Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Иммунодепрессивная терапия активных форм нефрита (клинико-экспериментальное исследование)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ШИЛОВ ЕВГЕНИЙ МИХАЙЛОВИЧ

ИММУНОДЕПРЕССИВНАЯ ТЕРАПИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ НЕФРИТА (КАИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) (14.00.05 — внутренние болезни)

Диссертация

на соискание ученой степени доктора медицинских наук в форме научного доклада

Москва 1994

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.М. Ермоленко доктор медицинских наук, профессор A.A. Михайлов доктор медицинских наук, профессор В.В. Сура

Ведущее учреждение - Институт ревматологии МЗ РФ

Защита состоится "_"_ 1994 года в "_" час. на

заседании специализированного ученого совета (Д-074.05.03) при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (Москва, Б. Пироговская ул., д. 2/6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (Зубовская площадь, д. 1).

Автореферат разослан "_"_____199 года.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета N 3 кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник Т.В. Рябова

АД АТ

БПВН ВН

гкг гн

ИЛ-1а,Р ИПРФ-1

мк мн-мн

МП

мпгн мкгн

НС

нтн

осн

ФНОа

ФП

ФСГС

пз

ТРФР

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

-артериальное давление -антитела

-быстропрогрессирующий волчаночный нефрит

-волчаночный нефрит

-главный комплекс гистосовместимости

-гломерулонефрит

-интерлейкин-1 альфа и бета '

-инсулиноподобный ростовой фактор-1

-мезангиальные клетки

-мононуклеарные (лейкоциты)

-мембранозный нефрит

-метилпреднизолон

-мезангиопролиферативный ГН

-мезангиокапиллярный ГН

-нефротический синдром

-нефротоксический нефрит

-острый сывороточный нефрит

-фактор некроза опухоли-альфа

-фибропластический нефрит

-фокально-сегментарный гломерулосклероз

-преднизолон

-трансформирующий рост фактор бета

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 5

Материалы и методы исследования 12

A. Клинические исследования 12

B. Экспериментальные исследования 16 Результаты исследований 20

A. Клинические исследования 20

1. Ретроспективный анализ результатов лечения прогрессирующих форм ГН цитостатиками 20

2. Клиническое испытание нового метода лечения хронического ГН сверхвысокими

дозами ЦФА 26

3. Прогноз больных волчаночным нефритом

при лечении сверхвысокими дозами ЦФА 34

4. Прогноз больных быстропрогрессирующим волчаночным нефритом, леченных

сверхвысокими дозами ЦФА 38

5. Осложнения пульс-терапии ЦФА у больных

ГН и ВН 44

B. Экспериментальные исследования 45

1. Особенности использованного

экспериментального подхода 45

2. Роль генотипа в развитии экспериментального ГН и его чувствительности к циклофосфановой пульс-терапии 47

3. Механизмы гломерулярного иммунного воспаления (роль мононуклеарных лейкоцитов, тромбоцитов)

и воздействия на него МП и ЦФА 51

Заключение 59

Выводы 63

Список работ, опубликованных по теме диссерации 62

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и современное состояние проблемы.

Результаты лечения больных гломерулонефритом (ГН) нельзя считать удовлетворительными. Иммунодепрессивные препараты улучшили прогноз некоторых форм ГН, но дальнейших успехов, используя обычные методы лечения, достичь не удается [Shena, Cameron, 1989]. Разработка новых методов лечения, способных предотвратить или замедлить развитие почечной недостаточности, имеет большое медицинское, социальное и экономическое значение (молодой возраст больных, высокая стоимость гемодиализа и трансплантации). По расчетам экспертов США, отдаление сроков развития терминальной почечной недостаточности на 5 лет только у 10% больных ГН дает экономию бюджета в 25 млн. долларов [Glassock, 1981].

Методы лечения кортикостероидами и цитостатиками, которые используются в настоящее время, разработаны исключительно эмпирическим путем - исходя из общих представлений об иммуновоспалительной природе ГН и мало учитывают индивидуальные особенности патогенеза [Glassock, 1992; Cameron, 1992]. Научные основы рациональной иммунодепрессивной терапии разработаны слабо и в первую очередь в экспериментальном плане. Механизмы действия кортикостероидов и цитостатиков на гломерулярное иммунное воспаление все еще недостаточно понятны [Westberg, 1992]. Среди причин этого: отсутствие систематических исследований по экспериментальной терапии, а также универсальных моделей ГН, которые бы реально отражали ситуацию в клинике у человека (многообразие морфологических вариантов, патогенетических механизмов, наличие разных фаз и стадий течения болезни).

В разработке методов лечения ГН наметились две основные тенденции. Первая, нацеленная в отдаленной перспективе на кардинальное решение проблемы, - поиск принципиально новых подходов к воздействию на иммунное почечное воспаление с учетом новых данных о механизмах развития и прогрессировать ГН - роли генетических факторов, иммунной системы, механизмов межклеточного взаимодействия в почечных клубочках в норме и при иммунном воспалении [Schrier, Klahr, 1990]. Вторая тенденция, ориентированная на сегодняшний день и ближайшую перспективу, - стремление максимально использовать возможности имеющихся иммунодепрессивиых препаратов, разработать новые способы их применения с целью повышения иммунодепрессивного и

противовоспалительного действия с одновременным снижением уровня побочных эффектов [Steinberg, 1986; 1989].

Для реализации этих тенденций требуются современная экспериментальная база и методически правильно организованные клинические исследования. Необходимы: (1) комплекс экспериментальных моделей ГН у животных, воспроизводящих основные особенности ГН человека - генетически обусловленную гетерогенность морфологических вариантов, естественной эволюции в нефросклероз, чувствительности к иммунодепрессивной терапии (Steinberg, 1986] и (2) комплекс методов in vivo и in vitro для изучения клеточных и молекулярных механизмов патогенеза ГН и действия на них иммунодепрессивных препаратов, который включает в себя современные морфологические иммунологические методы, а также анализ межклеточных взаимодействий с помощью культуры клеток почечных клубочков [Lovett, Sterzel, 1986; Schrier, Klahr, 1990].

Из-за относительно медленной скорости прогрессирования большинства случаев ГН, с развитием уремии через 5-10 лет от начала болезни, контролируемые клинические испытания методов лечения требуют достаточно длительных сроков наблюдения для получения надежных результатов. В этой ситуации важное значение сохраняют ретроспективные исследования при условии их правильной методической организации и выполнения. Их цель - не только обнаружить более эффективный метод, но и выявить больных, чувствительных или резистентных к тому или другому методу лечения, что позволит в дальнейшем избежать необоснованного назначения иммунодепрессивных препаратов [Westberg, 1992]. Единственно надежным способом решения этих вопросов является анализ выживаемости в сочетании с методами многомерного статистического анализа [Cameron, 1989]. Результаты этих клинических исследований в сочетании с экспериментальными данными о механизмах действия кортикостероидов и цитостатиков на гломерулярное иммунное воспаление позволят разработать научно-обоснованный подход к рациональной иммунодепрессивной терапии ГН.

Теоретически, эффективность лечения ГН можно повысить, усиливая иммунодепрессивный и противовоспалительный потенциал -применяя иммунодепрессанты в новых лекарственных режимах. Один из путей - периодическое введение сверхвысоких доз препаратов - так называемая "пульс-терапия" [Steinberg, 1986]. Преднизолоновая пульс-терапия оправдала себя при купировании кризов отторжения почечных трансплантатов, затем при лечении тяжелого волчаночного и

быстропрогрессирующего ГН [Cathcart et al., 1978; Couser, 1989]. Введение сверхвысоких доз циклофосфамида (циклофосфана [ЦФА]) в 1982 году предложено для лечения больных волчаночным нефритом [Dinant et al., 1982). К началу данной работы сведений о применении циклофосфановой пульс-терапии при ГН не было.

Начиная с 1985 г., автором ведутся исследования по разработке научных основ рациональной иммунодепрессивной терапии ГН. В основу исследований положено единство двух подходов: клинического и экспериментального.

Клинический подход объединяет:

(1) Анализ накопленного клинического опыта лечения ГН иммунодепрессантами с максимальным использованием биопсийной информации с целью выявить группы больных, чувствительных к данному методу лечения, и резистентных больных, которые в первую очередь должны рассматриваться кандидатами на новые, более активные методы лечения;

(2) Оценку эффективности новых методов лечения ГН.

Экспериментальный подход включает в себя:

(1) Создание комплекса экспериментальных моделей ГН, воспроизводящих весь спектр морфологических вариантов ГН человека;

(2) Использование комплекса методов in vivo и in vitro, позволяющих провести многоплановый анализ механизмов патогенеза ГН (морфологические, иммунологические, биохимические методы, методы культуры клеток);

(3) Анализ клеточных и молекулярных механизмов воздействия иммунодепрессантов на течение экспериментального ГН.

Цель работы: Повысить эффективность лечения ГН путем разработки научно-обоснованного подхода к рациональной иммунодепрессивной терапии, включая теоретическое обоснование использования цитостатиков и оптимизацию показаний для их применения.

Задачи исследования:

1. Провести ретроспективный анализ эффективности пероральной терапии цитостатиками у больных хроническим ГН с выделением группы больных, резистентных к этому методу терапии.

2. Оценить эффективность сверхвысоких доз ЦФА в лечении активных и прогрессирующих форм хронического ГН и волчаночного ГН.

3. С помощью многомерного статистического анализа выявить факторы, предсказывающие результаты ЦФА пульс-терапии у больных хроническим и волчаночным ГН.

4. Создать систему экспериментальных моделей ГН для оценки влияния иммунодепрессивных препаратов и разработки новых терапевтических подходов.

5. Изучить на экспериментальных моделях клеточные и молекулярные механизмы основных проявлений гломерулярного иммунного воспаления (роль антительного ответа, мононуклеарных лейкоцитов, цитокинов) и влияния на эти процессы иммунодепрессивных препаратов (МП и ЦФА).

6. Исследовать роль генотипа в развитии гломерулярного иммунного воспаления, а также в чувствительности ГН к ЦФА пульс-терапии.

Научная новизна:

1. Впервые на большом репрезентативном клиническом материале показана эффективность и хорошая переносимость терапии сверхвысокими дозами ЦФА, позволившей добиться хороших непосредственных результатов у половины больных ГН, резистентных к обычным методам иммунодепрессивной терапии. Выявлены клинические и морфологические признаки, позволяющие прогнозировать чувствительность больных к этому методу терапии.

2. Доказана высокая эффективность комбинированного метода лечения БПВН сверхвысокими дозами ЦФА в сочетании с пульсами МП и плазмаферезом, повысившего 5-летнюю почечную выживаемость с 5% до 75%.

3. Разработаны количественные морфологические критерии (индексы активности и склероза), позволяющие прогнозировать эффективность иммунодепрессивной терапии и течение процесса у больных ГН и ВН.

4. Предложена комплексная перспективная программа разработки научных основ рациональной иммунодепрессивной терапии ГН, объединяющая клиническое и экспериментальное направления.

5. Применен новый экспериментальный подход для анализа механизмов патогенеза ГН и воздействия иммунодепрессантов на гломерулярное иммунное воспаление, основанный на одновременном изучении процессов in vivo и in vitro.

6. Новыми являются данные о роли нммуно-генетического фактора в развитии морфологических вариантов ГН и чувствительности ГН к ЦФА.

7. Показана сложная регуляторная роль мононуклеарных лейкоцитов и тромбоцитов в пролиферации клеток почечного клубочка и синтезе ими компонентов внеклеточного матрикса при гломерулярном иммунном воспалении.

8. Впервые выявлено различное влияние МП и ЦФА на процессы отложения коллагена - возможность торможения с помощью ЦФА склеротических процессов при иммунном воспалении в почечных клубочках, экспериментально обосновывающая терапию сверхвысокими дозами ЦФА.

Практическая значимость:

Результаты работы определяют тактику рациональной иммунодепрессивной терапии у больных ГН, а также дают рекомендации для экспериментальных исследований, изучающих механизмы действия иммунодепрессантов и разрабатывающих новые методы лечения нефритов.

1. Результаты экспериментального раздела работы обосновывают использование как кортикостероидов, так и ЦФА на ранних этапах иммунного воспаления в почечных клубочках и предпочтительное применение ЦФА при стихании активного иммунного воспаления, начальных стадиях репарации и развития склероза. Снижение риска прогрессирующего склероза делает ЦФА препаратом выбора для длительного лечения хронического ГН.

2. Эффективность пульс-терапии ЦФА у половины больных ГН, резистентных к обычной пероральной иммунодепрессивной терапии, и у 3/4 больных с тяжелым ВН позволяет использовать этот метод в случаях резистентности, плохой переносимости или малой надежды на успех от обычной иммунодепрессивной терапии.

3. Существенное улучшение прогноза больных БПВН, получавших "комбинированный" метод лечения, позволяет рекомендовать этот метод для клинического применения.

4. Выявление клинических и морфологических признаков, прогнозирующих эффективность пероральной терапии цитостатиками или пульс-терапии ЦФА, позволяют сформулировать или уточнить показания для этих методов лечения у больных ГН и ВН.

5. Доказательство значительной прогностической роли морфологической информации (включая разработанную модификацию индексов активности и склероза) обосновывает важность биопсии почки для выбора метода иммунодепрессивной терапии. При решении вопроса о

назначении пульс-терапии ЦФА, особенно больным с большой длительностью нефрита и/или повышенным уровнем креатинина, данные биопсии почки должны играть решающую роль.

6. Использованный в работе комплекс экспериментальных моделей, воспроизводящих спектр морфологических вариантов ГН с различной чувствительностью к иммунодепрессивной терапии, и оригинальный экспериментальный подход одновременного анализа патологических процессов in vivo и in vitro могут быть использованы для изучения патогенетических механизмов ГН, а также для исследования механизмов действия различных препаратов и разработки новых методов лечения нефритов.

7. Экспериментальные данные о патогенетической роли мононуклеарных лейкоцитов и тромбоцитов могут быть (с известной осторожностью) перенесены на аналогичные процессы, протекающие у человека, и использованы в планировании дальнейших исследований патогенеза ГН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Лечение цитостатиками внутрь эффективно (непосредственный эффект) у 3/4 больных активным ГН при следующих морфологических формах: мембранозном, мезангиопролиферативном, мезангиокапиллярном нефрите и нормальном уровне креатинина.

2. Пульс-терапия циклофосфаном - хорошо переносимый и эффективный метод лечения ГН, позволяющий добиться хорошего непосредственного ответа и улучшить прогноз у значительной части больных, резистентных к пероральному приему иммунодепрессантов (в т.ч. больных фокально-сегментарным гломерулосклерозом и фибропластическим нефритом), при условии высокого морфологического индекса активности и применении достаточно большой суммарной дозы циклофосфана.

3. Пульс-терапия циклофосфаном - эффективный метод лечения тяжелого волчаночного нефрита, позволяет добиться ремиссии и замедлить прогрессирование у больных с мембранозным и пролиферативным волчаночным нефритом, при отсутствии тяжелых склеротических изменений в ткани почек. Комбинированная терапия (основа которой -сверхвысокие дозы циклофосфана) существенно улучшает прогноз больных быстропрогрессирующнм волчаночным нефритом.

4. При экспериментальном ГН у мышей развитие определенного морфологического варианта ГН и его дальнейшая эволюция (длительность активного иммунного воспаления, скорость развития склеротических процессов) определяются генотипом (генами главного комплекса гистосовместимости и другими генами, расположенными вне его). Чувствительность гломерулярного иммунного воспаления к пульс-терапии циклофосфаном также связана с генотипом.

5. Мононуклеарные лейкоциты и тромбоциты - главные продуценты медиаторов иммунного воспаления в почечных клубочках - цитокинов (интерлейкина-1 альфа и бета, фактора некроза опухоли-альфа, инсулиноподобного ростового фактора-1), контролирующих пролиферацию мезангиальных клеток и синтез коллагена.

6. Механизмы воздействия метилпреднизолона и циклофосфана на развитие и течение иммунного воспаления в почечных клубочках не одинаковы: циклофосфан, в отличие от метилпреднизолона, не ведет к бессистемному накоплению внеклеточного матрикса, снижая риск прогрессирующего склероза, что оправдывает его клиническое применение.

Внедрение результатов в практику.

Основные научные положения, выводы и рекомендации настоящего исследования используются в научной, педагогической и клинической работе следующих подразделений ММА им. И.М.Сеченова: кафедры терапии и профзаболеваний, кафедры нефрологии ФУВ, кафедры патологической анатомии; отделения нефрологии клиники терапии и профзаболеваний, отделения ревматологии клиники факультетской терапии, отделения ревматологии клиники детских болезней, научно-исследовательских лабораторий нефрологии и клинической морфологии НИЦ ММА.

