Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний.

005001266

На правах рукописи

ЛЕПЛИНА Ольга Юрьевна

ХАРАКТЕРИСТИКА ИНТЕ РФЕРОН-АЛЬФА-ИНДУЦИРОВАННЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК И ИХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ В ЛЕЧЕНИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ И ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

1 О НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2011

г 8

005001266

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Елена Рэмовна Черных

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Анна Вениаминовна Шурлыгина

доктор медицинских наук Константин Валентинович Гайдуль

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Ирина Соломоновна Фрейдлин

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Росрийский национальный исследовательский медицинский университет им^ни Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Москва

Защита состоится «22» декабря 2011 г. В 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу:

(630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14)

Автореферат разослан «25» октября 2011г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета

доктор медицинских наук / О.П.Колесниковаа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками (АПК), играющими центральную роль в поддержании врожденного иммунитета. Благодаря высокой экспрессии МНС антигенов I и II класса, костимуляторных молекул (CD80, CD86) и продукции широкого спектра цитокинов и хемокинов ДК обладают способностью активировать наивные Т-клетки и индуцировать антигенспецифический иммунный ответ [Massard G. et al, 1996; Peters J. et al, 1996]. Наряду со способностью индуцировать активацию иммунокомпететных клеток, ДК могут также ингибировать иммунный ответ. Толерогенные/супрессорные свойства ДК обусловлены различными механизмами, в том числе способностью ДК экспрессировать коингибигорные молекулы и рецепторы (В7-Н1, ILT-2, ILT-3, ILT-4, CD209, CD200R и HLA-G), продуцировать иммуносупрессивные цитокины (IL-10, TGF-p), [Reichardt W. et al, 2008; Fedoric B. et al, 2008] и индуцировать генерацию регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+T per) [Suciu-Foca N. et al, 2005]. Недавние исследования также показали, что ДК могут подавлять пролиферацию и оказывать непосредственный цитотоксический эффект на клетки опухолевых линий [Wesa A. et al, 2008, Chauvin С. et al, 2008]. Противоопухолевая активность ДК опосредуется с участием различных молекул семейства фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a, lymphotoxin-alp2, FasL, TRAIL), a также перфорина и/или гранзима [Wesa A. et al, 2008; Korthals M. et al, 2007] и имеет, по-видимому, большое значение, поскольку высвобождающиеся опухолевые антигены могут сразу же презентироваться дендритными клетками Т-лимфоцитам, обеспечивая запуск специфического иммунного ответа.

Изменения в количественном содержании и функциональной активности ДК выявлены при многих заболеваниях [Duan X.Z. et al, 2005; Pinzon-Charry A. et al, 2005; Yang L. et al, 2004]. При этом снижение стимуляторной активности ДК рассматривается в качестве возможного механизма персистенции вирусной и бактериальной инфекции, а также ускользания опухоли от иммунного надзора [Delia Bella S. et al, 2006; Zhang Z. et al, 2006; Ulsenheimer A. et al, 2005; Chen L. et al, 2007], тогда как нарушение толерогенных свойств ДК при гестации чревато угрозой преждевременного прерывания беременности [Scholz С. et al, 2008; Darmochwal-KolarzD. etal, 2003].

Способность ДК индуцировать антигенспецифический иммунный ответ и наличие цитотоксической активности сделали эти клетки привлекательными кандидатами для иммунотерапии опухолевых и инфекционных заболеваний. Действительно, исследования на животных [Akbar S.M. et al, 2004] и клинические испытания у человека [Steinman R.M. et al, 2001; Mashino К. et al. 2004, Chen L. et al, 2005] показали, что вакцинация миелоидными ДК, презентирующими вирусные или опухолевые антигены, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается положительным клиническим эффектом. С другой стороны,

толерогенные ДК представляют интерес в плане лечения аутоиммунных заболеваний, патологии беременности и трансплантации органов и тканей [Lim D-S. et al, 2009].

Изучению ДК и их клинической апробации во многом способствовала разработка методов генерации ДК in vitro. При этом выяснилось, что условия культивирования существенно влияют на свойства генерируемых ДК [Hart D.N. et al, 1997; Bender A. et al, 1996]. Традиционно ДК получают путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) в присутствии двух ключевых цитокинов - GM-CSF и IL-4 [Thurner В. et al, 1999]. Генерируемые таким образом незрелые миелоидные дендритные клетки (ИЛ4-ДК) обладают высокой способностью к захвату антигена, но слабой способностью активировать Т-клетки. Дальнейшее культивирование ДК в присутствии TNF-a, IL-1, LPS, СВ40-лиганда или коктейля «дозревающих» стимулов ведет к созреванию ДК и повышению их способности стимулировать Т-клеточный ответ [Jonuleit Н. et al, 2007]. Однако генерируемые in vitro ИЛ4-ДК обладают низкой миграционной активностью и в условиях дефицита ростовых факторов могут подвергаться обратной трансформации в моноциты.

Наряду с традиционным протоколом, Santini с соавт. продемонстрировали, что частично зрелые ДК можно генерировать при замене IL-4 интерфероном-а [Paquette R. et al, 1998; Santini S. et al, 2000; Santini S. et al, 2003; Santini S. et al, 2009; Santini S. et al, 2005]. Интерферон-а индуцированные ДК (ИФН-ДК) генерируются быстрее по времени, обладают высокой поглотительной активностью, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов и превосходят ИЛ4-ДК по миграционной активности, способности стимулировать CD8 Т-лимфоциты. Кроме того, ИФН-ДК индуцируют более сбалансированный иммунный ответ, поскольку наряду с выраженной Thl-стимулирующей способностью обладают умеренной ТЬ2-стимулирующей активностью [Parlato S. et al, 2001; Santini S. et al, 2003; Carbonneil C. et al, 2004]. Учитывая также, что интерфероиы способны усиливать цитотоксический потенциал ДК [Lu G. et al, 2002; Chauvin С. et al, 2008; Papewalis C. et al, 2008] и ИФН-ДК по некоторым данным могут обладать более выраженной цитотоксической активностью [Korthals М. et al, 2007], применение этого типа ДК при опухолевых и вирусных заболеваниях представляется весьма перспективным.

Однако до сих пор свойства этих клеток (включая спектр и уровень продуцируемых ДК цитокинов, экспрессию поверхностных молекул и способность активировать Thl и Th2 ответ), особенно активированных ИФН-ДК, охарактеризованы недостаточно. Практически отсутствуют сравнительные данные о цитотоксической и толерогенной активности ИЛ4-ДК и ИФН-ДК. Неисследованным остается также вопрос, насколько эффективно могут генерироваться ИФН-ДК при патологии и отличаются ли ИФН-ДК пациентов по функциональной активности. Наконец, большой интерес представляет клиническая апробация ИФН-ДК в качестве адьювантной клеточной терапии, направленной на активацию специфического иммунного ответа у больных с опухолевыми и инфекционными заболеваниями.

В связи с вышеизложенным, была сформулирована цель работы: на основании сравнительной характеристики ИФН-ДК и ИЛ4-ДК, анализе свойств ИФН-ДК при физиологических и патологических состояниях, оценке возможности их регуляции in vitro и клинической апробации у больных с внутримозговыми опухолями и хроническими вирусными инфекциями обосновать возможность использования ИФН-ДК в лечении онкологических и инфекционных заболеваний. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку поверхностных маркеров (стадиоспецифические, активационные, костимуляторные, коингибиторные, проапотогенные молекулы) в популяции ИФН-ДК и ИЛ4-ДК в группе здоровых доноров

2. Провести сравнительное исследование функциональной активности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (продукция цитокинов в культурах ДК, аллостимуляторная активность ДК, Thl- и Th2 - стимулирующая активность ДК), генерируемых у здоровых доноров.

3. Оценить цитотоксическую и цитостатическую активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК здоровых доноров против клеток опухолевых линий.

4. Исследовать способность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК к индукции регуляторных Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов.

5. Охарактеризовать поверхностные маркеры и функциональную активность ИФН-ДК у больных с онкологическими заболеваниями (злокачественные опухоли головного мозга, гемобластозы).

6. Исследовать фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у больных с хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких)

7. Исследовать in vitro влияние цитокинов и иммуноактивных факторов (интерлейкин-2, смесь провоспалительных цитокинов, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека) на аллостимуляторную активность и цитотоксический потенциал ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями.

8. Изучить фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у женщин с физиологической гестацией и беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.

9. Оценить влияние гормона дегидроэпиандростерона сульфата на экспрессию поверхностных маркеров и функциональную активность ИФН-ДК доноров.

10. Оценить безопасность и эффективность иммунотерапии с использованием ИФН-ДК в лечении больных злокачественными опухолями головного мозга.

11. Провести апробацию ИФН-ДК-вакцин у больных с хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В, герпесвирусная инфекция).

