Автореферат и диссертация по медицине (14.03.04) на тему:Идентификация модификаций белков крови ксенобиотиками методом матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации – масс-спектрометрии в ретроспективном токсикологическом анализе

На правах рукописи

005533061

ДУБРОВСКИЙ Ярослав Александрович

Идентификация модификаций белков крови ксенобиотиками методом матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации — масс-спектрометрии в ретроспективном токсикологическом анализе

14.03.04 - токсикология 03.01.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 СЕН 2013

Санкт-Петербург 2013

005533061

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» Федерального медико-биологического агентства (ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России) и Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН)

Научные руководители:

кандидат биологических наук Бабаков Владимир Николаевич кандидат химических наук Подольская Екатерина Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Кашуро Вадим Анатольевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства», заведующий лабораторией биохимической токсикологии и фармакологии

доктор медицинских наук Антонов Виктор Георгиевич

Федеральное государственное казенное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, доцент кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики

Ведущая организация:

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита диссертации состоится « ( » ^013 г. в часов на заседа-

нии диссертационного совета Д 208.030.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства», 192019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, 1

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства»

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Луковникова Любовь Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Белки и секретируемые пептиды могут приобретать различные поспрансляци-онпые модификации аминокислот в полипептидной цепи. В настоящее время описано большое количество посттрансляциионных модификаций белков и пептидов. Такие модификации, как фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование, как правило, имеют важное функциональное значение и влияют на биологические функции белков; ряд других модификаций не имеют функционального значения. Кроме того, возможны посттрансляционные модификации секреторных белков в результате взаимодействия с чужеродными соединениями — ксенобиотиками. К которым относятся токсичные агенты и лекарственные средства.

Электро- и нуклеофильные химические соединения способны формировать ко-валентные связи с белками, образуя адцукты (модификации, не имеющие общепринятого названия). В последнее время раздел биоорганической химии, который изучает такие модификации белков, получил собственное название - «аддуктомика». Большая часть опубликованных работ в этой области посвящена проблематике уничтожения химического оружия. В то же время, показана способность и ряда других ксенобиотиков формировать адцукты с белками.

Анализ биомедицинских проб позволяет по наличию определенных метаболитов токсичных агентов в организме человека или животного судить о факте отравления. Мощный инструментарий современной аналитической химии, как правило, направлен на идентификацию самого ксенобиотика или его метаболитов, которые в течение нескольких дней выводятся из организма. Аддукты токсиканта с белками могут сохраняться на протяжении всего времени жизни белка в организме и их можно рассматривать как долгоживущие биомаркеры экспозиции.

Для практических целей представляется целесообразным рассмотрение процедуры анализа постгрансляционных модификаций основных белков крови -сывороточного альбумина и гемоглобина, и сравнение с библиотекой модификаций белков высокоопасными соединениями и/или лекарственными средствами. Выявление участка белка и идентификация аминокислотного остатка, участвующего в образовании аддукта, являются стабильным показателем, зависящим от третичной и четвертичной структуры белка, позволяющим установить фаю1 воздействия. Разработанная процедура анализа белков крови для обнаружения аддуктов позволит значительно расширить спектр определяемых соединений и увеличить срок выявления факта экспозиции в токсикологическом анализе.

На сегодняшний день наиболее удобными для решения подобных задач являются иммунохимические и масс-спектрометрические методы анализа. Иммунохими-ческие методы требуют наличия специфичных антител, которые не всегда возможно получить и охарактеризовать. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации является более универсальным методом биоорганического анализа. Следует отметить, что в последние годы большинство работ по исследованию аддуктов ксенобиотиков с бёлками выполнены с помощью приборов, имеющих в качестве источников ионов «элекгроспрей». Данный класс приборов отличается высокими требованиями к анализируемым образцам. До сих пор в очень немногих исследованиях в области анализа аддуктов используется метод матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ), хотя этот метод менее чувствителен к присутствию солей и других загрязняющих компонентов. МАЛДИ масс-спектрометрия является универ-

сальным методом анализа белковых гидролизатов и выявления посттрансляционных модификаций, обеспечивающим быстрое получение обширных данных о составе образца.

Таким образом, разработка нового подхода, совмещающего в себе преимущества биоорганического, химико-токсикологического и масс-спектрометрического анализа аддукгов ксенобиотиков с белками представляется актуальной.

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения

Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России в 2008 — 2012 гг.: темы НИР: «Исследование биохимических маркеров и разработка методов их определения у лиц, контактировавших с отравляющими веществами нервно-паралитического и кожно-нарывного действия», «Исследование биохимических маркеров и разработка методов их определения у лиц, контактировавших с отравляющими веществами нервно-паралитического действия. Экспериментальная разработка новых методических подходов для идентификации биохимических маркеров острого воздействия отравляющих веществ нервно-паралитического действия» и «Экспериментальная разработка протеомных подходов для идентификации долгоживущих маркеров острого и хронического отравления фосфорорганическими отравляющими веществами».

Цель исследования:

Разработка нового методического подхода для определения и идентификации ковалентных постгрансляционных модификаций белков крови алкилирующими (сернистый иприт), ацетилирующими (ацетилсалициловая кислота) и фосфонилирующи-ми (производные метилфосфоновой кислоты — зарин, зоман и вещество типа Vx (RVX, VR) ксенобиотиками методами хроматографии и МАЛДИ масс-спекгрометрии.

Задачи исследования:

- определить и идентифицировать сайты связывания ксенобиотиков с белками крови (гемоглобин и/или сывороточный альбумин) человека и крысы;

- продемонстрировать возможность выделения модифицированных пептидов из гидролизата белка методами хроматографии (обращенно-фазовая, металл-аффинная);

- разработать методики выделения модифицированных пептидов из гидролизатов белков методом металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих металлы Ti (IV), Fe (III), Си (II), in vitro-,

- показать эффективность разработанного подхода на образцах крови, полученных в ходе токсикологического эксперимента.

Научная новизна

Выявлены и идентифицированы сайты связывания фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) с сывороточным альбумином крысы (Y-411). Экспериментально показана возможность выделения модифицированных ФОВ пептидов из гидролизата сывороточного альбумина человека и крысы с использованием металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих оксид титана (IV) и хелатиро-ванные ионы железа (III).

Впервые определены сайты связывания сернистого иприта с глобином крысы и человека (С-93, С-126 в бета-субъединице глобина крысы и Е-27 в альфа-субъединице

глобина крысы, и С-93 в бета-субьединице глобина человека). Инструментально выявлены модифицированные триптические пептиды глобина и сывороточного альбумина крысы, содержащие С-93 и С-34 соответственно, в эксперименте in vivo. Впервые показана возможность выделения модифицированных сернистым ипритом пептидов из гидролизата глобина с использованием металл-аффинной хроматографии на сорбенте, содержащем ионы меди (II).

Определены сайты связывания ацетилсалициловой кислоты (АСК) с глобином человека и крысы (К-17, К -41, К-57, К-91 в альфа-субъединице глобина человека и К-18, К-96, К-133 в бета-субъединице глобина человека; К-17, К-57, К-91, К-140 в альфа-субъединице глобина крысы и К-17, К-77 в бета-субъединице глобина крысы). Методом МАЛДИ масс-спектрометрии впервые идентифицированы ацетилированные К-17 и К-57 в бета-цепи глобина, выделенного из крови человека в модельном эксперименте после инкубации с АСК в концентрации 100 мкг/мл.

Реализация работы

Полученные в ходе диссертационного исследования результаты используются в научно-исследовательской работе отдела токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России. Результаты работы реализованы в методических рекомендациях «Методы определения алкилированных аддуктов сернистого иприта с белками крови» № 41-11 от 26.10.2011.

