Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:I и II фаза клинического изучения человеческого рекомбинантного интерлейкина -1 β у больных злокачественными опухолями

РГ8 О Л

На правах рукописи

Новиков Валерий Валентинович

I и II фаза клинического изучения человеческого рекомбинантного интерлейкина - "фу больных злокачественными опухолями.

14.00.14 - Онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в отделении комбинированных методов лечения и в отделении клинической радиоиммунологии Онкологического научного центра Российской академии медицинских наук (директор -академик Н.Н.Трапезников).

Научные руководители:

доктор медицинских наук М.РЛичиницер профессор З.Г.Кадагидзе

Официальные оппоненты:

профессор В.В.Малиновская профессор В.И.Борисов

Ведущее научное учреждение:

Научно - исследовательский институт диагностики и хирургии МЗ МП РФ

Защита диссертации состоится " 18 " декабря 1997 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Онкологического научного центра РАМН по адресу: 115478, Каширское ш., д. 24

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН. Автореферат разослан " 18 " ноября 1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор мед. наук, профессор

В.С.ТУрусов

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Интерлейкины (ИЛ) представляют новый класс потенциальных лекарств для лечения больных со злокачественными опухолями.

К настоящему времени п клинических исследованиях интенсивно изучаются ИЛ1, ИЛ2, ИЛЗ, ИЛ4, ИЛ6 и ИЛ12. Вместе с другими цитокинами (интерфероны, фактор некроза опухоли) и факторами роста (Г-КСФ, ГМ-КСФ, и др.) применение интерлейкинов составляет основу развития биотерапии как нового направления в клинической онкологии.

ИЛ1 обладает метаболической, эндокринной, иммунологической, гематологической и противоопухолевой активностью. ИЛ1а и ИЛ1р имеют значительные различия по аминокислотному составу, общий рецептор и сходные биологические эффекты. Клинические исследования рекомбинантных препаратов ИЛ1 только начинаются (ИЛ1Р, Буг^ех, США; ИЛ1а, Башрроп, Япония; ИЛ1а, 1штипех, США). В России создан ШПр (беталейкин) с высокими характеристиками биологической активности по международным стандартам.

Актуальным является клинико-фармакологическое и иммунологическое изучение беталенкина, которое проводится впервые. Такое исследование создает основу для развития новой лечебной стратегии в комбинированном лечении злокачественных опухолей.

Цель исследования:

Разработать рациональный режим применения беталейкина при самостоятельном использовании и в сочетании с цитостатическими препаратами (5-фторурацил). Дать характеристику влияния беталейкина на иммунитет, продукцию цитокинов и гемопоэз у больных со злокачественными опухолями.

Задачи исследования.

1. Дать клиническую характеристику переносимости беталейкина при внутривенном 30-мин и 3-часовом режиме введения в течение 5 дней при повышении дозы по модифицированной шкале Фибоначчи.

2. Разработать оптимальный режим клинического применения беталейкина, дать рекомендации по улучшению переносимости препарата.

3. Изучить влияние беталейкина на гемопоэз (динамика числа нейтрофилов, тромбоцитов, эритроцитов), иммунологические показатели (популяционный состав лимфоцитов: CD3, CD4, CD8, CD16, CD4/CD8, количество активированных Т-лимфоцитов (CD25, CD38 и HLA-Dr), изучение пролиферативной активности Т-лимфоцнтов в реакции бласттрансформации, исследование функциональной активности Т-хелперов по способности к продукции ИЛ-2 in vitro при стимуляции митогеном), а также уровни ИЛ6, ФИО и белков острой фазы иммунологического ответа (С-реактивный белок, С3-компонент комплимента) у больных раком почки и меланомой.

4. Изучить токсикомоднфнцирующее действие беталейкина при сочетаном применении с 5-фторурацилом, влияние беталейкина на противоопухолевое действие 5-фторурацила у мышей; провести I фазу разработки режима комбинации беталейкина и 5-фторурацила у больных раком желудка и толстой кишки.

Научно-практическая значимость.

Беталейкин стимулирует иммунитет, увеличивает количество тромбоцитов и лейкоцитов, что позволяет рекомендовать его применение в комбинированном лечении злокачественных опухолей.

Беталейкин уменьшает токсические эффекты цитостатической химиотерапии (на примере 5-фторурацила), что приводит к снижению частоты осложнений.

Беталейкин разрешен Фармакологическим комитетом России дня практического применения у онкологических больных.

Введение в медицинскую практику беталейкина создает новые возможности для научных исследований по биотерапии злокачественных опухолей.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц, иллюстрирована 20 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, выводов, указателя литературы. Список литературы включает 75 источников, в том числе 5 отечественных и 70 иностранных.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на совместной конференции отделений комбинированных методов лечения, лаборатории клинической радиоиммунологии, клинической фармакологии и химиотерапии, химиотерапии.

По материалам диссертации опубликовано 3 научных работы.

Материалы и методы.

I фаза клинического изучения Беталейкина проведена у 39 больных с различными злокачественными опухолями (рак почки - 19, меланома - 15, другие злокачественные опухоли - 5).

