Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Характеристика системы мононуклеарных фагоцитов при холодовом стрессе и применение дрожжевых гликанов

3 п 1 ! 4

шаядагл» здравоохра^пш rocciílickoK йжерадок ijc3^-.;;i:n'c;ci,¡ ордй^ тр^дасго красного kiamekh :,;fj5¡mn:ck;/i плотитут

ХУ^ЛгСГ^РСТПКЛ CIICVKl.Ii Ш10НШ2АИШ ФАГОЦИТОВ ПРИ

лаюдгшом ctpjjccp ц додавдп дрс^шл. шзшюз

I4.00.IC - патологическая физиология

Л В Т О Г Е Ф ü Р Л Т

диссертации tía соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

I'PAÜIJJIuIJ} vcu»£0e:-: 'J-ркгпбаэшч

УДК GI2.112.3:512.112.95

Новосибирск, 1992

Работа выполнена в лаборатории клеточной физиологии и биохимии Института физиологии СО РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Т.А.Короленко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В.И.Феденков

каццидат медицинских наук, ст.н.с. Я.Ш.Шварц

Ведущая организация: НИИ фармакологии ТНЦ РАШ,г.Томск

Защита состоится "_"_199 г. на заседании специализированного совета К 084.52.03 при Новосибирском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте (630091, Новосибирск, Красный проспект, 52).

с' диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского ордена Трудового Красного Знамени медицинского института.

Автореферат разослан "_"_199 г.

Ученый секретарь специализированного совета каццидат медицинских наук

В.И.Шарапов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение механизмов, повышающих неспецифическую резистентность организма к экстремальным факторам, остается актуальной проблемой, так как любое неблагоприятное воздействие (холод, гипоксия, перегревание, интенсивная физическая нагрузка и др.) может привести к подавлению защитных функций организма. Холод является одним из агрессивных факторов среды, поскольку может оказывать неблагоприятное влияние на жизненно важные процессы организма (Хаскин Б.В.,1975;Тимо-феез H.H.,1983; Панин Л.Е.,1990; Якименко М.А.,1990).

Резистентность организма к экстремальным воздействиям определяется функционированием системы мононуклеариых фагоцитов (СШ). Значительная роль при этом принадлежит периферическому звену С!®, представленному тканевыми макрофагами печени, легких и других органов, которые участвуют в очистке кровотока от инфекционных возбудителей, а также продуктов распада собственных тканей и тем самым обеспечивают постоянство внутренней среды (Uhing, Adama ,1989; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989).

Показано, что при стимуляции СШ, удается существенно повысить устойчивость организма к неблагоприятным воздействиям (Altura, Saba ,1983; Di Luzio ,1985; Domer ,1989; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Повышение резистентности к стрессу, после предварительной стимуляции С® полисахаридами дрожжевого и бактериального происхождения связано не только с активацией поглотительной и переваривающей функции макрофагов, но и секрецией макрофагами простагландинов, усиливающих микроциркуляцию (Decker ,1990), факторов, стимулирущих гранулоци-то- и эритропоэз, синтез фибронектина, компонентов комплемента, а такне факторов естественной резистентности таких как интерлейкин-1, интерферон (Nathan ,1987).

Воздействие низкой температуры сопровождается значительной депрессией поглотительной способности клеток печени (Тни-мов М.Х. и др.,1985), активацией свободно-радикальных процес- :

сов (Семенкж A.B. л др.,1983), и существенными изменениями ультраструктуры клеток печени (Непомнящих Г.И. и др. ,1987).

1 j

\ í

которые ведут к резкому сникенига устойчивости организма к холоду.

Б связи с этим представляло интерес изучение роли модификации СШ дрожжевыми полисахаридами в повышении устойчивости организма к острому холодовоцу воздействию.

Цель исследования. Изучить эффективность стимуляции систем ыононуклеарных фагоцитов новыми дрожжевыми полисахаридами при фармакологически или стрессорно обусловленной депрессии Я®.

Задачи исследование.

1. Исследовать поглотительную функцию клеток (Ж на модели острого холодового стресса у швей.

2. Выявить эффективность стимуляции СМЗ различными ло химической структуре дрокЕевыма полисахаридами (родэксман, крие-лан, -1,3-карбоксиметилглкшан) в зависимости от путей их введения и дозы интактным крысам и мыиам.

3. Исследовать эффективность стимуляции криеланом поглотительной функции С® при остром холодовом воздействии н введении хлористого гадолиния.

4• Исследовать активность лизосомальных ферментов л ультраструктурные изменения ткани печени при остром холодовом стрессе и предварительной стимуляции С® криеланом.

5. Исследовать активность лизосомальных ферментов и ультраструктурные изменения ткани печени при депрессии СШ> хлористым гадолинием и предварительной стимуляции криеланом.