Практическая значимость

Предложенный способ пробоподготовки с использованием металл-аффинной хроматографии для выделения модифицированных пептидов из гидролизата белков крови (сывороточный альбумин и гемоглобин) с последующим масс-спектрометрическим анализом может быть использован для разработки методов диагностики интоксикации ксенобиотиками алкилирующего, ацетилирующего и фосфо-нилирующего действий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Твердофазная экстракция и металл-аффинная хроматография являются перспективными методами, для выделения модифицированных пептидов, позволяющими увеличить чувствительность и надежность токсикологического анализа.

2. Сернистый иприт алкилирует сывороточный альбумин и гемоглобин человека и крысы in vitro и in vivo предпочтительно по свободным тиоловым группам остатков цистеинов. Алкилированные сернистым ипритом аддукты сывороточного альбумина и гемоглобина являются долгоживущими биомаркерами интоксикации.

3. Фосфорорганические отравляющие вещества способны образовывать кова-лентные аддукты с остатками тирозина сывороточного альбумина. Основным сайтом связывания для OB G-типа является Y-411, в то время как для OB V-типа более реак-ционноспособным является Y-150. Фосфонилированный сывороточный альбумин — перспективный долгоживущий биомаркер экспозиции.

4. Модификацию белков крови лекарственными средствами (на примере ацетилсалициловой кислоты) можно идентифицировать с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии.

Апробация работы

Результаты исследований, проведенных в рамках настоящей работы, нашли отражение в докладах на: IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях» (Санкт-Петербург, 27-28 мая 2010); 10th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents (Стокгольм, 8-11 июля 2010); Первой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 17-19 ноября 2010); V российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8-12 августа 2011); П международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 14—17 ноября 2011); Семинаре «Успехи современной масс-спектрометрии» (Санкт-Петербург, 12 мая 2011); 11th International Meeting on Cholinesterases (Казань, 4-9 июня 2012); Всероссийском симпозиуме «Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 17 февраля 2012); 11th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents (Стокгольм, 3-5 июня 2013); 38th Federation of European Biochemical Societies Congress «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013).

Личное участие автора

Автор принимал участие в планировании, и выполнении исследований, проводил регистрацию масс-спектров и принимал участие в анализе, обобщении и оформлении полученных данных.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 статей в научных рецензируемых журналах и 1 методические рекомендации.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы, изложена на 121 страницах и включает 47 рисунков, 9 таблиц и 113 наименований списка используемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения цели и решения поставленных задач проведены экспериментальные исследования in vitro и in vivo с использованием токсикологических и физико-химических методов.

Получение стандартных образцов

Инкубирование альбумина с RVX проводили в течение 24 часов при 37°С, концентрация белка 1 мг/мл, концентрация отравляющего вещества (ОВ) 100 мкг/мл.

Инкубирование альбумина с зарином и зоманом проводили в течение 24 часов при 37°С, концентрация альбумина составляла 1 мг/мл и 40 мг/мл. Концентрации ОВ составляла 10 нг/мл, 100 нг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл.

Инкубирование альбумина с сернистым ипритом (СИ) проводили в течение 24 часов при 37°С, концентрация белка 1 мг/мл, концентрация ОВ 100 мкг/мл.

Инкубирование глобина с СИ проводили в течение 24 часов при 37°С, концентрация белка 1 мг/мл, концентрация OB 10 мкг/мл, 50 мкг/мл и 100 мкг/мл.

Инкубирование глобина с АСК проводили в течение 24 часов при 37°С, концентрация белка 1 мг/мл, концентрация ксенобиотика 100 мкг/мл.

Обязательной стадией пробоподготовки после инкубирования была очистка от избытка ксенобиотика путем преципитации белков ацетонитрилом на холоду с последующим перерастворением образцов в 50 мМ водном растворе бикарбоната аммония.

Инкубирование плазмы крови с фосфонилирующими агентами проводили в течение 24 часов при 37°С. Концентрации OB составляла 10 нг/мл, 100 нг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл.

Итубирование крови с ацетилсалициловой кислотой проводили в течение 3 часов при 37°С, концентрация АСК составила 100 мкг/мл.

Токсикологический эксперимент проводили совместно с Н.Г. Войтенко и Н.В Гончаровым. Крыс экспонировали сернистым ипритом" п/к на уровне 0,1 ЛД50 (2 мг/кг). Отбор образцов крови проводили до 7 суток после отравления. Экспонирование крыс зоманом проводили в дозе 2x0,4 ЛД50 (80 мкг/кг). Отбор образцов крови проводили до 14 суток после отравления. Анализ и пробоподготовку полученных образцов крови автор проводил лично.

Работа выполнена с соблюдением правил гуманного отношения к животным в соответствии с требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ВОЗ, 1985).

Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа

Получение суммарного белка плазмы или сыворотки крови. Из пробы отбирали в микропробирку аликвоту 100 мкл, разбавляли в три раза 50 мМ раствором NH4HCO3 и добавляли тройной объем холодного ацетонитрила, содержащего 5% уксусной кислоты (УК). После этого раствор центрифугировали 10 минут при 10000 g, супернатант удаляли, а осадок промывали 3 раза холодным 5% раствором УК в аце-тошприле. Для проведения дальнейших исследований осажденные белки перерастворяли в 50 мМ растворе бикарбоната аммония.

Выделение сывороточного альбумина из плазмы крови проводили с помощью аффинных сорбентов Aurum, Affi-Gel Blue Gel (Bio-Rad) и Cibacron Blue 3GA Agarose, Type 3000-CL (Sigma-Aldrich), с использованием спиновых колонок. В колонку вносили 500 мкл раствора, содержащего сорбент, и промывали 2 раза раствором буфера для связывания по 1 мл (фосфатный буфер, pH 7,0), затем центрифугировали до высыхания сорбента. В микропробирке смешивали 60 мкл сыворотки и 180 мкл буфера для связывания. 200 мкл разбавленной сыворотки наносили на сорбент, инкубировали в течение 15 минут на качающейся платформе и центрифугировали 15 сек при 10000 g. Для полного удаления не связавшихся компонентов образца, сорбент трижды промывали 100 мкл буфера для связывания и центрифугировали 15 сек при 10000 g. Элюцию проводили путем внесения в колонку 100 мкл 6 М мочевины с последующей инкубацией 10 мин на качающейся платформе и центрифугированием (15 сек при 10000 g).

Выделение гемоглобина из эритроцитов проводили из цельной крови с антикоагулянтом (20 мМ Na2EDTA). Кровь крысы получали при декапитации лабораторных животных. Кровь от здоровых доноров получали венепункцией в вакуумную систему BD Vacutainer для получения K3EDTA плазмы. Образцы центрифугировали в течение 15 мин при 1200 g, плазму удаляли, а полученный осадок форменных элемен-

тов три раза промывали физиологическим раствором. К промытой клеточной массе добавляли равный объем дистиллированной воды для получения гемолизата. К алик-воте гемолизата при перемешивании добавляли шестикратный объем 50 мМ HCl в изопропиловом спирте, центрифугировали в течение 15 мин при 3000 g. Супернатант отделяли и приливали к нему четырехкратный объем этилацетата. Центрифугировали в течение 15 мин при 3000 g, затем осадок, содержащий гидрохлорид глобина, промывали чистым этилацетатом. Остатки растворителя удаляли с помощью лиофильной сушки.

