Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунные механизмы фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите C

На правах ру}сошк;и

Горелова Ирина Сергеевна

ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФИБРОЗНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ С

14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г О НОЯ 2014

Владивосток — 2014

005555616

005555616

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном

учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Скляр Лидия Федоровна Официальные оппоненты:

Ершов Феликс Иванович, академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела интерферонов ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Макаренкова Илона Дамировна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится «18» декабря 2014 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук по адресу: 105064, г. Москва, пер. Малый Казённый, д. 5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН, www.instmech.ru.

Автореферат разослан «15» ноября 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Яковлева Ирина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

В настоящее время хронические заболевания печени вирусной этиологии являются одной из наиболее актуальных медико-социальных и экономических проблем (Дерябин П.Г. с соавт., 2011; Ющук Н.Д. с соавт., 2013). Лидирующее место среди них занимает гепатит С (Мукомолов С.Л. с соавт., 2012; Сухорук А.А. с соавт., 2014). По данным ВОЗ на земном шаре насчитывается около 500 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С, 170-180 млн. из которых - это пациенты с хронической HCV-инфекцией (Шахгильдян И.В. с соавт., 2011; Marcellin P. et al., 2011). По некоторым оценкам Россия входит в число стран с наиболее высоким уровнем заболеваемости гепатитом С: от 1,5 до 3 млн. человек инфицированы вирусом (Пименов Н.Н. с соавт., 2012).

Известно, что основной путь прогрессирования хронического гепатита С (ХГС) - развитие последовательных стадий фиброза с формированием цирроза и рака печени (Павлов Ч.С. с соавт., 2008; Бобров А.Н. с соавт., 2010). Декомпенсация этих состояний приводит к снижению качества жизни, преждевременной потере трудоспособности, ранней инвалидизации и коротким срокам жизни пациентов с HCV-инфекцией (Lavanchy D., 2009; Ramachandran P. et al., 2012).

Несмотря на существенный прогресс в изучении патогенеза ХГС и его исходов, многие аспекты, включая процессы фиброзообразования в печени, до сих пор изучены недостаточно полно, а результаты проведенных исследований часто противоречивы (Сысоев К.А. с соавт., 2013; Hernandez-Gea V. et al., 2011). Так, комплексное изучение ключевых звеньев иммунофиброгенеза печени при ХГС, в частности, профиброгенных цитокинов, таких как изоформ семейства трансформирующего фактора роста-p (ТФР-р), и белков, отражающих состояние межклеточного матрикса, а именно матриксных металлопротеиназ (ММП) и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ТИМП), до настоящего времени не проводилось. Необходимо также отметить, что некоторые авторы связывают прогрессирование ХГС с развитием иммунного воспаления в органе-мишени, другие объясняют формирование цирроза печени с нарушением репарации клеток и стромы в участках вирусиндуцированного повреждения печени (Непомнящих Г.И. с соавт., 2012; Howell J. et al., 2013). Отсутствие единой теории

патогенеза ХГС тормозит разработку и внедрение в клиническую практику высокоинформативных и эффективных методов диагностики и терапии НСУ-инфекции, что отрицательно влияет на качество и продолжительность жизни пациентов, страдающих этим заболеванием (Ивашкин В.Т. с соавт., 2011).

Таким образом, можно заключить, в настоящее время назрела необходимость в углубленном исследовании механизмов иммунопатогенеза фиброза печени при ХГС, что, несомненно, будет способствовать созданию новых и/или усовершенствованию имеющихся методов диагностики фиброзных изменений в органе-мишени. Исходя из актуальности приведенных фактов, были определены цели и задачи исследования.

Цель работы: определить роль семейства трансформирующего фактора роста-р и системы протеолиз/антипротеолиз в фиброгенезе печени при ХГС, разработать математическую модель диагностики фиброза печени с учетом выявленных иммунных дисфункций.

Задачи исследования:

1. Изучить показатели семейства ТФР-р, а именно изоформ ТФР-Р1, ТФР-Р2 и ТФР-рЗ, в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов при НСУ-инфекции;

2. Оценить сывороточный и локальный профиль регуляторов ремоделирования ткани печени при ХГС по уровню ММП-9, ТИМП-1, комплексов ММП-9/ТИМП-1 и ММП-9/ТИМП-2;

3. Провести корреляционный анализ исследуемых параметров семейства ТФР-р, ММП/ТИМП на системном и локальном уровнях с учетом выраженности фиброзных изменений в печени;

4. Разработать математическую модель диагностики фиброза печени при ХГС с использованием иммунологических показателей регуляции фиброгенеза.

Научная новизна

Проведена комплексная оценка системного и локального статуса ТФР-р, его изоформ ТФР-р 1, ТФР-Р2 и ТФР-рЗ, с учетом биологических свойств вируса, биохимической активности крови и выраженности фиброзных изменений в печени. Обнаружено преимущественное повышение концентрации указанных ростовых факторов в органе-мишени при трансформации НСУ-ассоциированного

фиброза печени в цирроз. Комплексно исследовано состояние системы протеолиз/антипротеолиз, а именно ММП-9, ТИМП-1, комплексов ММП-9/ТИМП-1 и ММП-9/ТИМП-2, в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов у пациентов ХГС в проекции с биохимическими, вирусологическими и морфологическими параметрами. Установлено увеличение содержания ММП-9, ТИМП-1 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 в печеночной ткани при одновременном снижении их уровня в сыворотке крови по мере прогрессирования фиброза печени. Выявлены корреляционные связи системных и локальных показателей изоформ профиброгенного ТФР-р и белков, отражающих состояние внеклеточного матрикса, со стадиями фиброза печени при ХГС.

