Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование пароксетина

На правах рукописи

АПОЛЛОНСКАЯ ЯНА ЕВГЕНЬЕВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧКСКОВ ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРОКСЕТИНА

14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

1 7 МАЙ 2012

Пятигорск-2012

005043658

На правах рукописи

АПОЛЛОНСКАЯ ЯНА ЕВГЕНЬЕВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРОКСЕТИНА

14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск-2012

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении

высшего профессионального образования

«Пятигорская государственная фармацевтическая академия»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор фармацевтических наук, профессор,

Лазарян Джон Седракович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ

Попова Ольга Ивановна, доктор фармацевтических наук, профессор, ОППОНЕНТЫ: гюу впо Пятигорская ГФА

Минздравсоцразвития России, профессор кафедры фармакогнозии

Маршалкин Михаил Федорович, доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО Пятигорский ГГТУ, заведующий кафедрой охраны окружающей среды и химии

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГБОУ ВПО Алтайский ГМУ

Минздравсоцразвития России

Защита состоится «29» мая 2012 года в 9й на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан «27» апреля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета ^ ^ Е.В. Компанцева

z

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В медицине широко используется психотропное средство из группы антидепрессантов - пароксетин, которое активно применяется в клинической практике для лечения аффективных расстройств.

Наряду с терапевтическим эффектом пароксетин при передозировке, взаимодействии с другими лекарственными средствами, злоупотреблении, может привести к отравлениям, в том числе, со смертельным исходом.

Пароксетин в соответствии с приказом Минздрава России от 29 декабря 2000 г. № 460 «Об утверждении учетной документации токсикологического мониторинга» (Приложение №2) включен под торговым наименованием Паксил в «Перечень наименований токсичных веществ, наиболее часто встречающихся при острых отравлениях». В данном списке пароксетину согласно Международной классификации болезней (МКБ-10) присвоен код -Т50.9

В современных литературных источниках не достаточно освещены методики по изолированию и анализу пароксетина в биологических жидкостях, трупном материале. В связи, с этим разработка схем химико-токсикологического исследования биологических объектов на пароксетин является актуальной проблемой.

Химико-токсикологический анализ пароксетина позволяет своевременно диагностировать отравление (острое, смертельное).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методологического подхода к изолированию, обнаружению и количественному определению пароксетина для проведения химико-токсикологического анализа с использованием современных физико-химических методов.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

осуществить выбор оптимальных условий изолирования пароксетина из

биологических объектов (кровь, моча, печень, почки); ^ разработать методики обнаружения и количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов с помощью современных физико-химических методов;

апробировать разработанные методики на лабораторных животных; предложить схему химико-токсикологического анализа пароксетина; внедрить разработанные методики в работу химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий.

Научная новизна работы. Определены оптимальные условия экстракции пароксетина из водных растворов в зависимости от четырех факторов: природы органического растворителя, значения рН среды, наличия электролитов и продолжительности экстракции. Установлено, что на процесс изолирования пароксетина методом жидкость - жидкостной экстракции влияет значение рН среды, природа органического растворителя и наличие электролита.

Впервые обоснованы и разработаны методики изолирования пароксетина при химико-токсикологическом и судебно-химическом анализах биологических жидкостей (кровь, моча) и внутренних органов трупа (печень, почки).

Разработаны методики идентификации пароксетина в извлечениях из биологических объектов на основе химических методов (хромогенных и микрокристаллоскопических реакций) и современных физико-химических методов (ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ).

Разработаны методики количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) с помощью физико-химических методов: газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Разработанные методики апробированы на биологических объектах (кровь, моча, печень, почки) лабораторных животных (крыс) при введении токсических доз препарата, тем самым было показано определение пароксетина при отравлениях.

Практическая значимость работы н внедрение результатов исследования.

Разработанная схема химико-токсикологического анализа пароксетина позволяет достоверно диагностировать факт отравления и оценить его степень.

По материалам исследования подготовлено и утверждено Ученым советом ФГУ «Российский Центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России (протокол №3 от 09.06.2011 года) Информационное письмо «Химико-токсикологическое исследование пароксетина», которое рекомендовано к использованию в химико-токсикологических лабораториях и Бюро СМЭ Российской Федерации.

Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 64-й, 65-й и 66-й конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2009-2011гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них одна в ведущем научном журнале, рекомендованном ВАК России.

Основные положения, выносимые на защиту.

• выбор условий экстракции пароксетина из водных растворов с учетом влияния следующих факторов: значения pH среды, природы органического растворителя, присутствия электролита и продолжительности экстракции;

• разработка методик изолирования пароксетина из биологических жидкостей (кровь, моча) и биологического материала (печень, почки);

• способы идентификации и количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки);

• схема химико-токсикологического исследования пароксетина в биологических объектах (кровь, моча, печень, почки);

• апробация разработанных методик на лабораторных животных (крысах).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 110 страницах печатного текста, и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка литературы. В диссертации приводится 25 рисунков и 27 таблиц. Библиографический указатель включает 130 источников, из них 39 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Схема анализа пароксетина включает предварительное исследование с помощью метода ТСХ и подтверждающее исследование - хромогенными и микрокристаллоскопическими реакциями, методами ГХ/МС ВЭЖХ. Количественное определение пароксетина проводили методами ВЭЖХ и ГХ. Разработка методик изолирования, анализа и их валидация проводились на модельных пробах биологических объектов (кровь, моча, печень, почки).