Апробация работы.

Материалы исследования представлены и обсуждены на XII Международном конгрессе по нефрологии (Иерусалим, 1993), XVII и XXX Конгрессах Европейской ассоциации по диализу и трансплантации (Вена, 1990; Глазго, 1993), Конгрессе международного общества патофизиологов (Москва, 1991), 2-м Симпозиуме нефрологов социалистических стран (Ленинград, 1989), Конгрессе нефрологов Чехословакии (Прага, 1990), 1-й конференции нефрологов Северо-запада РСФСР (1987), XIX Всесоюзном съезде терапевтов (Ташкент, 1987), Республиканской конференции

нефрологов и урологов Белоруссии (Минск, 1989), VIII Пленуме правления Всесоюзного научного общества нефрологов (Кишинев, 1990), V Пленуме союзной проблемной комиссии "Нефрология" (Фрунзе, 1990), школах-семинарах врачей нефрологов РСФСР (Иваново, 1990; Воронеж, 1991; Курск, 1991), 1-й Всесоюзной конференции по экстракорпоральным методам лечения ревматологических заболеваний (Ростов-Великий, 1989), на заседаниях секции нефрологии и иммунопатологии МГНОТ (1989, 1991, 1992).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ А. КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Больные. Клиническую часть работы составили 4 серии исследований, охвативших в общей сложности 233 больных ГН и ВН:

(1) Анализ результатов лечения больных ГН цитостатиками внутрь (117 больных);

(2) Оценка эффективности пульс-терапии ЦФА у больных ГН (44 больных);

(3) Анализ эффективности пульс-терапии ЦФА у больных активным ВН (34 больных);

(4) Сравнение эффективности "стандартного" и нового ("комбинированного") метода лечения больных БПВН (38 больных). Больным проводилось общепринятое клиническое и лабораторное обследование, всем (кроме части больных БПВН) выполнена биопсия почки.1

2. Морфологическое исследование почечных биоптатов (проводилось проф. В.А.Варшавским - кафедра патологической анатомии ММА им И.М.Сеченова и д.м.н. А.А.Ивановым - лаб. клинической морфологии НИЦ ММА). Выполнялась световая микроскопия парафиновых срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, иммунолюминесцентная микроскопия

1 Клиническая часть работы проведена совместно с сотрудниками проблемной лаборатории по нефрологии НИЦ ММА к.м.н. Т.Н. Красновой, к.м.н. Н.Б. Гордовской, к.м.н. Ю.С. Миловановым, Д.В. Самойловым на базе нефрологического отделения (зав. - к.м.н. Н.Г. Мирошниченко), клиники терапии и профзаболеваний (директор - член.-корр. РАМН, проф. H.A. Мухин) ММА им. И.М. Сеченова, которым автор выражает искреннюю благодарность.

криостатных срезов с антисыворотками к иммуноглобулинам человека А, М, G и СЗ-фракции комплемента, электронная микроскопия.

Помимо определения морфологического варианта нефрита по принятой классификации [Серов В.В., 1977], в почечном биоптате полуколичественно оценивали признаки, характеризующие активный воспалительный процесс (в совокупности составляющие индекс активности) и необратимые склеротические изменения (индекс склероза), по Austin et al. [1983] в модификации А.А.Иванова. Индекс активности оценивался на основании 10 показателей: интракапиллярная пролиферация, клеточные полулуния, пролиферация подоцитов, пролиферация мезангиальных клеток, нейтрофильная инфильтрация, наличие тромбоцитов в клубочках, кариорексис, депозиты иммунных комплексов, васкулиты, воспаление интерстиция. Индекс склероза включал в себя 7 показателей: сморщенные клубочки, сегментарный склероз и гиалиноз, склероз мезангиалыюго матрикса, синехии, перигломерулярный склероз, атрофию канальцев, склероз интерстиция. Каждый из признаков оценивался по шкале от 0 до 3 баллов.

3. Оценка результатов лечения и методы статистического анализа. Для оценки эффективности лечения анализировали: (1) непосредственный ответ больных на лечение, (2) выживаемость больных и (3) скорость прогрессирования почечной недостаточности.

(1) Непосредственный ответ больных на леченне. Выделялись следующие варианты (Shena, Cameron [1989] с небольшими изменениями).

1. Ремиссия: для больных с НС - исчезновение признаков НС с полным восстановлением нарушенной функции почек или с сохранением нормальной функции почек; для больных с активным ГН без НС -снижение протеинурии ниже 1 г/сут. при сохранной функции почек

2. Улучшение: частичное уменьшение признаков НС с полным восстановлением функции почек или исчезновение НС при отсутствии дальнейшего прогрессирования почечной недостаточности; для больных с активным ГН без НС - восстановление функции почек при уровне протеинурии 1-3 г/сут.

3. Ухудшение: персистирование НС с дальнейшим нарастанием почечной недостаточности; для больных с активным ГН без НС - развитие НС и/или нарастание почечной недостаточности.

4. Уремия: повышение сывороточного креатинииа >5,0 мг%.

5. Смерть от почечных или непочечных причин.

Положительный ответ на лечение включал в себя ремиссию или улучшение, отрицательный ответ - ухудшение, уремию или смерть больного.

(2) Анализ выживаемости проведен моментным методом KaplanMeier с учетом времени от начала лечения до момента развития исхода. Рассчитывали два вида выживаемости: "почечную" и "общую". Исходом в первом случае являлась "почечная смерть" - развитие тяжелой почечной недостаточности (креатинин >5 мг%) , во втором - или смерть больного от почечных и других причин, или развитие тяжелой почечной недостаточности. У больных с быстропрогрессирующим течением нефрита критерием "почечной смерти" считался уровень креатинита >8мг%. Сравнение кривых выживаемости разных групп больных выполнялось с помощью теста logrank.

Прогностические факторы. Для выявления больных, чувствительных или резистентных к анализируемому методу лечения были изучены прогностические факторы - признаки, предсказывающие прогрессирование или, наоборот, отсутствие прогрессирования болезни после проведения данной терапии.

Монофакторный анализ. Для оценки индивидуального прогностического значения каждого из предполагаемых факторов использовался монофакторный вариант регрессионной модели Сох'а [1972]. Для этого в регрессионную модель по очереди вводился каждый из предполагаемых признаков (факторов) и оценивалось его индивидуальное прогностическое значение. После выявления факторов, имеющих достоверное прогностическое значение, каждый из них делился на подуровни. Затем для подгрупп больных, относящихся к этим подуровням, строились кривые выживаемости, различия между которыми оценивались с помощью теста logrank.

Многофакторный анализ. Учитывая возможность взаимной корреляции прогностических факторов, для выявления тех из них, которые обладают независимым влиянием на прогноз, был проведен многофакторный регрессионный анализ выживаемости [Сох, 1972], в котором действие каждого из факторов оценивается с коррекцией на одновременное действие других прогностических факторов. В регрессионной модели Сох'а фактор считается независимым и значимым, если его включение в модель существенно (р<0,05) улучшает предсказание развития исхода (почечной недостаточности или смерти больного). Значение "р" для каждого из факторов определялось с помощью теста проверки отношения правдоподобия. На первом этапе в многофакторную

модель были введены все предполагаемые факторы. Затем из модели удалялся фактор, обладающий наименьшей статистической значимостью, и оценивалась значимость оставшихся факторов. Процедура удаления слабых факторов повторялась до тех пор, пока в модели не оставались только значимые и независимые факторы.

Помимо выявления значимых прогностических факторов, было сформировано несколько математических моделей, включавших такую комбинацию прогностических факторов , которая наиболее точно предсказывала исход больного после лечения. Это позволило охарактеризовать больных , которые могут ответить (или не ответить) на данный метод лечения - тем самым сформулировать показания к его назначению. Модели строились в несколько этапов, на каждом из которых в них вводилось разное число факторов - соответственно тому объему информации, которым располагает врач на разных, последовательных, этапах обследования больного ГН и принятия решения о лечении.

На первом этапе, который соответствовал ситуации, когда не известны данные биопсии почки, в модель вводились только демографические и клинические данные (Модель 1 - клиническая). Поскольку лечение могло влиять на выживаемость, 1-я модель была скорригирована введением в нее параметров терапии (Модель 2). Наконец, в дополнение к ранее введенным параметрам в модель вводилась морфологическая информация - морфологический вариант ГН, индексы активности и склероза (Модель 3), что позволило решать вопрос о пользе морфологической информации и важности биопсии почки. Для всех расчетов выживаемости использовалась компьютерная программа "SurvCalk".

(S) Скорость прогрессировання почечной недостаточности оценивалась по следующей формуле: [ 1/СгО - 1/Crl ] / Т, где СгО и Cri -уровни сывороточного креатинина перед началом лечения и в конце периода наблюдения соответственно, а Т - длительность наблюдения больного (в мес.).

Монофакгорный анализ. Для выяснения связи каждого из прогностических факторов с типом ответа на лечение выясняли различие по данному фактору между двумя группами больных, имеющих положительный или отрицательный результат терапии. Для этого применяли: медианный тест - для количественных переменных, точный метод Фишера - для сравнения пропорций, вариант метода Манна-Уитни -для сравнения порядковых переменных.

Многофакторный анализ. Вопрос о прогностическом значении биопсий почек решался путем сравнения трех прогностических моделей, которые связывали скорость прогрессирования почечной недостаточности с комплексом прогностических переменных в виде уравнения множественной линейной регрессии. В первую, клиническую, модель были введены только клинические прогностические факторы, во вторую модель дополнительно к клиническим введен один морфологический фактор - тип морфологических изменений в почечном биоптате, в третью - вводились все предыдущие признаки плюс индексы активности и склероза.

При создании каждой из трех моделей с помощью компьютерной процедуры пошаговой множественной линейной регрессии (ПСП "Statgraphix") из предложенного для данной модели комплекса переменных отбирали группу факторов, которая наиболее точно предсказывала результаты терапии (скорость прогрессирования). Меру предсказывающей силы модели (коэффициент множественной линейной корреляции, R2) оценивали с помощью стандартного F-теста.

В. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Экспериментальные животные. В работе использованы крысы Wistar (самцы, весом 180-200 г - 220 животных) и имбредные мыши 5 линий: СВА, C57BL, BALB/c, NFR, NFS (самцы в возрасте 10-12 недель, весом 18-20 г - 280 животных).

¡¡Донорская [ si лошадииаа! ¡оыворотха]

Ю/

VXI_I_I_I_L_

-J_I_I_L.

GD'

JO

J

Морфолога qt cKii

ЯЯЯТТИД

(см) (н^И^м)

Рис. 1. Схема индукции острого сывороточного нефрита у мышей различных линий с введением и без введения циклофосфана (ЦФА). СМ -световая микроскопия, ИФ - иммунофлюоресцентная микроскопия, ЭМ -электронная микроскопия.

2. Экспериментальные модели ГН.

(1) Острый сывороточный нефрит (OCH). ОСН индуцировали введением мышам 5 различных линий донорской лошадиной сыворотки (Flow, Англия) по 1,0 мл в/б ежедневно в течение 10 дней (рис. 1). Контрольной группе вводили по 1,0 мл физиологического раствора. За 1 час до начала индукции ОСН одной из групп мышей интрагастралыю вводили по 0,1 мл ЦФА из расчета 240 мг/кг. За 18 час. до конца эксперимента мышей помещали в метаболические клетки для сбора мочи. Содержание белка в моче и гематурию определяли на анализаторе "Urotron" (Boehringer Mannheim, Австрия), биохимическое исследование сыворотки крови (общий белок, холестерин, азот мочевины, креатинин) проводили на анализаторе "Technicon" (Англия). Хроническую стадию ОСН исследовали на 30-й день от начала индукции.

+ * +■ 4 ■:PU1!| 4- 1 i 1

I I I I I I I I г

о 5

ат)-

—I—I—\—I—I—I 10 _14 15

1. Скорость пролиферации ^ ( Н - тимпдин)

2. Кл«точшый состав

- м»7ангжальиы1 елсгш

- мовоиуклсарные клегки (сигош и люмннисценгпая микроскопия)

Анализ супсрвагшгд J. Цятоеяпы: ИЛ-1альфа, ИЛ-1бета, ФНОяльфя, ТцФР, ИПФР-1

Рис. 2. Схема индукции нефротоксического нефрита (аутологичная фаза) на фоне введения и без введения метилпреднизолона (МП) или циклофосфана (ЦФА). НТС - нефротоксическая сыворотка, СМ - световая микроскопия, ИФ - иммунофлюоресцентная микроскопия, ЭМ электронная микроскопия.

(2) Нефротокскческкй нефрнт (НТН). Нефротоксическую сыворотку получали путем двукратной иммунизации кроликов суспензией базальных мембран клубочков. Для этого из коркового слоя почек крыс выделяли почечные клубочки, подвергали их ультразвуковой обработке до получения суспензии гломерулярных базальных мембран (ГБМ) на ультразвуковом

гомогенизаторе. Контроль чистоты суспензии проводили с помощью электронной микроскопии. НТС адсорбировали эритроцитами крысы и нагревали при 56° С в течение 90 мин. для разрушения комплемента. Гамма-глобулиновую фракцию анти-ГБМ сыворотки получали сульфат-риваноловым методом с последующей очисткой на колонке с сефадексом G-50 (Pharmacia, Швеция). Конечная концентрация белка в сыворотке - 260 мг/мл.

НТН индуцировали у крыс Wistar путем в/в введения 0,5 мл НТС из расчета 11 мг/100 г веса. Контрольным крысам вводили аналогичный объем физиологического раствора (рис. 2). Контрольным животным вводили аналогичный объем физиологического раствора. Аутологнчную фазу НТН изучали на 15-е сутки после введения НТС.

ЦФА вводили интрагастрально (240 мг/кг) за 1 час до индукции НТН. Метилпреднизолон (МП) вводили за 2 часа до начала индукции НТН в/б в дозе 14 мг/кг или 4 мг/кг и продолжали введение в течение всего срока развития НТН.2 За 18 часов до конца эксперимента крыс помещали в метаболические клетки для сбора мочи. Исследование протеинурии, гематурии, биохимических показателей сыворотки крови проводили выше описанными способами.

3. Культура клеток почечных клубочков. Почечные клубочки, полученные протиранием и просеиванием коркового слоя почек через сита (поры 110 мк и 38 мк - для крыс и 75 мк и 38 мк - для мышей), обрабатывали раствором коллагеназы - 750 ед/мл (Sigma, США) в течение 1 часа при 37° С. Далее клубочки помещали в 24-луночные платы, поверхность которых предварительно обрабатывали коллагеном, и культивировали при 37° С, 95% влажности и 5% С02 в воздухе в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глютамин (20 мМ), пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Культивирование проводили в течение 20 дней под контролем фазово-контрастной микроскопии.

На 20-й день культивирования определяли число мононуклеарных клеток в 5 полях зрения, произвольно выбранных в каждой лунке (увеличение х 320), и выражали в виде среднего числа клеток в поле зрения микроскопа. Интенсивность пролиферации мезангиальных клеток оценивали по включению Н3-тимндина в ядерную ДНК, которое

2 - часть экспериментов проведена совместно со ст. научн. сотр. Н.В.

Никифоровой (НИИ урологии МЗ России).

подсчитывали на бета-счетчике и выражали в виде числа имп./мин. (среднее из 3-х лунок).

4. Определение цитокинов. Активность интерлейкина-1 (ИЛ-1) в супернатанте культуры мезангиальных клеток определяли по пролиферации ФГА-стимулированных тимоцитов мышей BALB/c и выражали в виде числа имп./мин. и индекса стимуляции (среднее из 3-х лунок).3

Концентрацию интерлейкина-1 альфа (ИЛ-1а), интерлейкина-1 бета (ИЛ-1 в), фактора некроза опухоли альфа (ФНОа), инсулиноподобного ростового фактора-1 (ИПРФ-1) и тромбоцитарного фактора роста (ТФР) определяли в супернатанте культур мезангиальных клеток с помощью радиоиммунологического анализа, используя коммерческие наборы (Amersham, Англия), результаты выражали в нг/мл.4

5. Морфологическое исследование ткани почек и культур клеток. Материал изучался с помощью светооптического, иммунолюминесцентного и электронномикроскопического методов (д.м.н. А.А.Иванов).

Светооптическое исследование проводилось на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, а также в лунках культуральных плат, окрашенных азуром П-метиленовым синим-фуксииом.

Иммунолюминесцентную микроскопию проводили на криостатных срезах (4-5 мкм) и культуре клеток почечных клубочков после фиксации материала холодным ацетоном. Использовали моно- и поликлональные антитела к иммуноглобулинам кролика, меченные ФИТЦ (Dakopatts, Дания), к Ig крысы, IgG и IgM мыши, меченные ФИТЦ (Sigma, США), к общему лейкоцитарному антигену крысы (MRC Ох-1; Cedarlane, Канада), к коллагенам I, III, IV типов (Динго, Кардиоцентр).