Практическая значимость

На основании выявленных иммунных дисфункций показателей семейства ТФР-Р и системы ММП/ТИМП на системном и локальном уровнях предложен неинвазивный метод диагностики фиброза печени при ХГС с целью дифференциальной диагностики ранних (F0-2 ст.) и поздних (F3-4 ст.) стадий фиброза в органе-мишени.

Реализация результатов исследования

Отдельные фрагменты исследования легли в основу методических рекомендаций «Иммунологические методы ранней диагностики фиброза печени при хронических моно- и микст-вирусных гепатитах», «Хронические вирусные гепатиты сочетанной этиологии: аспекты эпидемиологии, иммунопатогенеза, клиники и диагностики», утвержденных Департаментом здравоохранения администрации Приморского края и ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России (2012 г.) и внедренных в клиническую практику медицинских учреждений здравоохранения Приморского края, а также в учебный процесс кафедры инфекционных болезней, физиологии человека и факультетской терапии ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России (2013 г.).

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях и симпозиумах международного, Российского регионального и местного уровня: XI, XII, XIII, XIV и XV Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых медиков с международным участием

«Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014); VIII и X Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2011, 2013); XI Региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» (Владивосток, 2013); XIV Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2011» (Санкт-Петербург, 2011); 17-ой Российской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, 2011); 17-ом, 18-ом и 19-ом Ежегодном Российском конгрессе «Гепатология сегодня» (Москва, 2012,2013, 2014); IV, V и VI Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012,2013,2014); XII Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2013); Международном форуме «Клиническая иммунология и аллергология — междисциплинарные проблемы» (Казань, 2014); Japan-Russia International Workshop 2010 (Tokyo-Niigata, Japan, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных положений диссертации.

Струетура и объём работы

Материал диссертации изложен на 145 страницах, проиллюстрирован 34 таблицами и 10 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций практическому здравоохранению и списка использованной литературы, содержащего 232 источника (их них - 120 источников отечественных и 112 зарубежных авторов).

Личный вклад автора в проведенное исследование

Автор непосредственно участвовал в планировании исследования, формировании групп пациентов, включенных в исследование, сборе материала, клиническом осмотре пациентов с хроническим гепатитом С, выполнении

лабораторных и инструментальных исследований, определении содержания цитокинов и регуляторов фиброзообразования в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов (70%), проведении аналитического обзора отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, интерпретации, анализе и статистической обработке полученных результатов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Системный и локальный дисбаланс изоформ ТФР-р свидетельствует об участии плейотропного цитокина в формировании фиброза печени при ХГС и его прогрессировали в цирроз.

2. В иммунопатогенезе НСУ-ассоциированных фиброзных изменений в печени имеет значение нарушение равновесия системы протеолиз/ антипротеолиз в печеночной ткани и сыворотке крови.

3. Выявленные взаимосвязи между показателями регуляции фиброгенеза (ТФР-р, ММП/ТИМП) и морфологическими изменениями в органе-мишени при НСУ-инфекции позволяют рекомендовать их в качестве сывороточных маркеров фиброза печени.

4. Сывороточное содержание ТФР-р 1, ТИМП-1, комплекса ММП-9/ТИМП-2 и гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТ) на основании математических расчетов с помощью разработанной диагностической модели дает возможность прогнозировать выраженную стадию фиброза и цирроз печени в исходе ХГС.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено в 2011-2014 гг. в ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России (ректор, д.м.н., профессор В.Б. Шуматов) на кафедре инфекционных болезней и на базе инфекционного отделения ГБУЗ Краевой клинической больницы №2 г.Владивостока. Основные иммунологические исследования выполнены на базе межкафедральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России, возглавляемой заведующей кафедрой физиологии человека, д.м.н., профессором Е.В. Маркеловой. Отдельные фрагменты работы проведены в лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии

им. Г.Б. Елякова ДВО РАН при участии заведующего отделом, д.х.н., профессора П.А. Лукьянова. Все пациенты подписывали информированное согласие для расширенного обследования. Протокол исследования был представлен на рассмотрение и одобрен комитетом по биомедицинской этике ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России (протокол № 2, дело № 6 от 19.12.2011 г.).

Контингент, материалы и методы исследования

Под наблюдением находился 81 пациент в возрасте от 23 до 60 лет (средний возраст 44,4±9,9 лет) с диагнозом ХГС. Преобладали женщины -56 чел. (69,1%), мужчин было 25 чел. (30,9%). Критериями включения в настоящее исследование служили возраст 18-65 лет, верифицированный диагноз ХГС и отсутствие этиотропной терапии в анамнезе. Критериями, исключающими участие пациентов в данном исследовании, были возраст до 18 лет и старше 65 лет, беременные или кормящие женщины, недееспособные, лица с избыточной массой тела (ИМТ > 25 кг/м2), наличие тяжелых сопутствующих соматических заболеваний, а также диффузных заболеваний печени, включая вирусные гепатиты иной этиологии, декомпенсированную стадию цирроза печени, активная наркомания, в том числе алкогольная зависимость, отсутствие информированного согласия на обследование.

