Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Характеристика противовирусного иммунитета у больных хроническим вирусным гепатитом C

На правах рукописи

СУХИНА Ирина Александровна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТИВОВИРУСНОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С

14.00.46 — клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор

Цыган Василий Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор

Рахманова Аза Гасановна

доктор медицинских наук

Митин Юрий Алексеевич

Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова МЗ РФ

Защита состоится 26 февраля 2004 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01. при ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, д.4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России

Автореферат разослан "_" января 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук доцент

Алексанин С.С.

2004-4 27570

Актуальность проблемы. В мире проживает, как минимум, 500 млн человек, инфицированных вирусом гепатита С (ИСУ) (Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999). Особенностью ИСУ-инфекции является ее преимущественно бессимптомное течение. Персистенция вируса гепатита С может длится многие годы, приводя к развитию хронического гепатита С (>85%), цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%) (МгаДИез Р., Тгеро С, 2000). Частота формирования хронической патологии печени, вызванной ИСУ, по крайней мере, в 10 раз выше, чем при вирусном гепатите В.

ИСУ присуща высокая скорость мутаций. Наиболее лабильны гены, кодирующие поверхностные антигены вируса, являющиеся основной мишенью иммунной атаки. Благодаря этому, вирус существует в организме инфицированных как популяция генетически близких, но иммунологиче-ски разграничиваемых вариантов - квазивидов (Соринсон С.Н. и др., 1999).

Углубленное изучение гистопатологических, клинических и иммунологических особенностей хронической ИСУ-инфекции показало, что в патогенезе поражений печени, помимо прямого цитопатического эффекта вируса, могут играть роль и иммунные механизмы. Появились многочисленные свидетельства того, что иммунные реакции, возникающие при длительной персистенции ИСУ, могут привести к появлению органоспецифи-ческих и неспецифических аутоантител, с последующим развитием внепе-ченочных проявлений хронической ИСУ-инфекции. Кроме того, оказалось, что ИСУ - не только гепатотропный, но и лимфотропный вирус. Описана его репликация в мононуклеарных клетках крови, которая может служить постоянным стимулом активации Т- и В- лимфоцитов, приводя к образованию аутоантител и циркуляции иммунных комплексов (Игнатова Т.М. и др., 1998; Лесняк О.М., 1999).

Эффективность и тип иммунного реагирования на различные инфекционные агенты определяются активностью клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Развитие иммунного ответа регулируется через продукцию регуляторных молекул - цитокинов, синтез которых осуществляется иммунокомпетентными клетками, в частности, Т-хелперами 1-го и 2-го типов. Ведущая роль в осуществлении противовирусного иммунитета отводится Т-клеточному иммунному ответу, но из-за низкой иммуногенно-сти вируса гепатита С наблюдается слабая Т-клеточная реакция (Николаева Л.И. и др., 1999). Процессы хронизации при гепатите С (ГС) также связывают с формированием гуморального иммунного ответа (КоЬазЫ К. й а1., 1998; Озпа N. й а1., 1997), который развивается при доминирующем влиянии Т-хелперов 2-го типа.

Результаты оценки иммунного статуса различных контингентов, инфицированных НСУ, весьма противоречивы Дальнд^уттее, изутение, иммунного ответа при различных формах |Г{^<атмДО0НДОкНОДв>ективные

I БИБЛИОТЕКА Г 1 СПет*р£ург фЯ} ! ОЭ УйПшжгМ \

ВВЕДЕНИЕ

методы коррекции системы зашиты инфицированных, повысит результативность лечения.

Цель исследования: На основании комплексного клинико-иммунологического обследования дать характеристику противовирусного иммунитета у больных хроническим вирусным гепатитом С (ХГС), оценить диагностическую значимость иммунологических показателей при хроническом гепатите С.

Задачи исследования:

1. Выявить нарушения со стороны различных звеньев иммунитета при хроническом гепатите С.

2. Провести сравнительный анализ показателей Т-клеточного, В-клеточного и врожденного иммунитета между больными ХГС и здоровыми лицами, а также между группами больных с различными генотипами ИСУ, степенью активности хронического гепатита (ХГ), степенью фиброза.

3. Установить степень корреляционных взаимосвязей между иммунологическими и клиническими показателями при хроническом гепатите С.

4. Разработать предложения по иммунологическому обследованию больных хроническим вирусным гепатитом С.

Научная новизна.

У больных ХГС проведено углубленное комплексное иммунологическое исследование с помошью таких высокочувствительных современных методов исследования как проточная цитометрия и иммунофермент-ный анализ. Проведен корреляционный анализ между клиническими и иммунологическими показателями.

Впервые изучено содержание Т-киллеров (С03+С056+), естественных киллеров, экспрессирующих молекулу СБ8 (СВЗ"С08+), Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы активации СБ25 и ИЬЛ-ВЯ, подклассов ^О, компонентов системы комплемента и низкомолекулярных иммунных комплексов в периферической крови больных ХГС, что позволяет уточнить иммунопатогенез заболевания.

Было проведено сравнение иммунологических показателей между группами больных ХГС с различными генотипами ИСУ, степенью активности патологического процесса, степенью фиброза.

Практическая значимость.

На основе исследуемого материала рекомендовано определение иммунологических показателей, которые могут служить дополнительными информативными критериями, позволяющими дифференцировать субтипы ИСУ За и 1Ь, а также судить о степени активности патологического про-

цесса в печени и степени фиброза, что поможет практическому врачу выбрать правильную стратегию лечения

Основные положения, выносимые на защиту.

1. У больных ХГС, в целом, иммунный ответ характеризуется увеличением количества В-клеток, экспрессирующих HLA-DR, повышением уровней сывороточных IgM, IgA и низкомолекулярных ЦИК при отсутствии характерных изменений со стороны субпопуляций Т-клеток, что свидетельствует об отклонении иммунного ответа почти у половины больных (48,5%) ХГС в сторону ^2. Нарушение цитокиновой регуляции иммунного ответа у пациентов с ХГС проявляется в гиперпродукции провоспалительных ци-токинов ИЛ- 1Р, ИЛ-8 и недостаточной продукции ИЛ-2.

2. Изменения некоторых иммунологических показателей при сравнении отдельных подгрупп пациентов с ХГС, различающихся по субтипам HCV, активности патологического процесса в печени и выраженности фиброза могут служить дополнительными критериями позволяющими дифференцировать субтипы HCV 1Ь и За, а также ориентировочно прогнозировать степень активности патологического процесса в печени и стадию хронического гепатита.

Апробация и реализация работы. Материалы диссертации доложены на 4-й научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000» (Санкт-Петербург, 23-25 мая 2000), 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 26-27 апреля 2001), 5-й научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 21-24 мая 2001), Всероссийской научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения профессора Н.К.Розенберга и 105-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 17-18 октября 2001), 6-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург, 20-23 мая 2002), 1-й съезд военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ (Санкт-Петербург, 2628 ноября 2002), научной конференции и 7-м съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 5-6 декабря 2002), 7-го Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 23-26 июня 2003).

