Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Идентификация и метаболическая верификация вирусных гепатитов А, В, С

На правах рукописи

СИДОРОВА Ирина Флуровна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ВЕРИФИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ А, В, С

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2005

Работа выполнена на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет МЗ РФ»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Радомская Виктория Марковна Баишева Гульнара Максимовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Рубин Владимир Иванович

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лабораторного отдела

Саратовского НИИТО Коршунов Геннадий Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия МЗ РФ»

Защита диссертации состоится «_»_2005 года в_час.

на заседании диссертационного совета К208.094.01 при Саратовском государственном медицинском университете

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Саратовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Бородулин В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Вирусные гепатиты, занимая одно из первых мест в инфекционной патологии человека, являются актуальной проблемой здравоохранения, имеют высокую социальную, экономическую, эпидемиологическую значимость.

За последние годы заболеваемость вирусными гепатитами возросла, преобладают среди заболевших пациенты молодого репродуктивного возраста (Суздальцев А.А. с соавт., 2003). Из гепатитов, вызываемых вирусами гепатита А,В,СДЕ,С,ТТ наиболее высока частота встречаемости гепатитов А,В,С (Жи-буртЕ.Б., 1998)

В мире проживает около 500 млн человек, инфицированных вирусом гепатита С (Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999). Особенностью HCV-инфекции является ее преимущественно бессимптомное течение. Персистенция вируса гепатита С может длится многие годы, приводя к развитию хронического гепатита С (более 85%), цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%) (Miaihes Р., Тгеро С, 2000). Частота формирования хронической патологии печени, вызванной HCV, по крайней мере, в 10 раз выше, чем при вирусном гепатите В. Изучение течения HBV-инфекции выявило, что у 5-15% заболевших заболевание рецидивирует, а у 2-6% пациентов прогрессирует в цирроз печени (Chu CM. et all., 2004).

Проблема вирусных гепатитов создает впечатление неисчерпаемости в силу высокой мутируемости возбудителя и относительной изменчивости организма человека, проживающего в экологически трансформируемой окружающей среде. Актуальным является поиск аргументированных диагностических критериев вирусоносительства, диагностика безжелтушных, стертых форм.

В настоящее время с учетом множества известных и появления мутант-ных штаммов вирусов, возбудителей заболевания, проводится углубленное изучение иммунологических, гистопатологических, клинических особенностей HBV, HCV- инфекции, переосмысление методических подходов к осуществле-

нию эпидемиологической диагностики, выявлению и обоснованию причин хро-низации заболевания.

Использование методов генодиагностики, в частности, полимеразной цепной реакции, позволяет провести количественную оценку возбудителей HBV, HCV в исследуемом биологическом материале. Наряду с общим цитопа-тическим эффектом всех возбудителей гепатита, проявляющимся поражением печени, показано, что HCV является также и лимфотропным вирусом (Игнатова Т.М. с соавт., 1998; Лесняк О.М., 1999). Очевидно, это не исключает и другой локализации вируса, более широкого спектра его повреждающего действия.

Как известно, различия в клинической картине вирусных гепатитов достаточно неспецифичны, а эпидемиология, патогенез, отдаленные последствия вызываемых ими заболеваний не одинаковы. Это обуславливает исключительную ценность результатов лабораторных исследований, поскольку они позволяют дифференцировать этиологический фактор, фазу заболевания, анамнестические и активные формы (Рахманова А.Г. с соавт., 2001). Представляет интерес вопрос о взаимосвязи выраженности виремии с характером сдвигов в показателях обмена, выявление специфики метаболического статуса при вирусных гепатитах с различным этиологическим фактором. Совершенствование диагностического процесса включает в качестве обязательного условия проведение внешней оценки качества и внутрилабораторного контроля качества. Актуальным является разработка новых чувствительных тест-систем и контрольных материалов для определения спектра маркеров вирусных гепатитов методом ПЦР, ИФА, иммуноэлектрохемилюминесцентного анализа.

Цель настоящего исследования заключается в выяснении характера метаболического ответа на различные молекулярно-биологические свойства вирусов гепатитов А,В>С в повышении эффективности и качества диагностики.

Задачи:

1. Идентифицировать вирусы гепатитов А,В,С с помощью различных диагностических методов, оценить информативность и выявляемость патогенов с

использованием полимеразной цепной реакции, иммуноферментного, им-муноэлектрохемилюминесцентного методов.

2. Изучить характер метаболического ответа в различные фазы заболевания гепатитом А,В,С в период репликации при отсутствии РНК и ДНК вирусов.

3. Оценить взаимосвязь между выраженностью виремии и особенностями метаболического статуса у больных с гепатитами А,В,С по показателям угле-водно-липидного, белкового обменов,

4. Сопоставить функциональное состояние печени при гепатитах АД С, оценив белоксинтезирующую, детоксикационную способность, глубину гисто-патологических нарушений.

5. Исследовать тип структурообразования сыворотки крови в зависимости от молекулярно-биологических свойств вирусов гепатитов АД С и характера метаболического ответа на них.

6. Апробировать систему контроля качества диагностики гепатитов В и С с использованием новых тест-систем и контрольных материалов в различных лабораториях региона, проанализировать результаты и выявить наиболее типичные ошибки на преаналитическом и аналитическом этапах.

Научная новизна. Впервые получены данные, характеризующие диапазон метаболических нарушений при гепатитах А, В, С в различные фазы патологического процесса в случаях репликации и при отсутствии РНК и ДНК вирусов. Получены новые сведения, раскрывающие этиопатогенетическую роль степени выраженности виремии в индукции метаболических нарушений в организме больных. Раскрыта взаимосвязь между молекулярно-биологическими свойствами возбудителей гепатитов, выраженностью виремии и характером метаболических расстройств при гепатитах В и С. При низкой концентрации ДНК-вируса HBV наблюдается слабовыраженная гиперферментемия аспарта-таминотрансферазы. При высокой виремии отмечается диспротеинемия за счет снижения содержания альбумина и увеличения высокая ти-

моловая проба, резкая активация ферментов, гипербилирубинемия за счет фракции прямого билирубина.

При гепатите С даже при минимальной виремии проявляются более глубокие структурные и функциональные нарушения гепатоцитов, чем при гепатите В, о чем свидетельствует высокий уровень активности аланин-аспартатаминотрансфераз, у- глутамилтрансферазы даже при нормальных величинах общего билирубина. По данным количественной оценки ПЦР при виремии свыше 6,03 Е5, соответствующей титру 1:10000, выраженная диспротеи-немия отсутствует, тимоловая проба в границах референтных величин, что прогностически неблагоприятно. Выявленные особенности течения гепатитов, вызванных различными патогенами, могут служить для метаболической верификации гепатитов, прогнозирования течения и исхода заболевания.

Впервые получена морфологическая картина сыворотки крови больных гепатитом А,В,С. Показано, что изменение физико-химических параметров, соотношения липофильных и гидрофильных метаболитов, нарушение баланса ионизированных интермедиатов при различных видах гепатитов проявляется в изменении белковой и солевой зоны, появлении характерных для каждого гепатита вариантов структурирования фаций.

Установленное нарушение белоксинтезирующей способности, диспро-теинемия, снижение содержания альбумина, детоксикациошюй функции печени, целостности гепатоцитов, о чем свидетельствует гиперферментемия, повышение фракции прямого билирубина даже при безжелтушных формах в целом служит подтверждением того, что вирусные гепатиты являются системным, заболеванием организма с преимущественным поражением печени.

Новым является аргументирование эффективности применения высокочувствительных тест-систем и контрольных материалов для проведения качества диагностики вирусных гепатитов с использованием методики ИФА.

Научно-практическая значимость. Получен новый блок сведений, раскрывающих взаимосвязь характера и глубины метаболических нарушений при гепатитах А, В, С с молекулярно-биологическими свойствами патогенов, количеством антигенов в крови. Сравнительное изучение метаболического статуса больных с гепатитом В и С с титром антигена 1:1 и 1: 10000 показало депрес-

сию белоксинтезирующей способности, иммуносупрессию при высокой вире-мии, что косвенно диагностируется с помощью тимоловой пробы, свидетельствующей о слабо выраженном антительном ответе, отсутствии прироста у-глобулинов.

