем 223,1+58,9 балла (табл. 2). Линейная корреляция этого маркёра с гестационным сроком оказалась незначимой ввиду несоответствия формы распределения данных нормальной. Как правило, развивающиеся ворсины по подавляющему большинству количественных и качественных измеряемых параметров всегда имеют значительный разброс индивидуальных величин показателей. В связи с указанными особенностями морфологии ворсин и небольшим объёмом исследуемой выборки нами предварительно были осуществлены процедуры проверки выпадов артефактов по методу, предложенному H.A. Плохинским [Плохинский, 1970] и соответствия распределения значений данных нормальному по критерию Шапиро-Уилка. Из всех анализируемых групп значений только значения HS VEGF-3 для гестационного возраста 7,5-10,5 недель имели нормальное распределение (значения критерия W=0,9 при р=0,073), остальные - статистически значимо отличались от нормального.

Таблица 2

Показатели иммуногистохимической экспрессии маркёров СЦТ плаценты человека 5-10,5 недель гестации в баллах (М±а)

№№ игх- Возраст эмбриона или плода в неделях * - р< по t- * -р< по

п/п маркер гестации критерию непарамет-

5-7 7,5 - 10,5 5 -10,5 Стьюдента рическим

(п=19) (п=20) (п=39) критериям

1 PLAP 0,00+0,00* 23,5+3,29* 12,05+2,62 0,004 0,003

2 VEGF-3 210,0+62,5* 235,5+53,8* 223,1±58,9 0,179 0,050

3 ß-hCG 270,5+39,6* 265,0±51,9* 267,7+45,8 0,712 0,008

При сравнении и поиска различий между возрастными группами 5-7 и 7,510,5 недель развития были использованы как параметрические, так и непараметрические критерии различий (табл. 2). Иммуноэкспрессия PLAP составила в среднем 12,05+2,62 баллов за исследованный период гестации и отчётливо выявлялась только после 7,5 недель (23,5+3,29 баллов). Коэффициент линейной корреляции Пирсона этого маркёра с возрастом был статистически значимым, его значение было положительным и составило (r±mr)=0,45+0,15, непараметрическая ранговая корреляция Спирмена также для этого показателя была статистически значима и имела более высокое значение rs=0,661 (р<0,05). Наличие статистически значимой линейной корреляции позволило построить график множественной регрессии показателя PLAP от гестацион-ного возраста. Скорректированный коэффициент регрессии составил PLAP-R2=0,504, уравнение множественной линейной регрессии выглядит следующим образом: «HS PLAP=ll,4 G-72,9», в котором «G»- возраст эмбриона или плода в неделях гестации. С учётом выраженной возрастной неравномерности экспрессии PLAP нами был осуществлён подбор её зависимости от возраста графическим способом в рамках опций программы Statistica. Наилучшим графическим отражением зависимости оказался полиномиальный график, соответствующее уравнение имело следующий вид: «HS PLAP=243,2-74,6- G+5,6- G2». Для маркёров VEGFR-3 и P-hCG значения скорректированных коэффициентов регрессии были не достоверными, и составили R2=0,037 (р=0,125) и R2=0,001 (р=0,332), соответственно. Полуколиче-

ственная оценка экспрессии рецепторов к P-hCG с помощью непараметрических критериев выявила некоторое незначительное статистически значимое снижение гистохимического коэффициента от 270,5+39,6 баллов в 5-7 недель гестации до 265,0+51,9 баллов к 7,5-10,5 неделям гестации, составив в среднем за исследованный период 267,7+45,8 баллов (табл. 2).

Наиболее значимым показателем развития ворсин хориона является степень их васкуляризации, которая была нами исследована с помощью реакции к рецепторам VEGF-3, избирательно экспрессирующимся в ангиобла-стах и эндотелиоцитах. На 5-й неделе гестации наблюдалась одновременная иммуноэкспрессия этого маркёра в эндотелии капилляров эндометрия и ворсинах плаценты. По мере увеличения срока гестации происходит укрупнение капилляров и плотности их распределения с ориентацией новообразованной сети в сторону эпителия ворсин на 6-ой неделе и, особенно выраженное, на 7-й неделе (рис. 1, «А-D»). Подобные картины наблюдались и на 8-ой неделе, что отражает структурную готовность капилляров для предстоящего интенсивного гемохориального обмена (рис. 1, «Е-F»). Аналогичные морфологические картины обнаружены в той же последовательности, начиная с 8-10 недель гестации рядом зарубежных исследователяей [Orlandini et al.,2005; Gu et al.,2006; Schiessl et al.,2008].