Ферментативный гидролиз сывороточного альбумина проводили с предварительными стадиями восстановления дисульфидных связей в присутствии дитиотреитола (10 мМ раствор ДТТ в 100 мМ NH4HCO3 до конечного соотношения белок:ДТТ 1:15, инкубация при 56°С в течение 45 мин) и с защитой — SH группы йо-дацетамидом (20 мМ раствор ICH2CONH2 в 100 мМ NH4HCO3 до конечного соотношения белокгйодацетамид 1:30, инкубация в темноте при комнатной температуре в течение 40 мин). При поиске аддукгов сывороточного альбумина с сернистым ипритом эти стадии не использовали. При исследовании образования аддукгов сывороточного альбумина с ипритом и RVX, ферментативный гидролиз проводили в присутствии трипсина для масс-спектрометрических исследований (proteomics grade). К раствору белка на холоду добавляли раствор трипсина (0,1 мг/мл) в 100 мМ NH4HCO3 в две стадии через 3 часа инкубации при 37°С до конечного молярного соотношения белок:трипсин 50:1. Суммарное время инкубации 6 часов. При анализе продуктов взаимодействия с зоманом и зарином для гидролиза белка использовали пепсин, эксперимент проводили в условиях восстановления дисульфидных связей и защитой —SH групп по методике описанной выше, после чего раствором HCl доводили pH до 2. Раствор пепсина (1 мг/мл в 10 мМ HCl) добавляли к раствору белка по той же схеме до конечного молярного соотношения белок:пепсин 20:1.

Ферментативный гидролиз глобина проводили в присутствии трипсина без восстановления дисульфидных связей и защиты -SH группы по той же методике, что и в случае сывороточного альбумина.

Твердофазная экстракция пептидов в ступенчатом градиенте ацетон ит-рила из пептического гидролизата сывороточного альбумина. Разделение проводили на картридже для твердофазной экстракции с Supelco Empore C-18-SD. Образцы пеп-тических гидролизатов сывороточного альбумина человека и триптических гидроли-затов сывороточного альбумина крысы, содержащие пептиды, модифицированные остатком зомана, разбавляли в 5 раз раствором 0,1% водным раствором трифторукск-ной кислоты (ТФУ) и наносили на картридж. Элюирование проводили в режиме ступенчатого градиента (5-60%) ацетонитрила с шагом 5%.

Металл-аффинную хроматографию на сорбенте ZipTipMC с хелатирован-ными ионами меди (II) использовали для выделения из триптического гидролизата глобина пептидов, модифицированных остатком сернистого иприта. Хелатирукмцую фазу обрабатывали 200 мМ раствором сульфата меди, промывали 0,1% трифторук-сусной кислоты (ТФУ), после чего наносили образец. Элюирование проводили в режиме ступенчатого градиента pH: 0,1% ТФУ, 400 мМ раствор гидроксида аммония в воде, 0,5% раствор пиперидина в воде.

Металл-аффинную хроматографию на сорбенте, содержащем ионы железа (III) PHOS-Select Iron Affinity Gel применяли для обогащения образца пептидами, фосфонилированными остатком RVX. Сорбент помещали в спиновую колонку, промывали 0,1% ТФУ, затем наносили образец и проводили элюцию в ступенчатом гра-

диенте: 0,1% ТФУ (стадия удаления неспецифично сорбированных компонентов), 100 мМ аммонийбикарбонатный буфер, 400 мМ водный раствор аммиака, 0,5% раствор пиперидина в воде.

Металл-аффинную хроматографию на сорбенте, содержащем ионы титана (IV) Supel-Tips Ti применяли для обогащения образца фосфонилированными пептидами (модифицированных остатком RVX, зарина и зомана). Микроколонку, содержащую сорбент, промывали 400 мМ водным раствором аммиака, наносили образец и промывали раствором аммиака. Элюирование проводили 60% раствором ацето-нитрила в 0,1% ТФУ.

Масс-спектрометрический анализ

Нанесение образцов на масс-спектрометрическую мишень проводили в двух режимах: без предварительного обессоливания и с использованием микроколонок ZipTipC18 или Supel-Tips С18 для обессоливания образцов. В первом случае на поверхности мишени смешивали 0,5 мкл 5-10% раствора матрицы (СНСА или DHB в зависимости от прибора) и 0,5 мкл образца. Во втором случае на микроколонку, последовательно промытую ацетонитрилом и 0,1% ТФУ в воде, наносили образец и элюировали на мишень раствором матрицы в 60% ацетонитриле с 0,1% ТФУ. Образцы, нанесенные на мишень, высушивали на воздухе до образования кристаллов.

Масс-спектрометрический анализ гидролизатов сывороточного альбумина человека, модифицированного остатком RVX, а также сывороточного альбумина и глобина, модифицированных остатком СИ, проводили с помощью времяпро-летного масс-спектрометра Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия), оснащенного УФ-лазером (337 нм), в режиме детектирования положительных ионов с использованием рефлектрона. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 700 до 4000 Да. В качестве внутреннего стандарта использовали пики автолиза трипсина (МН+ 842,508; 1045,563; 2211,093 Да), которые при обработке удалялись из масс-листов. Масс-спектры, полученные с использованием Ultraflex, обрабатывали с использованием программы Flex Analysis 2.4 (Bruker Daltonics, Германия).

Масс-спектрометрический анализ гидролизатов сывороточного альбумина, модифицированного остатками ФОБ, глобина человека и крысы, содержащих остатки иприта и АСК, а также гидролизат сывороточного альбумина крысы, полученного в токсикологическом эксперименте (in vivo, зоман), проводили с помощью времяпролетного масс-спектрометра Axima Performance с источником MAJI-ДИ, оснащенного УФ-лазером (337 нм), в режиме детектирования положительных ионов. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 800 до 5000 Да. Масс-спектры регистрировали при помощи программы Launchpad 2.8.4 MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония). Калибровку проводили по масс-спектру смеси пептидов: ангио-тензин 2 (А/Н+ 1046,542 Да), ангиотензин 1 (МГ 2296,685 Да), N-ацетил ренин (МН+ 1800,943 Да), адренокортикотропный гормон (1-17) (МН+ 2093,086 Да). Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF Axima Performance, проводили в программе Launchpad 2.8.4 MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония).

Масс-спектрометрический анализ образцов, содержащих гидролизат сывороточного альбумина и глобина крысы, полученных в токсикологическом эксперименте (in vivo, сернистый иприт), проводили с помощью ион-циклотронного масс-спектрометра FT-MS Varían 902-MS со сверхпроводящим магнитом 9,4 Тесла, используя источник ионизации МАЛДИ. Десорбцию и ионизацию пробы осуществляли

с помощью третьей гармоники (355 нм) Nd:YAG лазера. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 350 до 4500. Масс-спектры регистрировали при помощи программы Omega (Vanan, США). В качестве внутреннего стандарта использовали пики автолиза трипсина (Mí1" 842,508; 1045,563; 2211,093 Да), которые при обработке удаляли из масс-листов. Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра Varían, проводили в программе FTDocViewer (Varían, США).

Анализ данных

Расчет точной моноизотопной массы и форму изотопного распределения

для пептидов с нестандартными модификациями рассчитывали при помощи программы MassPro (ИАП РАН, Россия).