Возможность метаболической верификации различных форм гепатита обеспечивает базу данных для повышения точности диагностики вирусных гепатитов, улучшения эффективности работы клинико-диагностической лабораторий, не располагающих высокими научно-диагностическими технологиями. Проведенная нами лабораторная диагностика вирусных гепатитов с использованием ПЦР, ИФА, иммуноэлектрохемилюминесцентного анализа на одних и тех же образцах крови больных и сравнительный анализ выявляемости вирусов гепатитов, базирующийся на определении РНК и ДНК-вируса, а также на изучении антительного ответа позволили прийти к заключению о том, что максимальная выявляемость установлена для ПЦР и иммуноэлектрохемилюминес-центного анализа, при этом ИФА является более экономичным способом

Чтобы избежать, ложноположительных. и ложноотрицательных результатов и выяснить причины ошибок при выполнении исследований, целесообразно организовать проведение внутрилабораторного контроля качества определения HBsAg и анти-НСУ-антител методом ИФА с помощью контрольных карт, построенных по расчетному коэффициенту позитивности для данного метода, применяя тест-системы и контрольные материалы отечественных производителей, что важно для диагностики и мониторинга течения заболевания, оценки эффективности терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Аргументирование диагностической информативности в идентификации вирусов гепатитов А, В, С методом полимеразной цепной реакции, иммуноэлек-трохемилюминисцентного и иммуноферментного анализа в различные фазы заболевания; взаимосвязь характера метаболического ответа с молекулярно-биологическими свойствами патогенов.

2. Степень нарушения белоксинтезирующей, обезвреживающей функции печени, глубины цитопатологического процесса в зависимости от выраженности виремии.

3. Специфика структурообразования - интегральный тест, отражающий особенности физико-химических характеристик, соотношение высоко- и низкомолекулярных соединений в ионизированной и молекулярной форме в сыворотке крови больных вирусными гепатитами А,В,С.

4. Информативность использования новых тест систем, материалов для проведения контроля качества диагностики вирусного гепатита С по оценке антительного ответа методом ИФА, гепатита В - по изучению уровня антигенов и антител. Преимущественное распределение отдельных штаммов возбудителя гепатитов по региону, типичные диагностические ошибки в лабораторной практике.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ. Результаты диссертационного исследования внедрены в лекционный материал на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государственного медицинского университета, в работу клинико-диагностической лаборатории клиник Самарского государственного медицинского университета, клинико-диагностической лаборатории, инфекционного и терапевтического отделений городской клинической больницы №2 им. Н.А. Семашко г.Самары.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы представлены в материалах Пятой международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2004), Международного семинара по проблемам пожилых «Самарские лекции» (Самара, 2004), IX Международной научной конференции «Здоровье семьи XXI век» (Далянь,2005), совместном заседании Самарского отделения Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, кафедр общей бионеорганической и биоорганической химии и фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государственного медицинского университета и Са-

марского отделения научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Самара, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной характеристике объекта и методов исследования, 3-х глав собственных данных, заключения, выводов, практически рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 172 страницах, иллюстрирована 14 рисунками, содержит 36 таблиц. В работе использовано 216 литературных источников, из них 116 отечественных и 100 зарубежных авторов.

Материал и Методы исследования

Работа включала два этапа:

- Исследование маркеров вирусных гепатитов и метаболического статуса у больных вирусными гепатитами А,В,С.

- Анализ работы 63 лабораторий Приволжского Федерального округа по определению HBsAg, включая внешнюю оценку качества и внутрилабораторный контроль качества.

Общаяхарактеристика больныхвирусными гепатитами

Проведено клинико-лабораторное обследование 215 больных с диагнозом вирусный гепатит. Работа выполнена в Центральной клинико-диагностической лаборатории клиник Самарского государственного медицинского университета, которая является базой кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой.

По диагнозу больные распределялись следующим образом: острый вирусный гепатит А - 5,5 %; острый вирусный гепатит В - 1,8 %; хронический вирусный гепатит В -16,5 %; носитель HBs А - 6,4 %, острый вирусный гепатит С - 12,7 %; хронический вирусный гепатит С - 33,6 %; хронический гепатит неясной этиологии -10,9 %.

В качестве объекта исследования использовалась сыворотка крови.

Определение маркеров вирусных гепатитов проводилось методами им-муноферментного анализа на иммуноферментном анализаторе "Униплан" (Россия) с применением термостатируемого шейкера Elmi и автоматического промывающего устройства «Проплан» (Россия). Для иммуноферментного анализа использованы реагенты фирмы "Вектор-Бест" (Россия). Принцип метода заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хро-могенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется фотометрически. Использован гетерогенный твердофазный иммунофер-ментный анализ, что позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. В качестве твердой фазы использованы полистироловые планшеты. Для ферментативной метки конъюгата применена пероксидаза хрена. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, если в ней есть антитела (эти антитела называются первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело. После отмывки лунок от не-связавшихся (а значит неспецифичных) субстанций в каждую лунку добавляются так называемые вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IqA, IqG, IqM). К этим вторым антителам химически пришит активный фермент (Е). Такое комплексное соединение называется конъю-гат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа "сэндвич" (2/3/4). После отмывки несвязавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент, в результате субстрат превращается в окрашенный продукт, измеряемый на фотометре.

Проводилось определение следующих тестов:

• Anti-HAV Ig M - твердофазным двухступенчатым «sandwich» - вариантом иммуноферментного анализа с тетраметилбензидином в качестве хромогена.

• Anti-HAV Ig G - методом твердофазного непрямого иммуноферментного анализа с тетраметилбензидином в качестве хромогена.

• HBs-Ag - методом твердофазного одноступенчатого прямого иммуноферментного анализа на планшетах, с подтверждающим тестом методом конкурентного анализа с использованием в качестве хромогена тетраметил-бензидина.

• Anti-HBs-Ag - твердофазным двухступенчатым «sandwich» - вариантом им-муноферментного анализа с тетраметилбензидином в качестве хромогена.

• Anti-HBc-Ag (суммарные антитела) - методом одноступенчатого конкурентного ИФА на планшетах с использованием ТМБ в качестве хромогена.

• Anti-HBc-Ag Ig M - методом двухступенчатого «capture» ИФА с использованием ТМБ в качестве хромогена.

• HBe-Ag - с использованием «sandwich» - варианта одноступенчатого твердофазного ИФА на планшетах с хромогеном ТМБ.

• Anti-HBe Ig G - методом двухступенчатого непрямого иммуноферментного анализа на планшетах с использованием в качестве хромогена тетраметил-бензидина.

• Anti-HCV Ig M - методом твердофазного двухступенчатого непрямого ИФА на планшетах с хромогеном ТМБ.

• Anti-HCV Ig G - методом твердофазного двухступенчатого ИФА на планшетах с использованием в качестве хромогена ТМБ.

Аналогичный перечень маркеров гепатита определяли твердофазным пробирочным методом в электрохемилюминесцентной реакции (магнитные микрочастицы) на основе стрептовидин-биотиновой технологии с рутениевой меткой на электрохемилюминесцентном иммуноанализаторе Elecsys 2010 фирмы "Roche"c реагентами фирмы "Ф.Хоффман - Ла Рош Лтд." (Швейцария).

Определение ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С выполнено

количественным методом полимеразной цепной реакции с расчетом числа ко-

пий и определением титра (1:1, 1:100, 1:1000, 1:100000) на анализаторе Ampli-сог. .

Биохимические методы исследования показателей сыворотки крови проводили на автоматическом биохимическом анализаторе «Hitachi-902" фирмы "Roch-Diagnostics», производства Японии с помощью коммерческого набора реактивов фирмы "Roch-Diagnostics» (Швейцария). Оценивали концентрацию общего белка, альбумина, глюкозы, холестерина, р-липопротеинов, билирубина, активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глютамилтрансферазы, лактатдегидрогеназы. Тимоловую пробу проводили фотометрическим методом с реактивами фирмы «Lachema». Элетрофорез белков сыворотки крови - на приборе «Астра» (Россия)

Исследование морфологии сыворотки крови проводили методом клиновидной дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н.,2001) при естественном высыхании биологических жидкостей, комнатной температуре в течение одних суток. Результаты оценивали с помощью компьютерного микроскопа Intel (США). Анализировали рисунок солевой и белковой зон при увеличении 60.

