Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика системы иммунитета и овариальной функции у женщин с бесплодием при проведении экстракорпорального оплодотворения

На правах рукописи

АЙЗИКОВИЧ Ирина Валентиновна

ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА И ОВАРИАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ У ЖЕНЩИН С БЕСПЛОДИЕМ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ

14.00.36 - Аллергология и иммунология 14.00.01 - Акушерство и гинекология

I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 2005

Работа выполнена в ГУ НИИ клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

А.А. Останин И.О. Маринкин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

A.И.Аутеншлюс

B.М. Кулешов

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет (Москва)

Защита состоится «

»

2005 г. в

часов

на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН (630091, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14)

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О.Т. Кудаева

HMto

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время установлено, что функционирование репродуктивной системы осуществляется при тесном взаимодействии с иммунной и эндокринной системами. Происходящие во время менструального цикла и беременности изменения контролируются со стороны гипоталамо-гипофизарной системы и являются прямым результатом индуцированного гормонами тканевого ремоделирования тканей яичника и слизистой матки. Действие гормонов на клеточном уровне реализуется через вовлечение множества пептидных ростовых факторов, среди которых особая роль отводится лимфогемопоэтическим цитокинам, продуцируемым иммунокомпе-тентными клетками (ИКК) [Al-Harthi L., et al. 2000; Bornstein S R., et. AI. 2004; Macheion V. & Emilie D., 1997].

На сегодняшний день наиболее исследованными являются иммунологические аспекты, связанные с поддержанием и нормальным протеканием беременности. Вместе с тем роль иммунной системы в регуляции самых ранних этапов репродуктивного процесса - фолликулогенеза, овуляции, доимплантационных этапов развития эмбриона и его имплантации, остаются существенно менее изученными [Szekeres-Bartho J , 2002; Buculmez О. & Arid А.. 2000].

Одним из наиболее значимых достижений репродуктивной медицины явилась разработка современных методов лечения бесплодия с помощью вспомогательных репродуктивных технологий и, в частности, экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Внедрение ЭКО повлекло за собой целую серию экспериментальных исследований на животных, посвященных иммунной регуляции овариальной функции, оплодотворения и имплантации эмбриона, а с другой стороны явилось инструментом для изучения иммунной регуляции указанных процессов у человека. В результате стало очевидным, что прямо или опосредованно через растворимые продукты ИКК принимают активное участие в регуляции ранних стадий репродуктивного процесса Выяснилось, что клетки иммунной системы присутствуют в яичнике, и их количество может существенно возрастать за счет миграции ре-циркулирующих лейкоцитов [Brannstrom М., et al., 1993; 1999]. Причем многие цитокины присутствуют в фолликулярной жидкости в концентрации, существенно превышающей таковую в периферической крови, что указывает на их важность в регуляции функций яичников [Runesson Е., et al., 1996; Macheion V. & Emilie D., 1997] Наряду с регуляцией овариальной функции клетки иммунной системы и продуцируемые ими цитокины выполняют исключительно важную роль в подготовке эндометрия к имплантации эмбриона, а впоследствии - в сохранении беременности [Sharkey А., 1998; Norwittz M.D., et al., 2001; Jones R.L., et al., 2004]

Учитывая тесную взаимосвязь иммунной и репродуктивной системы в регуляции овариальной функции, развитии эмбриона, его имплантации и сохранении беременности очевидно, что наличие исходных иммунных дисфункций, а также развитие их в процессе стимуляции овуляции может быть серьезной причиной низкого качества ооцитов; дефекта оплодотворения яйцеклетки, нарушения развития и имплантации эмбриона, и, в конечном итоге, отсутствия/потери беременности. Поэтому большой интерес пред-

РОС.

Б^гJSuTLKA ^-CJUTepSypr

' iW

ставляет исследование показателей системного и локального иммунитета, а также овариальной функции в группах женщин, оплозитных по уровню фертильности, качеству эмбрионов, имплантации и клинической беременности Исследования такого рода имеют большое практическое и теоретическое значение, поскольку, во-первых, позволяют осмыслить новые аспекты иммуно-эндокринной регуляции ранних этапов репродуктивного процесса и патогенеза бесплодия, а, во-вторых, разработать прогностические критерии эффективности вспомогательных репродуктивных технологий Кроме того, возможно уже в скором времени полученные в этой области знания позволят разработать и внедрить в практику методы адьювантной цитокинотерапии, направленной на повышение эффективности ЭКО, результативность которой на сегодняшний день составляет по данным разных авторов от 30 до 40% [Разриа1ойо Е В , е1 а1, 2004; Брегс^ I., е1 а1,1999]. Все вышесказанное определило цель и задачи исследования Цель исследования

На основе комплексного анализа иммунологических параметров, а также показателей овариальной функции изучить возможность раннего прогноза развития беременности у женщин с бесплодием при проведении экстракорпорального оплодотворения. Задачи исследования

1. Изучить особенности иммунитета женщин на различных этапах овариального цикла при его физиологическом течении и в условиях проведения контролируемой стимуляции по программе ЭКО

2. Провести комплексный анализ уровня 17 цитокинов в фолликулярной жидкости на пике стимулированной суперовуляции и оценить роль цитокинов в процессе созревания ооцитов

3 Провести сравнительный анализ иммунологических параметров и показателей овариальной функции женщин в зависимости от эффективности ЭКО. 4. Проанализировать информативность и прогностическую значимость показателей иммунитета и овариальной функции в оценке эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО.

Научная новизна Впервые установлено, что в овуляторный период физиологического менструального цикла, и, особенно, на пике стимулированной суперовуляции в сыворотке женщин доминируют медиаторы с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью. Сдвиг баланса регистрируется как на системном, так и на местном (в фолликулярной жидкости) уровне, что в 4

сочетании с увеличением количества регуляторных С04+С025*Т-лимфоцитов, снижением уровня спонтанной пролиферации МНК и увеличением в крови доли апоптотических нейтрофилов свидетельствует о су-прессорной реорганизации иммунной системы на пике суперовуляции. В результате комплексной оценки уровня 17 цитокинов впервые охарактеризован цитокиновый профиль микроокружения фолликула в период стимулированной суперовуляции, что позволило получить новые данные о роли цитокинов в процессе созревания ооцитов При этом впервые показано, что на фоне пониженного уровня 11.-2, 11.-4, 11.-7 и в-СЭР происходит 2-кратное снижение общего количества образующихся ооцитов, тогда как в условиях

многокомпонентного дефицита Thl/провоспалительных (IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-1 р, IL-12, IL-17) и ТЪ2/противовоспалительных (IL-4, IL-10, IL-6, IL-13) ци-токинов, а также ростовых факторов (G-CSF, IL-7) и хемокинов (MIP-1a) нарушаются их качественные характеристики, и как следствие - эффективность оплодотворения in vitro. При ретроспективном анализе результатов лечения бесплодия методом ЭКО впервые показано, что уровень цитокинов в микроокружении фолликула не только во многом определяет количество и качество созревающих ооцитов, но также имеет большое значение для имплантации оплодотворенных яйцеклеток. Так, у женщин с низким содержанием IL-2, IL-4, IL-7 или G-CSF, а также в подгруппах женщин с повышенным содержанием IL-8 или IL-13 частота наступления беременности в цикле ЭКО составляла в среднем 20% (от 17,4 до 25%), т е в 3-4 раза ниже, чем в оппозитных подфуппах, где эффективность ЭКО достигала 75-80%.

Практическая значимость

Использование методов математического анализа позволило выделить диагностически значимые диапазоны параметров иммунного статуса, цитокинового профиля ФЖ, а также показателей овариальной функции, которые характеризовались высокой информативностью в раннем прогнозе эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО В диагностический комплекс, который позволяет прогнозировать успешное развитие беременности в цикле ЭКО, были включены 10 клинико-иммунологических показателей, диагностические коэффициенты (ДК) которых варьировали от +2,4 до +6,0. Диагностический комплекс, прогнозирующий вероятность неэффективного цикла ЭКО, включал 13 показателей с ДК от -3,6 до -12,0 Высокая прогностическая ценность выделенных комплексов признаков указывает на целесообразность использования методов иммунодиагностики при проведении вспомогательных репродуктивных технологий

Основные положения, выносимые на защиту:

1 В овуляторный период менструального цикла, особенно на пике контролируемой суперовуляции по программе ЭКО, в сыворотке и в фолликулярной жидкости женщин выявляется преобладающая активность регуляторных факторов с иммуносупрессорным и противовоспалительным действием

2 Иммунная система через цитокин-опосредованные механизмы принимает участие в регуляции процесса созревания ооцитов, при этом спектр и уровень цитокинов, продуцируемых в микроокружении фолликула, определяет не только общее количество и качественные характеристики созревающих ооцитов, но также эффективность последующей имплантации оплодотворенных яйцеклеток в цикле ЭКО

3 Комплексная оценка параметров иммунного статуса, уровня цитокинов в фолликулярной жидкости, а также показателей овариальной функции женщин, обследованных на этапе стимулированной суперовуляции, позволяет прогнозировать вероятную эффективность лечения бесплодия с помощью ЭКО.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выво-

дов Материал изложен на 119 страницах машинописного текста, включающего 29 таблиц и 7 рисунков Прилагаемая библиография содержит ссылки на 242 литературных источника, в том числе, 225 иностранных.

