Идентификация белковых маркеров для прогнозирования злокачественных опухолей желудка

Григорьева, Евгения Сергеевна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Идентификация белковых маркеров для прогнозирования злокачественных опухолей желудка

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Григорьева, Евгения Сергеевна Томск 2012 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.01.12

Автореферат диссертации по медицине на тему Идентификация белковых маркеров для прогнозирования злокачественных опухолей желудка

005054100

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ

ЖЕЛУДКА

14.01.12 - онкология 14.03.03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 1 НОЯ 2012

Томск-2012

005054100

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт онкологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители: Чердынцева Надежда Викторовна

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ "НИИ онкологии" СО РАМН заместитель директора по науке

Берестень Сергей Федорович доктор биологических наук, профессор, ФГБУН ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН старший научный сотрудник лаборатории структуры и функции хроматина

Официальные оппоненты: Кологривова Елена Николаевна,

доктор медицинских наук, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, профессор кафедры иммунологии и аллергологии

Юнусова Наталья Валерьевна,

доктор медицинских наук,

ФГБУ "НИИ онкологии" СО РАМН

ведущий научный сотрудник лаборатории

биохимии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии им. H.H. Петрова" Минздравсоцразвития России, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «_»_2012 г в_часов на заседании

Диссертационного Совета Д 001.032.01 при ФГБУ НИИ Онкологии СО РАМН по адресу: 634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский Институт Онкологии" СО РАМН по адресу: 634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5

Автореферат разослан «__»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д-р мед. наук, профессор

И.Г. Фролова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности на планете, составляя более 25% случаев всех смертей в развитых странах. Рак желудка (РЖ) остается одним из лидеров по показателям смертности среди больных со злокачественными новообразованиями во всем мире, несмотря на снижение показателей заболеваемости в развитых странах Европы и в США. Ежегодно в мире регистрируется более миллиона новых случаев заболевания РЖ, более 50 тысяч из которых диагностируется в РФ. В структуре заболеваемости мужского населения России РЖ занимает второе место, женского - третье. Среди больных РЖ высоки показатели одногодичной летальности - 53,2%, а показатели 5-летней выживаемости не превышают 20,2— 21,1%, что объясняется высокой запущенностью процесса при первичной диагностике в связи с отсутствием выраженной симптоматики на ранних стадиях заболевания [Давыдов М.И. и соавт, 2009; Чиссов В.И. и соавт, 2011]. Известно, что ранняя первичная диагностика любых типов злокачественных опухолей и точное прогнозирование их развития существенно повышают вероятность эффективного лечения. Так, у больных РЖ, диагностированном на I стадии заболевания, 5-летняя выживаемость составляет 69,3—75,5%, а при IV стадии — лишь 5,1-6,4% [Чиссов В.И. и соавт, 2011]. В настоящее время в мире не существует скрининговых программ РЖ, а инструментальные методы диагностики РЖ не всегда позволяют распознать заболевание на ранних стадиях, при этом нет общепринятых эффективных молекулярных маркеров ранней диагностики заболевания. Лишь в Японии, где на протяжении нескольких последних декад были внедрены скрининговые программы на основе фото-флюорографии с дальнейшей гастроскопией, удалось в 50% выявлять процесс на ранних стадиях и существенно повысить показатели 5-летней выживаемости [Hamashima С. et al, 2008].

В мировой клинической практике для послеоперационного мониторинга пациентов с РЖ используется ряд сывороточных маркеров (CAI9-9, СА 72-4, РЭА), обладающих умеренной прогностической значимостью примерно лишь для трети всех больных РЖ, однако они имеют высокую перекрестную реактивность и неэффективны для ранней диагностики [Кадагидзе 3. Г., Шелепова В. М., 2008]. Данные международной патентной базы США (http://www.uspto.gov) показывают, что за последние 10 лет заявлено всего несколько патентов по диагностике РЖ на основе идентификации новых молекулярных маркеров, однако в клинической практике запатентованные инновации не применяются, вследствие их низкой эффективности. Остается актуальным и поиск новых прогностических маркеров, использование которых могло бы определять показания к объему оперативного вмешательства.

Известно, что 95% всех опухолей желудка представлены аденокарциномами, которые по гистологическому строению подразделяют на интестинальный и диффузный типы, различающиеся по эпидемиологии, характеру клинического течения и прогнозу [Lauren Р., 1968], а, следовательно, и патогенезу [Rajkumar Т. et al., 2010; Nobili S. et al., 2011]. В частности, установлено, что РЖ диффузного типа чаще возникает у молодых пациентов, склонен к более агрессивному течению и более частому метастазированию [Park do Y.et al, 2010].

патогенеза, определяющих формирование и прогрессию диффузного и интестинального РЖ [Имянитов Е.Н. 2009; Nobili S. et al., 2011]. Это указывает на актуальность исследований по планомерному поиску генов, белковые продукты которых могут служить маркерами ранней диагностики и/или прогноза клинического течения РЖ разных гистологических типов.

В последние годы появились сведения, указывающие на потенциальную диагностическую и/или прогностическую значимость некоторых секреторных белков, таких как NF2, NEK6, INHBA, CDH17, PDCD6, SPARC при РЖ, однако необходимы дальнейшие трансляционные исследования для подтверждения их клинической значимости и определения связи с диффузным или интестинальным типом РЖ [Wang Q. et al, 2012; Cui J. et al, 2011].

Согласно сведениям литературы, достаточно широко для оценки прогноза клинического течения РЖ используется целый ряд иммуногистохимических маркеров апоптоза, пролиферации и клеточной дифференцировки (Ki-67, CDX2, MUC-2, MUC-5, р53, bcl-2) однако следует отметить, что данные различных авторов об информативности маркеров для больных с разными гистотипами РЖ не всегда согласуются между собой [Cletus А., 2010; Barros R. et al., 2011; Kim H.S. et al., 2006; Namikawa T. et al., 2010; Sym S. et al., 2011; Завьялова M.B. и др., 2012], и исследования в этом направлении остаются актуальными, также как и поиск новых прогностических маркеров.

Известно, что злокачественный фенотип формируется в результате изменения экспрессии патогенетически значимых белков, поэтому выявление ассоциированных с РЖ белков, для которых установлены выраженные количественные изменения в опухоли, их идентификация в опухолевых клетках, с учетом внутриклеточной локализации и взаимодействий друг с другом, позволит получить новые знания о процессах регуляции на разных этапах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. При этом возможно как выявление новых протеиновых молекул, вовлеченных в канцерогенез желудка, так и получение новых сведений о функциональной значимости известных белков.

Методы сравнительной протеомики открывают возможность идентификации белковых онкомаркеров, уровень синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто различается в опухолях и нормальных тканях. Этот подход основан на фракционировании белков нормальных и опухолевых тканей, идентификации белков с заметно изменённым уровнем экспрессии в опухолях с использованием масс-спектрометрии и последующем отборе секреторных белков по имеющимся базам данных.

Однако результаты исследований, проводимых различными авторами, с целью выявления маркеров ранней диагностики и прогноза, часто являются противоречивыми, а информативность предлагаемых маркеров низка, при этом практически нет «работающих» дифференциальных критериев разных гистологических типов РЖ. В литературе представлено ограниченное число публикаций по идентификации белков с различной концентрацией в нормальной и озлокачествленной слизистой оболочке желудка, при этом имеет место высокая вариабельность белков, ассоциированных с РЖ, выявленных в разных исследованиях, что может быть обусловлено как методическими особенностями получения белковых экстрактов из тканей, которые могут сказаться на результатах протеомного анализа, так и популяционными (этническими) отличиями обследованных выборок больных. В целом картина изменения протеома при

аденокарциноме желудка остается малоизученной, хотя для ряда белков показано значительное повышение уровня их синтеза при РЖ [Cheng Y. et al., 2007; Yoshihara Т. et al, 2006; Li et al., 2008; Nobili S. et al., 2011; KosevarN. et al., 2012].

Выявление различных белков, вовлеченных в механизмы формирования интестинальной или диффузной форм РЖ, различающихся по тяжести клинического течения, позволит, во-первых, проводить раннюю диагностику у лиц групп «высокого онкологического риска», во-вторых, при диагностике на ранних стадиях, когда макроскопически невозможно определить тип опухоли (при наличии ассоциированных с той или иной формой РЖ белковых маркеров) прогнозировать клиническое течение заболевания, и соответственно, дифференцированно подходить к выбору тактики лечения. При благоприятном прогнозе можно оптимизировать объем операции, что позволит уменьшить уровень хирургического и анестезиологического стресса и обеспечить снижение риска осложнений, связанных с расширенным объемом лимфодиссекции.

Актуальность работы обусловлена немногочисленностью и неоднозначностью имеющихся в мировой литературе сведений о молекулярных механизмах формирования и прогрессии РЖ различных гистологических типов, отсутствием внедренных в клиническую практику информативных маркеров ранней диагностики и прогноза течения заболевания.

Цель работы: идентификация потенциальных белковых маркеров, ассоциированных с РЖ, на основе методов протеомного и биоинформатического анализа, и оценка их прогностической значимости.

Основные задачи исследования

1. Поиск и идентификация потенциальных протеомных маркеров РЖ различных гистологических типов на основе метода 20--ллсктрофорсза, с последующим применением метода MALDI-TOF спектрометрирования.

2. Поиск потенциальных прогностических маркеров РЖ биоинформатическими методами с помощью баз данных Oncomine, dbEST, SAGE.

3. Валидация отобранных потенциальных маркеров со стабильным повышением уровня экспрессии методами ПЦР с обратной транскрипцией и вестерн-блот анализа с использованием собственной коллекции образцов опухолей желудка.

4. Исследование локализации ассоциированных с РЖ белков в клетках опухолей диффузного и кишечного типов и оценка связи их экспрессии с клинико-патологическими характеристиками процесса.

5. Исследование связи экспрессии выявленных белков в опухоли с гематогенным метастазированием у больных с диффузным и кишечным типами РЖ с известными отдаленными результатами лечения.

6. Получение высокочувствительных антител для детекции выявленных белков в биологических образцах, как основы для создания диагностической тест-системы.

Научная новизна

В настоящем исследовании выявлены новые белки, ассоциированные с РЖ, экспрессия и синтез которых стабильно повышены в опухолевой ткани по сравнению с неозлокачествленной слизистой.

С целью повышения эффективности протеомного анализа предложен оригинальный метод получения растворимой фракции минорных (низкокопийных) белков из тканей, позволяющий увеличить разрешающую способность Ю-электрофореза, за счет удаления высококопийных структурных белков.

Впервые проведен сравнительный протеомный анализ опухолей желудка в российской популяции, выявлены потенциальные белковые маркеры, ассоциированные с РЖ.

Идентифицированы белки, уровень экспрессии которых существенно различается в опухолях диффузного и интестинального типа, что свидетельствует об их патогенетическом значении в формировании новообразований разных гистотипов.

Впервые показаны различия в экспрессии цитокина из группы иммунофилинов РИА в опухолях желудка интестинального и диффузного типов и выявлена связь отсутствия его белковой экспрессии в клетках опухоли с гематогенным метастазированием у больных с диффузным типом РЖ.

Впервые получены данные о существенном снижении экспрессии гена фермента альдо-кеторедуктазы АКЛ1В10, вовлеченного в метаболизм ретиноевой кислоты, в опухолях желудка по сравнению с немалигнизированной тканью.

Показана прогностическая значимость экспрессии белка АКК1В10 в отношении гематогенного метастазирования для опухолей желудка интестинального типа.

Научно-практическая значимость

Полученные на основе биоинформатического анализа данные о стабильном повышении целого ряда белков в опухолях желудка по сравнению с немалигнизированной слизистой являются основой для исследования их патогенетической значимости при раке желудка различных гистологических типов.

Полученные в работе данные о различиях в выраженности экспрессии РР1А в опухолях желудка диффузного и интестинального типов и о прогностической значимости экспрессии РР1А для новообразований диффузного типа свидетельствуют о вовлечении указанного цитокина в патогенез РЖ диффузного типа.

Белок РР1А, обладающий прогностической значимостью при раке желудка диффузного типа, может быть внедрен в клиническую практику в качестве дополнительного прогностического маркера.

Полученные поликлональные антитела к белку АКШВЮ, для которого показана взаимосвязь с отдаленным метастазированием у больных РЖ интестинального типа, являются основой для создания тест-системы с целью детекции АКШВЮ в качестве прогностического маркера.

Положения, выносимые на защиту

1. Использование комплексного подхода на основе сравнительного протеомного анализа и биоинформатического поиска позволяет выявить гены/белки, ассоциированные со злокачественными новообразованиями желудка.

2. Сформированная панель потенциальных белковых маркеров в российской популяции больных РЖ является основой для изучения их прогностической значимости и роли в патогенезе РЖ.

3. Идентифицированные белки иммунофилин PPIA и альдокеторедуктаза AKR1B10 обладают прогностической значимостью для диффузного и интестинального типов РЖ соответственно в отношении гематогенного метастазирования.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на Российско-Тайваньском форуме "Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии" (Томск, 2009), V-VI Региональной конференции молодых ученых-онкологов им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии" (Томск, 2010, 2011), международной конференции "Опухоль и организм: современные аспекты старой проблемы" (Киев, Украина, 2010), VIII ежегодной международной конференции "Будущее протеомики" (Сан-Франциско, США, 2012), конференции по фундаментальной онкологии "Петровские чтения -2012" (Санкт-Петербург, 2012).

