Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование дельтаметрина.

На правах рукописи

БЕЛОУСОВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЛЬТАМЕТРИНА

4848566

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

2 ИЮН 2011

Курск-2011

4848566

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Шорманов Владимир Камбулатович Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Яцюк Валентина Яковлевна доктор фармацевтических наук, профессор Сливкин Алексей Иванович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы

народов»

ЛJ _ ^^ . 01'

Защита состоится » _2011 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан 20 ^"гГ

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Дельтам стрил (S-альфа-циано-З-фенокси-бензил-(Ж,цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2-диметилциклопропанкарбоксилат) (синонимы: бутокс, бутофлин, декаметрин, децис, К-Обиоль) широко применяется в сельском хозяйстве, медицинской и ветеринарной практике в основном в качестве инсектицида.

Данное вещество обладает значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. ДД50 для крыс чистого вещества составляет 128-139 мг/кг (пероральное введение с кунжутным маслом), по другим данным 3152 мг/кг (пероральное введение с арахисовым маслом), концентрата эмульсии-535 мг/кг (пероральное введение). Описаны многочисленные случаи отравления дальтаметрином, в том числе с летальным исходом.

Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществом в процессе его производства, хранения и применения, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, а также при суицидальных попытках.

Широкое применение дельтаметрина, его высокая токсичность, наличие случаев летального отравления обусловливает необходимость изучения этого соединения в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования этого соединения из объектов биологического происхождения, его обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе практически отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемого вещества в биологическом (трупном) материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики судебно-химического исследования дельтаметрина является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики судебно-химического исследования дельтаметрина (S-альфа-циано-З -феноксибензил-( 1R., цис)-3-(2,2-дибромвшил)-2,2-диметил-циклопропанкарбоксилата). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить характер хроматографической активности исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в случае использования жидких подвижных фаз.

2. Исследовать хроматографическое поведение дельтаметрина в капиллярных колонках при использовании газообразных подвижных фаз с последующим масс-селективным детектированием.

3. Изучить особенности электронных и колебательных спектров дельтаметрина.

4. Изучить особенности образования окрашенных продуктов в реакциях рассматриваемого соединения с рядом цветореагентов. Определить возможность применения данных цветных реакций в условиях анализа биологического материала.

5. Изучить особенности изолирования объекта исследования различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.

6. Исследовать распределение дельтаметрина в органах и биологических жидкостях теплокровных животных.

7. Определить сроки сохранения рассматриваемого вещества в разлагающемся трупном материале.

Научная новизна исследования. Изучены отдельные закономерности хроматографического поведения дельтаметрина в сорбентах с гидроксилированной и привитой поверхностями при использовании различных подвижных фаз; определены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов.

На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения дельтаметрина методами ТСХ, ВЭЖХ и хроматоспектрофотометрии.

Изучены особенности масс-спектра дельтаметрина, получаемого методом электронного удара, и показана возможность идентификации рассматриваемого соединения по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания в капиллярной колонке при хроматографировании методом ГЖХ.

Исследованы особенности электронных и колебательных спектров поглощения дельтаметрина. Для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.

Показана возможность образования окрашенных продуктов при взаимодействии дельтаметрина с рядом цветореагентов. На основе предложенных хромогенных реакций разработаны методики идентификации и количествеооного определения исследуемого вещества.

Впервые для изолирования дельтаметрина из биологического материала обосновано использование в качестве изолирующего агента диоксана. На основе применения в качестве изолирующего агента данного растворителя и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях или колонках нормальнофазовых сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого соединения в ткани трупных органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно измененного трупного материала.

С использованием вновь разработанных методик в опытах на животных (крысы) исследованы особенности распределения дельтаметрина в организме теплокровных.

Определены сроки сохранения рассматриваемого отравляющего вещества в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведённых исследований разработана методика изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения дельтаметрина.

Внедрение результатов работы:

- методика изолирования дельтаметрина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 7 апреля 2010 года, кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 5 октября 2009 года и кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии с 9 сентября 2009 года);

- методика изолирования дельтаметрина из крови и определения методами ТСХ и ВЭЖХ (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 5 октября 2009 года и кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии с 25 сентября 2009 года);

- методика идентификации дельтаметрина методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную и научную работу кафедры биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 11 ноября 2009 года);

- методика очистки дельтаметрина методами жидкость-жидкостной экстракции и адсорбционной колоночной хроматографии (внедрена в учебную и научную работу кафедры биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 19 ноября 2009 года);

- методика идентификации и количественного определения дельтаметрина по реакции получения аци-нитропроизводных (внедрена в учебную (практические занятая) и научную работу кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии с 25 сентября 2009 года).

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета N 36 РАМН. Номер государственной регистрации 012.01051088.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследования хроматографической активности дельтаметрина в тонких слоях и колонках сорбентов при использовании жидких подвижных фаз;

результаты исследования хроматографической активности рассматриваемого соединения в капиллярных колонках при использовании газообразных подвижных фаз с последующим масс-сеяективным детектированием;

- особенности поглощения электромагнитного излучения анализируемого вещества в УФ- и ИК- областях спектра;

- условия взаимодействия дельтаметрина с рядом цвегореагентов;

- методики идентификации и количественного определения объекта исследования хроматографическими и фотометрическими методами;

- результаты исследования особенностей очистки дельтаметрина методом жидкость-жидкостной экстракции, а также в тонких слоях и колонках сорбентов;

- методики изолирования объекта исследования из биологического материала и очистки от соэкстрактивных веществ;

- особенности распределения дельтаметрина в организме теплокровных животных;

- сохраняемость дельтаметрина в трупном материале.

Апробация работы. Основные положения работы

представлены и доложены на 74 научной конференции КГМУ, сессии Центрально-Чернозёмного научного центра РАМН и отделения РАЕН (Курск, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология, биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик» (Курск, 2009), на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия», посвященной 75-летию Курского государственного медицинского университета (Курск-2010), на IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» ЭОС-2010 (Воронеж, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 169 страницах машинописного текста, содержат 10 рисунков, 18 таблиц. Список цитируемой литературы включает 132 источника, из которых 65 - на иностранных языках.

Первая глава (обзор литературы) включает в себя известные данные о дельтаметрине как объекте химико-токсикологического исследования.

Вторая глава посвящена вопросам идентификации объекта исследования хроматографическими и спектральными методами, а также на основе образования окрашенных продуктов.

В третьей главе приводятся экспериментальные данные по вопросам количественного определения анализируемого вещества.