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 222 источ-

ника, в том числе 44 отечественных и 178 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 31 таблицами и 9 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящее клинико-лабораторное и иммунологическое исследование выполнено в 1996-2001 г.г. в Санкт-Петербурге на кафедре инфекционных болезней (начальник кафедры - Главный инфекционист МО РФ, кандидат медицинских наук, доцент, полковник м/с В.М. Волжанин) и НИЛ-иммунологии кафедры гематологии и клинической иммунологии Военно-медицинской академии (начальник НИЛ иммунологии - доктор медицинских наук, профессор В.Н. Цыган).

Под наблюдением находились 196 человек с хронической HCV-инфекцией. Подавляющее большинство обследованных являлись лицами мужского пола: 176 мужчин (89,8%) и 20 женщин (10,2%). Возраст больных колебался от 15 до 45 лет и составил в среднем 23±О,5 года. Большинство пациентов (80%) были жителями Санкт-Петербурга, Ленинградской области и Северо-Западного региона России. Остальные пациенты проживали в других областях страны. Большая часть обследованных была представлена военнослужащими РФ (90%) и меньшая часть - гражданскими лицами (10%).

Контрольную группу составляли здоровые лица у которых отсутствовали любые клинико-лабораторные и морфологические признаки поражения печени, а также соматические заболевания. Все лица, вошедшие в контрольную группу, являлись военнослужащими мужского пола и проживали в Санкт-Петербурге, Ленинградской области или Северо-Западном регионе России. Их возраст находился в пределах от 18-40 лет и составил в среднем 22±0,4 года.

Таким образом, группа больных ХГС и группа здоровых лиц были сопоставимы по возрасту, условиям питания, быта и трудовой деятельности.

Диагноз ХГС был доказан обнаружением у пациентов суммарных антител к ВГС (анти-HCV) и по данным биопсии печени.

Комплексное иммунологическое исследование крови включало в себя определение показателей клеточного (СБЗ, СОЗ+СЕ)4+, С03+С08+, С03+С047С03+С08+, С03+С05б\ СБЗ+С025*, СОЗ+НЬА-БК+, РТМЛ-тест, тест-ЕРОК) и гуморального (СБ 19, СБЗ"С025+, С19+НЬА-ОЯ\ 1ёЕ, ^М, IgA, 1,-2,-3,-4, ЦИК) иммунитета, а также факторов неспеци-

фической защиты организма НСТ-тест, ЛКТ, СЗ,

С4, С5,СЗа,С5а, ингС1, суммарныйИФН, ИФН-а,ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-1 р, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-6).

Изучение количественного состава субпопуляций лимфоцитов в периферической крови выполнялось на проточном цитометре Facscan фирмы "Becton Dickinson" (США) с использованием тройных комбинаций прямых моноклональных антител (CD4/CD8/CD3, CD3/HLA-DR/CD19, CD56/CD3, CD25/CD3) и изотопических контролей (CD45/CD14, IgGl/IgG2) той же фирмы.

Сывороточные иммуноглобулины класса IgE и подклассов IgG (IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4), компоненты системы комплемента С1-инг, СЗ, СЗа, С4, С5 и С5а, а также цитокины ИФН- а.ФНО- а и ИЛ-6 определяли методом ИФА с использованием отечественных диагностикумов ООО "Стибиум плюс", ЗАО "Вектор-Бест-Балтика" и зарубежных коммерческих тест-систем «Boehringer Mannheim» (Австрия). Определение сывороточных иммуноглобулинов классов М, G и А проводили методом простой радиальной иммунодифузии по G.Mancini et al. (1965). РТМЛ-тест с Т-клеточными митогенами фитогемагглютинином (ФГА) и конканавалином А (Кон А) проводили по методике Дж. Бендиксен и соавт. (1980) в модификации В.Г.Морозова и В.Х.Хавинсона (1980). Реакцию розеткообразо-вания с эритроцитами барана (тест-Е-РОК) проводили по методике ferman et al. (1976), Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. (1981) и Jondal et al. (1972), Sho-hat, Joshua (1982). Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводили методом, предложенным Ю.А.Гриневичем и А.Н.Алферовым (1981). Определение параметров фагоцитарной реакции нейтрофилов крови проводили по методу Васильева Н.В. с соавт., (1972) в модификации В.Г.Морозова и В.Х.Хавинсона (1980). Суммарный ИФН, ИФН- и ИФН- в сыворотке крови определяли методом количественной гемадсорбции по Н.Б.Финтеру (1964) в модификации О.А.Аксенова (1987) совместно с лабораторией СПНИИ детских инфекций (рук. лабор. -док.мед.наук проф. ОААксенов.). Определение ИЛ-1 р, -2, -8 в сыворотке крови, их спонтанную и индуцированную продукцию в клеточной культуре проводили с использованием отечественных диагностикумов (ТОО «Цитокин», «Протеиновый контур») совместно с лабораторией ГосНИИ ОЧБ (руклабор. - док.мед.наук проф. А.С.Симбирцев).

Кроме того, проводились дополнительные исследования крови на специфические маркеры вирусного гепатита С в ИФА, молекулярно-биологические исследования крови с использованием ПЦР и последующим генотипированием вируса ГС, пункционная биопсия печени, общеклинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, клинический осмотр больного по органам и системам, УЗИ органов брюшной полости. На основании молекулярно-генетического и морфологического обследования больные с хронической HCV-инфекцией были разделены на группы по: 1) генотипу HCV; 2) активности патологического процесса в печени; 3) стадии хронического гепатита.

Большинство серологических и все молекулярно-биологические исследования осуществлялись совместно с лабораторией вирусных гепатитов

СПНИИЭМ имени Пастера (руководитель лаборатории - доктор медицинских наук, профессор С.Л. Мукомолов).

Клинический осмотр больных, УЗИ органов брюшной полости, общеклиническое и биохимическое исследование крови, пункционная биопсия печени проводились совместно с кафедрой инфекционных болезней ВМедА (зам. нач.кафедры по клинич. работе, док. мед. наук К.В.Жданов и канд. мед. наук Д.А.Гусев). Для оценки активности и стадии патологического процесса в печени использовался индекс гистологической активности (ИГА), предложенный R.G.Knodell и соавт. в 1981 г.

Исходные данные накапливались и подвергались статистической обработке на персональном компьютере Pentium II с помощью пакета прикладных программ Exel для Windows (Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., 2000). При этом использовались следующие математико-статистические методы: расчет числовых характеристик иммунологических показателей; оценка значимости различий средних значений показателей с помощью t-критерия Стьюдента; корреляционный анализ для оценки направления, силы и значимости корреляционной связи между различными признаками, а также с целью отбора наиболее информативных из них.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На основании морфологического исследования гепатобиоптатов, обследованных пациентов с ХГС в большинстве случаев можно было рассматривать как больных гепатитом со слабовыраженной (реже минимальной) степенью активности патологического процесса в печени и со слабо-выраженным или умеренным фиброзом. У большинства обследованных больных ХГС (87%) отсутствовали субъективные клинические признаки вирусного гепатита. Наибольшее количество составили больные хроническим гепатитом С с предполагаемой длительностью инфицирования до двух лет (74%).