Статистическая обработка результатов исследований проведена с помощью специализированной статистической программы Statistica 5.0 и MS Exel 7.0, использовали критерии согласия Колмогорова-Смирнова, хи-квадрат и коэффициенты асимметрии и эксцесса. Для обработки полученных результатов были использованы непараметрические статистические методы (Гленц С, 1999; 2002). Для сравнения двух выборок применяли U-критерий Манна-Уитни (непараметрическая альтернатива t-критерию Стьюдента). Выявление взаимосвязей между показателями проводили с помощью корреляционного анализа R Спирмена и х Кендалла (Боровиков В.П., 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ результатов определения различных маркеров вируса гепатита В показал, что процент выявляемости HBs Ag и НВе Ag зависит от фазы инфекционного процесса (табл.1). В активную фазу репликации вируса гепатита В (ДНК +) процент выявления HBs Ag составляет 68,9 % от общего числа обследованных больных гепатитом В. В Эту фазу в 3 % случаев отмечены отрицательные результаты определения данного антигена, что, возможно, связано с мутациями генов, определяющих его синтез. В фазу ремиссии (ДНК -) HBsAg выявлен у каждого пятого больного (21%), что позволяет использовать его определения для выявления больных, перенесших вирусный гепатит.В.

Выявляемость НВе Ag меньше, в фазу репликации вируса он определялся в 13 % случаев, чаще наблюдались отрицательные результаты его определения - у 58 % больных гепатитом. Известно, что в результате мутаций в ргеС регионе синтез HBeAg прекращается, тогда как способность вируса к репликации сохраняется (KremsdorfD.etaL, 1991; Hadziyannis S.I., 1995).

Таблица 1

Соотношение выявляемости ДНК вируса гепатита В, HBs Ag и НВе Ag

HBsAg-(% от общего числа) HBs Ag + (% от общего числа) HBeAg-(% от общего числа) НВе Ag + (% от общего числа)

ДНК- 21,88 6,45 29,03 0,00

ДНК+ 3,05 68,92 58,06 12,90

Связь между наличием HBs Ag и выявляемостью ДЕЖ вируса гепатита В у больных вирусным гепатитом В подтверждена статистически (х 22,10, р=0,001). Связь между наличием НВе Ag и ДНК вируса гепатита В у больных вирусным гепатитом В отсутствовала (х2=1»88,р=0,17).

Характер метаболического ответа организма при вирусных гепатитах определялся видом возбудителя и фазой инфекционного процесса.

При вирусном гепатите В в фазе активной репликации вируса по сравнению с показателями контрольной группы отмечена более высокая концентрация общего билирубина (+58%; р<0,05), увеличение значения тимоловой пробы (+ 116% р<0,05), активности аланинаминотрансферазы (+ 169% р<0,05), аспар-татаминотрансферазы (+169% р<0,05), лактатдегидрогеназы (+31% р<0,001), более низкие значения коэффициентов ПТ/АЛТ (-33% р<0,05) и АСТ/АЛТ (32% р<0,05). Необходимо отметить, что большинство показателей не выходили за границы референтных значений.

У больных хроническим гепатитом В в фазе ремиссии, когда ДНК вируса не выявляется, по сравнению со здоровыми выявлены более высокие концентрации общего билирубина (+ 60% р<0,05), р-липопротеинов (+110%, р<0,05), значения тимоловой пробы (в 2,2 раза), выше активность аланинаминотрансфе-разы (+85% р<0,05), при этом концентрация холестерина более низкая (медианы: 3,72 ммоль/л и 4,20 ммоль/л, р<0,05). По сравнению с фазой репликации вируса В (табл. 2) отмечена нормализация содержания билирубина, показателя тимоловой пробы, исчезла гиперферментемия, однако стали более выраженными отклонения в обмене липидов, что проявилось снижением содержания холестерина и увеличением концентрации р-липопротеинов. Исследование выраженности метаболических изменений у больных гепатитом В в фазу активной репликации вируса в зависимости от выявляемое™ НВе Ag показало существование зависимости между повышением активности аланина-минотрансферазы и его наличием Полученные данные согла-

суются с результатами работы J.F. Tsai et я1. (2000), авторы считают HBeAg независимым фактором, с которым связано повышение активности аланинами-нотрансферазы. У больных с НВе Ag отмечена более высокая концентрация р-липопротеинов (+22%, р<0,001) и повышение тимоловой пробы (+39%, р<0,05), что свидетельствует о выраженном нарушении у них функций печени.

Таблица 2

Сравнительный анализ показателей метаболизма больных вирусным гепатитом В в зависимости от фазы заболевания

Показатель ДНК- ДНК+

М±ш Ме М±т . Мё

Глюкоза, ммоль/л 4,86±0,43 5,30 5,09±0,24 4,79

Общий белок, г/л 78,48±6,32 83,1 80,2±2,76 79,94

Альбумин, г/л 43,08±3,19 45,65 43,5±1,89 42,11

Общий билирубин, мкмоль/л 16,06±7,82 6,11 16,80±1,75 . 14,79

у-глютамилтранс-фераза, Е/л 12,36±1,94 11,1 15,30±1,98 12,70

Холестерин, ммоль/л 4,11 ±0,46 3,72 4,35±0,27 4,00

Аланинаминотранс-фераза, Е/л 31,86±8,01 26,34 46,1±10,91 25,00

Аспартатами-нотрансфераза, Е/л 25,92±5,03 21,38 45,90±9,98 33,61

Лактатдегидрогеназа, Е/л 257,8±18,14 253,34 ... 359,10±20, 05 . 341,01 ...

Тимоловая проба, ед 2,97±0,76 : 2,25 4,31±0,83 2,60 :

(кпипопротеины, ед.. 82,63±6,39 47,00 47,57±5,28 44,00*-. •

ГГТ/АЛТ 0,61±0,13 0,74 0,61±0,12 0,48

АСТ/АЛТ 1,22±0,28 0,94 1,23±0,13 1,00

-р<0,05.

Метаболический статус больных вирусным гепатитом d у которых обнаружена РНК вируса, по сравнению с группой здоровых отличался тем, что у них выше концентрация общего, билирубина на 143% (р<0,01), активность аланинаминотрансферазы на 370% (р<0,001), аспартатаминотрансферазы на 175% (р<0,001), лактатдегидрогеназы на 39% (р<0,001) . и гамма-глютамилтрансферазы на 112% (р<0,05), значение тимоловой пробы выше в 3,5 раза, а также более низкие значения коэффициентов ГГТ/АЛТ- на 51% (р<0,05),иАСТ/АЛТ-на42%(р<0,01). .

У пациентов с хроническим вирусным гепатитом С в стадии ремиссии также наблюдались существенные изменения в метаболизме. У них по сравне-

нию с группой здоровых выше активность аланинаминотрансферазы (+364%, р<0,05), аспартатаминотрансферазы (+133%, р<0,05), у-глютамилтрансферазы - на 133% (р<0,05), концентрация Р-липопротеинов - на 30% (р<0,05) и значение тимоловой пробы - на 388% (р<0,05), также наблюдались достоверно более низкие значения коэффициентов ПТ/АЛТ - на 44% (р<0,05) и АСТ/АЛТ - на 50% (р<0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных гепатитом С отрицательные результаты определения РНК вируса не означают прекращение воспалительно-деструктивного процесса в печени, хотя формально эта стадия болезни расценивается как ремиссия.

Данные в таблице 3 характеризуют отличия в метаболическом профиле у больных вирусным гепатитом С с признаками активной репликации вируса и находящихся в стадии ремиссии.

У больных с активной репликацией вируса были достоверно выше активность лактатдегидрогеназы - на 35% (р<0,01) и у-глютамилтрансферазы - на 50% (р<0,05), увеличена концентрация общего билирубина (+70; р<0,05) и |3-липопротеинов - на 13% (р<0,05). Значения же тимоловой пробы в среднем на 33% (р<0,001) были выше у пациентов, находящихся в фазе ремиссии, что, очевидно, свидетельствует о подавлении иммунного ответа у лиц с хроническими формами заболевания. В фазу ремиссии нормализуется содержание общего билирубина, но гиперфермснтемия аланинаминотрансферазы и аспартатами-нотрансферазы сохраняется. Необходимо отметить, что повышение активности аспартатаминотрансферазы у больных гепатитом В встречается реже. Исследование частоты встречаемости антител к вирусу гепатита С класса 1ёМ в группе больных, у которых была обнаружена РНК вируса показало, что АпИ НСУ 1ёМ выявляются в 35 % случаев.

Причиной низкой выявляемости антител класса 1ёМ к вирусу гепатита С в группе больных с активной репликацией вируса является, на наш взгляд, то, что антитела класса 1ёМ быстро перестают вырабатываться. Известно, что существуют серонегативные пациенты. Так, по данным Ь.Б. 8ее! е! а1. (2000) 20-

30% переболевших вирусным гепатитом С являются носителями РНК при отсутствии ЛШ HCV IgM и нормальной активности аланинаминотрансферазы.