Натчно-гграктнческая значимость. Обнаружена депрессия поглотительной способности макрофагов печени мывей после острого холодового воздействия. При предварительной стимуляции И® криеланом установлено протективное действие этого препарата, ■связанное с восстановлением поглотительной активности макрофагов и предупрездением ультраструктурных нарушений клеток печени, которые возникают в связи с эффектами острого переохлавде-■ния. Пройдя дополнительные экспериментальные и клинические испытания, криелан может быть рекомендован в качестве основы для создания црепаратов, повышающих общую неспецифическую резистентность организма при остром холодовом воздействии.

Нрвиз'на результатов. Впервые для предупреждения последствий острого холодового воздействия применен новый отвечествен-ный низхотоксичный стимулятор Ш5 - .дрожжевой гетерополисахарщ. криелан. Выявлено, что предварительная стимуляция системы мо-но'нуклеарных фагоцитов криеланом предупреждает

Холодову» дяцресспга фагоцитоза и существенно предотвращает ультраотруктурнне нарушения в клетках печена, вызванные острш воздействием холода. Однократное введение животным криелана в дозе 5 №/'100 г массы тела активирует поглотительную способность клэток печени, при этом наиболее выраженный эффект наблюдается при внутривенном способе введения по сравнению с внутрибращннкм способом введения. Установлено, что стимуляция СГ® сопровождается не только повышеЯШГфагоцатарноЗ активности (по клиренсу коллоидного угля), но и увеличением секреции кислых гкдролаз и усилением микробицидной активности фагоцитов.

Положения, выносите на защиту.

1. Острое холоцовое воздействие (-Ю°С, I час) у мышей вызывает снижение температуры ядра тела до 33,4°С, увеличение уровня кортакостерон?. н ллззмэ крови и депрессию поглотительной спо-собноотк макрофагов.

2. Предварительное вводите криелана при остром переохлая-дении и при введении хлористого гадолиния оказывает протектив-кое действие, связанное с восстановлением поглотительной активности макрофагов и предотвращением возникновения ультраструкту^-ных нарупений клеток печени.

3. Усиление фагоцитоза при стимуляции криеланом сопровоада-ется увеличением числа первичных лизосом в макрофагах печени, повышением секреции кислых пщролаз и усилением потенциальной микробицидной активности фагоцитов, что может быть одним из механизмов усиления неспецифической резистентности организма в условиях холодового стресса.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации представлены и обсувдены на конференции молодых ученых Института физи логии СО АМН ССОР, Новосибирск (1989); рабочем совещании с международным участием "Структура и функции лизосом", Новосибирск (1989); 7-м рабочем совещании Европейской группы исследования лизосошшх болезней, Швейцария, Ит-тинген (1989); 10-м объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР - ГДР, Ташкент (1989); республиканской конференции "Проблемы гистофизиологии соединительной ткани", Новосибирск (1989); рабочем совещании "Иммуномодуляторы естественного происходивши", Владивосток (1990); Всесоюзной конференции "Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды", Новосибирск (1990); 51,52-й научной конференции студентов и молодых ученых Новосибирского медицинского института,

Новосибирск (1990,1991); Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Патогенез хронического воспаления", Новосибирск (1991); 6-м Братиславском симпозиуме по углеводам, Чехословакия, Смоле-нине (1992); симпозиуме "Белки острой фазы - биологические функции и регуляция их синтеза", Польша, Краков (1992).

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 14 опубликованных работах. По материалам диссертации получено положительное решение на выдачу патента по заявке й 5002613 от 29.06.1992 г. "Способ коррекции последствий при остром воздействии холода".

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит Ч таблиц ирисунков. Состоит из введения, обзора литературы, собственных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего £>'{ отечественных и иностранных источешкэ.

Весь материал, представленный в диссертации, получен и цроанализирован лично автором. Электронно-микроскопическое исследование ткани печени проведено совместно со стартми научными сотрудниками Ш РАМН Правоторовым Г.В. и Филюшиной Е.Е.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Материалы и методы исследования. Исследования проведены на 317 крысах самцах Вистар и 331 мышах самцах СБА из питомника "Рассвет" Института сывороток и вакцин (г.Томск) и вивария Института цитологии и генетики СО РАН. (г.Новосибирск).

ХолодовоЗ стресс вызывали помещением мышей в морозильную-камеру с температурой -Ю°С, в течение I ч (в контрольной группе ректальная температура 37,5±0,16°С, в опытной - 33,4*0,28°С). Ректальную температуру измеряли с помощью медицинского электротермометра ТПЭМ-1 (любезно предоставлен с.н.с. ИФ СО РАМН Ди-вертом В.Э.). Содержание кортикостерона в плазме у мышей определяли с помощью набора для радиоиммунологического анализа кортикостерона РИН-В-3Н (Сухуми, НИИ экспериментальной патологии и терапии АМН СССР).