1 Разработка методик идентификации пароксетина Метод хроматографии й тонком слое сорбента

Обнаружение пароксетина методом хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) проводили по следующей методике: на линию старта хроматографической пластины с помощью микрошприца для тонкослойной хроматографии наносили по 2 мкл 1% раствора пароксетина. После удаления органического растворителя пластины хроматографировали в исследуемых системах растворителей.

Специфичность полученных результатов подтверждали при хроматографировании феназепама и амитриптилина (препаратов совместно применяемых в лечебной практике с пароксетином) в разработанных для пароксетина хроматографических системах.

Хроматографирование проводили в следующих системах растворителей:

- Б,: бензол-диоксан-25% раствор аммиака (60:35:5);

- 52: этанол-25% раствор аммиака (100:1,5)

- Бз: диоксан:бутанол: 25% раствор аммиака

Значения ЯГ исследуемых лекарственных веществ в предложенных системах растворителей представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Величины ЯГ исследуемых веществ

Исследуемое вещество Система растворителей / значение ЯГ

8, 5з

Пароксетин 0,50±0,01 0,36±0,02 0,49±0,01

Феназепам 0,65±0,03 0,80±0,02 0,65±0,02

Амитриптилин 0,82±0,01 0,64±0,03 0,32±0,01

Детекцию зон адсорбции осуществляли путем просмотра хроматографических пластин в УФ свете при длине волны 254 нм и с последующей обработкой хроматограммы реактивом Драгендорфа. Пределы обнаружения исследуемых лекарственных веществ представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Пределы обнаружения исследуемых веществ

Проявители Предел обнаружения, мкг в пробе

пароксетин феназепам амитриптилин

УФ свет 3,0 3,0 3,0

Реактив Драгендорфа 3,0 2,0 2,0

Предложенные системы растворителей позволяют достаточно четко разделить пароксетин с каждым из исследуемых веществ, а также разделить анализируемые вещества от соэкстрактивных компонентов крови, мочи, печени и почек.

Таким образом, методика разделения и обнаружения изучаемых веществ методом ТСХ может быть использована в химико-токсикологическом исследовании при направленном анализе, а также для их идентификации при комбинированных отравлениях.

Хромогенные реакции

Несмотря на широкое использование в практике работы судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий физико-химических

методов анализа для обнаружения и идентификации лекарственных веществ при отравлениях в извлечениях из биологических объектов, использование хромогенных реакций не утратило своего значения.

Исследование проводили при температуре окружающей среды 25±2°С. Наблюдали окрашивание с азотной кислотой концентрированной, серной кислотой концентрированной, реактивом Эрдмана и Манделина, чувствительность составила 1,2; 0,6; 1,2 и 0,6 мкг в пробе соответственно. В результаты хромогенных реакций проявляется специфическая окраска, поэтому они могут быть использованы в его химико-токсикологическом анализе. Эти реакции были использованы для обнаружения пароксетина в извлечениях из мочи.

На основании вышеописанного можно предложить использовать хромогенные реакции при анализе как биологической жидкости (мочи) при остром отравлении пароксетином, так и вещественного доказательства (в виде лекарственного препарата).

Микрокристаллоскопические реакции

Микрокристаллоскопический метод широко используется в химико-токсикологическом анализе ввиду простоты выполнения, высокой чувствительности и возможности в большинстве случаев исключить громоздкие операции.

Исследование проводили при температуре окружающей среды 25±2°С. Образовались характерные для пароксетина кристаллы с 0,2% раствором метилового оранжевого в 0,01 М растворе натрия гидроксида (0,8 мкг в пробе); а также в присутствии 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты с реактивами: 0,2% водным раствором метилового оранжевого (0,8 мкг в пробе), калия (III) феррацианидом (0,5 мкг в пробе), 15% раствором кадмия йодида (0,5 мкг в пробе).

На основании проведенных исследований можно предложить использовать микрокристаллоскопические реакции при анализе как

биологической жидкости (мочи) при отравлении пароксетином, так и вещественного доказательства (в виде лекарственного препарата).

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Анализ пароксетина методом ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» производства ЗАО «ЭкоНова» г.Новосибирск. Исследование пробы осуществляли на хроматографической колонке размером 2x75 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом "Силасорб С18". В качестве элюента А применяли 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент Б - ацетонитрил. Хроматографирование проводили в градиентном режиме от 10% элюента Б до 70% за 24 минуты. Скорость подачи подвижной фазы составляло 100 мкл/мин, время измерения -0,18 сек, температура термостата колонки - 35°С, объем вводимой пробы Юмкл.