Начальная доза беталейкина составила 1 нг/кг. Лечение осуществлялось до появления лимитирующих побочных реакций. Повышение дозы осуществлялось по модифицированной шкале Фибоначчи.

10 больных получили Беталейкин путем 3-часовой внутривенной инфузии. Препарат вводился в течение 5 дней. Курс лечения повторялся с интервалом 15 дней (от 1 дня) (режим I).

29 больных получили беталейкин в течение 30 мин в течение 5 дней, курсы с интервалом 15 дней (режим II).

Содержание гемоглобина, эритроцитов, тромбоцитов, лейкоци-

тов и их состав в периферической крови изучались до введения, в конце введения (+ 3 ч) и через 2 часа после окончания введения (+ 5 ч), а также на следующий день (+ 24 ч) (режим I).

При режиме II эти показатели изучались со следующей периодичностью: до введения, через 30 мин после начала введения, через 1,5 часа после начала введения, через 2,5 часа, через 3,5 часа и через 24 часа в дни 1, 3, 5 и 8. В дни 2 и 4 анализы брались только до введения беталейкина.

Биохимические показатели (креатинин, мочевина, о. белок, альбумин, AJIT, ACT, ЩФ, ЛДГ, глюкоза) изучали до введения и на 8 день.

В период курсов лечения анализировали все непосредственные реакции (повышение температуры тела, озноб, снижение или повышение артериального давления, головная боль, и др.).

Углубленное клинико-фармакологическое и иммунологическое исследование беталейкина проведено при оптимальном уровне дозы беталейкина 12 или 16 нг/кг. Число курсов составило 73.

Иммунологические показатели (иопуляционный состав лимфоцитов, количество активированных Т-лимфоцитов, пролиферативная активность, активность Т-хелперов по способности к продукции ИЛ-2) изучались до начала введения (день 1) и после введения препарата (день 8) (26 больных). Изучение содержания интерелейкина-6, фактора некроза опухоли и белков острой фазы (С-реактивный белок, С3-компонент комплимента) проведено до начала введения беталейкина и через полтора часа после начала введения (1 час после окончания введения), а также на высоте реакции (20 больных).

Экспериментальное изучение беталейкина проведено на 717 мышах.

Изучены токсикомодифицирующие свойства беталейкина при комбинации с 5-фторурацклом на мышах самцах Fl (СБА х С57В1), а также влияние беталейкина на противоопухолевое действие 5-фтору-рацила в эксперименте на мышах с опухолью (АК755, Р388).

При I фазе клинического исследования (10 больных) беталейкин и 5-фторурацил вводили в дозе 375 мг/м2/день внутривенно струйно в течение 5 дней. Беталейкин вводили в дозе 16 нг/кг/день в виде 30-мин внутривенной инфузии в физ. растворе хлорида натрия в течение 5 дней. 5-фторурацил вводили через 1,5 час после начала инфузии Беталейкина.

Лечебный эффект оценивали с использованием рентгенографии, эхографии, компьютерной томографии, и др. Использовали стандартные критерии для оценки лечебного результата и побочных эффектов.

Статистический анализ осуществлялся с использованием критерия Стьюдента и критерия х2-

Результаты исследования.

Клгашко-фармакологическое изучение беталейкина при 3-часопом режиме введения (I фаза).

Лечение беталейкином получили 10 больных в режиме 3-часовой инфузии (рак почки - 5 больных, меланома - 4 больных, без ясного первичного очага - 1 больной). Введение беталейкина проводилось ежедневно в течение 5 дней.

Разовая доза беталейкина повышалась от 1 до 7 нг/кг, по модифицированное шкале Фибоначчи. Данные о количестве проведенных курсов и дозах беталейкина приведены в таблице 1.

У 8 больных лечение прекращено в связи с появлением признаков прогрессирования. 1 больной отказался от дальнейшего лечения.

Таблица 1. Количество курсов, полученных в каждой группе.

Доза беталейкина, нг/кг 1 2 3.3 5 7

количество курсов 12 7 10 5 5

Отмечена хорошая переносимость беталейкина - только при одном введении у одного больного отмечено развитие осложнения (озноб с повышением температуры).

Отмечено достоверное увеличение количества лейкоцитов и ней-трофилов через 3 и 5 часов после начала введения (р<0,05 и р<0,001, соответственно); через 24 часа от начала введения первой дозы количество лейкоцитов оказывалось несколько сниженным по сравнению с исходным. На 4, 7 и 14 сутки от начала лечения изучаемые показатели практически не отличались от исходных (р > 0,01).

Изучено также изменение числа тромбоцитов и эритроцитов после введения беталейкина. Отмечена тенденция к повышению числа тромбоцитов на 14 день.

При изучении динамики эритроцитов установлена статистически значимое снижение от исходного значениия через 3, 5 часов и к исходу 1 суток (р<0,001, р<0,01 и р<0,05, соответственно).

Клшшко-фармакологическое изучение беталейкина при 30-минугном режиме лечения (I фаза).

После установления безопасности применения беталейкина при 3-часовом введении был начат следующий этап - 30 минутное введение.