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (08-04-13705-офи_ц, 09-04-99072-р_офи, 09-04-90729-мобст), Международного научно-технического центра (#3909), Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт № 02.740.11.0769 от 12.04.2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, отражающих основные положения диссертации, из них 5 журнальных статей в рецензируемых научных журналах и 7 тезисных работ в материалах региональных, всероссийских и международных съездов и конференций. Получено положительное решение о выдаче патента "Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка". (Авторы: Завьялова М.В., Перельмутер В.М., Степанов И.В., Вторушин C.B., Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Афанасьев С.Г., Августинович A.B., Савенкова О.В., Григорьева Е.С., Берестень С.Ф., Волкоморов В.В.) Приоритет 2011134537 от 17 августа 2011 г. Получено свидетельство о государственной регистрации базы данных №2012620818 от 22 августа 2012 г. "База данных клинико-патологических параметров пациентов с диагнозом рак желудка". (Авторы: Чердынцева Н.В., Григорьева Е.С., Афанасьев С.Г., Иванова A.A., Родичева Н.С., Перельмутер В.М., Вторушин C.B., Завьялова М.В., Степанов И.В., Гервас П.А., Бычков В.А.).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты. Исследования проведены на клиническом материале больных с морфологически подтвержденным первично-диагностированным РЖ, которые были разделены на 2 группы:

1 группа - для оценки генной и белковой экспрессии в парных образцах опухолевой ткани и нормальной слизистой желудка, включала 45 больных РЖ (27 больных с кишечным, 18 с диффузным типом), получавших лечение в клинике ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН в 2008-2011 гг, средний возраст 58,3±1,5 лет, из них 26 (60%) мужчин, 19 (40%) женщин. Материалом для исследования служили замороженные парные образцы нормальной слизистой и опухолевой ткани желудка от каждого пациента, полученные при оперативном вмешательстве.

2 группа - для оценки прогностической значимости белков PPIA и AKR1B10, включала 107 больных РЖ (64 больных с кишечным, 43 с диффузным типом), для которых известны отдаленные результаты лечения (рецидивирование, отдаленное метастазирование) с глубиной наблюдения от 1 до 6 лет. Материалом для исследования служили срезы ткани из парафиновых блоков операционного материала, приготовленных стандартными методами.

Гистологический тип РЖ устанавливался согласно классификации, предложенной Lauren Р. (1965).

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288), получено разрешение этического комитета института.

Биоинформатический анализ. Поиск потенциальных белковых онкомаркеров РЖ проводили с использованием транскриптомной базы данных Oncomine в коллекции образцов опухолей желудка Чена (Chen Gastric Collection), а также баз данных dbEST (Expressed Sequence Tag: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) и SAGE (Serial analysis of gene expression: http://cgap.nci.nih.gov/SAGE).

Протеомный анализ. Образцы, полученные после резекции, максимально быстро замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°С. Замороженный образец (масса образца в среднем 170 мг) помещали в охлажденную жидким азотом гильзу дисмембратора Mikro-Dismembrator U (Sartorius). Образец гомогенизировали при частоте встряхивания 2000 кГц в течение 2 минут. Полученный гомогенат ткани переносили в охлажденные жидким азотом пробирки и хранили при -80°С.

Использовалась модифицированная методика получения белковых экстрактов путем устранения мажорной фракции структурных белков, что повышает чувствительность обнаружения белков, которые могут секретироваться опухолями в кровоток. Использовали 20-электорофорез большого формата на материале замороженных пар образцов опухолевой ткани желудка и нормальной слизистой. На трубку наносили 100 мкг белка и проводили изоэлектрофокусирование в направлении кислого буфера (300 В, 16 ч). Разделение во втором направлении проводили в градиентном полиакриламидном геле (1022%) при 25 мА в течение 16 ч. После электрофореза гели окрашивали солями серебра. Белковые пятна с повышенным уровнем экспрессии в опухоли идентифицировали масс-спектрометрически (MALDI-TOF/TOF).

Оценка генной экспрессии. Для подтверждения стабильного повышения генной экспрессии выявленных белков использовали метод ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Суммарную РНК выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте, образцов опухолевых и нормальных тканей, очистку РНК проводили с помощью набора RNeasy Mini kit ("Qiagen", Германия). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора RevertAid1™ (Ферментас, Литва). ПЦР в реальном времени с кДНК после обратной транскрипции ставили при 2,5 мМ концентрации Mg2+ в режиме 92°С 10 мин, 40 циклов 92°С - 15 сек, 56°С - 30 сек на амплификаторе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Australia).

Последовательность праймеров и зондов (FAM-BHQ) подбирали при помощи программы Oligo Analysis Vector NTI с использованием генетического банка данных www.ncbi.nlm.nih.gov.

Оценка белковой экспрессии. Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка применяли метод вестерн-блот анализа, с использованием коммерческих антител. Белковые экстракты, содержащие 20 мкг белка в 10-15 мкл, подвергали электрофоретическому разделению по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле (10-20%). Для количественной оценки тестируемых полипептидов в качестве белкового стандарта использовали АСТВ (actin В) (ThermoScientific, США). После разделения белки подвергали электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя Mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем проводили хемилюминесцентную детекцию сигнала с помощью набора ECL (GE Healthcare, США).

Иммуногистохимический анализ. Анализ экспрессии белка в клетках опухоли на срезах ткани из парафиновых блоков проводили с использованием коммерческих антител методом ИГХ по стандартной методике. Использованы антитела к PPIA (Sigma-Aldrich, рабочее разведение 1:1200), к AKR1B10 (высокоаффинные моноклональные антитела, полученные в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, чувствительность антител в дот-блоте составила 100 пкг, в Вестерн-блоте - 100 пкг. Использовалось рабочее разведение антител 1:300). Выраженность экспрессии белка определялась по проценту клеток с позитивной цитоплазматической экспрессией изучаемого маркера при большом увеличении микроскопа (х400). Число клеток с позитивной экспрессией изучаемого маркера определялось на 100 клеток в 10 полях зрения при увеличении х400.

Статистическая обработка данных. Обработка полученных данных выполнялась с использованием пакета программ «Statistica 6.0». Сравнение среднего уровня экспрессии генов проводили с помощью непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Для обработки данных, полученных методом ИГХ применялся дисперсионный анализ (ANOVA, ANOVA по Краскелу-Уолессу), критерий у2. Обсуждаются результаты с достоверностью различий при р < 0,05.

Получение антител. Для получения высокоспецифичных антител к белку AKR1B10 нарабатывали рекомбинантный белок в бактериальном штамме-продуценте E.coli — BL21(DE3), проводили его очистку на хроматографической колонке с Ni-NTA агарозной смолой (Qiagen Inc., Chatsworth, USA). Очищенный препарат целевого белка использовался для проведения иммунизации

лабораторных животных по стандартной схеме на базе ФГУП 'Тос. НИИ ОЧБ ФМБА РФ". Из полученных высокоиммунных сывороток с использованием аффинной хроматографии была выделена фракция иммуноглобулинов класса G с наивысшей константой связывания.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Поиск белковых маркеров, ассоциированных с РЖ

1.1. Сравнительный анализ протеомов нормальной и опухолевой тканей желудка методом 2й-электрофореза и MALDI-TOF-спектрометрии

Для идентификации дифференциально экспрессируемых белков проводили разделение белковых экстрактов из парных образцов опухолевой и нормальной ткани (п=15) методом двумерного электрофореза (2-D PAGE). Для увеличения разрешающей способности 20-гель электрофореза использована предварительная экстракция растворимой фракции белков, для удаления мажорных структурных белков. Проведение 20-электрофореза на парных образцах опухолевой и нормальной ткани позволило разделить около 450 белковых пятен в каждом геле. Были выбраны наиболее часто повторяющиеся пятна, интенсивность которых увеличена в опухоли по сравнению с нормой, как минимум в 2 раза, не менее чем в четырёх образцах (Рисунок 1). В ходе сравнительного анализа электрофореграмм выявлено увеличение синтеза 8 белков: ТВ 10, PPIA, CTSD, ТРМЗ, SI00A9, TXN, S0D2, S100A6 (Таблица 1).

А Б

г-/-V

л-25

»mi 50

IS jr — J-J7

- '---- J_ 25 20

4а~- 2 У

| Г — 10l i

.¿Г _

4г

Г _ 15

рН

Рисунок 1 - Фрагменты двумерных электрофореграмм, полученных при разделении белков из нормальной (А, В) и опухолевой (Б, Г) тканей. Цифрами обозначены белки: 1 - ТВ 10, 2 - РР1А, 3 - СТвЭ, 4 - ТРМЗ, 5 - 8100А9

Таблица 1 - Характеристика идентифицированных методом 20-электрофореза _ белков с повышенным содержанием в опухоли желудка_

Название белка Мол. вес, локализация Функция Литературные сведения об ассоциации с РЖ

ТВ10 5кДа цитоплазма Формирование цитоскелета [Оюп Капп А. « а1., 2003]

PPIA 18,0 кДа цитоплазма Фолдинг белков Нет данных

CTSD 44,5 кДа Лизосомы Внеклеточный распад белков [1ке§исЫа М. е1 а1., 2001]

ТРМЗ 32,8 кДа цитоплазма Связывание актиновых филаментов, ассоциация тропонинового комплекса Нет данных

S100A9 13,2 кДа секретируемый Регуляция пролиферации. Ингибирует казеин киназу [ЕМ^ \¥. й а1„ 2002]

TXN 11,4 кД цитоплазма Оксиредуктаза, регулятор клеточного цикла и апоптоза [Оп^ап Т.М. л а!., 2000]

SOD2 24,7 кД митохондрии Оксиредуктаза [Такепо А. е1 а1„ 2008]

S100A6 10,1 кД цитоплазма, ядро, мембрана Регулятор клеточного цикла, пролиферации и дифференцировки [Уаг^ е1 а1„ 2007]

Стабильное повышение уровня синтеза белков PPIA и ТРМЗ в опухолях желудка обнаружено нами впервые, тогда как повышенный уровень синтеза ТВ 10, CTSD, S100A6, S100A9, TXN, SOD2 подтверждается литературными данными (Таблица 1). Мы показали, что повышение уровня синтеза белков TXN и SOD2 происходит в диффузных опухолях заметно чаще, чем в интестинальных. Преимущественная экспрессия белка TXN в опухолях желудка недифференцированного типа (тип, выделяемый в японской классификации, во многом аналогичный диффузным опухолям) описана ранее [Noda N. et al., 2000].

Компьютерный анализ базы данных GeneCards (http://www.genecards.org/) показал, что для большинства белков (ТВ 10, CTSD, ТРМЗ, S100A6, S100A9, TXN, SOD2) характерен средний и высокий уровень экспрессии в нормальных и опухолевых тканях различной природы и, следовательно, эти белки не могут использоваться в качестве специфичных маркеров РЖ.

В качестве потенциального маркера опухолей желудка наиболее перспективным является PPIA, поскольку не показано повышения его экспрессии в нормальной ткани. PPIA локализован в цитоплазме, является одним из представителей семейства иммунофилинов и катализирует реакцию цис-транс изомеризации Х-Pro пептидной связи. Показано, что данный белок участвует в регуляции процессов клеточного роста, дифференцировки и протеолиза [Khromykh L.M. et al., 2007, Li M. et al., 2006]. Показана сверхэкспрессия PPIA в опухолях молочной железы, эндометрия, поджелудочной железы, колоректальном раке, мелкоклеточном раке легкого, что указывает на его вовлечение в канцерогенез и возможную значимость в качестве маркера ранней диагностики [Cecconi et al., 2003: Li Z. et al., 2008; Zheng et al., 2008; Hathout et al., 2002]. При этом выявлены ассоциации его экспрессии с опухолевой прогрессией, свидетельствующие о его возможной прогностической ценности. В мировой литературе практически нет данных об экспрессии PPIA в опухолях желудка. Этот

белок был отобран нами для подтверждения более высокой его генной и белковой экспрессии в опухолях по сравнению с нормальной слизистой методом ОТ-ПЦР и вестерн-блот анализа, а также был протестирован in situ в опухолях желудка методом ИГХ для оценки его возможной прогностической значимости (см. п.2).

1.2. Биоинформатический поиск потенциальных белковых маркеров РЖ на основе транскриптомных и протеомных баз данных

Первый использованный подход основывался на отборе мРНК, уровень транскрипции которых наиболее часто возрастает одновременно в интестинальных и диффузных опухолях желудка по сравнению с нормальными тканями. Поиск осуществляли по базе данных Oncomine (https://www.oncomine.org/ resource/login.html. Гены-кандидаты для специфической диагностики и прогноза интестинального и диффузного подтипов РЖ отбирали на основе условий: 1) для дифузных опухолей - присутствие среди 1% генов с наибольшим уровнем транскрипции в диффузных опухолях по сравнению с нормой, при отсутствии изменения уровня экспрессии в интестинальных опухолях желудка или её понижении (Р < 0,1, критерий Стьюдента); 2) для интестинальных опухолей применялся зеркальный вариант анализа. Исходный набор генов-кандидатов (91 ген) получили в результате объединения двух полученных выборок. Затем набор был разделён на две части, содержащие гены, кодирующие секретируемые белки (14 генов для поиска диагностических маркеров, секреция которых во внеклеточное пространство или кровоток подтверждалась нижеописанными критериями) и все остальные гены (77 генов, для поиска прогностических маркеров).

Отбор генов, кодирующих белки, способных к секреции в кровоток или во внеклеточное пространство, проводили с использованием двух критериев:

1) присутствие кодируемого белка в базах, содержащих экспериментально подтверждённые данные о секреции белков (HUPO Plasma Proteome (http://www.hupo.org/research/hppp/) и Sys-BodyFluid (http://www.biosino.org/ bodyfluid/home.jsp);

2) присутствие кодируемого белка как минимум в двух из трёх баз данных секреторных белков, не подтверждённых экспериментально:

eSLDB (http://gpcr.biocomp.unibo. it/esldb/index.htm);

LOCATE:

Babelomics (http://babelomics.org).

Из набора секретируемых белков были удалены восемь генов кодирующих различные изоформы коллагенов, низкая информативность которых для диагностики и прогнозирования опухолей была показана ранее.

На втором этапе была проведена элиминация транскриптов, уровень синтеза которых, оцениваемый по количеству клонов в базе данных dbEST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) в клетках костного мозга, белых клетках крови и сосудах более чем вдвое превышает усреднённый уровень синтеза в опухолевых тканях желудка.

На третьем этапе проводили дополнительную оценку изменений уровня транскрипции мРНК, кодирующих потенциальные прогностические онкомаркеры, в нормальных и опухолевых тканях по базе данных dbEST.

На последнем этапе повторяли анализ, выполненный по базе данных dbEST, с использованием базы данных SAGE (http://cgap.nci.nih.eov/SAGEV по окончании которого элиминировали все гены, ранее описанные в литературе.

Таким образом, в результате использования трёх различных методов биоинформатического поиска онкомаркеров РЖ было выявлено восемь не идентифицированных ранее потенциальных прогностических маркеров опухолей желудка, при этом поиск потенциальных сывороточных маркеров для диагностики РЖ оказался непродуктивным (Таблица 2).