Диагноз ХГС устанавливали на основании совокупности клинико-анамнестических, эпидемиологических, лабораторных и инструментальных данных, включая пункционную биопсию печени (ПБП). Все пациенты с НСУ-инфекцией по результатам эластографии печени и/или гистологического исследования гепатобиоптатов бьши распределены в зависимости от стадии фиброза печени на три группы: 1-я - пациенты, у которых признаки фиброза отсутствуют (Б0 ст.) - 24 чел. (29,6%), 11-я - пациенты со слабовыраженным и умеренным фиброзом (Р1-2 ст.) - 26 чел. (32,1%), Ш-я - пациенты с выраженным фиброзом и циррозом печени (РЗ-4 ст.) - 31 чел. (38,3%).

Контрольную группу составили 22 клинически здоровых добровольца, сопоставимых по полу и возрасту с контингентом НСУ-инфицированных пациентов.

Для достижения поставленной цели нами проведено комплексное клинико-лабораторное, инструментальное и иммунологическое исследование. В качестве

биологических материалов для исследования использовались венозная кровь и биоптаты печени обследованных лиц. Всем обследованным лицам проводились ультразвуковое исследование органов брюшной полости и эластомегрия печени. Чрескожная ПБП иглой Менгини была выполнена по индивидуальному протоколу для каждого пациента после получения информированного согласия и при отсутствии всех существующих противопоказаний к проведению данной манипуляции. Анализ морфологических данных на биопсийном материале был проведен у 32 человек (31,1%) совместно с доцентом кафедры патологической анатомии, судебной медицины и права ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России, к.м.н., доцентом О.Г. Полушиным.

Для иммунологических исследований показателей системы ТФР-ß, а именно ТФР-ßl, ТФР-р2 и ТФР-РЗ, и содержания регуляторов фиброгенеза по уровню ММП-9, ТИМП-1, комплекса ММП-9/ТИМП-1 и ММП-9/ТИМП-2 использовались сыворотка венозной крови и супернатанты гепатобиоптатов обследованных лиц. Определение уровня указанных параметров в биологических субстратах проводили с помощью специфических реактивов фирмы «R&D Diagnostics Inc» (США) методом сендвич-варианта твердофазного ИФА в соответствии с инструкцией по применению.

Математическая обработка полученных результатов проводилась с использованием методов описательной (вычисление средних значений и средних квадратических отклонений, W-критерий Шапиро-Уилка), параметрической (t-критерий Стьюдента, корреляционный анализ по Пирсону, критерий Фишера) и непараметрической (корреляционный анализ по Спирмену) статистики с помощью пакета прикладных программ ВIО ST ATI STI CA (S.A.Glantz, McGraw Hill), STATISTICA 6.0 (StatSoft, USA). Вместе с тем для решения 4-ой задачи применяли один из методов нелинейного регрессионного анализа — метод логистической регрессии. Данный раздел работы выполнен при участии сотрудника кафедры математических методов в экономике ДВФУ, к.э.н. А.П. Гулевича. Проверка статистических гипотез заключалась в сравнении полученных значений "р" с принятым уровнем значимости, который составил 0,05 либо 0,01, либо 0,001.

Результаты исследований и их обсуждение

Для доказательства первого положения, выносимого на защиту, нами изучены показатели семейства ТФР-Р, а именно изоформ ТФР-Р 1, ТФР-Р2 и ТФР-РЗ, в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов при НСУ-инфекции и её исходах.

Результаты исследований сывороточного уровня представителей системы фактора роста-р свидетельствуют о снижении концентрации указанных цитокинов при ХГС относительно контрольной группы здоровых лиц, за исключением содержания ТФР-Р2 (рис. 1). Так, для ТФР-Р 1 она составила 20,7±0,9 нг/мл против 21,2±0,4 нг/мл (р>0,05), а для ТФР-рЗ - 31,3±3,3 пг/мл против 131,6±7,3 пг/мл (р<0,001). Как видно из рисунка 1, наблюдается тенденция к повышению уровня ТФР-Р2 у НСУ-инфицированных пациентов: 167±3,7 пг/мл против 124,8±5,8 пг/мл в норме (р<0,01).

Анализ локального цитокинового статуса выявил наличие гиперпродукции основных изоформ ростового фактора в сравнении с аналогичными показателями контрольной группы (см. рис. 1). При этом следует отметить, что концентрация ТФР-Р 1 в супернатантах гепатобиоптатов пациентов с ХГС и здоровых не различалась: 530,0±10,0 пг/мл и 510,0±70,0 пг/мл соответственно (р>0,05). В отношении ТФР-Р2 и ТФР-РЗ обнаружены статистически значимые различия между уровнем их содержания при НСУ-инфекции и норме (р<0,05), средние значения которых составили 252,6±5,6 пг/мл против 217,9±3,5 пг/мл и 48,4±1,5 пг/мл против 9,8±0,9 пг/мл соответственно.

