Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунный статус и структурно-функциональная характеристика иммунокомпетентных клеток у детей при пиелонефритах

•ШШСКШЬГОСУДАРСТВЕННЬШ ОРДЕНА ТРУДОВОГО ' 'Ш>АСНОТО ЗНАМЕНИ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУ Т

' 4 СЕН 1933 ^

УДК 616.61+615.37+616.053.2

ПРИЩЕПОВА Елена Викторовна

ИММУННЫЙ СТАТУС И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК У ДЕТЕЙ ПРИ ПИЕЛОНЕФРИТАХ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских нате

Минск- 1999

Работа выполнена в Белорусском НИИ экологической и профессиональной патологии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Титов Л.П.

Научный консультант:

кандидат медицинских наук доцент Остапенко С.М.

Оффициальные оппоненты:

член-корр. БелАМН, доктор медицинских наук профессор Беляева Л.М.

доктор медицинских наук профессор Адаменко Г.П.

Оппонирующая организация:

БелНИИ охраны материнства и детства

Защита состоится 25 мая 1999 г. в 15 часов на заседании совета по защите диссертаций Д 03.18.05 при Минском ордена Трудового красного Знамени государственном медицинском институте по адресу: 220116 г. Минск, пр-т Дзержинского, 83, тел. 272-55-98

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Минского государственного медицинского института

Автореферат разослан ^Сс'с^-?-- 1999 г.

Ученый секретарь специализированного совета по защите диссертаций,

к.м.н. доцент

И .А. Крылов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Изучение роли иммунной системы в развитии патологических процессов продолжает оставаться актуальной. Одной из основных, причин возникновения пиелонефрита ( ПН) у детей является снижение иммунологической реактивности организма. В силу этого перспективным подходом к оптимизации патогенетической терапии при данной патологии представляется оценка состояния различных звеньев иммунитета. Проблемы роста заболеваемости пиелонефритом у детей, патоморфоза этой патологии в современных экологических условиях и недостаточной эффективности традиционных методов лечения сегодня весьма актуальны. Поэтому применение эфферентных методов с целью коррекции состояния здоровья, и, в частности, дисфункции иммунной системы ( ИС) при пиелонефритах также приобретает важное значение. К тому же изучение механизма реализации подобного воздействия и адекватная оценка его эффективности с помощью новых диагностических подходов сможет дать дополнительные знания и новую информацию для разработки тактики и стратегии лечения детей, страдающих данной патологией.

Связь работы с крупными научньши программами. Работа была выполнена в рамках Комплексной целевой программы Беларуси «Охрана материнства и детства в условиях воздействия последствий катастрофы на Чернобыльской АЭС», утвержденной Верховным Советом Республики Беларусь 21 февраля 1991 года по теме НИР «Осуществить широкое внедрение в медицинскую практику разработанный комплекс мероприятий по совершенствованию диагностики, лечения, профилактики заболеваний почек у детей и новых организационных форм их диспансеризации ( Могилев-ская, Гомельская, Брестская: области).

Цель и задачи исследования.

Цель: Анализ параметров иммунного статуса и структурно-функционального состояния иммунокомпетентных клеток крови у детей с пиелонефритами с учетом различных экологических условий их проживания при включении курсов энтеросорбции и аутотрансфузии ультрафиолетом облученной крови в комплексное лечение.

Задачи:

1. Дать сравнительную оценку исходного иммунного статуса у детей с острыми и хроническими пиелонефритами в зависимости от различных экологических условий проживания.

2. Провести сравнительный анализ исходного структурно-функционального состояния интерфазного хроматина ядер лимфоцитов и нейгрофилов у здоровых детей и у детей, страдающих пиелонефритами, в зависимости от различных экологических условий проживания.

3. Оценить иммунный статус у детей с пиелонефритами при включении курсов энтеросорбции и аутогрансфузии ультрафиолетом облученной крови в комплексное лечение.

4. Сравнить структурно-функциональные изменения хроматина ядер лимфоцитов и нейтрофилов у детей с пиелонефритами при обычном противовоспалительном лечении и при включении курса энтеросорбции в комплекс лечебных мероприятий.

5. Провести исследование структурно-функциональных изменений хроматина ядер лимфоцитов и нейтрофилов у детей с пиелонефритами при обычном противовоспалительном лечении и при включении курса аутотрансфузии ультрафиолетом облученной крови в комплекс лечебных мероприятий.

Объект исследования - дети, страдающие пиелонефритами. Предмет исследования - иммунный статус и структурно-функциональное состояние лимфоцитов и нейтрофилов у этих детей.

Методология и методы проведенного исследования. Иммунный статус изучался стандартными методиками. Экспрессия СО-антигенов оценивалась проточной цитофлуорометрией. Фагоцитарная активность определялась тестом фагоцитоза с культурой дрожжей при окрашивании флуорохроиом. Структурно-функциональное состояние клеток изучалось методом компьютерной морфоденситометрии на системе анализа изображения "ДиаМорф".

Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые изучено состояние иммунной системы у детей с пиелонефритами в зависимости от различных экологических условий проживания этих детей. Показаны различия в состоянии эпигенома иммунокомпетентных клеток (ИКК) и фагоцитарной активности нейтрофилов детей, живущих в условиях хронического воздействия «радиационного» и «химического прессинга» по сравнению с проживанием в условиях «экологического комфорта». Впервые был использован новый методический подход - изучение состояния эпигенома клеток методом компьютерной морфоденситометрии с помощью системы анализа изображений для оценки структурно-функционального состояния лимфоцитов (ЛФ) и нейтрофилов (НФ). Метод компьютерной морфоденситометрии (КМДМ) впервые был применен для мониторинга лечения детей с почечной патологией. С помощью данного метода впервые было изучено структурно-функциональное состояние ядер нейтрофилов. При анализе полученных результатов исследования влияния эфферентных методов на структурно-функциональное состояние ИКК впервые было использовано сочетание методов математической статистики и элементов теории нечетких множеств.

Практическая значимость полученных результатов.