3 - работа проведенна совместно с гл. научн. сотр. В.П. Лесковым (Институт иммунологии МЗ России).

4 - работа проведена совместно со ст. научн. сотр. Е.П. Гителем (лаб. клинической биохимии тканевых гормонов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ А. КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Ретроспективный анализ результатов лечения прогрессирующих форм ГН цитостатикамн

Задача данного этапа исследований - оценить непосредственный и отдаленный эффект обычного перорального лечения РН цитостатикамн с целью выявить формы ГН, резистентные к этой терапии, при которых казалось целесообразным проводить новый метод лечения - сверхвысокими дозами ЦФА.

Характеристка больных

Ретроспективный анализ результатов лечения различными цитостатикамн проведен у 117 больных ГН (Табл. 1): 78 мужчин и 39 женщин в возрасте 15-59 лет, у 91 из которых был НС (у 39 - в сочетании с артериальной гипертензией - смешанный вариант нефрита) и у 26 -выраженный мочевой синдром - латентный ГН в стадии обострения (у 11 - в сочетании с артериальной гипертензией). У 40 больных (34%) уровень креатинина превышал 1,4 мг%. Длительность заболевания в момент начала цитостатической терапии составляла от 5 мес. до 24 лет (в среднем 3,6 года). У всех больных диагноз был подтвержден морфологически: МН был у 23 больных (19,6%), МПГН - у 40 (34,2%), МКГН - у 28 (23,9%), ФСГС - у 10 (8,5%) и ФП - у 16 (13,7%).

Таблица 1. Клиническая и морфологическая характеристика 117 больных ГН, леченных цитостатикамн per os

Пол, м/ж 67 % / 33 %

Возраст, годы, х 29,5

Длительность ГН, годы, х 3,6

Нефротический синдром 78 %

Артериальная гипертония 43 %

Креатинин, мг%, х 1,3

Морфологические варианты:

МН 19,6 %

МПГН 34,2 %

МКГН 23,9 %

ФСГС 8,5 %

ФП 13,7 %

Преднизолон 51 %

Применялись следующие цитостатики: азатиоприн (100-200 мг/сут.) -66 больных, циклофосфан (100-200 мг/сут.) - 23 больных, хлорбутин (4-12 мг/сут.) - 6 больных, батриден (300-600 мг/сут.) - 3 больных; еще 19 больных получали последовательно 2-3 препарата. 60 (51%) больных одновременно с цитостатиками получали малые (20% больных) или большие (31% дозы преднизолона. Общая длительность лечения составила от 6 мес. до 8 лет.

Непосредственные результаты лечения (через 6 месяцев). Через 6 мес. от начала лечения положительный результат отмечен у 77% (90) больных (ремиссия - у 30%, улучшение - у 47%), отсутствие эффекта или ухудшение - у 23% (27) больных.

Отдаленные результаты (почечная выживаемость).

На момент окончания исследования (октябрь 1992 г.) больные прослежены от 6 мес. до 20 лет (в среднем 4,4 года). Почечная выживаемость (креатинин <5 мг%) для всей группы больных составила: через 5 лет - 85%, через 10 лет - 56%, через 20 лег - 50%.

Характеристика больных, чувствительных и резистентных к цитостатической терапии (предикторы прогрессирования почечной недостаточности).

Монофакторный анализ. Ряд прогностических факторов влиял на

почечную выживаемость (табл. 2, рис. 3-5). %

Годы

Рис. 3. Лечение ГН цитостатиками per os: почечная выживаемость, влияние креатинина.

Значительно ухудшали прогноз: (1) исходно повышенный уровень сывороточного креатинина (при уровне <1,8 мг% 5-, 10- и 20-летняя выживаемость составила 90%, 70%, и 56%, при уровне >1,8 мг% 5- и 10-летняя выживаемость -46% и 0%; Х2=15,83, р<0,001; рис. 3) и (2) нефротический синдром (при наличии НС 10- и 20-летняя выживаемость -45% и 40%, при отсутствии - 82% и 82%; Х2=4,28, р<0,05; рис. 4).

Таблица 2. Монофакторный анализ: влияние отдельных факторов на почечную выживаемость больных ГН, леченных ЦТ

Переменная Значенне р Монофакторнын эффект

Пол (м/ж) - о

Возраст - о

Длительность ГН - о

НС (-/+) ♦ Ф

АГ (-/+) - о

Креатннин ф

Морфологический вариант • ** ф

(1, 2, 3, 4, 5)

ЦФА (+/-) - о

ПЗ (+/-) - о

Длительность лечения - о

Непосредственный эффект -г-

через 6 мес (+/-)

Обозначение символов: "-" , р > 0,05; "*", р < 0,05; "**", р< 0,01; "***", р < 0,001; "*»*»", р< 0,0001;

"Л-" - наличие этого признака улучшает прогноз "о" - признак не имеет эффекта на прогноз "Ф" - признак ухудшает прогноз

(3) Морфологические варианты ГН образовали две прогностически различающиеся группы (Х2=23,26, р<0,000; рис. 5). Первая, с более благоприятным прогнозом, включала МН, МКГН и МПГН, для которых 20-летняя выживаемость составила 94%, 71% и 61% (причем между собой эти показатели достоверно не различались, р>0,05). Вторая, прогностически неблагоприятная группа, включала в себя ФСГС (3-летняя выживаемость -42%) и ФП-нефрит (20-летняя -10%).

(4) Существенно влиял на прогноз непосредственный эффект терапии (рис. 6): если через 6 месяцев наступала полная или частичная

ремиссия, то прогноз был благоприятным (20-летняя выживаемость - 82%; при отсутствии в эти сроки ответа на лечение выживаемость значительно ухудшалась (45%- через 5 лет и 0% - 11 лет; р<0,000).

Не выявлено влияния на прогноз дополнительного к цитостатикам назначения преднизолона (в том числе и больших доз), общей длительности лечения цитостатиками, а также вида препарата (ЦФА или другие агенты).

10075 5025 -О

р <0,05

10

Годы

НС«

НС {*■)

15

20

Рис. 4. Лечение ГН цитостатиками per os: почечная выживаемость, влияние нефротического синдрома.

%

100-1 75 -50 -25 -О

ГЧЗ

^-фСГС

р < 0,0001

к

МН

-МКГН ■мпгн

•ФП

о

10

Годы

15

20

Рис. 5. Лечение ГН цитостатиками per os: почечная выживаемость, влияние морфологии ГН.

Г.

Годы

Рис. 6. Лечение ГН цитостатиками per os: почечная выживаемость, влияние непосредственного лечения серез 6 мес. Наличие эффекта через 6 мес -"Эффект (+)", отсутствие эффекта через 6 мес - "Эффект (-)".

Многофакторный аналнз. Модель 1 (Табл. 3). Для создания 1-й прогностической модели, предсказывающей вероятность почечной смерти больных, леченных цитостатиками, использовались только клинические признаки. В модель вошло два прогностических фактора: наличие НС и исходный уровень сывороточного креатинина. Наиболее высокой была выживаемость у больных с латентным ГН и нормальным уровнем креатинина, развитие НС, особенно с повышенным уровнем креатинина значительно ухудшало прогноз (Х2=16,93, р<0,001).

Модель 2 (Табл. 3, рис. 7). Дополнение клинических признаков данными почечной биопсии позволило создать более сильную, по сравнению с 1-й, прогностическую модель (X2 соответственно - 16,3 и 21,39), которая включала в себя морфологический вариант ГН и уровень креатинина. Наиболее высокой выживаемость (75% через 20 лет) была в первой морфологической группе (МН, МПГН, МКГН) при нормальном уровне сывороточного креатинина. Во 2-й морфологической группе выживаемость существенно хуже, особенно у больных с повышенным уровнем креатинина (>1,5 мг%) - 10% через 5 лет и 0% через 10 лет.

Модель 3 (Табл. 3) предсказывает выживаемость в зависимости от ответа больных на цитостатики через 6 мес. от начала терапии. Отсутствие ответа через 6 мес. предсказывало прогрессирование болезни, особенно выраженное у больных с резистентным к терапии НС (Х2=45,42, р<0,000).

100-

75 -50 25 0

T=t

о

Gü

р < 0,0000

10 Годы

15

Креагипшп Морфология (мгУ.)

< 1,5

> 1,5

< 1,5 > 1,5

20

{

МП

мпгн мкгн

с ФСГС 1ФП

Рис. 7. Лечение ГН цитостатиками per os: почечная выживаемость, влияние морфологии ГН и уровня креатинина (Модель 2).

Таблица 3. Статистические модели, предсказывающие исход (почечную смерть - Ser > 5,0 мг%) у 117 больных ГН, леченных ЦФА пульсами

Прогностические факторы X2 «iß R

(Р)

НС (-/+) Креатинин Морфол. вариант Непосредств енный эффект (через 6 мес)

Модель 1

(п=117) Ь + 1,681 + 0,977 16,93 (2) 0,27

(Р) (< 0,05) (< 0,001) (< 0,001)

Модель 2

(п=117)

b + 0,702 + 0,517 21,89 (2) 0,32

(Р) Модель 3 (<0,05) (<0,01) (0,000)

(п=117) b + 1,753 + 2,216 45,42 (2) 0,49

(р) (< 0,05) (< 0,000) (0,000)

В целом, данные этого этапа исследований свидетельствуют:

(1) Через 6 месяцев перорального лечения цитостатиками непосредственный эффект отмечен у 77% больных активным нефротическим и активным нефритом с выраженным мочевым синдромом.

(2) Почечная выживаемость (креатинин <5,0 мг%) для всей группы больных через 5, 10, и 20 лет составила 85%, 56%, и 50%.

(3) Предикторами прогрессирования - факторами резистентности к терапии были: нефротический синдром, повышенный уровень сывороточного креатинина (>1,8 мг%), ФСГС и ФП морфологические варианты ГН, а также отсутствие ответа на лечение через 6 месяцев.

(4) Отсутствие ответа через 6 мес. лечения цитостатиками повышало риск развития почечной недостаточности, причем у больных с НС в большей степени, чем у больных с активным латентным нефритом.

(5) Морфологическая информация, дополняющая клинические данные, существенно повышала точность прогноза, что оправдывает необходимость проведения биопсии почки.

2. Клиническое испытание нового метода лечения хронического ГН сверхвысокими дозами ЦФА

Задачами этого раздела работы были:

1) Оценка переносимости ЦФА пульс-терапии (частота и структура побочных эффектов);

2) Оценка эффективности метода (непосредственные и отдаленные результаты);

3) Выявление и характеристика больных, чувствительных и резистентных к данному методу лечения (формулировка общих показаний).

Характеристика больных

С учетом данных предыдущего этапа работы, касающихся прогрессирования ГН и резистентности к обычным методам иммуиодепрессивной терапии, для лечения сверхвысокими дозами ЦФА целенаправленно отбирались больные с тяжелым, прогностически неблагоприятным ГН, для которых попытка лечения новым методом была оправдана из-за отсутствия альтернативы.

В эту группу вошло 44 больных с НС, которые отвечали одному или нескольким из следующих критериев, имели:

1) НС, резистентный к предшествовавшей пероральной иммуиодепрессивной терапии (24 больных);

2) прогностически неблагоприятные морфологические варианты ГН -МКГН, ФСГС, ФП (25 больных);

3) прогрессирующее течение болезни - повышение креатинина более 1,4 мг% (от 1,5 до 5,0 мг% у 18 больных). Клиническая и морфологическая характеристика больных представлена в Таблице 4.

Таблица 4. Клиническая и морфологическая характеристика 44 больных ГН, леченных пульс-терапией ЦФА

Пол, м/ж 36 % / 64 %

Возраст, годы, х 29,7

Длительность ГН, годы, х 3,9

Артериальная гипертония 39 %

Креатинин, мг%, х 1,8

Морфологические варианты:

МН 8,1 %

МПГН 24,3 %

МКГН 24,3 %

ФСГС 32,4 %

ФП 10,8 %

Индексы, баллы, х:

активности 4,4

склероза 9,3

Преднизолон 50 %

Пульс-терапию ЦФА проводили в/в капельно из расчета 20 мг на 1 кг массы тела 1 раз в 4 недели при нормальной функции почек. Больным с клубочковой фильтрацией <20 мл/мин вводили 50% расчетной дозы. Каждую последующую дозу корригировали с учетом переносимости предшествующей дозы, осложнений и уровня лейкоцитов периферической крови на 10-14 день после проведения пульса.

Результаты

(1) Переносимость ЦФА пульс-терапии в целом была удовлетворительной, осложнения (см. ниже) у большинства больных не требовали отмены. Шести больным был проведен только один сеанс пульс-терапии: 5-ти - из-за плохой переносимости или осложнений, 6-я больная с тяжелым НС умерла через 1 мес. после 1-го пульса от неконтролируемого гиповолемического шока. Остальные 38 больных получили от 2 до 22 пульсов в течение 2-26 мес. лечения.

(2) Непосредственные результаты лечення (ближайший эффект). На момент окончания лечения положительный результат отмечен у 29 (59%) больных (ремиссия - у 32%, улучшение - у 27%), ухудшение наблюдалось у 17 (39%) больных, 1 больная (2%) умерла в начале терапии. Важно отметить эффект, полученный почти у половины (46%) больных, ранее резистентных к обычным методам иммунодепрессивной терапии. У нелеченных больных и больных, ранее отвечавших на иммунодепрессанты, положительные результаты достигнуты соответственно в 73% и 88% случаев.

(3) Отдаленные результаты (7-летняя почечная выживаемость -креатинин <5,0 мг%). К моменту окончания исследования (октябрь 1992 г.)

больные были прослежены от 1 мес. до 84 мес. (7 лет), в среднем, 30,5 мес. (2,5 года). Почечная выживаемость составила для всей группы больных через 5 лет - 63 %, через 7 лет - 51 %.

Характеристика больных, чувствительных и резистентных к терапии (прогностические факторы прогрессирования почечной недостаточности)

Для выявления больных чувствительных или резистентных к этому методу лечения были изучены прогностические признаки (факторы), ПрсдСКаЗЫЬахОЩйс при! рсссириьание или, н.шиири 1, отсутствие прогрессирования болезни после проведения ЦФА пульс-терапии.

Монофакторный аналнз (Табл. 5). Предикторами неблагоприятного нехода (прогрессирования) оказались повышенный исходный уровень сывороточного креатинина (рис. 8) и наличие артериальной гипертензии (рис. 9).

%

100 75 50 -25 -О

р < 0,01

О

Крсягинин < 1,5 иг %

Креагишш > 1,5 мг -1_

-1-1-Г

12 3 4

Годы

Н-1-г

5 6 7

Рис. 8. Лечение ГН пульсами ЦФА: почечная выживаемость, влияние уровня креатинина.

В то же время два параметра, связанные с лечением, существенно улучшали выживаемость: (1) суммарная доза ЦФА, полученная больным за весь период лечения, и (2) положительный непосредственный результат терапии. 5-летняя выживаемость повышалась с увеличением суммарной дозы препарата с 26% у больных, получивших <6,0 г препарата (в среднем 3,2 г), до 88% у больных, получивших >6,0 г (в среднем 13,0 г); рис. 10. При наличии положительного непосредственного эффекта лечения 5-летняя почечная выживаемость составила 100%, у всех больных с отсутствием эффекта через 3 года развилась уремия (рис. 11). Лечение ПЗ самостоятельного прогностического значения не имело, что свидетельствует

о том, что ПЗ, очевидно, не оказывал дополнительного к ЦФА влияния на прогноз.

Таблица 5. Монофакторнй анализ: влияние отдельных факторов на почечную выживаемость больных ГН, леченных ЦФА - пульсами

Переменная Знамение р Монофакторный эффект

Пол (м/ж) о

Возраст о

Длительность ГН о

Длительность НС о

АД среднее Ф

Креатинин Ф

Морфологический вариант о

Индекс активности о

Индекс склероза о

Доза ЦФА (суммарная) -г-

ПЗ (+/-) о

Непосредственный эффект

(конец лечения)(+/-)

Обозначение символов: "-" , р > 0,05; "*", р < 0,05; "**", р< 0,01; "»*»", р < 0,001;

"ф" - наличие этого признака улучшает прогноз "о" - признак не имеет эффекта на прогноз "4'" - признак ухудшает прогноз

100 75 50 Ч 25 -О

ч

< 150 мм рт. сг.

> 150 мм рт. сг.

р < 0,03

О

2 3 4 Годы

—г 7

Рис. 9. Лечение ГН пульсами ЦФА: почечная выживаемость, влияние среднего АД.