Идентификацию белков и пептидов проводили в базе данных SwissProt с помощью стационарного программного комплекса MASCOT (Matrix Science, Великобритания) и интернет-версии программы MS-Tag (University of California, США, prospector.ucsf.edu), при этом использовали следующие параметры поиска: точность определения массы родительского иона — 200 ррт, точность определения массы фрагментов - 1000 ррт, возможные модификации — обработка йодацетамидом, в случае поиска аддуктов зомана — изменение массы на 162,08 Да, зарина — на 120,19 Да RVX — 134,05 Да, СИ — 104,03 Да; а также соответствующая пробе таксономика (человек или крыса). В случае АСК устанавливали модификацию «ацетилирование лизина». Также, при обработке спектров вручную вели поиск сигналов, имеющих разницу масс, соответствующую фрагментации остатка агента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление и идентификация фосфонилированных аддуктов сывороточного альбумина человека и крысы

Фосфорорганические соединения (ФОС) способны образовывать ковалентные аддукты с сывороточным альбумином человека. Ранее были определены аддукты остатка RVX с сывороточным альбумином человека по Y-150 (Radilov et. al., 2009). В результате взаимодействия RVX с тирозином происходит фосфонилирование последнего и увеличение массы белка (пептида) на 134,05 Да. Позднее было показано, что основным сайтом связывания для OB G-типа является Y-411, в то время как для OB V-типа модифицирование данного тирозина происходит только при высоких концентрациях, более реакционноспособным является Y-150 (John et. al., 2010).

Для обнаружения фосфонилированных пептидов из сыворотки крови человека, проинкубированной с RVX, был выделен сывороточный альбумин с помощью сорбента на основе триазиновых красителей Cibacron Blue и проведен ферментативный гидролиз в присутствии трипсина. В масс-спектрах гидролизата были обнаружены два сигнала с массами 1876,94 и 2033,01 Да. С использованием тандемной масс-спектрометрии были получены фрагментные спектры, в которых были обнаружены дочерние ионы, характерные для пептидов с аминокислотными последовательностями HPYFYrvxAPELLFFAK (рис. 1) и RHPYFYrvxAPELLFFAK, соответственно. Выявленные пептиды входят в состав сывороточного альбумина человека, и присоединение RVX происходит по Y-150.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1X0 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

Mass/Charge

Рисунок 1. Фрагментный масс-спектр пептида HPYFYrvxAPELLFFAK

Пептид с А/Н+ 1876,94 Да, который образуется в результате полного гидролиза альбумина в присутствии трипсина, дает малоинтенсивный сигнал в масс-спектре. Более интенсивным является сигнал пептида с Л/Н+ 2033,01 Да, который соответствует пептиду с одним недоразрывом в полипептидной цепи. Пептид YqdTK фосфони-лированный по Y-411 с помощью метода МАЛДИ масс-спектрометрии обнаружить не удалось.

Как было продемонстрировано, металл-аффинная хроматография на сорбенте PHOS-Select Iron Affinity Gel, содержащем ионы Fe (III), может быть успешно применена для выделения и обогащения адцуктов альбумина с ФОС на примере параоксона (Гладилович и др., 2010). Нашей следующей задачей стала апробация этой методики для выделения фрагментов сывороточного альбумина, модифицированных RVX.

В результате в масс-спектрах после проведения металл-аффинной хроматографии в элюате 0,5 % водного раствора пиперидина удалось обнаружить идентифицированные ранее пептиды с МН+ 1876,94 и 2033,01 Да.

Для выделения фосфопептидов из гидролизата альбумина, модифицированного RVX, также использовали сорбент, содержащий Ti (IV) на колонках Supel-Tips Ti. В масс-спектрах после элюирования 0,5 % пиперидином также удалось обнаружить модифицированные пептиды (рис. 2).

Таким образом, в нашей работе была показана возможность использования сорбентов, содержащих ионы Fe (III) и Ti (IV), для обогащения пептидов сывороточного альбумина, модифицированных RVX. Оба сорбента дают сопоставимые результаты, в то же время, Supel-Tips Ti больше подходит для пробоподготовки, предшествующей МАЛДИ масс-спектрометрическому анализу. Во-первых, сорбент достаточно устойчив к растворителям, и, в отличие от геля, не претерпевает изменений при

элюировании раствором пиперидина. Во-вторых, микроколонки просты в использовании, нет необходимости самостоятельно готовить колонку. Сорбцию, промывку и элюирование можно проводить пипетированием растворов в микропробирке. В-третьих, техническое решение микроколонок позволяет работать с объемами образцов не превышающими 1-2 мкл. И, наконец, элюирование образца можно проводить непосредственно на масс-спектрометрическую мишень.

д

El

100 50; 0

189

9.0

2033.0

1876.7 1956.0

И 1

1623.8 18- 1.1

-да

1467.7

_1.....

1535.5

k-aJi_

2586.4

,..u ,in,.LL

27ij8.6 2975. i

jJjUL^J_S_jU.

I89J.6 ( , |гу)3.1 2260.12528.11 ^ f7^65 . 29^6.8

165$ 8

_L_i___Ц-41—t

21020 2260.0

4[c

3[c

1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 30001'!

in/l

Рисунок 2. Масс-спектры фракций триптического гидролизата сывороточного альбумина человека после проведения металл-аффинной хроматографии на сорбенте, содержащем Fe(IlI). А - проскок, Б - 0,1% ТФА в воде, В - 100 мМ NH4HCO3, Г - 400 мМ NH4OH, Д - 0,5% пиперидином. Во вкладке - увеличенный фрагмент масс-спектра Д (диапазон m/z 1850- 2050 Да)

Этот подход был апробирован на аддуктах сывороточного альбумина человека с OB G-типа, а именно зоманом и зарином. В результате взаимодействия зомана с сывороточным альбумином человека происходит фосфонилирование белка по Y-411, в результате происходит увеличение массы белка на 162,08 Да и 120,19 Да, соответственно. В связи с тем, что триптический фрагмент сывороточного альбумина, содержащий Y-411, обладает слишком малой массой для успешного определения методом МАЛДИ масс-спектрометрии, для проведения ферментативного гидролиза был использован пепсин.

В масс-спектрах пептического гидролизата сывороточного альбумина, инкубированного с зоманом, были обнаружены три сигнала отсутствующие в контроле. Далее с использованием тандемной масс-спектрометрии были получены фрагментные

спектры, в которых удалось обнаружить дочерние ионы характерные для пептидов с аминокислотными последовательностями: ШС 1992,11 Да LVRYgdTKKVPQVSTPTL, М1+ 1680,79 Да LVRYgdTKKVPQVSTPT, М1+ 1567,84 Да VRYGDTKKVPQVSTPT. Так же было доказано, что эти пептиды входят в состав сывороточного альбумина и присоединение остатка зомана происходит по Y-411. Следует отметить, что при проведении МС-МС анализа с использованием фрагментации СШ на времяпролетном масс-спектрометре Axima Performance наиболее интенсивные сигналы образуются в результате полного отщепления остатка зомана (162 Да) и деалкилирования остатка зомана (84 Да). Разница 78 Да соответствует остатку метилфосфоновой кислоты (рис. 3). Для идентификации адцуктов использовали переходы 1992—>1908—»1830; 1681—>1597—»1519; 1568—1484—1406.

.1651.54..

..................12:Л»..........

- 72 Да .....,

1916.33 |

-7а Да-, 1597.77

162 Да

лшт

162 Да

' 73 Да — 1485

1700 m'z

Рисунок 3. Фрагментные масс-спектры пептических пептидов сывороточного альбумина человека, модифицированных зоманом: 1 - VRYodTKKVPQVSTPT; 2 - LVRYqdTKKVPQVST; 3 - LVRYgdTKKVPQVSTPTL. Спектры получены на МАЛДИ масс-спектрометре Shimadzu Axima Performance в режиме CID фрагментации. На спектрах указаны среднеизотопные (усредненные) массы

Метод металл-аффинной хроматографии на микроколонках Supel-Tips Ti апробировали на пептическом гидролизате сывороточного альбумина человека, модифицированного остатком зомана. Для элюирования фосфонилированных пептидов с сорбента использовали 0,1% ТФУ в 60% растворе ацетонитрила. При понижении концентрации ОВ в инкубационной смеси, наиболее интенсивные сигналы после проведения металл-аффинной хроматографии дают примесные пептиды, способные к неспецифической сорбции. Для снижения количества мешающих пептидов сорбцию проводили из 400 мМ водного раствора аммиака. Присутствие фермента и больших протеолитических фрагментов белка негативно сказывается на проведении хромато-графического разделения, поэтому перед проведением микроколоночной экстракции преципитировали высокомолекулярные компоненты охлажденным ацетонитрилом.