Четвёртая глава включает в себя результаты изучения особенностей выделения и очистки объекта исследования экстракционными и хроматографическими методами.

В пятой главе рассмотрены вопросы определения дельтаметрина после его изолирования из биологического материала оптимальным изолирующим агентом.

В шестой главе приведены данные, полученные в результате изучения особенностей распределения дельтаметрина в организме теплокровных и сохраняемости в трупном материале.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования явился дельтаметрин ((8)-альфа-циано-3-феноксибензил-(1Я,цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2-диметилциклопро-

панкарбоксилат) (стандарт ФГУП «ВНИИХСЗР», содержание вещества >99%).

Дополнительные объекты исследования: лямбда-цигалотрин (стандарт ФГУП «ВНИИХСЗР», содержание вещества >99 %); эсфенвалерат (стандарт ФГУП «ВНИИХСЗР», содержание вещества >99 %).

Применены методы ТСХ, адсорбционной колоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ, электронной и ИК- спектрофотометрии, хромато-масс-спектрометрии.

Методики количественного определения были разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества Обработка результатов проводилась в соответствии с установленными требованиями с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследована хроматографическая подвижность дельтаметрина в тонких слоях и колонках нормальнофазовых и обращённофазовых сорбентов с использованием подвижных фаз различной полярности.

Для характеристики подвижности анализируемого соединения рассчитаны, в частности, значения абсолютной (Rf) и относительной (Rs) (по отношению к Rf эсфенвалерата) и условного удерживания тонком слое сорбента (В = 1/ Rf) для метода ТСХ, а также значения времени (tR) и объёма удерживания (VR), относительного (по отношению к удерживанию лямбда-цигалотрина) удерживания, коэффициента ёмкости (к), числа теоретических тарелок (N) для ВЭЖХ.

Как свидетельствуют данные таблицы 1, наиболее оптимальные условия хроматографирования дельтаметрина в тонких слоях сорбента с

Таблица 1

Параметры хроматографирования дельтаметрина в присутствии внутреннего стандарта (эсфенвалерат) в тонких слоях сорбентов с использованием оптимальных подвижных фаз___

Подвижные фазы Анализируемые вещества Rf Rs в

Нормальнофазовая хроматография

Гексан-бензол (5:5) Дельтаметрин 0,41 1,11 2,44

Эсфенвалерат 0,37 1,00 2,97

Гексан-толуол (5:5) Дельтаметрин 0,47 1,15 2,13

Эсфенвалерат 0,41 1,00 2,44

Гексан-диоксан Дельтаметрин 0,57 1,14 1,75

пропанол-2 (200:5:1) Эсфенвалерат 0,50 1,00 2,00

Гетпан-диоксан - Дельтаметрин 0,58 1,21 1,72

пропанол-2 (120:8:2) Эсфенвалерат 0,48 1,00 2,08

Обращённофазовая хроматография

Буферный раствор с рН Дельтаметрин 0,44 1,10 2,27

2,1-диоксан (3:7)) Эсфенвалерат 0,40 1,00 2,50

s

шдроксидированной поверхностью (силикагель СГХ-1ВЭ с размером частиц 8-10 мкм на пластинах «Сорбфил» с люминесцентным индикатором) достигаются при использовании ряда элюентов малой и средней полярности :гексан-бензол (5:5), гексан-толуол (5:5), гептан-диоксан-пропанол-2 (120:8:2), а также гексан-диоксан-пропанол-2 (200:5:1). Наиболее целесообразно применение в качестве подвижной фазы системы растворителей гексан-толуол (5:5).

Подвижная фаза гексан-диоксан-пропанол-2 150:5:1 (по объёму), явилась оптимальной для определения объекта исследования методом хроматографии низкого давления в колонках силикагеля L 40/100 ц.

Для варианта обращённофазовой ТСХ на пластинах «Сорбфил» с люминесцентным индикатором, обработанных вазелиновым маслом (модель привитой фазы Си -Cis), наиболее оптимальной подвижной фазой явилась система растворителей буферный раствор с рН 2,1-диоксан (3:7).

Система растворителей 0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объёму) явилась наиболее приемлемой для определения объекта исследования методом обращённофазовой ВЭЖХ в колонках 3,9x150+3,9x20 мм Symmetry С-18 (размер частиц 5ц).

Таблица 2

Параметры хроматографирования дельтаметрина и внутреннего

стандарта методом обращённофазовой ВЭЖХ

Анализируемые соединения tR VR Относительное удерживание к' N

Дельтаметрин 6,115 6115 1,066 3,07 7,445

Лямбда-цигалотрин 5,737 5737 1,000 2,817 4618

Результаты изучения особенностей хроматографической подвижности рассматриваемого соединения указывают на возможность их идентификации методами ТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Открываемый минимум при идентификации дельтаметрина методом ТСХ в сорбентах с гидроксилированной и привитой поверхностями составляет 0,1-0,2 мкг. Открываемый минимум рассматриваемого соединения методом обращённофазовой ВЭЖХ составляет 0,005 мкг в хроматографируемой пробе.

Разработаны методика количественного определения дельтаметрина методом обращённофазовой ВЭЖХ. Результаты представлены в таблице 3.

Как свидетельствуют полученные данные, методика отличается достаточными воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата составляет не более 0,99 % при проведении 6 параллельных определений и доверительной вероятности 0,95.

Изучены особенности светопоглощения рассматриваемого соединения в УФ- области спектра при использовании в качестве

Таблица 3

Результаты количественного определения дельтаметрина хроматографическими и спектральными методами_

Методика анализа Найдено,%

X S S,- Дх е

Обращённофазовая ВЭЖХ 99,98 0,95 0,39 0,99 0,99

Хроматоспектрофотометрия 100,07 0,93 0,38 0,97 0,97

Спектрофотометрия по собственному поглощению в среде ацетонитрила 99,98 0,68 0,28 0,71 0,71

Фотометрия на основе получения аци-нитросолей 99,94 1,15 0,47 1,21 1,21

Экстракционная фотометрия на основе реакции с 2,3,5-ТФТХ 100,03 1,33 0,54 1,40 1,40

растворяющих сред гексана. хлороформа, этилацетата, диоксана, ацетонитрила, метанола и этанола. Рассчитаны отдельные оптические характеристики электронных спектров дельтаметрина в данных средах.

В ИК-спектре анализируемого вещества (таблица 4) среди характеристических полос можно выделить полосы, соответствующие колебаниям С=С и С-Н ароматических колец, метальных групп алифатической части молекулы, карбонильной группы и связи С - О в сложном эфире.