'ФР-Р2 { = г* 1>Р-||| и'-рз

-5-4-3-2-10 12 3 4 * сывороточный уровень ^локальный уровень

Рис. 1. Схематическое изображение изменений содержания изоформ ТФР-(3 в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов у пациентов ХГС относительно границы контроля (|)

Примечание. * Статистическая значимость различий (р) с контрольной группой - р < 0,05 - 0,001.

Проведено комплексное исследование профиля системы ТФР-(3 у пациентов ХГС одновременно и в сыворотке крови, и в супернатантах гепатобиоптатов в зависимости от выраженности фиброзных изменений в печени (рис. 2А и Б).

Системные показатели ТФР-|31 имели характерные особенности в зависимости от стадии фиброза печени (см. рис. 2А). Так, при отсутствии морфологических изменений в органе-мишени у НСУ-позитивных пациентов уровень его снижался (19100,0±900,0 пг/мл против 21200,0±400,0 пг/мл у здоровых, р<0,05). По мере прогрессирования фиброза (Р1-2 ст.) концентрация ТФР-Р1 возрастала до 30200,0±1200,0 пг/мл, а при выраженном фиброзе и циррозе печени (РЗ-4 ст.) вновь наблюдались низкие значения указанного цитокина- 12900,0±700,0 пг/мл, что отличалось от контроля (р<0,01).

Рис. 2. Показатели изоформ ТФР-р в сыворотке крови (А) и супернатантах гепатобиоптатов (Б) в зависимости от стадии фиброза печени при ХГС

Примечание. * Статистическая значимость различий (р) с контрольной группой - р < 0,05 - 0,001.

Как следует из рисунка 2А, отмечена тенденция к снижению сывороточного содержания ТФР-Р2 и ТФР-РЗ с прогрессированием патологических изменений в печени при ХГС. Так, наименьший уровень их определен в группах пациентов с РЗ-4 ст., а именно 147,8±3,5 пг/мл и 13,9±2,7 пг/мл соответственно, в то время как аналогичные показатели у пациентов с отсутствием фиброза в органе-мишени составили 193,1±4,7 пг/мл и 47,9±3,5 пг/мл соответственно (р<0,05).

Локальные показатели системы ТФР-Р у пациентов при НСУ-инфекции с учетом выраженности фиброзных изменений в печени представлены на

рисунке 2Б. Полученные нами результаты демонстрируют, что с прогрессированием фиброза печени и нарушением её архитектоники прослеживается тенденция к увеличению концентрации ТФР-Р1 в органе-мишени. Она составила 70,0±20,0 пг/мл при РО ст., 560,0±60,0 пг/мл при Р1-2 ст. и 970,0±100,0 пг/мл при РЗ-4 ст. (р<0,05). При этом следует отметить, что не было установлено статистически значимых различий (р>0,05) исследуемой изоформы цитокина между пациентами с Р1-2 ст. и здоровыми лицами.

Средние значения ТФР-Р2 у НСУ-инфицированных пациентов с разными стадиями фиброза печени были выше контрольных (217,9±3,5 пг/мл), но наиболее высокими оказались при выраженном нарушении архитектоники печеночной ткани (РЗ-4 ст.) - 257,2±4,8 пг/мл (р<0,01).

Анализ показателей ТФР-рЗ в зависимости от выраженности фиброзных изменений в печени при ХГС показал наличие чрезмерного синтеза ростового фактора в сравнении с контрольной группой здоровых лиц. Причем наиболее высокие цифры исследуемого маркера были отмечены в группе пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени (70,1±1,3 пг/мл, р<0,01), значительными — при слабых и умеренных нарушениях структуры печеночной ткани (53,5±2,1 пг/мл, р<0,01), наименьшие — при отсутствии морфологических изменений в органе-мишени (21,6±1,2 пг/мл р<0,05).

Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать о ключевой роли плейотропного семейства ТФР-р в иммунофиброгенезе печени при НСУ-инфекции.

Для обоснования второго положения, выносимого на защиту, мы изучили сывороточный и локальный профиль регуляторов ремоделирования ткани печени при ХГС и его исходах по уровню ММП-9, ТИМП-1, комплексов ММП-9/ТИМП-1 и ММП-9/ТИМП-2.

Исследование отдельных представителей семейства внеклеточных протеиназ и их тканевых ингибиторов в сыворотке крови НСУ-инфицированных пациентов обнаружило изменения изучаемых показателей относительно контрольной группы здоровых лиц (табл. 1). А именно, отмечено статистически значимое повышение концентрации ММП-9 (241,3±6,7 нг/мл, р<0,05), а также её комплексов с ТИМП-1 (13,7±1,1 нг/мл, р<0,05) и ТИМП-2

(46,9±2,8 пг/мл, р<0,01) в сочетании с низким уровнем ингибитора первого типа (187,6±5,7 нг/мл, р<0,05).

Таблица 1. Сывороточные показатели системы ММП/ТИМП при ХГС, M±s

Показатели Здоровые доноры (п=22) Пациенты ХГС (п=81)

ММП-9, нг/мл 189,3±9,2 241,3±6,7*

ТИМП-1, нг/мл 222,0±7,3 187,6±5,7*

ММП-9/ТИМП-1, нг/мл 5,0±0,6 13,7±1,1*

ММП-9/ТИМП-2, пг/мл 2,9±0,7 46,9±2,8**

Примечание. Статистическая значимость различий (р) с контрольной группой: *-р<0,05, **-р<0,01.