Подавление поглотительной способности клеуок печени воспроизводили также с помощью введения хлористого гадолиния (<ИС1д х бН^О). Препарат вводили шиам внутривенно однократно в

дозе 20 мкмоль/кг (Bouma, smit ,1969). Исследование поглотительной способности макрофагов в модели депрессии системы мононуклеарных фагоцитов хлористым гадолинием проводили спустя 4,6,8 часов и 1,2,3 сут. после введения соединения.

Для стимуляции С1© животным вводили дрожжевые полисахариды одетые гликаны - маннан родэксман и гетерополисахарвд криелан (оба соединения продукция Ленинградского химико-фармацевтического института, Санкт-Петербург), а также дериват ß -глюкана ß -1,3-карбоксиметилглтан (Институт Химических исследований Словацкой Академии наук, Братислава, Чехо-Схова-кия) в дозе 5-10 мг на 100 г массы тела. Спустя 24 и 48 ч после стимуляция криеланом животные подвергались острому воздействию холода. Сразу после холодовой экспозиции изучали поглотительную способность макрофагов печени (фагоцитоз). В контрольной группе использовали мышей, которым за 24 и 48 ч до холодовой экспозиции вводили 0,9$ физиологический раствор.

Потенциальную . мавробшидную активность (ПМД) макрофагов оценивали с применением НСТ-теста совместно со ст.н.с. ЦЕЩ НОТКаИ Архиповым С.А.

Для электронно-микроскопического исследования печень пер-фузировали и фиксировали 2,5$ глютаровым альдегидом с последующей фиксацией в 1,Ъ% четырехокцеи осмия, образцы ткани де-гадротировали и заливали в эпон-арадцит. Срезы контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (1963) и исследовали в электронном микроскопе "J ЕМ-ЮОз ".

Общую поглотительную способность макрофагов печени определяли по способности очищать кровь от чужеродных частиц коллоидного угля, введенного внутривенно, под легким эфирным наркозом ( Saba,1970; Normann ,1974).

Активность ферментов лизосом печени кислой фосфатазн, /-галактозвдазы, jj-глюкозидазы, катепсина d определяли в гомогенате печени спектрофотометрически (de Dure et »1.,1955), с учетом рекомендаций Барретта ( Barrett,1972). Активность ферментов выражали в мкмолях отщепленного субстрата в процессе ферментативного гидролиза в I мин в расчете; на I г белка. Определение содержания белка в пробах проводили по методу Лоури и др. (Lowry et ai. ,1951), в качестве стандарта попользовали бычий сывороточный альбумин (фирма Koch-Light , Великобритания).

Статистическую обработку результатов проводили методом параллельных рядов вариационной статистики с использованием критерия Стьодента. Различия сравниваемых величин принимали как статистически достоверные при Р<0,05.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Поглотительная способность СМ$ после острого хордового воздействия и введения хлористого гадолиния

В опытах на мышах показано, что после острого холодового воздействия (-Ю°С, I ч) в плазме экспериментальных животных значительно увеличивается уровень кортикостерона (в 3 рава) и происходит снижение ректальной температуры (в контроле -37,5±0Д6сС, а в опытной группе 33,4±0,28°С).

Одновременно с увеличением урозня кортикостерона в плазме после острого холодового воздействия у швей отмечено подавление поглотительной способности макрофагов печени (в 2 раза) , определяемое по клиренсу крови от введенного внутривенно коллоидного угля. Депрессию поглотительной способности макрофагов печени регистрировали и спустя 3 ч после холодового воздействия, очищение крови от частиц коллоидного угля в это время было почти"' вдвое ниже контрольных значений. Через 24 ч поглотительная способность клеток печени восстанавливалась до нормы (рис.1).

Электронно-микроскопически в печени мышей после острого холодового воздействия зарегистрированы значительные структурные сдвиги. Для гепатоцитов наиболее характерными изменениями являлись: расширение шероховатой эцдоплазматической сети и снижение содержания гликогена, признаки набухания цитоплазмы в митохондрий, появление крупных фагосом, содержащих хлопьевидный или мембранный материал, сглаживание синусоидальной и бшшарной поверхностей.

Клетки Купфера уплощены и имели небольшие размеры. В них отмечено отсутствие или уменьшение полиморфных выростов, уплотнен цитоплазматический матрикс, наблюдалось снижение числа свободных рибосог и полисом, уменьшение протяженности цистерн шероховатой эвдоплазматической сети. Количество электронно-прозрачных вакуолей и эвдоцитозных везикул резко уменьшается.

Это свидетельствует об угнетении макро- л мгяропаноцитозной активности печеночных макрофагов.

По-зидкмому, наиболее вероятной г.жггнззн депрессии поглотительной функции CI.S и превде всего клеток Купфэра, которые вносят основной вклад в клиренс крови от корпускулярных частиц (Лдо А.Д., МаянскиЗ А.Н.,1983; Маянский д.Н.,1992; Altura, Saba ,1983; Kaplan ,1984),следующий: кортпкосторо&ш в экстремальных ситуациях могут выступать в качестве стабилизаторов мембран фагоцитов и ингибиторов поглотительной функции С!® (Aco3ta, 'A'ensel ,1974).

