Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунные механизмы инвазивности эндометриальных клеток при эндометриозе

На правах рукописи

Посисеев Денис Владимирович

ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИНВАЗИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ ЭНДОМЕТРИОЗЕ

14.00.36.- Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Н.Ю. Сотникова Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.В. Ганковская доктор биологических наук, профессор Л.А.Захарова

Ведущая организация:

ГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН

Защита диссертации состоится « » > 2006 г. к --^--

в / часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке университета по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан « _2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Т.Е.Кузнецова

Актуальность темы исследовании

Определение роли иммунных механизмов в развитии эктопической ткани является одной из самых актуальных задач клинической иммунологии. Расшифровка этих механизмов поможет уточнить многие аспекты трансплантологии и новообразований. К патологиям, связанным с ростом эктопической ткани, относится эндометриоз, характеризующийся ростом эндометриалыюй ткани за пределами обычной локализации эндометрия, преимущественно в перитоне-альной полости (Vinatier D., е.а., 2001, Starzinski-Powitz А., е.а., 2001).

Несмотря на многолетние исследования, патогенез эндометриоза остается до конца не установленным (Адамян JI.B., Кулаков В.И. 1998, Стрижаков А.Н., Давыдов А.И., 1996). Важную роль в развитии эндометриоидных гетеротопий в последние годы отводят иммунным механизмам, действующим на уровне эндометрия (Vinatier D., е.а., 2000, Dmowski W.P., е.а., 2001). К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о том, что существуют особые механизмы, позволяющие эндометриальным клеткам женщин с эндометриозом избегать иммунный надзор. К этим механизмам относят изменение антигенных свойств железистых и стромальных клеток эндометрия (Vinatier D., е.а., 2000); изменение экспрессии разных классов белков теплового шока (Ota H., е.а., 1997, Nip М.М.С., е.а., 1994). Большую роль в развитии эндометриоза отводят повышенной способности эндометриальных клеток больных эндометриозом к пролиферации и инвазии (Brenner R.M., 2002, Ciavattini А., е.а., 2004, Wingfïeld M., е.а., 1995). Для уточнения механизмов повышенной инвазивности эндометриальных клеток особый интерес имеет определение характера экспрессии интег-риновых молекул и матриксных метаплопротеиназ в эндометрии при эндомет-риозе. Имеющиеся на сегодняшний день данные носят зачастую противоречивый характер (Regidor P.A., 1998; Vinatier D, 2000; Chung H.W., Lee J.Y., 2002; Collette T., 2004; Zhou H.E., 2005) и не позволяют сделать однозначный вывод о роли этих факторов в патогенетических механизмах формирования эндометриоидных очагов.

Важную роль в изучении развития эктопического эндометрия играют экспериментальные модели эндометриоза (Story L., Kennedy S. 2005). К настоящему времени разработан ряд моделей с использованием разных животных (мыши, кролики, крысы), которые позволили уточнить многие патофизиологические процессы, происходящие при формировании эндометриоидного очага (Nisolle M., е.а., 2000, Uchiide I., е.а., 2002), что делает это модели перспективными в плане изучения иммунных основ развития эндометриоза. Использование экспериментальных моделей раскрывает широкие возможности изучения динамики изменения факторов, определяющих высокую инвазивность клеток эндометрия, на разных стадиях развития эктопического эндометрия.

Известно, что в эктопическом эндометрии значительно меняется продукция целого ряда цитокинов и факторов роста (Vinatier D., е.а., 2000, Arici А., 1998, Donnez J., 1998, Tsudo T., 2000). Однако динамика изменения продукции цитокинов на разных стадиях формирования эктопического эндометрия остается пока еще не изученной, нет данных о роли отдельных клеточных популяций в изменении цитокинового фона эктопического эндометрия и значении цитокинов в регуляции инвазивных свойств эндометриальных клеток.

Таким образом, выявление иммунных механизмов, определяющих повышенную инвазивность эндометриальных клеток у человека и в экспериментальной модели эндометриоза, существенно расширит наши представления о развитии эктопий в организме. Выявление факторов, регулирующих инвазив-ные свойства эндометрия, может послужить основой для разработки новых подходов к лечению эндометриоза у человека.

Цель работы:

С использованием экспериментальной модели установить новые иммунные механизмы, определяющие усиление инвазивности эндометриальных клеток при формировании эктопического эндометрия, и выявить роль цитокинов в ее регуляции.

Задачи:

1. Определить характер экспрессии интегриновых молекул и внутриклеточного синтеза 1Ь-б эндометриальными лимфоцитами и макрофагами на разных стадиях развития очага экспериментального эндометриоза.

2. Оценить экспрессию интегриновых молекул, внутриклеточный синтез 1Ь-6 и экспрессию генов ММР-2, Т1МР-2 и Тврр в эутопическом и эктопическом эндометрии при эндометриозе у человека.

3. Установить роль цитокинов, продуцируемых инфильтрирующими очаг эндометриоза МНК, в регуляции инвазии эндометриальных клеток.

4. Обосновать новые подходы к коррекции повышенной инвазивности эндометриальных клеток при эндометриозе с использованием цитокинсо-держащих препаратов.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что в рост эктопического эндометрия у женщин с эндометриозом ассоциирован с усилением экспрессии С049с на поверхности стромалъных клеток эндометриоидного очага и с угнетением экспрессии СВ49е молекул лимфоцитами и макрофагами, инфильтрирующими ткань эутопиче-ского и эктопического эндометрия.

Впервые показано, что на ранних стадиях развития очага экспериментального эндометриоза усиливается продукция 1Ь-6 эндометриальными макрофагами, тогда как в сформировавшемся очаге эндометриоза усиление продук-" ции 11,-6 обусловлено активностью эндометриальных лимфоцитов.