В эту группу вошли 29 больных (рак почки - 14, меланома - 11, другие - 4). Сведения о леченных больных даны в таблице 2. Началь-

Таблица 2. Характеристика больных, получивших лечение бета-лейкином при 30-минутном введении.

Характеристика Количество больных

пол м 18

ж 11

возраст по 50 лет 11

старше 50 пет 18

Всего 29

ной дозой была избрана доза 5 нг/кг с последующим увеличением по модифицированной шкале Фибоначчи. Лечение проводилось 5-дневными курсами с интервалом 2 недели.

Лечение прекращено в связи с прогрессированием заболевания у 26 человек, 1 отказался от продолжения лечения и у 2 больных - из-за плохой переносимости (сильный озноб с повышением температуры).

Количество курсов терапии (введенных доз) составило в группе 5 нг/кг - 6 (29), 7 нг/кг - 6 (25), 9,1 нг/кг - 4 (19), 12 нг/кг - 42 (205), 16 нг/кг - 19 (105).

Переносимость беталейкина в зависимости от величины разовой дозы и использования жаропонижающих препаратов до начала введения беталейкина представлена в таблице 3.

Основными реакциями при лечении беталейкином были повышение температуры, озноб', снижение артериального давления. Кроме того, наблюдали рвоту, головную боль, боль в области поясницы.

Озноб обычно развивался еще по время »ведения беталейкина (через 15 - 30 мин после начала введения) или в течение 30 мин после введения; температура появлялась одновременно с ознобом, иногда с задержкой на 10 - 20 мин; редко озноб не сопровождался повышением температуры; степень повышения температуры была 1 -2 по шкале ВОЗ.

Артериальное давление снижалось через несколько часов посте введения до 90 - 80 мм рт. ст., восстанавливалось в течение 30 мин, при внутривенном введении физиологического раствора или самостоятельно. Ни в одном случае гипотония не была клинически значимой.

С увеличением дозы беталейкина отмечено учащение частоты появления озноба при дозе 12 нг/кг и 16 нг/кг (р<0,05). Имеется также достоверное различие между группами 5 и 12 нг/кг (р<0,05), 7 и 12 нг/кг (р<0,01), 9 и 16 нг/кг (р<0,05).

Таблица 3. Количество осложнений и частота по отношению к общему числу введений беталейкина в зависимости от дозы и применения жаропонижающих препаратов.

Количество осложнений (%)

доза беталейкина 5 7 9,1 12 16

применение аспирина до введения не применялся применялся не применялся применялся не применялся применялся не применялся применялся не применялся применялся

общее количество ввеедений беталейкина 27 2 17 8 12 7 179 26 80 25

озноб 11 (40,7) 1 (50,0) 12 (70,6) 2 (25,0) 11 (91,7) - 139 (77,7) 20 (76,9) 65 (81,3) 17 (68,0)

всего 12 (41,4) 14 (56,0) 11 (57,9) 159 (77,6) 82 (78,1)

повыешине температуры < 38°С (ВОЗ=1) 3(11,1) - 8 (47,1) 2 (25,0) 4 (33,3) 1 (14,3) 32 (17,9) 8 (30,8) 16 (20,0) 16 (64,0)

> 38°С (ВОЗ =2) - - 1 (5,9) - 6 (50,0) - 87 (48,6) 15 (57,7) 55 (68,8) 7 (28,0)

всего 3 (10,3) 11 (44,0) 11 (57,9) 142 (69,2) 94 (89,5)

снижение артеоиального давления ниже мм рт. ст. - - - - 1 (8,3) - 11 (6,1) 8 (30,8) 7 (8,8) 3 (12,0)

всего - - 1 (5,3) 19 (9,2) 10 (9,5)

рвота - - - - 1 (8,3) - 10 (5,6) 4 (15,4) 2 (2,5) 1 (4,0)

всего - - 1 (5,3) 14 (6,8) 3 (2,9)

головная боль - - - - - - 5 (2,8) - 17 (21,3) -

всего - - - 5 (2,4) 17 (16,2)

боль в области поясницы 1 (3,7) - - - - - - - 3 (3,8)

всего 1 (3,3) - - - 3 (2,9)

о

и

Учащение повышения температуры статистически достоверно между группами 12 и 16 нг/кг (р<0,01), а также при сравнении групп 5 и 9, 7 и 12 нг/кг, 9 и 16 нг/кг (р < 0,01 во всех случаях).

В развитии гипотонии не отмечено статистически достоверной зависимости от дозы беталейкнна.

Головная боль наблюдалась у больных, получавших беталейкин в дозе 12 и 16 нг/кг (р<0,01). Возникала головная боль при введении беталейкина обычно на высоте озноба и/или повышения температуры. Она могла быть значительной. После прекращения озноба, нормализации температуры, головная боль проходила без использования медикаментозного лечения.

С целью предупреждения осложнений часть больных за 1 час до введения принимала аспирин в дозе 1 г. Как видно из таблицы 3, применение аспирина способно предупреждать развитие озноба; повышение температуры становится менее выраженным.

Все выше сказанное дает возможность утверждать, что частота появления озноба, повышения температуры и головной боли зависят от дозы беталейкина.