■у.

100 75 50 -25 0

ГГ

Доза > 6,0 г

"Ч

Доза < 6,0 г

р < О.VI

Т" 2

-Г

3 4 Годы

Рис. 10. Лечение ГН пульсами ЦФА: почечная выживаемость, влияние суммарной дозы ЦФА.

% 100-

75 -5025 -О

Эффект (♦-)

Эффект (•)

р < О.ОО!

2 3 4 Годы

Рис. 11. Лечение ГН пульсами ЦФА: почечная выживаемость, влияние непосредственного эффекта терапии. Наличие эффекта к концу лечения "Эффект (+)", отсутствие эффекта - "Эффект (-)".

Многофакторный анализ. Модель I (Табл. 6, рис. 12). Из всех клинических признаков наиболее точно предсказывала исход комбинация двух факторов - длительности ГН и уровня сывороточного креатинина (Х2=13,58, р<0,01). При этом прогностическая роль длительности ГН была различной при разных уровнях креатинина: при креатинине <1,5 мг% - не была существенной (р>0,05) и прогноз определялся в первую очередь нормальным уровнем креатинина, при креатинине >1,5 мг% - становилась важной (р<0,05). Наибольший успех вероятен при уровне креатинина <1,5 мг% и длительности ГН <2 лет (100%- почечная выживаемость через 5 и 7 лет). При уровне креатинина >1,5 мг% прогноз существенно ухудшался, особенно у больных с длительностью ГН >2 лет (7-летняя выживаемость соответственно 40% и 0%, р<0,05).

Таблица 6. Статистические модели, предсказывающие исход (почечную смерть - Бег > 5,0 мг%) у 44 больных ГН, леченных ЦФА пульсами

Прогностические факторы Х2(с10 я

(Р)

Длитель- Креати- ЦФА Морфол. ИА

ность ГН ннн доза вариант

Модель 1

(п=44)

Ь + 0,171 + 0,737 13, 58 (2) 0,32

(Р) (< 0,05) (< 0,001) (< 0,01)

Модель 2

(п=44)

Ь + 0,687 - 0,240 21, 54(2) 0,44

(Р) (< 0,001) (< 0,001) (< 0,001)

Модель 2А

(п=30)

Ь + 0,508 -0,176 6,77 (2) 0,26

(Р) (< 0,2) (< 0,05) (< 0,05)

Модель 3

(п=30)

Ь -0,258 + 0,416 -0, 557 12,36 (3) 0,44

(Р) (< 0,01) (< 0,05) (< 0,05) (< 0,01)

100-

75 -50 25 Н О

41

Длительность Креатиннн ГН (годы) (мгГ.) < 2.0 < 1,5

р < О.О!

>2.0

<2,0

>2,0

< 1,5

> 1.5

> 1,5

Т

2

-1-Г"

5 б

Годы

Рис. 12. Лечение ГН пульсами ЦФА: почечная выживаемость, влияние длительности ГН и уровня креатинина (Модель 1).

Модель 2 (Табл. 6, рис. 13). Поскольку лечение пульсами ЦФА существенно влияло на выживаемость, 1-я модель была скорригирована введением параметров лечения - суммарной дозы ЦФА и данных о сочетании с ПЗ. Полученная в результате модель обладала большей прогностической силой (Х2=21,54, р<0,001) и включала комбинацию уровня

сывороточного креатинина с суммарной дозой ЦФА. Наилучшими были результаты у больных с нормальным уровнем креатинина, получивших большую дозу (>6,0 г) ЦФА (100%-выживаемость через 5 и 7 лет). У больных с повышенным уровнем креатинина суммарная доза ЦФА играла решающую роль: у получивших >6,0 г 5-летняя выживаемость составила 63%, в то время как у плохо леченных - только 10% (р<0,05).

100-

У.

75 -50 25 -О

< 0,01 V.

-г-

2

-Г"

3

Л

Креатпнин Доза ЦФА (мгЛ) (г)

< 1.5

< 1,5

> 1,5

> 1.5

> 6,0 <6,0

>6,0 <6,0

Годы

Рис. 13. Лечение ГН пульсами ЦФА: почечная выживаемость, влияние уровня креатинина и суммарной дозы ЦФА (Модель 2).

1

6

Модель 3 (Табл. 6, рис. 14). Дополнение клинической информации данными биопсии позволило создать наиболее сильную прогностическую модель (р<0,05 по сравнению с моделью 2), включавшую сочетание морфологического варианта ГН, индекса активности и суммарной дозы ЦФА. Это позволило существенно детализировать показания к лечению ЦФА пульс-терапией и доказывает важность проведения почечной биопсии. Наилучшие результаты (100%-почечная выживаемость через 5 и 7 лет) - у больных со всеми морфологическими вариантами (в том числе с ФСГС и ФП) при высоком ИА (>4) и условии длительной активной терапии (суммарной дозе ЦФА >6,0 г). При недостаточном лечении (доза <6,0 г) больных с высоким индексом активности результаты ухудшались (выживаемость 64% - через 5 лет, 43% - через 7 лет). При низком индексе активности (<4) и плохом лечении все больные, независимо от морфологического варианта через 3 года достигли уремии.

р < о.оз

3 4

Годы

Морфология МН. МКГН, МПГН.ФП. ФСГС

{

МН, МКГН, МПГН.ФП, ФСГС

ФСГС, ФП

МН, МКГН, МПГН.ФП, ФСГС

ИА

> 4

> 4

< 4

< 4

Дом ЦФА

> 6,0

< 6,0

>6,0 <6,0

1

Рис. 14. Лечение ГН пульсами ЦФА: почечная выживаемость, влияние морфологии, индекса активности и суммарной дозы ЦФА (Модель 3).

Таким образом, результаты проведенного анализа свидетельствуют:

(1) Лечение сверхвысокими дозами ЦФА удовлетворительно переносится большинством (89%) больных хроническим ГН.

(2) К концу лечения положительный эффект получен почти у половины больных, ранее резистентных к пероральным методам иммунодепрессивной терапии.

(3) Для решения о назначении сверхвысоких доз ЦФА может быть использован следующий алгоритм. Хороший отдаленный результат можно ожидать у больных с нормальным уровнем креатинина и длительностью болезни не более 2 лет. Для более точного прогноза необходима морфологическая информация, что делает важным проведение биопсии почки - особенно больным с повышенным уровнем креатинина и давностью болезни более 2 лет. Более высокая эффективность ожидается при МН, МПГН и МКГН, более низкая - при ФСГС и ФП-вариантах ГН; однако решающее значение имеет степень активности иммуновоспалительного процесса: при всех морфологических вариантах выживаемость выше при индексе активности >4.

(4) Для достижения эффекта (у больных, потенциально чувствительных к ЦФА) необходимо длительное активное лечение (не менее 6,0 г ЦФА в течение 6 и более месяцев). Недостаточное лечение резко ухудшает прогноз, особенно у больных с повышенным уровнем креатинина. При этом дополнительное к ЦФА назначение ПЗ существенного влияния на выживаемость не имело.

(5) Положительный ответ больного к концу курса лечения (полная или частичная ремиссия) - показатель хорошего отдаленного прогноза,

отсутствие непосредственного ответа делает мало вероятным стабильное течение процесса.

3. Прогноз больных волчаночным нефритом при лечении сверхвысокими дозами ЦФА

Поражение почек - одна из главных причин смерти больных СКВ. Предварительные данные из Национальных институтов здоровья США [Austin et al., 1983] позволяют считать, что на сегодняшний день пульс-терапия ЦФА, возможно, является лучшим методом лечения тяжелого ВН. Однако, учитывая возможность осложнений как во время лечения, так и в отдаленный период, необходимо ограничивать применение этого метода только теми больными, у которых вероятность успеха достаточно высока. М}>\ провели анализ результатов пульс-терапии ЦФА 34 больных ВН с целью получить ответы на следующие вопросы:

1) какие клинические и морфологические признаки сочетаются с положительным или отрицательным ответом на этот вид терапии?

2) может ли морфологическая информация биопсий почек существенно улучшить предсказание результатов терапии?

3) какое сочетание клинических it/или морфологических признаков позволяет наилучшим образом предсказать ответ больных на данный метод лечения ВН?

Характеристика больных

Лечение сверхвысокими дозами ЦФА проведено 34 больным ВН, наблюдавшихся в нашей клинике с 1986 по 1990 г. (32 женщины и 2 мужчин в возрасте от 15 до 57 лет - Табл. 7). У 14 человек ВН развился в дебюте СКВ, а у остальных - в один из рецидивов заболевания. К моменту начала пульс-терапии ЦФА длительность СКВ составила от 1 года до 25 лет, ВН - от 2 мес. до 15 лет, настоящее обострение (клинически активный ВН) длилось от 1 до 9 мес. НС выявлен у 31 больного, активный нефрит без НС - у 3, артериальная гипертония (АД выше 150/100 мм.рт.ст.) - у 23, повышение уровня креатинина - у 23.

Биопсия почки проведена у 21 больного: диффузный и очаговый ВН, а также включенный в эту группу МКГН (который считается подклассом диффузного ВН [Striker et al., 1973]) составили 72% случаев, склерозирующий и мембранозный ГН - 14% и 14% соответственно. Образовавшиеся 3 гистологические группы с целью дальнейшего анализа

были разделены по степени морфологической тяжести: мембранозный ГН -1-я степень, волчаночный пролиферативный/МКГН - 2-я степень, склерозирующий ГН - 3-я степень морфологической тяжести. Помимо гистологической классификации ВН, в почечном биоптате полуколичественно оценивали индекс активности и индекс склероза.

Таблица 7. Клиническая и морфологическая характеристика 34 больных ВН, леченных пульс-терапией ЦФА

Пол, м /ж, п 2 / 32

Возраст, годы, х 29,1

Длительность ГН, годы, х 3,8

Артериальная гипертония 68 %

Креатинин, мг%, х 2,4

Морфологические варианты, п:

Мембранозный ГН 3

Пролиферативный ВН/МКГН 15

Склерозирующий ГН 3

Индексы, баллы, х:

активности 8,2

склероза 9,5

Пульс-терапию ЦФА проводили в/в капельно из расчета 20 мг на 1 кг массы тела 1 раз в 4 недели при нормальной функции почек. Больным с клубочковой фильтрацией <20 мл/мин вводили 50% расчетной дозы. Каждую последующую дозу корригировали с учетом переносимости предшествующей дозы, осложнений и уровня лейкоцитов периферической крови на 10-14 день после проведения пульса. Больные получили от 1 до 20 пульсов ЦФА.

У каждого больного оценивали 2 типа исходов. Исход первого типа предполагал один из двух возможных вариантов: положительный или отрицательный. Исход второго типа характеризовался величиной, отражающей скорость прогрессирования почечной недостаточности (см. "Материалы и методы").

Результаты

К моменту окончания наблюдения положительные результаты отмечены у 72% больных - ремиссия у 58% (19 человек), улучшение у 14 % (5), отрицательные - у 28% пациентов - ухудшение у 2% (1 больная), уремия у

12% (4) и смерть у 14% (5). У всех 5 больных летальный исход наступил на фоне прогрессирования почечной недостаточности - уровень креатинина 5-6 мг% (2 пациента) или терминальной уремии (3 больных).

Монофакторный анализ. Для выявления признаков, обладавших ко времени начала терапии прогностическим значением, мы сравнили по каждому из них 2 группы больных: с положительным (24 человека) и отрицательным (10) исходами (Табл. 8). Среди клинических такими оказались 3 параметра: пол, длительность обострения ВН и уровень креатинина - на успех пульс-терапии в данной группе больных с большей вероятностью можно было рассчитывать у женщин, с длительностью обострения не более 3 мес., уровнем креатинина не более 1,8 мг% (критические уровни для количественных переменных получены в медианном тесте).

Таблица 8. Монофакторный анализ ассоциации между клиническими, морфологическими параметрами и вариантом исхода у больных ВН, получавших пульс-терапию ЦФА

Прогностические факторы Группа больных Р

с положительным исходом с отрицательным исходом

Клинические факторы

(п=24) (п=10)

Пол, м., % 0 20 0,026

Возраст, годы, х 31,3 26,2 0,187

Длительность ВН, годы, х 3,5 4,4 0,25

Длительность обострения ВН, 2,5 3,4 0,01

месяцы, х

Креатинин сыворотки, мг%, х 1,9 3,7 0,01

Артериальная гипертония, % 58 90 0,068

Гематурия, % 75 90 0,25

Суммарная доза ЦФА, г, х 6,4 4,1 0,23

Морфологические факторы

(п=14) (п=7)

Морфологический вариант, 0,012

мембранозный ГН 21 0

пролиферативный ВН/МКГН 79 57

склерозирующнй ГН 0 43

Индекс, баллы, х: (п=10) (п=6)

активности 8,6 7,5 0,3

склероза 9,0 10,3 0,189

Данные биопсии почек имели самостоятельное прогностическое значение: в рамках нашей группировки гистологические варианты ВН достоверно ассоциировались с результатами терапии. Положительный исход отмечен у всех больных с мембранозным ГН и ни у одного со склерозирующим (фибропластическим) ГН. В группе пролиферативного ВН/МКГН исход не

был столь однородным: положительный - приблизительно у 3/4, отрицательный - у 1/4 больных.

Многофакторньт анализ. При решении вопроса о роли данных биопсий в предсказании исхода пульс-терапии ЦФА на первом этапе была создана статистическая модель из одних только клинических признаков. Из всего комплекса 8 клинических параметров в результате процедуры пошаговой множественной регрессии выделены 2: длительность ВН и уровень креатинина, сформировавших наиболее сильную клиническую модель - Модель 1 (Табл. 9).

Таблица 9. Статистические модели, предсказывающие исход у 34 больных ВН леченных пульсами ЦФА (пошаговая множественная линейная регрессия)

Модель Прогностические фактроры

длительность уровень морфо- индекс (Р)

ВН креатинина логический вариант склероза

Модель 1

(п=34) Р 3, 08 50,09 0,876

(Р) (0,015) (0,000) (< 10"4)

Модель 2

(п=21)

Р 31,63 27,48 0,947

(Р) (0,028) (0,008) (< Ю-4)

Модель 3

(п=16)

Р 31,32 3,80 0,964

(Р) (0,001) (0,019) (< 10"4)

На втором этапе к 8 клиническим параметрам добавлен 1 морфологический - гистологическая классификация ВН. При этом гистологическая классификация ВН вместе с уровнем креатинина была выделена в процессе пошаговой регрессии из всего комплекса переменных как наиболее сильная прогностическая модель (Модель 2). Коэффициент регрессии для гистологической классификации достоверно отличался от нуля; это свидетельствует о том, что морфологическая информация существенно улучшала предсказание исхода по сравнению с чисто клинической моделью (Моделью 1): предсказывающая сила модели достоверно возросла - с 87,6% (И2 х 100%) до 94,7% (р=0,0082).

На третьем этапе решался вопрос о наилучшей модели, которая могла быть получена из всего имеющегося комплекса клинических и морфологических переменных (8 клинических параметров.

морфологический вариант плюс индексы активности и склероза). В эту модель (Модель 3) в результате пошаговой процедуры выделен морфологический вариант ВН и индекс склероза, причем коэффициент регрессии последнего параметра существенно отличался от нуля, что повышало предсказывающую силу модели до 96,4% (р=0,0192).

Основной практический вывод, вытекающий из этих результатов: при решении вопроса о назначении пульс-терапии ЦФА, особенно больным с большой длительностью ВН и/или повышенным уровнем креатинина, решающую роль должны играть данные биопсии почки. В такой ситуации склерозирующий (фибропластический) вариант ВН оставляет очень мало надежды остановить прогрессирование почечной недостаточности. При других морфологических вариантах - мембранозном или пролиферативном волчаночном (мезангиокапиллярном) ГН - успех также зависит от степени необратимых склеротических изменений, которую отражает индекс склероза.