Таблица 4

Характеристика ИК-спектра дельтаметрина

Виды колебаний Максимумы характеристических полос, см"1

Асимметрические -СН3 2967

Валентные С-Н 3049,2925,2873

Колебания карбонильной группы в алифатических (предельных) эфирах 1735

Валентные ароматические С = С 1592,1584,1488, 1460, 1450

Симметрические деформационные - СНз ? 1376

Колебания с участием связи С - О в эфирной группе 1252

Плоскостные деформационные С-Н в ароматическом ядре 1124, 1072,1016

Внеплоскостные деформационные С-Н в ароматическом ядре 885,801,769, 754,700, 690

Показана возможность идентификации дельтаметрина по электронным (УФ-) и ИК-спектрам.

Изучены особенности получения аци-нитросоли продукта нитрования дельтаметрина 10% раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте, а также окрашенного ионного ассоциата нитропроизводного дельтаметрина с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия в водно-щелочной среде, способного экстрагироваться галогенпроизводными низших алканов.

На основе рассмотренных цветных реакций разработаны методики идентификации анализируемого вещества. Открываемый минимум - 0,2-0,3 мкг/мл.

Разработаны методики количественного фотометрического определения дельтаметрина на основе поглощения УФ-излучения в среде ацегонитрила, реакции нитрования дельтаметрина и последующего получения аци-нитропроизводных и реакции с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия после предварительного получения аци-нитропроизводных. Предложена также методика количественного определения рассматриваемого соединения, основанная на сочетании тонкослойной хроматографии и УФ-спектрофотометрии

Как следует из таблицы 3, относительная ошибка среднего результата во всех случаях не превышает ± 1,4% % (0,71-1,40%).

Для очистки исследуемого вещества рассмотрена возможность применения методов жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии.

В частности, исследованы особенности экстрагирования анализируемого соединения из водно-диоксановых растворов гидрофобными органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды, насыщения экстрагентов водой и электролитами.

Установлено отсутствие заметного влияния реакции среды гидрофильной фазы (интервал рН 2-12) на степень извлечения анализируемого вещества гидрофобными экстрагентами.

Показано, что оптимальные условия экстрагирования дельтаметрина могут быть достигнуты в широком диапазоне рН при использовании в качестве экстрагента этилацетата или бутанола в условиях насыщения водно-диоксанового слоя электролитом (хлоридом натрия).

По результатам изучения хроматографической активности дельтаметрина предложены способы его очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала в колонке с силикагеля L 40/100 ц, а также на пластинах «Сорбфил» с люминесцентным индикатором. Потери анализируемого вещества при моделировании очистки путём хроматографирования в колонке или тонком слое сорбента не превысили 1%. В случае моделирования очистки вещества сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии потери составляли не более 2,3%.

В опытах с контрольными образцами биоматериала показана достаточная эффективность очистки извлечений хроматографическими методами и сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и колоночной жидкостной хроматографии низкого давления.

Проведено сравнительное изучение изолирования дельтаметрина из биоматериала изолирующими агентами различной природы. В качестве изолирующих жидкостей рассмотрены гидрофобные (гексан, толуол, хлороформ, этилацетат, диэтиловый эфир) и гидрофильные (ацетонитрил, диоксан-1,4, ацетон, метанол, этанол, ледяная уксусная кислота, ДМФА) органические растворители, а также вода и растворы гидроксида натрия и уксусной кислоты)

Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Зависимость степени извлечения дельтаметрина из ткаии печени от

природы изолирующего агента (двукратное изолирование, соотношение изолирующего агента и биологического материала 2:1 (по массе))_

Изолирующий агент Степень извлечения, % Изолирующий агент Степепь извлечения, %

Диоксан 72,24 ±2,21 гексан 53,56+2,44

Ацетонитрил 57,36±2,42 этилацетат 33,67+1,75

Ацетон 65,13±2,31 толуол 24,73 + 1,53

Метанол 65,92±5,54 вода 0,20±0,01

Этанол 43,79±2,81 0,1н. р-р гидроксида натрия 0,65 ±0,03

Хлороформ 55,04±2,61 уксусная кислота 8 % 0,45+0,03

ДМФА 4,88±0,27

Как свидетельствуют полученные данные, наиболее высокий процент извлечения дельтаметрина достигается диоксаном-1,4.

Исследована зависимость степени извлечения рассматриваемого соединения диоксаном-1,4 от количественного соотношения изолирующего агента и биоматериала, от кратности настаивания и продолжительности каждого отдельного настаивания.

Исследования зависимости степени извлечения дельтаметрина диоксаном-1,4 от объема изолирующего агента и кратности изолирования показали, что для достижения достаточно полного извлечения анализируемого вещества из биологического материала необходимо, по крайней мере, двукратное настаивание при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае должно превышать количество биологического материала как минимум в два раза.

При изучении зависимости степени извлечения дельтаметрина от продолжительности контакта изолирующей жидкости и биоматериала установлено, что максимальные значения степени извлечения анализируемого соединения из ткани трупной печени достигаются уже при настаивании в течение 45 минут.

Установлено, что увеличение содержания дельтаметрина в модельных смесях в достаточно широком интервале концентраций (1,0-50,0 мг) при постоянной массе навески ткани трупной печени (25 г) сопровождается изменением степени извлечения, не превышающим 4,6%.

На основе предварительных исследований разработаны методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных (в том числе гнилостно изменённых) органов, крови и моче на основе изолирования диоксаном-1.4 и последующей очистки извлекаемого вещества методом колоночной хроматографии и сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии.

Количественная оценка результатов определения представлена на рисунке 1.

Печень Гнилостно Кровь Моча

измененная печень

■ Очистка колоночной хроматографией

□ Очистка жидкость-жидкостной экстракцией + колоночной хроматографией

Рис. 1. Результаты определения дельтаметрина в биологическом

материале после изолирования диоксаном (содержание вещества - 25 мг в 25 г биологического объекта)

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании дельтаметрина в количестве 25 мг в 25 г биоматериала разработанные методики, включающие очистку методом адсорбционной колоночной хроматографии, позволяют определить в ткани печени 72.46-72,51%, в гнилостно изменённой печени - 72,27-72,35% исследуемого вещества, а методики, включающие очистку сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и адсорбционной колоночной хроматографии, позволяют определить в ткани печени 69.74-69,82%, в гнилостно изменённой печени -69,48-69,58%, в крови - 77,99-78,04%, в моче - 92.29-92,30 % дельтаметрина.