Таблица 3

Сравнительный анализ показателей метаболизма у больных вирусным гепатитом С в зависимости от фазы заболевания

РНК- РНК+

Показатель М±щ Ме М±т Ме

Глюкоза, ммоль/л 4,98±0,21 4,58 4,44±0,19 4,60

Общий белок, г/л 80,48±2,05 79,10 75,88±1,17 73,41

Альбумин, г/л 45,44±1,27 42,39 44,02±0,72 43,94

Общий билирубин, мкмоль/л 15,40 Ь1,97 : 14,86 25,88±2,89* 20,58 .

у-глютамил- 35,00±4,45 1.4,06. 27,25±3,84* 21,13

трансфераза, Е/л

Холестерин, ммоль/л 4,40±0,31 4,06 3,95±0,20 3,88

Аланинаминотранс- 79,75±6,27 51,00 80,72±8,87 57,60

фераза, Е/л

Аспартатаминотранс-фераза, Е/л 54,04±6,04 .43,75 63,63±5,84 44,76

Лактатдегидрогеназа, 270,1±22,08 254,76 365,3±10,06** 351,32

Е/л

Тимоловая проба, ед 9,72±1,77 10,3 4,66±0,46** 3,40

(3-липопротеины, ед 51,11±7,91 53,00 45,60±2,42* 44,00

ГТТ/АЛТ 0,51±0,09 0,43 0,43±0,07 0,31

АСТ/АЛТ 0,91 ±0,10 0,80 1,03±0,08 0,90

***.р<0,001,** -р<0,01, * -р<0,05.

Сравнение показателей метаболизма в группах с положительным и отрицательным тестом на АШ HCV Ig M достоверных различий не выявило. Активность аланинаминотрансферазы была превышена в 42,80% у пациентов с отсутствием АШ НСУ ^М и в 24,07% случаев у АШ HCV IgM -позитивных пациентов.

Сравнительный анализ метаболических изменений при гепатитах В и С выявил, что в период активной репликации вируса в сыворотке крови у больных гепатитом С значительно выше, чем у больных гепатитом В, содержание билирубина, активность у-глутамилтрансфсразы (+78%; р<0,001), аланинаминотрансферазы (+74%; р<0,001), аспартатаминотрансферазы (+40%; р<0,001), что свидетельствует о более выраженных синдромах цитолиза и желтухи при гепатите С.

Эти данные также свидетельствуют о специфике течения вирусного гепатита С, при котором, очевидно, нарушается важная гомеостатическая роль печени в обеспечении организма структурно-пластическим материалом. В данном случае это проявляется гипохолестеринемическим состоянием у трети обследованных больных. Подтверждением этого служит существенно более низкое содержание в сыворотке крови у больных гепатитом С ЛПНП - основной транспортной формы холестерина. Трудно однозначно интерпретировать этот факт: может это связано с нарушением синтеза апопротеинов в печени или с дефицитом в содержании эндогенного холестерина вследствие недостаточного синтеза в печени в результате поражения вирусом. Мало вероятно, что это - следствие усиленного рецептор-опосредованного захвата тканями для репарации мембранных структур, биосинтеза биологически активных стероидов.

В период ремиссии показатели в группе больных вирусным гепатитом С отличались от показателей в группе больных хроническим вирусным гепатитом В: значения тимоловой пробы были выше почти в 3 раза (р<0,05). Резкое увеличение тимоловой пробы является показателем выраженности диспротеине-мии и нарастания фракции глобулинов как более грубодисперсных белков. Вместе с тем в группе больных гепатитом С обращает внимание превышение

активности у-глютамилтрансферазы в 2,9 раз, аланинаминотрансферазы - в 2,5 раза, аспартатаминотрансферазы - в 2 раза соответствующих показателей сыворотки крови больных гепатитом В, при этом средние значения активности обеих аминотрансфераз у больных гепатитом С выходят за пределы референтных. Как известно, активность изученных трансаминаз отражает уровень базовых метаболических процессов, в частности, белкового обмена. Нарастание активности в сыворотке крови является достоверным показателем не только нарушения проницаемости, но и процесса цитолиза. Особенно значимой является гиперферментемия аспартатаминотрансферазы, две трети активности которой сосредоточено в митохондриях. Поступление в кровь из гепатоцитов является следствием нарушения микроструктуры печени вплоть до субклеточного уровня. Гипербилирубинемия при верифицированном гепатите - специфический признак нарушения нативной структуры печеночной ткани. Результаты проведенного корреляционного анализа показателей обмена в сопоставлении с данными у клинически здоровых обследованных и в динамике течения различных форм вирусного гепатита раскрывают различный тип кооперативного взаимодействия ферментативных и в целом метаболических процессов, выявляя специфику нарушений в организме, которые являются результирующей реактивных воспалительных сдвигов, дисбаланса между скоростью деструкции тканевых структур и их репарации, использованием энергоемких субстратов.

Все эти данные указывают на то, что несмотря на отсутствие выявляемо-сти РНК вируса в крови, при гепатите С структурная целостность мембран ге-патоцитов и функциональная способность печени полностью не восстанавливаются. Поэтому в такой ситуации ремиссию заболевания можно признать только условной. Согласно полученным результатам, вирус гепатита С оказывает более глубокое повреждающее воздействие на печень, в результате чего даже в фазу ремиссии заболевания структура и функция гепатоцитов полностью не восстанавливается в отличие от вируса гепатита В.

Метаболический статус больных острым вирусным гепатитом А, у которых отмечалось преимущественно тяжелое течение заболевания, диагноз был подтвержден наличием АпИ-НАУ ^ М в сыворотке крови (табл. 4).

Таблица 4

Метаболический статус больных вирусным гепатитом А

Показатель Вирусный гепатит А Группа сравнения Нормы ВОЗ

М±т Ме М±т

Глюкоза, ммоль/л 4,3±0,15 4,4 5,00±0,19 3,00-6,00

Общий белок, г/л 75,51±1,11 75,55 73,66±1,15 65,00-85,00

Альбумин, г/л 45,57±1,22 45,07 44,10±0,38 35,00-50,00

а-1-глобулины 4,07±0,45 4,18 4,5±0,45 3,5-6,0

а -2-глобулины 9,31 ±0,62 9,73 8,7±0,12 6,9-10,5

(3-глобулины 12,37±0,76 12,6 9,9±0,67 7,3-12,5

у-глобулины 28,66±1,06* 28,25** 17,12±2,6 12,8-19,0

Общий билирубин, мкмоль/л 246,3±98* 175,15** 10,61±1,45 3,40-22,20

Прямой билирубин, мкмоль/л 91,03±21,16 *** 84,6*** 2,16±0,85 0,86-5,3

у-глютамилтрансфераза, Е/л 202,0±72,97 *** 149,5*** 12,87±1,88 7,00-50,00

Холестерин, ммоль/л 3,65±0,12 3,7 4,19±0,17 3,00-6,50

Аланинаминотрансфераза, Е/л 95,77±84,25 * 680* 17,18±3,06 6,00-42,00

Аспартатаминотрансфера-за, Е/л 362,65±104, с)*** 403*** 23,15±1,74 5,00-40,00

Тимоловая проба, ед 16,89±2,45* ** 18,0*** 1,099±0,89 0,00-4,00

р-липопротеины, ед 3,71±0,72 3,4 3,94±1,06 5,00-5,50

*** -р < 0,001; ** -р<0,01; * -р<0,05.

У пациентов значительно повышено содержание общего билирубина, соотношение фракций билирубина также нарушено (1:4), что свидетельствует не

только о разрушении мембран гепатоцита вследствие воспалительного процесса, но и о нарушении способности печени конъюгировать непрямой билирубин, обладающий большой токсичностью.

Существенно повышена у больных исследуемой группы активность тран-саминаз: активность аланинаминотрансферазы в 40 раз превышает значения группы сравнения и достигает 17-кратного превышения верхней границы референтных значений.

Активность аспартатаминотрансферазы, соответственно в 15 раз выше, чем показатель группы сравнения и имеет 9-крагное превышение верхней допустимой границы нормы. У больных исследуемой группы выявлено также резкое повышение активности являющейся наиболее чувствительным маркером холестаза. Уровень у-глютамилтрансфераз имеет более, чем 16-кратное превышение значений показателя группы сравнения и 4-кратное -верхней границы референтных значений. Это свидетельствует о наличии у больных вирусным гепатитом А в острую фазу заболевания выраженного холе-статического компонента в общем симптомокомплексе заболевания.