Таблица 2 - Характеристика белков, идентифицированных методом __биоинформатического поиска_

Название белка Мол. вес, локализация Функция Литературные сведения об ассоциации с РЖ

GPNMB 63 кДа, мембрана Определяет метастатический потенциал опухолевых клеток [Юю Н\У. е1 а!., 2010]

SERPINH1 46 кДа, мембрана Ингибирует активность сериновых протеаз нет данных

SPARC 46 кДа, секретируемый Регулирует пролиферацию клеток [\VangL., 2012]

SULF1 101 кДа, эндоплазматический ретикулум Фермент, отщепляющий сульфатные группы гепарин сульфатов [НигК., 2012]

CLDN4 22кДа, мембрана Участвует в образовании контактов между клетками, влияет на дифференцировку [Клуоп М.Д., 2011]

KRT6A 60 кДа, мембрана Формирование цитоскелета нет данных

РМЕРА1 32 кДа, мембрана Участвует в различных сигнальных путях [Хи, Ь.Ь., 2003]

AKR1B10 36 кДа, секретируемый Альдо-кето редуктаза, участвует в метаболизме ретиноевой кислоты ^¡китаг Т., 2010]

2. Сравнительный анализ содержания идентифицированных маркеров в образцах нормальной и опухолевой тканей желудка

2.1. Тестирование экспрессии генов выбранной панели белков ОТ-ПЦР в реальном времени в образцах опухолей и нормальной слизистой желудка Для подтверждения дифференциальной генной экспрессии выявленных в наших исследованиях потенциальных белковых маркеров проведен анализ уровня экспрессии мРНК в замороженных парных образцах опухолевой и неизмененной тканей желудка методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией, относительно референсного гена АСТВ. Статистически значимые различия получены для генов SPARC, S100A6, PPIA, AKRIB10. У 74% больных экспрессия SPARC в опухолевой ткани была выше, чем в нормальной слизистой желудка (р=0,0132), однако значимые различия получены только в группе больных с интестинальным типом РЖ (р=0,011). У 100% больных с кишечным типом РЖ экспрессия гена S100A6 в опухоли почти в 2 раза выше, чем в нормальной ткани, это свидетельствует о существенной типоспецифичности экспрессии S100A6. При

сравнительном анализе уровня экспрессии гена AKR1B10 в 45 парах образцов опухолевой и нормальной ткани было показано значительное снижение среднего группового уровня мРНК в опухолях диффузного и интестинального типов (р=0,0036 и 0,008); индивидуальные изменения экспрессии мРНК колебались от 2 до 342 раз. При этом более чем двукратное снижение экспрессии данного гена наблюдалось в опухоли у половины пациентов. Более выраженное снижение экспрессии было отмечено у пациентов с большей глубиной инвазии опухоли ТЗ-4. В литературе практически нет данных об изменении экспрессии AKR1B10 в опухолях желудка различных гистотипов.

Ген AKR1B10 кодирует белок, который является членом суперсемейства альдо-кето редуктаз (Cao, D., 1988., Hyndman, D. J., 1988). AKR1B10 участвует в

утилизации алифатических и ароматических альдегидов и метаболизме ретиноевой кислоты, которая ингибирует пролиферацию и стимулирует клеточную дифференцировку, играя важную роль в процессах канцерогенеза [Wang, X.J. et al., 2007].

Полученные данные о характере экспрессии AKR1B10 указывают на перспективность его тестирования в опухолях желудка в качестве возможного дополнительного критерия прогноза.

Следует отметить, что нам не удалось выявить статистически значимых различий в экспрессии гена PPIA в опухолевой и нормальной тканях желудка методом ОТ-ТТЦР. Но поскольку повышение экспрессии белка PPIA было идентифицировано у всех пациентов в 2D исследовании, мы предприняли исследование уровня белковой экспрессии на расширенной выборке пациентов с помощью вестерн-блот анализа.

2.2. Исследование уровня синтеза белков в опухолевой и нормальной ткани больных РЖ методом вестерн-блоттинга

Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка использовали метод вестерн-блоттинга, проведение которого позволяет уточнить результаты, полученные при оценке генной экспрессии, поскольку высокий уровень экспрессии мРНК не всегда соответствует высокому уровню синтеза белка вследствие дополнительной регуляции его экспрессии на уровне трансляции [Greenbaum D. et al., 2003]. Определение среднего уровня PPIA в 32 парных образцах позволило выявить повышение белковой экспрессии в опухолевой ткани у 63% больных.

Проведение вестерн-блот анализа с использованием коммерческих антител к другим идентифицированным белкам не позволило обнаружить специфического связывания в экстрактах нормальных и опухолевых тканей желудка. Это связано с тем, что чувствительность коммерческих антител обычно не превышает 500 нг и недостаточна для детекции низкокопийных белков, а как оказалось, почти все исследуемые нами белки являются низкокопийными, что было подтверждено при исследовании уровня их генной экспрессии по отношению к гену рефери АСТВ: уровень экспрессии был в 10-100 раз меньше. Недостаточная чувствительность коммерческих антител ставит задачу получения высокоспецифичных антител к выявленным потенциальным маркерам, использование которых позволит не только подтвердить стабильное изменение синтеза белков в опухолевой ткани, но и оценить их прогностическую значимость.

Таким образом, из первоначально выявленных 16 потенциальных маркеров, измененная генная/белковая экспрессия в опухоли была подтверждена лишь для 4 белков, а именно - SPARC, S100A6, AKR1B10, PPIA. Несмотря на выраженную дифференциальную экспрессию SPARC, S100A6 в опухолях желудка, эти белки не представляют существенного интереса для сывороточной диагностики по ряду причин. Многочисленные сведения, полученные в последние годы, о высокой прогностической значимости белка SPARC при интестинальном типе РЖ, а также белка S100A6, и для диффузного, и для интестинального типов, указывают на нецелесообразность продолжения исследований этих белков [Huang H.L. et al., 2008; Franke К. et. al., 2009].

В качестве наиболее перспективных для оценки прогностической значимости были выбраны белки PPIA и AKR1B10, на основе полученных нами данных о значимых различиях их экспрессии в опухолевых и нормальных образцах, указывающих на их роль в патогенезе РЖ, связи экспрессии AKR1B10 с глубиной опухолевой инвазии и сведениях литературы о прогностической значимости PPIA для других локализаций злокачественных новообразований.

2.3. Иммуногнстохимнческий анализ парафиновых блоков для оценки прогностической значимости идентифицированных маркеров

Для подтверждения наличия белков PPIA и AKR1B10 в клетках опухоли in situ и оценки их прогностической значимости был проведен ИГХ анализ срезов тканей из парафиновых блоков опухолей 107 пациентов с использованием коммерческих антител для PPIA и анти-AKRlBlO антител, полученных в ФГБУН ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН.

В препаратах определяли количество клеток разных структур опухоли на разной глубине инвазии с позитивной цитоплазматической экспрессией изучаемого маркера на 100 клеток в 10 полях зрения при увеличении х400.

При диффузном типе РЖ процент экспрессии PPIA был ниже в сравнении с экспрессией этого маркера в цитоплазме клеточных элементов карциномы кишечного типа (таблица 3).

Таблица 3 - Процент экспрессии РР1А в опухолевых клетках с учетом типа РЖ

Тип РЖ Процент экспрессии циклофиллина A (M±S.D.)

Кишечный 24,6±19,3 (п=26)

Диффузный 7,7±7,0 (п=15)

Примечание - F=10,5, р=0,002

Не было выявлено отличий в частоте и интенсивности (процент позитивных клеток) экспрессии РР1А у больных с диффузным и кишечным типами РЖ в зависимости от глубины инвазии опухоли. У больных с диффузным типом опухоли при мониторинге после специфического лечения гематогенные метастазы выявлялись чаще при отсутствии экспрессии РР1А в клетках опухоли (таблица 4), в то время как при кишечном типе РЖ частота возникновения отдаленных метастазов не была связана с наличием экспрессии РР1А.

Таблица 4 - Взаимосвязь наличия экспрессии РР1А в опухолевых клетках _с гематогенными метастазами при диффузном типе РЖ_

Экспрессия РР1А Гематоген (количество нет (Мо) ные метастазы больных, а.ч., %) есть (М+)

Негативная 0/2 (0%) 2/2(100%)

Позитивная 12/15 (80%) 3/15(20%)

Примечание - у2=5,4; р=0,01

Экспрессия АКШВЮ оценивалась по процентному содержанию положительно окрашенных клеток в каждом варианте структур паренхиматозного компонента первичной опухоли на различной глубине инвазии. В опухолях диффузного типа РЖ экспрессия АКШВЮ менее выражена в сравнении с экспрессией в цитоплазме клеточных элементов карциномы интестинального типа (таблица 5).

Таблица 5 - Выраженность экспрессии белка АКШВЮ в опухолевых клетках _с учетом типа РЖ__

Локализация Выраженность экспрессии, баллы (М±БО)

Опухоль кишечного типа 2,7±0,5 (п=29)

Опухоль диффузного типа 2,0±0,6 (п= 17)

Примечание - Р=13,9; р=0,0005

Различий в экспрессии белка АКШВЮ у больных с диффузным и интестинальным типами РЖ в зависимости от глубины инвазии опухоли не обнаружено (без учета гистологического варианта опухолевых структур).

В случаях с развитием гематогенной диссеминации в отдаленный период после лечения процент экспрессии белка АКШВЮ не изменялся при нарастании глубины инвазии опухоли в стенку желудка, при отсутствии прогрессирования процент экспрессии снижался по мере погружения новообразования в толщу стенки органа. Эти данные свидетельствуют о потенциальной прогностической значимости АКШВЮ (таблица 6).

Таблица 6 - Процент экспрессии АКШВЮ в железистоподобных структурах опухоли при различной глубине инвазии их в стенку желудка в зависимости от гематогенного метастазирования у больных с кишечным типом РЖ

Гематогенные метастазы Процент экспрессии протеина АКШВЮ в железистоподобных структурах (М±5.0.) Значение 13

слизистый подслизистый мышечный серозный

а б в г

Нет (Мо) 86,0±17,6 (п=24) 77,4±23,5 (п=23) ра=0,08 65,6±32,6 (п-12) ра=0,009 36,7±50,5 (п=3) Ра.0,0006 Рб-0,01 -0,95 р=0,04

Есть (М+) 97,3±1,1 (п=3) 94,2±7,8 (п=4) 96,5±4,5 (п=4) -(п=0) -0,25 р=0,84

Все выявленные закономерности были подтверждены на дополнительной независимой выборке больных РЖ (данные не представлены).

3. Получение высокоспецифичных поликлональных антител к AKR1B10

Эксперименты по анализу содержания белка AKR1B10 в клинических образцах с использованием коммерческих антител, проведенные коллегами из ФГБУН ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН показали, что их аффинность и специфичность недостаточны для надежной детекции белка. Ими были получены высокоспецифичные анти-AKRlBlO антитела, любезно предоставленные для проведения в настоящей работе ИГХ анализа AKR1B10 в опухолях желудка. В связи с ограниченным количеством экспериментальной партии антител, нами была поставлена задача получения высокоспецифичных антител к AKR1В10.

3.1. Оптимизация уровня экспрессии фрагмента белка AKR1B10, его очистка, рефолдинг

Первоначально, с использованием полуэмпирического метода, предложенного Kolaskar и Tongaonkar (1990), был выбран теоретически наиболее иммуногенный фрагмент последовательности AKR1B10 и клонирован в экспрессионный вектор рЕТ21а. Полученной конструкцией трансформировали компетентные клетки E.coli, штамм BL21(DE3), используя метод теплового шока, с последующей селекцией на твердой питательной среде LB с ампициллином. Нами были проведены работы по оптимизации уровня экспрессии фрагмента AKR1B10 посредством подбора оптимальной среды и условий культивирования, а также условий индукции.

Несмотря на проведенную оптимизацию индукции синтеза фрагмента AKR1B10 с помощью синтетического аналога лактозы, нам не удалось получить достаточного количества продукта для дальнейшей иммунизации лабораторных животных. В связи с этим, для последующих работ, в качестве индуктора синтеза целевого белка использовали лактозу в оптимальной 2%-ой концентрации (Рисунок 2).

Mw 00:00 3:00 6ДО 9:00 12:00 25:00

в ~ i ■в —1 1 -i i

— щ

чр да ^

Рисунок 2 - Накопление целевого продукта в штамме ВЬ21(ОЕЗ) [рЕТ21 а-АКР 1В10] при индукции 2% лактозой

Примечание - анализировали наличие целевого белка в супернатанте (б) и осадке (р) клеточной культуры после индукции 1 мМ ИПТГ, а также через 3, 6, 9, 12 и 25 часов.

Очистку полученного фрагмента целевого белка проводили при помощи аффинной хроматографии на сорбенте №-МТА ("Qiagen", Германия). Ренатурация полученного рекомбинантного белка была проведена с применением методов

диализа с понижением градиента концентрации мочевины и адсорбционной ренатурации в двухбуферной системе. Для подтверждения формирования корректной укладки полипептидной цепи был проведен анализ с применением КД-спектрополяриметра J-600 (Jasco).

Иммунизацию лабораторных животных полученным рекомбинантным фрагментом белка AKR1B10 осуществляли на базе ФГУП "Гос. НИИ ОЧБ ФМБА РФ" (г.Санкт-Петербург).

3.2. Получение Г^С-фракнии из высокоиммунной сыворотки крови кролика с помощью аффинной хроматографии

С целью выделения ^О из сыворотки кролика была применена аффинная хроматография на белок-А-сефарозе. Конечный выход целевого белка составил 20 мг/мл сыворотки. Чистота полученного препарата была подтверждена с использованием электрофореза в 12% ДСН-ПААГ и составляла 95%. Для определения специфической активности полученного препарата был использован метод дот-блот анализа с рекомбинантным фрагментом АКЛ1В10_С214-У316. На поливинилдифторидную мембрану наносили от 50 до 0,1 нг очищенного препарата фрагмента белка АКШВЮ и инкубировали с полученными поликлональными антителами в разведении 1:2000. Чувствительность детекции антигена АКК1В10 с использованием полученных антител составила 1-10 нг белка. Также проведено иммуногистохимическое определение белка АКЕЛВЮ на материале гистологических срезов (рисунок 3).