Значения стандартного отклонения и полуширины доверительного интервала (п=5; Р=0,95) при этом не превышают соответственно 1,81% и 2,50% (исследование ткани печени), 1.98% и 2,46% (исследование гнилостно

изменённой печени), 1,82% и 2,26% (исследование крови). 1,44% и 1,79% (исследование мочи).

Определяемый минимум дельтаметрина в биологических объектах при использовании очистки методом колоночной хроматографии составляет 0.4 мг в 100 г трупного органа, 0,6 мг в 100 г ткани трупной печени, подвергшейся гнилостным изменениям. 0,3 мг в 100 г крови, 0,08 мг в 100 г мочи, при использовании очистки сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии - соответственно 0,2, 0,3, 0,15 и 0,04 мг в 100 г биологического материала. Методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью.

Изучены особенности распределения дельтаметрина в организме теплокровных животных (крысы). Экспериментальным животным внутрижелудочно вводили приблизительно трёхкратную LDso дельтаметрина (130 мг на 1 кг массы животного) в виде раствора в рафинированном подсолнечном масле. После гибели животных их трупы вскрывали и исследовали кровь и внутренние органы и на наличие в них рассматриваемого соединения.

Результаты изучения распределения представлены на рисунке 2.

■ Почки

□ Сердце ЕЭ Кровь

□ Желудок с содержимым 0 Селезенка

Ш Печень ■ Легкие

НТонкий кишечник с содержимым ИМышцы

Рис. 2. Распределение дельтаметрина в организме теплокровных (крысы), в % к найденному в 100 г органов

Как свидетельствуют результаты проведённых исследований, рассматриваемое вещество может быть обнаружено с помощью разработанной методики как в органах так и в крови отравленных животных.

It

Наибольшие количества дельтаметрина обнаруживается в желудке и печени. Значительные количества исследуемого вещества присутствует также в тонком кишечнике, мышцах и селезёнке. В меньшей степени отравляющее вещество обнаруживается в крови, почках, сердце и лёгких подопытных животных.

Исследованы особенности сохранения дельтаметрина в трупном материале (искусственных смесях с тканью трупной печени) при температурах от 0 до 36°С. Результаты представлены на рисунке 3.

О 10 20 30 40 50 60 70 80

Рис. 3. Результаты изучения сохраняемости дельтаметрина в трупном материале

t, сутки

Как свидетельствуют полученные данные, в предлагаемых условиях дельтаметрин сохраняется в трупном материале в течение 30-75 суток.

По результатам проведенных исследований предложено 2 варианта общей схемы исследования биологического материала при отравлении дельтам етрином.

Предлагаемые схемы, представленные на рисунках 4 и 5, позволяют изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определить исследуемое отравляющее вещество.

Рис. 4. Общая схема исследования биологического материала при

отравлении дельтаметрином на основе изолирования диоксаном и очистки методом колоночной хроматографии

Рис. 5. Общая схема исследования биологического материала при

отравлении дельтаметрином на основе изолирования диоксаном и очистки сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Исследованы хроматографические свойства дельтаметрина в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями с использованием подвижных фаз различной полярности. Рассчитаны отдельные параметры, характеризующие процесс хроматографирования рассматриваемого соединения.

Установлено, что оптимальные условия определения дельтатметрина методом нормальнофазовой ТСХ (пластины «Сорбфил» с люминесцентным индикатором) достигаются при использовании подвижных фаз гексан-толуол (5:5), гексан-бензол (5:5), гексан-пропанол-2 (20:1), гексан-диоксан-пропанол-2 (160:5:1), методом обращённофазовой ТСХ (пластины «Сорбфил» с люминесцентным индикатором, обработанные вазелиновым маслом (модель привитой фазы С14-С15), - при использовании подвижных фаз буферный раствор с рН 2,1-диоксан (3:7), буферный раствор с рН 9,3-диоксан (3:7) и вода-ацетон (2:8).

Показано, что для определения дельтаметрина методом ВЭЖХ в колонке обращёниофазового сорбента («Nova Pack С-18») в качестве подвижной фазы целесообразно использовать систему растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1).

Разработаны методика количественного определения дельтаметрина методом ВЭЖХ с применением обращённофазного варианта хроматографирования. Относительная ошибка среднего результата (п=6; Р=0,95) не превышает 1%.

2. Проведено изучение особенностей определения дельтаметрина методом газо-жидкостной капиллярной хроматографии при использовании колонки DB-1MS (J&S Scientific, США) с неподвижной жидкой фазой диметилполисилоксан (длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм) и масс-селективного детектора, работающего в режиме электронного удара (70 эВ).

Показана возможность применения хромато-масс-спектрометрии для идентификации рассматриваемого соединения в субстанции по сочетанию времени удерживания вещества в колонке и набору характеристических полос в масс-спектре, соответствующих осколкам с массами 41, 51, 65, 77, 115, 152, 181, 208, 253, 277, 297, 317, 344, 397, 423, 505 , основным из которых является осколок с массой 181.

3. Изучены особенности поглощения дельтаметрином электромагнитного излучения в УФ- и ИК-области спектра. Показана возможность идентификации анализируемого вещества методами электронной и колебательной спектрофотометрии.

На основе способности дельтаметрина поглощать УФ- излучение в среде ацетонитрила разработана методика количественного определения рассматриваемого соединения спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата не превышает 1%.

4. Изучена возможность и определены оптимальные условия получения окрашенных соединений в реакции нитрования дельтаметрина с

последующим переводом нитропроизводных в аци-иитросоли, а также в реакции получения ионных ассоциатов нитропроизводных дельтаметрина с 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом.

На основе предложенных цветных реакций разработаны методики идентификации и количественного определения объекта исследования фотометрическим методом. Методики характеризуются достаточно высокой чувствительностью (открываемый минимум 0,2 - 0,3 мкг в 1 мл реакционного раствора), воспроизводимостью и правильностью.

Относительная ошибка среднего результата (п=6; Р=0,95) не превышает

1,4%.

5. Исследованы особенности экстракции анализируемого соединения из водно-диоксановых растворов органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды, насыщения водного слоя электролитами.

Показано, что степень извлечения дельтаметрина рассматриваемым рядом растворителей практически не зависит от рН водосодержащей фазы.

Оптимальные условия извлечения дельтаметрина из водных растворов достигаются при использовании в качестве экстрагента этилацетата как без насыщения водной фазы хлоридом натрия так и при использовании эффекта высаливания в широком диапазоне значений рН (212) водосодержащего слоя.