Выявлено, что в основе повышенной инвазивности эндометрия при эндометриозе лежит нарушение баланса активности факторов, регулирующих процессы протеолиза в ткани, что проявляется доминированием действия Т1МР-2 на уровне эутопического эндометрия при эндометриозе и усилением активности ММР-2 в эндометриоидном очаге.

Показано, что развитие эктопического эндометрия сопровождается усилением продукции и рецепции ТСИР в ткани эндометриоидного очага.

Установлено, что цитокины, продуцируемые мононуклеарными клетками, инфильтрирующими очаг эндометриоза, приводят к нарушению функционального состояния эндометриальных лимфоцитов здоровых женщин и усиливают экспрессию мРНК ТСРр в эндометрии, тогда как естественный комплекс цитокинов, содержащихся в препарате «Суперлимф», нормализует экспрессию С049е молекул и синтез 1Ь-6 эндометриальными лимфоцитами и макрофагами у пациенток с эндометриозом.

Практическая значимость работы.

Установлена роль цитокинов в регуляции инвазивных свойств эндометрия у женщин с эндометриозом, что может послужить основой для разработки новых методов лечения эндометриоза с использованием цитокинсодержащих препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту .

Развитие и рост эктопического эндометрия связаны с нарушением экспрессии интегриновых молекул на поверхности стромальных и мононуклеар-ных клеток эндометрия и дисбалансом е продукции тканевых металлопротеи-наз и их ингибиторов, что приводит к усилению инвазивных свойств эндометрия.

Изменение инвазивных свойств эндометриальных клеток ассоциировано с изменением продукции и рецепции цитокинов в эутопическом и эктопическом эндометрии; восстановление естественного цитокинового фона приводит к нормализации параметров, определяющих инвазивный потенциал эндометрия.

Реализация результатов работы.

Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), на научной конференции «Молодая наука - развитию Ивановской области» (Иваново, 2005), на IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005), на VII Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2005), на научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки — 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая наука — развитию Ивановской области» (Иваново, 2006), на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006).

Личное участие автора.

Самостоятельно проводилась работа с экспериментальными животными, выполнялись иммунологические исследования. Была проведена систематизация полученных результатов, их статистическая обработка, описание полученных результатов.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена па 116 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводи и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 11 отечественных и 153 иностранных источника. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 6 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.П.Городкова Федерального агентства

по здравоохранению и социальному развитию» (директор — засл. деятель науки РФ, д.м.н., профессор Посисеева Л.В).

Исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии — зав. лабораторией д.м.н., профессор Сотникова НЛО. и в гинекологической клинике (5 эндоскопическое отделение — зав. В.Н.Романов).

Всего было обследовано: 96 крыс линии Wistar, 25 женщин с наружным генитальным эндометриозом, 20 гинекологически здоровых на момент обследования женщин. Материалом для непосредственного исследования служили: биоптаты крысиного эндометрия из рога магки; биоптаты очагов экспериментального эндометриоза у крыс; биоптаты человеческого эндометрия из полости матки; биоптаты эктопического эндометрия из эндометриоидных очагов.

Для изучения очагов экспериментального эндометриоза использовали partee разработанную и широко применяемую крысиную модель эндометриоза (Vernon M.W., Wilson Е.А., 1985). В эксперименте использовались взрослые самки крыс линии Wistar (п=96, средний вес -220-250 г), которые содержались в виварии при соблюдении светового цикла 12 часов день - 12 часов ночь. Эндо-метриоз индуцировали у крыс хирургическим методом. Дистальная треть левого рога магки перевязывалась с использованием шелковых ниток, удалялась из перитонеальной полости и рассекалась на 3-4 небольших фрагмента. Образцы рога матки подшивались на брюшину эндометриалыюй поверхностью. Эндо-метриальные имплантаты удаляли с брюшины на 7, 14 и 21 день после проведения операции. В качестве контроля использовали нормальную эндометриаль-ную ткань, удаленную из рога матки до проведения аутотрансплантации (0 день).

Для проведения иммунологических исследований получали обогащенные популяции эндометриальных мононуклеарных клеток (МНК) человека и крыс стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (Upsala, Sweden). Для выделения популяции МНК из эндометриалыюй ткани использовали безферментативный механический метод

(Chernyshov V.P., 1993). Обогащенные популяции эндометриальных стромальных клеток человека получали с использованием стандартного ферментативного метода (Clover L.M., е.а., 2000). Выход клеток составлял 2,5±0,76х105 кл/г/ткани. Жизнеспособность клеток, определяемая по окрашиванию трипано-вым синим составляла 85-90%. Полученные клеточные фракции в дальнейшем использовали для фенотипирования методом проточной цитометрии.

Поверхностный фенотип иммунокомпетентных и стромальных клеток, а также внутриклеточную продукцию IL-6 эндометриальными лимфоцитами и макрофагами определяли с помощью моноклональных антител методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюорохромной метки использовали флюоресцеинизотиоцианат (FITC) или фикоэритрин (РЕ).

Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Для оценки внутриклеточного синтеза IL-6 проводили пермеабилизацию клеточной мембраны с помощью коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization kit (CALTAG Laboratories, Burlingame, CA, USA). Клетки метили анти-С045 и aiith-CD 14-антителами для наложения оптимального окна дискриминации для лимфоцитов и макрофагов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния. При анализе лимфонитарный гейт включал не менее 88-98% клеток с фенотипом CD45+CD14-, макрофагальный гейт включал не менее 88-96% клеток с фенотипом CD45+CD14+. Не менее 10000 клеток анализировалось в каждом образце. Анализ результатов проводили в программе "LYSYSII".