Увеличение числа лейкоцитов после введения беталейкина отмечается уже через 30 мин после начала введения. Максимальный уровень достигался через 2 часа после введения, к 4 часам число лейкоцитов снижалось и к исходу 1 суток достигало исходного уровня. У каждого больного максимальное увеличение числа лейкоцитов оставалось примерно равным от курса к курсу, но между больными имелись существенные различия.

В таблице 4 приведены средние значения числа лейкоцитов у больных, получивших лечение беталейкином в разных дозах и достоверность их отличия от исходного значения. Следует отметить, что увеличение числа лейкоцитов при дозе 7 и 9,1 нг/кг оказывается достоверным (через 2 часа р < 0,001 и р < 0,01, соответственно).

Не выявлено достоверных изменений числа тромбоцитов, хотя

отмечается тендеция к повышению числа тромбоцитов на 14 день при дозах 12 и 16 нг/кг.

Отмечается достоверное снижение числа эритроцитов через 4 часа при дозах 5, 7, 9,1 нг/кг (р < 0,01; р < 0,05; р < 0,05, соответственно) с последующим восстановлением через 1 сутки, а также снижение числа эритроцитов через 4 суток при дозе 16 нг/кг (р < 0,05). Исходя из предположения, что данное снижение вызвано задержкой жидкости и снижением гематокрита, мы проанализоировали отдельно этот показатель. Отмечено уменьшение гематокрита в течение 1 суток после введения при 5 нг/кг (через 4 часа - р<0,01), а при 16 нг/кг в течение 1 суток и через 4 дня (р<0,05).

Не отмечено ачияния на биохимические показатели крови.

Таблица 4. Среднее число лейкоцитов у больных, получивших лечение беталейкшшом, в зависимости от его дозы и по сравнению

с исходными показателями.

Доза беталей-кина, нг/кг Время определения До начала лечения через 30 мин через 1 час через 2 часа через 4 часа через 1 сутки через 4 суток через 7 суток

5 среднее число лейкоцитов 6,54 8,17 8,4 9,13 7,98 6,61 5,47 6,09

достоверность отличия от исходного значения - р > 0,01 р > 0,01 р > 0,01 р > 0,01 р > 0,01 р > 0,01 р > 0,01

7 среднее число лейкоцитов 6,37 10,66 10,72 12,34 11,23 5,97 5,78 6,03

достоверность отличия от исходного значения - р < 0,05 р < 0,01 Р < 0,001 Р < 0,001 р > 0,01 р > 0,01 р > 0,01

9,1 и 12(1 пациент) среднее число лейкоцитов 5,91 - 7,93 9,69 9,29 6,84 8,3 6,82

достоверность отличия от исходного значения - - р > 0,01 р < 0,01 р < 0,05 р > 0,01 р > 0,01 р > 0,01

Клиническое изучение иммуномодулиругощего действия беталейкина.

Изучено влияние беталейкина на показатели иммунитета (популя-ционный состав лимфоцитов: CD3, CD4, CD8, CD16, CD4/CD8, количество активированных Т-лимфоцитов, пролиферативная активность Т-лимфоцитов, исследование функциональной активности Т-хелперов по способности к продукции ИЛ-2 in vitro) у больных раком почки и меланомы.

В целом, у больных, получавших беталейкин в дозах 5, 7, 9, 12 или 16 нг/кг, не выявлено статистически значимых различий ни в общем количестве Т-лимфоцитов, ни в количестве CD4, CD8 или CD16 клеток между показателями до начала лечения и по окончании 1-го курса. Не отмечено также существенного изменения пропорции активированных лимфоцитов. Средние данные по этим показателям приведены в таблице 5.

Однако, больные были в достаточной степени неоднородными по исходным (до начала лечения) показателям, и поэтому был проведен

Таблица 5. Изменение пропорции Т-лимфоцитов и их субпопуляций после проведения 1-го курса лечения беталейкином.

Тип маркера % позитивных клеток Р

до лечения после 1 курса

CD3 56,33 1,78 58,47 1,5 » 0,05

CD4 35,25 1,2 36,40 1,38 » 0,05

CD8 22,49 1,1 21,84 0,96 » 0,05

CD16 17,49 2,08 16,37 1,48 » 0,05

CD25 4,26 0,68 4,92 0,93 » 0,05

CD38 33,63 3,23 28,03 1,97 » 0,05

HLA-DR 11,77 0,14 11,82 0,12 » 0,05

соотношение CD4/CD8 1,98 0,28 2,03 0,34 > 0,05

анализ результатов, полученных после 1 курса лечения беталейкштм по сравнению с данными до лечения, исхода из начальных показателей.

До начала лечения 69,5 % больных имели сниженную по сравнению с нормой пропорцию Т-лимфоцитов (CD3')- Во всей группе обследованных больных повышение количества Т-лимфоцитов выявлено у 47,8 %. Это повышение имело место преимущественно в группе больных со сниженным исходным показателем - в 62,5 % случаев, и было статистически значимым: в среднем 49,6 ± 3,2 % до и 62,02 ± 2,7 % после 1 курса (р < 0.05).