6. Изучены особенности препаративного хроматографирования дельтаметрина в колонке силикагеля L 40/100 ц при использовании подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1).

Для данных условий определены отдельные параметры хроматографирования рассматриваемого вещества.

Дана оценка потерь анализируемого соединения в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов.

Показана достаточная эффективность предлагаемых схем экстракционной и хроматографической очистки рассматриваемого вещества от соэкстрактивных веществ биологического материала.

7. Проведено сравнительное изолирование исследуемого вещества из биологического материала различными изолирующими агентами в режиме настаивания.

Установлено, что наиболее высокую степень извлечения дельтаметрина удается достичь при использовании в качестве изолирующего агента диоксана. Оптимальные условия изолирования дельтаметрина диоксаном могут быть достигнуты при проведении по крайней мере двукратного настаивания с массой изолирующего агента, которая как минимум в два раза численно превышает массу исследуемого биоматериала, и продолжительности каждого настаивания не менее 45 минут.

Разработаны методики определения дельтаметрина в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования диоксаном и последующей очистки методом колоночной хроматографии низкого давления и сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии.

8. При содержании дельтаметрина в количестве 25 мг в 25 г биоматериала методики, основанные на изолировании диоксаном и очиске методом колоночной хроматографии позволяют определять в ткани печени 72,46-72,51%, в гнилостно изменённой печени - 72,27-72,35% исследуемого соединения, а методики, основанные на изолировании диоксаном и очистке сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии позволяют определять в ткани печени 69,74-69,82%, в гнилостно изменённой печени - 69,48-69,58%, в крови - 77,99-78,04%, в моче - 92.29-92,30 % дельтаметрина. Значения полуширины доверительного интервала (п=5; Р=0,95) при этом не превышают соответственно 1,81% и 2,50% (исследование ткани печени), 1,98% и 2,46% (исследование гнилостно изменённой печени), 1,82 % и 2,26 % (исследование крови), 1,44 % и 1,79 % (исследование мочи).

Определяемый минимум дельтаметрина в биологических объектах при использовании очистки методом колоночной хроматографии составляет 0,4 мг в 100 г трупного органа, 0,6 мг в 100 г ткани трупной печени, подвергшейся гнилостным изменениям, 0,3 мг в 100 г крови, 0,08 мг в 100 г мочи, при использовании очистки сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии - соответственно 0,2, 0,3, 0,15 и 0,04 мг в 100 г биологического материала.

9. Изучены особенности распределения дельтаметрина в организме теплокровных животных (крысы) при внутрижелудочном введении трёхкратной LD50 отравляющего вещества.

Установлено, что наибольшее содержание рассматриваемого соединения отмечается в желудке и печени. Значительные его количества присутствуют также в тонком кишечнике, мышцах и селезёнке животных, погибших от отравления.

10. На примере модельных смесей с тканью печени исследована сохраняемость дельтаметрина в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Показано, что при температурах от 0 до 36°С дельтаметрин сохраняется в трупном материале в течение 30-75 суток.

11. По результатам проведенных исследований предложено 2 варианта общей схемы исследования биологического материала при отравлении дельтам етрином.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белоусова, О.В. Определение дельтаметрина в биологическом материале методом колебательной спектрофотометрии / О.В. Белоусова, Е.Н.Чигарёва, В.К.Шорманов // Биотехнология и био медицинская инженерия. Материалы III Межд. Всероссийской науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курского государственного медицинского университета. - Курск, 2010. - С. 262-265.

2. Белоусова, О.В. Определение дельтаметрина при судебно-химическом исследовании биологического материала / О.В.Бело) сова,

B.К.Шорманов, Е.Н.Чигарёва, Е.Н.Владимиренко // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2011. - № 1. - С. 146-152.

3. Белоусова, О.В. Особенности выделения и очистки дециса при судебно-химическом исследовании биологического материала / О.В. Белоусова, В.К.Шорманов, Е.Н.Чигарёва // IV Международная конференция «Экстракция органических соединений») ЭОС-2010. (Воронеж, 20-24 сентября 2010). - Воронеж, 2010. - С. 304.

4. Белоусова, О.В. Применение колебательной спектрофотометрии для определения дельтаметрина при исследовании биологического материала / ОВ.Белоусова, В.КЛИорманов, Е.Н.Чигарёва, Е.Н.Владимиренко // Биотехнология, биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик: сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф. - Курск, 2009. -

C. 104-106.

5. Пат. Российская Федерация № 2413225, МПК7 С 1 G01N30/02; B01J20/283; G01N31/00 / Способ определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина в биологическом материале / Шорманов В.К., Е.Н.Чигарёва, О.В .Белоусова; заявители и патентообладатели: В.К.Шорманов, Е.Н.Чигарёва, О.В.Белоусова. - № 2009140119; Заяв. 29.10.2009; Опуб. 27.02.2011 // Изобретения (Заявки и патенты). - 2011. - № 6. - 9 с.

6. Чигарёва, Е.Н. Особенности определения дельтаметрина в биологических жидкостях / Е.Н.Чигарёва, В.К.Шорманов, О.В.Белоусова // Фармация. - 2010. - Т. 59, № 8. - С. 19-22.

7. Шорманов, В.К. Экстракция альфа-циперметрина из водно-метанольных растворов / В.К.Шорманов, Е.Н.Чигарёва, О.В.Белоусова // Судебно-медицинская экспертиза. - 2010. - Т. 53, № 3. - С. 36-38.

8. Шорманов, В.К. Экстракция лямбда-цигалотрина из водно-диоксановых растворов / В.К.Шорманов, Е.Н.Чигарёва, О.В.Белоусова // Судебно-медицинская экспертиза. - 2011. - Т. 54, № 2. - С. 46-48.

Сдано в набор 16.05.2011 г. Подписано в печать 16.05.2011 г. Формат 60x84 '/16. Бумага «Снегурочка». Гарнитура Times New Roman Cyr. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1123.

Отпечатано: ПБОЮЛ Киселева О.В. ОГРН304463202600213

Актуальность темы. Дельтаметрин (Б-альфа-циано-З -фенокси-бензил-( 111,цис)-3 -(2,2-дибромвинил)-2,2-диметилциклопропанкарбоксилат) (синонимы: бутокс, бутофлин, декаметрин, децис, К-Обиоль) широко применяется в сельском хозяйстве, медицинской и ветеринарной практике в основном в качестве инсектицида.