1. Эфферентные методы терапии включены в комплексное лечение детей с пиелонефритами в нефрологическом отделении клиники БелНИИ

ЭПП. Их применение улучшало состояние эпигенома иммунокомпетентных клеток, способствовало нормализации показателей иммунного стату са, наступлению клинико-лабораторного улучшения.

2. Метод компьютерной морфоденситометрии может быть использо-зан для мониторинга состояния здоровья населения при воздействии неблагоприятных экологических условий проживания, а также для контроля эффективности проводимого лечения.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: ¡.Изменение иммунного статуса, преимущественно фагоцитарной активности нейтрофилов, у детей с пиелонефритами, проживающих в экологически неблагоприятных условиях, является одной из причин, определяющих патоморфоз этой патологии.

2. Хроническое воздействие малых доз ионизирующего излучения оказывает более выраженное негативное влияние по сравнению с химическими антропогенными экологическими факторами на иммунный статус и структурно-функционатьные характеристики иммунокомпетентных клеток (феномен активации интерфазного хроматина).

3. Компьютерная морфоденситометрия позволяет выявить тонкие структурно-функциональные изменения эпигенома иммунокомпетентных клеток.

4. Иммуномодулирующий эффект энтеросорбции и аутотрансфузии ультрафиолетом облученной крови, проявляющийся при включении данных методов эфферентной терапии в комплексное лечение детей с пиелонефритами, указывает на необходимость более широкого применения этих методов в клинической педиатрии.

Личный вклад соискателя. Лично автором проводился подбор детей для групп исследования из числа госпитализированных в нефрологическо-го отделение клиники БелНИИ ЭПП, выполнение тестов фагоцитоза, изучение структурно-функционального состояния иммунокомпетентных клеток с помощью метода компьютерной морфоденситометрии. Клинико-лабораторное наблюдение за обследуемыми детьми проводилось автором совместно с научным консультантом к.м.н. С.М. Остапенко и лечащими врачами нефрологического отделения клиники БелНИИЭПП. Определение экспрессии СБ-антигенов методом проточной цитофлуорометрии, постановка тестов иммунного статуса 1 уровня проводилось в иммунологической лаборатории Могилевского областного диагностического центра при участии коллектива лаборатории и доктора А.Е. Борисенко. Статистическая обработка результатов проводились лично автором диссертации.

Апробация результатов диссертации. Результаты исследований, включенные в диссертацию, были доложены на V Респ. науч.-практ. конференции «Научно-практические аспекты сохранения здоровья людей, подвергшихся радиационному воздействщо в результате аварии на Чернобыльской АЭС» ( Минск, 1996); на сатгелитном симпозиуме «Здоровье де-

тей «чернобыльской зоны» Беларуси» в рамках П1 Межд. конгресса «Мир после Чернобыля» (Могилев, 1996); на Межд. конф. «Biological Effects of Radiation Injury» ( Минск, 1996); на Конф. Центральной и Восточной Европы по астме, аллергии и клинической иммунологии (Лодзь, Полыпа,1996); на симпозиуме «Морфометрические методы в доклиническом изучении лекарственных средств» в рамках IV Российского нац. Конгресса «Человек и лекарство» ( Москва, 1997); на симпозиуме «Лабораторная медицина - тенденции и перспективы» в рамках Национальных дней лабораторной медицины России ( Москва, 1997); на V научном съезде специалистов клинической лабораторной диагностики Республики Беларусь ( Минск, 1997); на Международном Конгрессе PUER «Essiste il problema Chernobyl?» (Рим, Италия, 1997); на III Белорусской конференции «Эфферентные и физико-химические методы терапию) ( Могилев, 1998).

Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликована 1 статья в научном журнале; 7 статей в сборниках научных статей; 4 тезисов в материалах республиканских и международных конференций. Общее количество опубликованных материалов составляет 38 страниц.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах и состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, методической части, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 201 использованный источник. В работе 20 рисунков (11 страниц), 36 таблиц ( 24 страницы).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ Материалы и методы исследования

Было обследовано 79 детей с первичным пиелонефритом (38 человек с острым и 41 - с хроническим в стадии обострения) в возрасте от 6 до 14 лет, находившихся на стационарном лечении в нефрологическом отделении клиники БелНИИЭПП. Контрольную группу составили 34 ребенка из г. Могилева и Могилевской области, отнесенных к практически здоровым.

При проверке репрезентативности групп было установлено следующее. По критерию Колмогорова-Смирнова ( Гублер Е.В., 1978) по возрасту выборка детей с ПН имеет нормальное распределение (d=0.0850, /.табл.=0.1518, р>0.05). Выборка детей контрольной группы по возрасту также имеет нормальное распределение (d=0.1187, Хтабл.=0.2480, р>0.05). Между этими двумя выборками не установлено различий в форме распределения по критерию Колмогорова-Смирнова (Я.=0.9308, р=0.35). По критерию Стьюдента не выявлено различий между данными группами по полу (р=0.6365) и по распределению в зависимости от места проживания

(р=0.6105). Проведенный анализ репрезентативности групп позволяет утверждать, что данные выборки репрезентативны, и они различаются лишь пс наличию или отсутствию заболевания пиелонефритом.

Для изучения влияния различных экологических условий проживания как дети с ПН, так и дети контрольной группы были разделены на 3 группы.

В 1 группу включены живущие в сельской местности Могилевской области с плотностью загрязнения 137Cs до 1 Ku/км', в зоне относительного экологического комфорта; во 2 группу - дети, проживающие в Могилевской области (уровень загрязнения территории по 137Cs выше 1 Кн/км2 ), подвергающиеся хроническому воздействию малых доз ионизирующего излучения, т.н. радиационному прессингу. В 3 группу включены дети из г. Могилева, крупного индустриального центра с высоким уровнем атмо- и литохимического загрязнения, живущие в условиях химического техногенного прессинга.

Для проведения курса энтеросорбции (ЭС) в комплексном лечении детей с ПН был применен новый энтеросорбент "Белосорб-П». Дети получали энтеросорбент курсом - 10 дней (3-кратный ежедневный прием в дозе 0.1 г/кг веса).