Для количественной оценки экспрессии мРНК в эндометриальной ткани человека использовали метод RT-PCR в режиме реального времени. Процедуру выделения тотальной РНК из ткани эндометрия проводили стандартным гуани-дин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом (Velden van V.H.J., е.а., 2003). РНК переводили в комплементарную кДНК,' используя коммерческий набор реагентов Онкоскрин RT (ООО «Генотехнология», Гематологический научный

центр РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия). Для оценки экспрессии в ткани эндометрия мРНК р2-микроглобулина, ММР-2, TIMP-2, TGFß методом количественной RT-PCR в режиме реального времени использовались наборы праймеров, зондов и реагентов производства ООО «Генотехно-логия», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, (Москва, Россия). ПЦР-амплификацию в режиме реального времени проводили на амплификаторе с оптической насадкой iCycler ¡Q (BIO RAD, USA).

Для количественного определения уровня экспрессии мРНК ММР-2, TIMP-2, TGFß использовали сравнительный Ct метод (Veiden van V.H.J., е.а., 2003), при котором уровень экспрессии специфических генов сначала нормализовали относительно экспрессии мРНК гена домашнего хозяйства (в данном случае относительно ß-2-микроглобулина), а затем уровень экспрессии специфических генов в образцах ткани эутопического и эктопического эндометрия женщин с наружным эндометриозом нормализовали относительно соответствующих показателей эндометрия здоровых женщин (контроль) и рассчитывали коэффициент RQ (related quantity) по стандартной формуле (Veiden van V.H.J. е.а., 2003). Таким образом, все результаты представлены как n-кратные различия между уровнем экспрессии мРНК специфического гена при эндометриозе и уровнем экспрессии мРНК гена в контрольной группе.

Для уточнения роли цитокинов в регуляции инвазивных свойств эндо-метриальной ткани, проводили эксперимент по изучению in vitro влияния комплекса цитокинов, продуцируемых МНК эндометриоидных очагов, а также естественного комплекса цитокинов, содержащихся в препарате «Суперлимф» (Центр иммунотерапии «Иммунохелп» при Российском Государственном Медицинском Университете, Москва, Россия), на уровень экспрессии эндометри-альными лейкоцитами CD49e и внутриклеточный синтез ими IL-6, а также на уровень экспрессии в ткани эндометрия мРНК ММР-2, TIMP-2, TGFß. При этом образцы эутопического эндометрия здоровых женщин или эутопического эндометрия женщин с наружным эндометриозом объемом 0,3-0,5 см2 инкуби-

ровали в 1 мл СН МНК очага эндомстриоза или в 1 мл раствора препарата Суперлимф в концентрации 1 мкг/мл в течение 24 часов при 37° С и 5% С02. Образцы эндометриальной ткани, инкубировавшиеся в тех же условиях только в среде RPM1 1640 с глютамином, использовали в качестве контроля. После окончания срока культивирования часть эндометриальной ткани лизировапи и замораживали для проведения в дальнейшем процедуры выделения РНК и определения уровня экспрессии мРНК ММР-2, TIMP-2, TGF. Из другой части тканевых образцов выделяли обогащенную популяцию МНК безфермента-тивнм методом, описанным выше, и определяли экспрессию на поверхности эндометриальпых лимфоцитов и макрофагов CD49e молекул и оценивали внутриклеточную экспрессию 1L-6 методом проточной цитометрии.

Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000. Достоверность различий показателей при эндометриозе по сравнению с контрольной группой определялась по t-критерию Стьюдента.

Результаты работы и их обсуждение.

Для определения закономерностей изменения экспрессии адгезионных молекул эндометриальными клетками различных типов с учетом этапов развития очага эндометриоза нами была проведена оценка экспрессии CD49e молекул на поверхности эндометриальных лимфоцитов и макрофагов, инфильтрирующих эутопический и эктопический эндометрий, у человека и на разных стадиях очага экспериментального эндометриоза у крыс.

Анализ данных показал, что в очаге экспериментального эндометриоза как на ранних (7 день), так и на поздних этапах его развития (14 и 21 день после операции) значительно повышалась экспрессия иптегриновых молекул эндометриальными лимфоцитами по сравнению с показателями, полученными при изучении интактного эндометрия(р<0,001, р<0,05, р<0,001, соответственно). У эндометриальных макрофагов, выделенных из ткани очага эндометриоза на 7 и

14 день после проведения операции, не было выявлено изменений поверхностной экспрессии интегриновых молекул (р>0,05 в обоих случаях). На 21 день после операции нами отмечалось значительное снижение количества клеток, экспрессируюших С049 молекулу, по сравнению с параметрами интактного эндометрия (р<0,05).

У женщин с эндометриозом содержание С1)49е-позитивных лимфоцитов как в эутопичсском, так и в эктопическом эндометрии было значительно снижено по сравнению с показателями эндометрия здоровых женщин (р<0,05, р<0,001, соответственно). Уровень эндометриальных С049е+ макрофагов не изменялся в эутопическом эндометрии, но был достоверно ниже контрольных значений в ткани эндомстриоидного очага (р>0,05, р<0,05, соответственно).

С049е молекулы относятся к классу р1- или УЬА- интегринов и являются рецепторами к фибронектину. Установлено, что эта группа интегриновых молекул вовлекается в межклеточную и клеточно-матриксную адгезию (Во\уеп 2000). По-видимому, при эндометриозе в эндометрии угнетается взаимодействие иммунокомпетентных клеток с другими клетками и белками внеклеточного матрикса. Этот феномен может влиять на развитие процессов внутриклеточной передачи сигналов и определять нарушение формирования при эндометриозе адекватного локального, как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа.

При изучении особенностей экспрессии С049е молекул на поверхности стромапьных клеток эутопического и эктопического эндометрия женщин с эндометриозом было установлено, что экспрессия рецепторов к фибронектину в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом не изменялась но сравнению с соответствующим показателем в эндометрии здоровых женщин, но она резко повышалась на поверхности стромальных клеток очага эндометриоза (Р<0,01).