Данное вещество обладает значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. ЛД50 для крыс чистого вещества составляет 128-139 мг/кг (пероральное введение с кунжутным маслом), по другим данным 31-52 мг/кг (пероральное введение с арахисовым маслом), концентрата эмульсии-535 мг/кг (пероральное введение). Описаны многочисленные случаи отравления дельтаметрином, в том числе с летальным исходом.

Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществом в процессе его производства, хранения и применения, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, а также при суицидальных попытках.

Широкое применение дельтаметрина, его высокая токсичность, наличие случаев летального отравления обусловливает необходимость изучения этого соединения в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования этого соединения из объектов биологического происхождения, его обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе практически отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемого вещества в биологическом (трупном) материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики судебно-химического исследования дельтаметрина является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики судебно-химического исследования дельтаметрина (8-альфа-циано-3-феноксибензил-(1Я., цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2-диметил-циклопропанкарбоксилата). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить характер хроматографической активности исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в случае использования жидких подвижных фаз.

2. Исследовать хроматографическое поведение дельтаметрина в капиллярных колонках при использовании газообразных подвижных фаз с последующим масс-селективным детектированием.

3. Изучить особенности электронных и колебательных спектров дельтаметрина.

4. Изучить особенности образования окрашенных продуктов в реакциях рассматриваемого соединения с рядом цветореагентов. Определить возможность применения данных цветных реакций в условиях анализа биологического материала.

5. Изучить особенности изолирования объекта исследования различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.

6. Исследовать распределение дельтаметрина в органах и биологических жидкостях теплокровных животных.

7. Определить сроки сохранения рассматриваемого вещества в разлагающемся трупном материале.

Научная новизна исследования. Изучены отдельные закономерности хроматографического поведения дельтаметрина в сорбентах с гидроксилированной и привитой . поверхностями при использовании различных подвижных фаз; определены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов.

На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения > дельтаметрина методами ТСХ, ВЭЖХ и хроматоспектрофотометрии.

Изучены особенности масс-спектра дельтаметрина, получаемого методом электронного удара, и показана возможность идентификации рассматриваемого соединения по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания в капиллярной колонке при хроматографировании методом ГЖХ.

Исследованы особенности электронных и колебательных спектров поглощения дельтаметрина. Для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.

Показана возможность образования окрашенных продуктов при взаимодействии дельтаметрина с рядом цветореагентов. На основе предложенных хромогенных реакций разработаны методики идентификации и количествеооного определения исследуемого вещества.

Впервые для изолирования дельтаметрина из биологического материала обосновано использование в качестве изолирующего агента диоксана. На основе применения в качестве изолирующего агента данного растворителя и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях или колонках нормальнофазовых сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого соединения в ткани трупных органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно измененного трупного материала.

С использованием вновь разработанных методик в опытах на животных (крысы) исследованы особенности распределения дельтаметрина в организме теплокровных.

Определены сроки сохранения рассматриваемого отравляющего вещества в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведённых исследований разработана методика изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения дельтаметрина.

Внедрение результатов работы: - методика изолирования дельтаметрина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 7 апреля 2010 года, кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 5 октября 2009 года и кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии с 9 сентября 2009 года);

- методика изолирования дельтаметрина из крови и определения методами ТСХ и ВЭЖХ (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической, . токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 5 октября 2009 года и кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии с 25 сентября 2009 года);

- методика идентификации дельтаметрина методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную и научную работу кафедры биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 11 ноября 2009 года);

- методика очистки дельтаметрина методами жидкость-жидкостной экстракции и адсорбционной колоночной хроматографии (внедрена в учебную и научную работу кафедры биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 19 ноября 2009 года); методика идентификации и количественного определения дельтаметрина по реакции получения аци-нитропроизводных (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии с 25 сентября 2009 года).

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета N 36 РАМН. Номер государственной регистрации 01.2.01051088.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследования хроматографической активности дельтаметрина в тонких слоях и колонках сорбентов при использовании жидких подвижных фаз; результаты исследования хроматографической активности рассматриваемого соединения в капиллярных колонках при использовании газообразных подвижных фаз с последующим масс-селективным детектированием;

- особенности поглощения электромагнитного излучения анализируемого вещества в УФ- и ИК- областях спектра;

-условия взаимодействия дельтаметрина с рядом цветореагентов;

- методики идентификации и количественного определения объекта исследования хроматографическими и фотометрическими методами;

- результаты исследования особенностей' очистки дельтаметрина методом жидкость-жидкостной экстракции, а также в тонких слоях и колонках сорбентов;

- методики изолирования объекта исследования из биологического материала и очистки от соэкстрактивных веществ;

- особенности распределения дельтаметрина в организме теплокровных животных;

- сохраняемость дельтаметрина в трупном материале. Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на 74 научной конференции КГМУ, сессии ЦентральноЧернозёмного научного центра РАМН и отделения РАЕН (Курск, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология, биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик» (Курск, 2009), на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия», посвящённой 75-летию Курского государственного медицинского университета (Курск-2010), на. IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» ЭОС-2010 (Воронеж, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 169 страницах машинописного текста, содержат 10 рисунков, 18 таблиц. Список цитируемой литературы включает 132 источника, из которых

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Исследованы хроматографические свойства дельтаметрина в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями с использованием подвижных фаз различной полярности. Рассчитаны отдельные параметры, характеризующие процесс хроматографирования рассматриваемого соединения.

Установлено, что оптимальные условия определения дельтатметрина методом нормальнофазовой ТСХ (пластины «Сорбфил» с люминесцентным индикатором), достигаются при использовании подвижных фаз гексан-толуол (5:5), гексан-бензол (5:5), гексан-пропанол-2 (20:1), гексан-диоксан-пропанол-2 (160:5:1), методом обращённофазовой ТСХ (пластины «Сорбфил» с люминесцентным индикатором, обработанные вазелиновым маслом (модель привитой фазы С14-С15)) - при использовании подвижных фаз буферный раствор с рН 2,1-диоксан (3:7), буферный раствор с рН 9,3-диоксан (3:7) и вода-ацетон (2:8).

Показано, что для определения дельтаметрина методом ВЭЖХ в колонке обращённофазового сорбента («Nova Pack С-18») в качестве подвижной фазы целесообразно использовать систему растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1).

Разработаны методика количественного определения дельтаметрина методом ВЭЖХ с применением обращённофазного варианта хроматографирования. Относительная ошибка среднего результата (п=6; Р=0,95) не превышает 1 %.

2. Проведено изучение особенностей определения дельтаметрина методом газо-жидкостной капиллярной хроматографии при использовании колонки DB-1MS (J&S Scientific, США) с неподвижной жидкой фазой диметилполисилоксан (длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм ) и масс-селективного детектира, работающего в режиме электронного удара (70 эВ).