При аутотрансфузии ультрафиолетом облученной крови (АУФОК) был использована следующая схема: 3 процедуры через день. АУФОК проводилась на аппарате "Надежда" по стандартной методике (из расчета 1-2 мл/кг массы тела, длина волны 254 нм).

Для оценки иммунного статуса крови определяли: абсолютное содержание лейкоцитов, относительное кол-во лимфоцитов; абсолютное и относительное кол-во Т-лимфоцигов методом Е-РОК; кол-во клеток, относящихся к теофиллинчувствительным и теофиллинрезистентным субпопуляциям Т-лимфоцитов (Т-ц, Т-у); абсолютное и относительное кол-во В-лимфоцитов методом М-РОК; циркулирующие иммунные комплексы методом осаждения полиэтиленгликолем по общепринятым методикам ( Д.К. Новиков, 1987, В.В. Меньшиков, 1987). Содержание иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG определяли методом простой радиальной иммунодиффу-зии (Manchini О. et al, 1965). Экспрессия CD-антигенов ( CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD24, CDllb), определялась методом проточной цитофлуоро-метрии на аппарате «EPICS» (COULTER, Франция) с FITC-меченными монокпональными антителами ( моноклональные антитела "Sigma"( США) и "МедБиоСпектр" ( Москва, Россия)).

Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови был поставлен тест фагоцитоза с культурой дрожжей Candida albicans (Г. Фримель, 1987). Для подсчета результатов теста использовалась суправитальная окраска препаратов флуорохромом акридином оранжевым (DeDuveC., 1974).

Структурно-функциональное состояние иммунокомпетентых клеток оценивалось методом компьютерной морфоденситометрии (A.B. Жукоц-кий, 1992). Видеотехнология метода реализована на аппаратно-программном комплексе "ДиаМорф" (фирма "ДиаМорф", Москва). Для каждого этапа анализа изображения авторам совместно с профессором A.B. Жукоцким были разработаны компьютерные программы. Первоначально создавались изображения выбранных ядер, которые компоновались в видеоархивы с сохранением последних в памяти компьютера. Далее изображения ядер из архивов, селектированные после визуальной оценки, подвергались процессу улучшения изображения, и затем проводился их анализ с микроанатомированием ядра на компоненты и измерением заданного комплекса параметров с формированием файла полученных данных.

Исследовались ядра лимфоцитов и нейтрофилов в стандартных мазках периферической крови на предметных стеклах, обработанных РНК-азой в растворе сахарозы и специально окрашенных галлоцианин-хромовыми квасцами на выявление хроматина и заключенных в Canadian balsam (A.B. Жукотсий с соавт., 1985).

В процессе анализа лимфоциты были подразделены на малые и средние с помощью созданной автором программы для визуальной оценки субпопуляций ядросодержащих клеток. Для чистоты полученных результатов были взяты показатели только малых лимфоцитов. Следовательно, приводящиеся в работе данные исследования структурно-функционального состояния ЛФ касаются малых лимфоцитов периферической крови. При создании архивов НФ отбирались только сегментоядерные нейтрофилы, исключая палочкоядерные.

В исследовании кнтерфазный хроматин (ИХ) ядер подразделялся на 4 компоненты (A.B. Жукоцкий, 1995). Две из них были отнесены к компактному, плотному или конденсированному ( гетеро-) хроматину; и две - к диффузному, рыхлому или деконденсированному (эу-) хроматину. Наиболее темная, гранулярная, компонента гетерохроматина обозначена ql; светлая компонента гетерохроматина, так называемая перигранулярная зона - q2; наиболее светлая компонента эухроматина - q4, и соответственно промежуточная между q2 и q4 - компонента q3.

Иммунный статус и структурно-функцнональное состояние им-мунокомпетентных клеток у детей с пиелонефритами

Изучение иммунного статуса. При изучении иммунного статуса у детей с ПН в сравнении с контрольной группой было выявлен выраженный дисбаланс в иммунной системе. Причем наибольшие изменения обнаруживаются в Т-звене (рис. 1). Процентное содержание Е-РОК по сравнению с контрольной группой статистически достоверно ниже. Наряду с этим, при низком содержании теофиллинрезистентных лимфоцитов на-

блюдалось повышение теофнллинчувствительных (Ту) з 1.6 раза. Соответственно, соотношение ТцУТу у детей с ПН статистически достоверно меньше по сравнению с контрольной группой.

Результаты проточной цитофлуоро.метрии показали боле; зысоклто экспрессию СЭЗ'1' -антигенов у детей с ПН (1"- 1.5''о ) по сравнению с контролем (68.2 ± 3.0%, р<0.05). Наряду с незначительно большей экспрессией С04+-антигенов у больных детей достоверно больше содержание С08+-клеток (32.7 ± 2.7%, в контр, гр. 25 8 ± 1 3%. р<0 05). К тему же у детей с ПН наблюдается в 2 раза меньшее количество естественных киллеров (СБ 16+-клеток) по сравнению с группой контроля I р<0.0Г)

При сравнительном анализе показателей фагоцитоза нентрофилов периферической крови у детей с ПН по сравнению с контролем было обнаружено статистически достоверное снижение фагоцитарной активности При этом у них незначимо снижена бактерицидная активность фагоцитов, л также доля функционально состоятельных фагоцитов.

¡□дети с пиелонефритом □ контрольная группа

Рис.1 Показатели клеточного иммунитета у детей с ГШ в сравнении с контрольной группой.

Поскольку в ходе исследования не было выявлено статистически значимых различий в показателях иммунной системы у детей с острым и хр.ПН, для дальнейшего анализа группы детей с о.ПН и хр.ПН были объединены в одну.

При оценке влияния условий проживания не было выявлено достоверных различий показателей клеточного и гуморального иммунитета у детей, проживающих в различных экологических условиях..