Известно, что фибронектин способствует адгезии и распространению эпителиальных и мезенхимальных клеток, стимулирует пролиферацию и ми-

грацию эмбриональных и опухолевых клеток, контролирует дифференцировку и поддержание цитоскелета клетки (Пальцев М.А., Иванов A.A., 1995). При опухолевой прогрессии происходит модификация поверхности клетки таким образом, что обеспечивается ее прикрепление к компонентам внеклеточного матрикса. При этом в клетках инвазирующих и метастазирующих опухолей значительно возрастает количество интегриновых рецепторов для фибронекти-на, витронектина и ламинина (Пальцев М.А., Иванов A.A., 1995). Вероятно, высокий уровень экспрессии рецепторов к фибронектину на поверхности стро-мальных клеток эндометриоидного очага является одним из механизмов усиленной инвазивности эндометриальной ткани при эндометриозе, который обеспечивает развитие эктопического эндометрия по типу опухолевого роста.

Существует мнение, что инвазивные свойства гетсротопий и их способность к метастазированию зависят не только от адгезивных свойств ткани, но также и от продукции опухолевыми клетками протеолитических ферментов, разрушающих внеклеточный матрикс (Vinatier D., е.а., 2000). Особую роль при этом отводят тканевым протеазам, объединенным в семейство нейтральных ме-таллопротеиназ (ММР). В нашей работе мы исследовали уровень экспрессии мРНК ММР-2 и мРНК TIMP-2 в ткани эутопического и эктопического эндометрия женщин с наружным эндометриозом. Выбор для исследования именно ММР-2 и ее ингибитора был продиктован тем, что многие исследователи рассматривают экспрессию ММР-2 в качестве маркера инвазивности опухолевой ^ткани (Vinatier D., е.а., 2001), поэтому характер экспрессии ММР-2 может во многом определять способность эндометрия к росту в эктопических местах и к метастазированию.

Нами было установлено, что как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии пациенток с эндометриозом уровень экспрессии мРНК ММР-2 и Т1МР-2 был выше аналогичных показателей в эндометрии здоровых женщин. Однако в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом экспрессия мРНК Т1МР-2 в несколько раз превышала уровень экспрессии мРНК ММР-2,

что, по-видимому, приводило к доминированию активности TIMP-2 в эутопи-ческом эндометрии пациенток с эндометриозом (RQ для ММР-2 - 5,64+1,01, RQ для TIMP-2 - 19,44+4,76). В очаге эндометриоза, напротив, в максимальной степени проявлялось повышение экспрессии мРНК ММР-2 (RQ для ММР-2 -16,35±3,61), тогда как уровень экспрессии TIMP-2 изменялся в меньшей степени (RQ для TIMP-2 - 7,71±1,73), в результате чего активность ММР-2 превалировала над активностью ее специфического ингибитора Т1МР-2. Складывается впечатление, что на уровне эутопического эндометрия при эндометриозе высокий уровень продукции ММР-2 компенсируется еще более высокой продукцией ее тканевого ингибитора, что ведет к угнетению протеолитической активности фермента в эндометрии. В очаге эндометриоза продукция ММР-2 в несколько раз превышала продукцию ингибитора TIMP-2, что, по-видимому, обуславливает резкое усиление активности протеолиза ткани и рост эктопии.

Известно, что продукция в ткани ММР и их ингибиторов регулируется многими факторами, в том числе и цитокинами (Bruner-Tran K.L., е.а., 2002, Curry T.S., Osteen K.G., 2003). Важную роль в патогенезе эндометриоза отводят IL-6 и TGFß (Gazvani R., Templeton A., 2002, Oosterlilynck DJ-, е.а., 1994, Tsudo 'Г., е.а., 2000). В связи с этим, мы изучили взаимосвязь продукции IL-6 и TGFß, с изменение^ инвазивности эндометрия при эндометриозе.

Нами была проведена оценка уровня внутриклеточного синтеза IL-6 лимфоцитами и макрофагами крыс, выделенными из очага экспериментального эндометриоза. Анализ данных показал, что на ранних стадиях развития экспериментального очага эндометриоза (7 день) внутриклеточная продукция IL-6 лимфоцитами не изменялась, но повышалась на 14 день после проведения операции и оставалась высокой до 21-х суток после операции (р>0,05, р<0,001, р<0,001, соответственно). Продукция IL-6 эндометриальными макрофагами крыс была максимальной на 7 сутки, затем в динамике развития эндометриоид-ного очага постепенно снижалась и к концу периода наблюдения (21 день) ста-

новилась ниже аналогичного параметра в неоперированном эндометрии (р<0,01, р>0,05, р<0,01, соответственно).

У человека характер продукции IL-6 эндометриальными лимфоцитами и макрофагами в целом, соответствовал тем изменениям, которые мы выявили на экспериментальной модели эндометриоза у крыс. Так, в эутопичсском и в эктопическом эндометрии женщин с эндометриозом нами отмечалось достоверное увеличение содержания лимфоцитов, синтезирующих внутриклеточно IL-6 (р<0,001, в обоих случаях). Причем, на уровне очага эндометриоза это повышение было максимальным. Экспрессия IL-6 в макрофагах была, напротив, снижена как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии (р<0,01 в обоих случаях).

Обобщая данные экспериментальной модели эндометриоза и данные, полученные при исследованиях у человека, можно предположить, что на самых ранних этапах формирования очага эндометриоза основным источником IL-6 в эндометриоидной ткани являются тканевые макрофаги, которые, как известно, первыми реагируют на изменение гомеостаза в организме. Это предположение хорошо согласуется с имеющимися литературными данными о том, что макрофаги, инфильтрирующие ткань эндометриоидных очагов на ранних этапах развития, являются активированными, продуцируют в больших количествах такой митогенный фактор, как фактор роста гепатоцитов (HGF) и непосредственно участвуют в процессах, определяющих рост очага эндометриоза (Khan K.N., -2004).