Идентификация пароксетина осуществляли по времени удерживания 16,56± 0,05 мин (таблица 6) при длине волны 294 нм, соответствующей максимуму поглощения раствора пароксетина в элюенте.

Методика идентификации пароксетина методом ВЭЖХ была подвергнута валидационной оценке по следующим характеристикам: прецизионность, специфичность, предел обнаружения.

Для определения прецизионности методики идентификации пароксетина проводилась оценка метрологических характеристик его времени удерживания (таблица 3).

Таблица 3 - Результаты хроматографирования пароксетина методом ВЭЖХ

Время удерживания (мин) Метрологические характеристики

16,63; 16,52; 16,55; 16,53; 16,50; 16,62 X =16,56; SD= 0,05; RSD=0,3%

Время удерживания составляет 16,56 ± 0,05 мин, что соответствует времени удерживания стандартного образца пароксетина.

Относительное стандартное отклонение определения времени удерживания пароксетина при данных условиях хроматографирования

составляет 0,3%, что свидетельствует о высокой воспроизводимости данной методики.

Поскольку пароксетин назначается совместно с феназепамом и амитриптилином, нами была проверена специфичность методики по отношению к этим лекарственным препаратам. Время выхода феназепама и амитриптилина при хроматографировании составляет 13,07 и 18,15 минут соответственно. Коэффициент разделения для пиков пароксетина и феназепама составил 5,94, а для пиков пароксетина и амитриптилина - 4,61, что подтверждает разделение исследуемых лекарственных веществ.

Предел обнаружения определяли по методу «трех сигма», он составил 4,19мкг/мл.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности использования метода ВЭЖХ для обнаружения пароксетина в извлечениях из биологических объектов при отравлениях пароксетином как индивидуально, так и при сочетанном применении с феназепамом и амитриптилином.

Метод хромато-масс-спектрометрии

Методика обнаружения пароксетина методом ГХ/МС состояла в следующем: хроматографировапи на газовом хроматографе №5860/5973, фирмы «Agilent Technologi», оснащенном ПИД и капиллярной колонкой НР-1 размерами 30 м - 0,32мм (внутренний диаметр) - 0,25 мкм (толщина неподвижной фазы). Температуру колонки программировали от 70 до 290°С, температура детектора составляет 270°С. Ввод автоматический. Объем пробы -1мкл, режим Splitless.

Методика была подвергнута валидационной оценке по следующим характеристикам: специфичность, прецизионность, предел обнаружения методики идентификации.

Идентификацию пароксетина проводили по времени удерживания, которое соответствовало времени удерживания его стандартного образца (Rt)=20,5I±0,04 мин, а также с помощью библиотеки масс-спектров NIST 2.0, применяя систему обработки хромато-масс-спектральной информации AMDIS, со значениями m/z.

Характерны пики с числом т/т-192, 138, 109.

Поскольку пароксетин назначается совместно с феназепамом и амитриптилином, нами была проверена специфичность методики по отношению к этим лекарственным препаратам.

Предел обнаружения определяли по методу «трех сигма». Согласно расчетам, предел обнаружения пароксетина на водных растворах составил 3,34мкг/мл. Были определены пределы обнаружения пароксетина методом ГХ/МС в биологических объектах: кровь - 4,49 мкг/мл, моча - 3,83 мкг/мл, печень - 4,62 мкг/мл, почки- 4,69 мкг/мл.

Таким образом, предложена методика идентификации пароксетина с помощью ГХ/МС, которая может быть использована в химико-токсикологическом анализе.

Разработка способов количественного определения пароксетина на водных растворах и в биологических объектах

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Расчет проводили по площади пика с использованием внешнего стандарта. Разработанную методику на водных растворах оценивали по следующим валццационным характеристикам: специфичность, линейность, правильность, прецизионность (повторяемость), предел количественного определения.

Специфичность методики определяли набором хроматограмм растворов стандартных образцов пароксетина и извлечений из модельной и контрольной проб биологических объектов (кровь, моча, печень, почки). Полученные результаты свидетельствуют о специфичности разработанной методики.

При оценке методики проводили проверку линейной зависимости величины отклика от количества определяемого вещества. Линейная зависимость наблюдается в интервале концентраций 0,008-1,0 мг/мл. Контроль линейной зависимости по каждому исследуемому объекту проводили путем расчета коэффициента корреляции, который составил 0,999, что позволяет использовать данную методику для количественного определения пароксетина в указанном

диапазоне концентраций.

Для установления правильности методики готовили 9 растворов стандартных образцов пароксетина на трёх уровнях концентраций в трёх повторностях. Результаты определения свидетельствуют о том, что методика не отягощена систематической ошибкой, поскольку соблюдается неравенство > ^

Предел количественного определения рассчитывали методом «десяти сигма», он составил 13,83 мкг/мл пароксетина.

Метод газовой хроматографии

Разработанную методику количественного определения пароксетина на водных растворах методом ГХ оценивали по следующим валидационным характеристикам: специфичность, линейность, прецизионность (повторяемость), предел количественного определения.