Обращает внимание при стабильности важнейших показателей белкового (общий белок, альбумин), углеводного (глюкоза) и липидного обменов (холестерин, р-липопротеины) формирование выраженной диспротеинемии. Наблюдается нарастание уровня гамма-глобулинов (+65%; р<0,05), связанного с этим более, чем 4-кратного увеличения показателей тимоловой пробы, что отражает нарастание выраженности иммунного ответа в ходе острой воспалительной реакции.

Далее мы сопоставили выраженность метаболических изменений у больных вирусными гепатитом С с определяемыми методом ПЦР титражностью и степенью виремии, между которыми прослеживается четкая зависимость (рис.

Рис. 1 Соотношение уровня виремии и титражности (число колий выражено в Е5) Далее мы сравнили результаты определения маркеров вирусных гепатитов В и С, выполненных с помошью иммуноферментного и иммуноэлектрохе-милюминесцентного анализа. В большинстве случаев эти результаты сопоставимы, однако обращает внимание, что в единичных наблюдениях методом ИФА получены отрицательные результаты при определении НВвАв, тогда как при идентификации этого маркера методом иммуноэлектрохемилюминесцент-ного анализа получен положительный результат, что свидетельствует о большей степени надежности последнего метода. Если НВеА выявлялся двумя методами, то НВвАв обнаружен только методом иммуноэлектрохемилюминес-центного анализа. Ложноотрицательные результаты иммуноферментного анализа при определении данных маркеров при титре 1: 10000, возможно, связаны с блокированием ферментативной реакции избытком патогена.

При низкой виремии, при титре 1:1, у больных гепатитом В концентрация альбуминов достигает нижней границы нормы, уровень выходит

за верхнюю границу нормы, уровень не превышает норму, досто-

верно выше значения тимоловой пробы (+70%; р<0,05), активности аланинами-нотрансферазы и у-глютамилтранспептидазы не выходят за пределы референтных значенийй; в то время как активность аспартаттрансаминазы существенно возрастает (+76,3%; р<0,05), уровень гипербилирубинемии невелик (+13,4%; р<0,05) при существенном приросте прямого билирубина (+67,3%; р<0,05) и значительном изменении соотношений значений фракций прямого и непрямого билирубина (1,6:1).

При выраженной виремии с титром 1:10 000 у больных вирусным гепатитом В формируется четко выраженная диспротеинемия: снижение ниже нормы концентрации альбуминов (-11%, р<0,05) и а-глобулинов при нарастании значений р- (+23,6%; р<0,05)и у-глобулинов (+20,1%; р<0,05), при этом тимоловая проба изменяется незначительно.

По сравнению с предыдущей группой у больных с максимально выявленной степенью виремии заболевание протекает с выраженной гипербилиру-бинемией (+110%; р<0,05) при нормальных значениях непрямого билирубина и приросте прямого (+657,5%, р<0,05), изменением соотношений фракций прямого и непрямого билирубина (4,2:1); у них в 2,7 раза выше активность аланина-минотрансферазы, в 2,2 раза - аспартатаминотрансферазы, в 6,1 раз - у-глютамилтрансферазы.

Таким образом, высокая концентрация вируса гепатита В в крови, отражающая, по-видимому, активность возбудителя в гепатоцитах, сопровождается значительной гиперферментемией и диспротеинемией, .четко выраженной ги-пербилирубинемией, что приводит к клиническим проявлениям желтухи.

У пациентов с вирусным гепатитом С выраженность ряда метаболических изменений нарастает в зависимости от концентрации вируса, циркулирующего в крови. Особенно обращает внимание усугубление диспротеинемии и увеличение значений тимоловой пробы.

У больных с максимально выявленной степенью виремии заболевание протекает по сравнению с предыдущей группой с выраженной гипербилируби-немией (+110%; р<0,05) при нормальных значениях непрямого билирубина и

приросте прямого (+657,5%, р<0,05) с изменением соотношений фракций прямого и непрямого билирубина (4,2:1), у них в 2,7 раза выше активность алани-наминотрансферазы, в 2,2 раза - аспартатаминотраисферазы, в 6,1 раз - у-глютамилтрансферазы.

В то же время концентрация как общего, так и прямого билирубина значительно не отличалась при выявляемое™ РНК вируса гепатита С в титрах разведения сыворотки, соответствующих 1:100,1:1000,1:10 000.

Сравнительный анализ биохимических показателей сыворотки крови больных вирусными гепатитами В и С при максимально и минимально выраженной виремии выявил, что при максимальной виремии с титром 1:10 000, при гепатите С эти изменения выражены более значительно: концентрация у-глобулинов выше на 21,7% (р<0,05), в 2,9 раз выше значение тимоловой пробы, в 5,1 раза - уровень активности аланинаминотрансферазы, в 2,2 раза - активности аспартатаминотрансферазы..

При минимально выраженной виремии, при титре 1:1, общими чертами при гепатитах В и С являются нормальный уровень общего билирубина или незначительная гипербилирубинемия при значительном подъеме прямого билирубина; повышенные значения тимоловой пробы. При гепатите С метаболические отклонения более выражены: развивается диспротеинемия с гипоальбу-мин- и значительная гиперферментемия

аланин- и аспартаттрансаминаз; Согласно получен-

ным результатам вирус гепатита С является более агрессивным, чем вирус гепатита В, приводит к развитию значительного метаболического диссонанса даже при минимальной виремии и при нормальных значениях общего билирубина, т.е. безжелтушных формах.

Как и при других количественных исследованиях, надежность выявления маркеров вирусных гепатитов зависит от организации работы по контролю качества исследований, что обеспечивается осуществлением системы мер, включающих внешнюю оценку качества с использованием высококачествен-

ных контрольных материалов, а также внутрилабораторный контроль всех этапов лабораторного анализа.

Реализуя программу внешней оценки качества исследований HBsAg в 63 лабораториях по диагностике вирусных гепатитов, использовали разработанную в ЗАО «Вектор - Бест» панель контрольных сывороток с различным содержанием HBsAg разной субтиповой специфичности. Количество лабораторий, правильно выполнивших все задания программы внешней оценки качества определений HBsAg в 4 цикле составило 30 %, в 5 цикле - 50 %. Как показали результаты анализа образцов контрольной панели, существенной разницы в результатах исследований, выполненных с использованием разных тест-систем для выявления HBsAg, нет.

Мы проанализировали результаты определения HBsAg в образцах с минимальной концентрацией HBsAg, равной 0,125 у.е.. и максимальной, составляющей 0,5 у.е. (табл.5). Наименьшее число ошибок было при определении отрицательных образцов (98 - 100 %) и образцов с высоким содержанием антигена - 0,5 у.е. (83 % - 85 %). Наибольшее число ошибок было при определении антигена HBsAg в низких концентрациях - 0,125 у.е. (45 % - 48 %).

Таблица 5

Результаты выявления HBsAg в образцах крови контрольной панели

Тип HBsAg и концентрация (у.е./мл = нг/мл) Процент правильных ответов в 4 • и 5 цикле

отрицательная 98-92

аулу 2,0,5 у.е. 85-100

ау\уЗуагВ- 0,125 у.е. 48-70

ауш 2,0,25 у.е. 65-88

отрицательная 100-79

ауш Зуаг В, 0,5 у.е. 83 -100

а/№ 2,0,125 у.е. 45-79

ауш Зуаг В, 0,25 у.е. 65-96

Сравнительный анализ обнаружения HBsAg с помощью ИФА разными лабораториями показал, что правильный ответ зависит, в основном, от концентрации антигена и мало зависит от субтипа. При концентрации 0,5 у.е. выяв-ляемость составляет 100 %. Наиболее низкий процент положительных ответов имел место при определении HBsAg в концентрации 0,125 у.е. (от 70 % до 79 % при разных типах вируса). При исследовании отрицательных образцов процент правильных ответов составил 79 - 92 %. Это обуславливает актуальность осуществления контроля правильности в диапазоне низких концентраций.-

Ответы на вопросы тестового задания показали, что правильное выявление положительных образцов контрольных панелей связано с использованием одноразовых емкостей для растворов конъюгата и цитратно-буферной смеси; с включением стадии кипячения для обработки многократно используемых наконечников; созданием оптимального температурного режима для обеспечения нормального протекания ферментативной реакции; обработкой внутренних емкостей вошера 70 % этиловым спиртом. Обязательным условием получения правильных результатов является соответствие результатов исследования контролей указанным в паспорте значениям. Для избежания ошибок на аналитиче-" ском этапе необходимо применять дистиллированную воду с определенным значением рН; проводить метрологическую поверку автоматических пипеток.