Предложенная методика с использованием металл-аффинной хроматографии и МЛЛДИ масс-спекгрометрической детекции была опробована на сывороточном альбумине крысы инкубированном с OB in vitro.

При проведении ферментативного гидролиза сывороточного альбумина крысы в присутствии трипсина образуется пептид с одним недоразрывом (одним пропущенным разрывом) в полипептидной цепи, содержащий Y-411 с подходящей массой для детектирования на МАЛДИ масс-спектрометрах. Поэтому в качестве фермента использовали не только пепсин, но и трипсин. В результате нам удалось детектировать несколько сигналов. Каждый сигнал был проанализирован с использованием тандем-ной масс-спектрометрии, и каждому сигналу был соотнесен фосфонилированный пептид. Сигналу с Ш\+ 2122,08 Да соответствует пептид с аминокислотной последовательностью YcdTQKAPQVSTPTLVEAAR (триптичсский гидролизат), а МГ 1539,79 Да - пептид с аминокислотной последовательностью VRYgdTQKAPQVST (пептический гидролизат). Используемый в работе пепсин обладал дополнительной неспецифической активностью по гидролизу пептидной связи треонин-лейцин и лей-цин-валин. Оба идентифицированных пептида удалось обнаружить в элюате 60% ацетонитрила с 0,1% ТФУ после проведения металл-аффинной хроматографии на микроколоноках Supel-Tips Ti.

Эксперимент по определению аддуктов сывороточного альбумина с зарином проводился по аналогичной схеме. В результате обработки масс-спектров образцов пептического гидролизата альбумина человека, инкубированного с зарином, были выявлены два сигнала, которые отсутствовали в контроле. Для восстановления аминокислотных последовательностей был проведен тандемный масс-спектрометрический анализ, и было установлено, что сигналу с 1525,83 Да соответствует пептид VRYqbTKKVPQVST, а что сигналу с ЛЯГ1" 1638,79 Да соответствует пептид LVRYqdTKKVPQVST. Так же было доказано, что эти пептиды входят в состав сывороточного альбумина и присоединение остатка зомана происходит по Y-411.

В пептическом гидролизате сывороточного альбумина крысы, инкубированного с зарином, был идентифицирован только один фосфонилированный пептид с А/Н+ 1497,82 Да и аминокислотной последовательностью VRY0BTQKAPQVST.

При проведении МС-МС анализа с использованием фрагментации СШ на вре-мяпролетном масс-спектрометре Axima Performance наиболее интенсивные сигналы образуются в результате полного отщепления остатка зарина (120 Да) и деалкилиро-вания остатка зарина (42 Да). Для идентификации пептидов сывороточного альбумина, фосфонилированных зарином, в дальнейшем использовали переходы 1639—»1596—»1518; 1526-*1483-*1405 Да.

Все фосфонилированные зарином пептиды удалось обнаружить в элюате 60% ацетонитрила с 0,1% ТФУ после проведения металл-аффинной хроматографии на микроколонках Supel-Tips Ti.

Таким образом, была показана возможность использования сорбентов, содержащих ионы Fe (III) и Ti (IV), для обогащения пептидов сывороточного альбумина, модифицированных ФОВ. Аминокислотные последовательности и молекулярные массы обнаруженных и идентифицированных пептидов представлены в таблице 1.

Этот подход был использован для выделения аддуктов альбумина с зоманом из образцов сыворотки крови крыс, полученных в токсикологическом эксперименте. Крыс экспонировали зоманом в дозе 2х0,4ЛД50. Отбор образцов цельной крови про-

водили вплоть до 14 суток после отравления. Выделение белков и ферментативный гидролиз проводили по ранее описанной методике.

Таблица 1. Выявленные пептиды сывороточного альбумина, модифицированные ФОС

ФОС Аминокислотная последовательность пептида Масса пептида (Да) Фермент (для гидролиза) Сайт фосфо-нилирования

ЛЯГ теор МН* эксп

Человек

ЯУХ и 1ру1'у,^лргл.1.м'ак 2033,05 2033,01 трипсин У-150

ЯУХ нр\ту,,ухАРЕШТЛК 1876,94 1876,94 трипсин У-150

зоман ьуяупптккуроувтрть 1992,17 1992,11 пепсин У-411

зоман ьукупптккуроубт 1680,98 1680,79 пепсин У-411

зоман таутпскуроуэт 1567,90 1567,84 пепсин У-411

зарин 1638,93 1638,79 пепсин У-411

зарин унугапскуроубт 1525,85 1525,83 пепсин У-411

Крыса

зоман уг,пт0кар0у8тртьуеаая 2122,13 2122,08 трипсин У-411

зоман уяупптокароувт 1539,83 1539,79 пепсин У-411

зарин уяуовтокароувт 1497,78 1497,82 пепсин У-411

Для максимального снижения количества мешающих компонентов, гидролизат фракционировали на патроне для твердофазной экстракции С-18 со ступенчатым элюированием в градиенте ацетонитрила (от 5% до 60% с шагом 5%). Фосфонилиро-ванный пептид удалось детектировать во фракции, полученной при элюировании 20% ацетонитрилом с патрона С-18 с последующей металл-аффинной хроматографией на микроколонке 8ире1-Т|рз Ть Сигнал модифицированного зоманом пептида детектировали в образцах плазмы крови крыс до 14 суток после отравления;

В результате проделанной работы была показана эффективность использования комбинации металл-аффинной хроматографии с МАЛДИ масс-спектрометрическим детектированием для выявления фосфонилированных аддуктов с сывороточным альбумином в ретроспективном токсикологическом анализе.

Выявление и идентификация алкилированных аддуктов белков крови

человека и крысы

Белки крови способны образовывать аддукты не только с фосфорорганически-ми соединениями, но и с алкилирующими ксенобиотиками. Сернистый иприт (СИ, НО) способен образовывать аддукгы с сывороточным альбумином человека по С-34, в результате происходит увеличение массы белка на 104,03 Да. Чувствительный метод определения цистеинового аддукта остатка СИ с альбумином был разработан на основе ферментативного гидролиза белка проназой с последующим ВЭЖХ-МС-МС анализом образующегося трипептида С1ЮРР (N0011 й. а1., 1999).

Аддукты сывороточного альбумина с ксенобиотиками можно обнаружить в течете 3—4 недель после их образования. Вторым легкодоступным белком крови после сывороточного альбумина является гемоглобин, который можно выделить из эритроцитов. Аддукт сохраняется на всем протяжении жизни эритроцитов. Ы-концсвой ва-лин, алкилированный сернистым ипритом, возможно обнаружить методом ГХ-МС через 94 дня после отравления (ВепвсЫор е1:. а1., 2000). С использованием МАЛДИ масс-спектрометрии опубликована только одна работа по определению аддуктов СИ,

в которой был продемонстрирован сдвиг масс молекул цельного глобина при инкубации с СИ (Price et. al., 2000).