-гг.: • 'ЧГ,/

г?. 'A^f-m 1- ЛГ "

/ ' - ■ -4 ШОЕ- -' *

- • • Шш'^жшт

4, : - л . * ■

Рисунок 3 - Иммуногистохимический анализ присутствия белка АКИ1В10 в образцах тканей с использованием полученных препаратов антител

Примечание - А - кишечный тип РЖ, низкая степень дифференцировки, увеличение х400, выраженная экспрессия АКЮВЮ, разведение АТ 1:400; Б -диффузный тип РЖ, увеличение х400, умеренно выраженная экспрессия АКК1В10, разведение АТ 1:400.

Заключение

Таким образом, проведенные комплексные исследования с использованием биоинформатических и протеомных подходов позволили выявить новые потенциальные белковые маркеры, ассоциированные со злокачественными новообразованиями желудка различных гистологических типов. Проведение исследований по подтверждению стабильных изменений генной и белковой экспрессии найденных маркеров в коллекции замороженных парных образцов опухолевой и нормальной ткани желудка дало возможность идентифицировать несколько наиболее перспективных для оценки их прогностической значимости. Иммуногистохимическая детекция белков PPIA и AKR1B10 в коллекции парафиновых блоков опухолей от больных РЖ с прослеженными отдаленными результатами лечения показала их прогностическое значение в отношении гематогенного метастазирования для диффузного и интестинального типов РЖ, соответственно. Получены высокоспецифичные антитела к белку AKR1B10, которые в дальнейшем будут использованы в трансляционных исследованиях для валидации его клинической значимости при определении прогноза течения заболевания и выбора адекватной тактики лечения.

ВЫВОДЫ

1. Протеомный анализ парных образцов опухолевой и немалигнизированной тканей желудка с использованием 20-электрофореза позволил выявить восемь потенциальных маркеров РЖ, которые относятся к группам белков, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, участвующих в формировании цитоскелета, фолдинге и деградации белков.

2. В результате биоинформатического поиска отобрано восемь потенциальных прогностических генов маркеров РЖ, кодирующих белки следующих групп: мембранные белки, участвующие в передаче внутриклеточных сигналов, обеспечивающие контактное взаимодействие между клетками, ферменты клеточного метаболизма, белки, формирующие цитоскелет.

3. При сравнении уровней экспрессии исследуемых генов в нормальной и опухолевой ткани желудка методом ПЦР с обратной транскрипцией выявлено статистически значимое повышение в опухоли экспрессии генов: PPIA, SPARC, S100A6 и снижение экспрессии гена AKR1B10. Уровень экспрессии AKR1B10 зависит от глубины прорастания опухоли в стенку желудка. Для генов SPARC и S100A6 показана гиперэкспрессия в опухолях интестинального типа.

4. Вестерн-блот анализ выявил существенное повышение уровня синтеза иммунофилина PPIA в опухолевых образцах 63% больных РЖ независимо от гистологического типа. Детектировать другие белки на материале замороженных парных образцов не представилось возможным, ввиду их низкой копийности и низкой чувствительности коммерчески доступных антител.

5. Выявлено значимое снижение экспрессии PPIA в опухолевых клетках диффузного типа РЖ по сравнению с интестинальным (р=0,002). Экспрессия PPIA не зависит от размера опухоли и количества вовлеченных лимфатических узлов, как в случае диффузного, так и в случае интестинального типа. Выявлена положительная ассоциация негативной экспрессии PPIA с наличием гематогенного метастазирования у больных с диффузным типом РЖ (р=0,01).

6. Цитоплазматическая экспрессия AKR1B10 в опухолях диффузного типа менее выражена по сравнению с опухолями интестинального типа. Не обнаружено

связи между выраженностью экспрессии AKR1B10 в опухолевых клетках и наличием лимфогенных метастазов у больных, как с кишечным, так и с диффузным типом РЖ. Выявлена взаимосвязь снижения экспрессии AKR1B10 по мере увеличения глубины инвазии опухоли с отсутствием гематогенного метастазирования.

7. Получены высокоспецифичные поликлональные антитела к белку AKR1B10 как основа для разработки тест-системы с целью определения вероятности развития гематогенных метастазов у больных с кишечным типом рака желудка.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Григорьева, Е.С. 2D-npoTeoMiika рака желудка: идентификация белков с повышенным синтезом в опухоли [Текст] / Е.С. Григорьева, Ю.А. Букурова, Н.В. Чердынцева, С.Г. Афанасьев, Т.В. Комарова, С.А. Тузиков, Н.С. Родичева, С.Ф. Берестень // Сибирский онкологический журнал. — 2009. —№ 5. — С. 37-42

2. Grigoryeva, E.S. 2D proteomics of gastric cancer: identification of proteins with increased level of synthesis / E.S. Grigoryeva, Yu.A. Bukurova, N.V. Cherdyntseva, S.G. Afanasjev, T.V. Komarova, S.F. Beresten // Tomsk region and Taiwan: experience of scientific-technical and innovation cooperation. Experience and prospects for cooperation between Russian and Taiwanese scientists in the field of studying molecular-genetic mechanisms of cancer development and applying results of basic studies in oncology. Forum proceedings 16-17 September, 2009 Tomsk. - 2009. - Vol. № 2. - P. 109-111.

3. Григорьева, Е.С. Оценка эффективности методов 2D анализа и биоинформатического поиска для идентификации белковых маркеров опухолей толстой кишки [Текст] / Ю.А. Букурова, СЛ. Ханкин, Г.С. Краснов, Е.С. Григорьева, Т.Д. Машкова, Н.А. Лисицын, ВЛ. Карпов, С.Ф. Берестень // Молекулярная биология. - 2010. - 44:2, С.375-381

4. Григорьева Е.С. Клинико-морфологические и молекулярно-генетические особенности интестинального и диффузного типов карцином желудка [Текст] / И. В. Степанов, М. В. Завьялова, Е. С. Григорьева, Ю.А. Букурова, С. Г.Афанасьев, Н.В. Чердынцева // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - № 4. - С.55-66.

5. Григорьева, Е.С. Идентификация белков с повышенным синтезом в злокачественных опухолях желудка различных типов методом 2D [Текст] / Е.С. Григорьева, Ю.А. Букурова, И.В. Степанов, А.В. Августинович, М.Р. Патышева // V Региональная конференция молодых ученых-онкологов им. Академика РАМН Н.В. Васильева „Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии"(23 апреля 2010, г. Томск).

6. Grigoryeva, E.S. Expression of cyclophilin A in gastric cancer: association with histological type / E.S. Grigoryeva, Y.A. Bukurova, M.A. Buldakov, N.V. Litviakov, O.V. Savenkova, S.G. Afanasjev, V.M. Perelmuter, N.V. Cherdyntseva // Опухоль и организм: современные аспекты старой проблемы. 21-24 сентября (2010), Киев, Украина.

7. Григорьева, Е.С. Идентификация белков с повышенным уровнем синтеза в злокачественных опухолях желудка: сравнение результатов двумерного электрофореза и биоинформатического поиска [Текст] / Е.С. Григорьева, Ю.А. Букурова, Г.С. Краснов, Н.В. Чердынцева, С.Г. Афанасьев, С.А. Тузиков, ВЛ. Карпов, ЕЛ. Чойнзонов, Н.А. Лисицын, С.Ф. Берестень // Молекулярная биология. -2011. - Том.45, № 3. - С. 738-43.

8. Григорьева, Е.С. Циклофиллин А как потенциальный маркер рака желудка [Текст] / Е.С. Григорьева, М.А. Булдаков, И.В. Степанов, М.В. Завьялова, В.В. Волкоморов, С.В.Вторушин // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - Приложение 1. Материалы

VI региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева 28 апреля 2011 г. - С. 36-37.

9. Григорьева, Е.С. Экспресспоппые характеристики диффузного и кишечного типов рака желудка [Текст] / М.В. Завьялова, И.В. Степанов, C.B. Вторушин, О.В. Савенкова, Е.С. Григорьева, A.B. Августинович, С.Ф. Берестень, С.Г. Афанасьев, Н.В. Чердынцева, В.М. Перельмутер // Сибирский онкологический журнал. — 2012. — №3.

10. Grigoryeva, E.S. Cyclophilin A as a prognostic marker for stomach cancer / E.S. Grigoryeva, Yu.A. Bukurova, N.V. Cherdyntseva, I.V. Stepanov, V.M. Perelmuter, M. A. Buldakov, S.G. Afanasjev, S.A. Tuzikov, M.V Zavyalova., N.A. Lisitsyn, S.F. Beresten // 8th Annual Conference The Future of Proteomics March 4-7, 2012 Palace Hotel, San Francisco CA-p.65.

11. Григорьева, Е.С. Особенности экспрессионного профиля карцином желудка кишечного и диффузного гистологических типов [Текст] / М.В. Завьялова, И.В. Степанов, Е.С. Григорьева, C.B. Вторушин, О.В. Савенков, A.B. Августинович, С.Г. Афанасьев, С.Ф. Берестень, Н.В. Чердынцева, В.М. Перельмутер // Сборник статей "Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня" - 2012. - С. 50-57.

12. Григорьева, Е.С. Идентификация и отбор потенциальных белковых маркеров для диагностики и прогнозирования рака желудка [Текст] / Е.С. Григорьева, В.В. Волкоморов, М.С. Карбышев, И.В. Степанов, М.В. Завьялова, И.Г. Соловьева, Н.В. Чердынцева, H.A. Лисицын, С.Ф. Берестень // Материала конференции по фундаментальной онкологии "Петровские чтения- 2012"-2012,20 апреля 2012, г.Санкт-Петербург- С.57-59.

13. Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка. Завьялова М.В., Перельмутер В.М., Степанов И.В., Вторушин C.B., Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Афанасьев С.Г., Августинович A.B., Савенкова О.В., Григорьева Е.С., Берестень С.Ф., Волкоморов В.В. Заявка на патент, приоритет 2011134537 от 17 августа 2011 г. Получено решение о выдаче патента.

14. База данных кпинико-патологических параметров пациентов с диагнозом рак желудка. Чердынцева Н.В., Григорьева Е.С., Афанасьев С.Г., Иванова A.A., Родичева U.C., Перельмутер В.М., Вторушин C.B., Завьялова М.В., Степанов И.В., Гервас П.А., Бычков В.А. Свидетельство о государственной регистрации базы данных №2012620818 от 22 августа 2012 г.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность и благодарность д.х.н. Лисицыну Н.А, к.б.н. Краснову Г.С., Букуровой Ю.А., Кропотовой Е.С., проф. Перельмутеру В.М., д.м.н.

Завьяловой М.В., к.м.н. Степанову И.В., проф. Тузикову С.А., д.м.н. Афанасьеву С.Г., к.б.н. Литвякову Н.В., к.х.н. Ищенко A.M., Карбышеву М.С, Волкоморову В.В. за помощь, оказанную при проведении исследования и обсуждении результатов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РЖ

ПЦР

ОТ-ПЦР

игх

ФГУП "Гос. НИИ ОЧБ ФМБА РФ"

- рак желудка

- полимеразно-цепная реакция

- полимеразно-цепная реакция с обратной транскрипцией

- иммуногистохимическое исследование

- "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации

Тираж 100. Заказ 1035/1. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники.

634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. 533018.

Оглавление диссертации Григорьева, Евгения Сергеевна :: 2012 :: Томск

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Рак желудка: эпидемиология, этиология, классификация, клинико-морфологические особенности различных гистологических типов.

1.2 Молекулярно-генетические аспекты рака желудка.

1.3. Критерии прогноза при раке желудка.

1.4. Диагностические и прогностические маркеры опухолей желудка: принципы их идентификации.

1.4.1. Методы протеомики in vivo.

1.4.1.1. 2D гель-электрофорез.

1.4.1.2.Многомерная технология идентификации белка (MudPIT).

1.4.1.3 .Технология SELDI-TOF-MS.

1.4.2. Методы протеомики in silico.

1.4.2.1. Серийный анализ экспрессии генов (SAGE).

1.4.2.2. Метод учета маркерных экспрессирующихся ярлыков (EST).

1.4.2.3. Анализ базы данных Oncomine.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Методы исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сравнительный анализ изменений протеома нормальных и опухолевых тканей с помощью метода 2Б-электрофореза и MALDI-TOF-спектрометрии.

3.2. Идентификация потенциальных диагностических и прогностических маркеров рака желудка методами биоинформатики.

3.3. Анализ содержания идентифицированных белковых маркеров в образцах нормальной и опухолевой тканей желудка.

3.3.1.Тестирование экспрессии генов выбранной панели белков методом ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени в тканевых образцах опухолей желудка и нормальной слизистой.

3.3.2. Исследование уровня синтеза белков в опухолевой и нормальной ткани больных раком желудка методом вестерн-блот анализа.

3.3.3.Иммуногистохимический анализ опухолевой ткани желудка, оценка прогностической значимости идентифицированных маркеров.

3.4 Получение поликлональных антител к фрагменту белка AKR1B10.

3.4.1. Клонирование фрагмента гена AKR1B10 в бактериальном штамме.

3.4.2. Оптимизация уровня экспрессии фрагмента белка AKR1B10.

3.4.3. Очистка и рефолдинг рекомбинантного фрагмента белка

AKR1B10.