Апробация работы и публикации

Основные результаты работы доложены и обсуждены на' заседаниях Всероссийских семинаров по проблемам бесплодия (Саратов, 2001; Екатеринбург, 2002); XII научно-практической конференции врачей (Новосибирск, 2002); Международной научно-практической конференции «Цитокины Воспаление Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002).

Апробация работы состоялась на расширенном семинаре ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН 04 февраля 2005 г. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе обзорная статья в центральной печати.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 125 женщин, которым проводилось лечение бесплодия на базе отделения ЭКО медицинского центра «Авиценна» за период 2001 - 2004 гг. Средний возраст женщин составил 33 года (от 24 до 49 лет), продолжительность бесплодия варьировала от 2 до 16 лет (медиана 6 лет). В 32% случаев диагностировалось первичное, в 68% случаев -вторичное бесплодие, чаще всего обусловленное трубно-перитонеальным фактором У большинства обследованных женщин (78,4%, 98/125) регистрировались те или нарушения проходимости маточных труб, при этом наличие спаек в брюшной полости было выявлено в 76% случаев. До принятия решения о включении женщин в программу ЭКО проводилось их тщательное обследование: сбор соматического и акушерско-гинекологического анамнеза, ультразвуковое исследование (УЗИ), клинико-лабораторные (общий анализ крови, мочи), биохимические, гормональные и иммунологические исследования. По тем или иным причинам (в первую очередь, экономического характера) 44 женщины отказались от дальнейшего лечения с использованием вспомогательных репродуктивных технологий. У 81 пациентки цикл ЭКО был проведен полностью, и в день пункции фолликулов у них выполнялось развернутое иммунологическое исследование, включая оценку биологической активности и уровня цитокинов в фолликулярной жидкости.

При проведении иммунологических исследований были сформировано несколько контрольных групп. Первая включала 19 условно здоровых женщин-доноров крови в возрасте от 23 до 38 лет, у которых определялись нормативные значения количественных и функциональных показателей иммунного статуса. Во вторую группу вошли 14 женщин репродуктивного возраста, у которых проводили только оценку биологической активности сывороточных факторов на различных этапах физиологического менструального цикла, т е. в начале цикла (на 2-4 сутки) и в период овуляции Третья контрольная группа включала 7 гинекологически и соматически здоровых женщин в возрасте от 22 до 30 лет, ранее имевших беременность и срочные роды доношенным, здоровым ребенком, которые проходили цикл ЭКО по программе «донорства ооцитов» Им проводилось полное иммуно-

логическое обследование (на системном и местном уровнях) в день пункции фолликулов на пике стимулированной суперовуляции Все клинико-лабораторные исследования выполнялись после получения информированного согласия обследуемых женщин.

Методология ЭКО. Для индукции суперовуляции в лечебных целях использовались стандартные протоколы. Чаще всего (в 70% случаев у 57/81 женщин с бесплодием и у 4/7 женщин-доноров ооцитов) применялся «короткий» протокол с использованием диферелина (Ipsen, 0,1 мг) и пуре-гона (Organon, 100 - 300 ME) или меногона (Ferring, 2-4 мг). В оставшихся случаях стимуляция суперовуляции проводилась по «длинному» протоколу с использованием тех же препаратов. У 15 женщин с бесплодием (но не у доноров ооцитов) в начале лютеиновой фазы был диагностирован синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ) легкой или средней степени (соответственно у 11 и 4 пациенток), проявляющийся наличием жидкости в перитоне-альной полости и умеренным болевым синдромом.

Трансвагинальная пункция (TVP) фолликулов проводилась под ультразвуковым контролем с использованием аппаратов Aloka 500, Simens G50 После подсчета количества полученных ооцитов и оценки их качества по общепринятой бальной шкале (ооциты хорошего качества - 4-5 баллов; измененные - менее 4 баллов), ооциты и эмбрионы культивировали в 6-

луночных планшетах в среде IVF (MediCult, Дания) при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2 Обработку спермы проводили методом swim-up с использованием среды Sperm preparation (MediCult, Дания) Ооциты оплодотворяли через 4-5 ч после пункции, добавляя 50 -100 тыс подвижных сперматозоидов на ооцит Через 18 - 20 ч после оплодотворения ооциты исследовали на наличие пронуклеусов на инвертированном микроскопе при увеличении х400. Дальнейшую оценку дробления и качества эмбрионов проводили через 46-48 ч культивирования. Эмбрионы классифицировались согласно числу бластомеров, равномерности и сферичности бластомеров и наличию фрагментации. При этом рассчитывался индекс оплодотворения в виде процентного отношения количества оплодотворенных яйцеклеток к общему числу полученных ооцитов.

Трансфер эмбрионов проводили под УЗИ контролем на 3-4 день культивирования. Для переноса отбирали эмбрионы с наиболее высокой оценкой их качества. Следует отметить, что из 81 проведенных циклов ЭКО, завершившихся пункцией ооцитов, в 5 случаях трансфер эмбрионов не состоялся в силу отсутствия оплодотворенных яйцеклеток (п=2), или из-за остановки (п=1) или аномального (п=2) процесса их дробления в культуре in vitro. У остальных 76 женщин была выполнена процедура переноса эмбрионов, Наступление клинической беременности в результате проведенного цикла ЭКО диагностировали через 3-4 недели после эмбриопереноса при ультразвуковом исследовании по наличию плодного яйца в полости матки.

Иммунологические исследования. Для разных целей из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяли стандартными методами лейковзвесь, сыворотку, мононуклеарные клетки (МНК) МНК в концентрации 0,1х10в/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в

полной культуральной среде RPMI-1640 (Sigma) при 37°С в СО2-инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонА, 15 мкг/мл, Sigma). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению 3Н-тимидина (1 цЮо/лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования.

Методом проточной цитофлюориметрии (FACSCalibur, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела («Сорбент-сервис», Москва), определяли содержание различных субпопуляций ИКК (CD3*, CD4* и С08+Т-лимфоцитов, С020*В-лимфоцитов, С016+ЫК-клеток, HLA-DR+moho4htob) Для определения субпопуляции CD14+CD16* моноцитов использовали FITC-меченные анти-С016 антитела («Сорбент», Москва) и фикоэритрин (РЕ)-меченные анти-Сй14 антитела (Phar-Mingen, San Diego, США). Для определения субпопуляции CD4*CD25+ Т-клеток использовали FITS-меченные анти-С04 антитела и РЕ-меченные анти-С025 антитела (Phar-Mingen, San Diego, США).

Методом проточной цитофлюориметрии сроди свежевыделенных клеток лейковзвеси определяли также процентное содержание апоптотиче-ских лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов, которые вследствие фрагментации ДНК формируют характерный гиподиплоидный пик при окрашивании пропидиум иодидом (Sigma, 50 мкг/мл)

Образцы фолликулярной жидкости (ФЖ) получали во время TVP фолликулов после проведения курса контролируемой стимуляции суперовуляции Наличие в сыворотке или ФЖ супрессорной активности определяли по степени снижения КонА-индуцированной пролиферации МНК доноров (п=2-3) в присутствии 10% интактной сыворотки или ФЖ обследуемых женщин (опыт) в сравнении с уровнем митогенного ответа в присутствии 10% интактной сыворотки доноров (контроль) Полученные результаты выражали в виде индекса супрессорной активности (ИСА), рассчитанного по следующей формуле- ИСА = ОхК Значения ИСА менее 0,85 расч.ед свидетельствовали об иммуносупрессорной активности регуляторных факторов.

О суммарной активности медиаторов, контролирующих воспалительную реакцию, судили по способности исследуемых образцов (сыворотка или ФЖ женщин) стимулировать (воспалительная активность) или ингиби-ровать (противовоспалительная активность) интенсивность продукции перекиси водорода лейкоцитами здоровых доноров Сущность метода заключается в том, что в лейковзвеси здоровых доноров (п=2-3), инкубированной в течение 45 мин с исследуемыми образцами (опыт) или сывороткой доноров (контроль) в объемном соотношении 12, определяют активность нейтрофилов по продукции Н2О2. ИВА высчитывали по формуле ИВА = 0'К Значения ИВА более 1,33 расч.ед свидетельствовали о наличии воспалительной активности в тестируемых образцах ИВА менее 0,83 расч.ед расценивался, как проявление противовоспалительной активности регуляторных факторов.

Определение концентрации цитокинов. Содержание в фолликулярной жидкости 17 цитокинов (IL-1ß, TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MCP-1, MIP-1ß) оценивали методом проточной флюориметрии на 2-х лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с

использованием коммерческих тест-систем 17-Р1ех (определяемый динамический диапазон 2 - 32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Анализ содержания цитокинов в образцах ФЖ проводился четырьмя независимыми экспериментальными сериями, при этом значения цитокинов как в стандартных калибровочных разведений, так и в тестируемых образцах были хорошо воспроизводимы При статистической обработке значения цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода (< 2 пкг/мл), принимались за 1 пкг/мл.