При обзорном анализе микропрепаратов тщательные поиски активности PLAP не выявили присутствия фермента в тканях плаценты на 5-6 неделях гестации (рис. 1, «К»). Лишь на 7-й неделе изначально плацентарная щелочная фосфатаза выявлялась в синцитиальных почках и в отдельных участках покровного эпителия ворсин. На 8-й неделе иммуноэкспрессия PLAP определялась по всему периметру эпителия ворсин, в отдельных участках она явно концентрировалась в апикальной части СЦТ, т.е. в зоне щёточной каймы (рис. 1 «L-М»). На 5 неделе эмбриогенеза плода человека, согласно полученным результатам, наблюдается выраженная экспрессия p-hCG в цитоплазме СЦТ (рис. 1, «G»). Максимумы иммуноэкспрессии приходятся на 7-

Рис. 1. Микрофото развивающейся плаценты. Иммуногистохимическая экспрессия маркёров СЦТ ворсин в виде продукта реакции красного цвета (указано стрелками), ув. х200. Экспрессия VEGF-3 на 5-6 неделе гестации: А-В - васкулогенез в виде аутохтонно возникающих островков и небольших тяжей ангиобластов; С - ангиобласты и первичные капилляры; D - начало ан-гиогенеза в виде встречных тяжей ангиобластов между сформированными изолированными капиллярами. Экспрессия VEGF-3 на 7-8 неделе гестации: E-F - сформированная первичная капиллярная сеть. Экспрессия [З-hCG на 6-7 неделе гестации: G-I - высокая активность маркёра в апикальной зоне СЦТ хориальных ворсин при негативной реакции в клетках цитотрофобласта. Экспрессия PLAP: К - отсутствие экспрессии маркёра на 6-7 неделе; L-M (ув. хЮО) - экспрессия маркёра на 8-9 неделе в зоне щёточной каймы СЦТ.

8 недели развития, в период, когда p-hCG обнаруживается не только в цитоплазме, но и в свободных симпластах и стромальных макрофагах или клетках Кащенко-Гоффбауэра (рис. 1, «Н-1»), Как известно, ворсинчатый трофобласт содержит две популяции клеток, которые управляют сложными бимолекулярными взаимодействиями и в качестве важного эндокринного органа производят многочисленные факторы роста, регулируя процессы развития и роста плаценты и плода. VEGF является чрезвычайно специфичным мито-геном эндотелиальных клеток, который стимулирует эндотелиальную пролиферацию, миграцию клеток и замедляет апоптоз. Клетки Кащенко-Гоффбауэра часто обнаруживаются в непосредственной близости от цито-трофобласта, васкулогенных иангиогенных клеток-предшественников ворсинчатой ткани [Demir et al„ 2004]. Эти факты наводят на мысль о том, что они задействованы в процессах сопровождения и формирования ангиогенных клеток во время развития ворсинчатого остова. Обнаруженная нами динамика иммуноэкспрессии P-hCG показывает, что его выработка достигает самого высокого уровня в 8 недель, а затем постепенно падает. PLAP, источником которой в организме матери является плацента, относят к белкам, ассоциированным с беременностью и опухолевым ростом. В онтогенезе его экспрессия регулируется таким образом, что до 10-й недели беременности в плаценте присутствует фосфатаза, похожая по свойствам на печеночную взрослого человека, на 10-13 неделях удаётся обнаружить плацентарный изоэнзим, а к 14 неделям этот фермент обнаруживает полную активность, причём синтез его стимулируется эстрогенами [Беда, 2002]. Функция PLAP в организме матери представляется неоднозначной. В условиях физиологической беременности PLAP, наряду с 0-hCG, плацентарным лактогеном, специфическим бе-та-гликопротеином беременных и антигеном Ki-67, относится к маркёрам дифференцировки трофобласта [Onwuameze et al„ 1999], поэтому, по обнаруженной нами динамке экспрессии, она может быть надёжным индикатором срока гестации и развития плаценты.