Для оценки Т-клеточного иммунитета, играющего главную роль в элиминации вируса при внутриклеточной инфекции, определяли содержание субпопуляций Т- клеток и их функциональное состояние.

Сравнительный анализ средних значений относительного содержания популяций Т-лимфоцитов (CD3, CD3+CD4\ CD3+CD8+, CD3+CD56+) в периферической крови и CD3+CD4+/CD3+CD8+ не показал достоверных отличий (р>0,05) этих показателей Т-клеточного иммунитета между группой больных ХГС и группой здоровых лиц. Тем не менее, заслуживает внимание повышение относительного числа Т-хелперов (CD3+CD4+) у 13% больных ХГС, а также понижение ЦТЛ (СОЗ^СОв*) и Т-киллеров (CD3*CD56+) - у 16% и 13%, соответственно. Полученные данные не согласуются с литературными, где сообщается о снижении количества CD3,

CD4, повышении CD8 лимфоцитов и о значительном снижении отношения CD4/CD8 у больных ХГС (Маммаев С.Н., 2001).

Оценка функционального состояния Т-клеток проводилась с помо-шью определения активационных маркеров - CD25 ( а-цепь рецептора для ИЛ-2) и НЬА^Я на поверхности Т-лимфоцитов.

Исследования показали, что относительное содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих как молекулу CD25, так и HLA-DR находилось в пределах нормы у 71% больных ХГС. Заслуживает внимание повышение уровня Т-лимфоцитов (возможно, Т-хелперов), экспрессирующих CD25 у 19% больных и ША^Я - у 16%. Средние значения этих показателей у больных ХГС и у здоровых не имели статистически значимых различий (р>0,05). Проведенный корреляционный анализ между общим количеством лимфоцитов, экспрессирующих CD25 и HLA-DR с одной стороны и субпопуляциями Т-лимфоцитов с другой не выявил достоверных связей (р>0,05). Полученные данные противоречат литературным, в которых сообщается о повышении количества Т-лимфоцитов, несущих ША^Я-антиген у пациентов с ХГС, имеющих невысокую степень активности ХГ (Никитин И.Г. и др., 1999).

Таким образом, для большинства обследованных больных ХГС характерно нормальное содержание субпопуляций Т-клеток и Т-клеток, экс-прессирующих активационные молекулы CD25 и HLA-DR, что может свидетельствовать о нарушениях процесса активации Т-клеток и неадекватности Т-клеточного ответа на вирус у больных ХГС.

Для изучения В-клеточного иммунитета определяли следующие показатели: CD19 - пан В-клеточный маркер; маркеры активированных В-лимфоцитов - HLA-DR и CD25; иммуноглобулины класса Е, М, A, в и подкласса в ^в4); циркулирующие иммунные ком-

плексы (ЦИК).

Исследование показало, что средние значения относительного содержания CD 19 у больных ХГС (11,9+0,9%) были недостоверно (р>0,05) выше по сравнению со здоровыми (10,1+0,95%). Фактически каждый четвертый больной (26%) имел повышенное относительное содержание CD19 лимфоцитов. Эти данные не совсем согласуются с литературными, в которых сообщается о повышеннии экспрессии антигена CD19 у большинства больных ХГС (Маммаев С.Н., 2001).

Определение активационных молекул на поверхности В-лимфоцитов, показало, что повышение относительного содержания (В-клетки) наблюдалось у 48,5%, т. е. почти у половины больных ХГС (рис. 1).

Рис. 1. Распределение больных ХГС по количеству В-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR (CD3"HLA-DR+).

Средние значения относительного содержания CD3"HLA-DR+ лимфоцитов у больных ХГС (12,8±1,04%) были достоверно выше (р<0,01), чем у здоровых (8,95±0,7%). Кроме того, проведенный корреляционный анализ между общим количеством лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR и содержанием В-лимфоцитов (CD 19) выявил прямую сильную связь (г=0,83;р<0,001).

Известно, что повышение экспрессии В-лимфоцитами молекулы HLA-DR происходит на стадии представления ими антигена Т-хелперу для распознавания. Представляя антиген, В-клетки стимулируют Т-хелперы к дифференцировке в ТЬ2-клетки, вырабатывающие цитокины необходимые для дальнейшего развития В-клеток (Хаитов P.M. и др., 2000; Ярилин А.А., 1999). При очень низкой концентрации антигена В-клетки служат наиболее эффективными АПК, поскольку другие типы антигенпредставляющих клеток не могут захватить достаточное для представления количество антигенного материала (Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., 2000).

Определение вирусной нагрузки у 24 пациентов с хронической HCV-инфекцией, показало, что 20 (83%) человек из них имели низкую вирусную нагрузку (<2*106 копий/мл) и только 4 (17%) человека - высокую (>2*106 копий/мл). Низкая вирусная нагрузка и повышенное количество В-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR, могут свидетельствовать о том, что при ХГС, возможно, роль АПК берут на себя В-клетки, "склоняя" тем самым Т-хелперы на свою сторону. Таким образом, проведенные исследования согласуются с литературные данными, в которых сообщается об отклонении иммунного ответа при хроническом гепатите С в сторону Th2 (Kobayashi К. et al., 1998; Osna N. et al., 1997).

Определение другого активационного маркера - CD25 на поверхности В клеток показало, что средние значения относительного содержания CD3"CD25+., хотя и были несколько выше у пациентов с ХГС (2,45±0,27%), достоверных отличий по сравнению с группой здоровых лиц (1,9±0,15%) не имели. Заслуживает внимание тот факт, что повышение относительного

количества CD3*CD25+ наблюдалось у 31% больных ХГС. Проведенный корреляционный анализ между общим количеством лимфоцитов, экспрес-сирующих CD25 и содержанием В-лимфоцитов (CD19) выявил прямую средней силы связь (г=0,45; р<0,05).

Полученные данные показывают, что, по крайней мере, у 31% больных ХГС В-лимфоциты находятся в активированном состоянии, что также подтверждает развитие Th2 ответа, неэффективного при элиминации вирусного патогена.

Определение концентраций основных классов иммуноглобулинов Е, М, A, G и подклассов IgG (IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4) в сыворотке крови показало, что различия у сравниваемых групп имели средние значения уровней IgM (0,96+0,01 г/л - у больных ХГС и 0,81±0,04г/л - у здоровых; р<0,01) и IgA (2,8±0,05г/л - у больных ХГС и 2,4+0,14г/л - у здоровых; р<0,05) в сторону достоверного повышения у больных ХГС. Средние значения концентрации IgG у больных (13,8+0,18 г/л) были недостоверно (р>0,05) выше, чем у здоровых (12,7+0,33 г/л). Эти данные также косвенно указывают на активацию гуморального иммунитета у больных ХГС. А преобладание продукции IgM, являющегося «ранним» антителом более низкой аффинности (Ярилин А.А., 1997) может свидетельствовать о сниженной эффективности нейтрализации вирусных антигенов во внеклеточной среде. Средние значения уровней IgE, IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 у больных ХГС и здоровых лиц достоверных различий не имели. Тем не менее, заслуживает внимание повышение концентрации IgG3 у 16%, a IgG4 у 10,5% больных.