Введение диссертации по теме "Онкология", Григорьева, Евгения Сергеевна, автореферат

Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности на планете, составляя более 25% случаев всех смертей в развитых странах. Рак желудка (РЖ) остается одним из лидеров по показателям смертности среди больных со злокачественными новообразованиями во всем мире, несмотря на снижение показателей заболеваемости в развитых странах Европы и в США. В наши дни ежегодно в мире регистрируется более миллиона новых случаев заболевания РЖ, более 50 тысяч которых диагностируется в РФ. В структуре заболеваемости мужского населения России РЖ занимает второе место, женского - третье. Среди больных РЖ высоки показатели одногодичной летальности- 53,2%, а показатели 5-летней выживаемости не превышают 20,2-21,1% [1], что объясняется высокой запущенностью процесса при первичной диагностике в связи с отсутствием выраженной симптоматики на ранних стадиях заболевания [1, 2]. Известно, что ранняя первичная диагностика любых типов злокачественных опухолей и точное прогнозирование их развития существенно повышают вероятность эффективного лечения раковых заболеваний. Так у больных с раком желудка, диагностированном на I стадии заболевания, 5-летняя выживаемость составляет 69,3-75,5%, а при IV стадии - лишь 5,1-6,4% [2]. В Японии, где РЖ является одним из самых распространенных локализаций злокачественных новообразований, на протяжении нескольких последних декад были внедрены скрининговые программы на основе фотофлюорографии с дальнейшей гастроскопией, позволившие в 50% выявлять процесс на ранних стадиях и вдвое (до 40%) повысить показатели 5-летней выживаемости [3]. Однако этот японский феномен является уникальным. В России, как и в большинстве других стран, эффективных программ скрининга РЖ не существует, а для постановки диагноза необходимо проведение гастроскопии с биопсией, при этом отсутствуют достаточно чувствительные методы молекулярной диагностики. В этой связи актуальным является поиск маркеров ранней диагностики, которые могли бы детектироваться в биологических жидкостях на предклинических стадиях болезни. В настоящее время в клинической практике для послеоперационного мониторинга пациентов с РЖ используется ряд сывороточных маркеров (СА19-9, С А 72-4, РЭА), обладающих умеренной прогностической значимостью примерно лишь для трети всех больных РЖ, однако они имеют высокую перекрестную реактивность и неэффективны для ранней диагностики [4]. Остается актуальным и поиск новых прогностических маркеров, использование которых могло бы определять показания к объему оперативного вмешательства. Данные международной патентной базы США (http://www.uspto.gov) показывают, что за последние 10 лет заявлено всего несколько патентов по диагностике РЖ на основе идентификации новых молекулярных маркеров, однако в клинической практике запатентованные инновации не применяются, вследствие их низкой эффективности.

Известно, что 95% всех опухолей желудка представлены аденокарциномами, которые по гистологическому строению подразделяют на интестинальный и диффузный типы, различающиеся по эпидемиологии, характеру клинического течения и прогнозу [5], а, следовательно, и патогенезу [6]. В частности, установлено, что рак желудка диффузного типа чаще возникает у молодых пациентов, склонен к более агрессивному течению и более частому метастазированию [7].

Хотя большинство генетических повреждений являются общими для указанных гистологических субтипов, все более очевидным становится представление о различиях ключевых генетических перестроек, определяющих формирование и прогрессию диффузного и интестинального рака желудка [8, 9]. Злокачественную трансформацию предраковых изменений при интестинальном раке желудка связывают с микросателлитной нестабильностью, мутациями гена опухолевой супресии р53, снижением экспрессии гена р27, сверхэкспрессией циклина Е и транскриптов с-п^ гена.

Опухолевая прогрессия ассоциирована с потерей гетерозиготности 1Q региона, гена-онкосупрессора DCC, р27, снижением экспрессии рецептора к TGF-beta, амплификацией гена HER-2. Для развития диффузного типа РЖ ключевое значение имеет потеря гетерозиготности по 17р хромосоме (р53), мутации или потеря Е-кадхерина, при этом потеря р27, амплификация генов K-sam c-met ведет к диссеминации процесса.

В последние годы появились сведения, указывающие на потенциальную диагностическую и/или прогностическую значимость некоторых секреторных белков, таких как NF2, NEK6, INHBA, CDH17, PDCD6, SPARC при раке желудка, однако необходимы дальнейшие трансляционные исследования для подтверждения их клинической значимости [10, 11].

Согласно сведениям литературы, достаточно широко для оценки прогноза клинического течения РЖ разных гистотипов используется целый ряд иммуногистохимических маркеров (Ki-67, CDX2, MUC-5, MUC-5, р53, bcl-2) однако следует отметить, что данные различных авторов не всегда согласуются между собой [12, 13, 14, 15, 16] и исследования в этом направлении остаются актуальными, также как и поиск новых прогностических маркеров для больных с разными гистотипами рака желудка.

В свете современных представлений о вовлечении стромального микроокружения в формирование и прогрессию злокачественных опухолей не вызывает сомнений, что для разных гистотипов РЖ свойственен свой спектр медиаторно-рецепторных регуляторных взаимодействий опухолевых и стромальных клеток, которые играют ключевую роль в процессах пролиферации, апоптоза, морфогенеза, ангиогенеза и метастазирования. Изменения в факторах микроокружения также могут иметь патогенетическую значимость и выступать в качестве ассоциированных с РЖ маркеров.

Известно, что злокачественный фенотип формируется в результате изменения экспрессии патогенетически значимых белков, поэтому выявление ассоциированных с раком желудка белков, для которых установлены выраженные количественные изменения, их идентификация в опухолевых клетках, с учетом внутриклеточной локализации и взаимодействий друг с другом, позволит получить новые знания о процессах регуляции на разных этапах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. При этом возможно как выявление новых протеиновых молекул, вовлеченных в канцерогенез желудка, так и получение новых сведений о функциональной значимости известных белков.

В последние годы используются методы сравнительной протеомики, открывающие возможность идентификации белковых онкомаркеров, уровень синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто различается в опухолях и нормальных тканях. Этот подход основан на фракционировании белков нормальных и опухолевых тканей, идентификации белков с заметно изменённым уровнем экспрессии в опухолях с использованием масс-спектрометрии и последующем отборе секреторных белков по имеющимся базам данных.

Однако результаты исследований, проводимых различными авторами, с целью выявления маркеров ранней диагностики и прогноза, часто являются противоречивыми, а информативность предлагаемых маркеров низка, при этом практически нет «работающих» дифференциальных критериев указанных типов РЖ. В литературе представлено ограниченное число публикаций по идентификации белков с различной концентрацией в нормальной и озлокачествленной слизистой оболочке желудка, при этом имеет место высокая вариабельность белков, ассоциированных с РЖ, выявленных в разных исследованиях, что может быть обусловлено как методическими особенностями получения белковых экстрактов из тканей, которые могут сказаться на результатах протеомного анализа, так и популяционными (этническими и расовыми) отличиями обследованных выборок больных. В целом картина изменения протеома при аденокарциноме желудка остается малоизученной, хотя для ряда белков показано значительное повышение уровня их синтеза при РЖ [9, 17, 18, 19, 20].

Выявление различных белков, вовлеченных в механизмы формирования интестинальной или диффузной форм РЖ, различающихся по тяжести клинического течения, позволит, во-первых, проводить раннюю диагностику у лиц групп «высокого онкологического риска», во-вторых, при диагностике на ранних стадиях, когда макроскопически невозможно определить тип опухоли, при наличии ассоциированных с той или иной формой РЖ белковых маркеров, прогнозировать клиническое течение заболевания, и соответственно, дифференцированно подходить к выбору тактики лечения. При благоприятном прогнозе можно оптимизировать объем операции, что позволит уменьшить уровень хирургического и анестезиологического стресса и обеспечить снижение риска осложнений, связанных с расширенным объемом лимфодиссекции.

Актуальность работы обусловлена немногочисленностью и неоднозначностью имеющихся в мировой литературе сведений о молекулярных механизмах формирования и прогрессии рака желудка различных гистологических типов, отсутствием внедренных в клиническую практику информативных маркеров ранней диагностики и прогноза течения заболевания.

Цель исследования

Идентификация потенциальных белковых маркеров, ассоциированных с РЖ, на основе методов протеомного и биоинформатического анализа, и оценка их прогностической значимости.

Основные задачи исследования

1. Поиск и идентификация потенциальных протеомных маркеров РЖ различных гистологических типов на основе метода 2D-электрофореза, с последующим применением метода MALDI-TOF спектрометрирования.

Научная новизна

Впервые проведен сравнительный протеомный анализ опухолей желудка в российской популяции, выявлены потенциальные белковые маркеры, ассоциированные с раком желудка.

С целью повышения эффективности протеомного анализа предложен оригинальный метод получения растворимой фракции минорных (низкокопийных) белков из тканей, позволяющий увеличить разрешающую способность 2Б-электрофореза, за счет удаления высококопийных структурных белков.

Идентифицированы белки, уровень экспрессии которых существенно различается в опухолях диффузного и интестинального типа, что свидетельствует об их патогенетическом значении в формировании новоообразований разных гистотипов.

Впервые показаны различия в экспрессии цитокина из группы иммунофилинов РР1А в опухолях желудка интестинального и диффузного типов и выявлена связь отсутствия его белковой экспрессии в клетках опухоли с гематогенным метастазированием у больных с диффузным типом РЖ.

Впервые получены данные о существенном снижении экспрессии гена фермента альдо-кеторедуктазы АКЮВЮ, вовлеченного в метаболизм ретиноевой кислоты, в опухолях желудка по сравнению с немалигнизированной тканью.

Показана прогностическая значимость экспрессии белка АКШВ10 в отношении гематогенного метастазирования для опухолей желудка интестинального типа.

Научно-практическая значимость

Полученные поликлональные антитела к белку АКШВЮ, для которого показана взаимосвязь с отдаленным метастазированием у больных с раком желудка интестинального типа, являются основой для создания тест-системы с целью детекции АКЮВК) в качестве прогностического маркера.

Положения, выносимые на защиту:

3. Идентифицированные белки иммунофилин РР1А и альдокеторедуктаза АКШВЮ обладают прогностической значимостью для диффузного и интестинального типов РЖ соответственно в отношении гематогенного метастазирования.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на Российско-Тайваньском форуме "Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии" (Томск, 2009), V-VI Региональной конференции молодых ученых-онкологов им. Академика РАМН Н.В. Васильева „Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии" (Томск, 2010, 2011), международной конференции "Опухоль и организм: современные аспекты старой проблемы" (Киев, Украина, 2010), VIII ежегодной международной конференции "Будущее протеомики" (Сан-Франциско, США, 2012), конференции по фундаментальной онкологии "Петровские чтения - 2012" (Санкт-Петербург, 2012).

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (08-04- 13705-офиц, 09-04-99072-рофи, 09-04-90729-мобст), Международного научно-технического центра (#3909), Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт №02.740.11.0769 от 12.04.2010).

Публикации

Волкоморов B.B. Приоритет 2011134537 от 17 августа 2011 г. Получено свидетельство о государственной регистрации базы данных №2012620818 от 22 августа 2012 г. "База данных клинико-патологических параметров пациентов с диагнозом рак желудка". Авторы: Чердынцева Н.В., Григорьева Е.С., Афанасьев С.Г., Иванова A.A., Родичева Н.С., Перельмутер В.М., Вторушин C.B., Завьялова М.В., Степанов И.В., Гервас П.А., Бычков В.А.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 20 рисунков.

Заключение диссертационного исследования на тему "Идентификация белковых маркеров для прогнозирования злокачественных опухолей желудка"

выводы

1. Протеомный анализ парных образцов опухолевой и немалигнизированной тканей желудка с использованием 2D-электрофореза позволил выявить восемь потенциальных маркеров РЖ, которые относятся к группам белков, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, участвующих в формировании цитоскелета, фолдинге и деградации белков.

5. Выявлено значимое снижение экспрессии PPIA в опухолевых клетках диффузного типа РЖ по сравнению с интестинальным (р=0,002). Экспрессия PPIA не зависит от размера опухоли и количества вовлеченных лимфатических узлов, как в случае диффузного, так и в случае интестинального типа. Выявлена положительная ассоциация негативной экспрессии РР1А с наличием гематогенного метастазирования у больных с диффузным типом РЖ (р=0,01).

6. Цитоплазматическая экспрессия АКЮВЮ в опухолях диффузного типа менее выражена по сравнению с опухолями интестинального типа. Не обнаружено связи между выраженностью экспрессии АКЮВ10 в опухолевых клетках и наличием лимфогенных метастазов у больных, как с кишечным, так и с диффузным типом РЖ. Выявлена взаимосвязь снижения экспрессии АКЮВК) по мере увеличения глубины инвазии опухоли с отсутствием гематогенного метастазирования (р=0,04).

7. Получены высокоспецифичные поликлональные антитела к белку АКШВЮ как основа для разработки тест-системы с целью определения вероятности развития гематогенных метастазов у больных с кишечным типом рака желудка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что ранняя первичная диагностика любых типов злокачественных опухолей и точное прогнозирование их развития существенно повышают вероятность эффективного лечения онкологических заболеваний. Однако в настоящее время для большинства наиболее распространённых видов опухолей, в том числе для рака желудка, занимающего ведущие позиции в структуре смертности, не идентифицированы достаточно информативные диагностические и прогностические маркеры, вследствие высокой вариативности механизмов канцерогенеза и трудоёмкости методов идентификации опухолевых маркеров.

Известно, что злокачественный фенотип опухоли, ответственный за ее возникновение и прогрессию, определяется, в конечном счете, качественным и количественным изменением профиля белковых молекул, вовлеченных в канцерогенез. Предполагается, что могут быть выявлены белки, избирательно высоко экспрессированные в разных типах РЖ (интестинальном или диффузном), что даст возможность разработать тест-системы для дифференциальной ранней диагностики РЖ и прогноза клинического течения этих типов опухолей. В последние 10 лет были предприняты многочисленные попытки сравнительного транскриптомного анализа опухолей различной локализации (по оценке экспрессии мРНК с использованием технологии ДНК-микроаррей, генных чипов), однако было обнаружено отсутствие четкой корреляции между экспрессией мРНК и канцерогенезом, поскольку часто наблюдаются существенные различия между синтезом мРНК и белка, которые кодируются одним и тем же геном. В этой связи количественные и качественные изменения посттрансляционно модифицированных протеинов, как конечного продукта, рассматриваются как более информативные, по сравнению с мРНК, для изучения молекулярных событий в процессе канцерогенеза. Для идентификации опухолевых маркеров широко применяются протеомные методы сравнительного анализа белковых профилей нормальных и опухолевых тканей. Такой подход позволяет идентифицировать белковые маркеры, ассоциированные с опухолевой трансформацией. Для разработки потенциальных молекулярных маркеров с диагностической целью необходимо выявление белков, содержание которых существенно повышено в опухоли и биологических жидкостях (сыворотка крови), что позволило бы осуществлять их детекцию на ранних этапах опухолевого процесса.

В настоящее время в клинической практике ограниченно применяется лишь несколько тестов по диагностике и прогнозированию течения рака желудка. Часть из них основана на определении поверхностных белковых маркеров опухолевых клеток (например, СА19-9, СА 72-4, РЭА и ОЯ70), однако такие тесты имеют низкую специфичность и селективность.