Специфичность методики определяли набором хроматограмм растворов стандартных образцов пароксетина и извлечений из модельной и контрольной проб биологических объектов (кровь, моча, печень, почки). Полученные результаты свидетельствуют о специфичности разработанной методики.

При оценке методики проводили проверку линейной зависимости величины отклика от количества исследуемого вещества. Сначала выполняли проверку линейности, затем проводили регрессионный анализ данной зависимости в соответствии с соответствующим линейным уравнением.

Для этого строили график зависимости площади пика от концентрации пароксетина. Определение площади пиков проводили при хроматографировании спиртовых растворов, с концентрацией исследуемого вещества от 0,001 мг/мл до 16 мг/мл, охватывающих область действия методики, позволяющей количественно определить пароксетин.

Линейная зависимость наблюдается в интервале 0,006 - 12мг/мл концентраций спиртового раствора пароксетина. Зависимость площади пика от концентрации описывается линейным уравнением у = 1052,9х + 1,057. Коэффициент корреляции составил 0,999, таким образом, методика является

линейной. Предел количественного определения рассчитывали методом «десяти сигма», он составил 11,02 мкг/мл пароксетина.

2 Разработка методик изолирования пароксетина из водных растворов и биологических объектов

Изучение оптимальных условий экстракции пароксетина из водных

растворов

Для оптимизации условий экстракции пароксетина применяли один из методов математического планирования эксперимента - «латинский квадрат», позволяющий получить достоверную информацию при значительном сокращении числа опытов и учесть одновременное влияние нескольких факторов на степень экстракции органическими растворителями.

В эксперименте изучали одновременное влияние на процесс экстракции пароксетина четырех факторов: природы органического растворителя (А), наличие электролита (В), значения рН среды (С), времени экстракции (Б). В качестве экстрагентов использовали не смешивающиеся с водой свежеперегнанные растворители: хлороформ, этилацетат, диэтиловый эфир, гексан, смесь - гептан-дихлорэтан-изопропанол-хлороформ (32:23:10:35). Определенное значение рН среды в интервале 2,0-11,0 создавали с помощью универсальной буферной смеси (УБС) Бритгона-Робинсона. В качестве электролитов применяли натрия сульфат и натрия хлорид. Экстрагирование проводили в течение 3, 5, 7,9, 11 минут.

Степень экстракции пароксетина в условиях эксперимента определяли с помощью метода УФ спектрофотометрии. Для измерения спектров готовили стандартные растворы пароксетина с концентрацией 0,01%. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре марки СФ-56 в кювете с толщиной слоя 1 см. Раствором сравнения служил соответствующий растворитель.

В результате эксперимента определены оптимальные условия экстракции пароксетина: экстрагент - экстрагент этилацетат, рН среды 9, электролит 5% раствор натрия хлорида, позволяющие извлечь его до 96,32%,

продолжительность экстракции не оказывало значительного влияния.

Влияние указанных факторов необходимо учитывать при разработке методик изолирования пароксетина из биологических объектов при судебно-химическом и химико-токсикологическом анализах.

Изолирование пароксетина из биологических объектов

На основании проведенных исследований нами разработаны методики изолирования пароксетина из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки). Исследование проводилось на модельных смесях.

Затравленные модельные смеси биологических объектов (кровь - 10мл, моча - 10мл, печень -Юг, почки - Юг) с содержанием пароксетина в пробе Змг, 6мг и 9мг (исходя из графика линейности) оставляли на 24 часа при температуре окружающей среды 18°С. Через сутки с полученными образцами проводили исследование.

Методика изолирования из биологических жидкостей (моча, кровь): к модельной пробе объёмом 10мл добавляли 15% хлористоводородную кислоту до рН 2-3. Смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут. После гидролиза полученную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 8 мл 50% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Через 5-10 минут надосадочную жидкость отфильтровывали в делительную воронку, добавляли 30% раствор натрия гидроксида до значения рН среды 9 по универсальному индикатору, электролит - 0,5г натрия хлорида и экстрагировали трехкратно этилацетатом (по 20 мл) в течение 5 минут. Полученные органические извлечения фильтровали через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривали в потоке теплого воздуха до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в 10 мл спирта этилового 96% и исследовали.

Методика изолирования из биологических органов (печень, почки)'. модельную пробу биологического объекта (печень, почки) массой 10 г измельчали и прибавляли спирт этиловый 96% до зеркала и доводили 10% щавелевой кислотой до рН 2-3 по универсальному индикатору. Затем

настаивали 3 раза по 2 часа, каждый раз сливая надосадочную жидкость. Полученные извлечения упаривали при температуре 40°С до густоты сиропа. Далее добавляли по каплям спирт этиловый 96% до прекращения выпадения осадка. Надосадочную жидкость упаривали досуха. Остаток растворяли в 25 мл горячей воды (60°С) и охлаждали до комнатной температуры. К фильтрату добавляли 30% раствор натрия гидроксида до рН 9 по универсальному индикатору, затем добавляли электролит - натрия хлорид. Экстрагирование проводили трехкратно этилацетатом по 20 мл. Затем полученные извлечения центрифугировали в течение 5 минут при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, фильтровали через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривали до сухого остатка в потоке теплого воздуха. Сухой остаток растворяли в 10 мл спирта этилового 96% и исследовали.