Для обнаружения алкилированных пептидов был проведен ферментативный гидролиз сывороточного альбумина человека и крысы в присутствии трипсина. В масс-спектрах гидролизатоз были обнаружены несколько сигналов, отсутствующих в гидролнзатах контрольных белков. С помощью тандемной масс-спектрометрии были восстановлены аминокислотные последовательности обнаруженных пептидов ALVLIAFAQYLQQClmPFEDHVK (МН+ 2537,31 Да) и CudPYEEHIK (МН+ 1122,60 Да). Было подтверждено, что эти пептиды входят в состав сывороточного альбумина человека и крысы соответственно, а присоединение остатка сернистого иприта в обоих случаях происходит по С-34. Таким образом, впервые была показана возможность использования МАЛДИ масс-спектрометрии для обнаружения и достоверной идентификации адцуктов СИ с сывороточным альбумином.

Следующим этапом работы стали выявление и идентификация триптических пептидов, модифицированных сернистым ипритом, с использованием МАЛДИ масс-спектрометрии. На первом этапе были получены спектры цельных белков в линейном режиме (рис. 4) и было показано, что при высоких концентрациях СИ алкилирование происходит по нескольким сайтам.

%lnt 100" 90

80

70

60

50

40

30

20

10 0

н

15324

VL

VV,

AW1"

\

ч

\

Ч

15000 15500 16000 16500

тг

%lnt 100" S3

ВО

70

80

50

40

30

20

10 0

зльфз

t". t'l.'l Ч1ЯН4

j Яр

(jiWJVIMI

+ JID

16109

/ —т—

\

Ц I

6.11 с^ьсдоммлг

■ лп>

vfw^

15000 15500 16000

mi

Рисунок 4. Масс-спектры полноразмерных альфа - и бета — субъединиц глобина крысы: А -контроль, Б — белок, инкубированный с ипритом

В масс-спектрах триптического гидролизата были обнаружены три сигнала и с помощью тандемной масс-спектрометрии было установлено, что сигналу с МН* 1444,62 Да соответствует пептид ЕРТРСпоАрААБСЗК, сигналу с МН 1561,66 Да пептид ОТТАНЬБЕШСнеДЖ и сигналу с ШС 1676,78 Да пептид ЮОНООЕ[е>ЕАЬ(311. На рис. 5 представлен фрагментный масс-спекгр пептида с Ш\+ 1444,62 Да, разница между дочерними ионами Ь4 и Ь5 соответствует массе остатка цистеина, алкилированного сернистым ипритом. Таким образом, была подтверждена принадлежность выявленных пептидов глобину крысы, а также установлено, что алкилирование бета-субъединицы происходит по С-93 и -126, а альфа-субъединицы по Е-27. В масс-спектрах триптического гидролизата глобина человека,

инкубированного с СИ, удалось обнаружить только один сигнал с ЛЛ1+ 2633,32 Да. С применением тандемной масс-спектрометрии была восстановлена аминокислотная последовательность пептида ОТРЛТЬ8ЕШС| ЮВК1Л IУОРЕЫРК, и показано, что ал-килировапие происходит по С-93 в бета-субъединице. Аминокислотные последовательности и молекулярные массы обнаруженных и идентифицированных аддуктов представлены в таблице 2.

Рисунок 5. Фрагментный масс-спектр пептида EFTPCAQAAFQK, модифицированного сернистым ипритом по С-126, входящего в состав субъединицы бета глобина крысы (представленные в программе Sequence Viewer 2.0)

В образцах плазмы крови крыс, однократно экспонированных 0,1 ЛД50 СИ (2 мг/кг, п/к), был обнаружен сигнал ранее идентифицированного пептида С|ШРУЕЕН1К с А/Н+ 1122,64 Да вплоть до 7 суток после отравления. Однако сигнал обладал низкой интенсивностью и был получен исключительно с помощью высокочувствительного масс-спектрометра Varían 902-MS. В гидролизате глобина крысы, выделенного из эритроцитов, в масс-спектрах был найден только один из трех описанных пептидов (AÍH 1444,65 Да). При этом указанный сигнал был обнаружен в масс-спектрах, полученных не только с помощью ион-циклотронного масс-спектрометра, но и с помощью прибора Axima Perfomance, обладающего меньшей чувствительностью и разрешающей способностью.

Таблица 2. Пептиды выявленные в триптических гидролизатах, модифицированные сернистым ипритом__

Аминокислотная последовательность пептида Масса пептида (Да) Сайт алкилирования Белок

МГтеор Л^Гэксп

EFTPC1idAQAAFQK 1444,65 1444,62 С-126 Глобин крысы, субъединица бета

GTFAHLSELHChdDK 1561,7 1561,66 С-93 Глобин крысы, субъединица бега

IOGI IGGEYGEhoEALQR 1676,76 1676,78 Е-27 Глобин крысы, субъединица альфа

CiroPYEEIÜK 1122,5 1122,6 С-34 Сывороточный альбумин крысы

GTFATLSELHChdDKLHVDPENFR 2633,25 2633,3 С-93 Глобин человека, субъединица бега

ALVLIAFAQYLQQCiroPFEDHVK 2537,29 2537,31 С-34 Сывороточный альбумин человека

На сегодняшний день не существует методики, которая бы позволила специфично выделить из сложных биологических образцов пептиды, модифицированные остатками СИ. Поэтому, как и в экспериментах с ФОВ, нами была предпринята попытка выделения и обогащения алкилированных аддуктов с помощью металл-

аффинной хроматографии. Остаток СИ после гидролиза адцукта содержит полярную гндроксильную группу и атом серы. Была выдвинута гипотеза о возможности пептидов, модифицированных сернистым ипритом, образовывать устойчивые комплексы на сорбентах с хелатированными ионами Си (И). Таким образом, для повышения чувствительности метода идентификации пептидных адцуктов с СИ в триптических гид-ролизатах был применен метод металл-аффинной хроматографии на сорбенте, содержащим ионы Си (II).

В масс-спектрах гидролизата глобина, инкубированного с сернистым ипритом, при конечной концентрации последнего 60 мкМ наблюдаются все три сигнала алки-лированных пептидов. При понижении концентрации ОВ в среде инкубации в два раза в масс-спектре выявляется только один сигнал с массой Л/Н+ 1444,68 Да, два других сигнала отсутствуют. При конечной концентрации СИ 3 мкМ из спектра пропадают все три сигнала, принадлежащие модифицированным пептидам. Таким образом, минимальная концентрация, при которой удалось обнаружить алкилированные пептиды в гидролизате глобина крысы без дополнительного обогащения, составила 30 мкМ СИ.

После использования металл-аффинной хроматографии на микроколонке Zip-Tip МС, содержащей ионы Си (II), удалось детектировать сигнал с массой МП* 1444,68 Да в гидролизате глобина, инкубированного с 3 мкМ СИ. Хроматографиче-ское разделение проводили в ступенчатом градиенте, результаты представлены на рисунке 6. Пептид с массой MlI* 1444,63 Да элюируется 0,4 М водным раствором аммиака. С помощью МС-МС-анализа было установлено, что соответствующий сигнал действительно принадлежит пептиду с последовательностью EFTPCHdAQAAFQK, входящему в состав бета-субъединицы глобина крысы, и алкилирование пептида происходит по остатку С-126.

Таким образом, была показана принципиальная возможность применения металл-аффинной хроматографии для специфичной сорбции алкилированных аддуктов сернистого иприта с глобином.