Анализ содержания изучаемых белков внеклеточного матрикса (ВКМ) в органе-мишени при ХГС выявил статистически значимые отличия по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы (р<0,05). Данные из таблицы 2 свидетельствуют о снижении концентрации ММП-9 (158,5±13,6 нг/мл при норме 516,0±21,6 нг/мл, р<0,05), ТИМП-1 (10,0±2,0 пг/мл при норме 60,0±18,0 пг/мл, р<0,05) и ММП-9/ТИМП-2 (51,0±1,2 пг/мл при норме 57,8±1,2 пг/мл, р<0,05). Что касается комплекса ММП-9/ТИМП-1, то наблюдается высокий уровень его в супернатантах гепатобиоптатов, который превышал аналогичный показатель у здоровых лиц более чем в 8 раз и составил 34,4±1,2 нг/мл (р<0,05).

Таблица 2. Показатели системы ММП/ТИМП в супернатантах гепатобиоптатов при ХГС, M±s

Показатели Здоровые доноры (п=7) Пациенты ХГС (п=25)

ММП-9, нг/мл 516,0±21.6 158,5±13,6*

ТИМП-1, пг/мл 60,0±18,0 10,0±2,0*

ММП-9/ТИМП-1, нг/мл 4Д±1Д 34,4±1,2*

ММП-9/ТИМП-2, пг/мл 57,8±1,2 51,0±1,2*

Примечание. Статистическая значимость различий (р) с контрольной группой: * - р<0,05.

Известно, что активность металлопротеиназ контролируется их эндогенными ингибиторами, синтез и эксекреция которых тесно сопряжена с продукцией ММП (Friedman S.L., 2008; Valva P. et al, 2011). Так, они избирательно стехиометрически связываются с протеиназами и образуют необратимые комплексы, в которых ММП и ТИМП находятся в соотношении 1:1 (Назаров П.Г., 2001; Shiomi T. et al., 2010; Mormone Е. et al., 2011). С учетом вышесказанного нами

пересмотрен профиль изучаемой системы протеолиз/антипротеолиз в сыворотке крови, а также супернатантах гепатобиоптатов, и обнаружены изменения показателей только на локальном уровне (рис. 3). А именно, зарегистрировано увеличение концентрации ТИМП-1, что может объяснить наличие низких значений ММП-9 в органе-мишени при НСУ-инфекции.

ММП-,9

ММП-9/ Т11МП

14

* сывороточным уровень

8 10 12 14 16 ^локальный уровень

Рис.3. Схематическое изображение изменений показателей системы ММП/ТИМП в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов при ХГС относительно границы контроля (|)

Примечание. * Статистическая значимость различий (р) с кошрольной группой - р < 0,05 -0,01.

Результаты исследований сывороточного и локального уровня белков, отражающих состояние межклеточного матрикса, у пациентов ХГС в зависимости от выраженности фиброзных изменений в печени приведены на рисунке 4А и Б.

А Б

Рис. 4. Показатели системы ММП/ТИМП в сыворотке крови (А) и супернатантах гепатобиоптатов (Б) в зависимости от стадии фиброза печени при ХГС

Примечание. * Статистическая значимость различий (р) сконтрольнойгруппой-р<0>05-0,001.

При анализе содержания ММП-9 в сыворотке крови с учетом стадии фиброза печени НСУ-этиологии были выявлены статистически значимые

различия (р<0,05). Так, при отсутствии морфологических изменений в органе-мишени среднее значение изучаемого протеолитического фермента составило 249900,0±6100,0 пг/мл (при норме 189300,0±9200,0 пг/мл, р<0,05). По мере прогрессирования патологического процесса концентрация его повышалась до 269000,0±7400,0 пг/мл, однако с формированием тяжелой стадии фиброза и цирроза печени уровень ММП-9 резко снижался до 205300,0±6600,0 пг/мл, но все же превышал аналогичные показатели контрольной группы (р<0,05).

Сывороточная концентрация ТИМП-1 в зависимости от выраженности НСУ-ассоциированных фиброзных изменений в печени была снижена по сравнению с контролем (р<0,05) и наименьшая регистрировалась при циррозе — 162700,0±6900,0 пг/мл.

Системный уровень ММП-9/ТИМП-2 у пациентов ХГС имел тенденцию к снижению с прогрессированием фиброза печени (см. рис. 4А). А именно, отмечено уменьшение содержания ММП-9/ТИМП-2 с 65,0±3,5 пг/мл при Р0 ст. до 33,9±2,7 пг/мл при РЗ-4 ст. (р<0,05).

В ходе наших исследований обнаружен дисбаланс системы протеолиз-антипротеолиз в супернатантах гепатобиоптатов при НСУ-инфекции в зависимости от выраженности фиброзных изменений в органе-мишени (см. рис. 4Б). Данные нарушения характеризовались следующим образом: локальные значения ММП-9, ТИМП-1 и ММП-9/ТИМП-2 по мере трансформации фиброза печени в цирроз (от Р0 ст. к Р4 ст.) повышались (р<0,05).