В то же время, сравнительный анализ показателей фагоцитоза ней-трофилов выявил, что у детей из 2 группы фагоцитарный индекс (ФИ) достоверно выше по сравнению с 1 группой и ниже бактерицидность ( табл. 1). Доля же активных фагоцитов (АФ) в 1 и 2 группе примерно одинакова. В 3 группе ИП также достоверно ниже, чем в 1 группе. Но при этом доля АФ выше, чем в 1 и 2 группах. К тому же этот показатель даже несколько превышает таковой в контрольной группе .

Таблица 1

Показатели фагоцитоза у детей с ПН в зависимости

от воздействия неблагоприятных экологических факторов (М ± ш)

Показатели 1 группа (п = 20) «экол. комфорт» 2 группа (п = 17) «рад. прессинг» 3 группа (п = 23) «хим. прессинг»

ФИ (%) 83.9 ±2.1 90.1 ±1.64 87.5 ± 1.8

ФЧ 2.8 ±0.2 3.1 ±0.2 3.3 ±0.2

ИП(%) 27.1 ± 1.7 17.4 ±1.54 20.5+1.2*

АФ (%) 37.3 ±2.1 37.9 ±3.5 56.3±2.3**

Примечания:

1. ♦ - достоверные различия по критерию I между 1 и 2 гр. (р<0.05);

2. * - достоверные различия по критерию I между 1 и 3 гр. (р<0.001);

3. • - достоверное различие по критерию I между 2 и 3 гр. (р<0.001).

Следует отметить, что при сравнении показателей иммунного статуса здоровых детей, проживающих в различных экологических условиях, не было обнаружено статистически достоверных различий.

Обнаруженные в ходе исследования различия показателей иммунного статуса детей в зависимости от воздействия экологических факторов позволили предположить, что они могут быть обусловлены струюурно-функциональными изменениями ИКК. Для изучения этого был применен метод КМДМ.

Изучение структурно-функционального состояния ИКК. При анализе структурно-функционального состояния ИКК было установлено, что у детей, подвергающихся воздействию ионизирующей радиации, выявлен феномен активации хроматина: была статистически достоверно снижена доля неактивного хроматина с тенденцией к его компактизации, и увеличена доля активного хроматина в ядре с признаками его разрыхления (рис. 2). Подобный феномен наблюдался и у детей с ПН, и у здоровых детей, как в ЛФ, так и в НФ.

В ядрах ИКК у детей, проживающих в г. Могилеве и подвергающихся "химическому " прессингу, обнаружены лишь некоторые признаки активации: уменьшение доли гетерохроматина. Причем в ИХ ЛФ выявлено достоверное увеличение доли эухроматина с признаками его активации.

Наряду с этим были обнаружены характерные различия структурно-функционального состояния ИКК здоровых детей и страдающих ПН. Хроматин в компонентах и ядре в целом у последних был достоверно более контрастен. Причем величина разности показателей контрастности у здоровых и больных детей зависела от экологических условий проживания: наибольшая выявлена у детей, подвергающихся "химическому" прессинг}.

Рис. 2 Отношение плотного хроматина к рыхлому в ядрах НФ у детей с ПН ( 1, 2 и 3 гр.) и здоровых детей ( 1К, 2К и ЗК гр.) в зависимости от экологических условий проживания.

Состояние нммуннои системы у детей с пиелонефритами при включении в комплексное лечение методов эфферентной терапии

Иммунный статус в динамике курса ЭС. Для оценки воздействия ЭС на состояние ИС нами было проведено сравнительное обследование 2 групп детей с ПН: одна (Б) - дети, в комплексное лечение которых входил курс энтеросорбции сорбентом "Белосорб-П", вторая (А)- дети, пролеченные обычными методами ( антибактериальная терапия, симптоматическое лечение). Поскольку был выявлен ряд различий в исходном состоянии ИС в зависимости от различных экологических условий проживания, то каждая из них была разделена на 1,2 и 3 группы.

Следует отметить, что не было выявлено каких-либо достоверных изменений в показателях иммунограммы в данных группах как при проведении только традиционного лечения, так и при проведении ЭС. Лишь у детей, живущих в экологически чистых условиях, после обычного лечения выявлено достоверное снижение относительного количества Ти лимфоцитов и абсолютного количества В-лимфоцитов.

В тоже время обнаружены значимые различия фагоцитарной активности нейтрофилов ( табл. 2). При проведении курса ЭС у детей 1Б группы показатели фагоцитарной активности НФ практически не изменились. Во 2Б группе ( дети, подвергающиеся «радиационному прессингу») не выявлено положительных изменений показателей фагоцитоза, что, возможно, обусловлено исходной декомпенсацией НФ и истощением их лизосомаль-

2Б группе ( дети, подвергающиеся «радиационному прессингу») не выявлено положительных изменений показателей фагоцитоза, что, возможно, обусловлено исходной декомпенсацией НФ и истощением их лизосомаль-ного аппарата. Однако, в ЗБ группе ( дети, живущие в условиях «химического прессинга») изменения функционального состояния НФ были весьма благоприятными: наблюдалось приближение показателей фагоцитоза к их уровню у здоровых детей (увеличивалось число фагоцитов, повышалась их бактерицидная способность, снижалось количество активных фагоцитов).

Таблица 2

Сравнительные показатели фагоцитоза НФ у детей с ПН

в зависимости от экологических условий проживания _при проведении курса энтеросорбции (М±ш)_

Показатели 1Б группа «экол. комфорт» (п=11) 2Б группа «рад. прессинг» (п=10) ЗБ группа «хим. прессинг» (п=11)

до после до после до после

ФИ(%) 79.8± 3.0 87.3± 1.8 89.4±2.8 88.2 ±2.9 81.7 ±2.3 93.Ш.0*

ФЧ 2.4 ± 02 2.6 ±0.1 2.8 ±0.1 3.7 ± 0.2 2.8 ±0.2 2.9 ±0.2.