При патоморфологическом анализе микропрепаратов тканей плаценты, полученных при НБ с РХГ окрашенных гематоксилином и эозином, основное внимание уделялось маточно-плацентарной области, которая визуализировалась по внутреннему, выстилающему слою фибриноида Рора, якорным ворсинам с пролиферацией цитотрофобласта, изменениям хода спиральных артерий и фрагментам прилежащей РХГ. На микропрепаратах были исследованы все без исключения ворсины, которые непосредственно соприкасались с материнскими эритроцитами. Наиболее значимым структурным феноменом ретрохориальной гематомы в маточно-плацентарной области была поверхностная цитотрофобластическая инвазия с редко выявляемым внутрисосуди-стым компонентом (внутрисосудистый цитотрофобласт), который на продольных срезах спиральных артерий встраивался в сохранный слой эндоте-лиальных клеток, а на поперечных срезах формировал лишь неполные цито-трофобластические пробки. Следует отметить, что в просветах таких пробок даже на самых ранних сроках беременности от 5 до 7 недель развития были видны материнские эритроциты (рис. 2-А). В большинстве ворсин хориона обнаружены существенные структурные повреждения щёточной каймы СЦТ: микроворсинки укорочены, редко расположены на уплощенном СЦТ. Ворсинчатый цитотрофобласт представлен прерывистым слоем, строма - мезенхимой с редкими капиллярами на фоне увеличения числа плацентарных макрофагов. В максимальном объёме эти изменения ворсин отмечены в зонах межворсинчатого тромбоза, где щеточная кайма СЦТ практически отсутствовала и материнские эритроциты непосредственно прилегали к «оголённому» эпителию ворсин (рис. 2-В). Учитывая высокое разнообразие причин, приводящих к формированию РХГ, значимой является оценка давности сроков их образования. Как установлено в настоящем исследовании, она обусловлена сроком гестации. На протяжении 5-7 недели гестации преобладали морфологически «свежие» ранние гематомы при относительно сохранных материнских эритроцитах (оцениваемые 0-1 баллами), и, которые составили

ft Щ^Ш

- S •■• ••.'. «л

VtfV ' V, III

< . ' ■ '.. , X - ..

'•• ••. . .. ' V . .

' {*: • ♦ t* К? ? j, •

& Ж*

¿'ГУ г

....

С | Л ^ #

« ■ I?*

«

' АО ' '

t:

S

¿м*, -i. »-'fj, / .

Рис. 2. Микрофото плаценты в области ретрохориальной гематомы. Им-

муногистохимическая экспрессия маркёров СЦТ ворсин в виде продукта реакции красного цвета (указано стрелками). А - неполная цитотрофобластиче-ская пробка с эритроцитами матери в просвете спиральной артерии, 6-7 недель гестации, окр. гематоксилином и эозином (ув. х400); В - ворсина с отсутствием щёточной каймы СЦТ на 5-6 неделе гестации, иммуноэкспрессия PLAP (ув. х200); С - появление иммуноэкспрессии PLAP на 5-й неделе гестации (ув. х400); х200; D - отсутствие иммуноэкспрессии PLAP в ворсинах в 89 недель гестации (ув. х200); Е - васкулогенез на 8-9 неделе гестации, имму-ноэкспрессиия VEGF-3 (ув. х400); F - мозаичная иммуноэкспресия (З-hCG (ув. х200).

85% всех наблюдений. На сроках гестации от 8 до 11 недель гестации выявлены поздние РХГ больших сроков давности (1 балл - 16,3%, 2 балла - 26,2 % и 3 балла - 47,5%) с признаками распада эритроцитов и выходом гемосиде-рина в плазму, появлением сидерофагов. Таким образом, ранние гематомы причинно связаны с преждевременным началом маточно-плацентарного кровотока через неполноценные цитотрофобластические пробки в спиральных артериях, а поздние гематомы формируются в процессе нарастающего объема материнской крови, т.е. в тех сроках гестации, когда маточно-плацентарный кровоток регистрируется с помощью современных ультразвуковых сканеров [Jauniaux et al., 2000; Gembruch and Merz, 2011; Rousian et al., 2010].