Далее проводили идентификацию пароксетина в извлечениях из биологических объектов по разработанным ранее методикам с использованием методов ТСХ, хромогенных и микрокристаллоскопических реакций, ВЭЖХ, ГХ/МС. Проведенные исследования показали, что комбинированное использование разработанных методик позволяет нацежно идентифицировать изучаемое лекарственное вещество.

Следующим этапом исследования явилось количественное определение пароксетина с помощью ранее разработанньк методик (ВЭЖХ, ПХ) анализа и их валидация.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Были рассчитаны пределы количественного определения пароксетина методом ВЭЖХ в биологических объектах: кровь - 11,33 мкг/мл, моча - 9,54 мкг/мл, печень - 11,65 мкг/мл, почки - 11,45 мкг/ мл.

Для установления прецизионности методики анализировали модельные пробы биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) методом ВЭЖХ.

Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты количественного определения пароксетина в модельных пробах крови, мочи, печени, почках методом ВЭЖХ

Объект Внесено, мг в пробе Найдено, Метрологические характеристики

мг в пробе %

Кровь (10мл) 3,0 2,60; 2,33; 2,13 86,56; 77,81; 71,11 Л =79,63% 80=8,13 ЯБО=8,44%

6,0 5,19; 4,37; 4,46 86,52; 72,88; 74,32

9,0 7,83; 7,72; 6,72 86,96; 85,81; 74,71

Моча (10мл) 3,0 2,75; 2,56; 2,34 91,76; 85,42; 78,03 К =86,96% 80=6,14 1180=6,38%

6,0 5,55; 4,76; 5,29 92,56; 79,31; 88,24

9,0 8,41; 7,65; 8,00 93,44; 84,98; 88,87

Печень (Юг) 3,0 2,34; 1,86; 2,43 77,97; 62,00; 81,11 Л =72,61% 80=10,17 1*30=10,47%

6,0 3,81; 4,09; 4,91 63,47; 68,13; 81,87

9,0 7,11; 6,15; 6,45 78,95; 68,32; 71,69

Почки (Юг) 3,0 2,18; 1,86; 2,21 72,57; 62,01; 73,68 Я=71,50% 80=10,45 1180=10,77%

6,0 3,97; 4,94; 3,78 66,12; 82,34; 63,01

9,0 6,63; 6,03; 7,48 73,65; 66,98; 83,12

Разработанная методика позволяет количественно определить пароксетин в извлечениях из биологических объектов. Выход пароксетина из крови составил в среднем около 80%, из мочи - 87%, из печени - 73%, из почек- 72%. Относительное стандартное отклонение не превышает 10,77%.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности использования метода ВЭЖХ для количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических жидкостей (кровь, моча) и внутренних органов трупа (печень, почки).

Метод газовой хроматографии Были рассчитаны пределы количественного определения пароксетина методом ГХ в биологических объектах: кровь - 8,91 мкг/мл, моча - 8,11мкг/мл, печень - 9,86 мкг/мл, почки - 10,0 мкг/мл.

Для установления прецизионности методики анализировали модельные пробы биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) методом ГХ. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты количественного определения пароксетина в модельных пробах крови, мочи, печени, почках методом ГХ

Объект Внесено, мг в пробе Найдено, Метрологические характеристики

мг в пробе %

Кровь 3,0 2,50; 2,09; 2,22 83,32; 69,50; 73,84 Я =76,21% 80=7,13 1180=7,41%

6,0 4,94; 4,19; 4,44 82,32; 69,85; 74,04

9,0 6,49; 7,51; 6,97 72,06; 83,48; 77,48

Моча 3,0 2,65; 2,25; 2,58 88,34; 75,01; 86,09 Я =83,67% 8Э=6,91 К80=7,19%

6,0 5,34; 4,55; 5,15 89,04; 75,87; 85,78

9,0 8,13; 6,93; 7,71 90,32; 77,00; 85,61

Печень 3,0 2,35; 2,02; 1,92 78,20; 67,31; 63,86 Я=69,59% 80=9,46 1180=9,78%

6,0 4,70; 3,80; 4,31 78,30; 63,29; 71,75

9,0 6,84; 5,39; 6,10 75,98; 59,87; 67,79

Почки 3,0 2,32; 1,75; 1,99 77,15; 58,45; 66,21 Я =68,26% 80=10,22 1180=10,61%

6,0 4,64; 3,99; 3,74 77,25; 66,51; 62,28

9,0 6,97; 5,99; 5,63 77,43; 66,61; 62,44

Разработанная методика позволяет количественно определить пароксетин в извлечениях из биологических объектов. Выход пароксетина из модельных проб крови, мочи, печени и почек методом ГХ в среднем составил 76%, 84%, 70% и 68% соответственно. Относительное стандартное отклонение не

превышает 10,61%.