ИП(%) 30.8 ± 1.8 22.6 ± 2.5 17.5 ± 2.3 16.4 ± 0.6* 20.1 ± 1.7 47.6 ± 5.7*

АФ (%) 37.7± 3.3 39.0± 6.8 37.6±5.6 33.9± 2.6 59.8 ±2.8 46.5±10.3

Примечание: *- достоверные различия показателя по I до и после лечения у детей с ПН ( р<0.05).

Показатели фагоцитарной активности НФ при проведении только обычного лечения представлено в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительные показатели фагоцитарной активности НФ у детей с ПН

в зависимости от экологических условий проживания __при проведении обычной терапии (М±т)_

Показатели 1А группа (п =9) «экол. комфорт» 2А группа (п = 7) «рад. прессинг» ЗА группа (п = 12) «хим. прессинг»

до после ДО после ДО после

ФИ(%) 88.8 ±2.2 93.8 ±1.4 91.0 ±1.0 95.8 ±0.7* 92.8 ±1.8 94.1 ±1.2

ФЧ 3.3 ±0.3 3.3 ±0.3 3.5 ±0.2 3.4 ±0.2 3.7 ±0.3 3.6±0.3

ИП(%) 22.7 ±2.3 27.6 ±2.2 17.2 ±1.5 16.8 ±.8* 20.9 ±1.8 32.1±2.0*

АФ (%) 36.9 ± 2.5 49.8 ± 2.0* 38.5 ± 2.8 39.8 ± 4.8 53.0 ± 3.4 61.2 ± 3.2

Примечание: * - достоверные различия по критерию Стьюдента показателей до и после лечения у детей с ПН ( р< 0.01).

Иммунный статус в динамике курса АУФОК. Для изучения иммунного статуса у детей с ПН при проведении АУФОК было обследовано 7 девочек в возрасте 8-14 лет с ПН, находившихся на стационарном лечении в клинике БелНИИ ЭПП. У всех детей наблюдалось затяжное течение заболевания, проводимые ранее обычные методы терапии были малоэффективны. Следует отметить, что начальное состояние детей и показатели иммунного статуса, независимо от зколопгчесгагх условий их проживания, были сходными, поэтому они были объединены в одну группу. Для сравнения были подобрана репрезентативная по диагнозу, возрасту и экологическим условиям проживания группа из 10 девочек, страдающих пиелонефритом, которым проводилось только антибактериальное и противовоспалительное лечение.

При изучении динамики показателей иммунограммы у детей с ПН при проведении АУФОК не было выявлено статистически достоверных изменений.

При исследовании экспрессии СО-антигенов отмечалось значимое снижение Т-супрессоров (СЭ8+, с 32.7 ± 2.7% до 29.4 ± 2.5%) после проведения АУФОК (р<0.05).

В результате сравнительного анализа фагоцитарной активности НФ выявлено, что у всех детей после АУФОК наблюдаются достоверные однонаправленные изменения показателей. При умеренном увеличении Фй и ФЧ, повысились переваривающая способность клеток (20.0 ± 0.8% до и 25.8 ± 1.3 % после) и процентное содержание функционально активных фагоцитов (с 45.5 ± 2.7% до 60.9 ± 2.1%, р<0.05).

Наряду с этим, в группе детей, где проводилось обычное лечение, хотя и наблюдалась аналогичная динамика, но без достоверных различий показателей.

Структурно-функциональное состояние иммунокомпетентных клеток у детей с пиелонефритами при включении в комплексное лечение методов эфферентной терапии

Структурно-функциональное состояние ИКК в динамике курса ЭС. Сделать выводы о влиянии ЭС и обычного комплексного лечения на структурно-функциональное состояние иммунокомпетентных клеток на основании анализа динамики большого числа морфоденситометричесюн ( МДМ) параметров представлялось весьма сложным, вследствие неоднозначности изменений и различной степени их выраженности.

Поэтому для более полного рассмотрения этих данных была применена свертка параметров в интегральные показатели ( т.н. глобальные критерии). Такой статистический подход был сделан с целью свертывания большого объема МДМ показателей (90 пар сравнения по 30 параметрам в

6 группах сравнения), неоднозначно, но достоверно изменяющихся в ту или иную сторону. Трудность оценки заключалась еще и в том, что исходное состояние хроматина ИКК в различных группах сравнения было не одинаковым.

Весь полученный массив МДМ показателей был разделен на логические составляющие. А именно, в 1 интегральный показатель 01 были свернуты параметры, касающиеся гранулярной компоненты ql; в 02- перигра-нулярной компоненты q2; 03- самой рыхлой компоненты q4; в 04 - классические морфометрические показатели, касающиеся всего ядра; в 05 -показатели, характеризующие соотношение плотного и рыхлого хроматина в ядре. Интегральные показатели могут иметь значения от 0 до 1. Причем О- это его абсолютное отклонение от нормы; 1 - абсолютная принадлежность к норме; <1, но >0 - т.н. «серая зона».

При анализе динамики интегральных показателей МДМ параметров НФ у детей с ПН, проживающих в зоне "экологического комфорта" в группе 1А (обычное лечение) было выявлено ухудшение интегральных показателей после лечения ( показатели приближались к 0 ). В то же время в группе 1Б все интегральные показатели после курса ЭС приближались к норме ( к 1), при этом й2, ОЗ достоверно.

При сравнении интегральных показателей в группах детей с ПН, подвергающихся "радиационному прессингу", в группе 2А при проведении обычного лечения наблюдалась тенденция к повышению критериев 01 и 02, что свидетельствовало о нормализации показателей гетерохроматина. Однако, было выявлено достоверное ухудшение 05, характеризующего соотношение компонент в ядре. Следует напомнить, что у данной категории детей была выявлена активация хроматина, проявляющаяся в снижении доли гетеро- и повышении доли эухроматина.

В то же время при анализе изменений интегральных показателей в группе 2Б после курса ЭС выявлено достоверное повышение 01, 02, 03, что указывает на нормализацию состояния хроматина компонент.

При сравнительном анализе динамики интегральных показателей НФ в группах детей с ПН из г. Могилева, подвергающихся "химическому прессингу", не было выявлено достоверных различий этих параметров, исключая снижение 01 после курса ЭС в груше ЗБ.