О достаточной воспроизводимости проведённых серологических исследований с использованием в работе тест-систем и контрольных материалов фирмы «Вектор-Бест» свидетельствуют результаты проведения внутрилабора-торного контроля качества. Были построены контрольные карты Levey -Jennings по относительному показателю, по коэффициенту позитивности, рассчитанному как отношение оптической плотности контрольного образца к величине cut off или ОП вко/ОП крт- Коэффициент вариации при определении HBsAg был равен 6,02% и при определении анти- HCV 4,32 %, что, согласно Приказу №45 МЗ РФ от 07.02.2000, находится в допустимых пределах.

Анализ контрольных карт не выявил случайных и систематических по-

грешностей, что позволяет рекомендовать их использование для проведения текущего внутрилабораторного контроля.

Таким образом, совершенствование диагностики вирусных гепатитов, своевременное и правильное выявление их маркеров, зависит от целого комплекса мероприятий, включающего использование чувствительных и специфичных тест-систем, в том числе и отечественного производства, регулярный внутрилабораторный контроль качества с построением контрольных карт и использованием контрольных материалов с учетом регионального распространения разных субтипов вирусов гепатитов. Важным условием получения хороших результатов при определении генетического материала вирусов и их маркеров является использование высокочувствительного оборудования. Меньше лож-ноположительных и ложноотрицательных результатов получено при проведении исследований методом иммуноэлектрохемилюминесценции. Ложноотрица-тельные результаты при определении HBsAg методом иммуноферментного анализа могут быть связаны как с мутацией генов, контролирующих выработку данного антигена, так и с эффектом «больших доз», когда реакция заблокирована избытком патогена. Большую роль играет строгое соблюдение условий проведения исследований. В результате работы обнаружены наиболее частые источники случайных и систематических погрешностей, устранение которых улучшает выявляемость контрольных образцов с наименьшим содержанием вируса. Проведенные исследования показали важность адекватной оценки метаболического ответа организма на инфицирование вирусами гепатитов А,В,С с учетом фазы болезни и биологических свойств возбудителя, что открывает перспективы своевременной диагностики, осуществления мониторинга этих заболеваний и оценки эффективности лечения.

Детальный анализ ошибок аналитического и преаналитического этапов позволили выявить их основные причины. В случае выявления случайных ошибок(1 з^.'-К

- недостаточная промывка, обусловленная уменьшением их числа;

- сокращение времени и снижение температуры инкубации;

- увеличение времени хранения рабочего раствора субстрата;

- нарушения в работе приборов, колебания напряжения электричества;

- использование реагентов из разных серий тест-системы;

- ошибки в расчете ОП Крит.

- неправильная длина волны спектрофотометра;

- проблемы с чистотой посуды и наконечников;

- неаккуратная работа с автоматической пипеткой.

В случае выявления систематических ошибок (4 ¡$ ;10 х; 22!;):

• использование некалиброванных пипеток;

- контаминация реагентов грязной пипеткой;

- изменение качества воды;

- нарушение сроков и температурных условий хранения тест-систем;

- нарушение работы вошера (засорение системы промывки);

- неправильная длина волны спектрофотометра;'

- проблемы с чистотой посуды и наконечников;

- неаккуратная работа с автоматической пипеткой.

ВЫВОДЫ

1. При выполнении алгоритма иммунодиагностики и дифференциации острого и хронического вирусных гепатитов А, В, С установлена более высокая диагностическая информативность в оценке иммунного ответа (АШ-НАУ ^ М, АМ-НАУ ^ О, АпИ -НБйАв, АпИ -HBcAg, АпИ -HBcAg ^ М, АМ -НБеА ^ О) и выявляемости патогенов НБвАв, НБеАв методов полиме-разной цепной реакции и электрохемилюминисцентного анализа.

2. Выявлена взаимосвязь между выраженностью виремии и метаболическими сдвигами при гепатитах В и С. При низкой концентрации ДНК вируса В содержание метаболитов и активность ферментов, за исключением аспартата-минотрансферазы, содержание белковых фракций находятся в границах референтных величин. При высокой виремии отмечается диспротеинемия за счет снижения содержания альбумина и увеличения акти-

вация ферментов аланин- и аспартатаминотрансфераз, гипербилирубинемия за счет фракции прямого билирубина.

3. Показано, что гепатит С даже при минимальных значениях виремии проявляется более глубокими структурными и функциональными нарушениями гепатоцитов, чем гепатит В, что проявляется высоким уровнем активности аланинаминотрансферазы, глутамилтрансферазы даже при нормальных величинах общего билирубина. При виремии свыше 6,03 Е5, по данным количественного метода ПЦР, соответствующей титру 1:10000, характерна выраженная диспротеинемия, значительно увеличенная тимоловая проба, что служит признаком неблагоприятного прогноза возможности исхода заболевания в хроническую форму. Данные метаболические нарушения сохраняются и в фазу ремиссии при отсутствии репликации вируса.

4. Представлена метаболическая верификация вирусных гепатитов А, В, С, обоснованная параллельным проведением алгоритма иммунодиагностики и изучением белоксинтезирующей способности печени, показателей белкового, углеводного, липидного, пигментного обменов, маркеров повреждения гепатоцитов. Установлена специфика структурообразования сыворотки крови, отражающая характер метаболического ответа, обусловленного молеку-лярно-биологическими свойствами возбудителя. Характер метаболических изменений в фазу ремиссии вирусных гепатитов свидетельствует об усилении интеграции белкового и углеводного обменов как важнейшего элемента стабилизации обменных процессов в реализации ремиссии заболевания.

5. Определено, что в специализированных лабораториях по определению НВв^ правильное выявление отрицательных образцов контрольных панелей составляет 70%-100%, положительных с содержанием HBsAg 0,5 у.е. -83%-100%, с содержанием 0,125 у.е. 45%-70%. Основными источниками ошибок на аналитическом этапе являются несоблюдение температурного режима, необходимого для проведения ферментативных реакций, времени инкубации, отсутствие одноразовой лабораторной посуды, недостаточная промывка.

6. Качество иммуноферментных методов выявления маркеров вирусов В (HBsAg) и антител-HCV, апробированное тест - системами «РекомбиБест антиВГС » и «Вектогеп B-HBs -антиген-стрип» показало эффективность проведения внутрилабораторного контроля качества исследований HBsAg и анти-НВС методом ИФА с построением контрольных карт по коэффициенту позитивности -отношению ОП вко/ОП крит.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Наряду с широким использованием современных диагностических технологий целесообразно сохранить в диагностической панели информативные, легко воспроизводимые методы, в частности, тимоловую пробу, которая может быть использована для экспресс-диагностики, а также мониторинга лечения, прогнозирования течения, возможности хронизации процессов. Низкие значения тимоловой пробы в разгар болезни в период репликации вируса, при высокой виремии свидетельствует о слабом антительном ответе, иммуносупрессии, что служит предпосылкой исхода заболевания в хроническую форму.

2. Для дифференциальной диагностики вирусных гепатитов целесообразно проводить метаболическую верификацию в случае отсутствия ПНР и ИФА. Подтверждением гепатита А является высокая гипербилирубине-мия, гиперферментемия, тимоловая проба; гепатита В - повышенная тимоловая проба при минимальной виремии и отсутствие ее повышения при максимальной виремии; гепатита С - выраженная диспротеинемия и гиперферментемия независимо от фазы заболевания.

3. Для повышения эффективности и точности лабораторной диагностики вирусных гепатитов методом ИФА при проведении внешнего и внутри-лабораторного контроля качества рекомендуется использование нового поколения тест-систем и контрольных материалов отечественных производителей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Исследование ротовой жидкости в оценке активности воспалительного процесса// Материалы V международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке». - Москва: РУДН, 2004. -С.85. (Соавторы: Н.И. Гергель, И.Ф.Сидорова, Ю.А.Косякова, И.Е. Гильмиярова).

2. Преимущества определения гормонов в ротовой жидкости на электрохе-милюминисцентном иммуноанализиторе // Материалы V Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке». -Москва: РУДН, 2004. - С.85-86. (Соавторы: Н.И. Гергель, А.В. Бабичев, Ю.А.Косякова, И.Л.Блок).

3. Лабораторное обеспечение практических занятий по биохимии. - Самара: «Содружество Плюс»;ГОУВПО «СамГМУ», 2004.-272 с. (Соавторы: Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, А.В. Бабичев, Н.И. Гергель)

4. Логика межмолекулярных взаимоотношений - основа жизнеобеспечения организма / Ф.Н.Гильмиярова, В.М. Радомская, А.В. Бабичев - Материалы IX Международной научной конференции «Здоровье семьи XXI век». - Далянь (Китай), Пермь (Россия), 2005. - С. 82-83 (Соавторы: Ф.Н.Гильмиярова, В.М. Радомская, А.В. Бабичев, Н.И. Гергель, Л.Н. Виноградова, О.Ю. Кузнецова).