Пропорция CD4 клеток, практически не изменившаяся в целом по всей группе обследованных больных, статистически значимо возросла у 60 % больных с исходно сниженным ее уровнем - 27,5 ±1,9 % до и 34,53 ± 2,5 % но окончании 1 курса (р < 0.05).

Сходные результаты отмечены и в отношении CD8 клеток. Их количество было исходно сниженным у 61,9 % и возросло после 1 курса у 53,8 % из них. У 30% больных количество CD8 клеток снизилось, но это снижение не было статистически значимым.

Соотношение пропорций иммунорегуляторных Т-лимфоцитов CD4/ CD8 исходно было сниженным у 45 % и превышало нормальный уровень у 30 % больных. По окончании 1 курса у 45 % оно повысилось 2,0 ± 0,3 и 2,0 ± 0,3, соответственно, но это повышение не было статистически значимым (р > 0,05). В группе больных с исходно сниженным соотношением CD4/CD8 наблюдали достоверное возрастание показателя у 77,8 % (1,1 ± ОД и 2,3 ± 0,4; р < 0,05).

Количество CD16 и CD25 клеток менялась незначительно.

Интенсивность реакции бласттрансформации под действием бета-лейкина в среднем по группе возросла (1,8 ± 0,3 до начала и 10,2 ± 5,3 по окончании 1 курса), что свидетельствует об активации способности Т-лимфоцитов пролиферировать в ответ на митоген.

Заметные изменения выявлены в способности лимфоцитов боль-

f>

пых, получавших беталсйкип. к продукции in vitro интерлейкииа-2 (WI-2) в ответ на стимуляцию ФГА.

У 9 из 19 больных до начала лечения продукции ИЛ-2 не выявлено; у 8 больных исходно титр ИЛ-2 в супернатантах стимулированных лимфоцитов был 1/4 - 1/8. У 3 из 9 больных, лимфоциты которых не продуцировали ИЛ-2 до начала лечения, отсутствие продукции сохранялось и в процессе лечения. У 1 больного до лечения и сразу после 1-го курса активность ИЛ-2 определялась только в разведениях сунернатантов 1/4 и 1/16, а при последующих курсах снижалась до 0. Существенное возрастание продукции ИЛ-2 после-1-го курса лечения беталейкином отмечено у 4 больных: 1/32 - 1/64 и более. У 1 больной интенсивная продукция ИЛ-2 появилась после 3-го курса (титр 1/64); к началу очередного курса она падала до титров 1/4 -1/16, а после курса вновь возрастала до 1/64 и выше.

Среди 8 больных с исходно низкой (титры 1/2 - 1/8) продукцией ИЛ-2 у 1 она оставалась неизменной на протяжении 3 курсов; у 4 - слабо возрастала после каждого курса и у 3 возрастала существенно после 2 или 3 курсов до уровня, превышающего титр 1/ 64, а у 1 из них титр ИЛ-2 достигал 1/128 после 3 курса, но к 4 курсу у этой больной продукция ИЛ-2 упала до 0.

Таким образом, беталейкин обладает иммунокоррегирующим действием у больных с исходными нарушениями, он изменяет количественные и функциональные показатели лимфоцитов.

Влияние беталейкина на уровень шггерлейкина-б, фактора некроза опухоли и белков острой фазы.

У 20 больных до начала введения беталейкина в дозах 12 или 16 нг/кг/день и через полтора часа после начала введения (1 час после окончания введения) были взяты образцы крови. У 9 больных кровь бралась также на высоте реакции (максимальный озноб).

1Ь

Фактор некроза опухоли и ИЛ-6 были определены в 89 образцах. С-реактивный белок - п 303 образцах и С.-копоиепт комплимента - в 296 образцах.

В зависимости от выраженности температурной реакции все пациенты были разделены на три группы: с температурной реакцией до 37°С (В03=0, отсутствовало повышение температуры), от 37° до 38°С (ВОЗ=1) и выше 38°С (ВОЗ=2, выраженная температурная реакция). Отдельно было изучено различие показателей в этих 3 группах. Между группой без повышения температуры и с минимальным повышением температуры достоверного различия не выявлено ни но одному показателю, что позволило нам объединить их в одну группу - с минимальной температурной реакцией.

С-реактивный белок исходно был повышен в среднем примерно в 4 раза у всей группы больных. У больных с выраженной температурной реакцией исходное значение было в три раза выше чем у больных с минимальной температурной реакцией (р < 0,001). Та же самая закономерность отмечалась и после введения (р<0,001). На высоте температурной реакции значения различаются также более чем в 2 раза.

В обеих группах отмечается общая закономерность в повышении содержания С-реактивного белка (СРВ) на высоте реакции примерно в 2 раза с последующим снижением до исходного значения. При этом в группе с минимальной реакцией разница между исходным значением и значением на высоте реакции, также между значением на высоте реакции и через 1 час после введения достоверны (р<0.01). В группе со значительной температурной реакцией различия между значениями СРВ до введения и на высоте реакции оказались недостоверны, а между значениями на высоте реакции и после введения достоверными (р<0.05). Изменения СРВ во всех группах показаны на рис. 1.

При изучении содержания С3 фракции комплемента в общем

Рис. 1.