Блокада поглотительной способности клеток Купфера раввц«-вается и после введения хлористого гадолиния в дозе 20 мкмоль/ /кг. Снижение поглотительной способности клеток печени отмечено уже спустя 8 ч после введения црепарата и остается ниеэ контрольных значений на протяжении 3-х суток (рис.1), что в целом соответствует даннш, полученным ранее (Воияа, Smit, 1989).

Индекс фагоштозз

0,070

0,060 .

0,050

0,040

0,030 _

0,020

0,010 „

О

Контроль_

тшшшщтш/ш/

15 1

30 i i

6

8

24

*ju.

73 <-и-

часы

Еис.1. Поглотительная способность клеток печени мышей при остром холодовом стрессе и введении хлористого гадолиния.

По оси абсцисс - время после холодовой экспозиции и введения хлористого гадолиния. По оси ординат - индекс фагоцитоза

А А ■ - холодовой стресс - Ю°С, I ч а « . - хлористый гадолиний, (число животных в каждой группе - 10)

Обнаруженное нами подавление поглотительной способности клеток печени после введения хлористого гадолиния соответствует данным литературы, где показана аналогичная депрессия фагоцитарной активности макрофагов печени ( вошпа, Smit, 1989). Однако механизмы, приводящие к депрессии СШ, не ясны. Предполагают, что ато связано с клетками Купфера, 'поскольку электронно-микроскопические исследования демонстрируют уменьшение общего количества клеток Купфера ( Husztik et al.,1980). Электронно-микроскопическое исследование в клетках Купфера минимизируется численность электронно-прозрачных вакуолей. В ли-зосомальном аппарате преобладают крупные первичные лизосомы неправильЕюй формы с мелкозернистым матриксом. Нередко по периферии таких лизосом в виде ободка распределяются мелкие электронно-плотные гранулы,, похожие на кристаллы неорганических веществ.

2. Влияние предварительной стимуляции СЮ криеланом на поглотительную функцию макротагов при холодовом стрессе и введении хлористого гадолиния

Известно, что подавление поглотительной функции СШ> при стрессе делает животных чувствительными к повторному действию повреждающего фактора (Altura ,1982). Это в свою очередь позволяет предположить, что предварительная стимуляция будет оказывать положительное влияние на исход экстремальных воздействий. В связи с этим в следующей части эксперимента изучена поглотительная способность макрофагов печени в острую фазу стресса (холод) после предварительной (за 24 и 48 ч) стимуляции дрожжевым полисахаридом криеланом.

Показано, что предварительная стимуляция криеланом за 24 и 48 ч до холодовой экспозиции полностью отменяет депрессию фагоцитоза, вызванную острым воздействием холода (рис.2); аналогичный эффект обнаружен цри предварительном,за 24 ч введении криелана мышам на модели депрессии СМ$, вызванной хлористым гадолинием (рис.2).

Морфологические изменения при предварительной стимуляции экспериментальных швей криеланом (холод), касаются главным образом системы шероховатой эвдоплазматической сети, цистерны которой в значительной степени расширены и отличаются нерегу-лярнш распределением рибосом на мембранах. В цитоплазме и в

мтсзсснщпипх гепатосргоЕ цраяоттесая отсутствуют признаки набухания, зкрзктвриие д:1я острого холодозого воздействия. Что касается клеток лупуерз, то наблюдается их определенная гетерогенность по форме, размером, плотности цитоплазма, чкслу митохондрий :: протяженности шстерн энцоплазматвческсй сета.

Индекс фагоштоза

Рис.2. Поглотительная способность клеток печени при остром холодовсм стрессе и введении хлористого гадолиния после предварительной стимуляции криедапом (число нивотных в кавдой группе 8-10)

- контроль

криелан, 24 ч

холод, -10°С, I ч

и!

- криелан 24 ч + холод (-Ю°С, I ч)

- хлористый гадолиний, 24 ч

- криелан 24 ч +

гадолиний хлористый, 24 ч

Эндоцитозные везикулы многочисленны, электронно-прозрачных вакуолей больше, чем при одном воздействии на кивотных холода. Количество и размеры первичных и вторичных лизосом аналогичны тем, что наблюдались-у пнтактних животных.

Таким.образом, после предварительной стимуляции СШ> крие-ланом отменяется подавление поглотитольпой способностимакро-

фагов печени, вызванная острым воздействием холода и введением хлористого гадолиния (модель депрессии СШ). Электронно-микроскопические наблюдения показывают предотвращение ультраструктурных нарушений клеток печени. Можно заключить, что у животных существенно возрастает устойчивость к экстремальным воздействиям, в данном случае - острому холодовому воздействию.