4. Прогноз больных быстропрогрессирующим волчаночным нефритом, леченных сверхвысокими дозами ЦФА

Быстропрогрессирующий волчаночный нефрит (БПВН) по клинической картине соответствует классическому подострому "злокачественному" ГН; ведущий признак - бурное прогрессирование почечной недостаточности, обусловленное активностью почечного процесса. Этот вариант течения развивается у 1/10 - 1/6 части больных активным ВН. Прогноз больных БПВН тяжелый. По данным нашей клиники в 60-е годы, когда лечение проводилось в основном малыми или средними дозами преднизолона (ПЗ) (<50 мг/сут.), у части больных в сочетании с цитостатиками, 2-летняя выживаемость была менее 20% [Тареева И.Е., 1983]. С годами лечение БПВН менялось: становилось все более "агрессивным", наращивая суммарный иммунодепрессивный и противовоспалительный потенциал. В 70-е годы в нашей клинике стандартным методом лечения становятся большие дозы ПЗ (>50 мг/сут.), которые у большинства больных сочетаются с цитостатиками, а с 1979 г. дополняются внутривенным введением больших доз МП (пульс-терапией) [Тареева И.Е. и соавт., 1980; 1990]. Эффективность сверхвысоких доз ЦФА, предложенных в Национальных институтах здоровья США для лечения больных тяжелым ВН [ОшаЩ е1 а1., 1982], позволила нам с 1985 г. ввести "комбинированный" метод лечения БПВН, основа которого - периодическое

введение сверхвысоких доз ЦФА на фоне приема больших или средних доз ПЗ, у части больных в сочетании с пульсами МП, плазмаферезом, гепарином (у больных с ДВС-синдромом) [Тареева И.Е. и соавт., 1990].

Задачей данного раздела исследований было оценить, насколько комбинированная терапия, включающая в себя пульсы ЦФА, изменила прогноз больных БПВН.

Больные

Из 86 больных БПВН, наблюдавшихся в нашей клинике с 1965 по 1991 г. были отобраны 38, получавших активную иммунодепрессивную терапию (или большие дозы ПЗ, в т.ч. с цитостагиками, или комбинированный метод). Остальные 48 больных не получали достаточных доз ПЗ или цитостатиков и не были включены в исследование. Все больные имели несомненную СКВ (по критериям АРА) и были прослежены до развития исхода (см. ниже) или до окончания исследования (октябрь 1992 г.). Клинический синдром БПВН определяли как активный нефрит с быстрым ухудшением функции почек (нарастанием креатинина на >30% в течение 3-х последних месяцев) при тщательном исключении других причин острого ухудшения функции почек (токсических воздействий, аллергических реакций, инфекции мочевых путей, тяжелых электролитных и циркуляторных нарушений, тромбозов почечных сосудов [К1шЬег1еу е1 а1., 1981]).

Биопсия почки больным БПВН в первые годы исследования как правило не проводилась из-за тяжелого общего состояния (анасарка, высокое АД, анемия, тромбоцитопения), создающего высокий риск осложнений. Улучшение технической оснащенности и техники биопсии, возможность фармакологического контроля АД позволили в 80-х гг. провести биопсию почки 10 больным (1 - в 1-й группе и 9 - во 2-й группе): диффузный пролиферативный ВН выявлен у 7, мембранозный ВН - у 1, склерозирующий ГН - у 2.

Методы лечения (Табл. 10)

"Стандартный" метод (группа 1, 22 больных) включал в себя большие дозы ПЗ, 50 мг/сут. и более (13 больных) или большие дозы ПЗ в сочетании с длительным назначением цитостатиков внутрь - азатиоприна или ЦФА по 100-200 мг/сут. (9 больных). Среди 22 больных 12 наблюдались до 1980 г. (1965-1979 гг.) и 10 - после (1984-1987 гг.).

"Комбинированная" терапия (группа 2, 16 больных) в качестве обязательного компонента включала в себя периодическое введение сверхвысоких доз ЦФА (20 мг/кг веса) на фоне перорального приема больших или средних доз ПЗ (>40 мг/сут.); интервалы между пульсами составили от 2 до 4 недель. Кроме того, 10 больных получали также пульсы МП - по 500-1000 мг в течение 2-3 дней (у 4 больных повторно до 2-4 раз); 7 больным проводился плазмаферез - 2-3 сеанса в неделю с обменом за сеанс до 2-3 литров плазмы (всего, от 3 до 11 сеансов). При развитии ДВС-синдрома (7 больных) переливалась свежезамороженная плазма, вводился гепарин. Все больные поступили в клинику в 1985-1991 годах.

Таблица 10. Методы лечения больных БПВН

Стандартный Комбинированный

метод (п =22) метод (п = 16)

Лечение:

Преднизолон > 50 мг 22 16

Цитостатики per os 9

ЦФА-пульсы 16

МП-пульсы 10

Плазмаферез 7

Гепарин 7

Статистические методы анализа

Сопоставимость 1-й и 2-й групп больных по главным клиническим параметрам проверялась с помощью метода Манна-Уитни для количественных переменных и точного метода Фишера для качественных переменных.

Анализ выживаемости проведен моментным методом Kaplan-Meier с учетом времени от начала терапии до момента развития исхода. Рассчитывали два вида выживаемости: "почечную" и "общую". Исходом в первом случае являлась "почечная смерть" - развитие терминальной почечной недостаточности (креатинин >8 мг%), во втором - смерть больного от почечных или непочечных причин или развитие терминальной почечной недостаточности. Сравнение кривых выживаемости разных групп больных выполнялось с помощью теста logrank. Прогностические факторы выявлялись с помощью регрессионной модели Сох'а.

Результаты

В момент начала терапии у всех больных креатинин превышал 1,4 мг% и у 42% был выше 3,0 мг%, у 63% среднее АД превышало 150 мм. рт. ст. и у всех, кроме 1 больной, протеинурия была более 3,5 г/сут. Группы 1 и 2 были полностью сопоставимы по основным демографическим и клиническим характеристикам (Табл. 11).

Таблица 11. Характеристика больных БПВН, получавших стандартный или комбинированный методы терапии

Стандартный Комбинированный Р

Признаки: метод (п =22) метод (п = 16)

Пол (м/ж), п 3/19 2/14 >0.05

Возраст (годы), х 27.9 27.5 >0.05

Длительность ВН 32.3 28.2 >0.05

(месяцы), х

Креатинин (мг%), х 4.1 3.4 >0.05

АД среднее 161 156 >0.05

(мм.рт.ст.), X

Протеинурия (г/сут), х 7.5 11.0 >0.05

%

Годы

Рис. 15. Почечная выживаемость больных БПВН.

Данные выживаемости больных БПВН представлены на рис. 15 и 16. Как почечная, так и общая выживаемость были значительно выше у больных группы 2. На момент закрытия исследования живы 9 из 16 больных 2-й группы (8 из них с нормальной функцией почек) и только 1 из 22 больных 1-й группы. Почечная выживаемость (креатинин <8 мг%) у больных 1-й группы была очень низкой: менее 30% к концу 1-го года, 10% после 2-х лет и 5% после 5 лет от начала терапии. В то же время у больных

2-й группы почечная выживаемость составила 75% за 1-й и последующие годы наблюдения (р<0,01). Общая выживаемость в 1-й группе была 18% через 1 год, 9% через 2 года и 5% через 5 лет, в то время как во 2-й группе -соответственно 60%, 55% и 55% (р<0,01). При сравнении почечной и общей выживаемости больных 1-й группы, получавших только большие дозы ПЗ или ПЗ в сочетании с цитостатиками, различия оказались статистически недостоверными (р>0,05).

У.

Рис. 16. Общая выживаемость больных БПВН.

Для того, чтобы убедиться, что применявшийся метод лечения действительно имеет самостоятельное прогностическое значение, мы провели три вида расчетов. Во-первых, проанализировали возможность того, что различная выживаемость групп 1 и 2 могла быть связана не с методом лечения, а с различными периодами времени, в которые наблюдались эти больные. Во-вторых, попытались выявить и другие прогностические факторы, которые помимо метода лечения могли влиять на выживаемость (монофакторный анализ выживаемости). Наконец, оценили независимость влияния метода лечения на прогноз с учетом одновременного действия других прогностических факторов и возможной несбалансированности групп 1 и 2 по этим прогностическим факторам (многофакторный анализ выживаемости).

(1) Известно, что в 70-е годы выживаемость больных тяжелым ВН повысилась по сравнению с 60-ми годами в 2-2,5 раза (с 20% до 40-60%) [Donadío, 1985]. Это, возможно, было связано не только с применением новых белее активных методов иммунодепрессивной терапии [Felson, Anderson, 1984], но и с другими причинами (ранней диагностикой, выявлением более легких форм, успешной борьбой с тяжелыми

осложнениями - отеками, инфекциями, гипертонией) [Coggins, 1982; Ва1о\у, 1986]. Не исключается, что эта тенденция могла сохраниться и в последующие годы. Более половины больных 1-й группы поступили в клинику до 1980 г. (1965-1979 гг.), в то время как все больные 2-й группы -после 1980 г. (1985-1991 гг.). Поэтому мы сравнили выживаемость больных группы 2 и параллельной контрольной группы, сформированной из 10 больных группы 1, поступивших в клинику после 1980 г. (1984-1987 гг.), в те же сроки, что и больные группы 2. Опять же, как почечная, так и общая выживаемость оказались выше у больных группы 2 (р<0,01), что делало маловероятной роль периода времени и подтверждало значение нового метода лечения.

(2) Монофакторный анализ выживаемости. Для того, чтобы окончательно убедиться в том, что улучшение прогноза больных было связано в первую очередь с новым методом лечения, мы оценили роль и других возможных прогностических факторов.

Таблица 12. Факторы, влияющие на выживаемость больных БПВН (регрессионная модель Сох'а)

Прогностический фактор Монофакто рный анализ Многофакторный анализ

Р1 Р2 р1 Р2

Пол (м/ж) > 0,05 (0) > 0,05 (0) -

Возраст (годы) > 0,05 (0) > 0,05 (0) - -

Длительность ВН (мес) < 0,01 (-) > 0,05 (0) < 0,01 (-) -

Протеинури я (г/сут) > 0,05 (0) > 0,05 (0) - -

АД среднее (мм рт. ст.) < 0,01 (-) < 0,05 (-) - -

Креатинин < 0,01 (-) <0,025 (-) < 0.001 (-) < 0,001 {■)

Метод терапии < 0,001 (+) < 0,001 (+) < 0,01 (+) < 0,005 (+)

(стандартный - 0, комбинированный - 1)

Примечания. р1 - значение "р" для данного признака при анализе почечной выживаемости, р2 - то же, при анализе общей выживаемости; (+) -указывает на положительное влияние признака на прогноз, (-) - на отрицательное влияние признака на прогноз, (о) - отсутствие достоверного влияния признака на прогноз.

Для этого в регрессионную модель Сох'а по очереди вводился каждый из признаков (факторов) представленных в Таблице И, и оценивалось его индивидуальное прогностическое значение. Выявлено, что помимо метода лечения, на прогноз влияли длительность ВН, а также уровни АД и креатинина (Табл. 12). Чем выше были значения каждого из этих параметров, тем хуже была выживаемость.

(3) Многофакторный анализ выживаемости. Учитывая возможность взаимной корреляции этих факторов, для того, чтобы выявить те из них, которые обладают независимым влиянием на прогноз, был проведен многофакторный регрессионный анализ, в котором действие каждого из факторов оценивается с коррекцией на одновременное действие других прогностических факторов. В результате подтверждено, что метод лечения обладал независимым и достоверным влиянием на прогноз. Помимо метода лечения, независимое прогностическое значение имели: для почечной выживаемости - длительность ВН и уровень креатинина, для общей выживаемости - только уровень креатинина (Табл. 12). Уровень АД не имел независимого влияния на прогноз.

5. Осложнения пульс-терапии ЦФА у больных ГН и ВН

Таблица 13. Осложнения пульс-терапии ЦФА у 44 больных ГН и 34 больных ВН

п п

Инфекции: Осложнения со стороны органов пищеварения:

Бронхит/пневмония 8(1)* Тошнота, рвота 64 (1)

Туберкулез 1(1) Токсический гепатит 1 (1)

Гепатит В 2(1) Энтеропатпя 2 (2)

Инфекция мочевых путей 8 (5) Панкреатит 1 (1)

Гайморит 3 (1) Другие осложнения:

Паратонзиллярный абсцесс KD Геморрагический цистит 1 (1)

Герпес (zoster, simplex) 2 Уратурня 4

Аднексит 2 Алопеция 1

Фурункулез 1 Аллергические реакции 2 (2)

* в скобках - число случаев, потребовавших прекращения лечения

Осложнения пульс-терапии ЦФА наблюдались относительно часто, но в большинстве случаев не требовали прекращения лечения. Самыми частыми были тошнота, рвота, головная боль (Табл. 13), которые в той или иной степени были выражены у большинства больных. Ослабить их

удавалось профилактическим назначением противорвотных препаратов, нейролептиков или снижением дозы ЦФА.

Прекратить лечение пришлось у 18 из 78 больных (в 23% случаев). Причиной отмены чаще всего было токсическое действие ЦФА на органы пищеварения (энтеропатия, токсический гепатит, панкреатит) и развитие инфекций - в половине случаев наличие хронических инфекций (хронический бронхит, гайморит, инфекция мочевых путей), течение которых ухудшалось с началом лечения ЦФА. Связь с ЦФА единственного эпизода геморрагического цистита у больной с предшествующими атаками банального цистита не является достаточно убедительной. Развития злокачественных новообразований за время прослеживания не наблюдалось. Осложнения у больных ВН (в первую очередь инфекции) наблюдались почти в 2,5 раза чаще, чем у больных ГН (у 13/34 и 5/44), что, наиболее вероятно, обусловлено как патогенетическими особенностями СКВ, так и предшествующей длительной иммунодепрессивной терапией [Ошг!ег е1 а1., 1978].

В. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Особенности использованного экспериментального подхода

Число работ, посвященных механизмам воздействия иммунодепрессантов на гломерулярное иммунное воспаление, не велико и почти все они имеют те или иные существенные недостатки. Говоря в общем виде, в них моделируются лишь некоторые из важных сторон ГН человека. Поэтому результаты можно экстраполировать только на весьма узкий круг клинических ситуаций и невозможно оценить действие препарата (или метода лечения) на весь спектр патогенетических и морфологических вариантов ГН, с которым приходится иметь дело в клинике у человека.

В большинстве исследований используется лишь одна модель ГН, которой соответствует один морфологический вариант и определенный патогенетический механизм (например, антительный или иммунокомплексный). Поэтому остаются не установленными эффекты и механизмы влияния препарата на другие патогенетические механизмы гломерулярного повреждения и воспаления.

Модель как правило воспроизводится у животных (мышей или крыс) одной линии. Таким образом не учитывается роль иммуногенетического

фактора, с которым связана сама способность отвечать на тот или другой антиген и, возможно, развитие определенного морфологического варианта ГН.

Существенный недостаток - использование лишь одного направления анализа: либо in vivo, либо in vitro. Традиционный подход -морфологическое изучение почек животных с экспериментальным ГН (кинетики отложения иммунных комплексов, структурных изменений, клеточных популяций воспалительного инфильтрата и т.д.). Новый аидхид in vitro, возникший в последние годы (использование культуры клеток почечных клубочков), получил широкое распространение для изучения нормальной биологии и физиологии клеток почечного клубочка, а также -реакции клеток нормального клубочка в условиях культуры на различные физиологические и патологические стимулы (комплемент, цитокины, факторы роста и т.д.).5 Имеются лишь отдельные попытки использовать культуру гломерулярных клеток животных с экспериментальным ГН для анализа поведения клеток в условиях гломерулярного иммунного воспаления [Matsumoto, Atkins, 1989; Tipping et al., 1991]. Это позволяет исследовать механизмы клеточной пролиферации, развития склероза в реальном патологическом микроокружении, новой системе межклеточных взаимодействий.

Очевидно, более перспективным является сочетание обоих подходов, in vivo и in vitro - сопоставление кинетики морфологических изменений с одновременным анализом этих явлений в культуре клеток in vitro. С учетом сказанного, экспериментальный подход, использованный в данном исследовании, включал следующие методические моменты.

1. Среди известных в настоящее время экспериментальных моделей ГН были отобраны и воспроизведены две модели, соответствующие двум ведущим иммунопатологическим механизмам ГН: острый сывороточный нефрит (ОСН), соответствующий иммунокомплексному механизму, и нефротоксический сывороточный нефрит (НТН), связанный с отложением антител к БМК.6

2. ОСН, классически воспроизводимый у кроликов, был нами адаптирован для мышей, что учитывая большое число генетически чистых линий мышей, позволило исследовать роль иммуногенетического фактора и экспериментально воспроизвести значительную часть спектра

^ - подробнее, см.обзор: Шилов Е.М., Гордовская Н.Б., Иванов A.A. и соавт. -Тер. Архив, 1987, N 11, с. 150-154.

6 - Иванов A.A., Шилов Е.М., Гладских О.П. и соавт. - Тер. Архив, 1993, N 6, с. 23-26.