Определение высокомолекулярных, среднемолекулярных и низкомолекулярных иммунных комплексов показало, что в сыворотке больных ХГС достоверно (р<0,01) повышается уровень низкомолекулярных иммунных комплексов (186+7,0отн.ед. - у больных ХГС и 156+7,4отн.ед. - у здоровых). Известно, что низкомолекулярные ИК могут избегать захвата фагоцитами, т.к. менее эффективно фиксируют комплемент и, за счет этого, хуже связываются с рецепторами для комплемента на мембранах эритроцитов. В результате, они способны циркулировать в крови более длительное время и образовывать депозиты под эндотелием сосудов, так как в отличие от крупных могут проходить сквозь базальную мембрану (Фрейд-лин И.С., Кузнецова С.А., 1999). Поэтому, выявленное повышение уровня низкомолекулярных ИК в сыворотке больных ХГС может быть показателем предрасположенности этой категории больных к развитию иммунопатологических реакций, что согласуется с литературными данными об ассоциации HCV-инфекции с рядом аутоиммунных заболеваний (Лесняк О.М., 1999).

Для оценки врожденного иммунитета определяли содержание естественных киллеров и оценивали функциональную активность нейтрофилов, определяли уровень компонентов системы комплемента и цитокинов.

Исследования показали, что средние значения относительного содержания CD3"CD56+ были недостоверно (9,5+0,9% - у больных ХГС и 12,2+0,04% - у здоровых; р>0,05), а CD3CD8* достоверно (р<0,01) ниже у больных ХГС (4,4+0,45% - у больных ХГС и 7,1 ±0,9% - у здоровых). Пониженное относительное содержание CD3"CD56+ и CD3"CD8+ наблюдалось, соответственно, у 26% и 32% больных. Таким образом, изучение системы естественных киллеров показало, что у больных ХГС отмечается снижение количества NK-клеток, что согласуется с литературными данными (Маммаев С.Н., 2001). Из этого следует, что у больных ХГС могут быть угнетены реакции АЗКЦ и снижена эффективность киллинга инфицированных клеток, утративших молекулы МНС I класса, что способствует распространению инфекции. Тем не менее, уменьшение числа естественных киллеров может быть также связано с их миграцией в печень.

Другими клеточными факторами неспецифической резистентности являются нейтрофилы. Их роль в противовирусном иммунитете сводится к участию в модуляции иммунных реакций через синтез и продукцию имму-номодуляторных цитокинов. Изучая нарушение функциональной активности нейтрофилов, можно выявить влияние вирусов на их функциональность и оценить устойчивость организма к бактериальной инфекции (То-толян А.А., Фрейдлин И.С., 2000).

Поглотительная способность нейтрофилов оценивалась по фагоцитарному показателю (ФП) и фагоцитарному числу (ФЧ). Для оценки переваривающей функции использовали показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ). Кислородзависимый киллинг микроорганизмов оценивали по НСТ-тесту, а кислороднезависимый - по ЛКТ.

В результате исследований было установлено, что средние значения ФП у больных ХГС были достоверно (р<0,05) выше, а ПЗФ - достоверно (р<0,05) ниже, чем у здоровых. Повышенная поглотительная активность нейтрофилов может указывать и на повышение их миграционной активности, т.к. поглощение является одной из форм клеточного движения (Тото-лян А.А., Фрейдлин И.С., 2000).

Сравнительный анализ средних значений НСТ-теста и ЛКТ между группой больных ХГС и группой здоровых лиц не выявил достоверных различий (р>0,05).

Таким образом, изучение функциональной активности нейтрофилов показало незначительное усиление поглотительной и миграционной способности нейтрофилов, но при этом угнетение переваривающей функции. Тем не менее, выраженных нарушений в кислородзависимых и кислород-независимых механизмах бактерицидности выявлено не было.

Система комплемента, роль которой в защите против вирусов невысока, тем не менее, является важнейшим звеном в устранении иммунных комплексов, накопление которых может вызвать развитие иммунопатологических реакций. Исследования показали, что средние значения концентраций СЗ, С4, С5, СЗа, С5а и ингибитора С1 между группами больных и

здоровых не имели достоверных различий (р>0,05). Тем не менее, заслуживает внимание понижение уровней С5 и С4, соответственно, у 36% и 15% пациентов с ХГС.

Поскольку при активации комплемента концентрация СЗ и С4 уменьшается в результате их расхода при связывании иммунных комплексов, можно предположить, что система комплемента у больных ХГС активируется неадекватно. Возможно, должной активации комплемента иммунными комплексами по классическому пути не происходит из-за их мелких размеров. Наличие повышенного содержания низкомолекулярных иммунных комплексов в крови и недостаточная активация комплемента может привести к их отложению под эндотелием сосудов и развитию иммунопатологических реакций. Выявленное снижение С5 компонента комплемента происходит, возможно, в результате его перехода в С5а.

У больных ХГС изучали содержание следующих цитокинов: в сыворотке крови определяли ИФН-а, ИЛ-6,ФНО-а, ил-ip и ИЛ-8, а в клеточной культуре - спонтанную и индуцированную продукцию ИЛ-2, ИЛ-IP и ИЛ-8.

Исследование содержания ИФН-а показало, что его уровень повышался у 22% больных ХГС. Средние значения концентраций этого показателя у больных ХГС были достоверно выше (р<0,05), чем у здоровых. Но, по всей видимости, этого количества интерферона для устранения HCV-инфекции недостаточно.

Ключевым фактором в развитии Т-клеточных реакций является ИЛ-2. Как показали исследования, средние значения, как спонтанной, так и индуцированной продукции ИЛ-2 не выходили за пределы нормы. Спонтанная продукция ИЛ-2 отсутствовала у 100% больных ХГС, т. е. у всех больных соответствовала норме. Заслуживает внимания тот факт, что индуцированная продукция ИЛ-2 у 62,5% пациентов имела нормальные значения, у 25% - пониженные и у 12,5% - повышенные, т.е у каждого четвертого больного продукция ИЛ-2 была понижена. Таким образом, у большинства больных ХГС отсутствовало повышение продукции ИЛ-2, участвующего в активации Т-клеток и развитии Т-клеточного ответа, что не согласуется с литературными данными, в которых сообщается о возрастании уровня этого цитокина у больных ХГС (Kawakami Y. et al., 2000; Navas S. et al., 1998).