Научная новизна

Исследование свойств LPS-активированных интерфероном-П ДК в сравнении со стандартно генерируемыми ИЛ4-ДК показало, что популяция ИФН-ДК характеризуется более высоким содержанием клеток, экспрессирующих CD 14, CDllc/CD123 и TRAIL, и меньшим количеством CD83+ клеток. При этом ИФН-ДК отличаются более высокой продукцией IFN-y, IL-2, IL-17, IL-ip, IL-10, IL-5, G-CSF и MCP-1, более активно индуцируют генерацию CD3' IFN/ Т-клеток и способны активировать CD3+IL4+ Т-клетки. Кроме того, ИФН-ДК проявляют более выраженную цитостатическую активность против ТКА1Ъ-чувств1Ггельных опухолевых клеток и более высокую цитотоксическую активность в культурах TRAIL-резистентных опухолевых клеток. Сравнение способности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК индуцировать регуляторные Т-клетки позволило получить новые данные о толерогенном/супрессорном потенциале анализируемых ДК. В частности, показано, что в отсутствие активации LPS ингактные ИФН-ДК индуцируют не только генерацию CD4+FoxP3+, но также CD8+PoxP3+ и CD4'IL-10"- клеток, тогда как после активации LPS, ИФН-ДК теряют способность индуцировать генерацию CD4+FoxP3+-и обладают сходной с ИЛ4-ДК стимулирующей активностью в отношении CD8*FoxP3+ и CD4 IL-10 -клеток. В работе впервые исследована возможность генерации и свойства ИФН-ДК при различных онкологических и инфекционных заболеваниях. Продемонстрировано, что популяция ДК больных с онкопатологией (злокачественные внутримозговые опухоли, злокачественные лимфомы, множественная миелома) и хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких) отличается повышенным содержанием незрелых ДК и ДК промежуточной степени зрелости и уменьшением зрелых ДК; смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону ТИг/противовоспалительных цитокинов; снижением аллостимуляторной активности; уменьшением стимулирующей активности в отношении CD3+IFNy+ Т-клеток и/или усилением способности активировать CD3+IL4+ Т-клетки и угнетением цитотоксической противоопухолевой активности (у больных с онкопатологией). Причем выраженность указанных изменений существенно варьирует при различных нозологических формах патологических состояний. Впервые изучены свойства ИФН-ДК, генерируемых у женщин с физиологической и осложненной беременностью. Показано, что ИФН-ДК при физиологической беременности отличаются признаками незрелости, смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону ТК2-цитокинов, снижением аллостимуляторной и доминированием ТЬ2-стимуляторной активности и наличием цитотоксической активности против активированных NK-клеток. В то же время ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (с повышенным уровнем ДГЭАС) обладают более зрелым фенотипом ДК, сохранной аллостимуляторной активностью и способностью активировать Thl-ответ. При этом анализ влияния ДГЭАС на ИФН-ДК in vitro позволил получить новые данные о

стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку/созревание ИФН-ДК, продукцию IFN-y и TNF-a, Thl-стимуляторную активность ДК и ингибирующем эффекте на способность ИФН-ДК индуцировать гибель CD56+CD16+ клеток. Впервые проведена клиническая апробация вакцин на основе ИФН-ДК и показана их безопасность и эффективность в индукции иммунного и клинического ответа у больных злокачественными опухолями головного мозга и хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В и герпесвирусная инфекция)

Теоретическая и практическая значимость Сравнение фенотипа клеток в популяциях LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК позволило выявить ряд особенностей, которые свидетельствуют о менее зрелом, «промежуточном» фенотипе ИФН-ДК и их более высоком щгготоксическом потенциале, ассоциированном с экспрессией молекулы TRAIL. В свою очередь, выявленные функциональные отличия ИФН-ДК, в частности, их более высокая цитокин-продуцирующая активность и способность к индукции CD3+IFNy+ Т-клеток при сохранении умеренной ТЬ2-стимуляторной активности, а также более высокая цитостатическая и цитотоксическая активность против опухолевых клеток при сходной способности к индукции регуляторных Т-клеток, указывают на более высокий потенциал ИФН-ДК в индукции/опосредовании иммунного ответа. Выявленные при онкологических и инфекционных заболеваниях фенотипические и функциональные изменения ИФН-ДК свидетельствуют о нарушении дифференцировки/созревания ДК и снижении их способности индуцировать и опосредовать реакции клеточного иммунитета при данных патологических состояниях. При этом взаимосвязь нарушений ИФН-ДК со степенью злокачественности (у больных ЗОГМ) и угнетением антигенспецифического ответа (у больных ТБ) свидетельствует о патогенетической значимости дисфункций ДК при данных патологиях. Исследования свойств ИФН-ДК при физиологической и осложненной надпочечниковой пшерандрогенией беременности показало, что в условиях физиологической гестации ИФН-ДК приобретают

толерогенные/супрессорные свойства, которые утрачиваются на фоне повышенного уровня ДГЭАС при надпочечниковой гиперандрогении. При этом способность ДГЭАС индуцировать in vitro созревание ДК и активировать их иммуностимулирующую активность свидетельствует о важной роли гормонов в регуляции ИФН-ДК, и в частности значении ДГЭАС в ослаблении толерогенных/супрессорных свойств ДК. Выявленные отличительные свойства ИФН-ДК обосновывают перспективы их использования в качестве ДК-вакцин для иммунотерапии. При этом установление принципиальной возможности генерации ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями, а также возможности коррекции дисфункций ИФН-ДК, в частности, усиление их аллостимуляторной активности и повышение щгтотоксической активности in vitro с помощью различных медиаторов/соединений (интерлейкин-2, полиоксидоний,

двуцепочечная ДНК человека), является важной составляющей практической значимости работы. Значение работы в прикладном аспекте заключается также в разработке протокола иммунотерапии на основе ИФН-ДК и его клинической апробации у больных со злокачественными опухолями головного мозга и хроническими инфекциями (хроническим вирусным гепатитом В и герпесвирусной инфекцией). При этом полученные результаты о хорошей переносимости и отсутствии побочных эффектов/осложнений при проведении иммунотерапии на основе ИФН-ДК, а также данные об индукции специфического иммунного ответа, который сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями, прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности (соответственно, в 22 и 55%) при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции свидетельствуют о безопасности и терапевтическом потенциале ИФН-ДК-вакцин и обосновывают принципиальную возможность их использования в лечении онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активированные ИФН-ДК отличаются от ИЛ4-ДК менее зрелым фенотипом, повышенной экспрессией проапоптогенных молекул, а также более высоким уровнем продукции цитокинов (с преобладанием Thl/провоспалительных цитокинов), Thl- стимуляторной и цитотоксической активности.

2. При онкологических и инфекционных заболеваниях ИФН-ДК имеют признаки задержки дифференцировки/созревания и нарушения функциональной активности, наличие и выраженность которых существенно варьирует в зависимости от нозологической формы заболевания и может корригироваться in vitro рядом цитокинов или иммуноактивных факторов.

3. ИФН-ДК являются мишенями гормональной регуляции и опосредуют иммуностимулирующий эффект ДГЭАС, повышенный уровень которого у беременных с гиперандрогенией обусловливает снижение толерогенного потенциала ДК, характерного для физиологической беременности.

4. Использование ДК-вакцин характеризуется хорошей переносимостью, является безопасным, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями; прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница:

проблемы и решения», Ленинск-Кузнецкий, 2003 г, на 14-ой научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины», Новосибирск, 2004 г, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет. Новосибирск, 2005 г, на 15-й научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск, 2006 г; на международном конгрессе «International conference Basic Science for Biotechnology and Medicine», Новосибирск 2006 г, на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» в Красноярске 2005 г, 2006 г; в Томске 2008 г; на 11 Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» - 2007 г; на III Международной конференции "Фундаментальные науки -медицине" Новосибирск 2007 г; на 2nd World Conference on Magic Bullets Celebrating the 100th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich. Nürnberg 2008; на Объединенном иммунологическом форуме - Санкт-Петербург 2008 г, на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования щгтокнновой сети в норме и при патологии», Новосибирск 20 Юг.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 64 печатных работы, в том числе 19 статей в центральной печати, получен 1 патент.

Обьем и структура диссертации Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения^ обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 249 страницах машинописного текста, включающего 49 таблиц, 18 рисунков, 3 схемы. Прилагаемая библиограф™ содержит ссылки на 306 литературных источника, в том числе 293 иностранных. Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии НИКИ СО РАМН, руководитель -профессор Черных Е.Р. в рамках НИР 032: «Структурно-функциональная характеристика клеток иммунной системы и разработка клеточных биотехнологий иммунодиагностики и иммунотерапии инфекционно-воспалительных, аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний», НИР 037: «Разработка новых клеточных технологий в лечении онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека на основе изучения биологических свойств и молекулярно-генетических механизмов регуляции стволовых и иммунокомпетентных клеток», грантов РФФИ №09-04-00525-а «Гормонально-опосредованная регуляция толерогенной активности дендритных клеток» и №07-0400967 «Роль дегидроэпиандростерона сульфата в регуляции дифференцировки, созревания и функциональной активности дендритных клеток», гранта ФЦП госконтракт № 14.740.11.0007. - «Разработка технологии создания индивидуальных вакцин на базе инновационных подходов генерации дендритных клеток с

использованием интерферона для лечения онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика больных, включенных в исследование. Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 145 доноров крови и больных с онкологическими (94) и инфекционными (142) заболеваниями. Группа пациентов с онкологическими заболеваниями включала 68 больных с внутримозговыми опухолями, в том числе 46 больных со злокачественными опухолями головного мозга (ЗОГМ) и 22 - с опухолями низкой степени злокачественности и 26 пациентов со злокачественными лимфомами (ЗЛ), включая 5 пациентов с лимфомой Ходжкина, 7 больных с агрессивными вариантами неходжкинских лимфом и 14 пациентов с множественной миеломой (ММ). В группу с инфекционными заболеваниями вошли 37 пациентов с хроническими вирусными гепатитами В (ХВГВ, п=18) и С (ХВГС, п=19), у 15 из которых диагностировался цирроз печени (ЦП) как исход хронической вирусной инфекции; 90 больных туберкулезом легких (ТБ) и 15 пациентов с герпесвирусной инфекцией. Кроме того, в исследование были включены 60 женщин с физиологической беременностью и 36 беременных с гиперандрогенией надпочечникового генеза (все беременные со сроком гестации до 22 недель). Иммунологические исследования.

Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли стандартным методом и в концентрации 0,1 □ 106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в полной культуральной среде RPMI-1640 при 37°С в СОг-инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонА, Sigma, 15 мкг/мл), рекомбинантный IL-2 (50 ЕД/мл, Ронколейкин, ООО «Биотех», Санкт-Петербург), ППД (очищенный дериват туберкулина, РАО «Биопрепарат», Санкт-Петербург) в концентрации 50 мкг/мл, лизат опухолевых клеток (0,01- 0,1мг/мл ), специфический рекомбинантный антиген HSVlgD (НПО «Диагностические системы», г.Нижний Новгород) 5 мкг/мл, HBs Ag (вакцинальный AT «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия) 5 мкг/мл.

Дендритные клетки генерирован/ путем культивирования прилипающей фракции МНК в присутствии GM-CSF (Sigma-Aldrich, 40 нг/мл), INF-Ü (Роферон-А, Roche, Швейцария, 1000 Ед/мл) - ИФН-ДК и в присутствии GM-CSF и IL-4 (Sigma-Aldrich, 40 нг/мл) - ИЛ4-ДК течение 3 и 5 сут, соответственно. На последующие 24 ч в качестве дозревающего стимула вносился LPS (Е.colli 0114:В4, Sigma-Aldrich, 10 мкг/мл). Влияние ДГЭАС (Sigma-Aldrich, кат. № D5297) на фенотип и функциональную активность ДК оценивали, добавляя гормон (10_6М) либо в начале культивирования, либо на стадии дозревания за 24 ч до окончания культивирования.

Оценку поверхностных маркеров проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя меченные фикоэритрином (РЕ) анти-CDla, анти-

CD123 мАТ (BD PharMingen, США), anra-CD14, анти-CDló мАТ (Сорбент, Москва), меченные АРС анги-CDllc мАТ (BD PharMingen, США), меченныеБГГС aimi-CD25, ahth-CD83, ;uith-CD80, анти-С08б мАТ (BD PharMingen, США) и анти-HLA-DR мАТ (Сорбент, Москва).

Оценку способности ДК к эндоцитозу проводили методом проточной цитофлюориметрии по захвату FITC-декстрана (мол. вес 40 ООО, Sigma).

Аллостимуляторную активность ДК оценивали в реакции смешанной культуры лимфоцитов (CKJI). В качестве отвечающих клеток использовались МНК доноров (0,1х106/лунку), стимуляторами служили дендритные клетки в соотношении 10:1 и 100:1. Пролиферативный ответ оценивался на 3-5 сут радиометрически по включению 3Н-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования

Продукцию цытокинов (IL-1, IL-6,1L-7, IL-8, IL-12p70, TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MCP, MIP-1) в цельных культурах ДК оценивали методом проточной цитофлюориметрии на 2-х лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем 17Р1ех (определяемый динамический диапазон 2 - 32000 пкг/мл) В отдельной серии экспериментов концентрацию цитокинов TNF-a, IL-4, IFN-y, IL-6 («Вектор-Бест», Новосибирск) и IL-10 («Цитокин»; Санкт-Петербург) определяли методом иммуноферментного анализа.

Определение внутриклеточной экспрессии цитокинов в СОЗ+-популяции лимфоцитов периферической крови проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton Dickinson) с использованием АРС-мечённых моноклональных анти-СОЗ-антител, FITC-коньюгированных анти-INF-D и РЕ-меченных aHTti-IL-4 антител.

Оценку клеточного цикла в различных субпопуляциях NK-клеток проводили с помощью окрашивания клеток Actinomycin D, 7-Amino (50 мкг/мл, Calbiochem, Германия) методом проточной цитофлюориметрии. Уровень клеточного цикла оценивали среди CD56+CD16+ клеток в популяции МНК, культивированных в течение 24 ч в отсутствие и присутствии интактных или ДГЭАС-модифицированных ИФН-ДК.

Цитостатическую активность ДК в отношении опухолевых клеток оценивали по способности ДК ингибировать пролиферацию клеток опухолевых линий НЕр-2 (клетки эпителиальной карциномы гортани человека), Jurkat (Т-клеточная лимфома), U-87 (клетки глиобластомы человека). Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3Н-тимидина (1 мКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Индекс влияния ДК (ИВдк) рассчитывали как отношение пролиферативного ответа в опыте к контролю, а цитостатическую активность ДК определяли по формуле (1-ИВдк) х 100%. Цитотоксическую активность оценивали по лизису клеток-мишеней дендритными клетками в соотношениях 40:1, 20:1 и 10:1. Процент цитотоксичности рассчитывали по формуле: [1 - (имп/мин в культурах с

эффекторными клетками/имп/мин в контрольных культурах в отсутствие эффекторных клеток)] х 100% .

Толерогенные свойства ДК оценивали по их способности индуцировать регуляторные Т-клетки в алло-CKJI при совместном культивировании ДК с аллогенными МНК в соотношении 1:10. Относительное содержание CD4+FoxP3+, CD8+FoxP3+ и CD4+IL-10+ клеток в культурах оценивали на 5 сутки методом проточной цитофлюориметрии

Клинические испытания иммунотерапии (ИТ) с использованием ИФН-ДК были проведены в соответствии с разработанным протоколом, утвержденным Ученым советом Института (протокол №1, апрель 2003 г) и одобренным локальным этическим комитетом. В исследование были включены 32 человека (основная группа) с гистологически верифицированным диагнозом внутримозговых опухолей высокой степени злокачественности, включая 20 пациентов с анапластической астроцитомой (Grade III) и 12 пациентов с глиобластомой (GradelV), которым оперативное лечение и радиотерапия были дополнены иммунотерапией с использованием ДК. ИТ включала курс адоптивной иммунотерапии и курс вакцинаций дендритными клетками согласно разработанному патенту «Способ комбинированной иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга» (патент на изобретение Лг2 2262941 от 27.10.2005). Антигенный материал (лизат опухолевых клеток) для нагрузки ДК получали из фрагмента аутологичной опухоли больного, в результате 5-кратного замораживания/размораживания суспензии опухолевых клеток, и использовали в концентрации 0,1 мг/мл по белку. Исследование общего состояния включало изучение общемозговой симптоматики и оценку индекса качества жизни.

Клинические испытания иммунотерапии в лечении инфекционных заболевании проводились в дизайне открытого проспективного пилотного исследования с контролем «до-после» в соответствии с разработанными протоколами, утвержденными Ученым советом Института (протокол № 6 от 26 сентября 2006 г для ХВГВ и протокол №9 от И декабря 2007 для герпесвирусной инфекции) и одобренными локальным этическим комитетом. Группа пациентов составляла 9 больных ХВГВ и 7 женщин с орофациальной локализацией герпетической инфекции. ИТ включала два курса вакцинации дендритными клетками. Первый -4-6 вакцинаций ИФН-ДК, нагруженных HBs Ag (вакцинальный АГ «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия) или рекомбинантными антигенами вируса герпеса HSVlgD (НПО «Диагностические системы», г.Нижний Новгород) с 2-недельным интервалом. Второй курс - 3-6 вакцинаций с кратностью 1 раз в месяц. Количество ДК на одну вакцинацию - 5-х 106. При проведении вакцинаций в качестве адью ванта использовался ронколейкин в дозе 250000 Ед. Интенсивность антигенспецифического ответа оценивали на 3 сут по пролиферации МНК больных в ответ на стимуляцию Hbs Ag антигеном (5 мг/мл) либо HSVlgD антигеном в отсутствие и присутствии

ронколейкина (100 Ед/мл). Неспецифический ответ оценивали по пролиферации МНК в ответ на стимуляцию конканавалином А.

Реакцию гиперчувствителъности замедленного типа (ГЗТ) in vivo оценивали по выраженности кожной пробы в ответ на введение лшата опухолевых клеток. Реакцию ГЗТ in vitro оценивали в модифицированном тесте миграции лейкоцитов в ответ на аналогичную стимуляцию клеток лейковзвеси.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Отправной точкой исследования стало сравнительное исследование фенотипа LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК. Поскольку дифференцировка моноцитов в ДК сопровождается закономерной сменой фенотипов, в частности, появлением молекулы CD 1а и утратой CD 14, а созревание ДК ассоциировано с экспрессией молекул CD83 и CD25 и утратой CD 1а, а также усилением экспрессии молекул Ш;А-DR и CD86, оценка указанных маркеров послужила основой фенотипического анализа (табл.1).