морфологических вариантов ГН человека с различной чувствительностью к ЦФА.7

3. Метод культуры клеток почечных клубочков был адаптирован для экспериментальных моделей ГН, что позволило исследовать кинетику клеточных и молекулярных механизмов иммунного воспаления и изучать in vitro факторы межклеточного взаимодействия (цитокины, факторы роста), в том числе на фоне лечения МП и ЦФА.8

2. Роль генотипа в развитии экспериментального ГН и его чувствительности к циклофосфановой пульс-терапии

Наличие спектра морфологических вариантов ГН обусловлено, как доказано экспериментально, гетерогенностью иммунных и воспалительных механизмов действующих при этих типах ГН. Четкая ассоциация некоторых морфологических вариантов ГН человека с антигенами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), системы HLA, позволяет предполагать, что в развитии ГН играют роль генетические факторы. Однако эта связь не является абсолютной: хотя лица с данным HLA-антигеном имеют повышенный риск развития ГН, у большинства из них болезнь не развивается. Это пытаются объяснить особенностями генетического контроля иммунного ответа, который связан как с генами ГКГ, в первую очередь генами иммунного ответа, кодирующими силу и тип иммунного ответа (антительный или клеточный, изотип и авидность антител), но также и с генами, расположенными вне ГКГ, которые кодируют рецепторы Т-клеток, подкласс иммуноглобулинов, некоторые компоненты системы комплемента. Поэтому предполагается, что и развитие, и характер морфологии в конечном счете определяются комбинацией генов ГКГ и генов, расположенных вне ГКГ. Причем последние, возможно, модифицируют действие генов ГКГ [Frymoyer et al., 1988; 1989]. Можно предполагать, что неодинаковая эффективность иммунодепрессантов при разных морфологических вариантах ГН также связана с гетерогенностью иммуновоспалительных механизмов и генетическим контролем иммунного ответа [Steinberg, 1986]. Для изучения этой проблемы наиболее перспективны модели ГН у мышей, которые имеют большое число генетически чистых линий.

7 - Samoilov D.V., Ivanov A.A., Gladskich O.P., Shilov E.M. - Nephron, 1990, V. 55, N 3, p. 338.

8 - Иванов A.A., Шилов E.M., Гладских О.П. и соавт. - Архив патологии, 1991, N 7, с. 15-19.

Результаты

Для решения вопроса о роли генотипа на ранних этапах развития экспериментального ГН был индуцирован иммунокомплексный острый сывороточный нефрит (ОСЫ) у мышей 5 линий с разными гаплотипами ГКГ (Н-2): СВА (H-2k), C57BL (H-2b), BALB/c (H-2d), NFS (H-2d), NFR (H-2s). Выявлены следующие закономерности (Табл. 14):

(1) Обнаружена четкая ассоциация морфологических вариантов ГН с разными гаплотипами Н-2. В ответ на однотипное антигенное воздействие в почках мышей получены 3 морфологических варианта ГН, аналогичных морфологическим вариантам ГН человека. Причем у всех мышей одного генотипа (линии) развивался только один морфологический вариант ГН. У мышей линии СВА морфологическая картина соответствовала диффузному пролиферативному ГН (ЦПГН), мышей C57BL и BALB/c мезангиокапиллярному ГН (МКГН), у мышей NFS и NFR мезангиопролиферативному ГН (МПГН).

Таблица 14. Связь морфологии ОСН с гаплотипом Н-2 у мышей пяти линий

Линия мышей (гаплотнп Н-2)

СВА (к) C57BL (Ь) | BALB/c (d) NFS (d) | NFR (s)

Морфологический вариант нефрита (по аналогии с ГН человека) Диффузный пролиферативный (ДПГН) Мезангиокапиллярный (МПГН) Мезангиопролифера тивный (МПГН)

(2) В то же время, при одном и том же гаплотипе у мышей разных линий могли развиться разные (хотя и близкие) морфологические варианты ГН. При общем гаплотипе H-2d у мышей BALB/c развивался МКГН, у мышей NFS - МПГН. Так как эти линии мышей различались по генам, расположенным вне Н-2, то, вероятно именно это опредилило различия в морфологии ГН.

(3) Внутри одной и той же морфологической группы существовала генетическая гетерогенность. Развитие одного и того же морфологического варианта наблюдалось при нескольких гаплотипах Н-2 (МКГН - при Н-2Ь и H-2d, МПГН - при H-2d и H-2s), возможно, за счет схожести не Н-2 генов.

Таким образом, все выявленные закономерности совпадают с предположением о том, что развитие морфологического варианта ГН связано с совместным действием генов, контролирующих иммунный ответ,

как генов ГКГ, так и других генов расположенных вне ГКГ [Ргутоуег е1 а1., 1989]. Конечный результат обусловлен уникальным сочетанием этих генов.

Роль генотипа в чувствительности нефритогенного иммунного ответа к ЦФА. Одновременно с началом индукции сывороточного нефрита мышам однократно вводили большую дозу ЦФА (240 мг/кг веса), соответствующую дозе циклофосфановой пульс-терапии у человека. Пульс-терапия оказала различное влияние на развитие морфологических изменений в почечных клубочках - разные линии мышей проявили разную чувствительность к ЦФА (Табл. 15):

Таблица 15. Связь гаплотипа Н-2 с чувствительностью ОСН к ЦФА (Морфология ОСН на фоне ЦФА )

ДПГН МКГН МПГН

СВА (к) C57BL (Ь) BALB/c (d) NFS (d) NFR (s)

Депозиты ИК - - - - +

Инфильтрация клубочка + - - - -

Пролиферация и другие + - 4- - +

структурные изменения

Чувствительность к ЦФА - ++- 4- ++ -

Примечание. Показаны изменения в морфологической картине на фоне введения ЦФА: (-) - обозначает исчезновение признака, (+) - сохранение признака. Чувствительность к ЦФА: (-) - отсутствует, (+) - умеренная, (++) -выраженная.

- ДПГН у мышей СБА оказался достаточно резистентным (отсутствовали депозиты ИК, но сохранялась инфильтрация клубочков, пролиферация мезангиальных клеток);

- МКГН у мышей C57BL оказался достаточно чувствительным, в то время как у BALB/c - менее чувствительным (сохранялась пролиферация мезангиальных клеток);

- МПГН у мышей NFS был чувствительным, а у мышей NFR -резистентным.

Таким образом, чувствительность иммунного воспаления в клубочках к ЦФА связана с генотипом: гаплотипы Н-2к и H-2s (СВА, NFR) ассоциируются с резистентностью, а гаплотипы Н-2Ь и H-2d (C57BL, BALB/c, NFS) - с высокой или умеренной чувствительностью к ЦФА. Эти закономерности моделируют ситуацию в клинике у больных ГН, где разные морфологические типы в целом различаются по чувствительности к

иммунодепрессивной терапии и внутри одного морфологического варианта чувствительность у отдельных больных также не одинакова.

Роль генотипа на более поздних этапах иммунокомплексного ГН • стадии стихания иммунного воспаления и репарации. Исследовали динамику морфологических изменений спустя 30 дней от начала индукции ОСН, обращая внимание на сохранение признаков активности иммунного воспаления (депозиты иммунных комплексов, мононуклеарную инфильтрацию, пролиферацию и другие структурные изменения в клубочках), которые сопоставляли с развитием начальных признаков склероза (утолщение БМК, расширение мезангнального матрикса) (Табл. 16).

Таблица 16. Морфология ОСИ и чувствительность к ЦФА на поздних этапах иммунного воспаления (связь с гаплотипом Н-2)

СВА (к) C57BL (Ь) BALB/c (d) NFS (d) NFR (s)

"Активность" - ++ - - +

"Склерозирование" + ++ + + +

Примечание. Выраженность явления: (-) - отсутствует, (+) - незначительная, (+) - умеренная, (++) - заметная.

На этом этапе у всех мышей, независимо от линии, проявлялась одна и та же тенденция: стихание активного иммунного воспаления и нарастание первых признаков склероза. В то же время выраженность этих процессов была неодинакова и четко связана с генотипом. У мышей линии СВА, BALB/c, NFS признаки активного иммунного воспаления практически отсуствовали, в то время как у мышей C57BL и NFR были заметно выражены ( мезангиальные депозиты IgG и пролиферация мезангиальных клеток сохранялась на прежнем уровне). Нарастание склеротических изменений (расширение мезангиалыюго матрикса) было максимально выражено у мышей C57BL (Н-2Ь), в меньшей степени - у СВА (Н-2к) и NFR (H-2s) и было минимальным у BALB/c (H-2d) и NFS (H-2d), указывая на связь склероза с генотипом: генотип Н-2Ь ассоциировался с выраженным, а H-2d - с минимальным склерозом.

3. Механизмы гломерулярного иммунного воспаления (роль мононуклеарных лейкоцитов, тромбоцитов) и воздействия на него МП и ЦФА

Протеинурия, гиперклеточность и склероз клубочков - основные проявления ГН. В конце 70-х гг. установлено, что гиперклеточность клубочков - следствие двух процессов: инфильтрации клубочков МН-лейкоцитами и пролиферации мезангиальных клеток [Hansicker et al., 1979]. Пролиферация мезангиальных клеток и протеинурия во времени совпадали с развитием МН-инфильтрата, позволяя предположить, что МН-лейкоциты являются их причиной [Holdsworth et al., 1980]. Позже, исследования с чистыми культурами мезангиальных клеток показали [Kashgarian, 1985], что ряд цитокинов и факторов роста могут in vitro стимулировать пролиферацию мезангиальных клеток и синтез ими белков матрикса. Так как в организме МН-лейкоциты и тромбоциты являются основным источником цитокинов, предполагалось, что именно цитокины из активированных МН-лейкоцитов и тромбоцитов вызывают пролиферацию мезангиальных клеток и синтез матрикса, ведущий к нефросклерозу [Lovett, Sterzel, 1986]. Однако, практически не было доказательств, полученных на экспериментальных моделях ГН [Matsumoto, Atkins, 1989], что этот механизм дествительно имеет место при гломерулярном иммунном воспалении in vivo.

МП и ЦФА - основные препараты, применяемые для лечения ГН. Но механизмы их воздействия на гломерулярное иммунное воспаление остаются во многом не понятны, что затрудняет разработку методов рациональной, терапии.

Для исследования иммунопатологических механизмов протеинурии, пролиферации мезангиальных клеток, отложения коллагена и воздействия на них МП и ЦФА был использован подход одновременного изучения патологических процессов in vivo и in vitro. Одновременно с клиническим и морфологическим изучением развития экспериментального ГН проводился анализ клеточных и молекулярных механизмов в культуре клеток почечных клубочков.

В данной серии экспериментов исследовалась аутологнчная фаза НТН (как наиболее близкая модель пролиферативных вариантов ГН человека), которую индуцировали у крыс Wistar, и ОСН у мышей C57BL. Две группы крыс на протяжении всего срока развития НТН (14 суток) получали МП в/б в дозе 4 мг/кг (группа 1) и 14 мг/кг (группа 2). Помимо

этого непосредственно перед индукцией НТН и ОСН одной из групп крыс (группа 3) и мышей (группа 4) вводили ЦФА в дозе 240 мг/кг (см. раздел "Материалы и методы исследования"). Схемы экспериментов представлены на рис. 1 и 2. (Морфологические исследования проводились д.м.н. А.А.Ивановым, лаб. клинической морфологии ММА, часть культуральных исследований - к.б.н. О.П.Гладскнх, лаб. клинической морфологии ММА, исследование активности ИЛ-1 - вед.н.с. В.П.Лесковым, Институт иммунологии, исследование концентрации цитокинов - с.н.с. Е.П.Гителем, лаб. биохимии тканевых гормонов, ММА, часть экспериментов выполнено совместно со с.н.с. Н.В.Никифоровой, НИИ урологии МЗ РФ, которым автор выражает искреннюю благодарность).

Результаты

На 15 сутки НТН (аутологичная фаза) у крыс развилась выраженная протеинурия (600 мг/мл, в контроле - < 10 мг/мл).

Пролиферация МК "—■ Прогеппурпя

Ллгитым О-О Колпагев (IV)

ЕППИГШ] Мопопуклеарпы» лейкоциты

Рис. 17. Нефротоксический нефрит у крыс (аутологичная фаза), влияние метилпреднизолона (МП). In vivo: (А) - протеинурия (мг/мл), (В) -интенсивность свечения IgG крысы, (С) - количество мононуклеарных лейкоцитов, мезангиальных клеток и коллагена в почечной ткани; in vitro: (D) - количество мононуклеарных лейкоцитов (кл./п.з.), (Е) - скорость пролиферации мезангиальных клеток (включение Н3-тимидина, имп./мин.), (F) - интенсивность отложения коллагена.

В почечных клубочках выявлялись интенсивные отложения крысиного ^О гранулярного характера вдоль БМК; морфологическая картина соответствовала очагово-сегментарному МПГН человека с выраженной инфильтрацией клубочков МН-лейкоцитами, отслойкой эндотелия и отложением коллагена IV типа вдоль БМК (рис. 17).

4 I

3,5 - \

3 I- \

А

В

С

Рис. 18. Изменение спектра медиаторов, продуцируемых в культуре гломерулярных клеток крыс. (А) - в НТНа; (В) - в НТНа на фоне действия МП; (С) - в контроле. По оси абсцисс - время (в сут); по оси ординат -концентрация медиаторов (в нг/мл: х). 1 - ИПРФ-1; 2 - ФИО альфа; 3 - ИЛ-1 бета; 4 - ИЛ-1 альфа.

В культуре клеток почечных клубочков также отмечено значительное количество МН-лейкоцитов, высокая скорость пролиферации мезангиальных клеток, значительные отложения коллагена IV типа.

Секреция цитокинов в культуре характеризовалась определенной последовательностью: продукция ФНОа, ИЛ-1а и ИЛ-1в, максимально выраженная на ранних этапах, постепенно снижалась с одновременным нарастанием секреции ИПФР-1 (рис. 18).

Введение МП (группы 1 и 2) практически не влияло на отложение аутологичных АТ и повреждение капиллярной стенки клубочка - уровень протеинурии был близок к показателям контрольной группы животных (400 мг/мл и óüú мг/'мл, couiueiciBCHHu). Б ю же ьрсмя МП полностью подавлял инфильтрацию клубочков МН-лейкоцитами, повреждение эндотелия, а также ослаблял пролиферацию мезангиальных клеток (рис. 17).

В культуре клеток почти полностью повторялись закономерности, обнаруженные in vivo. При почти полном отсутствии МН-лейкоцитов скорость пролиферации мезангиальных клеток была значительно снижена (ниже, чем у интактных животных; р<0,05). Это сопровождалось резким снижением секреции ИЛ-1а и ИЛ-1в и в еще большей степени - ФНОа. Влияние МП на МН-лейкоциты имело дозо-зависимый характер: средние дозы МП (4 мг/кг) частично, а высокие дозы (14 мг/кг) полностью подавляли МН-инфильтрацию и пролиферацию мезангиальных клеток (рис. 19).

(А) (В)

гтуттптд Мононухледрные леЛкоцпгы •—• Пролиферация МК

Рис. 19. Влияние различных доз метилпреднизолона (МП), 4 и 14 мг/кг в сутки на развитие аутологичной фазы нефротоксического нефрита: (А) -число МН-лейкоцитов (кл./п.зр.), (В) - интенсивность пролиферации мезангиальных клеток (включение Н3-тимидина, имп./мин).

Введение МП сопровождалось значительным увеличением мезангиального матрикса за счет отложения в мезангии коллагена IV типа,

хотя в контрольной группе (при естественном развитии НТН, без введения МП) коллаген выявлялся исключительно в зоне основного повреждения -вдоль БМК. В то же время в культуре клеток коллаген практически не выявлялся, что позволяло предположить, что при отсутствии МН-лейкоцитов мезангиальные клетки теряют способность к секреции коллагена.

Из анализа этих закономерностей вытекало, что в данной модели:

(1) Протеинурия связана с повреждением капиллярной стенки клубочка, обусловленным частично антительным механизмом, частично -реакцией клеточно-опосредованного иммунитета.

(2) Пролиферация мезангиальных клеток в значительной мере обусловлена инфильтрацией клубочка МН-лейкоцитами, которая, как показано [Bhan et al., 1978, 1979], представляет собой клеточно-опосредованную иммунную реакцию на чужеродный антиген (антитела к БМК), фиксированный в капиллярной стенке клубочка. Прямая связь между количеством МН-клеток в культуре, уровнем цитокинов (ФИО и ИЛ-1) и интенсивностью пролиферации мезангиальных клеток позволила рассматривать МН-лейкоциты, как источник этих медиаторов, запускающих пролиферацию мезангиальных клеток. Это, однако, не исключает возможную роль в этом процессе также и АТ-зависимых механизмов.

(3) Синтез коллагена IV типа мезангиальными клетками контролируется факторами, одним из источников которых могут быть МН-лейкоциты.

(4) МП подавляет МН-инфильтрацию клубочков и синтез ими ФНО и ИЛ-1, снижая в итоге пролиферацию мезангиальных клеток и частично протеинурию. Влияние МП на антительный ответ в данной модели менее выражено.