Количественное определение ИЛ- 1р,ФНО-а и ИЛ-6, полифункциональных цитокинов, обладающих сходными биологическими эффектами, показало что средние значения их концентраций в сыворотке больных ХГС не выходили за пределы нормы, хотя по литературным данным отмечается повышение уровня этих цитокинов (Huang Y.S. et al., 1999). Возможно, полученные данные свидетельствуют о слабом системном воздействии этих цитокинов на организм, т.е. индукции ими воспалительных реакций, которые сопутствуют также специфическому ответу. Известно, что вырыбаты-ваемый Thl-хелперами ФНО участвует в осуществлении цитотоксических

реакций, усиливает синтез ИФН-у и ИЛ-2 (Ершов Ф.И., 1996; Кетлинский СА и др., 1992). Поэтому отсутствие его повышения в сыворотке больных ХГС можно принимать за косвенные доказательства ослабления Т-клеточных реакций.

В тоже время, определение продукции ИЛ-1Р в клеточной культуре показало, что спонтанная продукция ИЛ-1 Р была повышена у 47% больных ХГС, а ее средние значения (193±76,6пг/мл) намного превышали верхнюю границу нормы (30-50пг/мл), что согласуется с литературными данными (Маммаев С.Н. и др., 2000).

Определение уровня ИЛ-8, являющегося и провоспалительным ци-токином и хемоаттрактантом, вызывающим миграцию нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов в очаг воспаления показало, что в сыворотке больных ХГС его средние значения не выходили за пределы нормы. В тоже время, спонтанная продукция ИЛ-8 (рис. 3) в клеточной культуре оказалась повышенной у большинства больных (87%).

Средние значения спонтанной продукции ИЛ-8 у больных ХГС (1226±279пг/мл) значительно превышали верхнюю границу нормы (30-100пг/мл), что согласуется с литературными даннами (Маммаев С.Н. и др., 2000; Машто1:о Т. й а1., 1998). Известно, что синтез ИЛ-8 может происходить под воздействием ИЛ-1 и ФНО (Кетлинский С.А. и др., 1992). Поэтому можно предположить, что усиленная продукция ИЛ-8, в данном случае, связана с действием ИЛ-1 Р, спонтанная продукция которого как было обнаружено, также повышена.

Таким образом, исследования цитокинового статуса показали, что у больных ХГС отмечается повышение уровня ИФН-а в сыворотке, а также уровней спонтанной продукции ИЛ-1 Р и ИЛ-8 клетками крови и отсутствует усиление продукции ИЛ-2 в ответ на антигенную стимуляцию. Эти факты говорят о нарушениях цитокиновой регуляции иммунного ответа.

Проведенный сравнительный анализ иммунологических показателей у отдельных подгрупп больных ХГС, отличающихся по генотипу вируса гепатита С, степени активности патологического процесса в печени и стадии хронического гепатита показал следующие результаты.

Генотипирование вируса выявило, что среди обследованных больных самыми распространенными субтипами ИСУ оказались За (63,3%) и 1Ь (17,7%). Сравнительный анализ иммунологических показателей (рис. 4) между группами, имеющих эти субтипы вируса показал, что группа больных с субтипом НСУ За характеризуется недостоверным (р>0,05) снижением относительного содержания естественных киллеров (7,3±1,0% - ИСУ За и 10,7+1,7% - ИСУ 1Ь ) и достоверным (р<0,05) повышением уровней ^М (2,2+0,17г/л - ИСУ За и 1,4+0,12г/л - ИСУ 1Ь) и ИФНа (64,5+11 пг/мл - НСУ За и 33,8+2,4пг/мл - НСУ 1Ь). Возможно, повышение сывороточного ^М у больных, имеющих субтип ИСУ За, косвенно указывает на то, что гуморальный ответ у этих больных менее эф-

фективен, чем у больных с субтипом HCV 1Ь. Уменьшение относительного содержания NK-клеток у больных ХГС с субтипом HCV За может быть вызвано ослаблением их цитотоксической активности. Поскольку субтип HCV За ассоциируется с употреблением наркотических средств, эти данные совпадают с литературными, в которых описано снижение количества естественных киллеров у больных ХГС, употребляющих наркотики (Иоан-ниди Е.А., 1999).

В группе с субтипом HCV 1Ь (рис. 2) отмечалось некоторое повышение уровня ДО2 (4,8±0,ЗЗг/л - HCV За и 6,0±0,47г/л - HCV 1Ь) и низкомолекулярных ЦИК (189±11отн.ед. - HCV За и 221±13,6отн.ед. - HCV 1Ь), но оно не было достоверным (р>0,05).

1дМГ/л* г/л ЦИК них. С03-С056»%* ИФН-»лг/мл*

отн ед.

Рис. 2. Иммунологические показатели, характеризующие различия между больными ХГС с субтипами HCV За и 1Ь (* различия статистически достоверны между сравниваемыми группами при р<0,05).

Повышение уровня низкомолекулярных ЦИК, возможно, указывает на то, что у больных ХГС с субтипом HCV 1Ь наблюдается тенденция к повышению риска развития иммунопатологических реакций по сравнению с больными, имеющих субтип За. Согласно литературным данным (Сорин-сон С.Н. и др., 1999), больные с субтипом HCV 1Ь фактически не отвечают на интерферонотерапию. Поэтому, при повышении концентрации низкомолекулярных ЦИК и IgG2 на фоне нормального содержания естественных киллеров, IgM и ИФН-а, у больных ХГС можно предположить наличие HCV субтипа 1Ь, следовательно, таким больным нецелесообразно проводить интеферонотерапию.

Таким образом, изменение этих иммунологических показателей может служить дополнительным информационным критерием, позволяющим дифференцировать субтипы HCV 1Ь и За.

Обследование биоптатов печени показало, что у больных ХГС чаще определялась минимальная - (ИГА=1-3, у 43,5%) и слабовыраженная -

(ИГА=4-8, у 53%) активность патологического процесса в печени. Сравнительный анализ иммунологических показателей между этими группами выявил (рис. 3), что в группе больных ХГС со слабовыраженной активностью процесса (ГА2) наблюдается достоверное (р<0,05) понижение относительного содержания Т-киллеров (СОЗ^СОЗб*) (5,2±0,9% - ГА1 и 3,1+0,4% - ГА2) и уровня ИФН-а (95±27ш7мл - ГА1 и 45,6±7,2пг/мл -ГА2) по сравнению с группой больных с минимальной активностью (ГА1). Возможно, что снижение относительного содержания Т-киллеров в периферической крови при усилении степени активности патологического процесса связано с их миграцией в печень.

Рис. 3. Иммунологические показатели, характеризующие различия между больными ХГС с минимальной (ГА1) и слабовыраженной (ГА2) активностью патологического процесса в печени (* различия статистически достоверны между сравниваемыми группами при р<0,05).