Учитывая вышесказанное, можно сделать вывод, что нарушение равновесия системы протеолиз/антипротеолиз приводит к дисрегуляции ремоделирования ткани печени при ХГС.

Для доказательства третьего положения, выносимого на защиту, нами изучены корреляционные связи сывороточных и локальных параметров семейства ТФР-Р и белков, отражающих состояние экстрацеллюлярного матрикса, со стадиями фиброза печени НСУ-этиологии.

Корреляционный анализ, проведенный между системными и локальными показателями изоформ профиброгенного ТФР-0 и выраженностью фиброзных изменений в печени при ХГС, обнаружил статистически значимые (р<0,05) обратные связи в сыворотке крови и прямые - в органе-мишени (рис. 5).

ТФР-Р1 (1) г5=+0,71, р<0,05 биоптат

ТФР-Р1 ( г,= -0,36, р<0,( кровь

СТФР-Р2 (1) г,= -0,53, р<0,001 кровь

Рис. 5. Корреляционные связи между показателями изоформ ТФР-Р на системном и локальном уровнях и стадиями фиброза печени при ХГС

Установлено, что медиаторы, регулирующие состояние ВКМ, находятся в статистически значимой (р<0,05) корреляционной взаимосвязи различной силы и направления со стадиями НСУ-ассоциированного фиброза печени (рис. 6).

ММП-9/ТИПМ-1 (!) г„= +0,95, р<0,05, кровь

ММП-9 (!) г,= +0,58,р<0,05; биоптат

ММП-9/ТИПМ-г„= +0,96, р<0. биоптат

ММП-9/ТИПМ-2 (]) г5= +0,24, р<0,05, биоптат

Рис. 6. Корреляционные связи между показателями ММП/ТИМП на системном и локальном уровнях и стадиями фиброза печени при ХГС

Следовательно, выявленные в ходе работы взаимосвязи показателей

регуляции фиброгенеза (ТФР-р и ММП/ТИМП) со структурными изменениями

в печени могут свидетельствовать об участии данных маркеров в

формировании фиброза печени в исходе ХГС и его прогрессировании в цирроз.

16

Четвертое положение, выносимое на защиту, можно обосновать следующим образом: на основании результатов изучения иммунофиброгенеза печени при ХГС, применяя логистический регрессионный анализ, нами разработана модель неинвазивной диагностики фиброза печени. Для удобства применения она представлена компьютерной программой в операционной среде Microsoft Window's и состоит из двух взаимосвязанных математических формул. Диагностика с помощью которых осуществляется следующим способом: определив концентрацию ТФР-Р1, ТИМП-1, комплекса ММП-9/ТИМП-2 и ГГТ в сыворотке крови, на первом этапе в автоматическом режиме рассчитывается вероятность наличия HCV-ассоциированного фиброза печени (Рнфп), используя формулу, в которую вводятся полученные показатели:

Рнфп = (еу/(1 + еу)) х 100 %, где (1)

у = -13,6 + 3,78 х Xi — 0,1 х Х2, где (2)

X! - сывороточное значение ММП-9/ТИМП-2, Х2 - сывороточное значение ТИМП-1, еу - экспоненциальная функция. Результат расчета выводится на монитор в виде значения Рнфп в процентах. Рнфп > 50% указывает на наличие фиброзных изменений в органе-мишени, что позволяет перейти ко второму этапу диагностики, на котором после ввода данных автоматически рассчитывается вероятность стадии фиброза печени при ХГС (Рсфп) с помощью формулы:

Рсфп = (еу/(1 + еу)) х 100 %, где (3)

у = -12 + 0,134317 х X! + 0,527778 х Х2 - 0,05 х Х3 (4), где (4) Xi - сывороточное значение ММП-9/ТИМП-2, Х2 - сывороточное значение ТФР-pi; Хз - сывороточное значение ГГТ, еу - экспоненциальная функция. Вычисленный результат Рсфп в процентах также выводится на экран компьютера, где Рсфп > 50% свидетельствует о наличии F3-4 стадии при HCV-инфекции, РСфп < 50% - F0-2 стадии.

Таким образом, предложенная модель диагностики фиброза печени при ХГС является простой в техническом выполнении, доступной для практических медицинских учреждений здравоохранения, неинвазивной и безопасной для пациентов, экономичной во времени, эффективной для дифференциальной диагностики ранних (F0-2 ст.) и поздних (F3-4 ст.) стадий фиброза печени.

выводы

1. Определен разнонаправленный характер изменений показателей ТФР-pi, ТФР-Р2 и ТФР-РЗ в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов по мере прогрессирования фиброза печени при ХГС с преобладанием содержания профиброгенного цитокина в органе-мишени.

2. Обнаружен дисбаланс в системе протеолиз/антипротеолиз, который характеризовался снижением сывороточных значений ММП-9, ТИМП-1 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 при трансформации HCV-ассоциированного фиброза печени в цирроз (от F0 ст. к F3-4 ст.) с одновременным увеличением их концентрации в супернатантах гепатобиоптатов.