В мире практически нет данных о протеомном профиле интестинальных и диффузных опухолей, единичные работы посвящены характеристике качественных и количественных различий белковых молекул в ткани опухоли по сравнению с нормальной тканью, для аденокарциномы желудка вообще, при этом большинство из них касаются РЖ у пациентов азиатской, но не европеоидной популяции.

В нашей работе применялись методы сравнительной протеомики, которые дают возможность идентификации потенциальных белковых онкомаркеров, ассоциированных с определенными злокачественными опухолями, в частности, с раком желудка. Большинство протеомных исследований выполняется с использованием тотальных экстрактов тканей, содержащих огромное количество структурных и мембранных белков, что затрудняет выявление растворимых протеинов, концентрация которых на порядки ниже. В предлагаемой работе использовалась модифицированная методика получения белковых экстрактов путем устранения мажорной фракции структурных белков, что повышает чувствительность обнаружения белков, которые могут секретироваться опухолями в кровоток.

Идентификация потенциальных протеомных маркеров рака желудка была осуществлена на основе анализа научно-технической литературы, мировых баз данных и проведения 2D протеомного анализа образцов опухолей и нормальной ткани от больных, с последующим подтверждением изменений генной и белковой экспрессии методами ПЦР с обратной транскрипцией и вестерн-блота с коммерческими антителами.

Прогностический потенциал идентифицированных в работе маркеров оценен иммуногистохимическим анализом собственной коллекции парафиновых блоков опухолей желудка на основе корреляции между изменением уровня синтеза белка и данными об отдаленных результатах лечения пациентов, полученными в результате длительного наблюдения после проведенного специфического противоопухолевого лечения.

В процессе работы проводились экспериментальные исследования по поиску белков, интенсивность синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто повышается в опухолях желудка обоих типов по сравнению с нормой с использованием 2D протеомного анализа и биоинформатического поиска по мировым базам данных dbEST, SAGE и Oncomine. Протеомные исследования были проведены с использованием 2Б-электорофореза большого формата на материале замороженных пар образцов нормальной ткани и опухолей слизистой желудка. Для увеличения разрешающей способности 20-гель электрофореза была использована предварительная экстракция растворимой фракции белков, для удаления мажорных структурных белков. Белковые пятна с повышенным уровнем экспрессии в опухоли идентифицированы масс-спектрометрически (MALDI-TOF/TOF).

В ходе сравнительного протеомного анализа было выявлено увеличение синтеза 8 белков: ТВ 10, PPIA, CTSD, ТРМЗ, S100A9, TXN, SOD2, S100A6. Дальнейший анализ источников литературы и баз данных, в которых представлены сведения о функциональной значимости указанных белков и уровне экспрессии в различных нормальных и малигнизированных тканях, позволил обосновать перспективность дальнейших исследований иммунофилина PPIA, поскольку в литературе нет сведений о его сверхэкспрессии в опухолях желудка, не показано повышения его экспрессии в нормальной ткани, а также есть указания о его секреции клетками воспалительного микроокружения и способности регулировать процессы клеточного роста и дифференцировки [119, 120]. Мы подтвердили стабильное повышение синтеза PPIA в опухолях желудка по сравнению с нормальной слизистой методом вестерн-блота. Для выяснения локализации PPIA в клетке было проведено тестирование in situ в срезах тканей опухолей (и прилежащей нормальной ткани) методом иммуногистохимии на основе коммерческих антител, показано цитоплазматическое окрашивание.

На коллекции парафиновых блоков больных РЖ с известными отдаленными результатами лечения была выявлена прогностическая значимость отсутствия цитоплазматической экспрессии белка PPIA в опухолевых клетках в отношении гематогенных метастазов для больных с диффузным гистотипом РЖ. Данный факт, ввиду практического отсутствия работающих маркеров прогноза для диффузного гистотипа РЖ, делает актуальными дальнейшие исследования по валидации PPIA как прогностического маркера. К сожалению, не представляется возможным и/ или целесообразным получение антитела к данному белку с целью создания тест-системы для ранней диагностики в связи с высокой гомологией нескольких белков из этого семейства, что предполагает перекрестное реагирование при его детекции в биологических жидкостях, в частности, в сыворотке крови.

Для выбора генов - новых потенциальных маркеров РЖ, также проводили сравнительный анализ транскриптомов нормальных и опухолевых тканей с использованием EST-клонотек с помощью разработанной нами компьютерной программы. Кроме того, мы использовали базу данных по серийному анализу генной экспрессии (SAGE) и транскриптомную базу данных Oncomine (https://www.oncomine.org), используя дифференциальный анализ (тип сравнения норма-опухоль) в коллекции образцов опухолей желудка Чена [128].

На основе анализа этих постоянно обновляющихся баз выявлены дополнительные гены с наиболее значительными изменениями уровня синтеза мРНК в сравниваемых тканях, в число которых вошло несколько генов, вовлеченных в метаболизм ретиноевой кислоты, играющей важную роль в канцерогенезе, в том числе ген альдо-кето редуктазы AKR1B10, его экспрессия в опухоли была существенно снижена по сравнению с уровнем в нормальной слизистой желудка.

В результате поиска по базе Oncomine было отобрано семь не идентифицированных ранее потенциальных прогностических маркеров РЖ, кодирующих следующие белки: GPNMB (трансмембранный гликопротеин, определяющий метастатический потенциал опухолевых клеток); SERPINH1 (мембранный белок ингибирующий активность сериновых протеаз); SPARC (секретируемый белок, регулирующий пролиферацию клеток); SULF1 (внеклеточный фермент, отщепляющий сульфатные группы гепарин сульфатов); CLDN4 (участвует в образовании межклеточных контактов, влияет на дифференцировку); KRT6A (белок цитоскелета, экспрессируемый преимущественно в эпителиальных тканях); РМЕРА1 (трансмембранный белок, индуцируемый андрогенами предстательной железы и другими гормонами).

Таким образом, в результате использования трёх различных методов биоинформатического поиска онкомаркеров РЖ было идентифицировано восемь потенциальных прогностических маркеров опухолей желудка, при этом поиск потенциальных диагностических маркеров и маркеров, специфичных для интестинального или диффузного подтипов РЖ, оказался непродуктивным.

Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных на данном этапе белков в опухолях желудка был использован метод оценки экспрессии мРНК (ОТ-ПЦР) и вестерн-блоттинга (с использованием коммерческих антител), который является «золотым стандартом» исследований в данной области, поскольку высокий уровень экспрессии мРНК не всегда соответствует высокому уровню синтеза белка вследствие дополнительной регуляции его экспрессии на уровне трансляции.

В результате сравнения уровней экспрессии исследуемых генов в нормальной и опухолевой ткани желудка в общей группе больных, определенных относительно референсного гена АСТВ, статистически-значимые различия получены для генов SPARC, S100A6, CLDN4, AKR1B10. Показано, что экспрессия SPARC и S100A6 в опухоли достоверно выше только при интестинальном РЖ (р=0,01), но не при диффузном, такое повышение отмечается у 74% и 100% больных соответственно, что свидетельствует о существенной гистоспецифичности экспрессии этих белков. Следует отметить, что, несмотря на выраженную дифференциальную экспрессию SPARC, S100A6 в опухолях желудка, эти белки не представляют существенного интереса для сывороточной диагностики, во-первых, в связи с наличием большого числа гомологичных i белков этих семейств, во-вторых, высокого уровня их экспрессии в различных нормальных тканях. Многочисленные сведения, полученные в последние 3 года, о высокой прогностической значимости белка SPARC при интестинальном типе РЖ, а также белка S100A6, и для диффузного, и для интестинального типов [133, 135] делают неактуальным продолжение их изучения в настоящей работе.

При анализе уровня экспрессии гена AKR1B10 по отношению к уровню референс-контроля АСТВ в 45 парах образцов опухолевой и нормальной ткани выявлено двукратное снижение среднего группового уровня мРНК в опухоли по сравнению с нормальной слизистой; при индивидуальном анализе более чем двукратное снижение экспрессии данного гена (от 2 до 340 раз) наблюдалось в клетках опухоли у половины пациентов, была выявлена ассоциация с размером опухоли. Иммуногистохимическое исследование показало цитоплазматическую локализацию белка AKR1B10 в клетках опухоли. В опухолях диффузного типа рака желудка экспрессия AKR1B10 менее выражена в сравнении с экспрессией в цитоплазме клеточных элементов карциномы интестинального типа. По результатам сравнительной детекции белка AKR1B10 в опухолевых клетках больных РЖ с наличием или отсутствием рецидивирования или гематогенного метастазирования выявлена его прогностическая значимость в отношении гематогенных метастазов для интестинального типа РЖ. Данные положены в основу заявки на изобретение, получено положительное решение. Настоящий способ прогнозирования относится конкретно к определению вероятности развития гематогенных метастазов у больных с кишечным типом рака желудка при инвазии не менее чем до мышечного слоя стенки органа. Поставленная задача решается путем иммуногистохимической оценки процента экспрессии протеина AKR1B10 (альдо-кето редуктаза I BIO семейства) в клетках рака желудка кишечного типа, формирующих железистоподобные структуры, располагающиеся в слизистом, подслизистом, мышечном и серозном слоях стенки желудка. При этом подсчитывается коэффициент регрессии ß с помощью метода множественной регрессии из пакета программ Statistica 6.0 for Windows.

Следует отметить, что детекция белка AKR1B10 в опухолевой ткани производилась с использованием антител к полноразмерному белку, любезно предоставленных нам сотрудниками ФГБУН ИМБ им. В. А. Энгельгардта РАН в качестве экспериментального образца. В связи с выявлением прогностического значения детекции этого белка в клетках РЖ актуальной явилась задача получения высокочувствительных антител к данному белку, которые могли бы быть основой для создания коммерческих тест-систем для прогнозирования клинического течения заболевания.

Прежде всего, была проведена оценка теоретической антигенности всей аминокислотной последовательности выбранного белка и выявлен фрагмент с наиболее высоким уровнем антигенности. Для получения высокоспецифичных антител к белку AKR1B10 нарабатывали рекомбинантный белок в бактериальном штамме-продуценте Е.соН -ВЬ21(ОЕЗ), проводили его очистку на хроматографической колонке с ИТ А агарозной смолой (<31а§еп, США). Очищенный препарат целевого белка использовался для проведения иммунизации лабораторных животных по стандартной схеме. Из полученных высокоиммунных сывороток с использованием аффинной хроматографии была выделена фракция иммуноглобулинов класса в с наивысшей константой связывания.

Таким образом, проведенные комплексные исследования с использованием информатических и протеомных подходов позволили выявить новые потенциальные белковые маркеры, ассоциированные со злокачественными новообразованиями желудка различных гистологических типов. Проведение исследований по подтверждению стабильных изменений генной и белковой экспрессии найденных белков в коллекции замороженных парных образцов опухолевой и нормальной ткани желудка, дало возможность идентифицировать несколько наиболее перспективных для оценки их прогностической значимости. Иммуногистохимическая детекция белков РР1А и АКЮВЮ в коллекции парафиновых блоков опухолей от больных РЖ с прослеженными отдаленными результатами лечения показала их прогностическое значение в отношении гематогенного метастазирования для диффузного и интестинального типов РЖ соответственно. Получение высокоспецифичных антител для белка АКЮВЮ послужит основой для создания тест-систем с целью применениях их в клинической практике для прогноза клинического течения заболевания и выбора адекватной тактики лечения.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Григорьева, Евгения Сергеевна

1. Давыдов М. И. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2007 г. / Давыдов М. И., Аксель Е.М. // Вестник РОНЦ. 2009. - Т. 20. - приложение № 3. - С. 15.

2. Чиссов В.И. Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность) / В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова М.: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России»-2011.-С.260.

3. Hamashima С. The Japanese guidelines for gastric cancer screening / C. Hamashima, D. Shibuya, H. Yamazaki et al. // Jpn J Clin Oncol. 2008. - Vol. 38(4). - P.259-67.

4. Кадагидзе 3. Г. Основные опухолевые маркеры / 3. Г. Кадагидзе,

5. B. М.Шелепова // Проблемы клинической медицины. 2008. - № 2(14).1. C.10-19.

6. Lauren P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-called intestinal type carcinoma / P. Lauren // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1965. - Vol. 64 (1). - P.31-49.

7. Rajkumar T. Identification and validation of genes involved in gastric tumorigenesis / T. Rajkumar, N. Vijayalakshmi, G. Gopal et al. // Cancer Cell Int. 2010. - November 24. - Vol.10. - P.45.

8. Gastrointestinal Oncology // J.L. Abbruzzese et al. Oxford University Press. - 2003. - 948 p.

9. Имянитов E.H. Эпидемиология и биология рака желудка / Е.Н. Имянитов // Практическая онкология. 2009. - Т. 10, №1. - С. 1 -6.

10. Nobili S. Genomic and genetic alterations influence the progression of gastric cancer / S. Nobili, L. Bruno, I. Landini et al. // World J Gastroenterol. 2011. -Vol. 17(3). P.290-9.

11. Wang Q. Upregulated INHBA expression is associated with poor survival in gastric cancer. / Q. Wang, Y.G. Wen, D.P. Li et al. // Med Oncol. -2012. Vol.29(l). - P.77-83.

12. Cui J. An integrated transcriptomic and computational analysis for biomarker identification in gastric cancer / J. Cui, Y. Chen, W.C. Chou et. al //

13. Nucleic Acids Res. 2011. - March 39. - Vol.4. - P. 1197-207.

14. Cletus A. Ki-67 proliferation index and gastric cancer: Answers or more questions / A. Cletus // J. Surg. Oncology. 2010. -Vol.102 (3). -P. 199-200.

15. Barros R. CDX2 autoregulation in human intestinal metaplasia of the stomach: impact on the stability of the phenotype / R. Barros, L.T. da Costa, J. Pinto-de-Sousa et al. // Gut. 2011. -Vol.60 (3). - P.290-298.

16. Kim H.S. CDX-2 homeobox gene expression in human gastric carcinoma and precursor lesions / H.S. Kim, J.S. Lee, J.N. Freund // J. Gastroenterol. Hepatol. 2006. - Vol.21. - P.438^142.