Исследование иммуноэкспрессии гистохимических маркёров периода плацентации и ранних этапов развития плаценты позволило дополнить патогенез формирования РХГ рядом существенных элементов. Если в образцах плацентарной ткани пациенток контрольной группы иммуноэкспрессия PLAP в области щёточной каймы СЦТ выявлялась лишь на 7-й неделе гестации, то в случаях НБ с РХГ в ворсинах окруженных материнскими эритроцитами, её очаговая экспрессия была уже видна на 5-й неделе гестации (рис. 2-С). Это явление может быть охарактеризовано как опережающий синтез фермента. Такую реакцию можно расценить как раннюю, предотвращающую развитие РХГ на ранних сроках её развития, но недостаточную по компенсаторным возможностям. Ферментативная активность PLAP является маркёром полноценного функционирования щёточной каймы СЦТ ворсин хориона, предполагается, что она обладает важными антикоагуляционными свойствами [Милованов, 1999; Nozawa et al., 1989; Сухарев, 1992]. Для поздних РХГ наиболее характерно явление резкого снижения активности PLAP и полное её отсутствие в щёточной кайме ворсин, окруженных плотными гематомами после 8-10 недели гестации (рис. 2-D).

Иммуногистохимическое определение экспрессии рецепторов 3 типа к VEGF дополнительно к полученным данным подтвердило слабую васкуляри-зацию ворсин плаценты при НБ с РХГ, которая по морфологическим признакам соответствовала стадии васкулогенеза. С помощью указанного маркера ангиобласты и эндотелиоциты на этой стадии выявлялись в виде изолированных трубочек и тяжей с начинающимися формироваться узкими просветами, изредка содержащими форменные элементы крови (рис. 2-Е). В микропрепаратах плаценты контрольной группы пациенток, в те же гестационные сроки выявлялась полноценная протяженная капиллярная сеть, ангиогенез в ворсинах хориона при физиологически протекающей беременности происходит путем интенсивного почкования капилляров. Коэффициент иммуноэкс-прессии VEGF-3 в основной группе с РХГ составил 122,05+8,90, что статистически в 2 раза ниже, чем в группе сравнения - 223,08±9,43 (р<0,001).

Иммуноэкспрессия p-hCG в плацентарной ткани, полученной от пациенток с НБ и РХГ была мозаичной в пределах даже одной ворсины. Как видно из рис. 2-F небольшие участки СЦТ с выраженной иммуноэкспрессией хори-онического гонадотропного гормона, чередуются с участками, в которых обнаруживаются только его следы. Характерной чертой является также резкое снижение, либо полное отсутствие иммуноэкспрессии в очагах деструкции СЦТ. В ряде случаев эти участки замещались комочками фибриноида. Гра-нулоподобная экспрессия гормона при этом отмечается в прилежащем фиб-риноиде и вблизи гематом (рис. 2-F). Наряду с этим полное отсутствие гормона часто наблюдалось в синцитиальных почках и в свободных симпластах. Коэффициент иммуноэкспрессии P-hCG также, как и в случае с PLAP и VEGF-3, рассчитывался по основной группе в целом и составил 208,9+68,9 единиц, что было статистически значимо на 20% меньше аналогичного показателя в контрольной группе - 267,69+7,34 (р<0,001).

Сопоставление патоморфологической картины нарушений структуры плаценты при НБ с РХГ с результатами иммуногистохимического выявления

плацентарных маркеров позволяют сделать заключение о том, что, наиболее вероятным главным патогенетическим звеном (инициальным фактором) НБ следует считать недостаточность процессов цитотрофобластической инвазии, которая не обладает в этом случае должным объемом и глубиной продвижения стромального и особенно, внутрисосудистого цитотрофобласта. В нашем

НИЗКОКИСЛОРОДНОЕ ОКРУЖЕНИЕ

ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС

Преждевременный маточно-плацентарный кровоток

Рис. 3. Схема элементов патогенеза развития ретрохориальной гематомы при не вынашивании (неразвивающейся) беременности на основе анализа иммуноэкспрессии гистохимических маркёров СЦТ ворсин хориона. I - морфология ворсины хориона и иммуноэкспрессия маркёров при нормальной беременности; II - то же при не вынашивании (неразвивающейся) беременности с ретрохориальной гематомой.