Изменение содержания СРБ во всех группах.

14,00 -12,00 10,00 -8,00 -6,00 -4,00 -2,00 0,00

сохраняется та же тенденция к повышению на высоте реакции и последующему снижению через 1 час после окончания введения до исходного значения. Различия между группами до введения, на высоте реакции и через 1 час после введения статистически не значимы.

При анализе содержания инерлепкина-6 в сыворотке у всех больных отмечается увеличение концентрации на высоте реакции (незначительно) и через 1 час после окончания введения в 3 раза (р<0.01). Не отмечено достоверного различия содержания ИЛ-6 в сыворотке до начала введения и на высоте реакции, а также на высоте реакции и после введения. При сравнении содержания ИЛ-6 до введения в группах с минимальными и выраженными температурными реакциями отмечается статистически достоверное различие (р<0.01). То же и для значений через 1 час после введения (р<0.001). При анализе динамики в группах отмечается достоверное увеличение концентрации ИЛ-6 у больных с выраженной температурной реакцией через 1 час после введения (Р<0.01). Также отмечено увеличение ИЛ-6 у больных с минимальной реакцией, хотя и не столь выраженное (р > 0,01) (рис. 2).

Фактор некроза опухоли был изучен в тех же образцах, что и ИЛ-6. Результаты приведены на рисунке 3.

Рис. 2. Изменение содержания ИЛ-6 у больных с минимальными температурными реакциями, выраженными реакциями и в общей группе.

4o.ce

с; 2

30.00

20.00

дЛ

I < 38°С ■> 38°С □ Общая группа

Рис. 3. Изменение содержания фактора некроза опухоли после введения беталейкина у всех больных и у больных с выраженными температурными реакциями.

40 у 35 -30

до на после

высоте реакции

И Общая группа ■> 38°С

Отмечается повышение содержания ФИО через 1 час после введения по сравнению с исходным (разница статистически не достоверна). На высоте реакции его содержание примерно соответствовало исходному. При отдельном анализе групп содержание ФНО увеличивается через 1 час после введения. В группе с минимальными температурными реакциями разница статистически не достоверна, в группе с выраженными температурными реакциями достоверна (р<0,05).

Изуче1ше токснкомодифицирующих свойств беталейкина при комбинации с 5-фторурацнлом у экспериментальных животных.

Предварительно была изучена острая токсичность 5ФУ на мышах. ЛД^ составила 350 (241 ч- 507) мг/кг; МПД= 150 (103 ч- 217) мг/кг.

Для изучениея влияния беталейкина на количественную токсичность 5ФУ примененяли в дозе 60 мг/кг, что вызвало гибель 100% животных в период с 10 по 20 сутки опыта. Сочетанное применение 5ФУ с беталейкином уменьшило количество павших животных до 60%, сроки гибели отодвинулись к 15 - 33 суткам.

Однократное применение 5ФУ в дозе 500 мг/кг вызвало гибель 90% животных с 17 по 30 сутки. Применение беталейкина в дозе 10 тыс ЕД на мышь уменьшило процент гибели до 50 % и сроки гибели отодвинулись к 26 - 33 суткам. Применение одного беталейкина в дозе 10 тыс ЕД на мышь, пятикратно, ежедневно, гибели животных не вызвало.

При аналогичной постановке опыта, но с дозами 5ФУ равными 30 и 300 мг/кг (соответственно МПД и ДЕу, применение беталейкина снизило процент павших животных до 0.

С целью количественной оценки этого эффекта было проведено исследование выживаемости мышей под воздействием 5ФУ в комбинации с беталейкином.

В первой серии опытов 5ФУ вводили внутрибрюшинно однократно в градиенте доз от 100 до 700 мг/кг. Расчетную ЛД,Л принимали за

единицу. Животным ежедневно пятикратно вводили беталейкип в дозе 10 тыс ЕД на мышь. Через час после последнего введения беталейкина виутрибрюшинио вводили 5ФУ в градиенте доз от 100 до 700 мг/кг. Расчетную ЛД^ соотносили с ЛД^ для чистого 5ФУ. В данном случае фактор изменения дозы (ФИД) составил 1,5.

В следующей серии опытов 5ФУ вводили виутрибрюшинио ежеде-невно в течение 5 дней в градиенте разовых доз от 12 до 80 мг/кг. Беталейкин в дозе 10 тыс ЕД на мышь вводили за 1 час перед каждым введением 5ФУ. В данном случае ФИД составил 1,67.

Для изучения влияния беталейкина на качественные проявления токсичности, 5ФУ вводили виутрибрюшинио однократно в дозе 300 мг/кг или пятикратно ежедневно в разовой дозе 30 мг/кг. За трое суток перед введением и на 3, 6, 10, 13, 16, 19 и 22 сутки после курсового или однократного введения 5ФУ у животных брали кровь для определения общего количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. В эти же сроки у 5 животных из каждой группы определяли клеточиость костного мозга. Каждая группа насчитывала 40 мышей.