На более поздних этапах развития эктопического эндометрия высокий уровень продукции IL-6 обусловлен, в основном, лимфоцитами. Как известно, IL-6 играет важную роль в обеспечении развития реакций гуморального иммунитета. Согласно имеющимся литературным данным в очаге эндометриоза на первый план выходят реакции В-звена иммунитета (Uchiide 1., е.а., 2002). В очагах наружного эндометриоза у женщин иммуногистохимическим методом также было показано присутствие дегранулирующих эозинофилов, которое ассо-

циировалось с наличием эотаксина, IL-5 и RANTES (Blumenthal R.D., е.а., 2000). Можно предположить, что увеличение содержания в очаге эндометриоза эозинофилов и плазматических клеток связано с усилением реакций гуморального звена иммунитета, в том числе и с высоким уровнем продукции IL-6 эндо-метриальными лимфоцитами.

Нами также оценивались особенности продукции и рецепции в ткани эу-топического и эктопического эндометрия при эндометриозе TGFp, еще одного фактора, которому отводят важную роль в механизмах развития эндометриоид-ных гетеротопий (Oosterlilynck D.J., е.а., 1994). Было установлено, что экспрессия мРНК TGFP в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом незначительно превышала уровень экспрессии этого фактора роста в эндометрии здоровых женщин, тогда как в эндометриоидном очаге экспрессия мРНК TGFp была резко повышена как по сравнению с показателями контрольного эндометрия, так и по сравнению с аналогичным параметром в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом (р<0,05).

На поверхности стромапьных эндометриальных клеток мы определяли уровень экспрессии CD 105, или эндоглина, являющегося рецептором TGFp. Нами было установлено, что в эутопическом эндометрии при эндометриозе уровень CD105+ стромальных клеток был снижен (р<0,05), тогда как в очаге эндометриоза экспрессия рецепторов к TGFp была, напротив, повышена по сравнению с параметрами эндометрия здоровых женщин (р<0,01).

Известно, что TGFP является одним из основных индукторов фиброгене-за и ангиогенеза, а также оказывает хемоаттрактантное действие в отношении моноцитов (Ковальчук J1.B. с соавт, 2001). Показано, что в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом было повышено содержание TGFp, что, по мнению авторов, может обуславливать угнетение активности перитонеальных ЕК (Oosterlilynck D.J., е.а., 1994). Наши данные свидетельствуют о том, что в очаге эндометриоза высокая продукция этого цитокипа ассоциировалась с повышением экспрессии рецептора TGFp на поверхности стромальных клеток.

По-видимому, высокий уровень экспрессии CD105 стромальными клетками эн-дометриоидных гетеротопий обуславливает реализацию биологического действия TGFP, направленную, с одной стороны, на регуляцию процессов фиброза, рубцевания и ремоделирования эндометриоидной ткани, а с другой стороны, ведущую к подавлению локальных реакций клеточной цитотоксичности на уровне эктопического эндометрия.

Для определения взаимосвязи инвазивных свойств эндометриальной ткани у женщин с наружным эндометриозом с нарушением цитокинового профиля в эндометрии нами была проведена серия экспериментов in vitro, в которых мы проводили сравнительную оценку действия комплекса цитокинов, продуцируемых МНК эктопического эндометрия, а также препарата «Суперлимф» на параметры, характеризующие инвазивные свойства эндометрия.

Нами было установлено, что комплекс цитокинов, продуцируемых МНК эктопического эндометрия, снижал экспрессию CD49e молекул и усиливал внутриклеточный синтез IL-б эндометриальными лимфоцитами здоровых женщин (р<0,01 в обоих случаях), а также повышал экспрессию мРНК TGFP в ткани эндометрия. Таким образом, цитокины, продуцируемые мононуклеарными клетками эндометриоидного очага, оказывали выраженное негативное влияние на параметры функциональной активности лимфоцитов эндометрия здоровых женщин.

Для определения возможности коррекции инвазивных свойств эндометрия при эндометриозе мы оценивали in vitro влияние препарата «Суперлимф» на показатели эндометрия здоровых женщин и женщин с эндометриозом. Известно, что препарат «Суперлимф» представляет собой сбалансированный комплекс природных цитокинов (Ковальчук Л.В., с саовт, 2005). Инкубация МНК эндометрия здоровых женщин с «Суперлимфом» не вызывала значительных изменений в экспрессии интегриновых молекул CD49e на поверхности эндо-метриальных лимфоцитов и макрофагов и не вгияла на продукцию в эндомет-

рии ММР-2 и Т1МР-2, но приводила к снижению уровня внутриклеточного синтеза лимфоцитами IЬ-6 (р<0,01).

Препарат «Суперлимф» усиливал изначально сниженную экспрессию СЕ)49е молекул на поверхности эндометриальных лимфоцитов и макрофагов (р<0,01, р<0,05, соответственно), повышал уровень 1Ь-6-позитивных макрофагов и снижал количество 1Ь-6+ лимфоцитов (р<0,05 в обоих случаях). Следует обратить особое внимание на то, что инкубация эндометрия женщин с эндомет-риозом с препаратом «Суперлимф» приводила к снижению уровня экспрессии мРНК ММР-2. Полученные результаты свидетельствуют, что препарат «Суперлимф» нормализует экспрессию интегриновых молекул на поверхности эндометриальных лимфоцитов и макрофагов и выработку ими цитокинов, а также способствует снижению активности эндометриальных ММР, регулируя таким образом инвазивные свойства эндометрия при эндометриозе. Выявленные свойства препарата «Суперлимф» позволяют предположить целесообразность проведения дальнейших исследований по возможности практического использования этого препарата в лечении эндометриоза.