В то же время обнаружена разнонаправленность изменений 01,02 и ОЗ. Так, в группе ЗА прослеживалась тенденция нормализации интегральных показателей 01 и 02, характеризующих гетерохроматиновые компоненты, наряду с ухудшением ОЗ - показателя активного хроматина, а в группе ЗБ наблюдается снижение 01 и 02, но явная тенденция к улучшению 03. Следует отметить, что у детей г. Могилева было выявлено повышение активности q4, которую характеризует 03.

Изменения структурно-функционального состояния ЛФ в группах сравнения детей с ПН, как при проведении ЭС, так и при обычном лечении, были, в целом, сходны и имели те же тенденции.

Структурно~функционалъное состояние ИКК в динамике курса АУФОК. Анализ МДМ параметров ИКК в динамике курса АУФОК у детей с ПН не выявил каких-либо достоверных различий. Для того, чтобы в данном случае полнее оценить влияние АУФОК на структурно-функциональное состояние хроматина также была применена свертка МДМ параметров в интегральные показатели.

У всех интегральных показателей после АУФОК наблюдалась тенденция к нормализации, приближение к 1, причем по критерию Вилкоксо-на 01 улучшатся достоверно .

В то же время при анализе изменений интегральных показателей при проведении обычного комплексного лечения выявлена тенденция к их ухудшению. А при сравнении по методу Вилкоксона обнаружено достоверное снижение 05.

Следует отметить, что изменения МДМ параметров НФ были сходными и динамика ГК была такой же.

Таким образом, в результате проведенного анализа после курса АУФОК выявлена нормализация структурно-функционального состояния как компонент хроматина, так и ядра в целом. В то же время динамика показателей при обычном комплексном лечении свидетельствует либо об отсутствии каких-либо изменений, либо об их ухудшении.

ВЫВОДЫ

На основании анализа результатов, полученных при проведении данного исследования, были сделаны следующие выводы:

1. У детей с острыми и хроническими (в стадии обострения) пиелонефритами выявлены однонаправленные изменения иммунного статуса. Из них наиболее значимыми являются изменения Т-клеточного звена ( высокое содержание Т-супрессоров и низкое естественных киллеров) и фагоцитарной системы нейтрофилов ( снижение фагоцитарной активности с сохранением поглотительной способности, но снижением бактерицидной активности и состоятельности фагоцитов в переваривании) [3,5 ].

2. Неблагоприятные экологические условия проживания приводят к выраженным изменениям иммунного статуса у детей с пиелонефритами, преимущественно в фагоцитарной системе, и имеют свои особенности в зависимости от характера экологического воздействия. В условиях «радиационного прессинга» фагоцитарная система у детей находится в стадии декомпенсации, о чем свидетельствует высокое число фагоцитов

наряду с низкой бактерицидной активностью. У детей, подвергающихся «химическому прессингу», обнаружена гиперактивация фагоцитарной системы (низкая переваривающая способность наряду с высокой долей активных фагоцитов) [6, 9,10].

3. Воздействие неблагоприятных экологических факторов приводит к существенным изменениям структурно-функционального состояния имму-нокомпетентных клеток, которые также имеют свои особенности в зависимости от их характера. У детей, подвергающихся «радиационному прессингу», выявлен феномен активации хроматина иммунокомпетент-ных клеток. У детей же, подвергающихся воздействию «химического прессинга», наблюдается только лишь признак данного феномена (компактизация неактивной части хроматина). Выявленные изменения обнаружены как у здоровых, так и у больных детей, но при наличии патологии они носят выраженный характер [1,2, 4, 7, 8, 9,12].

4. Включение в комплексное лечение детей с пиелонефритами курса энте-росорбции с применением препарата «Белосорб-П» способствовало нормализации фагоцитарной активности нейтрофилов и структурно-функционального состояния нейтрофилов и лимфоцитов. Причем более выраженный позитивный эффект наблюдался у пациентов, подвергающихся воздействию неблагоприятных экологических факторов, и также имел свои особенности в зависимости от их характера. У детей, проживающих в условиях хронического воздействия малых доз ионизирующей радиации, с декомпенсированной системой фагоцитоза выявлено улучшение структурно-функционального состояния иммунокомпетентных клеток, что указывает на вероятность перехода этой системы в субком-пенсированное состояние; при химическом прессинге также отмечается модулирующее действие энтеросорбции - снижение признаков гиперактивации фагоцитарной системы нейтрофилов [4, 7,11,12].

5. При включении аутотрансфузии ультрафиолетом облученной крови в комплексное лечение детей с пиелонефритами отмечено позитивное влияние на систему фагоцитоза - умеренное увеличение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа при выраженном повышении переваривающей способности клеток и содержания функционально активных фагоцитов. Разнонаправленность изменений состояния эпигенома при обычном лечении и при аутотрансфузии ультрафиолетом облученной крови и высокая вариабельность морфоденситометрических параметров нейтрофилов и лимфоцитов свидетельствуют об определенном влиянии этого метода на структурно-функциональное состояние иммунокомпетентных клеток, характер которого остается неясным [ 4, 8].

6. Компьютерная морфоденситометрия позволяет выявить тонкие структурно-функциональные изменения эпигенома иммунокомпетентных клеток под влиянием экологически неблагоприятных факторов, а также при мониторинге проводимого лечения [ 1, 2, 7, 8, 12]. Морфоденситомет-рические параметры могут служить чувствительными диагностическими маркерами различных патологических состояний. Использование компьютерной морфоденситометрии в сочетании с традиционными иммунологическими методиками является адекватным диагностическим подходом для клинической иммунологии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Use of Computer TV Morphodensitometry to study epigenetic changes in blood lymphocytes from children affected by low-dose irradiation / Ostapenko V., Prishchepova E., Ostapenko S., Zhukotsky A. // Radiation Injury and the Chernobyl Catastrophe. Stem Cells. - 1997. - 15 (Suppl 2). - P. 103-109.