17. Namikawa T. Mucin phenotype of gastric cancer and clinicopathology of gastric-type differentiated adenocarcinoma / T. Namikawa, K. Hanazaki // World J. Gastroenterol. 2010. -Vol. 16. - P.4634-4639.

18. Sym S. Prognostic impact of immunohistochemical expression of Ki-67 in patients with advanced gastric cancer who underwent curative resection / S. Sym, J. Hong, E. Cho et al. // J. Clin. Oncol. 2011. - Vol. 29. - P.l 133-1137.

19. Cheng Y. Proteome analysis of human gastric cardia adenocarcinoma by laser capture microdissection / Y. Cheng, J. Zhang, Y. Li et al. // BMC Cancer. -2007.-Vol. 7.-P.191.

20. Yoshihara T. Proteomic alteration in gastic adenocarcinomas from Japanese patients / T. Yoshihara, Y. Kadota, Y. Yoshimura et al. // Mol. Cancer. 2006.-Vol. 5.-P. 5.

21. Li Z. Proteomics Identification of Cyclophilin A as a Potential Prognostic Factor and Therapeutic Target in Endometrial Carcinoma / Z. Li, X. Zhao, S. Bai et al. // Mol Cell Proteomics 2008. - Vol. 7. - P.1810-1823.

22. Kocevar N. Proteomic analysis of gastric cancer and immunoblot validation of potential biomarkers / N. Kocevar, F. Odreman, A. Vindigni // World J Gastroenterol.-2012.-March 21.-Vol. 18(11).-P.1216-28.

23. Давыдов М.И. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2001 году / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель М.: Медицинское информационное агентство, 2003. С. 95-97, 223-224.

24. Давыдов М.И. Результаты хирургии раннего рака желудка / М.И. Давыдов, И.Н. Туркин, Б.Е. Полоцкий и др. // Вестник Московскогоонкологического общества. 2008. - № 9. С.2-8.

25. Давыдов М.И. Современная стратегия хирургического лечения рака желудка / М.И. Давыдов, М.Д. Тер-Ованесов // Современная онкология -2000. Т. 2, № 1. - С.4-10.

26. Давыдов М.И. Факторы риска лимфогенного метастазирования раннего рака желудка / М.И. Давыдов, И.Н. Туркин, В.В. Мочальникова // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ. 2008. - С.286.

27. Zheng Н. Pathobiological characteristics of intestinal and diffuse-type gastric carcinoma in Japan: an immunostaining study on the tissue microarray / H. Zheng, H. Takahashi. // J. Clin. Pathol. -2007. Vol. 60. - P.273-277.

28. Поддубный Б.К. Современное состояние эндоскопической диагностики и лечения ранних форм рака пищевода и желудка / Б.К. Поддубный, Ю.П. Кувшинов, О.Н. Ефимов // Современная онкология 2000. - № 2. - С.68-72.

29. Nogueira С. Early Gastric Cancer: Ten years of Experience / C. Nogueira, A.S. Silva, J.N. Santos // World J. Surg. 2002. - Vol. 26, Suppl. 3. -P.330-334.

30. Araujo-Filho I. Prevalence of helicobacter pylori infection in advanced gastric carcinoma / I. Araujo-Filho, J. Brandao-Neto // Arq. Gastroenterol. 2006. Vol. 43. P. 288-292.

31. Nardone G., Rocco A., Malfertheiner P. Review article: Helicobacter pylori and molecular events in precancerous gastric lesions / G. Nardone, A. Rocco, P. Malfertheiner // Aliment. Pharmacol. Ther. 2004. -Vol. 20. -P.261-270.

32. Fischbach W. Helicobacter pylori and Gastric Malignancy / W. Fischbach, A. Chan, B. Wong // Helicobacter. 2005. - Vol. 10. -P.34-39.

33. Gutierrez-Gonzalez L. Biology of intestinal metaplasia in 2008: More than a simple phenotypic alteration / L. Gutierrez-Gonzalez, N.A.Wright // Dig. Liver Dis. 2008. - Vol. 40. - P.510-522.

34. Kumar V. Robbins Basic Pathology / V. Kumar, R.S. Cotran, S.L. Robbins 7th Edition. Philadelphia: Saunders. 2003. - P.873.

35. Mutoh H. Perycriptal fibroblast sheath in intestinal metaplasia and gastric carcinoma / H. Mutoh, S. Sakura, K. Satoh // Gut. 2005. Vol. 54. - P.33-39.

36. Jass J.R. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review / J.R. Jass, M.D. Walsh // J. Cell. Mol. Med. 2001. - Vol. 5. - P.327-351.

37. Mesquita P., Raquel A., Nuno L. Metaplasia a transdifferentiation process that facilitates cancer development: the model of gastric intestinal metaplasia / P. Mesquita, A. Raquel, L. Nuno // Crit. Rev. Oncog. - 2006. -Vol. 12.-P.3-26.

38. Dinis-Ribeiro M. A follow up model for patients with atrophic chronic gastritis and intestinal metaplasia / M. Dinis-Ribeiro, C. Lopes, A. Costa-Pereira // J. Clin. Pathol. 2004. - Vol. 57. - P. 177-182.

39. Zhu C-Q. Immunohistochemical markers of prognosis in non-small cell lung cancer: a review and proposal for a multiphase approach to marker evaluation / C-Q. Zhu, W. Shih, C.H. Ling, M.S. Tsao // J. Clin. Pathol. -2006. -Vol. 59. P.790-800.

40. Brooks-Wilson A.R. Germline E-cadherin mutations in hereditary diffuse gastric cancer: Assessment of 42 new families and review of genetic screening criteria / A.R. Brooks-Wilson, P. Kaurah, G. Suriano // J. Med. Genet. -2004. Vol. 41.-P.508-517.

41. Tamura G. Alterations of tumor suppressor and tumor-related genes in the development and progression of gastric cancer / Tamura G. // World J.

42. Gastroenterol. 2006. - Vol. 12 (2). - P.192-198.

43. Tamura G. Promoter methylation status of tumor suppressor and tumor-related genes in neoplastic and non-neoplastic gastric epithelia / Tamura G. // Histol. Histopathol. 2004. - Vol. 19. - P.221-228.

44. Steeg P.S. Altered expression of NM23, a gene associated with low tumor metastatic potential, during adenovirus 2 Ela inhibition of experimental metastasis / P.S. Steeg, G. Bevilacqua, R. Pozzatti et al. // Cancer Res. 1988 -Vol. 48(22). -P.6550-4.

45. Leone A. Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer / A. Leone, O.W. McBride, A. Weston et al. // Cancer Res. 1991 - Vol. 51(9). -P.2490-3.

46. Kodera Y. Expression of nm23 H-l RNA levels in human gastric cancer tissues. A negative correlation with nodal metastasis / Y. Kodera, K. Isobe, M. Yamauchi et al. // Cancer. 1994. - Vol. 73(2). - P.259-65.

47. Nakayama H. Reduced expression of nm23 is associated with metastasis of human gastric carcinomas / H. Nakayama, W. Yasui, H. Yokozaki et al.//Jpn J Cancer Res.- 1993.-Vol. 84(2).-P. 184-90.

48. Lee K.E. Prognostic significance of p53, nm23, PCNA and c-erbB-2 in gastric cancer / K.E. Lee, H.J. Lee, Y.H. Kim // Jpn J Clin Oncol. 2003 - Vol. 33(4). -P.173-9.

49. Tang C. Major role of human liver microsomal cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) in the oxidative metabolism of celecoxib, a novel cyclooxygenase-II inhibitor / C. Tang, M. Shou, Q. Mei et al. // J Pharmacol Exp Ther. 2000. - Vol. 293(2).-P.453-9.

50. Shi H. Prognostic significance of expression of cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth factor in human gastric carcinoma / H. Shi, J.M. Xu, N.Z. Hu et al. // World J Gastroenterol. 2003. - Vol.9(7). -1421-6.

51. Han S.L. Expression of COX-2 in stomach cancers and its relation to their biological features / S.L. Han, H.J. Tang, Y.W. Hua // Dig Surg. 2003. Vol. 20(2). - P.107-14.

52. Zhao Z.S. SPARC is associated with gastric cancer progression and poor survival of patients. / Z.S. Zhao, Y.Y. Wang, Y.Q. Chu et al. // Clin Cancer

53. Res.-2010.-Vol. 16(1). -P.260-8.

54. Wang C.S. Overexpression of SPARC gene in human gastric carcinoma and its clinic-pathologic significance / C.S. Wang, K.H. Lin, S.L. Chen et al. // Br J Cancer. -2004. Vol. 91(11). - P.1924-30.

55. Junnila S. Gene expression analysis identifies over-expression of CXCL1, SPARC, SPP1, and SULF1 in gastric cancer / S.Junnila, A. Kokkola, T. Mizuguchi // Genes Chromosomes Cancer. 2010. - Vol. 49(1). - P.28-39.

56. Varis A. Coamplified and overexpressed genes at ERBB2 locus in gastric cancer / A. Varis, A. Zaika, P. Puolakkainen // Int. J. Cancer. 2004. - Vol. 109. -P.548-553.

57. Scartozzi M. Molecular biology of sporadic gastric cancer: Prognostic indicators and novel therapeutic approaches / M. Scartozzi, E. Galizia, F. Freddari // Cancer Treat. Rev. 2004. - Vol. 30. - P.451—459.

58. Чумаков П.М. Белок p53 и его универсальные функции в многоклеточном организме / П.М. Чумаков // Успехи биологической химии. -2007.-Т. 47.-С. 3-52.

59. Levine A.J. The р53 pathway: what questions remain to be explored? / A.J. Levine, W.Hu, Z. Feng // Cell Death Differ. 2006. - Vol. 13. -P. 1027-1036.

60. Wiksten J.P. Comparison of the prognostic value of a panel of tissue tumor markers and established clinico-pathological factors in patients with gastric cancer / J.P. Wiksten, J. Lundin, S. Nordling // Anticancer Res. 2008. -Vol. 28. -P.2279-2287.

61. Grady W.M. Methylation of the CDH1 promoter as the second genetic hit in hereditary diffuse gastric cancer / W.M. Grady, J. Willis, P J. Guilford // Nat. Genet. 2000. - Vol. 26. - P. 16-17.

62. Qiang L. CDX2 expression is progressively decreased in human gastric intestinal metaplasia, dysplasia and cancer / L. Qiang, T. Ming, I. Kosei // Modern Pathol. 2007. - Vol. 20. - P. 1286-1297.

63. Itoh K. Proteomic alteration in gastric adenocarcinomas from Japanese patients / K. Itoh // Mol. Cancer. 2006. - Vol. 5. - P. 75.

64. Veenstra T.D. Biomarkers: mining the biofluid proteome / T.D. Veenstra, T.P. Conrads, B.L. Hood et al. // Mol. Cell Proteomics. 2005. - Vol. 4 (4).-P. 409-418.

65. Cheng Y. Proteome analysis of human gastric cardia adenocarcinoma by laser capture microdissection / Y. Cheng, J. Zhang, Y. Li et al. // BMC Cancer. -2007.-Vol. 7.-P. 191.

66. Yoshihara T. Proteomic alteration in gastic adenocarcinomas from Japanese patients/ T. Yoshihara, Y. Kadota, Y. Yoshimura et al. // Mol. Cancer.2006.-Vol. 5.-P. 75.

67. Волков М.Ю. Анализ результатов хирургического лечения больных кардиоэзофагеальным раком / М.Ю. Волков, А.В. Августинович, А.В. Пак и др. // Сибирский онкологический журнал. 2010. Прил. № 1. -С. 29.

68. Elpek G.O., Gelen Т., Aksoy N.H. Microvessel count, proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 indices in gastric adenocarcinoma // Pathol. Oncol. Res. 2000. - Vol. 6. - P. 59-64.

69. Seno H. CDX2 expression in the stomach with intestinal metaplasia and intestinal-type cancer: Prognostic implications / H. Seno, M. Oshima, M.A. Taniguchi // Int. J. Oncol. 2002. - Vol. 21 (4). - P. 769-774.

70. Lee W-S. Expression of Cyclooxygenase-2, p53 and Ki-67 in Gastric Cancer / W-S. Lee, H-S. Kim, S-K. Choi et al. // J. Korean Med. Sci. 2006. -Vol. 21.-P. 871-876.

71. Joo Y.E. Cyclooxygenase-2 expression is associated with well-differentiated and intestinaltype pathways in gastric carcinogenesis / Y.E. Joo, W.T. Oh, J.S. Rew // Digestion. 2002. Vol. 66. P. 222-229.

72. Brooks-Wilson A.R. Germline E-cadherin mutations in hereditary diffuse gastric cancer: Assessment of 42 new families and review of genetic screening criteria / A.R. Brooks-Wilson, P. Kaurah, G. Suriano // J. Med. Genet. -2004.-Vol. 41.-P. 508-517.

73. Cunningham D. Colorectal cancer / D. Cunningham, W. Atkin, H. J. Lenz et al. // Lancet. 2010. - 375. - P. 1030-47.

74. Fujiwara Y. Genetic detection of free cancer cells in the peritoneal cavity of the patient with gastric cancer: present status and future perspectives / Y. Fujiwara, Y. Doki, H. Taniguchi et al. // Gastric Cancer. 2007. - Vol. 10. - P. 197-204

75. Leung W. K. Screening for gastric cancer in Asia: current evidenceand practice / W. K. Leung, Wu MS, Y. Kakugawa, et al. // Lancet Oncol. 2008. -9(3).-P. 279-87.

76. Veer van't L. J. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer / L. J. van't Veer, H. Dai, M.J. van de Vijver et al. // Nature. -2002.-415.-P. 530-536

77. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins / P.H. O'Farrell //J Biol Chem. 1975. Vol. 250(10). - P. 4007-21.

78. Bjellqvist B. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications / B. Bjellqvist, K. Ek, P.G. Righetti et al. // J Biochem Biophys Methods. 1982. - Vol. 6(4). - P. 317-39.

79. Gelfi C, Bossi ML, Bjellqvist B, Righetti PG. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients in the pH 10-11 range / C. Gelfi, M.L. Bossi, B. Bjellqvist et al. // J Biochem Biophys Methods. 1987. - Vol. 15(1). - P.41-8.

80. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227(5259). -P.680-5.