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной и непараметрической статистики с использованием программы «БТАПвТЮА 5,0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика иммунитета женщин на различных этапах физиологического и стимулированного овариального цикла

Сравнительный анализ параметров иммунного статуса доноров крови и женщин с бесплодием показал (табл. 1), что в начале менструального цикла, до проведения стимуляции овуляции по программе ЭКО, содержание отдельных клеточных субпопуляций, уровень пролиферации и апоптоза клеток в исследуемых группах не различались В то же время, на пике стимулированной овуляции отмечается достоверное снижение интенсивности спонтанной пролиферации и относительного количества С016+М<-клеток, в сочетании с увеличением доли С020+В-лимфоцитов и Н1_А-ОР^моноцитов. Кроме того, отмечалась также тенденция к увеличению апоптоза циркулирующих клеток крови, которая в отношении свежевыде-ленных нейтрофилов достигала статистически значимого уровня Однако, поскольку аналогичные изменения регистрировались также в группе женщин - доноров ооцитов, можно заключить, что выявленные отклонения не были связаны с нарушением репродуктивной функции, а скорее отражали изменения гормонального фона или могли быть обусловлены циклическим изменением сывороточных факторов

Действительно, даже в физиологических условиях в овуляторный период в сыворотке крови женщин регистрируется появление супрессорной и противовоспалительной активности, не отмеченной в начале менструального цикла (табл 2) Причем при проведении контролируемой овариальной суперстимуляции регистрируется более выраженное усиление противовоспалительной и супрессорной активности сывороточных факторов При этом у большинства обследованных женщин обнаруживаются наиболее глубокие изменения, при которых индивидуальные значения соответствующих индексов выходили за нижнюю границу нормативных диапазонов (ИСА<0,85; 0,68 ± 0,02 расчед в 68,6% (48/70) случаев и ИВА<0,83; 0,55 ± 0,03 расч ед в 74% (34/46) случаев) Частота выявления таких изменений в овуляторный период физиологического менструального цикла была достоверно ниже, и составляла 28,6% (ртмф=0,04) Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о супрессорной реаранжировке иммунной системы на пике овуляции и изменении баланса регуляторных факторов в сторону доминирования иммуносупрессорных и противовоспалительных медиаторов.

Таблица 1

Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса в группах _женщин-доноров крови и женщин с бесплодием_

Показатель Группы 4

N91 №2 №3 №4

CD3 Т-лимфоциты (%) 70,8 ±1,5 69,6 ±1,2 72,6 ±1,3 70,2 ±4,1

CD4 Т-лимфоциты (%) 43,6 ±1,4 42,0 ± 1,2 44,6 ±1,3 44,0 ±4,9

CD8 Т-лимфоциты (%) 25,6 ±1,0 25,9 ± 0,9 26,0 ±0,9 26,0 ±2,9

CD4/CD8 1,76 ±0,1 1,71 ±0,09 1,78 ±0,07 1,71 ±0,16

CD20 В-клетки (%) 10,5 ± 0,9 9,2 ± 0,5 12,0 ± 0,6 ** 12,6 ±1,2*

CD16 NK-кпетки (%) 10,0 ±2,0 14,4 ±1,3 10,7 ±0,8* 11,4 ±2,3*

HLA-DR""*1 моноциты (%) 37,0 ±1,1 42,0 ± 1,8 69,0 ± 2,6 ** 70,0 ± 5,0 **

Пролиферация (имп/мин) Спонтанная 1530 ±140 1560 ±90 1280 ±80* 1230+160*

КонА-индуцированная 40200 ± 3830 43930 ± 3160 36950 ± 2780 32880 ±5790

ИВкоиА 32 ± 4,8 32,4 ±1,3 35,8 ± 3,6 28,0 ±5,3

Апоптоз лимфоцитов (%) 7,4 ±1,0 6,5 ±1,0 9,0 ±1,6 НД

Апоптоз моноцитов (%) 14,5 ±1,7 13,1 ± 1,4 17,5± 1,9 НД

Апоптоз нейтрофилов (%) 7,5 ±1,1 7,8 ±1,1 12,9 ±2,0* НД

Примечания: Группы: №1 - женщины доноры крови (п=19); №2 - женщины с бесплодием до начала цикла ЭКО (п=39) и на пике контролируемой суперовуляции (N63, п=55); N«4 - женщины доноры ооцитов на пике суперовуляции (п=7). ** - Ри < 0,01, * -ри < 0,05, достоверность различий показателей по сравнению с группами №1 и №2. НД - нет данных.

Таблица 2

Биологическая активность сыворотки крови доноров и женщин в различные фазы физиологического менструального цикла и на пике суперовуляции

Группы Активность регуляторных факторов (расч. ед.)

ИСА ИВА

1,4 ±0.1 1,05 ±0,04

/п-101 мешал 1,4 1,0

пип - шах 0,85-2,3 0,83-1,33

2-4 сутки физиологического менструального цикла (л =7) 1,08 ±0,17 0,99 ± 0,04

Овуляторный период физиологического менструального цикла (п=7) 0,87 ± 0,03 ** 0,78 ± 0,06 **

Стимулированная суперовуляция по программе ЭКО 0,78 ± 0,02 *** п=70 0,68 ± 0,04 *** п=46

Примечания: ** - ри<0,01 *** - ри<0,001, достоверность различий значений по сравнению с группой здоровых доноров крови (и- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Известно, что сдвиг цитокинового баланса в иммуносупрессорном направлении может существенным образом сказывается на регуляторной активности моноцитов и генерации естественных супрессорных С04С025 Т-клеток. Действительно, исследование на пике стимулированной овуляции содержания Сй14С016 моноцитов, которые в плаценте обладают супрессор-ной активностью, выявило четкую тенденцию к их увеличению (табл 3), при

этом у 28% (11/40) обследованных женщин их количество выходило за верхнюю границу нормы (>17%). Относительное содержание CD4+CD25+ Т-клеток в группе доноров крови варьировало от 1,0 до 10% и составляло в среднем 5,4 ± 0,5%, тогда как у женщин на пике стимулированной овуляции доля С04*С025+Т-клеток увеличивалась почти в два раза (ри<0,01). Причем у 17 из 40 женщин (в 42,5% случаев) относительное количество CD4*CD25+T-клеток превышало верхнюю границу нормативных значений (> 10%)

Таблица 3

Содержание CD14*CD16* моноцитов и С025*С04*Т-клеток в группах здоровых

доноров крови и женщин на пике стимулированной овуляции

Г руппы CD14*CD16* моноциты (%) CD4*CD25* Т-кпетки (%)

М ± S.E. 8,9 ±1,2 5,4 ± 0,5

7.1 5.8

2,6-17,0 1,0-10,0

п 16 15

Женщины по программе ЭКО (п=40) 12,3 ±1,0 9,6 ± 0,8

Достоверность различий Ри = 0,09 Ри < 0,01

Увеличение доли циркулирующих регуляторных Т-клеток на фоне доминирующей иммуносупрессорной и противовоспалительной активности сывороточных факторов показывает, что в супрессорной реорганизации иммунной системы женщин в период овуляции задействованы цитокин- и клеточно-олосредованные механизмы.

Цитокиновый профиль фолликулярной жидкости и особенности овариальнойфункции

Следующий этап работы был посвящен изучению роли цитокинов в регуляции фолликулогенеза на основе комплексного анализа уровня 17 цитокинов и биологической активности фолликулярной жидкости у женщин, включенных в программу ЭКО Из данных таблицы 4 видно, в ФЖ идентифицировался широкий спектр цитокинов, включая ТЬ 1 /провоспалительные (11.-2, 1РМ-у, "ГОР-а, И-1Р, И-12, И-17) и ТИг/противовоспалительные (1Ь4, И-5,1Ы0, И-6, 11.-13) цито-кины, хемокины (И-8, МСР-1Р, М1Р-1), а также гемопоэтические ростовые факторы (вМ-СЭР, ¿-СБЯ, И-7). При этом пациентки с бесплодием и здоровые женщины-доноры ооцитов были сопоставимы между собой по уровню цитокинов в ФЖ, однако характеризовались выраженным разбросом индивидуальных значений. Присутствие в ФЖ ряда из анализируемых нами цитокинов (11.-2,1РК1-у, ПЧР-а, И-1Р, И-6, 11.-8, МСР-1Р, М1Р-1а, ОИ-СЭР, в-СвР) является известным фактом В то же время вопрос о наличии в ФЖ И-4 и 11.-10, 11.-12 остается открьпым в силу единичных исследований Поэтому полученные нами данные являются дополнительным аргументов в пользу присутствия указанных цитокинов в ФЖ Что касается 11.-7 и 11.-17 - эти цитокины идентифицированы на пике стимулированной овуляции впервые. Что примечательно, уровень значительного числа цитокинов существенно превышал таковой в сыворотке крови, что указывает на потенциальную роль цитокинов в регуляции овариальной функции При этом наряду с 1.1Р, 11.-8,11-6, и в-СЭР, селективный характер продукции которых в ФЖ известен, более высокий уровень в ФЖ по сравнению с сывороткой крови был характерен для вМ-СБР, 11.-2,1РК1-у, М1Р-1Р и 11.-7.