Так как вычисленное значение коэффициента Фишера для всех исследуемых биологических объектов меньше табличного (t^ -10,97), можно сделать вывод о том, что разработанные методики количественного определения пароксетина с помощью методов ВЭЖХ и ГХ не отличаются по своей воспризводимости.

3 Схема химико-токсикологического исследования пароксетина в биологических объектах 3.1 Апробация разработанных методик на лабораторных животных

Разработанные методики обнаружения и количественного определения пароксетина были апробированы на лабораторных животных (крысах). Экспериментальные исследования выполнялись в соответствии с правилами европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в эксперименте для научных целей. Исследования проводили на белых крысах в возрасте 2,0-2,5 месяца массой 180-300 г.

Группе крыс (по 6 на каждую концентрацию) вводились перорально токсические дозы пароксетина (850, 1000, 1200 мг) с водной нагрузкой в пересчете на массу животных (соответственно 14,3; 16,9; 20,2 мг). Параллельно проводился контрольный опыт. Через 5,2 часа (время максимальной концентрации в плазме) биологические объекты исследовали.

Идентификацию пароксетина осуществляли с помощью предварительного и подтверждающего исследований (п. 2-3).

Количественное содержание пароксетина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) лабораторных животных определяли методами ВЭЖХ и ГХ (п. 3.1 - 3.2).

Полученные результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Результаты количественного определения пароксетина в крови, моче, печени, почках лабораторных крыс методами ВЭЖХ и ГХ

Объект Введено (перорапьно) субстанции пароксетина крысе (мг)

14,3 16,9 20,2

Метод ВЭЖХ кровь X =20,87%; Б* =0,78; ДХ = 2,01; 6 = 9,64% X = 21,01%; Бх =0,77; АХ - 1,99; е = 9,47% X = 21,17%; Бх =0,78; АХ = 1,998; 6 =9,44%

моча * = 9,14%; Б* =0,34; Д 7 =0,87; £=9,50% X = 9,26%; =0,33; ДХ = 0,86; £=9,26% ~Х = 9,38%; Б х =0,33; АХ = 0,85; 6 = 9,02%

печень X = 20,86%; Б х =0,93; АХ = 2,40; 6 = 11,48% Х = 21,08%; 5^ = 0,91; ЛХ-2,34; е = 11,11% Л" = 21,26%; вх =0,92; АХ = 2,36, е = 11,08%

почки X = 9,46%; Бх =0,45; ДХ= 1,15; £ = 11,86% X = 9,66%; Б л =0,44; АХ = 1,14; с = 11,80% X = 9,88%; Б* =0,45; ДХ= 1,15; 6= 11,60%

1 Метод ГХ кровь X = 19,98%; 5*= 0,76; ДХ = 1,95; €=9,75% Х = 20,22%; Б* =0,75; Д7= 1,93; 6 = 9,56% * = 20,54%; Б* =0,74; АХ = 1,91; 6 = 9,29%

моча X = 8,27%; Бх =0,31; ДХ = 0,81; £=9,73% X = 8,42%; Эх =0,32; АХ = 0,81; 6 = 9,65% Х = 8,57%; Эх =0,32; ДХ = 0,81; £ = 9,45%

печень X = 19,93%; Б * =0,90; Д* = 2,32; е= 11,65% X = 20,12%; Б х =0,90; ДХ = 2,31;« = 11,49% 7 = 20,27%; Б* =0,89; АХ = 2,29; 6 = 11,32%

почки X = 8,41%; =0,40; АХ = 1,02; 6 = 12,07% ~Х — 8,56%; Б х =0,40; АХ = 1,02; £ = 11,96% Л- = 8,72%; 8 х =0,40; Д* = 1,04; 6 = 11,88%

Исходя из данных таблицы 6, относительная погрешность определения не превышает 12,07%.

Разработанные методики позволяют достоверно обнаружить и количественно определить пароксетин в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) лабораторных животных (крыс).

3.2 Схема химико-токсикологического исследования пароксетина в биологических объектах (кровь, моча, печень, почки)

Результаты проведенных исследований были использованы для разработки схемы химико-токсикологического анализа пароксетина в биологических жидкостях (кровь, моча) и во внутренних органах трупа (печень, почки).

Рисунок 1 - Схема химико-токсикологического исследования пароксетина в

извлечениях из мочи

Заключение о присутствии пароксетина в исследуемых биологических объектах дают при положительном результате предварительного исследования методом ТСХ и подтверждающего исследования методами ГХ/МС и ВЭЖХ.

Таким образом, химико-токсикологический анализ биологических жидкостей (крови, мочи) и внутренних органов трупа (печени, почек) позволяет достоверно диагностировать факт отравления пароксетином.

Выводы

1. Изучена зависимость степени экстракции пароксетина из водных растворов от природы органического растворителя, значения рН среды, присутствия электролита. Выбраны оптимальные условия изолирования пароксетина: экстрагент - этилацетат, значение рН среды - 9, электролит- 5% раствор натрия хлорида. Выход в найденных условиях составляет около 96%.