5. Метаболический статус больных вирусным гепатитом В // Материалы межрегиональной научно-практической конференции биохимиков «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины». -Самара, 2005. - С. 229-235 (Соавторы: О.Ю. Кузнецова, Ю.А. Косякова, Н.А. Преснякова, Л.С. Карслян, Ю.Г. Лихарева).

6. Показатели метаболизма в крови больных хроническим гепатитом С с разным уровнем виремии // Материалы межрегиональной научно-практической конференции биохимиков «Новая идеология в единстве

фундаментальной и клинической медицины». - Самара, 2005. - С. 213219 (Соавторы: Ю.В. Мякишева, Л.С. Карслян, И. А. Зубова).

СИДОРОВА ИРИНА ФЛУРОВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ВЕРИФИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ А, В, С

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 11.04.2005 г. Формат 60x85/16 Бумага офсетная. Объем 1,8 услов. печ. л. Заказ № 765 Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ООО «Волга Документ» Г. Самара, ул. Молодогвардейская, 209, тел. (8462) 33-64-06

( 'm

V V > 7/--

2 2 АПР 2005 . 249

Актуальность. Вирусные гепатиты, занимая одно из первых мест в инфекционной патологии человека, являются актуальной проблемой здравоохранения, имеют высокую социальную, экономическую, эпидемиологическую значимость. За последние годы заболеваемость вирусными гепатитами возросла, преобладают среди заболевших пациенты молодого репродуктивного возраста. Из гепатитов, вызываемых вирусами гепатита А,В,С,Д,Е,0,ТТ наиболее высока частота встречаемости гепатитов А,В,С (Суздальцев A.A. с соавт., 2003).

В мире проживает около 500 млн человек, инфицированных вирусом гепатита С (HCV). Особенностью HCV-инфекции является ее преимущественно бессимптомное течение. Персистенция вируса гепатита С может длится многие годы, приводя к развитию хронического гепатита С (более 85%), цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%). Частота формирования хронической патологии печени, вызванной HCV, по крайней мере, в 10 раз выше, чем при вирусном гепатите В. Изучение течения HBV-инфекции выявило, что у 5-15% заболевших заболевание рецидивирует, а у 2-6% пациентов прогрессирует в цирроз печени (Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999; Chu С.М. et all., 2004).

Проблема вирусных гепатитов создает впечатление неисчерпаемости в силу высокой мутируемости возбудителя и относительной изменчивости организма человека, проживающего в экологически трансформируемой окружающей среде. Актуальным является поиск аргументированных диагностических критериев вирусоносительства, диагностика безжелтушных, стертых форм.

В настоящее время с учетом множества известных и появления мутант-ных штаммов вирусов, возбудителей заболевания, проводится углубленное изучение иммунологических, гистопатологических, клинических особенностей HBV, HCV- инфекции, переосмысление методических подходов к осуществлению эпидемиологической диагностики, выявлению и обоснованию причин хронизации заболевания.

Использование методов генодиагностики, в частности, полимеразной цепной реакции, позволяет провести количественную оценку HBV, HCV в исследуемом биологическом материале. Наряду с общим цитопатическим эффектом всех возбудителей гепатита, проявляющимся поражением печени, показано, что HCV является также и лимфотропным вирусом. Очевидно, это не исключает и другой локализации вируса, более широкого спектра его повреждающего действия (Koenig A.S. et al., 1989; McGowan J.E. 1995; Kenny-Walsh

E., 1999; Kronenberg В. et al, 2000; Tseliou P. et al., 2000; Laperehe S. et al.,2001; Valentine-Thon E. et al., 2001).

Как известно, различия в клинической картине вирусных гепатитов достаточно неспецифичны, а эпидемиология, патогенез, отдаленные последствия вызываемых ими заболеваний не одинаковы. Это обуславливает исключительную ценность результатов лабораторных исследований, поскольку они позволяют дифференцировать этиологический фактор, фазу заболевания, анамнестические и активные формы (Рахманова А.Г. с соавт., 2001; Gonsales Junior

F.L.1998; Bartenschlanger R., Lohmann V., 2004; Hwang S.J. et al., 2000). Представляет интерес вопрос о взаимосвязи выраженности виремии с характером сдвигов в показателях обмена, выявление специфики метаболического статуса при вирусных гепатитах с различным этиологическим фактором. Совершенствование диагностического процесса включает в качестве обязательного условия проведение внешней оценки качества и внутрилабораторного контроля качества (Гаранина E.H.,1997; Назареенко Г.И., Кишкун A.A.,2001; Меньшиков В.В., 1998; 2002; Мошкин A.B., Долгов В.В., 2004; Bull M.J., 1992). Актуальным является разработка новых чувствительных тест-систем и контрольных материалов для определения спектра маркеров вирусных гепатитов методом ПЦР, ИФА, иммуноэлектрохемшпоминесцентного анализа (Кудрявцева E.H. с соавт.,2002; Исаева О.В. с соавт.,2004; Нетесова И.Г. с соавт.,2004; Садикова Н.В. с соавт., 2004).

Цель настоящего исследования заключается в выяснении характера метаболического ответа на различные молекулярно-биологические свойства вирусов гепатитов А,В,С в повышении эффективности и качества диагностики.

Задачи:

1. Идентифицировать вирусы гепатитов А,В,С с помощью различных диагностических методов, оценить информативность и выявляемость патогенов с использованием полимеразной цепной реакции, иммуноферментного, им-муноэлектрохемилюминесцентного методов.

2. Изучить характер метаболического ответа в различные фазы заболевания гепатитом А,В,С в период репликации и отсутствии РНК и ДНК вирусов.

3. Оценить взаимосвязь между выраженностью виремии и особенностями метаболического статуса у больных с гепатитами А,В,С по показателям угле-водно-липидного, белкового обменов.

4. Сопоставить функциональное состояние печени при гепатитах А,В,С, оценив белоксинтезирующую, детоксикационную способность, глубину гисто-патологических нарушений.

5. Исследовать тип структурообразования сыворотки крови в зависимости от молекулярно-биологических свойств вирусов гепатитов А,В,С и характера метаболического ответа на них.

6. Апробировать систему контроля качества диагностики гепатитов В и С с использованием новых тест-систем и контрольных материалов в различных лабораториях региона, проанализировать результаты и выявить наиболее типичные ошибки на преаналитическом и аналитическом этапах.

Научная новизна. Впервые получены данные, характеризующие диапазон метаболических нарушений при гепатитах А, В, С в различные фазы патологического процесса в случаях репликации и при отсутствии РНК и ДНК вирусов. Получены новые сведения, раскрывающие этиопатогенетическую роль степени выраженности виремии в индукции метаболических нарушений в организме больных. Раскрыта взаимосвязь между молекулярно-биологическими свойствами возбудителей гепатитов, выраженностью виремии и характером дисметаболических расстройств при гепатитах В и С. При низкой концентрации ДНК-вируса В наблюдается слабовыраженная гиперферментемия аспарта-таминотрансферазы. При высокой виремии отмечается диспротеинемия за счет снижения содержания альбумина и увеличения р и у-глобулинов, высокая тимоловая проба, резкая активация ферментов, гипербилирубинемия за счет фракции прямого билирубина.

При гепатите С даже при минимальной виремии проявляются более глубокие структурные и функциональные нарушения гепатоцитов, чем при гепатите В, о чем свидетельствует высокий уровень активности аланин-аспартатаминотрансфераз, у- глутамилтрансферазы даже при нормальных величинах общего билирубина. По данным количественной оценки ПЦР при виремии свыше 6,03 Е5, соответствующей титру 1:10000, выраженная диспротеинемия отсутствует, тимоловая проба в границах референтных величин, что прогностически неблагоприятно. Выявленные особенности течения гепатитов, вызванных различными патогенами, могут служить для метаболической верификации гепатитов, прогнозирования течения и исхода заболевания.

Впервые получена морфологическая картина сыворотки крови больных гепатитом А,В,С. Показано, что изменение физико-химических параметров, соотношения липофильных и гидрофильных метаболитов, нарушение баланса ионизированных интермедиатов при различных видах гепатитов проявляется в изменении белковой и солевой зоны, появлении характерных для каждого гепатита вариантов структурирования фаций.