Таким образом, развитие и рост эктопического эндометрия связаны с нарушением экспрессии интегриновых молекул на поверхности стромальных и мононуклеарных клеток эндометрия и дисбалансом в продукции тканевых ме-таллопротеиназ и их ингибиторов, что приводит к усилению инвазивных свойств эндометрия. Нарушение инвазивных свойств эндометриальных клеток связано с изменением продукции и рецепции цитокинов в эутопическом и эктопическом эндометрии, восстановление естественного цитокинового фона с помощью препарата «Суперлимф» приводит к нормализации параметров, определяющих инвазивный потенциал эндометрия.

Выводы

1.' Изменение инвазивных свойств эндометриальной ткани в процессе формирования эктопического эндометрия связано с нарушением экспрессии

интегриновых молекул на поверхности стромальных и мононуклеарных клеток эндометрия, изменением цитокинового профиля и дисбалансом в продукции тканевых протеолитических ферментов.

2. В процессе развития очага экспериментального эндометриоза усиливается экспрессия СЕ)49е молекул эндометриальными лимфоцитами крыс, при этом на поздних этапах патологического процесса снижается уровень С049е-позитивных макрофагов. У пациенток с эндометриозом отмечается снижение экспрессии С049е молекул лимфоцитами, инфильтрирующими ткань эутопического и эктопического эндометрия, и макрофагами очага эндометриоза при повышении уровня СЭ49с+ стромальных эндо-метриальных клеток в эндометриоидных гетеротопиях.

3. На ранних этапах развития очага экспериментального эндометриоза у крыс резко усиливается внутриклеточный синтез 1Ь-6 эндометриальными макрофагами, на поздних этапах формирования эндометриоидных гете-ротопий уровень 11_-6+ макрофагов снижается, но увеличивается содержание 11-,-6-позитивных лимфоцитов. Как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии женщин с эндометриозом значительно повышается внутриклеточный синтез 1Ь-6 лимфоцитами, но снижается содержание эндометриальных макрофагов, продуцирующих \ L-6-

4. В ткани эутопического эндометрия женщин с эндометриозом и в эндо-метриоидном очаге повышена экспрессия мРНК ММР-2 и Т1МР-2 по сравнению с показателями эндометрия здоровых женщин, при этом в эутопическом эндометрии при эндометриозе экспрессия мРНК Т1МР-2 превышает таковую для ММР-2, а в эктопическом эндометрии уровень экспрессии мРНК ММР-2 достоверно повышен по сравнению с уровнем экспрессии гена Т1МР-2.

5. В эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом снижается экспрессия СО 105 молекул на поверхности стромальных клеток, тогда как в

эндометриоидном очаге усиливается экспрессия рецепторов к TGFp стро-мальными клетками и повышается уровень мРНК TGFp в ткани.

6. Цитокины, продуцируемые МНК очага эндометриоза, при воздействии на эндометрий здоровых женщин угнетают экспрессию CD49e молекул на поверхности лимфоцитов, усиливают продукцию IL-6 эндометриальны-ми лимфоцитами и повышают уровень экспрессии в ткани мРНК TGFp. Естественный комплекс цитокинов, содержащихся в препарате «Суперлимф», при воздействии на эндометрий здоровых женщин уменьшает внутриклеточный синтез IL-6 лимфоцитами, при воздействии на эндометрий женщин с наружным эпдометриозом - нормализует экспрессию CD49e молекул и уровень внутриклеточной продукции IL-6 в популяциях лимфоцитов и макрофагов, а также снижает экспрессию мРНК ММР-2 в ткани эндометрия.

Практические рекомендации

1. Рекомендуется проведение клинических испытаний препарата «Суперлимф» для решения вопроса о возможности его применения для лечения наружного эндометриоза.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Посисеева Л.В., Шор А.Л., Ма-лышкина А.И., Посисеев Д.В. Роль иммунных механизмов в развитии эндометриоидных очагов различной локализации //Медицинская иммунология,- 2005. - Том 7. - № 2-3. - С.180-181.

2. Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Посисеева Л.В., Шор АЛ., Посисеев Д.В. Роль локальных иммунных нарушений в формировании очагов эндометриоза //Russian Journal of Immunology.- 2005.-V. 9, Suppl. 1-P.187-188.

3. Посисеев Д.В., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С. Роль локальных иммунных факторов в формировании очагов эндометриоза //Ж. Аллер-

гология и иммунология в педиатрии.-2005.- №5.- Т.6 (приложение 1).-С.144.

4. Посисеев Д.В., Назаров С.Б., Анциферова Ю.С. Экспериментальное обоснование участия интерлейкина-6 в формировании очагов наружного эндометриоза//Сб. материалов VII Российского форума «Мать и дитя». - Москва, 2005. - С.487.

5. Посисеев Д.В. Иммунные механизмы повышенной инвазивности эндо-мстриапьных клеток при эндометриозе // Тезисы докладов научной конференции «Молодая наука — развитию Ивановской области»,-Иваново, 19-25 апреля 2005 г. - Иваново: Иван. гос. ун-т, 2005. - С.211 -213.

6. Посисеев Д.В. Характеристика инвазивных свойств эндометрия при наружном эндометриозе //Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки — 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая наука — развитию Ивановской области» 19-27 апреля 2006 Г.-С.73-75.

7. Posiseeva L.V., Nasarov S.В., Sotnikova N.Yu., Antsiferova Yu.S., Na-sarova A.O., Sharabanova I.Yu., Posiseev D.V. Local cytokine production in the rat model of the endometriosis // Abstracts of 19,h Europcan Congress of Obstetrics and Gynecology.- Torino, Italy, 2006.-P.38.