Кроме этого, в группе со слабовыраженной активностью процесса (ГА2) достоверно (р<0,05) возрастает уровень ^03 (1,4±0,07г/л - ГА1 и 1,6±0,06г/л - ГА2) и спонтанная продукция ИЛ-8 (534±270пг/мл - ГА1 и 2375±726пг/мл - ГА2) (рис.3). Заслуживает внимание также недостоверное (р=0,1) увеличение уровня ФНО-а (8,7±4,1пг/мл - ГА1 и 53,1±24,5пг/мл -ГА2) в сыворотке крови, спонтанной (315±169пг/мл - ГА1 и 72,5±42,3пг/мл - ГА2) и индуцированной (5бЗЗ±1102пг/мл - ГА1 и 3350±538пг/мл - ГА2) продукции ИЛ- 1р в этой группе больных.

Увеличение концентрации провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ- и ИЛ-8 с усилением активности процесса в печени, по-видимому, связано с их участием в реакциях воспаления. Увеличение концентрации ИЛ-8 может быть также связано с его хемотаксическими свойствами с целью привлечения фагоцитов в очаг воспаления.

По степени выраженности фиброза в печени у больных ХГС определяли стадию хронического гепатита. Чаще всего встречались слабовыра-женный фиброз -1 стадия ХГ (у 49%) и умеренный - II стадия ХГ (у 32%). Сравнительный анализ иммунологических показателей у этих 2-х групп показал (рис. 4), что в группе с умеренным фиброзом наблюдались достоверно более высокие средние значения уровней IgG2 (4,8±0,18г/л - I стадия ХГ и 5,5±0,29г/л - II стадия ХГ; р<0,05) и ДО3 (1,5±0,05г/л -1 стадия ХГ и 1,8±0,08г/л - II стадия ХГ; р<0,001) в сыворотке крови, а средние значения уровней IgGl (7,6±0,1г/л - I стадия ХГ и 8,0±0,2г/л - II стадия ХГ), ДО4 (1,14±0,03г/л - I стадия ХГ и 1,2±0,06г/л - II стадия ХГ), низкомолекулярных ЦИК (180±10отн.ед. - I стадия ХГ и 208±16отн.ед. - II стадия ХГ) иИФН-а (46,8±8,7иг/мл - 1 стадия ХГ и 84,9±22,2иг/мл - II стадия ХГ) были недостоверно (р>0,05) выше, чем в группе со слабовыраженным фиброзом.

1дС2 г/л • 1дСЗ г/л ФЧабс* С4мг/мл* ИЛ-8спон"

пг/мл

Рис. 4. Иммунологические показатели, характеризующие различия между больными ХГС со слабовыраженным (I стадия ХГ) и умеренным (II стадия ХГ) фиброзом (* различия статистически достоверны между сравниваемыми группами при р<0,05; ** различия статистически достоверны между сравниваемыми группами при р<0,01; *** различия статистически достоверны между сравниваемыми группами при р<0,001).

Проведенный корреляционный анализ между степенью выраженности фиброза и некоторыми показателями В-клеточного иммунитета выявил прямую средней силы связь (р<0,05) с IgGl и IgG2. По-видимому, повышение уровней подклассов IgG и низкомолекулярных ЦИК связано с активацией гуморального иммунитета с ростом степени фиброза.

Также заслуживает внимание достоверное (р<0,01) повышение средних значений уровня спонтанной (188±152,6пг/мл - I стадия ХГ и 1510±282,9пг/мл - II стадия ХГ) продукции ИЛ-8 клетками крови у больных с умеренным фиброзом.

Кроме этого, в группе с умеренным фиброзом наблюдалось достоверное (р<0,5) снижение поглотительной способности нейтрофилов (ФЧ) (17,4±1,1у.е. - I стадия ХГ и 13,5±1,Оу.е. - II стадия ХГ) и понижение уровня С4 компонента комплемента в сыворотке крови (0,47±0,03мг/мл -1 стадия ХГ и 0,36±0,04мг/мл — II стадия ХГ). Также отмечалась тенденция к понижению относительного содержания естественных киллеров (СЭЗ" С056+) (9,5+1,5% - I стадия ХГ и 7,5+0,8% - II стадия ХГ). Проведенный корреляционный анализ между степенью фиброза и некоторыми показателями неспецифической резистентности выявил обратную средней силы связь с С4 компонентом комплемента (р<0,05). Поскольку С4 активируется в первую очередь иммунными комплексами, снижение его уровня может быть связано с продолжительной активацией комплемента циркулирующими иммунными комплексами (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998). Понижение фагоцитарного числа, предположительно, может быть вызвано влиянием ИСУ на поглотительную способность нейтрофилов.

Таким образом, проведенное комплексное иммунологическое исследование показало, что у большинства больных ХГС нарушения Т-клеточного иммунного ответа проявляются снижением способности к активации Т-лимфоцитов при их нормальном содержании и гиперпродукцией провоспалительных цитокинов ИЛ- 1Р и ИЛ-8, а также в недостаточной продукции ИЛ-2, стимулятора Т-клеточного иммунитета. По-крайней мере, у 48,5% больных ХГС наблюдается активация В-клеточного иммунного ответа, что отражается в повышении содержания В-лимфоцитов, экспрес-сирующих ИГЛ-БЯ, сывороточных иммуноглобулинов М, А и низкомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов. Увеличение концентрации низкомолекулярных ЦИК может являться предпосылкой к их отложению в тканях и развитию иммунопатологических реакций. Снижение количества естественных киллеров у больных ХГС может быть связано с угнетением их функциональной активности или с их миграцией в печень. Уровень компонентов системы комплемента у большинства больных ХГС находится в пределах нормы, что, возможно, указывает на слабую активность комплемента в устранении иммунных комплексов. Больные с субтипом ИСУ За характеризуются снижением количества КК-киллеров и повышением концентрации ^М и ИФН-а, тогда как у больных с субтипом 1Ь отмечается тенденция к повышению уровней ^02 и низкомолекулярных ЦИК. С ростом степени активности патологического процесса в печени у больных ХГС снижаются количество Т-киллеров и уровень ИФН-а, при этом возрастают уровни 1яОЗ и провоспалительных цитокинов ИЛ-8, ИЛ-1Р, ФИО- а. С ростом степени фиброза, характеризующего стадию хронического гепатита отмечается увеличение концентрации подклассов иммуноглобулина 0, низкомолекулярных ЦИК, спонтанной продукции ИЛ-8 и уменьшение уровня С4 компонента комплемента и количества КК-киллеров.

ВЫВОДЫ

1. Для больных ХГС, в целом, характерно повышение количества ОБ 19 (у 26%) и В-клеток, экспрессирующих НЬЛ-БЯ (у 48,5 %), а также повышение средних значений уровней ^М, IgA и низкомолекулярных ЦИК, а содержание субпопуляций Т-лимфоцитов, в том числе, Т-лимфоцитов, экспрессирующих активационные молекулы вВ25 и НЬА-БЯ не измененяет-ся, что свидетельствует об отклонении иммунного ответа почти у половины больных ХГС в сторону ТИ2. Нарушение цитокиновой регуляции иммунного ответа у пациентов с ХГС проявляется в гиперпродукции провос-палительных цитокинов ИЛ- 1Р, ИЛ-8 и недостаточной продукции ИЛ-2.