2. Функциональное состояние лимфоцитов периферической крови у детей при воздействии малых доз ионизирующего излучения / Е.В. Пришепо-ва, С.М. Остапенко, А.В. Жукоцкий, В.А. Остапенко // Медицинские последствия Чернобыльской катастрофы: Сб. ст. науч.-практ. конференции. - Минск, 1997. - С. 254-257.

3. Прищепова Е.В., Сергеева О.М., Новиков Д.В. Морфофункциональные изменения иммунной системы при заболеваниях почек у детей // Молодые ученые в решении проблемы ликвидации медицинских последствий Чернобыльской катастрофы сегодня и в будущем: Сб. мат. межд. науч. конгресса, 19-21 сент. 1994 г., Гомель - Гомель, 1994. - С. 43.

4. Применение методов эфферентной терапии в комплексном лечении детей с заболеваниями почек, проживающими на экологически неблагоприятных территориях / С.М. Остапенко, О.М. Сергеева, Е.В. Прищепова, Д.В. Новиков // Чернобыльская катастрофа: прогноз, профилактика, лечение и медикопсихологическая реабилитация пострадавших: Сб. мат-лов IV межд. конф.. - Минск: Изд-во Бел. комитета «Дзещ Чарнобыля»,

1995.-С. 416-417.

5. Состояние иммунной системы у детей с воспалительными заболеваниями почек при экопатологических воздействиях / С.М. Остапенко, Е.В. Прищепова, А.М. Горчаков, В.А. Остапенко // Охрана материнства и детства в условиях воздействия последствий катастрофы на Чернобыльской АЭС: Материалы научн. исследований 1991-1995. - Ч. 2. - Минск,

1996.-С. 60-67.

6. Прищепова Е.В., Прокопович А.С., Остапенко С.М. Воздействие экологических условий на гематологические параметры у детей // Мат. V на-

учного съезда специалистов клинической лабораторной диагностики Республики Беларусь, Минск, 16-17 окг. 1997 г. - Минск, 1997. - С.126.

7. Структурно-функциональное состояние нейтрофилов при применении энтеросорбшш в комплексе терапии у детей с пиелонефритами, проживающими в различных экологических условиях / Е.В. Пришепова, С.М. Остапенко, Н.К. Витко и др. // Эфферентные и физико-химические методы терапии: Сб. материалов III Белорусской конференции, Могилев, 2325 сентября 1998 г. - Минск, 1998. - С. 158-167.

В. Влияние курса ультрафиолетового облучения крови на эпигеном лимфоцитов детей с пиелонефритами / Е.В. Прищепова, С.М. Остапенко, В.А. Остапенко, Л.П. Титов, Т.И. Чегерова // Эфферентные и физико-химические методы терапии: Сб. материалов Ш Белорусской конференции, Могилев, 23-25 сентября 1998 г. - Минск, 1998. - С. 152-157.

9. Горчаков A.M., Горчакова Ф.Т., Прищепова Е.В. Люминесцентная цитодиагностика: новые возможности в иммунологическом мониторинге И Актуальные проблемы экологической и клинической иммунологии: Мат. II Пленума Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов, Могилев, 20-21 окт. 1993 г. - Минск, 1995. - Ч. 2. - С. 9-12.

10. Prishchepova Е., Ostapenko S., Gorchakov A. Ecopathology and children's immune system in inflammatory renal diseases И Central and Eastern European Conference on Astma, Allergy and Clinical Immunology: Poster Session Abstracts, Lodz, Poland, 20-22.06.1996. -Lodz, 1996. - P. 21.

11.Фагоцитарная активность нейтрофилов при применении энтеросорбен-та "Белосорб" у детей с заболеваниями почек / Е.В. Пршцепова, С.М. Остапенко, Н.К. Витко, В.А Остапенко П Клиническая и лабораторная диагностика. - 1997. - №5. - С. 71.

12. Применение компьютерной морфометрии в объективизации оценки иммуномодулирующего эффекта препарата Белосорб на донозологиче-ском уровне у пострадавших в результате катастрофы на ЧАЭС детей Беларуси / В.А. Остапенко, Е.В. Прищепова, С.М. Остапенко и др. // IV Российский национальный конгресс " Человек и лекарство": Тез. докладов, 8-12 апреля 1997 г. - Москва: РЦ"Фармединфо", 1997. - С. 281.

17

РЕЗЮМЕ

ПРШЦЕПОВА Елена Викторовна

ИММУННЫЙ СТАТУС И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК У ДЕТЕЙ ПРИ ПИЕЛОНЕФРИТАХ

Ключевые слова: аутогрансфузня ультрафиолетом облученной крови, дети, иммунный статус, интерфазный хроматин, ионизирующая радиация, лимфоциты, морфоденситометрия, неблагоприятные экологические факторы, нейтрофилы, пиелонефрит, химические антропогенные факторы, фагоцитоз, энтеросорбция, ядро клетки,

Объекты исследования - дети, страдающие пиелонефритами. Предмет исследования - иммунный статус н структурно-функциональное состояние лимфоцитов и нейтрофилов у этих детей.

Цель: анализ иммунного статуса и структурно-функционального состояния клеток у детей с пиелонефритами, проживающих в различных экологических условиях, при включении курсов энтеросорбции и аутотранс-фузии ультрафиолетом облученной крови в комплексное лечение.

Методы исследования. Иммунный статус изучался стандартными методиками. Экспрессия СО-антигенов оценивалась проточной цитофлуо-рометрией. Фагоцитарная активность определялась тестом фагоцитоза с культурой дрожжей при окрашивании флуорохромом. Структурно-функциональное состояние клеток изучалось методом компьютерной мор-фоденситометрии на системе анализа изображения "ДиаМорф".