Таблица 1

Фенотнпнческая характеристика ИЛ4-ДК н ИФН-ДК_

Маркер ИЛ4-ДК (n=14) ИФН-ДК (n=14)

M ± SE Medial LQ-UQ M±SE Median LQ- UQ

CD14 11,1 ±2,4 8,0 3-19 22,2 ±3,6* 23,0 10-27

CD83 52,8 ± 6,2 47,4 36-51 34,6 ±3,7 * 36,0 22-46

CD86 58,3 ±3,6 50,0 49-62 65,2 ± 4,2 54,0 48-71

CD25 29,4 ± 2,6 27,8 14-38 25,1 ±3,5 26,0 13-36

CDla 48,8 ± 2,3 38,2 28-54 10,4 ±2,0 * 10,0 7,5 - 11

CD 123 6,7 ± 1,8 6,1 2-12 40,1 ±3,4* 36,5 25-49

HLA-DR 91,8 ±7,4 89,4 80-97 86,4 ± 9,2 90,1 76-92

Примечание: относительное содержание (%) различных субпопуляций ДК представлено в виде средних (M±SE.), медианных (Median) и диапазона 25-75% квартальных значений (LQ - UQ). * pt< 0,01 - достоверность различий показателей (t-критерий Стьюдента для связанных выборок)

ИФН-ДК были сходны с ИЛ4-ДК по количеству CD86, HLA-DR и CD25-позитивных клеток, однако содержали большее количество CD 14 и меньшее - CD83 клеток, т.е. имели менее зрелый - промежуточный фенотип. Значительная доля ИФН-ДК экспрессировала молекулу CD123, что также указывало на меньшую зрелость, поскольку экспрессия данного маркера снижается по мере дифференцировки миеловдных ДК. Промежуточный фенотип ИФН-ДК подтверждался также их достаточно высокой фагоцитарной активностью, в частности, способностью

поглощать FITC-меченный декстран, Так 74,9D6,2% интактных ДК активно поглощали FITC-декстран, но и после активации дозревающим стимулом (LPS) доля клеток с внутриклеточным содержанием FITC-декстрана оставалась высокой (62,01" 8,6%).

Исследование поверхностных молекул, способных опосредовать цитотоксическую и/или супрессорную активность ДК (табл. 2), показало, что как интактные, так и LPS-стимулированные ИФН-ДК отличались более высокой экспрессией цитотоксической молекулы TRAIL. Интактные ИФН-ДК содержали большее количество В7-Н1-позитивных и меньшее HLA-G -позитивных клеток. Однако после активации LPS экспрессия В7-Н1 на ИФН-ДК снижалась, и эти клетки уже не отличались от ИЛ4-ДК по экспрессии толерогенных молекул.

Таблица 2

Экспрессия TRAIL, В7-Н1 и HLA-G молекул на ИЛ4-ДК и ИФН-ДК

Маркер ИЛ4-ДК ИФН-ДК

(0) LPS(+) (0) LPS(+)

TRAIL (п=12) 10,6±1,1 8,8±1,9 18,3±2,0 * 16,1±1,6 *

В7-Н1 (п=12) 27,5±4,7 36,0±5,7 # 37,3±3,4 * 27,5±4,7 #

HLA-G (п=8) 16,3±4,9 7,1 ±2,0 # 8,5±1,4 * 10,0±1,9

Примечание относительное содержание (%) интактных и ЬРБ-активированных ДК, экспрессирующих соответствующие маркеры, представлено в вцде средних значений (М ± ЭЕ), # ри < 0,05 - достоверность различий интактных и LPS-aктивиpoвaнныx ДК, *рц<0,05 -достоверность различий ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (и-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Исследование функциональной активности ДК включало оценку продукции цитокинов в культурах ДК, аллостимуляторной и ТЫ/ТЬ2-стимуляторной активности ДК по их способности индуцировать в СКЛ возрастание количества и 1Ь-4-

продуцирующих Т-клеток, а также продукции ТЫ- и ТЬ2 цитокинов. Культуры ИФН-ДК характеризовались более высоким содержанием ]ИМ-7, ТЬ-2, 1Ь-1р, ЮТ-а, 1Ь-17, а также более высоким уровнем 1Ь-10 и 1Ь-5. т.е. ИФН-ДК могли более активно стимулировать ТЬ1 и ТЬ2 ответ (табл. 3). При этом соотношение концентрации Т№"-а/П^-Ю в супернатантах ИФН-ДК 2-кратно превышало аналогичный показатель в культурах ИЛ4-ДК, свидетельствуя о доминировании провоспалительного потенциала. Наконец, ИФН-ДК отличались более высокой продукцией в-С5Р и МСР-1, но более низким уровнем П^-12р70 и 1Ь-7, что могло указывать на более высокую способность рекрутировать моноциты и поддерживать их выживаемость, но меньшую эффективность в поддержании гомеостатической пролиферации.

Таблица 3

Продукция цитокинов дендритными клетками, генерированными в _присутствии IL-4 и IFN-a_

Цитокины (пг/мл) ИЛ4-ДК (п=17) ИФН-ДК (п= 17)

М ± S.E. 1 Median М± S.E. | Median

ТЫ/провоспалителъные цитокины

IFN-y 3326±1270 1406 4916 ±1707* 2277 t

IL-2 828 ±102 830 1177 ±78* 1121 Т

Окончание таблицы 3

IL-ip 274 ± 55 197 503 ± 47 * 456 t

TNF-a 11605 ±3281 8504 19980 ±2684* 19806 t

IL-12(p70) 796 ±196 504 435 ±61 ** 300|

IL-17 402 ± 48 433 489 ±19* 480 T

Th2/npomueoeocna.4umeibnbie цитакины

IL-5 13,1 ±2.0 10 41,4 ± 14,2** 22]

1L-6 28082 ± 3249 34561 35580 ±1412 38135

IL-10 496 ±210 181 658±138 * 422 T

IL-13 178 ±40 145 133± 16 109

Факторы илшуногемопоэза

IL-7 44.2 ± 2,3 48 38,4 ± 1,6* 38 1 Г

G-CSF 3884±1500 1378 4291 ±512* 4045 t

Хемокины

IL-8 26514 ±759 27962 27606 ± 46 27697

MCP-1 11254 ± 1760 11453 29167 ± 1598 ** 28948 T

MIP-1P 15539 ±519 16285 16274 ±8 16285

Примечание: представлены средние (M±SE) и медианные (Median) значения концентрации цитокинов (пг/мл) в супсрнатантах цельных культур ДК. * ри < 0,05, ** ри < 0,01 -достоверность различий значений между ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни].

Сравнение аллостимуляторной активности не выявило различий ИЛ4-ДК и ИФН-ДК (18625±909 и 18922±1743, соответственно, п=14). Вместе с тем ИФН-ДК более активно стимулировали генерацию IFN-у-продуцирующих Т-клеток, т.е. активировали Thl-клетки и в отличие от ИЛ4-ДК обладали умеренной Th2-стимуляторной активностью (табл. 4).

Таблица 4

Содержание Т-клеток с внутриклеточной экспрессией IFN-y и BL-4 в культурах

% клеток СКЛ, индуцнрованная ИЛ-4ДК (n=21) СКЛ, индуцированная ИФН-ДК (n=21)

ДК(-) ДК(+) ИВдк ДК(+) ИВдк

CD3+T-IFN-y+ 1,8±0,11 7,5±0,6* 4,9±0,8 10,5±0,5*# 11,1±2,2#

CD3T-IL-4T 1,75±0,2 2.96±0,42 1,9±0,37 5,1±0,6*# 4,8±^7#

Примечание: данные представлены в виде средних (M±SE), ИВдк - индекс влияния ДК, рассчитанный по формуле: ИВдк = ДК(+)/ДК(-), * - достоверность различий показателей по сравнению с контролем, # - достоверность различий между ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (ри <0,05, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни/

Сравнение концентрации различных цитокинов в СКЛ, индуцированной ИЛ4-ДК или ИФН-ДК, также показало, что ИФН-ДК более активно стимулируют Т-клетки к продукции IFNy, IL-5 и МЕР-10, что дополнительно свидетельствует о более выраженной способности этих клеток стимулировать Thl и Th2 ответ, а также хемоаттрактивную активность Т-клеток.

Учитывая, что ИФН-ДК характеризуются повышенной экспрессией TRAIL и более высокой продукцией IL-10, на следующем этапе было проведено сравнительное

исследование цитотоксической/статической активности анализируемых ДК против опухолевых клеток, а также их способности индуцировать регуляторные Т-клетки. ИФН-ДК обладали более высокой цитотоксической активностью против TRA.IL-чувствительных клеток Лигка! и более высоким цитостатическим эффектом против ТКА1Ь-резистентных клеток НЕр-2 (рис, I).