ЦФА у крыс с НТН (группа 3) значительно подавлял АТ-ответ и связанное с ним повреждение капиллярной стенки клубочка: аутологичный IgG присутствовал только в отдельных капиллярных петлях, уровень протеинурии снизился с 600 до 150 мг/мл (р<0,05). В отличие от МП, ЦФА не только не подавлял, но даже несколько усиливал МН-инфильтрацию клубочков, причем помимо МН-лейкоцитов в просвете капилляров появлялись тромбоциты. Это, однако, не вызывало ожидаемого усиления пролиферации мезангиальных клеток, но сопровождалось интенсивным отложением коллагена IV типа в зоне наибольшего повреждения - вдоль БМК (рис. 20).

(Е)

-35 (F)

-ЭО Г + + +

-25

-го -++

-15

-ю

-5

L о

Норма

НТН

НТН ЦФА

Пролнф«рацпя МК ■ Протеннурия

Автигсла О-О Коллаген (IV)

iiiiiiiiiij.1 Мововуклсарные лейкоциты

Рис. 20. Нефротоксический нефрит у крыс (аутологичная фаза), влияние циклофосфана (ЦФА). Обозначения те же, что и на рис. 17.

Эти события полностью повторялись в культуре клеток: повышение количества МН-лейкоцитов сопровождалось снижением пролиферативной активности мезангиальных клеток и усилением секреции коллагена IV типа. Все это указывало на возможное изменение спектра медиаторов МН-лейкоцитов: снижение продукции цитокинов, стимулирующих пролиферацию мезангиальных клеток или, наоборот, повышение продукции супрессорных факторов и факторов, стимулирующих секрецию коллагена. Наиболее вероятным кандидатом на эту роль может быть ТРФв, ведущая роль которого в развитии склероза при экспериментальном ГН недавно показана Border et al. [1992]. Основным источником ТРФв являются моноциты и тромбоциты.

Для выяснения: является ли неожиданное усиление МН-инфильтрации клубочка особенностью действия ЦФА только при НТН или же более универсальным свойством ЦФА, эксперимент был повторен на другой модели - ОСН у мышей, в которой повреждение локализуется в другой зоне, в мезангии, и вызывается локальным образованием или отложением иммунных комплексов. Через 10 дней от начала индукции ОСН уровень протеинурии у мышей составил 500 мг/мл (в контроле

< 10 мг/мл; р<0,05). Интенсивные отложения ^М и 1еО выявлялись преимущественно в зоне мезангия. Морфологическая картина соответствовала МКГН человека и характеризовалась выраженной МН- и тромбоцитарной инфильтрацией капиллярных петель и мезангия, выраженной пролиферацией мезангиальных клеток, умеренным отложением в мезангии коллагена IV типа (рис. 21).

Норма ОСН ОСИ ЦФ

• • Пролиферация МК ■ Протеннурия

Лпптла О-О Коллаген (IV)

—I Мопопухлеарпые лепиоцпгы

Рис. 21. Острый сывороточный нефрит у мышей, влияние циклофосфана (ЦФА). Обозначения те же, что и на рис. 17.

Аналогично и в культуре клеток клубочков отмечено значительное количество МН-лейкоцитов, высокая скорость пролиферации мезангиальных клеток, умеренные отложения коллагена.

ЦФА (группа 4) вызывал те же эффекты, что и при НТН крыс: практически полное подавление протеинурии (20 мг/мл; р<0,05) и отложения антител, за исключением небольших отложений ^М в мезангии. Инфильтрация и пролиферация мезангия практически отсуствовала, но в просвете капилляров количество МН-лейкоцитов и тромбоцитов было таким же как и в контроле, а интенсивные отложения коллагена IV типа локализовались в зоне повреждения - в мезангии (рис. 21).

В культуре клеток выявлены те же закономерности, которые ЦФА оказывал при НТН: повышение количества МН-лейкоцитов и отложений коллагена сопровождалось снижением пролиферации мезангиальных клеток.

Из этих двух экспериментов следует:

(1) ЦФА эффективно подавляет антительный ответ и связанное с ним поврсждсп;:: капиллярной станки клубочка, предупреждая тем самым развитие протеинурии.

(2) В данных условиях ЦФА не влияет на развитие МН-инфильтрата, однако, при этом отсуствуют типичные проявления клеточно-опосредованного (ГЗТ) повреждения клубочков: повреждение БМК (протеинурия) и пролиферация мезангиальных клеток. Это предполагает, что ЦФА или изменял функциональное состояние клеток-эффекторов ГЗТ, устраняя повреждающий и сохраняя защитный, репаративный компонент клеточного иммунного ответа, или же вообще подавлял реакцию ГЗТ, а в развитии МН-инфильтрата играли роль другие механизмы, например, хемотаксис. Рядом авторов на других моделях также показано, что не всегда МН-инфильтрация вызывает серьезное повреждение клубочков [Sterzel et al., 1982], выполняя, в принципе, защитную роль - удаление антигена. Не ясно, какие факторы определяют переход защитной реакции в повреждение (сильное антигенное раздражение, генетические особенности иммунного ответа и т.д.).

Таким образом, биологическая роль МН-инфильтратов в процессе развития иммунного воспаления в почечных клубочках неоднозначна: они могут быть проявлением повреждающего клеточного иммунного ответа или же защитно-репаративным процессом, направленным на удаление антигена и восстановление целостности ткани.

(3) В обеих моделях отложения внеклеточного матрикса (коллагена IV типа) происходят в очагах повреждения и не приводят к существенному нарушению структур почечных клубочков, следовательно, носят характер репаративной регенерации, позволяя в целом рассматривать гломерулярное иммунное воспаление как репаративный процесс.

(4) На фоне действия ЦФА сохраняется репаративный характер отложений коллагена, в то время как при введении МП отложения происходят вне зоны повреждения - носят бессистемный характер, создавая при определенных условиях риск прогрессирующего склероза. МП, подавляя секрецию ИЛ-1 и ФНОа в МН-лейкоцитах [Alegre et al, 1991], одновременно способен стимулировать синтез ими ТФРв, который в свою

очередь, дополнительно подавляя пролиферацию мезангиальных клеток, может усиливать синтез ими коллагена IV типа [Sporn, Roberts, 1990].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вопрос о рациональной иммунодепрессивной терапии ГН сложен и противоречив. Этот вопрос слабо разработан прежде всего в теоретическом отношении, что, в свою очередь, создает большие трудности для научно-обоснованного практического применения иммунодепрессантов в клинике у больных ГН.

Несмотря на значительный рост знаний о патогенезе ГН, механизмы действия кортикостероидов и цитостатиков на гломерулярное иммунное воспаление все еще плохо понятны [Westberg, 1992]. Не ясны многие конкретные звенья патогенетической цепи и механизмы, которые являются мишенью для их воздействия. Вследствие этого в клинике при назначении иммунодепрессивной терапии до сих пор доминирует интуитивный, эмпирический подход, который порой приводит к необоснованному применению иммунодепрессантов у больных, мало чувствительных к этому методу лечения, и, наоборот, недостататочно активному лечению потенциально чувствительных больных [Cameron, 1992; Glassock, 1992].

Набор клинических и морфологических параметров, на которые опираются в настоящее время при выборе метода иммунодепрессивной терапии, ограничен. Как правило ориентируются на нозологическую принадлежность нефрита (идиопатический или в рамках системного заболевания), тяжесть клинической картины, скорость прогрессирования и давность заболевания [Мухин H.A., Тареева И.Е., 1989]. Морфологическая информация используется весьма ограниченно - обычно учитывается лишь морфологический вариант и наличие склеротических изменений. Прогностическая значимость многих из этих параметров не достаточно четко определена [Cameron, 1988].

В данной работе предпринята попытка разработать научно-обоснованный подход к рациональной иммунодепрессивной терапии ГН, которая предусматривает выбор оптимального метода лечения для каждого конкретного больного. Условиями для разработки рациональной терапии являются: 1) глубокое понимание патогенеза ГН и его различных вариантов, 2) знания о механизмах действия кортикостероидов и цитостатиков в зависимости от патогенетического варианта, стадии процесса, что позволяет сделать лучший выбор препарата, их комбинаций и методов применения, 3) выявление прогностических признаков,

позволяющих заранее предположить чувствительность больного к тому или другому методу иммунодепрессивной терапии, тем самым избежать необоснованного назначения иммунодепрессантов, выбрать лучший метод с точки зрения оптимального соотношения эффективности и токсичности. В соответствии с этими условиями разработка велась параллельно в двух направлениях: клиническом и экспериментальном.

Ciрсммсь максимально приблизиться к клинической ситуации v человека, был использован комплекс экспериментальных моделей, которые охватывают основные патогенетические механизмы ГН (антительный и иммунокомплексный) и воспроизводят спектр морфологических вариантов ГН с различной чувствительностью к иммунодепрессивной терапии. Для анализа механизмов воздействия иммунодепрессантов на гломерулярное иммунное воспаление был использован перспективный подход одновременного изучения патологических процессов in vivo и in vitro.

Существенным результатом экспериментальных исследований было подтверждение роли иммуно-генетического фактора в развитии ГН и разнообразии его морфологических вариантов. Помимо этого обнаружено, что особенности прогрессирования (персистенция воспалительной активности, скорость нарастания склеротических изменений) и чувствительность гломерулярного иммунного воспаления к ЦФА также имеют иммуно-генетическую основу. Последнее обстоятельство обосновывает поиск у больных ГН генотипов, чувствительных и резистентных к иммунодепрессивной терапии, что позволит дополнить список факторов, определяющих прогноз и выбор оптимальной терапии.

Получены новые данные об эффектах и механизмах действия МП и ЦФА на иммунное воспаление в почечных клубочках, способствующие рациональному использованию этих препаратов. ЦФА вызывал эффекты более предпочтительные с клинической точки зрения, чем те, что давал МП. В отличие от МП, вызывавшего бессистемное накопление внеклеточного матрикса и создававшего, таким образом, риск прогрессирующего склероза, на фоне ЦФА иммунное воспаление сохраняло характер репаративной регенерации: отложения коллагена носили избирательный характер, только в очагах повреждения, и не нарушали структур почечного клубочка. Эти закономерности подтверждают более ранние клинические наблюдения из Национальных институтов здоровья США [Austin et al., 1983; Balow et al., 1984]. Длительное лечение больных тяжелым ВН сверхвысокими дозами ЦФА, как показали повторные биопсии, подавляло активность воспаления без нарастания

склеротических изменений. При лечении только преднизолоном склеротические изменения прогрессировали, сопровождаясь более быстрым нарушением почечной функции. ЦФА, таким образом, представляется более предпочтительным препаратом для длительного лечения хронического иммунного воспаления.

Опираясь на полученные экспериментальные и клинические данные о действии МП и ЦФА на развитие иммуновоспалительного процесса в почке, мы полагаем, что при разработке теории лечения ГН необходимо исходить из общих принципов воздействия на хроническое иммунное воспаление [Маянский Д.В., 1991] с учетом конкретных особенностей патологического процесса в почке: 1) типа преобладающего иммунного ответа (антительный, клеточно-опосредованный) и всего комплекса медиаторов воспалительной реакции (комплемент, нейтрофильные лейкоциты, тромбоциты, МН-лейкоциты); 2) преобладающей фазы иммуновоспалительной реакции (повреждение, пролиферация, репарация). На ранних этапах развития патологического процесса, очевидно, целесообразно использовать как МП, подавляющие клеточные иммуннне реакции и предотвращающий накопление МН-лейкоцитов в клубочках, так и ЦФА, подавляющий антительный и клеточный иммунный ответ. При затихании острого иммуновоспалительного процесса и начале репарации или первых стадиях склероза более предпочтителен ЦФА, предотвращающий бессистемное накопление внеклеточного матрикса и риск развития прогрессирующего склероза. Единственный источник информации о реально происходящих в почечной ткани патологических процессах - биопсия почки, возможности которой на сегодняшний день используются весьма ограниченно.

Как следует из представленных выше экспериментальных данных, генетическая гетерогенность механизмов ГН, которая обусловливает разнообразие морфологических изменений и различную скорость прогрессирования процесса, определяет в то же время и различную чувствительность ГН к иммунодепрессивной терапии. Учитывая немалый риск серьезных осложнений, связанных с современными иммунодепрессантами, важно исключить их необоснованное назначение, в первую очередь больным с доброкачественным течением ГН. В то же время, важно вовремя распознать больных с высоким риском прогрессирования почечной недостаточности, которые и должны рассматриваться как кандидаты для "агрессивной" терапии [\Vestberg, 1992]. Важно также предсказать вероятность положительного ответа на лечение

(выявить чувствительных и нечувствительных больных). Эти вопросы связаны с проблемой прогнозирования, выявления факторов, предсказывающих течение и чувствительность процесса к терапии, учет которых является условием для разработки рациональной иммунодепрессивной терапии ГН [Pei et al., 1992]. Возможность поиска этих факторов открывают современные методы математического моделирования выл.иьас;»1сст;; [Ссх, 1972].

Четыре серии клинических исследований, выполненных у больных с различными формами ГН (идиопатическим и волчаночным), получавших различные виды цитостатической терапии (обычную пероральную или сверхвысокие дозы ЦФА, в том числе в составе наиболее "агрессивного" комбинированного режима), выявили группу прогностических факторов, куда вошли в различных комбинациях: длительность течения ГН, исходный уровень креатинина, нефротический синдром, а также активность и тяжесть морфологических изменений (морфологический вариант, индексы активности и склероза). Важно подчеркнуть, что в каждой серии исследований морфологическая информация неизменно повышала точность прогноза, обосновывая тем самым важность проведения биопсии почки. Среди прогностически неблагоприятных факторов были длительный нефрит, повышенный уровень креатинина и склеротические изменения в ткани почки. Выявление именно этих факторов как предикторов неблагоприятного исхода не случайно. Повышенный уровень креатинина -сигнал серьезных функциональных нарушений, обусловленных как текущим активным воспалительным процессом, потенциально обратимым, так и необратимыми склеротическими изменениями. Предсказать, насколько обратимо повышение уровня креатинина, исходя только из клинической информации, не зная реальной тяжести и соотношения активных и хронических изменений, как правило, затруднительно. Биопсия почки дает ответ на этот вопрос [Austin et al., 1983].

Относительная редкость БПВН, как и БПГН в целом, затрудняет быстрое проведение контролируемых клинических испытаний методов лечения. Отсюда, важное значение приобретают ретроспективные исследования, при условии их правильной организации и выполнения. Два главных условия должны быть выполнены при проведении таких исследований. Первое - наличие параллельной контрольной группы. Использование только исторического контроля - риск не учесть возможную эволюцию болезни, не связанную с проведением новых методов активной терапии. Второе - строгий контроль известных прогностических факторов

(факторов риска развития уремии или смерти больных), формирование групп, сбалансированных по главным прогностическим факторам. В нашем исследовании оба условия были соблюдены.

Хотя в данной работе не проводилось проспективных контролируемых исследований, большая эффективность пульс-терапии ЦФА у больных ГН и ВН с достаточной надежностью доказывается следующими фактами. 1) Положительными непосредственными результатами у половины больных ГН, резистентных к обычной пероральной иммунодепрессивной терапии. 2) Результатами многофакторного анализа , выявившего зависимость почечной выживаемости больных ГН от суммарной дозы ЦФА (дозо-зависимый эффект), а также отсуствие дополнительного эффекта преднизолона. 3) Существенным улучшением прогноза больных БПВН, леченных комбинированным методом, основу которого составляли сверхвысокие дозы ЦФА.

До широкого применения новых лекарственных препаратов и методов лечения, которые в корне изменят течение ГН, может пройти еще очень много времени. Поэтому необходимо рассматривать виды лечения, которые доступны в настоящее время и могут быть предложены больным сегодня и в недалеком будущем [Steinberg, 1993]. Терапия сверхвысокими дозами ЦФА представляется сегодня одним из таких возможных вариантов.

ВЫВОДЫ

1. Иммунодепрессивная терапия сохраняет ведущее место в лечении прогрессирующих форм хронического ГН. Рациональная иммунодепрессивная терапия должна строиться с учетом прогностической информации, получаемой на разных этапах ведения больного и позволяющей, с определенной вероятностью, предсказать чувствительность больного к различным методам лечения иммунодепрессантами.

2. При пероралыюм лечении цитостатиками непосредственный положительный результат возможен у 3/4 больных с активным ГН. Предикторами прогрессирования (возможной резистентности к пероральной цитостатической терапии) являются: нефротический синдром, повышенный уровень сывороточного креатинина (>1,8 мг%), ФСГС и ФП морфологические варианты , а также отсутствие ответа на лечение через 6 месяцев. Морфологическая информация существенно повышает точность прогноза, что оправдывает необходимость проведения биопсии почки.