Таблица 4

Биоактивность и уровень цитокинов (пкг/мл) в ФЖ женщин-доноров ооцитов и _пациенток с бесплодием_

Цитокины Доноры ооцитов (п=7) Пациентки ЭКО (п=52)

М ± Б.Е. МесНап М ± Э.Е. МесЫап Мт - шах

1РМ-у 78 ±36 55 65 ±13 59 1-604

11.-2 18 ± 5 25 17 ±2 26 1 -37

И-4 8 ±1,6 9,6 7 ±0,7 8,4 1-15

11.-5 2,4 ± 0,2 2,7 2,2 ± 0,1 2,8 1 -5,5

11.-6 17 ±3,5 13 31 ±10 18 1-541

11.-10 10± 1 10 10 ± 0,7 10 1-24

11.-13 54± 16 24 44 + 6 26 1 -225

пир 25 ± 3 23 27 ±1,6 25 9-63

ТЫР-а 16,5 ±6 10 19 ±3,6 10 1-156

И-12(р70) 12 ±0,2 12 14 ± 1,5 12 1-64

11.-17 21+5 16 22,5 ± 3 16 1-114

И-7 10,7 ±0,5 11 8,2 ± 0,9 11 1-38

в-СЭР 132 ±30 166 120 ±12 157 1 -296

ЭМ-СЭР 202 ±48 136 220 ±36 137 1 -1262

И-8 21 ± 4,4 21 33,5 ±15 15 2,5-812

М1Р-13 81 ±16 75 115 ± 13 81 14,3-496

МСР-1 11 ±8 1 20 ±8 1 1-362

ИСА расч.ед. 0,62 ± 0,06 0,63 0,58 ± 0,02 0,60 0,15-0,93

ИВА расч.ед. 0,81 ± 0,04 0,80 0,80 ± 0,02 0,78 0,5-1,24

Несмотря на присутствие в ФЖ цитокинов с различной функциональной активностью, их суммарный биологический эффект как в группе доно-ров-ооцитов, так и у женщин с бесплодием проявлялся в виде супрессорной и противовоспалительной активности (медианные значения ИСА 0,63-0,6 расч.ед и ИВА 0,80-0,78 расч ед). Вероятно, спектр иммуноактивных медиаторов, продуцируемых на пике стимулированной овуляции, не ограничивается панелью 17 тестированных нами цитокинов, а включает и какие-то другие дополнительные факторы (например, ТСР-р, И1-ЯА, растворимые рецепторы цитокинов - эТ^-Я I и II типа, эШ-Я II типа, 811.2-^), которые и определяют преобладающую иммуносупрессорную и противовоспалительную активность ФЖ

При сравнении женщин различающихся по супрессорному потенциалу фолликулярных факторов было установлено (табл 5), что в подгруппе с более высоким уровнем супрессорной активности ФЖ концентрация 1РМ-у, И-2, 11.-4, И-6, 11.-7 и С-СБЯ была достоверно ниже, чем в оппозитной подгруппе Причем, если уровни И-4 и 11.-6 в сравниваемых группах различались в 2 раза, то уровни 11.-2 и 1Р1Ч-у в 14 и в 6 раз, соответственно Вероятно, доминирование иммуносупрессорной активности фолликулярных факторов в данной ситуации сопряжено с более выраженным снижением ТМ цитокинов, а не с переключением на продукцию ТЬ2/противовоспа-лительных цитокинов.

Таблица 5

Уровень цитокинов (пкг/мл) в ФЖ пациенток ЭКО, оппозитных по уровню су-прессорной активности

Показатели Подгруппы женщин, различающиеся по величине ИСА«ж

ИСА >0,6 (п=18) ИСА 20,6 (п=21)

МесЛап МесКап Выраженность изменений

ИСА (расч.ед.) 0,69 0,51 "

60,0 10,0 ** 1 в 6 раз

11.-2 28,0 2,0" 1 в 14 раз

11-4 10,0 5,0* 1 в 2 раза

11-6 22,0 11,0* 1 в 2 раза

11.-7 12,0 3,0" 1 в 4 раза

в-свя 155,0 43,0" 1 в 3,6 раза

Примечания: в качестве пограничного уровня ИСА взяты медианные значения в целом по группе обследованных женщин. " - ри < 0,01, * - ри < 0,05, достоверность различий средних значений исследуемых параметров между подгруппами.

Интересно отметить, что концентрация ряда цитокинов с провоспали-тельной активностью обратно коррелировала с количеством в периферической крови супрессорных Сй4*С025* Т-клеток (уэ 11.-1 р Гб= - 0,36, р<0,05; ув Т^-а гв= - 0,35, р<0,05; ^ И-8 гэ= - 0,49, р<0,01). В то же время между количеством С04+СЭ25+ Т-клеток и уровнем 11.-4 выявлялась прямая корреляционная связь (гэ= +0,31, р<0,05) Установленный факт свидетельствует, очевидно, о сопряженности цитокин- и клеточно-опосредованных механизмов регуляции фолликулогенеза, реализуемых как на местном, так и на системном уровне. Не исключено, что циркулирующие С04*С025+Т-лимфоциты представляют только одну часть общего пула регуляторных клеток, тогда как другая их часть может быть локализована в области фолликула, где, возможно, непосредственно участвует в супрессорной реорганизации микроокружения созревающих ооцитов и в контроле над выраженностью местной воспалительной реакции

Чтобы проанализировать возможную роль выявленных цитокинов в регуляции овариальной функции, далее мы исследовали взаимосвязь между уровнем исследуемых цитокинов и такими показателями, как общее количество ооцитов (Кол_0), доля среди них ооцитов высокого качества (Кач_0) и индекс оплодотворения (Инд_Опл). Одновременно учитывался факт развития ятрогенного осложнения ЭКО в виде синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ), клинически проявляющегося наличием жидкости в перитонеальной полости и умеренным болевым синдромом. Из данных, представленных в таблице 6, видно, что в подгруппе пациенток с низким количеством полученных ооцитов (Месйап=4) концентрация 11.-2, И-4,11.-7 и в-СвЯ была достоверно ниже, чем в оппозитной группе, где среднее количество ооцитов было в 3 раза выше Можно полагать, что указанные цито-кины участвуют в инициации созревания яйцеклеток

Интересно, что схожий цитокиновый профиль ФЖ определяется и при развитии СГЯ, хотя при этом у женщин и образуется достаточное количество ооцитов (МесНап=15). Однако в этом случае помимо низкого содержания И.-2, И-4, 11.-7 и в-СЭР дополнительно регистрируется достоверное увели-

чение (примерно на 40%) уровня 11_-1|3 (с 23-25 до 34 пкг/мл) и более чем 2-кратный прирост концентрации И-13 (до 59 пкг/мл) Следует отметить, что при высоком количественном выходе ооцитов у женщин с СГЯ отмечалась отчетливая тенденция к наименьшей эффективности их оплодотворения (Инд_Опл 51,5 уй 67-68% в оппозитных группах, ри=0,19).

Таблица 6

Уровень цитокинов (пкг/мл) в ФЖ и показатели овариальной функции в подгруппах пациенток ЭКО, различающихся по количеству полученных ооцитов и

развитию синдрома гиперстимуляции яичников

Показатели Доноры ооцитов (п=7) Подгруппы пациенток ЭКО, различающиеся по количеству полученных ооцитов *> и развитию СГЯ

№1 (< 8; СГЯ"Г) п=37 №2 (>8; СГЯ"") ¡1=24 N83 (>8; СГЯ*0"") п=14

МесНап МесНап МесИап Ме£Иап

Кол О 8 4 ** 13 15

Инд Опл (%) 67 66 68 51,5

И-2 25 1,5 "1 30,3 6,0* X

11.-4 9,6 3,5 ** X 11,5 2,7 *Х

11.-13 24 23,7 26 59" Т

11.-13 23 23,7 24,9 34*|

11.-7 11 7,3 "X 11,5 5,3 *Х

с-свя 166 88 "X 194 46** X

Примечания: а) в качестве пограничного уровня взята медиана количества ооцитов, полученных у доноров ооцитов. * Ри < 0,05, ** Ри < 0,01 - достоверность различий средних значений исследуемых параметров по сравнению с подгруппой №2. Стрелками помечены достоверные различия по сравнению с донорами ооцитов.

а б

Рис. 1. Цитокиновый профиль ФЖ женщин, различающихся по качеству полученных ооцитов

А - подгруппа женщин (п=23), у которых 100% яйцеклеток, полученных на пике стимулированной овуляции, имели высокую оценку качества Б - подгруппа женщин (п=6), у которых доля качественных ооцитов не превышала 60% (тесНап= 50%) Данные представлены в виде относительной величины от среднего уровня цитокинов в ФЖ доноров ооцитов, принятого за 100%. * Ри < 0,05, ** Ри < 0,01 - достоверность различий средних значений исследуемых параметров между оппозитными подгруппами.

Известно, что патогенез СГЯ связан с избыточной продукцией провос-палительных цитокинов, отражением чего является увеличение И-1р При этом увеличение И-13, по-видимому, можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на ограничение местного воспаления, которая помимо этого приводит к снижению И-2, 11.-4, 11-7 и в-СЭР. Можно предположить, что к этому моменту процесс созревания ооцитов уже завершился, и их количество оказывается достаточным, но в условиях развивающегося цитокинового дисбаланса, по-видимому, изменяются качественные характеристики яйцеклеток, что снижает эффективность их последующего оплодотворения.