Рисунок 1 Цитотоксическая активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК здоровых доноров против опухолевых линий Н£р-2 (А) и Jurkat (Б)

Представлены средние значения (M±SE) цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток линий Jurkat и НЕр-2, п=9, *- ри<0,05 - достоверность различий между цитостатической активностью ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни/ Оценка способности ДК индуцировать генерацию Трег в СКЛ показала, что в отсутствие LPS стимуляции интактные ИФН-ДК обладали более высоким толерогенным/супрессорным потенциалом, поскольку стимулировали генерацию всех трех типов Трег. (CD4ToxP3+. CD8+FoxP3+ CD4"lL10+). В то же время после активации LPS ИФН-ДК теряли способность индуцировать CD4"FoxP3' Т-клетки и не отличались от ИЛ4-ДК по способности стимулировать генерацию CD8 FoxP3' и CD4 ILIO" Т-лимфоцитов. Таким образом, LPS-активированные ИФН-ДК не отличались по толерогенному потенциалу от ИЛ4-ДК (табл. 5).

Таблица 5

Сравнительная характеристика процентного содержания регуляторных

% клеток МНК СКЛ, инду цированная ИЛ4-ДК(п=12) СКЛ, индуцированная ИФН-ДК(п=14)

ДК(0) flK(LPS) ДК(0) flK(LPS)

CD44 FoxP3* 3,700,4 6,9 0 0,9* 4,8 □ 0,6 7,1 DO,8* 5,8Q0,8*

CD8 FoxP3" 6,601,7 7,7 □ 1,6 юд а 2,0* 14,7П2,5*# 13,402,6*

CD41L-10" 2,200,5 2,3 ПО,6 5,0 □ 1,8* 4,6П0,6*,# 5,600,9*

.ч^д ^ш^шш иидсржаНИЯ КЛиТОК

.(%) в СКЛ, индуцированной ИЛ4-ДК либо ИФН-ДК. ДК(0) - интактные, ДК(ЬР8)-после добавления дозревающего стимула. МНК-евежевыделенные МНК периферической крови. *-Ри<0,05 - статистические различия по сравнению с МНК периферической крови. # - ри<0.05 -различия ИФН-ДК по отношению к ИЛ4-ДК, (II- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Суммируя полученные, данные можно заключить, что, несмотря на активацию ЬРБ, ИФН-ДК сохраняют промежуточный фенотип и высокую поглотительную активность, отличаются более высоким провоспалительным и цитотоксическим потенциалом, более эффективно и сбалансированно активируют Т-клетки к продукции цитокинов 1 и 2 типа и при этом не обладают повышенной толерогенной активностью, что обосновывает перспективы использования данного типа клеток в качестве клеточных вакцин. Поэтому следующим этапом работы явилась оценка возможности генерации и характеристика свойств ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями.

ИФН-ДК больных злокачественными опухолями головного мозга (ЗОГМ) характеризовались повышенным содержанием С0141 и С01а~ клеток, включая незрелые-(С01а+С083") и промежуточные (С083+СШа+/С.Ш231 СБНс") ДК, а с другой стороны - снижением доли СЭ83+ и СБ25" ДК. ИФН-ДК у больных лимфомами также отличались признаками задержки дифференцировки и созревания. Эти изменения были наиболее выражены у больных злокачественными лимфомами (ЗЛ), что проявлялось снижением доли зрелых (С083+), в том числе терминально дифференцированных (СВ83Х01а"), активированных (СБ25+) ДК и увеличением ДК с незрелым (СО 14 /СШа"/'СИ 1 а С.083") и промежуточным (С083+СШа+) фенотипом. В то же время у больных множественной миеломой (ММ) ИФН-ДК фенотипически не отличались по структуре от таковых у здоровых доноров (рис. 2).

Шдоноры (п=18) □ больные ЗЛ (п=10) □больные ММ (п=12) □больные ЗОГМ(п=19)

35 30 ' 2520 15; 10 5 0

5Й

№

я

4 АЛ г

Рисунок 2 Фенотипическая характеристика ИФН-ДК у больных онкологического профиля

Представлены средние значения (М±5Е) относительного содержания субпопуляций ДК (%)* -ри<0,05 - достоверность различий по сравнению с донорами, и - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Сравнение цитокин-продуцирующей функции показало, что культуры ДК у больных ЗОГМ не отличались по уровню продукции ТЫ и ТЬ2 цитокинов, у больных ЗЛ характеризовались снижением ГРЫ-у и повышением 1Ь-10, у больных ММ - только усилением продукции 11.-10. Аллостимуляторная активность ДК больных ЗОГМ не отличалась от таковой у доноров, тогда как у больных ЗЛ была существенно снижена.

Угнетение аллостимуляторной активности у пациентов ММ было выражено существенно в меньшей степени. При этом ДК больных ЗОГМ и ММ обладали сходной с донорами ТЫ-стимуляторной активностью и не индуцировали ТЪ2 ответ, тогда как ДК больных ЗЛ имели повышенную ТЬ2-стимуляторную активность (табл.

б).

Таблица б

Функциональные особенности ИФН-ДК у больных онкологического профиля

Доноры ЗОГМ ЗЛ ММ

Продукция цитокинов (пг/мл) - 113 + 55 146 + 39 35 + 17* 127± 35,0

- 1И0 82 ± 12 153+48 444 + 59 * 110+12,3 *

Аллостимуляторная активность (имп/мин) 12877±1109 11494+ 1400 3825 + 852* 7093+913 *

ТЫ -стимулирующая активность (ИВдк)СОЗ+Т-1тт+ 5,4+1,1 3,9+1,2 5,4 + 1,4 5,5 + 1,4

ТЪ2-стимулирующая активность (ИВдк)С1)3+Т-1Ь-4+ 2,7 + 0,25 1,3 ±0,24 4,2 + 0,6 * 2,0 + 0,2

Примечание: данные представлены в виде средних (\bfcSE), ИВдк - индекс влияния ДК. * -достоверность различий показателей по сравнению с донорами (ри <0,05. и- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Отличительным свойством ДК у больных глиомами явилось также снижение цитотоксической активности против опухолевых клеток линии НЕр-2 (рис. ЗА). А Б

Рисунок 3 Цитотоксическая активность ИФН-ДК у онкологических больных

А - представлены средние значения (М±8Е) цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток линий НЕр-2, *- ри<0,05 - достоверность различий между цитостатической активностью доноров и больных ЗОГМ(п=28), # ри<0.05-достоверность различий доноров и больных ЗЛ (п=9), (0 - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) Б - представлены средние значения(М±5Е) цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток линий НЕр-2 у больных ЗОГМ разной степени злокачественности (п=16) *- рц<0,05 - достоверность различий

Анализ пациентов с учетом степени злокачественности опухолей показал выраженную гетерогенность цитотоксического потенциала. При этом снижение цитотоксической активности ДК было характерно для пациентов с высокой степенью злокачественности (Grade III-IV), тогда как больные с опухолями низкой степени злокачественности (Grade 1-Й) характеризовались сохранной цитотоксической активностью (рис. ЗБ). Снижение цитотоксической активности ДК наблюдалось также у больных злокачественной лимфомой.

Исследования ИФН-ДК у больных с инфекционными заболеваниями выявило сходные закономерности. Так, ДК больных хроническими вирусными гепатитами имели признаки задержки созревания и активации ДК, повышенный уровень продукции IL-10, угнетение аллостимуляторной активности и повышение Th-2 стимуляторной активности. Эти признаки регистрировались у больных гепатитом С, максимально проявлялись у пациентов с циррозом печени (независимо от типа инфекции) и практически не наблюдались у пациентов с хроническим гепатитом В (табл. 7).

Характеристика ИФН-ДК у больных X Таблица 7 юнической вирусной инфекцией

Параметры Доноры HBV HCV HBV+ЦП HCV + ЦП

Фенотип - CD25 (%) 25,5+3,5 17,7±3,0* 16,6±3,7* 15,2+4,8* 11,0+3,2

Продукция цитокинов (пг/мл) -IFNy 94 + 46 250 ± 87 146 ±42 58 ± 12 214 ± 18

-IL-10 82+13 122 ± 34 566 ±99* 124 ±24 584+112*

Аллостимуляторная активность (имп/мин) 12820±1110 9020+1020 13895+1870 7200 +987* 3220+584*

Th 1 -стимулирующая (HBik)CD3+T-FNT+ 5,0 ± 1,0 4,5 + 0,6 3,9 ± 0,9 3,9+ 1,1 2,8 ± 1,1*

ГЬ2-стимулир\'Ющая (HB;ik)CD3*T-IL-4' 1,8 + 0,6 1,9 + 0,8 1,7 + 0,7 2,9 ±0,1 * 2,7 ± 0,7 *

Примечание : данные представлены в виде средних (М±8Е), ИВдк- индекс влияния ДК, * - достоверность различий показателей по сравнению с донорами (ри <0,05, II- критерий В илкоксона-Манна-У итни).

ДК больных ТБ (табл. 8) также характеризовались признаками меньшей зрелости, о чем свидетельствовало более высокое содержание СБ14+ клеток в исследуемых культурах и снижение числа зрелых активированных ДК, экспрессирующих СЕ)25'-молекулу. Кроме того, ИФН-ДК больных отличались повышенной продукцией 1Ь-10 и 1Ь-6, угнетением аллостимуляторной активности, снижением способности активировать ШЫ-П -продуцирующие Т-клетки и усилением ТИ2-стимуляторной активности. Эти изменения были более выражены в группе пациентов со сниженным антигенспецифическим ответом на ППД (табл. 8).