Повышение резистентности кивотных к стрессу мох:ет быть сея-зако с усилением поглотительной способности макрофагов, секрецией макрофагами простагландинов IITEj и ПГЕ2, усиливающих микроциркуляцию (Decker,1990), факторов, 'стимулирующих гранулову -то-, эритропоэз (Matcalf ,1985), синтез фибронектина и компонентов Cg и Cg комплемента, способствующих' опсонизации частиц (Marino , spagnuolo ,1988), а также факторов естественной резистентности, таких как интерлейкин-1, интерферон (Nathan, 1987).

Полученные результаты позволяют предполохать, что краелаа, проДдя дополнительные и клинические испытания, может быть рекомендован в качестве основы для создания препаратов, повышающих общую неспецифическую резистентность организма при остром хояодовом воздействии.

3. Опенка обшей поглртительной способности СШ при стимуляции дрояяевнми полисахарид?'.*;;

Одним из наиболее распространенных способов для оценки поглотительной способности клеток СШ, является метод внутривенного введения чужеродных частиц: коллоидный углерод, латекс, меченые эритроциты и др. (bíozzí e-t al. ,1957; Ногтшш,

1974). Этот тест характеризует поглотительную функцию тканевых макрофагов печени и по мнению рада исследователей находится в строгой корреляции с тяжестью экстремальных воздействий (Меерсон З.Ф. И ДР.,1990; Altura, Saba ,1983).

Результаты проведенных нами исследований.по оценке поглотительной способности макрофагов печени показали, что стимуляция дрожжевыми полисахаридами в большинстве случаев значительно активирует фагоцитоз клетками печени.

Так, внутрибршинное введение крысам криелана (5 мг/ЮО г) сопровождается значительным усилением '-поглотительной активности клеток печени по сравнению с контролем максимально на 2-е

сутки в 2,5 раза (табл.1). Енутривенное введение крысам крле-нала в той :ке дозе вызывает наиболее выраженную стимуляцию фагоцитарной активности макрофагов на 4-е сутки в 3 раза (табл.1).

Внутрибрюшинное введение крысам родэксмана в'дозе 5 глг на 100 г кассы тела активирует поглотительную способность макрофагов на 6-е сутки в 1,2 раза в сравнении с животными'контрольной группы (табл.1). Внутривенное введение крысам родэксмана в той же дозе активирует поглотительную способность макрофагов печени максимально на 1-е сутки в 2 раза.(табл.1). Увеличение дозы родэксмана на 10 мг/ЮО г массы тела сопро-воадается более ранней и выраженной активацией поглотительной способности макрофагов печени на 2-е сутки более чем в 2 раза по сравнению с животными, которым родэксман вводили в дозе 5 .мг/ЮО г массы тела (рис.3).

К-ШЩЕКС 0,100 -0,080 -0,060 -0,040 -0,020 О

контроль I 2 6 13 сут

Рис.3. Влияние однократного внутрибрюианного введения крысам '. родэксмана в дозах 5 и 10 мг/100 г на фаговдтоз коллоидного углерода • . -

-. (число животных в каждой группе 8-10)

Аналогичный эффект - усиление поглотительной активности макрофагов печени - 'Показан и у мышей СВА при стимуляции Cl® | криеланом и дериватом jî-глюкана J> -1,3-карбоксшетилглюка-

ном. ... . .

à

Так, внутрибрюшинное введеЕше мышам криелана (5 мг/100 г) активирует поглотительную способность макрофагов печени на 5-е сутки более чем в 2 раза по сравнению с контролем. Внутривенное Ее введоние криелана мышам оказывает более выраженную стимуляцию поглотительной способности клеток печени на 2-е сутки в 3,5 раза по сравнению с контролем (рис.4).

ЗяутрибрюшиЕшое введение мысам £ -1,3-карбоксиметилглю-кана такзе сопрововдается активах!'.эй фагоцитоза в 1,8 раза на 5-е сутки, по сравнению с животными контрольной группы, тогда как внутривенная стимуляция мышей криеланом в той же дозе вызывает более ранний и выражонный на 1-е сутки бодае Чем в 2 раза по сравнению с внутрибрюшпнпим введением (г;;с.5).

Таким образом, при стимуляции СШ крыс п шпо;1 дрожлэзы-т полисахаридами обнару;::оЕ1 сходный эффект, стимулирующий поглотительную активность макрофагов печени.

К-ивдекс

контроль

Внутрибрюшинное введение

I I Внутривенное -введение

14 сут

Рис.4. Влияние .однократного введения мышам СБА криелана (5 мг/100 г) на фагоцитоз коллоидного углерода. (Число животных в каждой группе 8-10).