Действительно при сравнительном анализе подгрупп женщин, различающихся по качеству полученных ооцитов, было установлено (рис 1), что в группе пациенток, у которых доля качественных ооцитов не превышала 60%, выявляется глубокий дефицит цитокинов с ТМ/провоспалительной (1РЫ-у, И_-2, ТХР-а, 11_-1р, 11.-12, 11.-17), ТЬ2/противовоспалительной активностями (11.-4, И-10, И-6, 11.-13), а также ростовых факторов иммуногемопоэза (С-СБР, 11.-7) и хемокинов (М1Р-1а).

Таким образом, выраженный многокомпонентный дефицит цитокинов ассоциировался с 2-кратным снижением выхода качественных ооцитов (Кач_0 50% 100%, ри<0,01), а также с достоверным снижением индекса оплодотворения (Инд_Опл 39% уя 91%, ри<0,01). Таким образом, полноценное созревание ооцитов требует определенного уровня в микроокружении ооцитов целой системы цитокинов, в том числе 11.-2, И-4,11.-7 и в-СБЯ, участие которых в дифференцировке яйцеклетки ранее не обсуждалось. Соответственно, нарушение качественных характеристик ооцитов и уровня их оплодотворения сопряжено с многокомпонентным цитокиновым дефицитом, а не изменением какого-либо одного фактора.

Клинико-иммунологический анализ эффективности ЭКО

Важно отметить, что количество ооцитов, их качество, уровень оплодотворения являются важными параметрам, определяющими исходы ЭКО Однако, кроме того, наступление беременности зависит также от эффективности начальных этапов развития эмбриона и его успешной имплантации. В нашем исследовании все выполненные циклы ЭКО (п=81) закончились пункцией фолликулов. Однако в 5 циклах трансфер эмбрионов не состоялся в силу отсутствия оплодотворенных яйцеклеток или из-за аномального процесса их дробления. Всего наступило 32 клинические беременности, что составило в расчете на цикл и на пункцию - 39,5% (32/81), а в расчете на эмбриоперенос - 42,0% (32/76) При ретроспективном анализе женщин, различающихся по клиническому эффекту (беременность есть/нет), не было выявлено достоверных различий по среднему возрасту пациенток, а также по длительности или формам бесплодия (табл 7) Сравниваемые группы были также однородны и по медикаментозным протоколам индукции суперовуляции (данные не представлены).

Сравнительный анализ параметров овариальной функции в оппозит-ных подфуппах показал, что в группе женщин, у которых лечение бесплодия оказалось неэффективным, частота встречаемости пациенток с критически низкими показателями овариальной функции была достоверно выше

по сравнению с группой, где после проведения ЭКО наступила клиническая беременность (рис 2).

Таблица 7

Клиническая характеристика женщин с бесплодием, оппозитных по результатам ЭКО _

Беременность ЕСТЬ Беременности НЕТ

Показатели <п= 32) (п=44)

М±в.Е МесНап М±&Е МесНап

Средний возраст (лет) 31,4 ±0,7 31 34 ±0,8 34

Длительность бесплодия (лет) 6,8 ±0,7 6 7,7 ±1,0 6,5

Форма бесплодия

Первичное 31% (10/32) 34% (15/44)

Вторичное 69% (22/32) 66% (29/44)

ПУк

12,5% ■

Бпрамсщоста. ЕСТЬ

Ь^миин, ЕСТЬ Ьрмнпся нет

Рис. 2. Частота встречаемости пациенток с критически низкими показателями овариальной функции в подгруппах, оппозитных по результатам ЭКО

Видно, что частота женщин с низким количеством полученных ооцитов (Кол_0 5 4, рис 2А), а также с недостаточным содержанием среди них яйцеклеток высокого качества (Кач_0 < 60%, рис 2Б) в оппозитных группах составляла соответственно 42,5 ^ 18,7% (рТМФ=0,03) и 28,6 их 0% (Ртмф=0,006). Кроме того, в подгруппе женщин отрицательным исходом ЭКО отмечалась также тенденция к увеличению частоты случаев с низкой эффективностью оплодотворения полученных ооцитов (Инд_Опл <33%, в 22,5 уя 12,5% случаев, ртмф=0,21; рис. 2В).

Анализ показателей иммунного статуса в день забора ооцитов не выявил различий в зависимости от исхода ЭКО за исключением относительного количества С08 Т-клеток, которых было больше в группе с отсутствием беременности (28 + 1,3 ув 23,2 ± 1,6%, ри<0,05) В то же время при анализе цитокинов и биологической активности ФЖ, отражающих в большей степени состояние местного иммунитета, было показано, что отсутствие беременности сопряжено с более низким содержанием 1Ь-2, 11.-4, 11.-7, в-СЭР и М1Р-1Р в сочетании с повышенным уровнем И-8, 11.13 и более выраженной супрессорной активностью (рис. 3)

ИСАф^с*». 200 .ТЬ-2** М1Р-1**Ч \ /

Рис 3. Цитокиновый профиль ФЖ

женщин с неэффективным циклом

ЭКО (п=24)

1Ы7

1Ы2

ТШ-а

Данные представлены в виде относительной величины от среднего уровня цитокинов в ФЖ женщин (п=24), у которых наступила клиническая беременность, принятого за 100%. * Ри < 0,05, " Ри < 0,01 - достоверность различий средних значений исследуемых параметров между оппозитными подгруппами.

Ранее нами было установлено, что дефицит 11.-2, И-4, 11.-7, С-СБР и М1Р-1р ассоциирован с низким количеством и качеством созревающих ооцитов В то же время достоверных отличий в уровне И-8 и 11.-13 в подгруппах женщин, различающихся по количеству или качеству полученных ооцитов, выявлено не было Поэтому можно предположить, что повышение указанных цитокинов может ассоциироваться с нарушением ранних этапов имплантации и созревания эмбриона.

Значимость цитокинов в наступлении клинической беременности можно проиллюстрировать результатами сравнительного анализа женщин, у которых индивидуальные значения содержания цитокинов в ФЖ были выше или ниже медианного уровня Из данных таблицы 8 видно, что у женщин, у которых в ФЖ регистрируется критически низкий уровень 11.-2 (2,5 ± 0,7 пкг/мл), или 11.-4 (1,5 ± 0,2 пкг/мл), или 11.-7 (3,1 ± 0,7 пкг/мл), или (В-СвР (37,5 ± 7,8 пкг/мл), эффективность ЭКО по сравнению с оппозитной группой снижается в среднем в 4 раза (Ргмф<0,001) И, наоборот, такая же низкая частота (20-25%) наступления клинической беременности отмечается при избыточном содержании в ФЖ И-8 (59 ± 30 пкг/мл) или 11.-13 (84 ± 11,5 пкг/мл).

Частота развития беременности была также достоверно ниже в подгруппах с чрезмерно выраженной иммуносупрессорной активностью фолликулярных факторов и с количеством регуляторных С04С025 Т-клеток менее 8% Причем важно отметить, что «неблагоприятные» для наступления беременности признаки проявлялись в «сочетанном виде». Например, у женщин с низким содержанием С04+С025+ Т-клеток одновременно регистрировался дефицит 1РЫ-у, И-2, 11.-4, 11.-7, О-СБЯ и повышенный уровень И-8, И-13, а также 11.-1 р и ТЫР-а (данные не представлены).

Важность сбалансированной продукции цитокинов в микроокружении фолликула в период созревания ооцитов и на ранних этапах имплантации оплодотворенных яйцеклеток можно проиллюстрировать данными рисунка 4 Результаты частотного анализа показывают, что проградиентное уменьшение содержания в ФЖ И-2 характеризуется четким линейным трендом снижения эффективности ЭКО с 91 до 19% (рис 4А) Аналогичная, но обратная зависимость частоты развития беременности регистрируется при увеличении в ФЖ уровня 11.-8 (рис 4Б)

Таблица 8

Эффективность ЭКО в подгруппах женщин, оппозитных по уровню цитокинов в

Показатели Значения Частота развития Ртмо

Ме(Мап М±в.Е беременности

11.-2 пкг/мл а 26 30 ± 0,4 77 % (20/26) 0,0001

<26 2,5 ±0,7 18,2 % (4/22)

11.-4 пкг/мл й8 11,5 ±0,2 80 % (20/25) 0,0001

<8 1,5 ±0,2 17,4% (4/23)

11.-7 пкг/мл г 11 12,6 ±1,0 79 % (19/24) 0,0001

< 11 3,1 ±0,7 20,8 % (5/24)

в-СБЯ пкг/мл а 157 203 ±6 75 % (18/24) 0,0006

<157 37,5 ± 7,8 25 % (6/24)

И-8 пкг/мл 5 15 8,0 ±0,6 75 % (18/24) 0,0006

>15 59 ±30 25 % (6/24)

И-13 пкг/мл £26 19,5 ±1,2 71,5 % (20/28) 0,0005

>26 84± 11,5 20 % (4/20)

ИСАфж расч ед. >0,6 0,72 ± 0,01 48 % (13/27) 0,013

5 0,6 0,48 ± 0,01 18 % (6/33)

С04СИ25 Т-клетки % ¿8 12,5 ± 0,9 52% (11/21) 0,049

<8 5,0 ± 0,4 20% (3/15)

10-26 (24) 26-30(29) 11.-2 (пкг/мл)

>30(31)

—

<10 (6,6)

10-15(12) 16-25(21) 11.-8 (пкг/мл)

>26 (34)

Рис. 4. Эффективность ЭКО в подгруппах женщин, с различным уровнем 11.-2 (А) и 11.-8 (Б) в фолликулярной жидкости

Представлена частота наступления клинической беременности в подгруппах По оси абсцисс - пограничные значения концентрации цитокина в ФЖ, в скобках - медианные значения.