2. Разработаны методики изолирования пароксетина из мочи, крови, печени и почек. Выход изучаемого лекарственного вещества составил в среднем 86%, 79%, 72% и 71% соответственно.

3. Разработаны методики идентификации пароксетина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) с помощью предварительного исследования (методом ТСХ) и подтверждающего исследования химическими (хромогенными и микрокристаллоскопическими реакциями) и физико-химическими методами (ГХ/МС, ВЭЖХ).

4. Найдены оптимальные системы для хроматографирования пароксетина методом ТСХ: бензол - диоксан - аммиака раствор 25% (60:35:5); диоксан - бутанол - 25% раствор аммиака (25:20:5); этанол-25% раствор аммиака (100:1,5). Значение ЯГ (п=6) пароксетина соответственно равно: 1) 0,50±0,01; 2) 0,49±0,01; 3) 0,36±0,02. Детекцию зон адсорбции предложено проводить путем просмотра хроматографических пластин в УФ свете при длине волны 254 нм и с последующей обработкой хроматограммы реактивом Драгендорфа.

5. Показана возможность использования хромогенных и микрокристаллоскопических реакций для идентификации пароксетина при анализе как биологической жидкости (мочи) при остром отравлении пароксетином, так и вещественных доказательств (лекарстве!шого препарата).

Предел обнаружения пароксетина с помощью хромогенных реакций составляет от 0,6 до 1,2 мкг в пробе, микрокристаллоскопических реакций от 0,5 до 0,8 мкг в пробе.

6. Разработана методика идентификации пароксетина методом хромаго — масс -спектрометрии. Методика отличается высокой чувствительностью (334 мкг/мл), специфичностью и прецизионностью.

7. Разработаны методики количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) методами ВЭЖХ и ГХ. Валидационная оценка методики по параметрам: прецизионность, предел количественного определения подтвердила пригодность её использования.

8. Вычисленное значение коэффициента Фишера меньше табличного 0табл=Ю,97) для всех исследуемых биологических объектов, поэтому сделан вывод о том, что разработанные методики количественного определения пароксетина с помощью методов ВЭЖХ и ГХ не отличаются по своей прецизионности.

9. Предложена схема химико-токсикологического анализа биологических жидкостей (кровь, моча) и внутренних органов (печень, почки) при отравлении пароксетином.

10. Разработанные методики апробированы на биологических объектах (кровь, моча, печень, почки) лабораторных животных (крыс) при введении токсических доз препарата, тем самым было показано определение пароксетина при отравлениях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Аполлонская, Я.Е. Химико-токсикологический анализ пароксетина в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/ Я.Е.Аполлонская // Токсикологический вестник.-2010.-№3 .-С.44-46.

2.Аполлонская, Я.Е. Поиск оптимальных условий экстракции пароксетина из водных растворов/Я.Е.Аполлонская//Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009,- Вып.64,-С. 319-320

3.Аполлонская, Я.Е. Оценка пригодности ВЭЖХ методики для идентификации и количественного определения пароксетина/ Я.Е.Аполлонская // О проблемных вопросах организации производства судебно-медицинских экспертиз: материалы. Всерос. науч.-практ. конф. 5 - 6 ноября 2009г.- М.: РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава»,2009.-С.362-365.

4.Аполлонская, Я.Е. Идентификация пароксетина с помощью химических реакций/ Я.Е.Аполлонская // Актуальные вопросы судебно - химических, химико - токсикологических исследований и фармацевтического анализа: материалы Рос. науч.- практ. конф. с междунар. участием 28 сентября - 3 октября 2009г. - Пермь, 2009. -С.121-123.

5.Аполлонская, Я.Е. Идентификация и количественное определение пароксетина в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/ Я.Е.Аполлонская//Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.-Пятигорск, 20Ю.-Вып.65.-С.368-370.

6.Аполлонская, Я.Е. Использование хромато-масс-спектрометрии для идентификации пароксетина в биологических объектах / Я.Е.Аполлонская // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2010,- № 7. -С. 258-259.

7.Аполлонская, Я.Е. Обнаружение и количественное определение пароксетина в извлечениях из печени крыс/ Я.Е.Аполлонская // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.- Пятигорск, 2011.-Вып.66,- С. 345-347.

АПОЛЛОНСКАЯ ЯНА ЕВГЕНЬЕВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРОКСЕТИНА

14.02.04. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Подписано к печати 26.04.2012г. формат бумаги 60x84-1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 0,8. Тираж 100 экз. Заказ № ч&в

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Актуальность темы. В медицине широко используется психотропное средство из группы антидепрессантов - пароксетин, которое активно применяется в клинической практике для лечения аффективных расстройств си.

Наряду с терапевтическим эффектом пароксетин при передозировке, взаимодействии с другими лекарственными средствами, злоупотреблении, может привести к отравлениям, в том числе, со смертельным исходом.