2. Иммунологическое обследование отдельных подгрупп пациентов с ХГС, различающихся по субтипам HCV, активности патологического процесса в печени и выраженности фиброза позволило выявить изменения некоторых иммунологических показателей, которые могут служить дополнительными критериями, позволяющими дифференцировать субтипы HCV 1Ь и За, а также ориентировочно прогнозировать активность и стадию хронического гепатита.

3. Группа больных с субтипом НСУ За характеризуется снижением относительного содержания естественных киллеров и повышением уровней ^М и ИФН-а, а тенденция к повышение уровня IgG2 и низкомолекулярных ЦИК характерна для группы с субтипом HCV 1Ь.

4. С ростом степени активности патологического процесса в печени у больных ХГС наблюдается достоверное снижение относительного содержания Т-киллеров (СЭЗ'СВЗб*), уровня ИФН-а и увеличение концентрации провоспалительных цитокинов ФНО- а,ИЛ- 1р и ИЛ-8.

5. С ростом степени фиброза отмечается увеличение концентрации подклассов IgG, низкомолекулярных ЦИК, ИЛ-8, а также уменьшение концентрации С4 компонента комплемента и фагоцитарного числа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Снижение относительного содержания Т-киллеров (С03*С05б+), ИФН-а и увеличение концентрации провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-1Р и ИЛ-8 может служить косвенным прогнозирующим фактором роста степени активности патологического процесса в печени.

2. Увеличение концентрации подклассов низкомолекулярных ЦИК, ИЛ-8 и уменьшение концентрации С4 компонента комплемента и фагоцитарного числа может служить косвенным прогнозирующим фактором роста степени фиброза.

3.Снижение относительного содержания естественных киллеров (СОЗ" СБ56*) и повышение уровней ]£;М и ИФН- а характерно для больных с субтипом НСУ За, а повышение уровня и низкомолекулярных ЦИК -с субтипом НСУ 1Ь. Изменения этих иммунологических показателей могут служить косвенным критерием, позволяющим дифференцировать субтипы НСУ За и 1Ь.

4. При повышении концентрации низкомолекулярных ЦИК и на фоне нормального содержания естественных киллеров, ^М и ИФН- а, у больных ХГС можно предположить наличие НСУ субтипа 1Ь, следовательно, таким больным нецелесообразно проводить интерферонотерапию.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Клинико-иммунологическая характеристика больных хроническими вирусными гепатитами В и С // Мед. иммунология. - 2000. - Т.2, №2. - С. 202 (соавт. Цыган В.Н., Никитин В.Ю., Жданов К.В., Жоголев К.Д.).

2. Изучение особенностей иммунопатогенеза латентных форм хронических вирусных гепатитов В и С // Мед. иммунология. - 2001. - Т.З, №2. - С. 229-230 (соавт. Никитин В.Ю., Жданов К.В.).

3. Изучение клинико-иммунологических особенностей латентных форм хронических вирусных гепатитов В и С // Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении: Тез. докл. науч.-практ. конф. - СПб., 2001. - С.101 (соавт. Никитин В.Ю., Жданов К.В.).

4. Динамическое наблюдение за течением инфекционного процесса при латентных формах вирусных гепатитов В и С // Клинические перспективы в инфектологии: Тез. докл. науч. конф. - СПб., 2001. - С. 141-142 (соавт. Никитин В.Ю., Жданов К.В.).

5. Особенности гуморального ответа и состояния системы комплемента у больных хроническим гепатитом С // Мед. иммунология. - 2002. - Т.4, №2. - С. 247 (соавт. Никитин В.Ю., Жданов К.В.)

6. Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов: Метод. рекомендации/ М-во обороны РФ. Глав. Воен.-мед. упр. - М.: Б.и., 2002. -78с. (соавт. Новик А.А., Цыган В.Н., Никитин В.Ю., Соколова Е.Д., Жданов К.В., Огарков П.И., Лобзин Ю.В., Жоголев К.Д., Малышев В.В., Токмаков B.C.).

7. Уровень иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента в сыворотке крови при хронической HCV-инфекции // Воен. проф. медицина. Проблемы и перспективы: Тр. 1-го съезда воен. врачей мед.-профилакт. профиля. - СПб., 2002. - С. 278 (соавт. Никитин В.Ю., Жданов К.В., Цыган В.Н.).

8. Иммунологическая характеристика хронического гепатита С у лиц молодого возраста // Проблема инфекции в клинической медицине.: Тез. докл. науч. конф. и VII съезда итало-рос. о-ва по инфекционым болезням. -СПб., 2002. - С. 113 (соавт. Жданов К.В., Гусев Д.А., Шахманов Д.М., Никитин В.Ю., Яременко М.В.).

9. Изучение маркеров активации лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С // Проблема инфекции в клин, медицине: Тез. докл. науч. конф. и VII съезда итало-рос. о-ва по инфекционым болезням. - СПб., 2002. - С. 228 (соавт. Никитин В.Ю., Жданов К.В., Гусев Д.А., Шахманов Д.М.).

10. Экспрессия активационных маркеров лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С // Мед. иммунология. - 2003. - Т.5, №3/4. — С. 311 (соавт. Никитин В.Ю., Гусев Д.А., Жданов К.В., Шахманов Д.М.).

Подписано в печать 22 И 0.9. Объем п.л._Тираж

т>

Формат 60x84 '/„.. Заказ№_

«О

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева. 6

экз

-2177

РНБ Русский фонд

2004-4 27570

Актуальность проблемы. В мире проживает, как минимум, 500 млн человек, инфицированных вирусом гепатита С (HCV) [1]. Особенностью HCV-инфекции является ее преимущественно бессимптомное течение. В период острого гепатита желтуха проявляется только менее чем у 20% инфицированных. Молниеносный (фульминантный) гепатит развивается очень редко [156]. Персистенция вируса гепатита С длится многие годы по типу медленной инфекции, приводя к развитию хронического гепатита С (>85%), цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%) [31, 156]. Частота формирования хронической патологии печени, вызванной HCV, по крайней мере в 10 раз выше чем при вирусном гепатите В [31].

HCV присуща высокая скорость мутаций. Наиболее лабильны гены, кодирующие поверхностные антигены вируса, являющиеся основной мишенью иммунной атаки. При такой высокой изменчивости HCV происходит как бы постоянное «состязание на скорость» между образованием новых антигенных вариантов и механизмами их нейтрализации в котором, в итоге, побеждает вирус [31].

IICV, в отличие от вируса гепатита В (HBV), оказывает прямое цитопатическое действие [31, 46]. Углубленное изучение гистопатологических, клинических и иммунологических особенностей хронической HCV-инфекции показало, что в патогенезе поражений печени, помимо прямого цитопатического эффекта вируса, могут играть роль и иммунные механизмы. Появились многочисленные свидетельства того, что иммунные реакции, возникающие при длительной персистенции HCV, могут привести к появлению органоспецифических и неспецифических аутоантител, с последующим развитием внепеченочных проявлений хронической HCV-инфекции [19, 30].