Прогностические критерии эффективности ЭКО

На заключительном этапе работы была проведена количественная оценка диагностической ценности исследуемых параметров в раннем прогнозе эффективности ЭКО. В итоге были выделены два комплекса признаков, наиболее информативных для прогноза неэффективного ^ успешного цикла ЭКО (табл. 9 и 10, соответственно) Видно, что низкий уровень 11.-7, И-4 и И-2, относительный дефицит С-СЭР и М1Р-1Р, чрезмерная супрес-сорная активность ФЖ, избыточная концентрация 11.-13 и И-8 имели высокую диагностическую ценность в отношении отрицательного прогноза беременности Специфичность их при этом варьировала от 83% до 95%, однако чувствительность была недостаточно высокой

Таблица 9

Комплекс диагностически значимых показателей, прогнозирующих неэффек-__тивный цикл ЭКО_

Признак Уровень ДК SN % SP% J(Sh) RR

CD4CD25 Т-кл (%) 56 -12 46 100 3,94 -27

Кач 0(%) <66 -11 24 100 3,65 -16,3

ИСА ф/ж (расч ед ) S 0,49 -8,7 39 95 2,9 -11

CD8 Т-кп (%) >32 -8,1 40 93,8 2,68 10

IL-7 ф/ж (пкг/мл) S6 -8,1 54 91,7 2,7 -13

IL-4 ф/ж (пкг/мл) s 2 -7,3 67 87,5 2,42 -14

G-CSF ф/ж (пкг/мл) 5 50 -7,3 67 87,5 2,42 -14

IL-2 ф/ж (пкг/мл) £7 -6,3 71 83,4 2,09 -12

MIP-1P ф/ж (пкг/мл) S 55 -5,2 41 87,5 1,74 -5

IL-13 ф/ж (пкг/мл) 2 40 -5,1 54 83,4 1,7 -5,9

Абс. лимфоцитоз (хЮ") >2,0 -4,2 50 81 1,39 -4,2

IL-8 ф/ж (пкг/мл) 2 25 -4,0 41 83,4 1,32 -3,6

Кол О S 4 -3,6 42,6 81,3 1,2 -3,2

Примечание: ДК - диагностический коэффициент; SN - чувствительность и SP -специфичность признака; J(Sh) - информативность по К. Шеннону, RR - показатель относительного риска Представлены ДК с отрицательными значениями в порядке убывания информативности

Те же самые цитокины, но в других диапазонах, обладали диагностической ценностью в отношении позитивного прогноза результатов ЭКО (табл. 10) Не только цитокины, но и более доступные показатели овари-альной функции и некоторые параметры иммунного статуса также имели определенную диагностическую ценность Например, высокий лимфоцитоз, повышенное содержание CD8 Т-лимфоцитов, количественный дефицит CD4CD25 Т-клеток, сниженные показатели овариальной функции с высокой вероятностью свидетельствовали о негативном прогнозе

Таблица 10

Комплекс диагностически значимых показателей, прогнозирующих наступление клинической беременности в цикле ЭКО____

Признак Уровень ДК SN % SP% J(Sh) RR

IL-4 ф/ж (пкг/мл) 28 +6,0 83 79 1,88 19

IL-7 ф/ж (пкг/мл) 2 11 +5,8 79 79 1,93 14,4

IL-2 ф/ж (пкг/мл) 2 26 +5,2 83 75 1,74 15

G-CSF ф/ж (пкг/мл) 2 157 +4,8 75 75 1,58 9

IL-8 ф/ж (пкг/мл) <15 +4,8 75 75 1,58 9

IL-13 ф/ж (пкг/мл) £26 +4,0 83 67 1,32 10 I

MIP-1B ф/ж (пкг/мл) >81 +3,6 67 71 1,19 4,9

Абс лимфоцитоз (хЮ8) £ 1,85 +3,8 71,5 70 1,25 5,8

ИСА ф/ж (расч.ед) 2 0,6 +3,0 68,5 66 1,0 4,2

Кол О >8 +2,4 65,6 62,5 0,81 3,2 I

Примечание: представлены ДК с положительными значениями в порядке убывания информативности

Таким образом, высокая информативность выделенных диагностических комплексов в прогнозе вероятного исхода ЭКО, свидетельствует, на наш взгляд, о целесообразности использования методов иммунодиагностики при проведении вспомогательных репродуктивных технологий.

ВЫВОДЫ

1 В овуляторный период физиологического менструального цикла и, особенно, на пике стимулированной суперовуляции в сыворотке и фолликулярной жидкости женщин доминируют регуляторные факторы с им-муносупрессорной и противовоспалительной активностью, что в сочетании с увеличением количества регуляторных CD4+CD25+T-лимфоцитов, снижением уровня спонтанной пролиферации МНК и увеличением в крови доли апоптотических нейтрофилов свидетельствует о супрессорной реорганизации иммунной системы.

2 В микроокружении фолликула обнаруживается широкий спектр иммуно-гемопозтических цитокинов" Th 1 /провоспалительные (IL-2, IFN-y, TNF-a, IL-1P, IL-12), П12/противовоспалительные (IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, IL-13) цитокины, хемокины (IL-8, MCP-1P, MIP-1a), ростовые факторы (GM-CSF, G-CSF), в том числе впервые выявленные IL-7 и IL-17, что указывает на их участие в регуляции фолликулогенеза

3 Наличие обратной корреляционной зависимости циркулирующих CD4*CD25* естественных супрессорных Т-клеток с концентрацией IL-1р, TNF-a, IL-8 и прямой взаимосвязи с уровнем IL-4 в ФЖ на пике стимулированной суперовуляции указывает на сопряженность цитокин- и клеточно-опосредованных механизмов регуляции фолликулогенеза

4 Снижение количества созревающих ооцитов сопряжено с низким содержанием в ФЖ IL-2, IL-4, IL-7 и G-CSF, тогда как нарушение качественных характеристик ооцитов и эффективности их оплодотворения in vitro ассоциируется с дефицитом большинства исследуемых цитокинов (IFN-y, IL-2, IL-1P, TNF-a, IL-12, IL-17, IL-б, IL-4, IL-10, IL-7, G-CSF, MIP-1p), что подтверждает значимость цитокинов в регуляции овариальной функции.

5 Уровень и спектр цитокинов в фолликулярной жидкости сопряжен не только с количеством и качеством ооцитов, но также с эффективностью имплантации эмбрионов и развитием беременности Так, в подгруппах женщин с дефицитом IL-2, IL-4, IL-7, G-CSF и с повышенным содержанием IL-8 или IL-13 эффективность ЭКО в 3-4 раза ниже, чем в оппо-зитных фуппах (20-25 vs 75-80%).

6 Для раннего прогноза исходов ЭКО выделены комплексы иммунологических параметров, характеризующиеся в определенных диапазонах значений высокой информативностью и диагностической значимостью, что указывает на целесообразность использования методов иммунодиагностики при проведении вспомогательных репродуктивных технологий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Хонина H.A., Айзикович И В., Ладыгина Е.А, Дегтярев М.А, Черных Е Р. Особенности иммунитета у женщин, страдающих бесплодием // Тез докладов Всероссийского семинара по проблемам бесплодия.- Саратов, 2001 .-С. 106.

Хонина H А, Айзикович И.В., Ладыгина Е.А, Белова А Е., Дегтярев M А., Тихонова М.А , Черных Е.Р. Роль иммунных механизмов в фолли-кулогенезе у женщин репродуктивного возраста // Актуальные вопросы современной медицины.- Новосибирск, 2002.- С. 57. Хонина H.A., Шевела Е Я , Айзикович И.В., Ладыгина Е.А., Белова А Е., Дегтярев М.А., Черных Е.Р. Биологическая активность и уровни цитоки-нов в фолликулярной жидкости у женщин со стимулированным фолли-кулогенезом // Тез докладов Международной научно-практической конференции «Цитокины Воспаление Иммунитет», С-Пб, 2001.- Цитокины и воспаление.- 2002 - Т. 1, № 2,- С. 155.

Хонина H А, Айзикович И.В., Ладыгина Е.А., Дегтярев М.А., Шевела Е Я , Тихонова М.А., Черных Е.Р. Системные и локальные проявления активной иммуносупрессии у женщин в период овуляции // Тез докладов Всероссийского семинара по проблемам бесплодия,- Екатеринбург, 2002,-С. 176-177.

Айзикович И.В., Ладыгина Е.А., Хонина Н.А, Белова А.Е., Дегтярев М.А., Шевела Е.Я., Черных Е.Р. Роль ИЛ-2 в развитии синдрома гиперстимуляции яичников II Тез докладов Всероссийского семинара по проблемам бесплодия.- Екатеринбург, 2002,- С. 4-5. Хонина H.A., Бурухина А.Н., Айзикович И.В., Ладыгина Е.А., Белова А Е., Сычева Н.В, Черных Е.Р., Пасман Н.М. Использование метода сочетанной антибактериальной и иммунокорригирующей терапии при лечении резистентных случаев урогенитапьной инфекции // Тез докладов Всероссийского семинара по проблемам бесплодия,- Екатеринбург, 2002,-С. 177-178.