Показана возможность применения хромато-масс-спектрометрии для идентификации рассматриваемого соединения в субстанции по сочетанию времени удерживания вещества в колонке и набору характеристических полос в масс-спектре, соответствующих осколкам с массами 41, 51, 65, 77, 115, 152, 181, 208, 253, 277, 297, 317, 344, 397, 423, 505 , основным из которых является осколок с массой 181.

3. Изучены особенности поглощения дельтаметрином электромагнитного излучения в УФ- и ИК-области спектра. Показана возможность идентификации анализируемого вещества методами электронной и колебательной спектрофотометрии.

На основе способности дельтаметрина поглощать УФ- излучение в среде ацетонитрила разработана методика количественного определения рассматриваемого соединения спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата не превышает 1 %.

4. Изучена возможность и определены оптимальные условия получения окрашенных соединений в реакции нитрования дельтаметрина с последующим переводом нитропроизводных в аци-нитросоли, а также в реакции получения ионных ассоциатов нитропроизводных дельтаметрина с 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом.

На основе предложенных цветных реакций разработаны методики идентификации и количественного определения объекта исследования фотометрическим методом. Методики характеризуются достаточно высокой чувствительностью (открываемый минимум 0,2 - 0,3 мкг в 1 мл реакционного раствора), воспроизводимостью и правильностью.

Относительная ошибка среднего результата (п=6; Р=0,95) не превышает 1,4%.

5. Исследованы особенности экстракции анализируемого соединения из водно-диоксановых растворов органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды, насыщения водного слоя электролитами.

Показано, что степень извлечения дельтаметрина рассматриваемым рядом растворителей практически не зависит от рН водосодержащей фазы.

Оптимальные условия извлечения дельтаметрина из водных растворов достигаются при использовании в качестве экстрагента этилацетата как без насыщения водной фазы хлоридом натрия так и при использовании эффекта высаливания в широком диапазоне значений рН (2-12) водосодержащего слоя.

6. Изучены особенности препаративного хроматографирования дельтаметрина в колонке с силикагеля Ь 40/100 [I при использовании подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1).

Для данных условий определены отдельные параметры хроматографирования рассматриваемого вещества.

Дана оценка потерь анализируемого соединения в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов.

Показана достаточная эффективность предлагаемых схем экстракционной и хроматографической очистки рассматриваемого вещества от соэкстрактивных веществ биологического материала.

7. Проведено сравнительное изолирование исследуемого вещества из биологического материала различными изолирующими агентами в режиме настаивания.

Установлено, что наиболее высокую степень извлечения дельтаметрина удается достичь при использовании в качестве изолирующего агента диоксана. Оптимальные условия изолирования дельтаметрина диоксаном могут быть достигнуты при проведении по крайней мере двукратного настаивания с массой изолирующего агента, которая как минимум в два раза численно превышает массу исследуемого биоматериала, и. продолжительности каждого настаивания не менее 45 минут.

Разработаны методики определения дельтаметрина в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования диоксаном и последующей очистки методом колоночной хроматографии низкого давления и сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии.

8. При содержании дельтаметрина в количестве 25 мг в 25 г биоматериала методики, основанные на изолировании диоксаном и очиске методом колоночной хроматографии позволяют определять в ткани печени 72,46-72,51 %, в гнилостно изменённой печени - 72,27-72,35 исследуемого соединения, а методики, основанные на изолировании диоксаном и очистке сочетанием жидкость-жидкостной экстракции, и колоночной хроматографии позволяют определять в ткани печени 69,7469,82 %, в гнилостно изменённой печени - 69,48-69,58 %, в крови - 77,9978,04 %, в моче - 92.29-92,30 %. Значения полуширины доверительного интервала (п=5; Р=0,95) при этом не превышают соответственно 1,81% и 2,50 % (исследование ткани печени), 1,98 % и 2,46 % (исследование гнилостно изменённой печени), 1,82 % и 2,26 % (исследование крови), 1,44 % и 1,79 % (исследование мочи)

Определяемый минимум дельтаметрина в биологических объектах при использовании очистки методом колоночной хроматографии составляет 0,4 мг в 100 г трупного органа, 0,6 мг в 100 г ткани трупной печени, подвергшейся гнилостным изменениям, 0,3 мг в 100 г крови, 0,08 мг в 100 г мочи, при использовании очистки сочетанием жидкостьжидкостной экстракции и колоночной хроматографии - соответственно 0,2, 0,3, 0,15 и 0,04 мг в 100 г биологического материала.

9. Изучены особенности распределения дельтаметрина в организме теплокровных животных (крысы) при внутрижелудочном введении трёхкратной 1Л)5о отравляющего вещества.

Установлено, что наибольшее содержание рассматриваемого соединения отмечается в желудке и печени. Значительные его количества присутствуют также в тонком кишечнике, мышцах и селезёнке животных, погибших от отравления.

10. На примере модельных смесей с тканью печени исследована сохраняемость дельтаметрина в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Показано, что при температурах от 0 до 36°С дельтаметрин сохраняется в трупном материале в течение 30-75 суток.

11. По результатам проведенных исследований предложено 2 варианта общей схемы исследования биологического материала при отравлении дельтаметрином.

Заключение

Представленный обзор научной литературы по различным направлениям рассматриваемой проблемы позволяет заключить, что многие аспекты изолирования дельтаметрина из объектов биологического происхождения, его очистки от эндогенных веществ биологических тканей, обнаружения, идентификации и количественного анализа рассматриваемого вещества разработаны недостаточно. Недостаточно изучены вопросы распределения дельтаметрина в органах и биожидкостях теплокровных организмов, а также особенности его сохранения в разлагающемся трупном материале.

В связи с этим было проведено химико-токсикологическое исследование дельтаметрина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, ПРИБОРЫ, РЕАКТИВЫ, МАТЕРИАЛЫ, ПОСУДА

Основной объект исследования:

Дельтаметрин ((8)-альфа-циано-3-феноксибен-зил-(111,цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2-диметилциклопропанкарбоксилат) (стандарт ФГУП «ВНИИХСЗР», содержание вещества >99%).

Дополнительные объекты исследования:

Лямбда-цигалотрин (стандарт ФГУП «ВНИИХСЗР», содержание вещества >99 %); эсфенвалерат (стандарт ФГУП «ВНИИХСЗР», содержание вещества >99 %).