8. Посисеев Д.В., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Шишков Д.Н., По-лумисков Д.М. Изменение уровня экспрессии мРНК ММР-2 и Т1МР-2 в эндометрии женщин с наружным эндометриозом. Сборник материалов VIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». -Москва, 3-6 октября 2006 г. - С.489.

9. Посисеев Д.В. Сотникова Н.Ю., Назаров С.Б., Анциферова Ю.С., Ша-рабанова ИЛО. Изменение продукции IL-6 мононуклеарными клетками, инфильтрирующими ткань очага экспериментального эндометриоза у крыс //Современные проблемы материнства и детства: Сборник науч-

ных трудов, посвященных 25-летию института /Под ред. Посисеевой Л.В., Назарова С.Б. — Иваново: ОАО «Издательство «Иваново». - 2005. — С.124-132.

Формат бумаги 60x84 1/16. Печ. л. 1.38 Усл.печ. л. 1.28 Отпечатано на ризографе Тираж 80 экз. Заказ № 335/1

Полиграфический отдел ФГОУ ВПО Ивановской ГСХА

Актуальность темы исследования

Определение роли иммунных механизмов в развитии эктопической гкани является одной из самых актуальных задач клинической иммуноло1ии. Расшифровка этих механизмов поможет уточнить многие аспекты трансплантологии и новообразований. К патологиям, связанным с ростом эктопической ткани, относится эндометриоз, характеризующийся ростом эндометриальной ткани за пределами обычной локализации эндометрия, преимущественно в перитоне-альной полости (135, 152).

Несмотря на многолетние исследования, патогенез эндомефиоза 0С1ае1Ся до конца не установленным (1,2, 10, 152). Важную роль в развитии эндомет-риоидных гетеротопий в последние годы отводят иммунным механизмам, действующим на уровне эндометрия (151). К настоящему времени получены данные, свидетельавующие о том, что существуки особые механизмы, позволяющие эндометриальным клеткам женщин с эндометриоюм избегать иммунный надзор. К этим механизмам относят изменение антигенных свойств железистых и стромальных клеток эндометрия (151), изменение экспрессии разных классов белков теплового шока (110, 97). Большую роль в развитии ждоме]-риоза отводят повышенной способности эндометриальных клеток больных эн-дометриозом к пролиферации и инвазии (28, 40, 159). Для уючнения механизмов повышенной инвазивности эндометриальных клеток особый интерес имеет определение характера экспрессии интегриновых молекул и матриксных ме-таллопротеиназ в эндометрии при эндометриозе. Имеющиеся на сегодняшний день данные носят зачастую противоречивый характер (115, 151, 39, 43, 164) и не позволяют сделать однозначный вывод о роли этих факторов в патогенетических механизмах формирования эндометриоидных очагов.

Важную роль в изучении развития эктопического эндомефия играют экспериментальные модели эндометриоза. К настоящему времени разработан ряд моделей с использованием разных животных (мыши, кролики, крысы), которые позволили уточнить многие патофизиологические процессы, происходящие при формировании эндометриоидного очага (98, 147), что делае1 это модели перспективными в плане изучения иммунных основ развития эндометриоза. Использование экспериментальных моделей раскрывае1 широкие вснможносш выявления динамики изменения факторов, определяющих высокую инвазив-ность клеток эндометрия, на разных стадиях развшия жтопического эндометрия.

Известно, что в эктопическом эндометрии значительно меняется продукция целого ряда цитокинов и факторов роста (151, 16, 50, 146). Однако динамика изменения продукции цитокинов на разных стадиях формирования эктопического эндометрия остается пока еще не изученной, нет данных о роли отдельных клеточных популяции в изменении цитокинового фона эктопического эндометрия и значении цитокинов в рефляции инвазивных свойсш эндомефиал ьных клеток.

Таким образом, выявление иммунных механизмов, определяющих повышенную инвазивность эндометриальных клеток у человека и в эксиеримен-тльной модели эндометриоза, существенно расшириг наши предетвления о развитии эктопий в организме. Выявление факторов, регулирующих инвазив-ные свойства эндометрия, може1 послужить основой для разработки новых подходов к лечению эндоме триоза у человека. Цель работы:

С использованием экспериментальной модели усыновить новые имм>н-ные механизмы, определяющие усиление инвазивности эндометриальных клеток при формировании эктопического эндометрия, и выявить роль цитокинов в ее регуляции.

Задачи:

1. Определить характер экспрессии интегриновых молекул и внутриклеточного синтеза IL-6 эндометриальными лимфоцитами и макрофлиши на разных стадиях развития очага экспериментального эндометриоза.

2. Оценить экспрессию интегриновых молекул, внутриклеточный синтез IL-6 и экспрессию генов ММР-2, TIMP-2 и TGF(3 в эу топическом и эктопическом эндометрии при эндометриозе у человека.

3. Установить роль цитокинов, продуцируемых инфильтрирующими очаг эндомефиоза МНК, в рефляции инваши эндомефил 1ьны\ к ююк

4. Обосновать новые подходы к коррекции повышенной инвазивносги эн-дометриальных клеток при эндометриозе с использованием цигокинсо-держащих препаратов.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что в рост эктопического эндометрия у женщин с эндометриозом ассоциирован с усилением экспрессии CD49e на поверхности стромальных клеток эндометриоидного очага и с угне1ением экспрессии CD49e молекул лимфоцитами и макрофагами, инфильтрирующими ткань эутопиче-скот и эктопического эндомефия.