Хонина H.A., Айзикович И.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Роль цитокинов в овариапьной функции // «Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты», Новосибирск: Наука, 2004,- С. 96-109.

Соискатель И.В. Айзикович

Подписано в печать 23.03.05. Формат бумаги 60x90/16. Уч.-изд. л. 1,4. Заказ 1890 .Тираж 120 экз. Ротапринт СНИИГГиМСа (лиц. ПД 12-0076). 630091, Новосибирск, Красный проспект, 67

РНБ Русский фонд

2005-4 46420

sZ N

/ í;?f \

г г дпр zoos

I' È I У »

i i s t * •

M f í / 1062

Актуальность исследования:

В настоящее время установлено, что функционирование репродуктивной системы осуществляется при тесном взаимодействии с иммунной и эндокринной системами. Происходящие во время менструального цикла и беременности изменения контролируются со стороны гипоталамо-гипофизарной системы и являются прямым результатом индуцированного гормонами тканевого ремоделирования тканей яичника и слизистой матки. Действие гормонов на клеточном уровне реализуется через вовлечение множества пептидных ростовых факторов, среди которых особая роль отводится лимфогемопоэтическим цитокинам, продуцируемым иммунокомпетентными клетками (ИКК) [19, 142, 36].

На сегодняшний день наиболее исследованными являются иммунологические аспекты, связанные с поддержанием и нормальным протеканием беременности. Эта сфера включает изучение механизмов иммунологической перестройки, направленной на подавление реактивности иммунной системы матери по отношению к аллоантигенам плода. Вместе с тем роль иммунной системы в регуляции самых ранних этапов репродуктивного процесса - фолликулогенеза, овуляции, доимплантационных этапов развития эмбриона и его имплантации, остаются существенно менее изученными [210, 42].

Одним из наиболее значимых достижений репродуктивной медицины явилась разработка и внедрение в практику лечения бесплодия методов вспомогательных репродуктивных технологий и, в частности, экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Данная процедура основана на гормональной стимуляции роста нескольких фолликулов в яичниках (стимуляция суперовуляции), пункции фолликулов и забора из них яйцеклеток, оплодотворении яйцеклеток in vitro и переносе эмбрионов в полость матки. Внедрение ЭКО повлекло за собой целую серию экспериментальных исследований на животных, посвященных иммунной регуляции овариальной функции, оплодотворения и имплантации эмбриона, а с другой стороны явилось инструментом для изучения иммунной регуляции указанных процессов у человека.

В результате стало очевидным, что прямо или опосредованно через растворимые продукты ИКК принимают активное участие в регуляции ранних стадий репродуктивного процесса. Выяснилось, что яичники не являются в строгом смысле иммунопривилегированным органом [47]. Клетки иммунной системы присутствуют в яичнике, и их количество может существенно возрастать за счет миграции рециркулирующих лейкоцитов [40, 41]. Причем многие цитокины присутствуют в фолликулярной жидкости в концентрации, существенно превышающей таковую в периферической крови, что указывает на их важность в регуляции функций яичников [189, 142]. Продуцируемые ИКК цитокины контролируют в фолликулиновую фазу созревание фолликула, стимулируя рост клеток гранулозы, но ингибируя их дифференцировку. Во время пика выброса лютеинизирующего гормона (JIT) происходит мощный приток нейтрофилов и макрофагов и секреция провоспалительных цитокинов. Именно эти механизмы лежат в основе процесса овуляции и позволяют рассматривать разрыв фолликула как воспалительный процесс, ведущую роль в котором играют IL-1, TNF-a [71, 42, 142]. Миграция лейкоцитов в яичник обеспечивается хемокинами (IL-8, МСР-1, RANTES), уровень которых контролируется гонадотропинами и цитокинами и резко возрастает к моменту овуляции [83, 190, 141]. Присутствие в фолликулярной жидкости ИКК и цитокинов указывает на их возможное участие в созревании ооцитов [150, 151, 194]. Во время лютеиновой фазы необходимым условием формирования желтого тела является неоваскуляризация. Важную роль в этом процессе играют цитокины, прямо (сосудистый эндотелиальный ростовой фактор, VEGF) или опосредованно (IL-6, TNF-a, TGF-P) стимулирующие неоангиогенез [142].

Причем наряду с активацией ангиогенеза, цитокины индуцируют дифференцировку клеток гранулозы и запуск синтеза стероидных гормонов [136]. Если беременность не наступает, Т-клетки и эозинофилы участвуют в регрессии желтого тела, оказывая прямой токсический эффект, а также привлекая макрофаги и активируя фагоцитоз поврежденных клеток [185, 142].

Наряду с регуляцией овариальной функции клетки иммунной системы и продуцируемые ими цитокины выполняют исключительно важную роль в подготовке эндометрия к имплантации эмбриона, а впоследствии - в сохранении беременности [196, 109, 170]. Значительное количество находящихся в эндометрии лимфоцитов и макрофагов являются ключевыми медиаторами ремоделирования ткани эндометрия [93]. Взаимодействие децидуальных NK клеток с аллоантигенами трофобласта (HLA-G, HLA-E) играет важную роль в успешной имплантации и плацентации. Кроме того, важной функцией плацентарных NK-клеток, макрофагов и Т-клеток является формирование и поддержание толерантности к аллоантигенам плода. Это достигается за счет преимущественной продукции иммунокомпетентными клетками ТЪ2/противовоспалительных цитокинов [181, 98, 218].

Учитывая тесную взаимосвязь иммунной и репродуктивной системы в регуляции овариальной функции, развитии эмбриона, его имплантации и сохранении беременности очевидно, что наличие исходных иммунных дисфункций, а также развитие их в процессе стимуляции овуляции может быть серьезной причиной низкого качества ооцитов; дефекта оплодотворения яйцеклетки, нарушения развития и имплантации эмбриона, и, в конечном итоге, отсутствия/потери беременности. Поэтому большой интерес представляет исследование показателей системного и локального иммунитета, а также овариальной функции в группах женщин, оппозитных по уровню фертильности, качеству эмбрионов, имплантации и клинической беременности. Исследования такого рода имеют большое практическое и теоретическое значение, поскольку, во-первых, позволяют осмыслить новые аспекты иммуно-эндокринной регуляции ранних этапов репродуктивного процесса и патогенеза бесплодия, а, во-вторых, разработать прогностические критерии эффективности вспомогательных репродуктивных технологий. Кроме того, возможно уже в скором времени полученные в этой области знания позволят разработать и внедрить в практику методы адьювантной цитокинотерапии, направленной на повышение эффективности ЭКО, результативность которой на сегодняшний день составляет по данным разных авторов от 30 до 40% [6, 175, 205].

Анализ данных литературы в указанной области свидетельствует о достаточной противоречивости полученных результатов. Целый ряд авторов отвергают возможность определения концентрации цитокинов или других иммунологических маркеров в качестве прогностического критерия эффективности ЭКО. Так, Geva Е. с соавт. показали отсутствие корреляции между концентрацией IL-10 в фолликулярной жидкости (ФЖ) и количеством ооцитов, уровнем оплодотворения, качеством эмбрионов и наступлением беременности при проведении ЭКО [88]. Отсутствие достоверных различий в группах женщин, оппозитных по наступлению беременности, продемонстрировано также в отношении содержания в ФЖ иммуноглобулинов, IL-6, IL-8, GM-CSF, фактора роста фибробластов (FGF) и молекулы адгезии sICAM-1 [91, 90, 86]. Ozornec М.Н. с соавт. исследовали содержание в ФЖ LIF и показали сходный уровень данного цитокина у женщин с наличием и отсутствием беременности [174]. К аналогичному заключению пришли авторы, изучающие в ФЖ IL-2 и его растворимые рецепторы (sIL-2R). Им не удалось выявить какой-либо связи между концентрацией IL-2 и sIL-2R с уровнем фертилизации, качеством эмбрионов и наступлением беременности [30].

С другой стороны имеются данные о достоверных различиях в уровне отдельных цитокинов в ФЖ в группах женщин, оппозитных по исходу ЭКО.

Так, продемонстрировано, что отсутствие беременности на циклах ЭКО сопряжено с наличием в ФЖ определяемого уровня IL-12 [86] и более высокого содержания VEGF [77]. В свою очередь наступление беременности ассоциируется с нарастанием в ФЖ M-CSF на фоне стимуляции гонадотропинами [166], а также более высоким содержанием фактора роста стволовых клеток [201] и TGF-j31 [78]. Наиболее противоречивые данные получены в отношении IL-1. В литературе имеются данные как о положительной ассоциации между высоким уровнем IL-1{3 в момент забора яйцеклетки и успешной имплантацией эмбрионов [111], так и отрицательной ассоциации IL-1{3 с наступлением беременности [151], или же отсутствием корреляционной связи между концентрацией IL-1 J3 и уровнем оплодотворения яйцеклетки [32].