Таблица I

Влияние однократного введения крысам Впстар криедона л г .гъвсиана (о мг/ЮО г) на фагоцитоз коллоидного угля. Чисго зиотних в л- жлой группе £-10,

День после стимуляции

К р и е л а н

о д о к с м а и

Индекс фагоцитоза

Шщикс фагоцитоза

Внутрибрюшинное введете

Внутривенное введение

ВнутрибрюЕшнное введение

Внутривенное введет о

Контроль 0,032 ± 0,005 0,032 + 0,005 0,032 + 0,005 0,032 + 0,005

1-й 0,060 ± 0,006 0,075 + 0,010** 0,035 + 0,006 0,073 + 0,006®

2-Я 0,087 ± 0,011** 0,098 + 0,013®* 0,046- _± 0,007 0,056 + 0,00423

4_д 0,051 ± 0,007* 0,106 + 0,003**

6-а 0,058 ± 0,009* 0,077 + 0,010® 0,068 + 0,003** 0,055 + 0,003^

13-й 0,042 ± 0,007 0,076 + 0,010®* 0,038 + 0,004 0,039 + 0,004

0,0 5 по сравнению с контрольной группой Ж »-Р<0,01 по сравнению с контрольной! группой

R-ивдакс 0.120 _ 0,100 _

0,080 _

0,060 _ 0,040 _ 0,020 _ 0

Контроль I S 5 14 сут

Рис.5. Влияние однократного введения мыиам J> -1,3-кар-боксиметилипжана (5 мг/100 г) Еа фагоцитоз коллоидного углерода. Число животных в каждой груше 8-10 .

3.4. Определение ппташтияльноА .миирпЛтгттитгнпй активности (ПМА) макрофаров

Учитывая, что приобретение такрофагами цитотоксичности после стимуляции СЮ иммуномодулирупцими средствами является одним из центральных ввеньев эффекторного потенциала макрофагов ( seijeiied ,1987), нами в эксперименте было изучено влияние дроякевых полисахаридов криелана, родэксмана, ^-1,3-карбоксиметилглшана на потенциальную шкрскЗштоностьг макрофагов перитонеального экссудата. Показано, что стимуляция перитонеадьных макрофагов in vitro криеланом, родэкс-маном и ^-1,3-карбоксиметилглшаном соцровоадается усилением микробилзддной активности по сравнению с контролем (рис.6).

Q0% C0% _ A0% 20% 0

о a,

i

1

■'.0.6. L'tTT-reo? при стэдглоо^з дроакавши полисахаридами. (Результаты выраг.епы в процентах от контроля)

Примечание:

- криелан, 150 мкг/мл I- j - родэксман, 150 мкг/мл

- _0-1,3-карбоксиметилгяюкан, 150 мкг/мл

3.5. Биохимическое иссзгедозакде активности дизосомальннх Ферментов в сыворотка и в печеночном гомогенате

»а

Показано, что увеличение активности гидролаз (кислая фос-фатаза,/ -галактозвдаза, J> -глюкозвдаза, катепсины) является надежным показателем не Только для оценки функционального состояния, но и для степени активации фагоцитирующих клеток ( Decker,1990). В связи с этим наш была исследована активность ферментов лизосом печени при стимуляции криеланом. Показано, что стимуляция криеланом сопровоадается увеличением секреции кислой фосфатавы сыворотки крови через 2 ч (рис.7), в гомогенате печени на 5-е сутки отмечено возрастание активности кислой фосфатазы, J> -глюкозидазы, катепсина D (рис.8).

s

140 120 100 80 60 40 20 0

2ч I сут Ь сут

Рис.7. Влияние введения криелана на активность квелой фосфатазы сыворотки.

Результаты выражены в процентах от контроля,

принятого за 100$.

Число животных в каждой группе - 10

Электронно-микроскопкчески в купферовских и эндотелиаль-ных клетках печеночных синусоддов через 48 ч после введения криелана зарегистрировано увеличение числа первичных лизосом небольшого размера. В купферовских клетках более значительно, чем в норме, количество вторичных лизосом. Причем, нередко в купферовских и ээдотелиальных клетках отмечались лизосомопо-добные структуры с узким темным ободком по периферии и светлым мелкозернистым матриксом в центре.

При введении коллоидного угля в купферовских клетках на-блвдали крупные фагосомы с включением коллоидных частиц. Ассоциации таких частиц встречаются у поверхности купферовских и эвдотелиаяьных клеток. В перитонеальных макрофагах при воздействии криелана также возрастало количество первичных лизосом и фагосом. В некоторых клетках встречались довольно крупные лизосомоподобные структуры с темным ободком, возрастало количество электронно-прозрачных вакуолей.

кислая фос^атаза

Т

X

X

щ

1

-галактоз идаз а

^-глюкозидаза Л

тк

ш

х

катопсин в

8

х

□

- контроль

- криелан, 2 ч

криелан, I су т.