Таблица 8

Характеристика ИФН-ДК у больных туберкулезом легких_

Параметр Доноры Больные ТБ Больные туберкулезом

ППД(+) ППД(-)

Фенотип (%) CD 14 CD25 8,7 ± 1,4 25,1 ±3,5 19,6 ±2,5* 9,6+1,2* 12,2 ± 2,7* 8,8 + 1,3* 30.0 ±5,4* 12.1 ±2,9*

Продукция цитокинов (пг/мл) - IFNy -1L-10 -IL-6 110 + 60 121 + 56 9248 ± 2487 19+1,6* 500 + 50 * 12950 + 795* 20 ±2,1 * 411 ±68* 13468 +859 14 + 3,7* 604 ±64* 10685+1953

Аллосгимуляторная активность (имп/мин) 12820+ 1192 4200 ±192 6230+ 124 1890+47

Th 1 -стимулирующая (ИВдк) CD3 T-IFNy+ 5,0 ± 1,0 4,8 ± 0,9 2,4 + 0,3 * - : 1,3 + 0,2 *

ТЬ2-стим\'лирующая (ИВдк) CD3+T-IL-4+ 1,8 ±0,6 1,3 + 0,2 1,6 + 0,1 2,8 + 0,3 *

Примечание: данные представлены в виде средних (М±5с), ИВдк - индекс влияния ДК, *

достоверность различий показателей по сравнению с донорами (ри <0,05, и- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Обнаруженные нами изменения фенотипа и функций ИФН-ДК при онкопатолопш и инфекционных заболеваниях ставят вопрос о полноценности генерируемых ДК при использовании их в качестве клеточных вакцин и разработке подходов к коррекции нарушений ДК, генерируемых у больных с онкопатологией и инфекционными заболеваниями. Поэтому с целью изучения возможности коррекции функциональной активности ДК было проанализировано влияние различных иммуноактивных факторов на аллостимуляторную активность ДК, полученных от больных злокачественными лимфомами и туберкулезом легких. В качестве потенциальных модуляторов использовались рекомбинантный интерлёйкин-2, человека («Ронколейкин»), сополимер №окси-1,4-этиленпиперазина и (14-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида («Полиоксидоний»), комплекс провоспалительных цитокинов («Суперлимф») и двуцепочечная ДНК человека («Панаген»), Добавление указанных факторов на этапе созревания к ДК больных злокачественной лимфомой и ТБ повышало исходно низкий уровень аллостимуляторной активности. При этом ДК больных ТБ отличались меньшей чувствительностью к рИЛ-2 и ДНК, чем ДК больных ЗЛ (табл. 9).

Таблица 9

Влияние иммуноактивных факторов на аллостимуляторную активность

пациентов злокачественной лимфомой

Пролиферативная активность в СКЛ (имп/мин)

ЗЛ (п=14) ТБ (п=19)

МНК (спонтан) 575 ± 44 687 ± 75

МНК+ДК(0) 3178 ±325 5331 ±638

МНК+ДК (+)рИЛ-2 (ЮОЕД/мл) 12211 ±977* 10562 ±2491 *

МНК+ДК(+)полиоксидоний (2 нг/мл) 5771 ±472 6281 ±798*

Окончание таблицы 9

МНК+ДК(+)с\ перлимф (20 нг/мл) 5014 ±361* -

МНК+ДК(+) панаген (5 мкг/мл) 7433,3 ± 357,4* 5861,5 ±948,4

Примечание: представлены средние значения (M±SE) пролиферативной активности в СКЛ. Респондеры - аллогенные МНК, стимуляторы -интактные (ДКО) и предобработанные ДК (+), *-Ри<0,05- достоверность различий показателей по отношению к культурам ДК(0), U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Наряду с аллостимуляторной активностью, важным свойством ДК, особенно в аспекте их использовании в качестве противоопухолевых вакцин, является прямая противоопухолевая цитотоксическая активность. Выявление дефектности указанной функции у больных с глиомами головного мозга высокой степени злокачественности и пациентов злокачественными лимфомами побудило исследовать возможность стимуляции цитотоксической активности ДК in vitro с помощью анализируемых факторов. Как следует из данных таблицы 10, анализируемые факторы усиливали исходно сниженную цитотоксическую активность ДК больных ЗОГМ и ЗЛ против клеток линии Нер-2. Таким образом, стимуляция ДК в культуре in vitro рядом иммуноактивньгх препаратов позволяет частично или полностью восстановить сниженную цитотоксическую активность ДК у больных онкологическими заболеваниями.

Таблица 10

Влияние иммуноактивных факторов на цитотоксическую активность ДК

больных ЗОГМ (Grade ГУ) и ЗЛ против клеток линии НЕр-2

Больные ЗОГМ (Grade IV) (п=8) Больные ЗЛ (п=7)

(%) ИВ (%) ИВ

ДК(0) 8 ±2,5 - 29 ± 8,4 -

ДК (+р-ИЛ-2 100 Ед/мл)) 27 ± 4,7* 7,5 ± 2,6 30 ± 4.8 2,1 ±1,2

ДК (+панаген 5 мкг/мл) 16 ±2,9* 6,1 ±3,7 31 ±3,9 2,3 ± 1,3

ДК(+полиоксидоний 2 нг/мл) 20 ±4,3* 7,4 ±4,1 30 ±3,3 1.8 ±0,8

Примечание: представлены средние значения (M±SE) цитотоксической активности ДК (%) больных ЗОГМ (Grade IV) и ЗЛ в присутствии различных иммуностимулирующих факторов в МТТ-тесте, ИВ- (индекс влияния) - отношение цитотоксичности в присутствии стимулов к ДК (0)*-рь<0,05 - достоверность различий по сравнению с ДК (0), U - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Полученные выше данные продемонстрировали, что, несмотря на выраженную способность к стимуляции Thl-ответа, ИФН-ДК могут обладать супрессорной/толерогенной активностью. При онкологических и инфекционных заболеваниях данная активность ДК является неблагоприятным фактором. Однако толерогенная активность ДК может играть позитивную роль в индукции иммунологической толерантности при беременности, при этом функции ДК могут быть подвержены гормональной регуляции. Проведенные нами ранее исследования показали, что угроза прерывания беременности при надпочечниковой гиперандрогении (ГА) сопряжена с дефектом супрессорной перестройки [Селедцова и др., 2006 г]. Учитывая стимулирующее действие дегидроэпиандростерон сульфата

(ДГЭАС) на Thl-ответ и Ж-клетки [Powell J.M. et al, 2006] и экспрессию на ДК рецепторов к стероидным гормонам, можно предположить, что физиологическая беременность ассоциирована с доминированием толерогенной активности дендритных клеток, тогда как у беременных с ГА ДК проявляют иммуностимулирующую активность, индуцированную ДГЭАС. Соответственно, следующий раздел был посвящен сравнительному исследованию ДК при физиологической гестации и у беременных с ГА, а также оценке влияния ДГЭАС на созревание и функции ИФН-ДК in vitro (табл. 11).

Таблица 11

Особенности ИФН-ДК при физиологической беременности и

беременности, осложненной гиперандрогенией_

Параметр Женщины (п=20) Физиологическая беременность (п=18) Беременные ГА (п=18)

Фенотип (%) CD83 CD25 23 + 4,1 23+4,1 11 + 1,2* 9 + 1.3* 26 ± 1,8 # 27 ± 2,9 #

Продукция цитокинов (пг/мл) - IFNy -IL-4 340+63 92+5 33 + 7* 174+17* 2303±518 * # 31 ± 8 * #

Аллостимуляторная активность (ИВ) 24 ±3,9 8 + 0,9* 22 ± 8.7#

Th 1 -стимулирующая активность (ИВ jjK)CD3+IFNy+ 5,2 ± 0,9 1,1 ±0,2* 2,0 ± 0,4*#

ГЬ2-стимулирующая активности (ИВж)С03ЛЬ-4+ 1,3 ±0,2 3,5 ±0,4* 2,4 ±0.5*

Продукция в СКЛ(ИВ) - IFNy - IL-4 22 + 3,1 2,0 ± 1.0 3.4 ± 0,9* 4,6 ± 2.2* 13,3 + 3,1* 5,4 ± 2,0*#

Апоптоз CD16CD56 4.2 ±0,6 21,5 ±3,8 -

Примечание: данные представлены в виде средних значений (М±8Е), ИВдк- индекс влияния ДК, * - достоверность различий показателей по сравнению со здоровыми женщинами, # -достоверность различий по сравнению с физиологической беременностью, (р„ <0,05, и-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

По сравнению с небеременными женщинами ДК беременных отличались меньшим содержанием С1383' - и СТ)25+- клеток, сниженной продукцией 1РМ-1_ и повышенной - IЬ-4, меньшей аллостимуляторной активностью, отсутствием способности индуцировать генерацию 1Ш-у продуцирующих Т-клеток и продукцию 1БМ-у и повышенной способностью индуцировать 1Ь4-продуцирующие клетки и секрецию 1Ь-4. Следует отметить, что одним из интересных проявлений толерогенной активности ДК беременных была их способность индуцировать апотоз активированных 1ЧК-клеток, что, видимо, объясняет снижение количества этих клеток при беременности. По сравнению с физиологической гестацией ДК беременных с ГА характеризовались нормальной экспрессией С083- и СБ25, более высокой продукцией ПГЫ-П и низкой - 1Ь-4, сохранной аллостимуляторной активностью и, наряду с Т1г2-стимуляторной активностью, индуцировали возрастание числа продуцирующих клеток и секрецию ГО^-у в СКЛ (табл. 11).