Впервые показано, что на ранних стадиях развития очага экспериментальною эндометриоза усиливается продукция IL-6 эндометриальными макрофагами, тогда как в сформировавшемся очаге эндомефиоза усиление продукции IL-6 обусловлено активностью эндометриальных лимфоциюв.

Выявлено, что в основе повышенной инвазивности эндометрия при эндометриозе лежит нарушение баланса активности факторов, регулирующих процессы протеолиза в ткани, что проявляется доминированием дейавия TIMP-2 на уровне эутопического эндометрия при эндомефиозе и усилением активности ММР-2 в эндометриоидном очаге.

Показано, что развитие эктопического эндометрия сопровождается усилением продукции и рецепции TGFP в ткани эндометриоидного очага.

Установлено, что цитокины, продуцируемые мононуклеарными клетками, инфильтрирующими очаг эндометриоза, приводят к нарушению функционального состояния эндометриальных лимфоцитов здоровых женщин и усиливают экспрессию мРНК TGF(3 в эндометрии, тогда как естес1 венный комплекс цитокинов, содержащихся в препарате «Суперлимф», нормализует экспрессию CD49e молекул и синтез IL-6 эндометриальными лимфоцитами и макрофа1ами у пациенток с эндометриозом.

Практическая значимость работы.

Установлена роль цитокинов в регуляции инвашвных свойств muomci-рия у женщин с эндометриозом, что может послужить основой для разработки новых методов лечения эндомефиоза с использованием цигокинсодержащих препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

Развитие и рост эктопического эндометрия связаны с нарушением экспрессии интегриновых молекул на поверхности стромальных и мононуклеар-ных клеток эндометрия и дисбалансом в продукции тканевых металлопрогеи-наз и их ингибиторов, что приводиi к усилению инвашвных своис1в зндомш-рия.

Изменение инвазивных свойств эндометриальных клеток ассоциировано с изменением продукции и рецепции цитокинов в эутопическом и эктопическом эндометрии; восстановление естественного цитокинового фона приводит к нормализации параметров, определяющих инвазивный потенциал эндометрия.

Реализация результатов работы.

Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники ФГУ «Ивановский научно-исследова1ельский инсшгут ма1ерин-ства и детства имени В.Н.Городкова Федеральною аюшава по правоочране-нию и социальному развитию».

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), на научной конференции «Молодая наука - развшию Ивановской области» (Иваново, 2005), на IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005), на VII Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2005), на научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая наука - развитию Ивановской области» (Иваново, 2006), на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006). Личное участие автора.

Самостоятельно проводилась работа с экспериментальными животными, выполнялись иммунологические исследования. Была проведена сис1ематизация полученных результатов, их статистическая обработка, описание полученных результатов. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 116 сфаницах машинописною тексы, содержит введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводи и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 11 отечественных и 153 иностранных источника. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 6 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Изменение инвазивных свойств эндометриальной ткани в процессе формирования эктопического эндометрия связано с нарушением экспрессии интегриновых молекул на поверхности стромальных и мононуклеарных клеток эндометрия, изменением цитокинового профиля и дисбалансом в продукции тканевых протеолитических ферментов.

2. В процессе развития очага экспериментальною эндометриоза усиливается экспрессия CD49e молекул эндомефиальными -лимфоцитами крыс, при этом на поздних этапах патологического процесса снижается уровень С049е-позитивных макрофаюв. У пациенток с эндометриозом отмечается снижение экспрессии CD49e молекул лимфоцитами, инфильтрирующими ткань эутопического и эктопического эндометрия, и макрофагами очага эндометриоза при повышении уровня CD49e+ стромальных эндометриальных клеток в эндометриоидных гетероюпиях.

3. На ранних этапах развития очага экспериментального эндометриоза у крыс резко усиливается внутриклеточный синтез IL-6 эндометриальными макрофагами, на поздних этапах формирования эндомефиоидных гетеротопий уровень IL-6+ макрофагов снижается, но увеличивается содержание IL-6-позитивных лимфоцитов. Как в эутопическом, гак и в эктопическом эндометрии женщин с эндометриозом значительно повышается внутриклеточный синтез IL-6 лимфоцитами, но снижается содержание эндометриальных макрофагов, продуцирующих IL-6.

4. В ткани эутопического эндометрия женщин с эндометриозом и в эндо-метриоидном очаге повышена экспрессия мРНК ММР-2 и TIMP-2 по сравнению с показателями эндометрия здоровых женщин, при этом в эутопическом эндометрии при эндометриозе экспрессия мРНК TIMP-2 превышает таковую для ММР-2, а в эктопическом эндометрии уровень экспрессии мРНК ММР-2 достоверно повышен по сравнению с уровнем экспрессии гена TIMP-2.

5. В эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом снижается экспрессия CD 105 молекул на поверхности стромальных клеток, тогда как в эндометриоидном очаге усиливается экспрессия рецепторов к TGF(3 стромальными клетками и повышается уровень мРНК TGF(3 в ткани.

6. Цитокины, продуцируемые МНК очага эндометриоза, при воздействии на эндометрий здоровых женщин угнетают экспрессию CD49e молекул на поверхности лимфоцитов, усиливают продукцию IL-6 эндомефиальны-ми лимфоцитами и повышают уровень экспрессии в ткани мРНК TCiFp. Естественный комплекс цитокинов, содержащихся в препарате «Суперлимф», при воздействии на эндометрий здоровых женщин уменьшает внутриклеточный синтез IL-6 лимфоцитами, при воздействии на эндометрий женщин с наружным эндометриозом - нормализует экспрессию CD49e молекул и уровень внутриклеточной продукции IL-6 в популяциях лимфоцитов и макрофагов, а также снижает экспрессию мРНК ММР-2 в ткани эндометрия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется проведение клинических испытаний препарата «Суперлимф» для решения вопроса о возможности его применения для лечения наружного эндометриоза.