Приборы: жидкостный хроматограф «Alliance» фирмы «Waters» (США) модели 2695 с диодно-матричным детектором (модель 2996);

ИК-спектрофотометр JMPAKT 400d фирмы «Nicolet» (США) с детектором DTOS КВг; спектрофотометр СФ-46 (производственное объединение «ЛОМО», город Ленинград); газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6890N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N (Agilent Technologies); потенциометр ЭВ-74; ультрафиолетовый облучатель Л-8 0 или другой модели; водяная баня; вакуумный испаритель; электроплитка; термостат ТС-80М-2.

Реактивы: ацетон о.с.ч. ТУ 6-09-3513-86; ацетонитрил ч. ТУ 6-09-8534-87; бензол ч.д.а ГОСТ 5955-75; борная кислота х.ч. ГОСТ 9656-75; бутанол, ч.д.а.; ГОСТ 6006-78; гексан ч. д. а. ТУ 261-003-05807999-98; гептан, ч.д.а. ГОСТ 5.395-70; гидроксид натрия х.ч. ГОСТ 4328-77; гидроксид калия; х.ч. ГОСТ 24363-80; дигидрофосфат калия ч.д.а. 4198-75; N. 14-диметилформамид (ДМФА) ч. ГОСТ 20289; 1,4-диоксан ч.д.а. ГОСТ 10455-80; дихлорэтан-1,2 х.ч. Т. У 6-09-2661-78; диэтиловый эфир ОСТ 82-2006-88; метанол, ч.д.а. ГОСТ 6995-77; натрия хлорид, ч.д.а.; нитрат калия ч.д.а. ГОСТ 4217-77; пропанол-2 х.ч. ТУ -09-402-87; серная кислота х.ч. ГОСТ 4204-77; сульфат натрия безводный х.ч. ГОСТ 4166-76; тетрахлорметан ч.д.а. ГОСТ 20288-74; толуол ч.д.а. ГОСТ 5789-78; уксусная кислота х.ч. ГОСТ 61-75; фосфорная кислота ч.д.а. ГОСТ 6552-80; хлорид 2,3,5-трифенилтетразолия ч.д.а. ТУ 6-09-07-1646-87; хлороводородная кислота х.ч. ГОСТ 3118-77; хлороформ ч.д.а. ТУ 2631-020-1129058-96; этанол 95%; этилацетат х.ч. ГОСТ 22300-76.

Материалы: гелий ос. ч.; бумага индикаторная универсальная («Lachema», Чехия) ПНД 50975-84; предколонка (3,9x20 мм) и хроматографическая колонка (3,9x150 мм) для жидкостного хроматографа с сорбентом Symmetry С-18 (размер частиц 5 ц); колонки капиллярные газо-хроматографические DB-1MS (J&S Scientific, США) с неподвижной жидкой фазой диметилполисилоксан (длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм ) для хромато-масс-спектрометра; пластины «Сорбфил» с люминесцентным индикатором UV-254 и алюминиевой подложкой; силикагель L 40/100 ц (фирма «Chemapol» Чехия); фильтры бумажные.

Посуда: бюретки стеклянные, градуированные на 25 мм; воронки делительные вместимостью 25,100и500 мл; камеры хроматографические цилиндрические, стеклянные, с внутренним объёмом около 600 см3; колбы конические вместимостью 250 мл; колбы мерные вместимостью 25 и 50 мл; кюветы спектрофотометрические кварцевые прямоугольные с длиной оптического пути 10 мм; стаканы химические стеклянные вместимостью 50, 100 и 250 мл; пипетки, градуированные на 0,2; 1; 2; 5 и 10 мл; пробирки стеклянные вместимостью 20 мл; пробирки центрифужные стеклянные, градуированные на 10 мл; фильтры стеклянные диаметром 4 см; цилиндры мерные стеклянные, градуированные на 10, 50 и 100 мл; чашки выпарительные фарфоровые вместимостью 50, 100 и 250 мл.

Методы исследования

Были использованы методы хроматографии в тонких слоях сорбентов, жидкостной колоночной хроматографии низкого давления, электронной и ИК-спектрофотометрии, хромато-масс-спектрометрии.

Статистическая обработка данных

Методики количественного определения были разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Обработка результатов проводилась в соответствии с установленными требованиями и с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel».

Глава 2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДЕЛЬТАМЕТРИНА

2.1. Идентификация хроматографическими методами

Значение различных видов колоночной и тонкослойной хроматографии в практике судебно-химического анализа обусловлено их широким применением для очистки, концентрирования, идентификации и количественного определения отравляющих веществ в процессе исследования извлечений из биологического (трупного) материала.

Нами рассмотрена возможность применения методов ТСХ и ВЭЖХ для идентификации дельтаметрина.

2.1.1. Идентификация в тонких слоях нормальнофазного сорбента

Вначале исследовались особенности хроматографического поведения дельтаметрина в тонком слое сорбента с гидроксилированной поверхностью.

Процесс хроматографирования осуществляли в тонком слое силикагеля СТХ-1ВЭ с размером частиц 8-10 мкм (пластины «Сорбфил» с люминесцентным индикатором ЦУ-254 и алюминиевой подложкой). Анализируемое вещество (2-4 мкг) наносили на линию старта хроматографических пластин в виде 0,04% раствора в этаноле. В качестве подвижных фаз для нормальнофазного варианта хроматографирования рассмотрены отдельные органические растворители различной полярности, а так же их двух- и трехкомпонентные комбинации.

В экспериментах использовали стеклянные хроматографические камеры с внутренним объёмом около 600 см . Камеры предварительно насыщали парами подвижной фазы в течение 30 минут. Хроматографировали восходящим методом. Хроматограммы проявляли путём облучения УФ-светом. Анализируемое вещество проявлялось при этом на хроматограммах в виде тёмного пятна на более светлом общем фоне пластины.

Для оценки поведения исследуемых структур при хроматографировании рассчитывались значения величин коэффициента абсолютной хроматографической подвижности: относительной (по отношению к подвижности внутреннего стандарта- суми-альфа) Иб и условного удерживания в тонком слое сорбента В.

ИГ- величина, которая представляет собой отношение средних скоростей перемещения вещества и фронта подвижной фазы за время получения хроматограммы.

Из - отношение значений средних скоростей перемещения анализируемого вещества и вещества-внутреннего стандарта за время получения хроматограммы.

В - условное удерживание в тонком слое сорбента, рассчитанное по формуле: В = 1/1У.

Результаты хроматографирования дельтаметрина в тонких слоях нормальнофазового сорбента при использовании различных подвижных фаз представлены в таблице 1.