- криелан, 5 сут

йгс.З. Влияние криелана на удельную активность ферментов лизосом печена шией цри стимуляции СШ криеланом в дозе 5 мг/100 г, п. - /о

Повышение поглотительной активности макрофагов печени после стимуляции криеланоы, родэксыаном, jS -1,3-карбоксиметил-глюканом, по-видимому. обусловлено рецепторным взаимодействием стимуляторов с макрофагами, что ивдуцирует изменение функциональной активности мононуклеарных фагоцитов (Шишкина Л.Н., Ма-ЯНСКИЙД.Н., 1985; Takemura, Werb ,1984).

Вероятно, что одним из механизмов, способствующих усилению их поглотительной способности.является синтез фибронекти-на стимулированными макрофагами, являющегося одним из универсальных опсонинов (Воронина Н.П., Маянский Д.Н.,1987; Trotter et al.,I989; Mo ïeovffl et al., ,1990; Beezhold, Lause, 1987). Также показано, что стимуляция макрофагов липополиса-харидамп in vivo, приводит к усилению адгезивности и увеличению экспрессии рецепторов на плазматической мембране фагоцитов, которые способствуют более быстрой элиминации чужеродного материала из периферической крови ( Glass ,1983).

Известно, что стимуляция СШ лишшолисахарвдачи приводит к активации С3 компонента, комплемента, играющего ключевую роль в опсонизации объектов фагоцитоза ( Esekowitz et al-,I983). Таким образом, стимуляция CI® криелано.м, родэксманом и J> -1,3-карбоксиметилглюканом усиливает клиренс коллоидного угля макрофагами печени, стимулирует ыикробицидны?. потенциал перитонеальных макрофагов. Показано, что активация фагоцитоза дрожжевыми полисахаридами зависит от способа введения, при этом,как и следовало ожидать,наиболее выраженный эффект наблюдается при внутривенном введении стимуляторов.

ДРСШЕВЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ

X

экспрессия эюитвопоэтины, рецепторов КСФ

(Glass . 1933 (¡¡istpalf > hcat-^hook pro- j.9857 teina (Killer, 19Э2)

фнбронсктин, гоглюиент;:

;'3.C5 (ü-iba, I9C3)

V

V

ИЛ-I, интерферон, лизо-цам, биоокислители (Nathan, 1987; Decker, 1990)

V

Повышение температуры ядра, синтез эндогенного пирогена? (Бокуть Т.Е., Викентьева Н.К. 1990)

v

Усиление

фагоцитоза,

опсонизации

усиление гранулоцато-и эритро-поэза

усиление минроби -цздного действия

усиление защитных сил организма

Повышение устойчивости к экстремальным воздействиям (Chihara ,1992, ааянскив Д.Н.,1989)

выводы

1. Острое холедовое -воздействие (-Ю°С, I час) вызывает значительное снижение поглотительной способности СШ и ультраструктурные нарушения клеток печени.

2. Повышение поглотительной способности макрофагов зависит от путей введения (криелан, ^ -1,3-карбоксиметилглюкан) и дозы ^родэксман) стимуляторов. Наиболее выраженный стимулирующий эффект наблюдается при внутривенном способе введения.

3. Дрозжевые полисахариды обладают не одинаковой стимулирующей способностью в отношении СШ: ыаннан с разветвленной •структурой (криелан) оказывает более выраженный эффект на поглотительную активность макрофагов, чем маннан с линейной структурой (родэкоман Д в одинаковых условиях).

4. -Стимуляция макрофагов перитонеального экссудата мышей дрожжевыми полисахаридами исгс криеланом, родэксма-ном и -1,3-карбоксиметилглюканом сопровождается повышением потенциальной шкробицидаой активности по НСГ-тесту.

5. Стимуляция С® криеланом, сопровождается повышением активности кислых гидролаз в сыворотке и гомогенате печени мышей. Электронно-микроскопически в. макрофагах печени происходит увеличение числа первичных лизосом.

6. Предварительная симуляция СШ ва 24 и 48 ч криеланом предотвращает развитие ультраструктурных нарушений клеток печени при остром холодовом вовдействм.

7. Стимуляторы С® типа криелана и родэксмана являются перспективными для разработки препаратов, обладающих протек-тивным действием при остром холодовом воздействии.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Уразгалиев К.Ш., Рукавишникова Е.В., Короленко Т.А. Звдоцптоз в клетках печени крыс при воздействии ллзссомотроп-ных препаратов и повреждении печени // Тез.докладов УП Всесоюзной конференции по экологической физиологии.- Ашхабад, 1989.- С.259.

2. йячурина C.B., Правоторов Г.В., Рукавишникова Е.В., Уразгалиев К.Ш., Демзденко Н.Я., Ковалева Л.М., Кашкина М.А., Короленко Т.А. Исследование морфо-функциональных свойств макрофагов печени 'л легких крыс при введении иымуномодуяяторов дрожжевых полисахаридов // Тез.докладов республиканской кон-Ференул но проблемам гистсфцзпологш соединительной ткани.-Новосибирск,1989.- С.132.