3. Установлено, что более выраженные нарушения показателей изоформ профиброгенного ТФР-Р, а также металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов наблюдаются на локальном уровне, что может свидетельствовать о реализации биологических эффектов изучаемых медиаторов непосредственно в органе-мишени.

4. Разработана математическая модель неинвазивной диагностики фиброза печени при ХГС с учетом выявленных иммунных дисфункций, позволяющая провести скрининг выраженной стадии фиброза и цирроза печени (F3-4 ст.).

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЕ

Для скрининга тяжелой стадии фиброза и цирроза печени (F3-4 ст.) при ХГС разработана прогностическая модель. Она представлена компьютерной программой в операционной среде Microsoft Window's и состоит из двух взаимосвязанных математических формул, с помощью которых у HCV-инфицированного пациента по сывороточной концентрации ТФР-р 1, ТИМП-1, комплекса ММП-9/ТИМП-2 и ГГТ в автоматическом режиме рассчитывается вероятность наличия в печени начальных (F0-2 ст.) или выраженных (F3-4 ст.) фиброзных изменений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Значение ММР-9 в диагностике фиброза печени у больных хроническими моно- и микст-вирусными гепатитами / В. А. Иванис, Е. А. Путилова, И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова // Тихоокеанский мед. журн. - 2012. - № 4. - С. 74-77.

2. Горелова, И. С. Зависимость содержания сывороточного уровня ТФР-ßl от стадии фиброза при хроническом вирусном гепатите С / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова // Рос. аллергологический журн. - 2013. - № 2. -С. 69-70.

3. Горелова, И. С. Фиброгенная роль ТФР-ßl при хроническом вирусном гепатите С / КС. Горелова, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова // Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии : сб. статей и тез. XI Регион, науч.-практ. конф., г. Владивосток, 11 апр. 2013 / ТГМУ, Департамент здравоохр. Прим. края; отв. ред. Е. В. Просекова, В. А. Сабыныч. - Владивосток : МГУ им. адм. Г. И. Невельского, 2013. - С. 10-12.

4. Локальный профиль системы ТФР-ß при HCV-ассоциированном фиброзе печени / Е. В. Маркелова, И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр, А. И. Симакова, И. П. Клепцова, М. И. Печеркина // Клиническая иммунология и аллергология — междисциплинарные проблемы : тр. Междунар. форума, г. Казань, 14-17 мая 2014 г. - Казань, 2014.-С. 158-159.

5. Скляр, Л. Ф. Цитокиновый профиль и фиброзрегулирующая активность ронколейкина при хроническом вирусном гепатите С / Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова, И. С. Горелова // Цитокины и воспаление. — 2014. - Т. 13, № 1. - С. 44-50.

6. Горелова, И. С. Сывороточные показатели семейства трансформирующего фактора роста-ß у пациентов с фиброзом печени при HCV-инфекции / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова // Фундаментальные исследования. - 2014. - №7, ч. 4. - С. 671-674.

7. Оценка выраженности фиброза печени методом эластографии у больных с хроническим вирусным гепатитом С / А. А. Апасова, А. А. Паршина, Ю. А. Ли, И. С. Горелова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XI Тихоок. науч,-практич. конф. студентов и молодых ученых медиков с междунар. участием, г. Владивосток, 21-22 апреля 2010 г. / ВГМУ; [ред. В. А. Невзорова, А. В. У скова, Т. А. Бродская]. - Владивосток : Медицина ДВ, 2010. - С. 318.

8. Clinicopathologic characteristics and local cytokine profile of patients with chronic viral hepatitis С / J. A. Li, I. S. Gorelova, L. Ph. Sklyar, E. V. Markelova, P. A. Lukynov // The 54th ISTC : Japan-Russia International Workshopthe, Tokyo,

May 29-30 2010 / National Center Global Health & Medicine (NCGM). - Tokyo, Japan, 2010.-P. 33-34.

9. Путилова, E. А. Иммунный и цитокиновый статус при хронических вирусных гепатитах разной этиологии / Е. А. Путилова, Ю. А. Ли, И. С. Горелова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XII Тихоок. науч,-практич. конф. студентов и молодых ученых медиков с междунар. участием, г.Владивосток, 14-15 апреля 2011 г. / ВГМУ; [ред. В. А. Невзорова,

B. А. Петров, Т. А. Бродская, Т. В. Тилик]. - Владивосток : Медицина ДВ, 2011. -С. 330.

10. Иммунологические показатели при хронических вирусных гепатитах разной этиологии / Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова, Е. А. Путилова,

C. П. Кругляк, И. С. Горелова, Ю. А. Ли, Н. А. Саргсян // Мед. иммунология. -2011.-Т. 13, №4-5.-С. 408-409.

11. Анализ уровня сывороточного маркера фиброза печени у пациентов с хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) / И. С. Горелова, Ю. А. Ли, Е. В. Русак, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова, Н. А. Саргсян // Человек и лекарство : мат. VIII Дальневост. регион, конгр. с междунар. участием, г. Владивосток, 15-16 сентября 2011 г. / ВГМУ; [науч. ред. В. Б. Шуматов; сост. В. А. Невзорова, Т. А. Бродская, Н. М. Кондрашова, Е. А. Афутина]. - Владивосток : Медицина ДВ, 2011. - С. 16-17. (Прил. к журн. "Тихоокеанский мед. журн.", 2011, № 3).