Эффект ДГЭАС на экспрессию поверхностных маркеров оценивался в культурах ДК, генерируемых из периферической крови женщин с физиологической беременностью. Добавление ДГЭАС в культуры ДК на этапе дозревания (совместно с LPS) приводило к значимому возрастанию доли CDla+, CD83+ и CD25+ДК (таблица 12) , усилению аллостимуляторной активности (9354±1916 в присутствии ДГЭАС. против 4640±1007 в отсутствие гормона) и индуцировало появление Thl-стимулирующей активности.

Таблица 12

Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на диффереицировку и созревание

ИФН-ДК беременных женщин

CD маркер (%) В отсутствие ДГЭАС (п=10) В присутствии ДГЭАС (10"6М)

В течение всего периода генерации ДК (п=10) На стадии дозревания ДК (п=10)

CD83 17.0 ±2.4 17,5 ±2,8 21.5 ± 3,1**

CDla 4,1 ±0.3 4,9 ± 0.7 6.3 ± 0,8*

CDllc 18,4 ±2.8 19.6 ±3,0 19.3 ±3,0

CD 123 21,6 ±3,4 23.0 ±3.8 21.5 ±4.1

CD14 14,3 ±2.2 12,8 ± 1.9 14,4 ±2.2

CD25 8,8 ± 2.2 9,4 ± 1.6 12.0 ±2,1*

Примечание: данные представлены в виде средних значений (М±5.Е\; *рц<0,05, **рц<0,01 -достоверность различий по сравнению с ДК, полученными в стандартных условиях (II-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Так, концентрация №N-7 в культурах СКЛ, индуцированных ДГЭАС-модифицированными ДК более чем в 2 раза превышала таковую в культурах СКЛ, индуцированных интактными ДК (344±160 против 144±90 пг/мл; (п=14); ри <0,05), т.е. гормон индуцировал свойства, характерные для ДК беременных с ГА. Обработка ДК ДГЭАС приводила также к ослаблению проапоптогенной активности ИФН-ДК, т.е. их способности индуцировать апоптоз СБ16+С056+ клеток (с 4,1±0,7 до 21,1±5,0%; ри<0,05). Аналогичным образом ДГЭАС влиял и на ДК доноров, т.е. стимулировал созревание ДК и усиливал их ТЫ-стимуллторную активность. Тем не менее, ДК беременных обладали большей чувствительностью к стимулирующему эффекту гормона. Так, в культурах ДК доноров ДГЭАС практически не влиял на аллостимуляторную активность (18780 ± 1190 имп/мин в отсутствие ДГЭАС против 19910 ± 1870 имп/мин в присутствии ДГЭАС) и не менял баланса цитокинов.

Полученные данные свидетельствуют о том, '¿то ДГЭАС может оказывать иммуностимулирующий эффект опосредованно через ДК, индуцируя их диффереицировку/созревание, усиливая ТЫ стимуля торную активность и подавляя способность индуцировать апоптоз МК-клеток.

Следующий этап работы был посвящен клинической апро.бации ИФН-ДК в лечении больных ЗОГМ и хроническими вирусными инфекциями (ХВГВ и герпесвирусная инфекция). Клинические испытания безопасности и эффективности иммунотерапии (ИТ) с использованием ИФН-ДОС были проведены на базе ФГУ

НИИТО Росмедтехнологий в период с 2003 до 2007 гг в соответствии с разработанным протоколом, утвержденным Учеными советами Института клинической иммунологии и ФГУ НИИТО Росмедтехнологий (протокол № 1, апрель 2003 г) и одобренным локальным этическим комитетом. Клинические испытания проводились в дизайне пилотного контролируемого нерандомизированного исследования с историческим контролем. Основным критерием эффективности служило развитие антигенспецифического противоопухолевого иммунного ответа, дополнительным - улучшение показателей выживаемости и качества жизни. ИТ как дополнение к оперативному лечению и радиотерапии проводилась 32 пациентам (основная группа). Группу сравнения (исторический контроль) составил 91 пациент, которые получали хирургическое лечение и радиотерапию. ИТ включала курс адоптивной иммунотерапии (2-кратное локорегиональное введении лимфокин-активированных киллерных клеток и цитотоксических Т-клеток в ложе удаленной опухоли) и курс вакцинотерапии (6 подкожных инъекций ДК, нагруженных опухолевыми антигенами, в дозе 5-10х106/введение с кратностью вакцинаций - 1 раз в 2 недели в сочетании с подкожным введением Роиколейкина в дозе 250000 МЕ). Проводимая терапия характеризовалась хорошей переносимостью, поскольку не вызывала выраженных цитокиновых реакций и ухудшения общемозговой симптоматики, а также каких-либо осложнений, связанных с интрацеребральным введением клеток и вакцинацией пациентов.

Таблица 13

Индукция антиген-специфического ответа в процессе вакцинации дендритными клетками больных злокачественными глиомами

До вакцинации После трех вакцинаций После шести вакцинаций

Спонтанная пролиферация 425 ± 74 321 ±88 666 ± 145

Опухолевый АГ 0,01 мг/мл 663 ±154 (1,65 ±0,4) 363±121 (1,3 ±0,3) 5170 ± 1507 * (10,9 ±4,9) :

Примечание: представлены средние значения пролиферативного ответа (имп/млн) МНК больных (п=10) на специфический опухолевый антиген. В скобках - индексы влияния (отношение индуцированной антигеном пролиферации к спонтанной пролиферации), *-ри<0,05 - достоверность различий по сравнению с состоянием до начала вакцинаций (и -критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

При этом ИТ с использованием ИФН-ДК сопровождалась индукцией антигенспецифического иммунного ответа. Об этом свидетельствовало существенное возрастание пролиферативного ответа МНК на опухолевые антигены после 3, и особенно после 6 вакцинаций (табл. 13). Кроме того, развитие иммунного ответа подтверждалось появлением положительной кожной пробы на опухолевые антигены в реакции ГЗТ. Так, исходно кожная проба на ОА была отрицательной у всех 25 обследованных пациентов. В то же время после 3 и 6 иммунизаций положительная кожная проба регистрировалась у 7 (28%) и 16 (64%) пациентов, соответственно. При

этом значительных различий среди пациентов с опухолями Grade IV и Grade П1 не наблюдалось. При статистическом анализе показателей выживаемости в сравниваемых группах оказалось, что относительное количество выживших больных в основной группе к исходу 12, 24 и 36 мес. было достоверно выше, чем в группе сравнения (65,6%, 50%, 37% против 48,4%, 23%, 7,7%, соответственно). Анализ кривых выживаемости у пациентов с глиобластомой и анапластической астроцитомой показал, что выживаемость больных, получивших ИТ, в обеих группах была достоверно выше, чем у больных при проведении стандартного лечения (рис.4). Показатель продолжительности жизни больных глиомами Grade III составил в основной группе 30,7±3,1 мес, что значимо превышало таковую в группе сравнения (20,0±2,3; р ¡¿2=0,01). Средняя продолжительность жизни в основной группе больных Grade IV составила 12,8±1,9 мес, что также значимо превышало аналогичный показатель в группе исторического контроля (7,2±0,28 мес; р=0,002). При сравнении показателей качества было установлено, что при равных исходных значениях индекса Карновского показатели качества жизни через 6, 12 и 24 мес. в основной группе были достоверно выше (84 ± 1,4; 86 ± 1,6; 91 ± 2,3 балла), чем в группе сравнения (66 ± 1,6; 66 ± 1,8 и 61 ± 3,7 баллов, соответственно).

А Б

Рисунок 4. Показатели выживаемости (мес) больных глиомами

А - Grade III- Основная группа - пунктирная линия, группа сравнения сплошная линия. Достоверность различий кривых - р=0,001. Б - Grade IV. Достоверность различий кривых -р=0,009

Таким образом, ИТ больных ЗОГМ с использованием ИФН-ДК показала хорошую переносимость и отсутствие побочных токсических реакций, а также возможность индуцировать иммунный ответ, что ассоциировалось с улучшением показателей выживаемости и качества жизни пациентов

Апробация ДК-вакцин у больных хроническими вирусными инфекциями была проведена в дизайне открытых проспективных пилотных исследований с контролем «до-после» в группе 9 пациентов хроническим вирусным гепатитом В (ХВГВ) и 7 больных с герпесвирусной инфекцией в соответствии с протоколами (протокол № 6 от 26 сентября 2006 г. для ХВГВ и протокол № 9 от 11 декабря 2007 г. для

герпесвирусной инфекции). Отбор больных и лечение проводились на базе отделения иммунологии Клиники Института клинической иммунологии СО РАМН в период с сентября 2006 по ноябрь 2008 г. Основным критерием эффективности лечения у больных гепатитом служило прекращение репликации вируса, дополнительными - нормализация биохимических показателей и индукция антигенспецифического ответа. У больных герпесвирусной инфекцией основным критерием эффективности являлось удлинение межрецидивного периода . после завершения 2-х курсов ИТ, дополнительным - индукция антигенспецифического ответа. Иммунотерапия включала два курса: первый состоял из 4-6 вакцинаций ИФН-ДК, нагруженными рекомбинантными вирусными антигенами (HBsAg -вакцинальный АГ «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия и рекомбинантный антиген вируса герпеса -HSVlgD, соответственно) с 2-недельным интервалом. Второй курс - 4-6 вакцинаций с кратностью 1 раз в месяц. Количество ДК на одну вакцинацию составляло 5x106 клеток.