При введении 5ФУ на фоне предварительного пятикратного ежедневного введения беталейкина в разовой дозе 10 тыс ЕД/мышь, различий в сроках и глубине лейкоцитопении не обнаружено. Однако при курсовом применении 5ФУ на фоне ежедневных введений беталейкина лейкопения выражена значительно слабее, чем при введении одного 5ФУ.

Однократное применение 5ФУ в дозе 300 мг/кг приводило к снижению общего количества эритроцитов к 13 суткам до 3,8 млн в мм куб. Восстановление этого показателя наступало только к 19 суткам. Предварительное курсовое применение беталейкина несколько уменьшало эритроцитопенический эффект 5ФУ в этом режиме и практически полностьью купировало его при курсовом введении 5ФУ.

Аналогичная картина наблюдается при подсчете количества тром-

боцитов. Применение беталейкина перед однократным введением 5ФУ практически полностью купирует тромбоцнтопенню. При курсовом введении 5ФУ на фоне беталейкина тромбоцитопения вообще не наступала.

Оценка противоопухолевого эффекта 5-фторурацила и беталейкина у мышей.

В первом из проведенных экспериментов использована доза 5-фторурацила равная 10 мг/кг с 1 по 11 сутки и доза беталейкина 10 тыс. Ед/мышь. Эффективность лечения оценивали по проценту торможения роста солидной опухоли (адепокарцинома молочной железы АК755) по сравнению с контролем (ТРО, %) на 12, 17 и 21 сутки после прививки и увеличению средней продолжительности жизни (УПЖ, %).

Средние объемы опухолей в группе, получавшей беталейкин, не отличались от контрольных величин. На 12 сутки ТРО в группе, получавших 5ФУ составило 60 %. Комбинированное применение беталейкина с 5ФУ не снижало противоопухолевой активности последнего и ТРО в этой группе составляло на 12 сутки 58 %. С 17 суток противоопухолевый эффект 5ФУ (по критерию ТРО) во всех подопытных группах отсутствовал. Средний объем опухолей практически не отличался от контроля. Различий в противоопухолевой активности 5ФУ и комбинации беталейкина с 5ФУ не наблюдалось также и по критерию увеличения средней продолжительности жизни подопытных животных по сравнению с контролем. Так СПЖ в группе 5ФУ составила 123,5 %; в группе комбинированного применения беталейкина с 5ФУ - 135,8 %. Чистый беталейкин не вызывал увеличение продолжительности жизни мышей по сравнению с контролем. СПЖ в этой группе составило 106,3 %.

Учитывая тот факт, что в обеих подопытных группах получена достоверная противоопухолевая активность по критерию ТРО в сравнении с контролем, можно считать терапию беталейкином в сочета-

нии с 5ФУ эффективной.

Задачей второго эксперимента было оценить влияние беталейкина в дозе 10 тыс. Ед/мышь на противоопухолевую активность 5-фторура-цила при его дозе 12 мг/кг с 1 по 9 сутки у мышей с перевитой опухолью Р388.

Средняя продолжительность жизни в контрольной группе (без лечения) составила 8,4±0,6; в группе, получавшей 5-фторурацил -СПЖ составила 13,0+1,2; в группе, получавшей комбинированную терапию - 10,7±2,4; в группе, получавшей только беталейкин - 9,0 дней. Разница между группами, получавшими 5ФУ и 5ФУ в комбинации с беталейкином не достоверна.

Учитывая, что в обеих лечебных группах получено достоверное увеличение противоопухолевой активности в сравнении с контролем, можно считать терапию беталейкином в сочетании с 5-фторурацилом эффективной. Однако, была отмечена тенденция к некоторому снижению активности 5-фторурацила при сочетанном его применении с беталейкином в сравнении с эффектом 5-фторурацила. Поэтому было проведено исследование в постановке доза - эффект на солидной опухоли с целью анализа эффективности (по кривым ТРО и УШК %) и определения терапевтического индекса комбинации.

С этой целью проведен третий эксперимент с увеличением дозы 5-фторурацила. Эффективность химиотерапии оценивали по проценту торможения роста солидной опухоли (аденокарцинома молочной железы АК755) по сравнению с контролем (ТРО, %) на 12, 17 и 21 сутки после прививки и увеличению средней продолжительности жизни.

Средние объемы опухолей в группе, получавшей беталейкин, не отличались от контрольных величин. На 12 сутки ТРО в группе, получавших 5 ФУ 10 мг/кг составляло 61 %; 5 ФУ 12 мг/кг - 65,9 %, 5 ФУ 15 мг/кг - 75 %. Комбинированное применение беталейкина с 5 ФУ не снижало противоопухолевой активности последнего и ТРО в этих группах составило на 12 сутки 62 %, 73 % и 74 %, соответственно.

I фаза разработки комбинации 5-фторурацила и беталейюша у больных с опухолями пищеварительного тракта.

Основной задачей этой части исследования было оценить переносимость 5-фторурацила при ежедневном 5-кратном его введении после введения беталейкина.

В данную часть исследования вошло 10 больных (рак толстой кишки - 9, рак желудка - 1). 2 курса лечения проведено трем пациентам, 3 курса - двум, 4, 5, 6 или 7 курсов - но одному пациенту. Общее число курсов - 34.