HCV - не только гепатотропный, но и лимфотропный вирус. Описана его репликация в мононуклеарных клетках крови, что может служить постоянным стимулом для активации Т- и В- лимфоцитов с последующим образованием аутоантител и циркуляцией иммунных комплексов [10, 19].

Проблеме патогенеза гепатита С и изучению характера иммунного ответа на вирусный агент посвящены многие исследования. Эффективность и тип иммунного реагирования на различные инфекционные агенты определяются активностью клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Развитие иммунного ответа регулируется через продукцию иммунокомпетентными клетками, в частности, Т-хелперами 1-го и 2-го типов, регуляторных молекул цитокинов. Ведущая роль в осуществлении противовирусного иммунитета отводится Т-клеточному иммунному ответу, но из-за низкой иммуногенности вируса гепатита С наблюдается слабая Т-клеточная реакция [24]. Процессы хронизации при гепатите С (ГС) также связывают с формированием гуморального иммунного ответа [86, 126, 177, 196], который развивается при доминирующем влиянии Т-хелперов 2-го типа.

Результаты оценки иммунного статуса различных контингентов, инфицированных HCV, весьма противоречивы. Дальнейшее изучение иммунного ответа при различных формах ГС, поможет найти эффективные методы коррекции системы защиты инфицированных, повысит результативность лечения.

Цель исследования. На основании комплексного клинико-иммуиологического обследования дать характеристику противовирусного иммунитета у больных хроническим вирусным гепатитом С (ХГС), оценить диагностическую значимость иммунологических показателей при хроническом гепатите С.

Задачи исследования.

1. Выявить нарушения со стороны различных звеньев иммунитета при хроническом гепатите С.

2. Провести сравнительный анализ показателей Т-клеточного, В-клеточного и врожденного иммунитета между больными ХГС и здоровыми лицами, а также между группами больных с различными генотипами HCV, степенью активности ХГ, степенью фиброза.

3. Установить степень корреляционных взаимосвязей между иммунологическими и клиническими показателями при хроническом гепатите С. •

4. Разработать предложения по иммунологическому обследованию больных хроническим вирусным гепатитом С.

Научная новизна.

У больных ХГС проведено углубленное комплексное иммунологическое исследование с помощью таких высокочувствительных современных методов исследования как проточная цитометрия и иммуноферментный анализ. Проведен корреляционный анализ между клиническими и иммунологическими показателями.

Впервые изучено содержание Т-киллеров (CD3+CD56+), естественных киллеров, экспрессирующих молекулу CD8 (CD3"CD8+), Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы активации CD25 и HLA-DR, подклассов IgG, компонентов системы комплемента и низкомолекулярных иммунных комплексов в периферической крови больных ХГС, что позволяет уточнить иммунопатогенез заболевания.

Было проведено сравнение иммунологических показателей между группами больных с различными генотипами HCV, степенью активности патологического процесса, степенью фиброза.

Практическая значимость.

На основе исследуемого материала рекомендовано определение иммунологических показателей, которые могут служить дополнительными информативными критериями, позволяющими дифференцировать субтипы HCV За и lb, а также судить о степени активности патологического процесса в печени и степени фиброза, что поможет практическому врачу выбрать правильную стратегию лечения

Основные положения, выносимые на защиту.

1. У больных ХГС, в целом, иммунный ответ характеризуется увеличением количества В-клеток, экспрессирующих HLA-DR, повышением уровней сывороточных IgM, IgA и низкомолекулярных ЦИК при отсутствии характерных изменений со стороны субпопуляций Т-клеток, что свидетельствует об отклонении иммунного ответа почти у половины больных ХГС в сторону Th2. Нарушение цитокиновой регуляции иммунного ответа у пациентов с ХГС проявляется в гиперпродукции провоспалительных цитокинов ИЛ-lp, ИЛ-8 и недостаточной продукции ИЛ-2.

2. Изменения некоторых иммунологических показателей при сравнении отдельных подгрупп пациентов с ХГС, различающихся по субтипам HCV, активности патологического процесса в печени и выраженности фиброза могут служить дополнительными критериями позволяющими дифференцировать субтипы HCV lb и За, а также ориентировочно прогнозировать степень активности патологического процесса в печени и стадию хронического гепатита.

Апробация и реализация работы. Материалы диссертации доложены на 4-й научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000» (Санкт-Петербург, 23-25 мая 2000), 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 26-27 апреля 2001), 5-й научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 21-24 мая 2001),

Всероссийской научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения профессора Н.К.Розенберга и 105-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 1718 октября 2001), 6-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург, 2023 мая 2002), 1-й съезд военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ (Санкт-Петербург, 26-28 ноября 2002), научной конференции и 7-м съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 56 декабря 2002), 7-го Всероссйского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 23-26 июня 2003).

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 222 источника, в том числе 44 отечественных и 178 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 31 таблицами и 9 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Для больных ХГС, в целом, характерно повышение количества CD 19 (у 26%) и В-клеток, экспрессирующих HLA-DR (у 48 %), а также повышение средних значений уровней IgM, IgA и низкомолекулярных ЦИК, а содержание субпопуляций Т-лимфоцитов, в том числе, Т-лимфоцитов, экспрессирующих активационные молекулы CD25 и HLA-DR не измененяется, что свидетельствует об отклонении иммунного ответа почти у половины больных ХГС в сторону Th2. Нарушение цитокиновой регуляции иммунного ответа у пациентов с ХГС проявляется в гиперпродукции провоспалительных цитокинов ИЛ-1(3, ИЛ-8 и недостаточной продукции ИЛ-2.

2. Иммунологическое обследование отдельных подгрупп пациентов с ХГС, различающихся по субтипам HCV, активности патологического процесса в печени и выраженности фиброза позволило выявить изменения некоторых иммунологических показателей, которые могут служить дополнительными критериями, позволяющими дифференцировать субтипы HCV lb и За, а также ориентировочно прогнозировать активность и стадию хронического гепатита.

3. Группа больных с субтипом HCV За характеризуется снижением относительного содержания естественных киллеров (CD3"CD56+) и повышением уровней IgM и ИФН-а, а тенденция к повышение уровня IgG2 и низкомолекулярных ЦИК характерна для группы с субтипом HCV lb.

4. С ростом степени активности патологического процесса в печени у больных ХГС наблюдается достоверное снижение относительного содержания Т-киллеров (CD3+CD56+), уровня ИФН-а и увеличение концентрации провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-ip и ИЛ-8.

5. С ростом степени фиброза отмечается увеличение концентрации подклассов IgG, низкомолекулярных ЦИК, ИЛ-8, а также уменьшение концентрации С4 компонента комплемента и фагоцитарного числа.