исследовании это подтверждается уменьшением количества пролиферирую-щего цитотрофобласта в основаниях якорных ворсин, неглубоким проникновением стромального цитотрофобласта в сторону спиральных артерий ма-

точно-плацентарной области, и, главное, отсутствием полностью облитери-рующих их просвет цитотрофобластических «пробок», не пропускающих эритроциты матери в межворсинчатое пространство ранней плаценты. Полноценные цитотрофобластические «пробки», и, соответственно, адекватное развитие щёточной каймы СЦТ, васкуляризации ворсин в необходимом для этого низкокислородном окружении наблюдается в нормальном морфогенезе плаценты на 5-7 неделях гестации (рис. 3, часть I). В дальнейшем при становлении всех основных структурных компонентов ворсин сформировавшейся плаценты осуществляется постепенно нарастающий объём маточно-плацентарного кровотока и переход к более эффективному гемохориальному обмену.

При НБ складывается принципиально иное неблагоприятное микроокружение эмбриона и плаценты. Маточно-плацентарный кровоток при этом возникает намного ранее, опережающими темпами из зияющих спиральных артерий, в 5-7 недель, когда структурные компоненты ворсин ещё не готовы к приему артериальной крови, богатой кислородом и свободными радикалами. Они повреждают, прежде всего, щёточную кайму СЦТ, нарушают его гормон-продуцирующую функцию, синтез многочисленных плацентарных белков, процессы перехода васкулогенеза в ангиогенез [Jauniaux et al., 2000]. Ранее всего страдают антикоагуляционные свойства щёточной каймы СЦТ, в зоне непосредственного контакта с материнской кровью. Возникают гемо-реологические условия для образования ранних РХГ и гибели эмбриона. В случае достаточности компенсаторных возможностей щёточной каймы СЦТ, опережающего синтеза и активности PLAP, объём поступающей материнской крови ограничивается и возможен благоприятный исход небольшой краевой РХГ. К 9-11 неделям гестации объёмы поступающей артериальной крови существенно нарастают, структурно незрелая щеточная кайма СЦТ и дефицит PLAP не способны противостоять процессам коагуляции, возникает

оксидативный стресс, что приводит к образованию поздних некомпенсируе-мых форм РХГ с гибелью эмбриона (рис. 3, часть П).

ВЫВОДЫ

1. Ранний морфогенез ворсин плаценты в условиях физиологической беременности сопровождается выраженной продукцией P-hCG, иммуноги-стохимически выявляемой в синцитиотрофобласте, свободных симпластах и стромальных макрофагах (клетках Кащенко-Гоффбауэра), интенсивным ан-гиогенезом с экспрессией 3-го типа рецепторов к VEGF в эндотелиоцитах, формированием капиллярной сети и приближением её к эпителию ворсин, а также устойчивой экспрессией PLAP в щёточной кайме синцитиотрофобла-ста с 7-ой недели гестации.

2. Неразвивающаяся беременность с ретрохориальной гематомой сопровождается выраженными нарушениями гормонпродуцирующей функции синцитиотрофобласта - снижением на 20% и мозаичной иммуноэкспрессии P-hCG, двукратным снижением иммуноэкспрессии VEGFR-3 с задержкой ан-гиогенеза и развития капиллярной сети.

3. Критическим иммуногистохимическим показателем неразвивающейся беременности с ретрохориальной гематомой является опережающая очаговая иммуноэкспрессия PLAP в щёточной кайме синцитиотрофобласта на 56 неделях и нерегулярная её экспрессия с полным исчезновением к 8-10 неделям гестации. Существенное снижение иммуноэкспрессии PLAP, либо негативной её реакция наблюдается в 43,5% случаев.

4. Патоморфологические изменения в плаценте в сопоставлении с им-муноэкспрессией плацентарных маркёров позволяют патогенетически обосновать наличие ранних, компенсируемых ретрохориальных гематом, возникающих на 5-7 неделях развития и поздних некомпенсируемых гематом на 910 неделях развития беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для улучшения качества патоморфологической диагностики при неразвивающейся беременности с ретрохориальной гематомой рекомендуется использовать иммуногистохимические маркёры щёточной каймы синцитиотро-фобласта на PLAP, VEGF-3 и ß-hCG, имеющие тесную функциональную связь с тромболитическими свойствами плаценты.