Установленное нарушение белоксинтезирующей способности, диспротеинемия, снижение содержания альбумина, детоксикационной функции печени, целостности гепатоцитов, о чем свидетельствует гиперферментемия, повышение фракции прямого билирубина даже при безжелтушных формах в целом служит подтверждением того, что вирусные гепатиты являются системным заболеванием организма с преимущественным поражением печени.

Новым является аргументирование эффективности применения высокочувствительных тест-систем и контрольных материалов для проведения качества диагностики вирусных гепатитов с использованием методики ИФА.

Научно-практическая значимость. Получен новый блок сведений, раскрывающих взаимосвязь характера и глубины метаболических нарушений при гепатитах А, В, С с молекулярно-биологическими свойствами патогенов, количеством антигенов в крови. Сравнительное изучение метаболического статуса больных с гепатитом В и С с титром антигена 1:1 и 1: 10000 показало депрессию белоксинтезирующей способности, иммуносупрессию при высокой вире-мии, что косвенно диагностируется с помощью тимоловой пробы, свидетельствующей о слабо выраженном антительном ответе, отсутствии прироста у-глобулинов.

Возможность метаболической верификации различных форм гепатита обеспечивает базу данных для повышения точности диагностики вирусных гепатитов, улучшения эффективности работы клинико-диагностических лабораторий, не располагающих высокими научно-диагностическими технологиями. Проведенная нами лабораторная диагностика вирусных гепатитов с использованием ПЦР, ИФА, иммуноэлектрохемилюминесцентного анализа на одних и тех же образцах крови больных и сравнительный анализ выявляемости вирусов гепатитов, базирующийся на определении РНК и ДНК-вируса, а также на изучении антительного ответа позволили прийти к заключению о том, что максимальная выявляемость установлена для ПЦР и иммуноэлектрохемилюминес-центного анализа, хотя ИФА является более экономичным способом.

Чтобы избежать ложноположительных и ложноотрицательных результатов и выяснить причины ошибок при выполнении исследований, целесообразно организовать проведение внутрилабораторного контроля качества определения HBsAg и анти-НСУ-антител методом ИФА с помощью контрольных карт, построенных по расчетному коэффициенту позитивности для данного метода, применяя тест-системы и контрольные материалы отечественных производителей, что важно для диагностики и мониторинга течения заболевания, оценки эффективности терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Аргументирование диагностической информативности в идентификации вирусов гепатитов А, В, С методов полимеразной цепной реакции, иммуноэлек-трохемилюминисцентного и иммуноферментного анализа в различные фазы заболевания; взаимосвязь характера метаболического ответа с молекулярно-биологическими свойствами патогенов.

2. Степень нарушения белоксинтезирующей, обезвреживающей функции печени, глубины цитопатологического процесса в зависимости от выраженности виремии.

3. Специфика структурообразования - интегральный тест, отражающий особенности физико-химических характеристик, соотношение высоко- и низкомолекулярных соединений в ионизированной и молекулярной форме в сыворотке крови больных вирусными гепатитами А,В,С.

4. Информативность использования новых тест систем, материалов для проведения контроля качества диагностики вирусного гепатита С по оценке антительного ответа методом ИФА, гепатита В - по изучению уровня антигенов и антител. Преимущественное распределение отдельных штаммов возбудителя гепатитов по региону, типичные диагностические ошибки в лабораторной практике.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ. Результаты диссертационного исследования внедрены в лекционный материал на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государственного медицинского университета, в работу клинико-диагностической лаборатории клиник Самарского государственного медицинского университета, инфекционного, терапевтического отделений, клиникодиагностической лаборатории городской клинической больницы №2 им. H.A. Семашко г.Самары.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы представлены в материалах Пятой международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2004), Международного семинара по проблемам пожилых «Самарские лекции» (Самара, 2004), IX Международной научной конференции «Здоровье семьи XXI век» (Далянь,2005), совместном заседании Самарского отделения Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, кафедр общей бионеорганической и биоорганической химии и фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государстве'нного медицинского университета и Самарского отделения научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Самара, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 работ. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объекту и методам исследования, 3-х глав собственных данных, заключения, выводов, практически рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 172 страницах, иллюстрирована 14 рисунками, содержит 36 таблиц. В работе использовано 216 литературных источников, из них 116 отечественных и 100 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. При выполнении алгоритма иммунодиагностики и дифференциации острого и хронического вирусных гепатитов А, В, С установлена более высокая диагностическая информативность в оценке иммунного ответа (Апй-НАУ ^ М, Апй-НАУ в, Апй -НВбА§, Апй -HBcAg, Апй -HBcAg ^ М, Апй -HBeAg ^ в) и выявляемое™ патогенов HBsAg, HBeAg методов полимеразной цепной реакции и электрохемилюминис-центного анализа.

2. Выявлена взаимосвязь между выраженностью виремии и метаболическими сдвигами при гепатитах В и С. При низкой концентрации ДНК вируса В содержание метаболитов и активность ферментов, за исключением ас-партатаминотрансферазы, содержание белковых фракций находятся в границах референтных величин. При высокой виремии отмечается дис-протеинемия за счет снижения содержания альбумина и увеличения Р и у-глобулинов, активация ферментов аланин- и аспартатаминотрансфераз, гипербилирубинемия за счет фракции прямого билирубина.

3. Показано, что гепатит С даже при минимальных значениях виремии проявляется более глубокими структурными и функциональными нарушениями гепатоцитов, чем гепатит В, что проявляется высоким уровнем активности аланинаминотрансферазы, у- глутамилтрансферазы даже при нормальных величинах общего билирубина. При виремии свыше 6,03 Е5, по данным количественного метода ПЦР, соответствующей титру 1:10000, характерна выраженная диспротеинемия, значительно увеличенная тимоловая проба, что служит признаком неблагоприятного прогноза возможности исхода заболевания в хроническую форму. Данные метаболические нарушения сохраняются и в фазу ремиссии при отсутствии репликации вируса.

4. Представлена метаболическая верификация вирусных гепатитов А, В, С, обоснованная параллельным проведением алгоритма иммунодиагностики и изучением белоксинтезирующей способности печени, показателей белкового, углеводного, липидного, пигментного обменов, маркеров повреждения гепатоцитов. Установлена специфика структурообразования сыворотки крови, отражающая характер метаболического ответа, обусловленного молекулярно-биологическим свойством возбудителя. Характер метаболических изменений в фазу ремиссии вирусных гепатитов свидетельствует об усилении интеграции белкового и углеводного обменов как важнейшего элемента стабилизации обменных процессов в реализации ремиссии заболевания.

5. Определено, что в специализированных лабораториях по определению HBsAg правильное выявление отрицательных образцов контрольных панелей составляет 70%-100%, положительных с содержанием HBsAg 0,5 у.е. - 83%-100%, с содержанием 0,125 у.е. 45%-70%. Основными источниками ошибок на аналитическом этапе являются несоблюдение температурного режима, необходимого для проведения ферментативных реакций, времени инкубации, отсутствие одноразовой лабораторной посуды, недостаточная промывка.

6. Качество иммуноферментных методов выявления маркеров вирусов В (HBsAg) и антител-НСУ, апробированное тест - системами «Рекомби-Бест антиВГС » и «Вектогеп В-НВб -антиген-стрип» показало эффективность проведения внутрилабораторного контроля качества исследований HBsAg и анти-НВС методом ИФА с построением контрольных карт по коэффициенту позитивности -отношению ОП вко/ОП крит.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Наряду с широким использованием современных диагностических технологий целесообразно сохранить в диагностической панели информативные, легко воспроизводимые методы, в частности, тимоловую пробу, которая может быть использована для экспресс-диагностики, а также мониторинга лечения, прогнозирования течения, возможности хронизации процессов. Низкие значения тимоловой пробы в разгар болезни в период репликации вируса, при высокой виремии свидетельствует о слабом антительном ответе, иммуносупрессии, что служит предпосылкой исхода заболевания в хроническую форму.

2. Для дифференциальной диагностики вирусных гепатитов целесообразно проводить метаболическую верификацию в случае отсутствия ПЦР и ИФА. Подтверждением гепатита А является высокая гипербилирубине-мия, гиперферментемия, тимоловая проба; гепатита В - повышенная тимоловая проба при минимальной виремии и отсутствие ее повышения при максимальной виремии; гепатита С — выраженная диспротеинемия и гиперферментемия независимо от фазы заболевания.

3. Для повышения эффективности и точности лабораторной диагностики вирусных гепатитов методом ИФА при проведении внешнего и внутри-лабораторного контроля качества рекомендуется использование нового поколения тест-систем и контрольных материалов отечественных производителей.