Пароксетин в соответствии с приказом Минздрава России от 29 декабря 2000г. № 460 «Об утверждении учетной документации токсикологического мониторинга» (Приложение №2) включен под торговым наименованием Паксил в «Перечень наименований токсичных веществ, наиболее часто встречающихся при острых отравлениях». В данном списке пароксетину согласно Международной классификации болезней (МКБ-10) присвоен код - Т50.9

В литературе имеются сведения о химико-токсикологическом исследовании биологических объектов на лекарственные вещества группы антидепрессантов. Приведены способы их изолирования, обнаружения и количественного определения с помощью химических и физико-химических методов (фотометрических, хроматографических и др.).

Однако в современных литературных источниках не достаточно освещены методики по изолированию и анализу пароксетина в биологических жидкостях, трупном материале. В связи, с этим разработка схемы химико-токсикологического исследования биологических объектов на пароксетин является актуальной проблемой.

Химико-токсикологический анализ пароксетина позволяет своевременно диагностировать отравление (острое, смертельное).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методологического подхода к изолированию, обнаружению и количественному определению пароксетина для проведения анализа с использованием современных физико-химических методов.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи: разработать методики обнаружения и количественного определения пароксетина в водных растворах с помощью современных физико-химических методов; ^ осуществить выбор оптимальных условий изолирования пароксетина из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки); разработать методики обнаружения пароксетина в извлечениях из биологических объектов; ^ разработать методики количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов; ^ апробировать разработанные методики на лабораторных животных; ^ предложить схему химико-токсикологического анализа пароксетина при отравлениях; внедрить разработанные методики в работу химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий.

Научная новизна работы. Определены оптимальные условия экстракции пароксетина из водных растворов в зависимости от четырех факторов: природы органического растворителя, значения рН среды, наличия электролитов и продолжительности экстракции. Установлено, что на процесс изолирования пароксетина методом жидкость - жидкостной экстракции влияет значение рН среды, природа органического растворителя и наличие электролита.

Впервые обоснованы и разработаны методики изолирования пароксетина при химико-токсикологическом и судебно-химическом анализах биологических жидкостей (кровь, моча) и внутренних органов трупа (печень, почки).

Разработаны методики идентификации пароксетина в извлечениях из 6 биологических объектов на основе химических методов (хромогенных и микрокристаллоскопических реакций) и современных физико-химических методов (ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ).

Разработаны методики количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) с помощью физико-химических методов: газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Апробированы разработанные методики на биологических объектах (кровь, моча, печень, почки) лабораторных животных (крысах) и представлена схема химико-токсикологического анализа пароксетина.

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования. Разработаны методики изолирования пароксетина из биологических жидкостей (кровь, моча) и биологического материала (печень, почки). Предложены методики идентификации пароксетина в извлечениях из биообъектов физико-химическими методами: высокоэффективной жидкостной хроматографией, хромато-масс-спектрометрией, тонкослойной хроматографией, а также с помощью хромогенных и микрокристаллоскопических реакций. Количественное содержание исследуемого вещества в извлечениях предложено определять методами газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработана схема химико-токсикологического исследования пароксетина в биологических объектах (кровь, моча, печень, почки).

Материалы внедрения.

По материалам исследования подготовлено и утверждено Ученым советом ФГУ «Российский Центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России (протокол №3 от 09.06.2011 года) Информационное письмо «Химико-токсикологическое исследование пароксетина», которое рекомендовано к использованию в химико-токсикологических лабораториях и Бюро СМЭ Российской Федерации.

Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 116 страницах печатного текста, и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы. В диссертации приводится 24 рисунка и 33 таблицы. Библиографический указатель включает 127 источников, из них 39 иностранных.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана методика обнаружения пароксетина в водных растворах методом ТСХ с использованием трех оптимальных систем растворителей с детекцией зон его локализации УФ светом и рективом Драгендорфа. Предел обнаружения составил 3 мкг в пробе.

2. Показана возможность использования хромогенных и микрокристаллоскопических реакций для идентификации пароксетина в моче или в вещественных доказательствах (лекарственном препарате).

3. Разработана методика идентификации пароксетина в водных растворах и в биологических объектах (кровь, моча, печень, почки) методом ВЭЖХ. Проведена валидационная оценка данной методики.

4. Предложены условия идентификации пароксетина в водных растворах и в биологических объектах (кровь, моча, печень, почки) методом хромато-масс-спектрометрии. Проведена валидационная оценка данной методики.

5. Разработаны методики количественного определения пароксетина в водных растворах и биологических объектах (кровь, моча, печень, почки) методом ВЭЖХ и ГХ. Проведена валидационная оценка данных методик по основным параметрам: специфичность, линейность, прецизионность, правильность и предел количественного определения.

6. Изучена зависимость степени экстракции пароксетина из водных растворов от природы экстрагента, значения рН среды, наличия электролита и продолжительности экстракции. В найденных оптимальных условиях разработаны методики изолирования пароксетина из крови, мочи, печени и почек.

7. Проведена апробация разработанных методик идентификации количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) лабораторных животных (крыс).

Предложена схема химико-токсикологического анализа пароксетина в крови, моче, печени и почках с использованием комплекса физико-химических и химических методов.

V. Vi