12. Оценка сывороточного уровня матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) у пациентов с хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) / И. С. Горелова, Ю. А. Ли, Е. А. Путилова, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2011. - Т. XXI, №5, прил. №38.-С. 83.

13. Горелова, И. С. Диагностика фиброзных изменений печени при хроническом вирусном гепатите С (ХВГС) / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2012. — Т. XXII, № 2, прил. № 39. - С. 17.

14. Горелова, И. С. Лабораторно-морфологические изменения печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр // Инфекционные болезни. - 2012. - Т. 10, прил. № 1. - С. 105.

15. Русак, Е. В. Взаимосвязь между уровнем сывороточной матриксной металлопротеиназы ММР-9 и степенью выраженности фиброза печени при хронических вирусных гепатитах / Е. В. Русак, И. С. Горелова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XII Тихоок. науч.-практич. конф. студентов и молодых ученых медиков с междунар. участием, г. Владивосток, 19-20 апреля 2012 г. / ВГМУ; [ред. В. А. Невзорова, А. В. Кропотов, Е. В Елисеева, Н. М. Кондрашова]. -Владивосток : Медицина ДВ, 2012. - С. 130.

20

16. Иммунологические методы ранней диагностики фиброза печени при хронических моно- и микст-вирусных гепатитах / Е. А. Путилова, И. С. Горелова, В. А. Иванис, JI. Ф. Скляр. — Владивосток : Медицина ДВ,

2012.-20 с.

17. Хронические вирусные гепатиты сочетанной этиологии: аспекты эпидемиологии, иммунопатогенеза, клиники и диагностики / И. С. Горелова, Е. А. Путилова, Л. Ф. Скляр, В. А. Иванис. - Владивосток : Медицина ДВ, 2012. -52 с.

18. Горелова, И. С. Роль ТФР-pi в патогенезе фиброза печени, вызванного вирусом гепатита С / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр, А. С. Журавлева // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2013. — Т. XXIII, № 1, прил. № 40. - С. 28.

19. Горелова, И. С. Зависимость уровня матриксной металлопротеиназы-9 и её комплекса с ингибитором от стадии фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр // Инфекционные болезни. —

2013. —Т. 11., прил. № 1.-С. 105-106.

20. Горелова, И. С. Роль сывороточного уровня ММР-9 в диагностике фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С / И. С. Горелова, С. В. Кныш // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XIV Тихоок. науч.-практич. конф. студентов и молодых ученых медиков с междунар. участием, г. Владивосток, 19-20 апреля 2013 г. / ТГМУ; [ред. В. А. Невзорова, А. В. Кропотов, Е. В. Елисеева, Н. М. Кондрашова]. - Владивосток : Медицина ДВ, 2013. - С. 10-11.

21. Горелова, И. С. Сывороточный уровень ТФР-В1 у пациентов с HCV-инфекцией в зависимости от стадии фиброза печени / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр. // Человек и лекарство : мат. X Дальневост. регион, мед. конгр., г. Владивосток, 19-20 сентября 2013 г. - Владивосток : Медицина ДВ, 2013. — С. 13-14. (Прил. к журн. "Тихоокеанский мед. журн." 2013, № 4).

22. Горелова, И. С. Содержание тканевого ингибитора металлопротеазы-1 в сыворотке крови у пациентов с фиброзом печени при HCV-инфекции / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр, О. Б. Дадалова // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2014. — Т. XXII, № 2, прил. № 43. — С. 17.

23. Горелова, И. С. Прогностическая роль комплекса матриксной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора металлопротеазы-2 в сыворотке крови у пациентов хроническим вирусным гепатитом С / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2014. - Т. XXII, № 2, прил. № 43. - С. 17.

24. Сывороточный уровень комплекса матриксной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора металлопротеиназы-2 при фиброзе печени HCV-этиологии / И. С. Горелова, Л. Ф. Скляр, И. П. Клепцова, О. И. Липовская // Инфекционные болезни.-2014.— Т. 11., прил.№ 1, —С. 105-106.

21

25. Горелова, И. С. Локальный уровень трансформирующего фактора роста-рз в зависимости от стадии фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С / И. С. Горелова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XV Тихоок. науч,-практич. конф. студентов и молодых ученых медиков с междунар. участием, г.Владивосток, 10-11 апреля 2013 г. / ТГМУ; [ред. В. А. Невзорова, О. А. Коршукова, Н. Ю. Матвеева, Л. В. Родионова]. - Владивосток : Медицина ДВ, 2014. - С. б.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВКМ

внеклеточный матрикс гамма-глутамилтранспептидаза матриксная металлопротеиназа пункционная биопсия печени

тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы трансформирующий фактор роста-Р хронический гепатит С фиброз

вирус гепатита С

ГГТ

ММП

ПБП

ТИМП ТФР-Р ХГС

К

НСУ

Горелова Ирина Сергеевна

ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФИБРОЗНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ С

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 15.10.2014 г. Формат 60x84/16. Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ООО "Литера V", 690091, г. Владивосток, ул. Светланская, ЗЮ e-mail: litera_v@mail.ru