Впервые изучено состояние иммунной системы у детей с пиелонефритами, проживающих в различных экологических условиях. Показаны различия в состоянии эпигенома иммунокомпетентных клеток и фагоцитарной активности нейтрофилов детей, живущих в условиях хронического воздействия «радиационного» и «химического прессинга», и «экологического комфорта». С помощью метода морфоденситометрии впервые было изучено структурно-функциональное состояние ядер нейтрофилов. Этот метод был применен для мониторинга лечения детей с почечной патологией. При анализе данных впервые использовано сочетание методов статистики и элементов теории нечетких множеств.

Рекомендации по использованию. Применение эфферентных методов в комплексном лечении существенно улучшает клиническое состояние, лабораторные показатели детей с пиелонефритами. Метод компьютерной морфоденситометрии может использоваться для мониторинга состояния здоровья при воздействии неблагоприятных экологических условий, а также для контроля эффективности лечения.

Область применения: клиническая иммунология, экологическая иммунология, педиатрия, нефрология

18

РЭЗЮМЕ

ПРЫШЧЭПАВА Алена Висгарауна

1МУННЫ СТАТУС I СТРУКТУРНА-ФУНКЦЫЯНАЛЬНАЯ ХАРАКТАРЫСТЫКА ЕМУНАКАМПЕТЭНТНЫХ КЛЕТАК У ДЗЯЦЕЙ ПРЫ П1ЕЛАНЕФРЫТАХ

Ключавыя словы: аутатрансфуз1я улыраф1ялетам апрамененай крыв1, дзет, ¡ашзуючая радыяцыя, ¡мунны статус, штэрфазны храмашн, Л1мфацыты, морфадэксггаметрыя, нейтрафшы,, шеланефрыт, х1М1чныя ан-трапагенныя факгары, фагацытоз, энтэрасорбцыя, ядро клети.

Аб'екты даследвання - дзещ, пакугуючыя на теланефрыт.

Прадмет даследвання - ¡мунны статус I структур на-фут 1 кдыянатьны стан Л1мфацытау 1 нейтрафшау у гэтых дзядей.

Мэта работы: анатз шуннага статусу ( структурна-функцыянатьнага стану клетак у дзяцей з шеланефрьгош, пры уключэнт курсау энтэра-сорбцьп 1 аутатрансфузй ультраф1ялетам апрамененай крыв: у комплекснае лячэнне.

Метады даследвання. 1ммунны статус вывучауся з дапамогай стандартных методык. Экспрэсст СО-антыгенау ацэньвалася праточнай цы-тафлюараметрыяй. Фагацытарная актыунасць вызначалася тэстам фагацы-тоза з кулыурай дражджэй пры афарбаванш флюарахромам. Структурна-функцыянальны стан клетак вывучауся з дапамогай астэмы аналЬу вобра-затворау «ДиаМорф».

Упершыню быу вывучаны стан шуннай астэмы у дзяцей з шеланефрытам1, пражываючых у розных экалапчных умовах. Выяулены адрозненш у стане эшгенома ¡мунакампетэнтных клетак 1 фагацытарнай актыунасщ нейтрафшау дзяцей, пражываючых ва умовах храшчнага уздзеяння «радыяцыйнага» 1 <оамхчнага прэссшга», i «экалапчнага камфор-ту». 3 дапамогай гэтага метада упершыню вывучаны структурна-функцыянальны стан ядрау нейтрафшау. Упершыню ён быу применены дзеля манпорынга лячэння дзяцей з ныркавай паталопяй. У час анализу дадзеных упершыню выкарастана спалучэнне метадау матэматычнай ста-тыстыга 1 элементау тэорьй невыразных мноствау.

Рэкаиендацьн па выкарыстанню. Выкарыстанне эферэнтных метадау у комплексным лячэяш ютотна паляпшае юшнчны стан 1 лабораторныя параметры у дзяцей з теланефрыталй. Метад кампутарнай морфадэн-спаметрьй можа выкарыстоувацца дзеля машторынгу стану здароуя пры уздзеянш неспрыяльных экал алчных умоу, а таксама дзеля кантролю эф-фектыунасщ лячэння.

Галша выкарыстання. кттчная ¿муналопя, экалапчная ¡муналопя, педыятрыя, нефралопя.

19

RESUME

PRISHCHEPOVA Elena Victorovna

THE IMMUNE STATUS AND STRUCTURAL-FUNCT.'ON'AL CHARACTERISTIC OF IMMUNOCOMPETENCE CELLS IN CHILDREN WITH PYELONEPHRITIS

Key words: autotransfusion of blood irradiated oy ultra". ;oiet. chemicai anthropogenic factors, children, enterosorption, immune status, interphase cliromatin, ionizing radiation, lymphocytes, morphodensitometry. neutrophils, nucleus, phagocytosis, pyelonephritis, unfavourable ecological factors.

The research object - children suffered pyelonephritis.

The research subject - immune status and structural-functional state of lymphocytes and neutrophils of this children.

The aim: analysis of immune status and cell structural-functional state in children with pyelonephritis living in different ecological conditions during courses of enterosorption and autotransfusion ofblcod irradiated by ultraviolet.

Methods. Immune status had researched by standard methods. CD-expression had estimated by the flow cytofluorometiy. Phagocytic activity - by the phagocytosis test with C. albicans with fluorochrommg. Stnictural-functional state of cells had researched by Computer TV Morphodensitometry on an image analysis system «DiaMorph».

For the first time the immune status in children with pyelonephritis living in different ecological conditions was investigated. It was shown being of differences at the epigenom of immunocompetence cell and phagocytic activity of neutrophils in children living in chronical exposure of «radiational» and «chemical pressing» and «ecological comfort». By Computer TV Morphodensitometry, for the first time the state of neutrophils nuclei had investigated. For the first time this method was used for monitoring during a treatment of children with renal pathology. For data analysis for the first time the combination statistical methods and elements of «fuzzy sets» theory had used.

Recomendation for use. The including of efferent methods in the complex treatment of children with pyelonephritis have improved the clinical state and laboratory parameters. Computer TV Morphodensitometry is an adequate method for the health monitoring in unfavourable ecological exposures and for a control of the treatment efficiency.

Fields for use. clinical immunology, ecological immunology, paediatiy, nephrology