Рисунок 6. Фрагменты масс-спектров гидролизата глобина, инкубированного с СИ (3 мкМ), после проведения металл-аффинной хроматографии на микроколонке Zip-Tip МС, содержащей ионы Си (II), при ступенчатом элюировании растворами 0,5% пиперидина (А), 400 мМ гидроксида аммония (Б), 0,1%TFA (В), мертвый объем (Г)

Выявление и идентификация ацетилированных аддуктов глобинов

человека и крысы

Ацетилсалициловая кислота (АСК) имеет широкое распространение в качестве лекарственного средства, и отмечены случаи передозировок при его применении, вплоть до смертельных отравлений. Выявление ацетилированных остатков лизина сывороточного альбумина и гемоглобина может быть дополнением при токсикологическом анализе острых отравлений ацетилсалициловой кислотой.

Содержание салицилатов в плазме крови человека при обычных терапевтических дозах АСК отмечается на уровне 30-100 мкг/мл; при высоких дозах — 50-300 мкг/мл и при острых отравлениях - 700-1400 мкг/мл (Baselt, 2008). Очищенный глобин инкубировали с АСК в концентрации 100 мкг/мл. Для исследования ацетилиро-вания гемоглобина, белок был выделен из эритроцитов человека и крысы, при этом описанная в экспериментальной части методика его выделения предполагает удаление гема. Таким образом, в изучаемом образце содержались несвязанные между собой альфа- и бета-субъединицы глобина. Процедура была одинаковой для выделения глобина крысы и человека. Молекула гемоглобина из двух альфа- и двух бета-субъединиц содержит 44 остатка лизинов — потенциальных сайтов модифицирования. При рассмотрении масс-спектров цельного белка были обнаружены сигналы, смещенные в область больших масс по сравнению с контрольными образцами, как для альфа-, так и для бета-субъединиц глобина, кроме того, практически пропадают сигналы, соответствующие субъединицам глобина, не модифицированным АСК. В масс-спектрах триптических гидролизатов модифицированных белков был обнаружен ряд сигналов отсутствующих в контрольных образцах. Каждый из обнаруженных пептидов был проанализирован методом тандемной масс-спектрометрии. В результате для глобина крысы были обнаружены 4 сайта ацетилирования в альфа- и 2 сайта в бета-субъединице. Для глобина человека 4 сайта ацетилирования в альфа- и 3 сайта в бета-субъединице. Все идентифицированные ацетипированые пептиды представлены в таблице 3.

Следующим этапом работы было проведение поиска ранее идентифицированных ацетилированных пептидов гемоглобина человека после обработки цельной крови раствором АСК. Донорскую цельную кровь с антикоагулянтом (K3EDTA) инкубировали с АСК в конечной концентрации последней 100 мкг/мл. В случае с гемоглобином человека были обнаружены два сигнала, принадлежащие ацетилированным триптическим пептидам, причем оба пептида входят в состав альфа-субъединицы глобина. Это пептид AAWGKacVGAIIAGEYGAEALER, содержащий ацетилирова-ный К-17, и пептид TYFPHFDLSHGSAQVKAcGHGK, содержащий ацетилированный К-57. Таким образом, АСК способна проникать через мембрану эритроцитов и модифицировать глобин.

Для идентификации пептидов были использованы программные комплексы MASCOT MS/MS Ions Search и MS-Tag. Все идентифицированные пептиды находились на первом месте в списке с максимальным показателем Score. Спектры дополнительно проверяли и восстанавливали аминокислотную последовательность каждого пептида вручную.

Таблица 3. Обнаруженные и идентифицированные ацетшированные триптичекие пептиды глобина человека и крысы_

Аминокислотная последовательность пептида Масса пептида (Да) Сайт ацетшшрования Субъединица глобина

ЛДТЧеор ДДГэксп

Крыса

FLASVSTVLTSKacYR 1613,87 1613,89 К-140 альфа

TYFSI IIDVSPGSAQVKacAI ICK 2171,12 2171,19 К-57

NCWGKAcIGGHGGEYGEEALQR 2202,96 2202,85 К-17

AADHVEDLPGALSTLSDLHAHKacLR 2608,33 2608,33 К-91

vinafndglkaJildnlk 1852,99 1852,8 К-77 бета

AAVNGLWGKacVNPDDVGGEALGR 2237,12 2236,89 К-17

Человек

AAWGKAcV<j.M iageyoaealer 2085,00 2085,00 К-17 альфа

TYFPHFDLSHGSAQVKacGHGK 2255,09 2255,19 К-57

MFLSFPTTKAcTYFPHFDLSHGSAQVK 2928,43 2928,47 К-41

VADALTNAVAHVDDMFNALSA LSDLIIAIDCacLR 3307,67 3307,74 К-91

SAVTALWGKacVNVDEVGGEALGR 2270,16 2270,15 К-18 бета

EFTPPVQAAYQKacVVAGVAN ALAI1 2551,35 2551,29 К-133

GTFATLSELHCDKacLHVDPENFR 2571,21 2571,21 К-96

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанные подходы позволят значительно усилить доказательную базу и надежность ретроспективного токсикологического анализа при отравлении различными ксенобиотиками.

В отношении идентификации ФОВ Организация по запрещению химического оружия (ОЗХО) рекомендует определение в биопробах как их свободных метаболитов, так и аддуктов с белками. Ковалентные адцукты белков крови с другими опасными химикатами, например цианидами (Fasco et. al., 2007), являются долгоживущи-ми и надежными биомаркерами интоксикации, а разработка методов идентификации нестандартных постгрансляционных модификаций белков крови является актуальным направлением в ретроспективном анализе факта интоксикации.

ВЫВОДЫ

1. Масс-спектрометрический анализ модификаций сывороточного альбумина и гемоглобина, как основных белков крови, является перспективным подходом для ретроспективного токсикологического анализа.

2. Сернистый иприт модифицирует сывороточный альбумин человека и крысы по С-34. Глобин крысы алкилируется по Е-27 в альфа-субъединице и С-93, С-126 в бета-субъединице, и глобин человека по С-93 в бета-субъединице. Аддукты сернистого иприта с сывороточным альбумином и гемоглобином были выявлены до 7 суток после интоксикации. Метод металл-аффинной хроматографии на ионах Cu(II) позволяет концентрировать алкилированныс пептиды глобина крысы.

3. Фосфорорганические вещества фосфонилируют сывороточный альбумин человека и крысы по Y-411 для зомана и зарина, и Y-150 для вещества типа Vx (RVX, VR). Аддукт сывороточного альбумина крысы с зоманом выявляли в плазме крови экспонированных дозой 2X0,4 ЛД50 животных до 14 суток после интоксикации, ис-

пользуя комбинацию методов твердофазной экстракции, металл-аффинной хроматографии на сорбентах содержащих Ti(IV) и МАЛДИ масс-спектрометрии.

4. Ацетилсалициловая кислота приводит к ацетилированию остатков лизина сывороточного альбумина и гемоглобина человека и крысы. При инкубации цельной крови человека с ацетилсалициловой кислотой в концентрации 100 мкг/мл определяются ацетилированные лизины: К-17 и К-57 в бета-субъединице глобина человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Краснов, И. А. Идентификация алкилированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии / И. А. Краснов, Н. В. Гончаров, В. Н. Бабаков, Л. М. Глашкина, Е. Е. Ермолаева, Я. А. Дубровский, Д. С. Прокофьева, Н. Г. Войтенко, Т. И. Смолихина, Н. Б. Поляков, А. С. Радилов, Е. П. Подольская, Н. В. Краснов. Идентификация алкилированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии // Научное приборостроение. - 2008. - т. 18. - № 4. - С . 46-53.