Лейкопения отмечена только у 1 из 10 больных при двух курсах лечения. Частота лейкопении составила 5,9 % (2 из 34 курсов). Однократное снижение числа лейкоцитов было отмечено на 22 день при 1 и 5 курсе лечения. Длительность лейкопенического периода менее 1 недели. В остальных случаях число лейкоцитов, гранулоци-тов, эритроцитов и гемоглобина существенно не менялось.

Диарея отмечена при 6 (17,6 %) из 34 курсов лечения. Во всех случаях диарея была незначительная, длительностью от 1 до 5 дней. Стоматит отмечен лишь в одном случае (2,9 %).

Таким образом выявлено урежение гематологической токсичности при комбинации 5-фторурацила с беталейкином.

Оценка противоопухолевого действия комбинации 5-фторурацил + беталейкин требует дальнейшего изучения.

Выводы.

1. Клинико-фармакологическое и экспериментальное исследование отечественного рекомбинантного интерлейкина - 1р (беталейкина) установило его нммунокоррегирующее и гемостимулирующее действие при злокачественных опухолях.

2. Беталейкин в дозе от 1 до 7 нг/кг/день при внутривенной 3-часовой инфузии в течение 5 дней редко вызывает побочные эффекты. Частота озноба и повышения температуры составила 2,5 %. Отме-

чено повышение числа лейкоцитов и нейтрофилов через 3 - 5 часов после введения беталейкина с нормализацией этих показателен через 24 часа.

3. Беталейкин в дозе 5 - 16 нг/кг/день при внутривенной 30-минутной инфузии вызывает озноб, повышение температуры, снижение артериального давления. Частота развития этих побочных эффектов возрастает с увеличением дозы беталейкина: озноб 7 нг/кг -53,3 %, 12 нг/кг - 66 %, 16 нг/кг - 80 %; повышение температуры - 27,5 %, 69,5 % и 89,4 %, соответственно. Прием 1 г аспирина за 1 час до введения беталейкина уменьшал выраженность озноба и степень повышения температуры. Среди других эффектов при введении беталейкина - снижение артериального давления, головная боль, боль в области поясницы.

Отмечено достоверное увеличение числа лейкоцитов и нейтрофилов через 30 мин после введения с максимальным подъемом через 2 часа и последующей нормализацией. Определено некоторое увеличение числа тромбоцитов к 14 дню после начала лечения.

4. Беталейкин вызывает коррекцию исходно сниженных иммунологических показателей у онкологических больных. Отмечено повышение количества Т-лимфоцитов (СБЗ) в 62,5 % случаев, Т-хелперов (С04) - 60 %, соотношения Тхелнеры/Тсунрессоры (СИ4/СГ>8) - 77,8 %, а также увеличение продукции интерлейкина - 2 и реакции бласт-трансформации. Не отмечено влияния на содержание С016, СВ25, СБ38 и НЬА-Бг.

5. Беталейкин при внутривенном введении в дозе 12 - 16 нг/кг/ день вызывает изменения содержания С-реактивного белка, С3-комио-нента комплемента, фактора некроза опухоли (ФНО) и интерлейкина - 6 (Ш1-6).

У больных со значительным повышением температуры после введения беталейкина уровень С-реактивного белка до лечения был в 3 раза выше, чем в группе без температурной реакции. На высоте температурной реакции отмечено увеличение содержания С-реактивного белка и С3-фракции комплемента.

Обнаружено увеличение содержания ИЛ-6 в 3 раза по сравнению с исходным уровнем. Исходное содержание ИЛ-6 и содержание через 1 час после введения было в два раза выше у больных, имевших температурную реакцию.

Содержание ФНО достоверно выше через 1 час после введения беталейкина, но не на высоте температурной реакции.

При гипотонии после введения беталейкина наблюдали повышенное содержание ИЛ-6, снижение уровня ФНО, отсутствие изменения концентрации С-реактивного белка и С3-компонента комплемента.

6. Исходя из клинико-фармакологического и иммунологического исследования у больных раком почки и меланомы, рекомендуется использование беталейкина в дозе 16 нг/кг/день 30-минутной инфу-зией в течение 5 дней.

7. В экспериментах на мышах установлено, что беталейкин значительно снижает токсичность 5-фторурацила, что позволяет увеличить его максимально переносимую дозу в 1,5 раза.

Беталейкин уменьшает частоту и длительность лейко- и тромбо-цитопении, имеет гематопротективное действие при введении 5-фторурацила. Беталейкин не снижает противоопухолевого действия 5-фторурацила.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Новиков B.B. I фаза клинического изучения беталейкина (человеческого рекомбинантного интерлейкина -1 бета) у больных злокачественными новообразованиями. II Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва. - 10-15 апреля 1995.

2. Новиков В.В. Клинико-эксперименталыгое изучение комбинации беталейкин + 5-фторурацил. III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва. - 1996.

3. Новиков В.В., Личиницер М.Р., Д.А.Бодягин, ИД.Трещалин, Э.Р.Переверзева. Токсикомодифицирующее действие беталейкина в отношении 5-фторурацила в эксперименте. III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва. - 1996.