2. Выделение патогенетически «ранних» ретрохориальных гематом, формирующихся в течение 5-7 недель гестации и «поздних» (8-10 недель гестации) позволяет дифференцировать сроки нарушения маточно-плацентарного кровообращения, и обосновать возможность их коррекции и профилактики ан-тиоксидантными препаратами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Груздев С.А. Инфекционные и неинфекционные предикторы невынашивания беременности/ Канаева Ю.И., Кирикова Е.В., Груздев С.А., Хай-руллин P.M.// В кн.: Онкология сегодня: пациент, государство, медицинское сообщество: матер. VII Росс, научно-практ. конф. с элемент, научн. шк. для молодёжи «Модниковские чтения».- Ульяновск: УлГУ, 2011.- С. 128-132.

2. Груздев С.А. Невынашивание беременности и эколого-физиологическое нормирование в охране репродуктивного здоровья / Груздев С.А., Канаева Ю.И., Кирикова Е.В.// В кн.: Высшее сестринское образование в системе российского здравоохранения: матер, росс, научно-практ. конф. с междунар. участ. (15-16 декабря 2011 г., г. Ульяновск).- Ульяновск: УлГУ, 2011.-С. 14-16.

3. Груздев С.А. Региональные особенности тренда клинико-социальных показателей женщин с невынашиванием беременности/ Канаева Ю.И., Груздев С.А., Кирикова Е.В.// В кн.: Высшее сестринское образование в системе российского здравоохранения: матер, росс, научно-практ. конф. с междунар. участ. (15-16 декабря 2011 г., г. Ульяновск).- Ульяновск: УлГУ, 2011.-С. 25-27.

4. Груздев С.А. Эмбриохориальная недостаточность: обоснование, дефиниции и патогенетические механизмы/ Милованов А.П., Ожиганова И.Н., Груздев С.А.// В кн.: Матер.VI Пленума президиума Росс. общ. патологоанатомов (15-17 мая 2012 г., г. Н. Новгород).- Нижний Новгород.- 2012.-С. 24-28.

5. Груздев С.А. Патогенез ретроплацентарной гематомы при неразвивающейся беременности/ Груздев С.А., Милованов А.П.// В кн.: Труды V

Съезда Росс. общ. дет. патологов 21-22 мая 2012 года.- С.-Пб. Зелено-горек, 2012,-С. 209-211.

6. Груздев С.А. Клинико-социальные аспекты причин неразвивающейся беременности/ Канаева Ю.И., Груздев С.А., Милованов А.П., Хайруллин P.M.// В кн.: Первый Национальный Форум «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации», Ростов-на-Дону, 18-19 октября 2012 года,- Ростов-на-Дону, 2012,- С. 13-14.

7. Груздев С.А. Активность плацентарной щелочной фосфатазы в синци-тиотрофобласте как маркёр ретрохориальной гематомы/ Груздев С.А., Милованов А.П., Хайруллин P.M., Канаева Ю.И.// В кн.: Первый Национальный Форум «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации», Ростов-на-Дону, 18-19 октября 2012 года.- Ростов-на-Дону, 2012.-С. 10-11.

8. Груздев С.А. Иммуногистохимическая экспрессия некоторых маркёров синцитиотрофобласта на ранних стадиях развития плаценты человека/ Груздев С.А., Хайруллин P.M., Милованов Л.П.// Фундаментальные исследования.- 2012.- № 12.- Ч. 1.- С. 52-58.

9. Груздев С.А. Об участии клеток Кащенко-Гоффбауэра в тканевом обмене хорионического гонадотропина на ранних этапах беременности/ Груздев С.А., Хайруллин P.M., Милованов А.ПЛ Фундаментальные исследования.- 2013.- № 5.- Ч. 1.- С. 67-71.

10. Груздев С.А. О роли отдельных продуцентов ворсин плаценты в патогенезе ретрохориальной гематомы при неразвивающейся беременности/ Груздев С.А., Милованов А.П., Калашников А.С., Хайруллин P.M.// Фундаментальные исследования.- 2013.- № 7.- С. 61-66.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НБ - невынашивание беременности, неразвивающаяся беременность

РХГ - ретрохориальная гематома

СЦТ - синцитиобластический трофобласт

P-hCG - (P-human Chorionic Gonadotropin) Р-субъединица хорионического гонадотропного гормона человека

PLAP - (Placental Alkaline Phosphatase) - плацентарная щелочная фосфатаза

VEGF-3 (Vascular Endothelial Growth Factor 3) - фактор роста эндотелия сосудов 3-го типа

HS - (Histochemical Score) - гистохимический коэффициент