Следует отметить, что некоторые системные параметры иммунитета, включая концентрацию сывороточных цитокинов и количество отдельных субпопуляций ИКК, также могут различаться в группах женщин с наступившей и не наступившей/прервавшейся беременностью. Например, при проведении ЭКО численность активированных NK-клеток (CD56dimCD 16+CD69+) в периферической крови женщин с наступившей беременностью оказалась достоверно ниже, чем в группе с отсутствием беременности [220], а повышенный уровень в сыворотке IFN-y и растворимых рецепторов к IL-2 на 11 день после переноса эмбрионов был сопряжен с ранним прерыванием беременности [73].

Что касается качества эмбрионов, то оцениваемый морфологически данный критерий является одним из основных и наиболее прогностически ценных параметров при проведении ЭКО. Тем не менее, морфологическая оценка эмбрионов перед переносом, хотя и позволяет проводить их раннюю селекцию, не является фактором прогноза успешной беременности [7, 13].

Из представленных выше данных следует, что только небольшое количество иммунологических параметров достоверно различается в зависимости от исхода ЭКО. Однако даже эти маркеры не охарактеризованы с точки зрения информативности. Многие цитокины, в частности, хемокины (МСР-1, М1Р-1Ь) и лимфокины (IL-4, IL-7, IL-13, IL-17), которые были недавно выявлены в ФЖ [42, 228], не исследованы соотносительно их прогностической ценности при различных исходах ЭКО. В литературе также полностью отсутствуют сведения о количественных изменениях естественных супрессорных клеток при различных исходах ЭКО. Между тем не исключено, что данный тип клеток наряду с цитокин-опосредованной супрессией играет важную роль в развитии периферической толерантности, в том числе к аллоантигенам плода. Количество супрессорных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+ увеличено при физиологической беременности [16]. В то же время сведения об участии этих клеток в регуляции самых ранних этапах репродуктивного процесса отсутствуют.

Таким образом, несмотря на достаточно интенсивные исследования в области иммунной регуляции начальных этапов репродуктивного процесса, пригодные для прогноза ЭКО иммунологические маркеры (включающие показатели иммунитета на системном и локальном уровне) до сих пор не определены. Исходя из этого, была сформулирована цель настоящего исследования:

Цель исследования:

На основе комплексного анализа иммунологических параметров, а также показателей овариальной функции изучить возможность раннего прогноза развития беременности у женщин с бесплодием при проведении экстракорпорального оплодотворения.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить особенности иммунитета женщин на различных этапах овариального цикла при его физиологическом течении и в условиях проведения контролируемой стимуляции по программе ЭКО.

2. Провести комплексный анализ уровня 17 цитокинов в фолликулярной жидкости на пике стимулированной суперовуляции и оценить роль цитокинов в процессе созревания ооцитов.

3. Провести сравнительный анализ иммунологических параметров и показателей овариальной функции женщин в зависимости от эффективности ЭКО.

4. Проанализировать информативность и прогностическую значимость показателей иммунитета и овариальной функции в оценке эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО.

Научная новизна

Впервые установлено, что в овуляторный период физиологического менструального цикла, и, особенно, на пике стимулированной суперовуляции в сыворотке женщин доминируют медиаторы с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью. Сдвиг баланса регистрируется как на системном, так и на местном (в фолликулярной жидкости) уровне, что в сочетании с увеличением количества регуляторных CD4+CD25+T-лимфоцитов, снижением уровня спонтанной пролиферации МНК и увеличением в крови доли апоптотических нейтрофилов свидетельствует о супрессорной реорганизации иммунной системы на пике суперовуляции.

В результате комплексной оценки уровня 17 цитокинов впервые охарактеризован цитокиновый профиль микроокружения фолликула в период стимулированной суперовуляции, что позволило получить новые данные о роли цитокинов в процессе созревания ооцитов. При этом впервые показано, что на фоне пониженного уровня IL-2, IL-4, IL-7 и G-CSF происходит 2-кратное снижение общего количества образующихся ооцитов, тогда как в условиях многокомпонентного дефицита Thl/провоспалительных (IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-lp, IL-12, IL-17) и ^/противовоспалительных (IL-4, IL-10, IL-6, IL-13) цитокинов, а также ростовых факторов (G-CSF, IL-7) и хемокинов (М1Р-1а) нарушаются их качественные характеристики, и как следствие - эффективность оплодотворения in vitro. При ретроспективном анализе результатов лечения бесплодия методом ЭКО впервые показано, что уровень цитокинов в микроокружении фолликула не только во многом определяет количество и качество созревающих ооцитов, но также имеет большое значение для имплантации оплодотворенных яйцеклеток. Так, у женщин с низким содержанием IL-2, IL-4, IL-7 или G-CSF, а также в подгруппах женщин с повышенным содержанием IL-8 или IL-13 частота наступления беременности в цикле ЭКО составляла в среднем 20% (от 17,4 ф до 25%), т.е. в 3-4 раза ниже, чем в оппозитных подгруппах, где эффективность ЭКО достигала 75-80%.

Практическая значимость

Использование методов математического анализа позволило выделить диагностически значимые диапазоны параметров иммунного статуса, цитокинового профиля ФЖ, а также показателей овариальной функции, которые характеризовались высокой информативностью в раннем прогнозе эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО. В диагностический комплекс, который позволяет прогнозировать успешное развитие беременности в цикле ЭКО, были включены 10 клинико-иммунологических показателей, диагностические коэффициенты (ДК) которых варьировали от +2,4 до +6,0. Диагностический комплекс, прогнозирующий вероятность неэффективного цикла ЭКО, включал 13 показателей с ДК от -3,6 до -12,0. Высокая прогностическая ценность выделенных комплексов признаков указывает на целесообразность использования методов иммунодиагностики при проведении вспомогательных репродуктивных технологий.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования внедрены в практику работы отделения ЭКО медицинского центра «Авиценна» г. Новосибирска.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В овуляторный период менструального цикла, особенно на пике контролируемой суперовуляции по программе ЭКО, в сыворотке и в фолликулярной жидкости женщин выявляется преобладающая активность регуляторных факторов с иммуносупрессорным/противовоспалительным действием.

2. Иммунная система через цитокин-опосредованные механизмы принимает участие в регуляции процесса созревания ооцитов, при этом спектр и уровень цитокинов, продуцируемых в микроокружении фолликула, определяет не только общее количество и качественные характеристики созревающих ооцитов, но также эффективность последующей имплантации оплодотворенных яйцеклеток в цикле ЭКО.

3. Комплексная оценка параметров иммунного статуса, уровня цитокинов в фолликулярной жидкости, а также показателей овариальной функции женщин, обследованных на этапе стимулированной суперовуляции, позволяет прогнозировать вероятную эффективность лечения бесплодия с помощью ЭКО.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 119 страницах машинописного текста, включающего 29 таблиц и 7 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 242 литературных источника, в том числе, 225 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. В овуляторный период физиологического менструального цикла и, особенно, на пике стимулированной суперовуляции в сыворотке и фолликулярной жидкости женщин доминируют регуляторные факторы с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью, что в сочетании с увеличением количества регуляторных CD4+CD25+T-лимфоцитов, снижением уровня спонтанной пролиферации МНК и увеличением в крови доли апоптотических нейтрофилов свидетельствует о супрессорной реорганизации иммунной системы.

2. В микроокружении фолликула обнаруживается широкий спектр иммуногемопоэтических цитокинов: Thl/провоспалительные (IL-2, IFN-y, TNF-a, IL-1 (В, IL-12), Т112/противовоспалительные (IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, IL-13) цитокины, хемокины (IL-8, MCP-1(3, MlP-la), ростовые факторы (GM-CSF, G-CSF), в том числе впервые выявленные IL-7 и IL-17, что указывает на их участие в регуляции фолликулогенеза.

3. Наличие обратной корреляционной зависимости циркулирующих CD4+CD25+ естественных супрессорных Т-клеток с концентрацией IL-ip, TNF-a, IL-8 и прямой взаимосвязи с уровнем IL-4 в ФЖ на пике стимулированной суперовуляции указывает на сопряженность цитокин- и клеточно-опосредованных механизмов регуляции фолликулогенеза.

4. Снижение количества созревающих ооцитов сопряжено с низким содержанием в ФЖ IL-2, IL-4, IL-7 и G-CSF, тогда как нарушение качественных характеристик ооцитов и эффективности их оплодотворения in vitro ассоциируется с дефицитом большинства исследуемых цитокинов (IFN-y, IL-2, IL-lp, TNF-a, IL-12, IL-17, IL-6, IL-4,

IL-10, IL-7, G-CSF, MIP-1J3), что подтверждает значимость цитокинов в регуляции овариальной функции.

5. Уровень и спектр цитокинов в фолликулярной жидкости сопряжен не только с количеством и качеством ооцитов, но также с эффективностью имплантации эмбрионов и развитием беременности. Так, в подгруппах женщин с дефицитом IL-2, IL-4, IL-7, G-CSF и с повышенным содержанием IL-8 или IL-13 эффективность ЭКО в 3-4 раза ниже, чем в оппозитных группах (20-25 vs 75-80%).

6. Для раннего прогноза исходов ЭКО выделены комплексы иммунологических параметров, характеризующиеся в определенных диапазонах значений высокой информативностью и диагностической значимостью, что указывает на целесообразность использования методов иммунодиагностики при проведении вспомогательных репродуктивных технологий.