81. Fish W.W. Gel chromatography of proteins in denaturing solvents. Comparison between sodium dodecyl sulfate and guanidine hydrochloride as dénaturants / W.W. Fish, J.A. Reynolds, C. Tanford // J Biol Chem. 1970. - Vol. 245(19).-P.5166-8.

82. Spengler B. Peptide sequencing by matrix-assisted laser-desorption mass spectrometry / B. Spengler, D. Kirsch, R. Kaufmann // Rapid Commun Mass Spectrom. 1992. - Vol. 6(2). - P. 105-8.

83. Karas M. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons / M. Karas, F. Hillenkamp // Anal. Chem. -1988.-Vol. 60.-P. 2299

84. Tanaka K. Protein and Polymer Analyses up to m/z 100 000 by Laser Ionization Time-of flight Mass Spectrometry / K. Tanaka, H. Waki., Y. Ido et al. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. -Vol. 2. - P. 151.

85. Schagger H. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa / H. Schägger, G. von Jagow // Anal Biochem. 1987. - 166(2). - P. 368-79.

86. Collet B. Differential analysis of glioblastoma multiforme proteome by a 2D-DIGE approach / B. Collet, N. Guitton, S. Saikali // Proteome Sci. 2011. -Vol. 9(1).-P. 16.

87. Wolters D.A. An automated multidimensional protein identification technology for shotgun proteomics / D.A. Wolters, M.P. Washburn, J.R. 3rd Yates // Anal Chem. 2001. - Vol. 73(23). - P. 5683-90.

88. Tong W. Identification of proteins in complexes by solid-phase microextraction/multistep elution/capillary electrophoresis/tandem mass spectrometry / W. Tong, A. Link, J.K. Eng, J.R.Yates // Anal Chem. 1999. -71(13).-P. 2270-8.

89. Yates J.R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database / J.R. Yates, J.K. Eng, J.K. A.L. McCormack et al. // Anal Chem. 1995. - Vol. 67(8). - P. 1426-36.

90. Sadygov R.G. Large-scale database searching using tandem mass spectra: looking up the answer in the back of the book / R.G. Sadygov, D. Cociorva, J.R. Yates // Nat Methods. 2004. - Vol. 1(3). - P. 195-202.

91. Hutchens T.W. New desorption strategies for the mass spectrometric analysis of macromolecules / T.W.Hutchens, T.T. Yip // Rapid Commun Mass Spectrom. Vol.7. - P.576-580.

92. Bischoff R. Methodological advances in the discovery of protein and peptide disease markers / R. Bischoff, T.M. Luider // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2004. - Vol. 803(1). - P.27^10.

93. Issaq H.J. The SELDI-TOF MS approach to proteomics: protein profiling and biomarker identification / H.J. Issaq, T.D. Veenstra, T.P. Conrads et al. // Biochem Biophys Res Commun. 2002. - Vol. 292(3). - P. 587-92.

94. Caputo E. Methods for on-chip protein analysis / E. Caputo, R. Moharram, B.M. Martin //Anal Biochem. 2003. - Vol. 321(1). - P. 116-24.

95. Liu C. The application of SELDI-TOF-MS in clinical diagnosis of cancers / C. Liu // J Biomed Biotechnol. 2011. - Vol. 2011. - ID. 245821.

96. Velculescu V.E. Serial analysis of gene expression / V.E. Velculescu, L. Zhang, B. Vogelstein et al. // Science. 1995. - Vol. 270(5235). - P. 484-7.

97. Hastie N.D. The expression of three abundance classes of messenger

98. RNA in mouse tissues / N.D. Hastie, J.O. Bishop // Cell. 1976. - Vol. 4(2). -P. 761-74.

99. Yamamoto M. Use of serial analysis of gene expression (SAGE) technology / M. Yamamoto, T. Wakatsuki, A. Hada et al. // J Immunol Methods. -2001. Vol. 250(1-2). - P. 45-66.

100. Ruijter J.M. Statistical evaluation of SAGE libraries: consequences for experimental design / J.M. Ruijter, A.H.Van Kampen, F. Baas // Physiol Genomics. 2002. -Vol. 11(2). - P. 37-44.

101. Adams M.D. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project / M.D. Adams, J.M Kelley, J.D. Gocayne et al. // Science. 1991. - Vol. 252. - P. 1651-1656.

102. Rhodes D.R. ONCOMINE: a cancer microarray database and integrated data-mining platform / D.R. Rhodes, J. Yu, K. Shanker et al. // Neoplasia. 2004. -Vol. 6(1). -P. 1-6.

103. Bai Z. Proteomics-based identification of a group of apoptosis-related proteins and biomarkers in gastric cancer / Z. Bai, Y. Ye, B. Liang et al. // Int J Oncol. 2011. - Vol. 38(2). - P. 375-83.

104. Washington K. 7th Edition of the AJCC Cancer Staging Manual: Stomach / K. Washington // Ann Surg Oncol. 2010. - Vol. 17. - P. 3077-3079.

105. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248-54.

106. Mortz E. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis / E. Mortz, T. Krogh, H. Vorum et al. // Proteomics. 2001. - Vol. l.-P. 1359-1363.

107. Cottingham K. HUPO Plasma Proteome Project: challenges and future directions / K. Cottingham // J. Proteome Res. 2006. - Vol. 5. - P. 1298.

108. Li S. J. Sys-BodyFluid: a systematical database for human body fluid proteome research / S. J. Li, M. Peng, H. Li et al. // Nucleic Acids Res. 2009. -37. -D907-12.

109. Karin O.A. Profiling, comparison and validation of gene expression in129 figastric carcinoma and normal stomach / O.A. Karin, VJ. Keith, D.G. Fullarton I I Oncogene. 2003. - Vol. 22. - P. 4287^300.

110. Ikeguchia M. Clinicopathological Significance of Cathepsin D Expression in Gastric Adenocarcinoma / M. Ikeguchia, K. Fukudaa, S. Okaa et al. // Oncology. 2001. - Vol. 61. - P.71-78.

111. El-Rifai W. Gastric Cancers Overexpress S100A Calcium-binding Proteins / W. El-Rifai, C.A. Moskaluk, A.M. Khalouck et al. // Cancer Research. -2002. Vol. 62. - P. 6823-6826.

112. Takeno A. Integrative approach for differentially overexpressed genes in gastric cancer by combining large-scale gene expression profiling and network analysis / A. Takeno, I. Takemasa, Y. Doki et al. // Br. J. Cancer. 2008. - Vol. 99.-P. 1307-1315.

113. Yang Y.Q. Upregulated expression of S100A6 in human gastric cancer / Y.Q. Yang, L.J.Zhang, H. Dong et al. // J. Dig. Dis. 2007. - Vol. 8. -P. 186-193.

114. Khromykh L.M. Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells / L.M. Khromykh, N.L. Kulikova, T.V. Anfalova et al. // Cell Immunol. 2007. - Vol. 249(1). - P. 46-53.

115. Li M. Cyclophilin A is overexpressed in human pancreatic cancer cells and stimulates cell proliferation through CD 147 / M. Li, Q. Zhai, U. Bharadwaj et al. // Cancer. 2006. - Vol. 106(10). - P. 2284-94.

116. Sherry B. Identification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product of lipopolysaccharide-activated macrophages / B. Sherry, N. Yarlett, A. Strupp et al. // Proc Natl Acad Sci. 1992. - Vol. 89. - P. 3511-3515.

117. Xu Q. Leukocyte chemotactic activity of cyclophilin /Q. Xu, M.C. Leiva, S.A. Fischkoff et al. // J Biol Chem. 1992. - Vol. 267(17). - P. 11968-71.

118. Bharadwaj U. Effects of cyclophilin A on myeloblasts cell line KG-1 derived dendritic like cells (DLC) through p38 MAP kinase activation / U.

119. Bharadwaj, R. Zhang, H. Yang // J Surg Res. 2005. - Vol. - 127(1). -P. 29-38.

120. Cecconi D. Proteomic analysis of pancreatic ductal carcinoma cells treated with 5-aza-2'-deoxycytidine / D. Cecconi, H. Astner, M. Donadelli // Electrophoresis. 2003. - Vol. 24. - P. 4291-4303.

121. Li Z. Proteomics Identification of Cyclophilin A as a Potential Prognostic Factor and Therapeutic Target in Endometrial Carcinoma / Z. Li, X. Zhao, S. Bai et al. // Mol Cell Proteomics. 2008. - Vol. 7. - P. 1810-1823.

122. Zheng J. Prolyl isomerase cyclophilin A regulation of Janus-activated kinase 2 and the progression of human breast cancer / J. Zheng, J.E. Koblinski, L.V. Dutson // Cancer Res. 2008. - Vol. 68. - P. 7769-7778.

123. Hathout Y. Differential protein expression in the cytosol fraction of an MCF-7 breast cancer cell line selected for resistance toward melphalan / Y. Hathout, K. Riordan, M. Gehrmann et al. // J Proteome Res. 2002. - Vol. 1. -P. 435-442.

124. Chen X. Variation in gene expression patterns in human gastric cancers / X. Chen, S.Y. Leung, S.T. Yuen et al. // Mol Biol Cell. 2003. -Vol. 14(8).-P. 3208-15.

125. Pierleoni A. eSLDB: eukaryotic subcellular localization database / A. Pierleoni, P. L. Martelli, P. Fariselli, R. Casadio // Nucleic Acids Res. 2007. -Vol. 35. -D208-12.

126. Sprenger J. LOCATE: a mammalian protein subcellular localization database / J. Sprenger, J. L. Fink, S. Karunaratne et al. // Nucleic Acids Res. -2008. Vol. 36. - D230-3.

127. Babelomics: advanced functional profiling of transcriptomics, proteomics and genomics experiments / F. Al-Shahrour, J. Carbonell, P. Minguez et al. // Nucleic Acids Res. 2008. - 36. - W341-6.

128. Franke K. Differential Expression of SPARC in Intestinal-type Gastric Cancer Correlates with Tumor Progression and Nodal Spread / K. Franke, S. Carl

129. McGrath, F.W. Rohl, et al. // Transl. Oncol. 2009. - Vol. 2. - P. 310-320.

130. Wang X.H. S100A6 overexpression is associated with poor prognosis and is epigenetically up-regulated in gastric cancer / X.H. Wang, L.H. Zhang, X.Y. Zhong et al. // Am. J. Pathol. 2010. - Vol. 177. - P. 586-597.

131. Huang H.L., Wu B.Y., Zhu X.D., et al. (2008) Expression of S100A6 in primary and metastatic human gastric cancer / H.L. Huang, B.Y. Wu, X.D. Zhu, et al. // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2008. - Vol. 30. - P. 506-510.

132. Xu L.L., A novel androgen-regulated gene, PMEPA1, located on chromosome 20ql3 exhibits high level expression in prostate /L.L. Xu, et al. // Genomics. 2000. - Vol. 66. - P. 257-263.

133. Giannini G., EGF- and cell-cycle-regulated STAG 1/PMEPA1 /ERG 1.2 belongs to a conserved gene family and is overexpressed and amplified in breast and ovarian cancer / G. Giannini // Mol. Carcinog. -2003. Vol. 38, N 41. -P. 88-200.

134. Rae F.K., Characterization of a novel gene, STAG1/PMEPA1, upregulated in renal cell carcinoma and other solid tumors / F.K. Rae, et al. // Mol. Carcinog. 2001. - Vol. 32, N 1. - P. 44-53.

135. Singha P.K., Transforming growth factor-beta (TGF-beta)-inducible gene TMEPAI converts TGF-beta from a tumor suppressor to a tumor promoter in breast cancer / P.K. Singha, et al. // Cancer Res. -2010. Vol. 70, N 15. -P. 6377-83.

136. Cao D, Fan ST, and Chung SS (1998) Identification and characterization of a novel human aldose reductase-like gene. J Biol Chem 273:11429-11435.

137. Heringlake S. Identification and expression analysis of the aldo-ketoreductasel-ВЮ gene in primary malignant liver tumours / S. Heringlake, M. Hofdmann, A. Fiebeler // J Hepatol. 2010. - Vol. 52, N2. - P. 220-7.

138. Кропотова E. С. Снижение экспрессии гена AKR1B10 приколоректальном раке / Е. С. Кропотова, Р. А. Тьічко, О. JI. Зиновьеваи др. І І Молекулярная биология. 2010. - Том 44, № 2. - С. 243-251.

139. Wang С. Aldo-keto reductase family 1 member BIO promotes cell survival by regulating lipid synthesis and eliminating carbonyls / C. Wang, R. Yan, D. Luo // J Biol Chem. 2009. - Vol. 284(39). - P. 26742-8.

140. Endo S. Kinetic studies of AKR1B10, human aldose reductase-like protein: endogenous substrates and inhibition by steroids / S. Endo, T. Matsunaga, H. Mamiya et al. // Arch Biochem Biophys. 2009. - Vol. 487(1). - P.l-9.

141. Li C.P. AKR1B10 in usual interstitial pneumonia: expression in squamous metaplasia in association with smoking and lung cancer / C.P. Li, A. Goto, A. Watanabe // Pathol Res Pract. 2008. - Vol. 204(5). - P. 295-304.

142. Balendiran G.K. Cancer biomarker AKR1B10 and carbonyl metabolism / G.K. Balendiran, H.J. Martin, Y. El-Hawari // Chem Biol Interact. -2009.-Vol. 178(1-3).-P. 134—7.

143. Yan R. Aldo-keto reductase family 1 B10 gene silencing results in growth inhibition of colorectal cancer cells: Implication for cancer intervention / R. Yan, X. Zu, J. Ma // Int J Cancer. 2007. - Vol. 121(10). - P. 2301-6.

144. Rho H.W., Identification of valid reference genes for gene expression studies of human stomach cancer by reverse transcription-qPCR / H.W. Rho, B.C. Lee, E.S. Choi, et al. // BMC Cancer. 2010. - Vol. 10. - P. 240.

145. Myllykangas S. Integrated gene copy number and expression microarray analysis of gastric cancer highlights potential target genes / S. Myllykangas, S. Junnila, A. Kokkola // Int J Cancer. 2008. - Vol. 123(4). -P. 817-25.

146. Gallego O. Structural basis for the high all-trans-retinaldehyde reductase activity of the tumor marker AKR1B10 / O. Gallego, F.X. Ruiz, A. Ardevol et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2007. - Vol. 104(52). - P. 20764-9.