3. Xorolenko T.A., Rukavishnikova E.V., Urazgaliev K.Sh. Lysosomotropic agents and endooytosis by rat liver cells.

la: Abstracts of 7th Workshop of the European Study Group on Lysosomal Diseases. Ittingen, Switzerland, 1989, p. 36.

4. Уразгалиев К.Ш., Кынкина Г.И., Сафина А.Ф., Рукавишникова Е.В., Кашкина М.А. Острое холодовое воздействие и активация макрофагов дрожжевыми полисахаридами // Тез.докладов Всесоюзной конференции "Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды".- Новосибирск,1990.- С.39.

5. Уразгалиев К.Ш., Короленко Т.А., Верещагин Е.И., Шв-кина Г.И., Сафина А.Ф., Демиденко Н.Я., Кашкина М.А. Ивдуно-модуляторы - дрожжевые полисахариды: лизосомотропные свойства и активация макрофагов // Тез. докладов рабочего совещания "Иммуномодуляторы природного происхождения".- Владавоо-ток, 1990.- С.43.

-6. Правоторов Г.В., Уразгалиев К.Ш., Кашкина М.А.,- Коро-лейко Т.А. Морфо-функциональные изменения в клетках печемч-ных синусоидов и в перитонеальных макрофагах у ыыпей, симулированных дрожжевым полисахаридом в условиях острого холодов ого воздействия // Тез. докладов Всесоюзной конференции "Микроциркуляция в экстремальных условиях".- Фрунзе, 1990.-С.295.

7. Уразгалиев К.Ш., Мынкина Г.PL, Сафина А.Ф. Характеристика жидкостного и рецепторно-опосредованного эндоцитоза клетками печени при стимуляции макрофагов дрожжевыми полисахаридами // Tee. докладов 51-й научной конференции студентов и молодых ученых Новосибирского медицинского института.- Новосибирск, 1990.- С.34.

8. Korolenko Т.A., Urazgaliev K.Sh., Vereshagin E.I., Myn-kina G.I., Safina A.P., Gilinsky M.A. and Kashkina M.A. Liver macrophage activation by lysosomotropic agents and in cold eocpoeure. Ins Abstracts of International Simposium on Cells oi the Hepatic Sinusoid. 26-30 August, 1990. Tucson, Arizona, U.S.A.

9. Уразгалиев К.Ш., Демвденко Н.Я., филюиина Е.Е., Право-торов Г.В. Иммуномодуляторы дрожжевые полисахариды: стимуляция макрофагов и защитный эффект цри воздействии холода // Тез. докладов 52-й научной конференции студентов и молодых ученых Новосибирского мединститута.- Новосибирск,1991.-С.44.

10. Короленко Т.А., Уразгалиев К.Ш., Верещагин Е.И., Са-фина А.Ф., Красносельская Г.А., Каикина М.А. Механизм защитного действия лизосомотропных соединенна - стимуляторов макрофагов при хроническом гепатите // Тез. докладов Всесоюзного симпозиума с международным участием "Патогенез хронического воспаления",- Новосибирск, 1991.- С.159.

11. Korolenko Т.А., Urazgaliev K.Sh., DushkinM.I., Safina A.P., Vereshagin £.1. and Sandula J. Mechanism of macrophage stimulation induced by yeast polysaccharides and their derivaties. In: Abstracts of 6-th Bratislava Simposium On Saccharides, p. 3-6. 15-19 June, 1992. Smolenice, Czechoslovakia.

12. Korolenko T.A., Vereshagin E.I., Urazgaliev K.Sh., Safina A.F., Dushkin M.I., Arkhipov S.A. and Sandula J. Immunomodulatory and antiproteolytic function of acute phase proteins. Ins Abstracts Satellite Symposium of the 8-th International Congress of Immunology, p. 45, 19 - 22 August,

1992. KrakiAi, Poland.

13. Короленко Т.А., Верещагин Е.И., Уразгалиев К.Ш., Сафина А.Ф., Сацдула И., Каикина М.А. Иммуномодуляторы - дрож-

хеше полисахариды, лизосомотропные. свойства и биологический эффект // Тез. докладов Первого Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство",- Москва,1992.- С.IOO.

14. Верещагин Е.И., Уразгалиев К.Ш., Демиденко Н.Я., Архипов С.А., Гилинский М.А., Филюиина Е.Е., Короленко Т.А., Гри-горенко В.Е., Каштана H.A. Возможности стимуляции системы мо-нонуклеарных фагоцитов дрожжевыми полисахаридами и их эффект на резистентность организма // Билл. Сибирского отделения РАГЛН,- 1992.- :;> I.- С.80-84.

Зак .268 .Тир. 100. Печ .л. 1,0 .Бум .писч. Тип. СО РАМН г.Новосибирск 1992 23