3. Лечение сверхвысокими дозами ЦФА удовлетворительно переносится большинством (89%) больных хроническим ГН и дает положительный непосредственный эффект у половины больных, резистентных к пероральным методам лечения кортикостероидами и цитостатиками. Хороший отдаленный результат можно ожидать у больных с нормальным уровнем креатинина и длительностью болезни не более 2 лет. У больных и повышенным урсппсг.: креатинина и длительностью болезни более 2 лет для уточнения прогноза необходима биопсия почки. Более высокая эффективность ожидается при МН, МПГН и МКГН, более низкая - при ФСГС и ФП вариантах ГН. При всех морфологических вариантах выживаемость выше при индексе активности >4 и длительной активной терапии (суммарной дозе ЦФА >6.0 г). Отсутствие непосредственного ответа на лечение - показатель неблагоприятного прогноза.

4. Пульс-терапия ЦФА эффективна у 72% больных тяжелым ВН. У больных с длительным ВН и повышенным уровнем креатинина (>1,8 мг%) в определении прогноза (показаний к ЦФА пульс-терапии) решающую роль играют данные биопсии почки. При мембранозном и ДПВН успех зависит от степени склеротических изменений, которую отражает индекс склероза. При ФП нефрите - терапия мало эффективна.

5. Пульс-терапия ЦФА, у части больных в сочетании с пульсами МП, плазмаферезом и антикоагулянтами, значительно улучшает прогноз больных БПВН (повышая 5-летнюю почечную выживаемость с 5% до 75%). Независимое прогностическое значение имеют также общая длительность ВН и уровень креатинина.

6. Развитие различных морфологических вариантов экспериментального ГН и их чувствительность к пульс-терапии ЦФА обусловлены генотипом - совместным действием генов ГКГ и других генов, контролирующих иммунный ответ. При этом внутри одного генетического варианта имеется генетическая гетерогенность. Направленность дальнейшей эволюции имунного воспаления (персистенция иммунных комплексов, соотношение пролиферации мезангиальных клеток и склонности к склерозу) также генетически детерминированы.

7. Пролиферация мезангиальных клеток при экспериментальном ГН (одно из основных проявлений гломерулярного иммунного воспаления) на ранних стадиях обусловлена действием цитокинов (ФНОа, ИЛ-1а и ИЛ-1в), источником которых являются МН-лейкоциты, инфильтрирующие почечные клубочки. В процессе развития иммунного воспаления МН-

лейкоциты и тромбоциты меняют спектр секретируемых цитокинов, регулируя таким образом пролиферацию мезангиальных клеток и синтез компонентов внеклеточного матрикса.

8. Механизмы воздействия МП и ЦФА на развитие и течение иммунного воспаления в почечных клубочках различны: МП блокирует МН-инфильтрацию клубочков, синтез ими цитокинов, в итоге подавляя развитие мезангиальной пролиферации и, частично, протеинурии; влияние на антительный ответ выражено в значительно меньшей степени. ЦФА подавляет и антительный и клеточный иммунный ответ, предотвращая структурное повреждение, но, очевидно, не препятствует защитной миграции макрофагов в клубочки. ЦФА, в отличие от МП, не ведет к бессистемному отложению внеклеточного матрикса, снижая риск прогрессирующего склероза, что обосновывает его применение для длительного лечения хронического иммунного воспаления при ГН.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор выражает искреннюю признательность заведующей проблемной лабораторией нефрологии НИЦ ММА им. И.М. Сеченова, Лауреату государственной премии СССР, заслуженному деятелю науки РСФСР, академику РАЕН, профессору И.Е. Тареевой за постоянное внимание и содействие проведению работы, а также ценные советы при обсуждении результатов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.М.Шилов, И.Е.Тареева. Механизмы образования и патогенетическая роль иммунных комплексов при гломерулонефрите. Иммунология, 1983, N 5, с. 5-13.

2. Е.М.Шило», В.П.Лесков. Патогенетическая роль и клиническое значение обнаружения циркулирующих иммунных комплексов при гломерулонефрите. Тер. архив, 1983, N 6, с. 127-133.

3. Е.М.Шилов, В.П.Лесков. Роль тромбоцитов и их продуктов в иммунопатологии гломерулонефрита. Тер. архив, 1984, N 7, с. 134-139.

4. Е.М.Шилов, В.П.Лесков, Н.Б.Гордовская. Роль мононуклеарных лейкоцитов и клеточного иммунитета в повреждении почек у больных нефритами . Тер. архив, 1986, N 3, с. 138-143.

5. В.М.Ермоленко, Ю.С.Милованов, Е.М.Шилов, Ю.В.Комягин, М.В.Захаров. Применение экстракорпоральных методов лечения у больных с системными заболеваниями соединительной ткани. В кн.: 1-я Всесоюзная конференция по экстракорпоральным методам лечения ревматологических заболеваний (тезисы докладов). Ростов-Великий, 1986.

6. Е.М.Шилов, Н.Б.Гордовская, А.А.Иванов, В.П.Лесков, В.В.Сура. Клеточные аспекты иммуновоспалительного поражения почек. Тер. архив, 1987, N 11, с. 150-154.

7. Ю.С.Милованов, Е.М.Шилов В.М.Ермоленко. Применение экстракорпоральных методов лечения у больных с системными заболеваниями соединительной ткани. В кн.: 1-я конференция нефрологов Северо-Запада РСФСР (тезисы докладов), 1987, с. 32-33.

8. Ю.С.Милованов, Е.М.Шилов, М.В.Захаров, В.М.Ермоленко. Оценка эффективности гемосорбции и плазмафереза в лечении больных волчаночным нефритом с почечной недостаточностью. В кн.: XIX Всесоюзный съезд терапевтов (тезисы докладов). Ташкент, 1987, с. 217218.

9. Н.Б.Гордовская, Е.М.Шилов, Т.Н.Краснова, Н.Г.Мирошниченко. Влияние терапии цитостатиками на течение гломерулонефрита. Там же: с. 429.

10. Ю.С.Милованов, Ю.В.Комягин, Е.М.Шилов, В.М.Ермоленко. Плазмаферез в лечении быстропрогрессирующего гломерулонефрита. Тер. архив, 1989, N 6, с. 78-81.

11. И.Е.Тареева, Н.Б.Гордовская, О.П.Гладских, А.А.Иванов, Т.Н.Краснова, Н.Г.Мирошниченко, Л.Р.Полянцева, Д.В.Самойлов, Е.М.Шилов. Лечение хронического гломерулонефрита цитостатиками. Тер. архив , 1989, N 6, с. 9-13.

12. А.А.Иванов, Е.М.Шилов, О.П.Гладских, О.В.Габрилевская, Н.В.Никифорова, М.А.Пальцев. Иммуногистохимическая характеристика нефротоксического сывороточного нефрита у крыс: роль интерлейкина в развитии гетерологичной и аутологичной фаз. Архив патологии, 1991, N 7, с. 15-19.

13. Д.В.Самойлов, А.А.Иванов, О.П.Гладских, Т.Н.Краснова, Е.М.Шилов, М.А.Пальцев, И.Е.Тареева. Действие циклофосфана при различных морфологических вариантах гломерулонефрита мышей. Архив патологии. 1990, N 4, с. 53-57.

14. И.Е.Тареева, Т.Н.Янушкевич, Е.М.Шилов, Ю.С.Милованов, М.Д.Романова. Быстропрогрессирующий волчаночный нефрит. Тер. архив, 1990, N 6, с. 46-49.

15. Л.Р.Полянцева, Н.Б.Гордовская, Т.Н.Краснова, Д.В.Самойлов, Е.М.Шилов. Осложнения цитостаической терапии гломерулонефрита. Тер. архив, 1990, N 12, с. 63-66.

16. О.В.Габрилевская, А.А.Иванов, С.М.Терехов, Е.М.Шилов. Выделение и характеристика клеток первичной культуры почечных клубочков крыс. Бголл. эксп. биол. мед., 1990, N 1, с. 57-60.

17. Е.М.Шилов, О.В.Габрилевская, А.А.Иванов, О.П.Гладских, М.А.Пальцев, И.Е.Тареева. Метил-преднизолон при нефротоксическом нефрите у крыс: анализ действия с помощью культуры гломерулярных клеток. В кн.: Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины (Сб. научи, трудов 1 ММИ им. И.М.Сеченова). Москва, 1990, с. 45-48.

18. Е.М.Шилов, Н.Б.Гордовская, О.В.Габрилевская, Т.Н.Краснова, А.А.Иванов, С.Н.Савицкий, Д.В.Самойлов. Клиническая и экспериментальная оценка иммуно-воспалительной активности гломерулонефрита. В кн.: Критерии активности гломерулонефрита (V Пленум союзной проблемной комиссии "Нефрология"). Фрунзе, 1990, с. 47.

19. О.В.Габрилевская, О.П.Гладских, А.А.Иванов, В.П.Лесков, Е.М.Шилов. Мононуклеарные лейкоциты и продукция интерлейкина -1 в культуре гломерулярных клеток при экспериментальном гломерулонефрите. Там же: с. 5.

20. А.А.Иванов, Д.В.Самойлов, О.П.Гладских, Е.М.Шилов. Влияние Н-2 антигенов на активность экспериментального гломерулонефрита и его чувствительность к иммунодепрессантам. Там же: с. 6.

21. Л.Р.Полянцева, Н.Б.Гордовская, Т.Н.Краснова, Д.В.Самойлов, Е.М.Шилов. Побочное действие цитостатических препаратов при лечении хронического гломерулонефрита. В кн.: Диагностика и лечение болезней почел. îÏBa;;ci;c, 1990, с .19-40.

22. Н.Б.Гордовская, Т.Н.Краснова, Л.Р.Полянцева, Д.В.Самойлов, Е.М.Шилов. Цитостагики в лечении гломерулонефрита. Там же: с. 1011.

23. Ю.С.Милованов, Е.М.Шилов, Ю.В.Комягин, В.М.Ермоленко. Плазмаферез в лечении быстропрогрессирующего гломерулонефрита. Там же: с. 13.

24. Е.М.Шилов, О.В.Габрилевская, А.А.Иванов, О.П.Гладских, В.П.Лесков, М.А.Пальцев, И.Е.Тареева. Роль мононуклеарных лейкоцитов в патогенезе гломерулонефрита. Тер. архив, 1991, N 6, с. 21-26.

25. О.В.Габрилевская, О.П.Гладских, А.А.Иванов, В.П.Лесков, Н.В.Никифорова, Е.М.Шилов, И.Е.Тареева, М.А.Пальцев, В.И.Кирпатовский. Продукция интерлейкина-1 мононуклеарными лейкоцитами и мезангиальными клетками при экспериментальном нефротоксическом нефрите. Бюлл. экспер. биол. мед., 1991, N 3, с. 229232.

26. Т.Н.Краснова, Е.М.Шилов, А.А.Иванов, Д.В.Самойлов, Н.Б.Гордовская, Н.Г.Мирошниченко, И.Е.Тареева. Лечение хронического гломерулонефрита сверхвысокими дозами циклофосфана. Тер. архив, 1991, N 6, с. 115-118.

26а. T.N.Krasnova, E.M.Shilov, A.A.lvanov, D.V.Samoilov, N.B.Gordovskaya, N.G.Miroshnichenko, I.E.Tareyeva. The treatment of chronic glomerulonephritis with cyclophosphamide pulse therapy. Soviet Archives of Internal Medicine, 1991, 63 (3): 125-129.

27. А.А.Иванов, Е.М.Шилов, О.П.Гладских, О.В.Габрилевская, Н.В.Никифорова, M.А.Пальцев. Иммуногистохимическая характеристика нефротоксического нефрита крыс: влияние метилпреднизолона и фенозана калия. Архив патологии, 1992, N 1, с. 45-50.

28. Е.М.Шилов, Т.Н.Краснова, А.А.Иванов, Н.В.Аккуратова, Н.Г.Мирошниченко, Н.Б.Гордовская, И.Е.Тареева. Прогноз

волчаночного нефрита при лечении сверхвысокими дозами циклофосфана. Тер. архив, 1992, N 8, с. 63-67.

28а. E.M.Shilov, T.N.Krasnova, A.A.Ivanov, N.V.Akkuratova,

N.G.Miroshnichenko, N.B.Gordovskaya, I.E.Tareyeva. Prognosis of lupus nephritis treated with high dose intravenous cyclophosphamide. Soviet Archives of Internal Medicine, 1992, 64 (4): 489-493.

29. Т.Н.Краснова, Е.М.Шилов. Иммуносупрессивная терапия хронического (брайтова) нефрита. Тер. архив, 1993, N 6, с. 88-93.

30. А.А.Иванов, Е.М.Шилов, О.П.Гладских, Т.Н.Краснова, В.В.Карпухин, М.А.Пальцев. Экспериментальное обоснование иммунодепрессивной терапии гломерулонефрита. Тер. архив., 1993, N 6, с. 23-26.

31. I.E.Tareyeva, T.N.Krasnova, D.V.Samojlov, E.M.Shilov. Contemporary role of cytostatics in the treatment of nephritis. XX Ceskoslovensky Nefrologicky Kongres. Pragha, 1990 (Free communication).

32. N.B.Gordovskaja, L.R.Polijantceva, E.M.Shilov, D.V.Samojlov. Complications of cytotoxic treatment of glomerulonephritis. Ibid. (Poster).

33. T.N.Krasnova, E.M.Shilov, N.B.Gordovskaja. Medium dose cyclophosphamide treatment of chronic glomerulonephritis. Ibid. (Poster).

34. I.E.Tareyeva, M.A.Paltsev, E.M.Shilov, A.A.Ivanov, O.V.Gabrilevskaya. Mononuclear leukocytes (MNL) and interleukin-1 (1Ы) production in the glomerular cell cultures in experimental glomerulonephritis. XXVII-th Congress EDTA/ERA (Abstracts). Vienna, 1990 , p. 68.

35. D.V.Samoilov, A.A.Ivanov, O.P.Gladskich, E.M.Shilov. Cyclophosphane "pulses" in three inbred strains of mice with experimental immune complex nephritis. Nephron, 1990, 55 (3): 338.

36. O.V.Gabrilevskaja, O.P.Gladskich, A.A.Ivanov, V.P.Leskov, E.M.Shilov, M.A.Paltsev. Production of interleukin-1 by mononuclear leukocytes and mesangial cells in experimrntal nephrotoxic nephritis. Nephron, 1991, 58 (1): 112-113.

37. O.V.Gabrilevskaja, O.P.Gladskich, A.A.Ivanov, V.P.Leskov, E.M.Shilov, M.A.Paltsev, I.E.Tareyeva. Mononuclear leukocytes and production of interleukin-1 in the glomerular cell cultures in experimental glomerulonephritis. Proc. International. Soc. Pathophysiology, Moscow, 1991 (Abstracts), p.165 (Poster).

38. M.A.Paltsev, A.A.Ivanov, E.M.Shilov, O.V.Gabrilevskaya, O.P.Gladskich. The effects of potassium phenozani on the heterologous phase of nephrotoxic nephritis. Pathol. Res. Pract. 1991, 187 (6): 741 (Abstract).

39. A.Ivanov, E.Shilov, O.Gladskich, E.Gitel, V.Karpuchin, M.Paltsev, I.Tareyeva. IL-1 and TNF-a are major mediators in two different models of experimental nephritis. XXX-th Congress of EDTA, Glasgow, 1993 (Abstracts), p. 24.

40. I.Tareyeva, E.Shilov, T.Krasnova, D.Samoilov. Cyclophosphamide pulse-therapy in rapidly progressive lupus nephritis. Ibid., p.64 (Oral . presentation).

41. A.Ivanov, O.Gladskich, V.Karpukchin, E.Shilov, M.Paltsev. Is a glomerular MN infiltration always dangerous in glomerulonephritis ? XII-th International Congress of Nephrology, Jerusalem, 1993 (Abstracts), p.65 (Poster).

42. A.Ivanov, O.Gladskich, V.Karpukchin, E.Shilov, M.Paltsev. Role of mononuclear cell (MN) mediators in nephrotoxic serum nephritis (NTN). Ibid.,p. 66 (Poster).

43. I.Tareyeva, E.Shilov, T.Krasnova, D.Samoilov. Cyclophosphamide pulse-therapy in rapidly progressive lupus nephritis. Ibid., p. 175 (Poster).

44. E.M.Shilov, T.N.Krasnova, A.A.Ivanov, I.E.Tareyeva. Prognostic factors in lupus nephritis treated with cyclophosphamide pulses. Nephron, 1993 (Accepted for publication).