2. Бабаков, В. Н.. Использование масс-спектрометрии с методом ионизации MALDI при поиске биомаркеров интоксикаций высокоопасными отравляющими веществами / В. Н. Бабаков, Е. П. Подольская, Н. В. Гончаров, И. А. Краснов, Л. М. Глашкина, Я. А. Дубровский, Е. Е. Ермолаева, Д. С. Прокофьева, Н. Г. Войтенко, А. С. Радилов, Н. В. Краснов, В. Р. Рембовский // V российский симпозиум «Белки и пептиды». - Казань, 2009. - С.78.

3. Дубровский, Я. А. Идентификация алкилированных аддуктов глобина крысы методами масс-спектрометрии / Я. А. Дубровский, Е. П. Подольская, Н. Г. Войтенко, И. А. Краснов, В. Д. Гладилович, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров, Н. В. Краснов // Научное приборостроение. - 2010. - т. 20. - № 4. - С. 77-83.

4. Дубровский, Я. А. Взаимодействие глобина крысы и человека с ацетилсалициловой кислотой in vitro: масс-спектрометрическая идентификация ацети-лированных лизинов / Я. А. Дубровский, В. Д. Гладилович, Е. П. Подольская, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров, Н. В. Краснов // Научное приборостроение. - 2010. — т. 20.-№4.-С. 71-76.

5. Гладилович, В. Д. Идентификация пептидов сывороточного альбумина модифицированных фосфорорганическими соединениями с применением методов хроматографии и масс-спектрометрии / В. Д. Гладилович, И. А. Краснов, Е. П. Подольская, Я. А. Дубровский, Н. Г. Войтенко, С. В. Фиронов, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров, Н. В. Краснов // Научное приборостроение. - 2010. - т. 20. - № 4. -С. 84-92.

6. Дубровский, Я. А. Ацетилирование глобина ацетилсалициловой кислотой / Я. А. Дубровский, В. Н. Бабаков, Е. П. Подольская, Н. В. Гончаров // Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях/ под общ. ред В.Р. Рем-бовского и A.C. Радилова, - СПб.: Фолиант, 2010. - С. 75.

7. Babakov, V. Comparative analysis of methods for retrospective detection of suliur mustard metabolites and its protein adducts in rats / V. Babakov, N. Voytenko, O. Orlova, Ya. Dubrovsky, I. Krasnov, E. Podolskaya, N. Koiyagina, E. Savelieva, A. Radilov, N. Goncharov // Proceedings 10th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents. - Stockholm, 2010. - Статья по материалам конференции.

8. Краснов, И. А. Идентификация алкилированных адцуктов сывороточного альбумина и гемоглобина методами масс-спектрометрии / И. А. Краснов, Н. В. Гончаров, В. Н. Бабаков, JI. М. Глашкина, Е. Е. Ермолаева, Я. А. Дубровский, Д. С. Прокофьева, Н. Г. Войтенко, А. С. Радилов, Е. П. Подольская, Н. В. Краснов // Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях/ под общ. ред В.Р. Рембовского и A.C. Радилова, - СПб.: Фолиант, 2010. — С. 87.

9. Краснов, И. А. Идентификация пептидов альбумина, модифицированных фосфорорганическйми соединениями, с применением методов хроматографии и масс-спектрометрии / И. А. Краснов, В. Д. Гладилович, Я. А. Дубровский, В. Н. Бабаков, Е. П. Подольская // Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях/ под общ. ред В.Р. Рембовского и A.C. Радилова, - СПб.: Фолиант, 2010. — С. 86.

10. Подольская, Е. П. Использование методов фосфопротеомики при анализе ковалентных аддуктов белков крови с фосфорорганическими соединениями / Е. П. Подольская, В. Д. Гладилович, И. А. Краснов, Я. А. Дубровский, В. И. Шмурак, Н. Г. Войтенко, С. В. Фиронов, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров // Первая международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». — Москва, 2010. — С. 55.

11. Дубровский, Я.А. Применение металл-аффинной хроматографии для выделения алкилированных аддуктов гемоглобина крысы / Я.А. Дубровский, В. Д. Гладилович, И. А. Краснов, Е. П. Подольская, Е. А. Мурашко, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров // V российский симпозиум «Белки и пептиды». - Петрозаводск, 2011. — С.78.

12. Методы определения алкилированных аддуктов сернистого иприта с белками крови / Методические рекомендации № 41-11 от 26.10.2011.

13. Дубровский, Я. А. Применение металл-аффинной хроматографии для выделения алкилированных аддуктов гемоглобина крысы / Я. А. Дубровский, В. Д. Гладилович, И. А. Краснов, Е. П. Подольская, Б. А. Мурашко, В. Н. Бабаков // Биоорганическая химия. — 2012. - т. 38. — № 1. — С. 52-57.

14. Шрейнер, Е. В. Идентификация сайтов ацетилирования гемоглобинов крысы и человека при их взаимодействии с ацетилсалициловой кислотой / Е. В. Шрейнер, Б. А. Мурашко, Я. А. Дубровский, Н. В. Краснов, Е. П. Подольская, В. Н. Бабаков //Биоорганическая химия. - 2012. — т. 38. — № 2. — С. 149-155.

15. Дубровский Я. А., Идентификация сайтов ацетилирования гемоглобина человека при взаимодействии с ацетилсалициловой кислотой / Я. А. Дубровский, Е. В. Шрейнер, Е. А. Мурашко, Е. П. Подольская, В. Н. Бабаков // Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации. — Санкт-Петербург, 2012. - С.86.

16. Murashko, Е.А. Phosphoproteomics approach for detection of butyrylcholinester-ase adducts with organophosphorous nerve agents by maldi mass spectrometry / E.A. Murashko, Ya.A. Dubrovsky, V.l. Shmurak, A.D. Nadeev, E.P. Podolskaya, V.N. Babakov U 11th International Meeting on Cholinesterases. — Казань, 2012. — C.78.

17. Dubrovskii, Ya. A. Enrichment of sulfur mustard alkylated rat hemoglobin adducts using metal-affinity chromatography / Ya. A. Dubrovskii, V. D. Gladilovich, I. A. Krasnov, E. P. Podilskaya, E. A. Murashko, V. N. Babakov // Proceedings 11th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents. — Stockholm, 2013. — P. 126

18. Murashko, E. A. Phosphoproteomics approach for enrichment and detection of albumin adducts with organophosphorous nerve agents by MALDI mass spectrometry / E. A. Murashko, V. D. Gladilovich, Ya. A. Dubrovskii, E. P. Podilskaya, V. N. Babakov // Proceedings 11th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents. - Stockholm, 2013. - P. 131.

19. Lockridge, O. Reaction of tyrosinyl, histidinyl and lysinyl residues with OP / O. Lockridge, B. Li, W. Jiang, M. Liyasova, L.M. Schopfer, F. Nachon, P. Masson, E. A Murashko, Ya A. Dubrovskii, E. P. Podolskaya, V. N. Babakov //Proceedings of 38th FEBS Congress. St. Petersburg, 2013. / FEBS Journal. - V. 280. - 2013. Suppl. 1. - P. 163-164.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACK — ацетилсалициловая кислота

ВЭЖХ-МС-МС - жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

ГХ-МС - газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией ЛД - летальная доза

МАЛДИ - матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации

МС-МС — тандемная масс-спектрометрия

ОВ — отравляющее вещество

СИ (HD) - сернистый иприт

ТФУ - трифторуксусная кислота

УК - уксусная кислота

ФОВ - фосфорорганические отравляющие вещества

ФОС — фосфорорганические соединения

СНСА — а-циано-4-гидроксикоричная кислота

CID - фрагментация вызванная соударением

DHB — 2,5-Дигидроксибензойная кислота

GB — зарин

GD — зоман

RVX, VR - вещество типа Vx

Подписано в печать 28.08.2013 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 399

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А