В группе больных с ХВГВ к моменту завершения исследования 2 из 9 больных гепатитом имели полный стабильный ответ (прекращение репликации вируса и нормализация биохимических показателей), у 3 пациентов отмечалось временное прекращение репликации вируса, сопровождающееся устойчивой нормализацией биохимической активности. ИТ сопровождалась достоверным усилением антигенспецифического ответа, который сохранялся повышенным до 6 мес после завершения терапии. При этом у больных не отмечалось усиления биохимической активности, а также исходно сохранной митогенной реактивности или реактивности к IL-2 (табл. 14).

Таблица 14

Динамика пролиферативного ответа МНК больных ХВГВ на НВв-антиген

Пролиферативная активность (имп/мин)

МНК(0) МНК(АГ+) MHK(1L2+) MHK(IL2+ АГ) КонА(15 мкг/мл)

До лечения 272±65 354±109 2624±532( 3632±881 34379±6071

После 1 курса ИТ 296±51 424±51 2406±541 4393±82 40185±6525

После 2 курса ИТ 183±98 695±220* 2892±892 3506±934 36830±7689

Через 6 мес.п/е ИТ 215±96 956±289* 2987±789 3870±987 39879±8950

Примечание: данные представлены в виде средних значений пролиферативного ответа (М±8Е) МНК больных ХВГВ в отсутствие антигена (МНКО), в присутствии АГ- МНК(АГ+), интерлейкина-2 в дозе 100 Ед/мл МНК(1Ь2+) и сочетания стимулов МНК(1Ь2+АГ), *-достоверность различий по отношению к МНК(0), ри<0,01, и-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни

Как известно, стандартная противовирусная терапия у больных ХВГВ не всегда позволяет достичь прекращения репликации вируса и нормализации биохимических показателей. С этой точки зрения активация специфического иммунного ответа с

помощью иммунизации ДК, нагруженными НВя-антигеном, может рассматриваться в качестве дополнительной стратегии противовирусной терапии.

У больных герпесвирусной инфекцией ИТ с использованием ДК сопровождалась достоверным увеличением межрецидивного периода за время лечения (9 мес) и б-месячного срока последующего наблюдения. При анализе клинической эффективности у больных герпесвирусной инфекцией было показано достоверное уменьшение числа обострений на фоне лечения (4,0±0,7 против 5,93±0,48 эпизодов до лечения; ри<0,05) и в течение последующих б месяцев наблюдения (2,4±0,97; ри<0,05). Соответственно, межрецидивный период на фоне терапии возротал до 81,6±13,8 дней, и в период 6 мес наблюдения после терапии составил 67,1±16,2 дня, что было достоверно выше соответствующего показателя до лечения (18,7±3,2; ри<0,05) При этом у 3 пациентов после лечения не было зарегистрировано ни одного обострения, а у остальных 4-х обострения протекали более мягко, с меньшей площадью высыпаний и менее выраженной интоксикацией. Исследование антигенспецифического и митогениндуцированного пролиферативного ответа в культурах МНК больных показало, что исходно пациенты с герпесвирусной инфекцией характеризовались сниженным уровнем Кон-А стимулированной пролиферации и отсутствием реактивности при стимуляции вирусным антигеном. Проведение ИТ сопровождалось достоверным усилением антигенспецифического ответа, который сохранялся повышенным до б мес после завершения терапии. Кроме того, у больных отмечалось значимое усиление исходно сниженной митогенной реактивности на конканавалин А (табл. 15).

Таблица 15

Динамика пролиферативного ответа МНК больных на антиген и

конканавалин А

Пролиферативная активность (имп/мин)

МНК(О) МНК(АГ+) МНК(КонА+)

До лечения 198 ±44 208,1 ±44 12314±1840

После 1 курса ИТ 167 ±45 932,0 ± 280* 16444 ±2861

После 2 курса ИТ 150± 27 598 ± 222* 25979 ±4453*

Через 6 мес после ИТ 208 ±43 1196 ±552* 64450±18050*

Примечание: данные представлены в виде средних значений пролиферативного ответа (М±8Е) МНК больных герпесвирусной инфекцией в отсутствие (МНКО) и в присутствии АГ - МНК(АГ+), "-достоверность различий, ри<0,05, и-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни

Таким образом, ИТ хронических вирусных инфекций с использованием ДК позволяет уменьшить число рецидивов и, соответственно, увеличить продолжительность безрецидивиого периода, а также снизить тяжесть рецидивов, что сопряжено с активацией специфического и неспецифического иммунного ответа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование позволило охарактеризовать ДК, генерируемые в условиях замены ингерлейкина-4 интерфероном-D, причем впервые сравнить ИФН-ДК и ИЛ4-ДК, активированные LPS. Полученные результаты продемонстрировали, что ИФН-ДК имеют отличительные особенности, ряд из которых делает эти клетки привлекательными для клинического использования. ИФН-ДК сохраняют промежуточный по степени зрелости фенотип и высокую эндоцитарную активность, характеризуются более высокой цитокинсекреторной, ТЫЛПгё-стимулирующей и цитотоксической активностью против опухолевых клеток, в том числе, ассоциированной с экспрессией молекулы TRAIL. Исследование ЙФН-ДК при патологии показало, что ИФН-ДК, генерируемые у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями могут существенно отличаться по фенотипическим и функциональным свойствам, в частности, приобретать толерогенную/супрессорную активность, обусловленную повышенной продукцией IL-10, снижением Thl- и усилением Th-2 стимуляторной активности. Эти изменения наиболее выражены у пациентов злокачественными лимфомами, хроническим вирусным гепатитом С и больных туберкулезом легких со сниженным антигенспецифическим ответом. Исследование влияния различных иммуноакгивных препаратов на функции ДК показало, что обработка ДК в культуре in vitro интерлейкином-2, комплексом провоспалительных цитокинов, двуцепочечной ДНК, полиоксидонием значимо усиливала аллостимуляторную активность ДК у больных со злокачественными лимфомами и туберкулезом легких, а также цитотоксическую активность ДК у больных онкологического профиля. Эти данные обосновывают принципиальную возможность коррекции дисфункций ИФН-ДК у больных с онкопатологией и инфекционными заболеваниями. Кроме того, было показано, что ИФН-ДК являются мишенями гормональной регуляции и опосредуют иммуностимулирующий эффект ДГЭАС, повышенный уровень которого у беременных с гиперандрогенией обусловливает снижение толерогенного потенциала ДК, характерного .. для физиологической беременности. Итогом работы стала апробация иммунотерапии на основе ИФН-ДК в лечении больных злокачественными опухолями головного мозга и хроническими вирусными инфекциями. Использование ДК-вакцин характеризовалось хорошей переносимостью и приводило к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождалось улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями; прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции, что обосновывает возможность и перспективность использования ИФН-ДК в качестве клеточной основы при создании индивидуальных лечебных вакцин.

выводы

1. По сравнению с LPS-активированными ИЛ4-ДК популяция генерированных in vitro ИФН-ДК характеризуется более высоким содержанием клеток, зкспрессирующих CD 14, CDllc/CD123 и TRAIL и меньшим количеством CD83+ клеток, что в совокупности с высокой эндоцитарной активностью ИФН-ДК свидетельствует об их промежуточной степени зрелости и более выраженном цитотоксическом потенциале.

2. ИФН-ДК обладают более высокой, чем ИЛ4-ДК, цитокин-продуцирующей активностью (продукция IFN-y, IL-2, IL-ip, TNF-a, IL-10, 1L-5, MCP-1 и G-CSF), более активно индуцируют генерацию CD3+IFNy+ Т-клеток и способны активировать CD3 1L4* Т-клетки, что обусловливает их высокий потенциал в индукции/регуляции иммунного ответа.

3. ИФН-ДК более эффективно ингибируют пролиферацию TRAIL-резистентных опухолевых клеток НЕр-2 и обладают большей цитотоксической активностью против TRADL-чувствительных клеток Jurkat, что свидетельствует о более высоком противоопухолевом потенциале этих ДК по сравнению с ИЛ4-ДК. При этом отсутствие прямой взаимосвязи между цитотоксической и цитостатической активностью ИФН-ДК указывает на возможное вовлечение различных механизмов в реализацию данных эффектов.

4. В отсутствие стимуляции LPS ИФН-ДК обладают более высокой способностью к индукции регуляторных Т-клеток, о чем свидетельствует более высокое содержание не только CD44Foxp3' , но и CD8+FoxP3+ и CD4+IL-10+ Т-клеток в культурах СКЛ, индуцированных ИФН-ДК. После активации LPS ИФН-ДК теряют способность индуцировать CD4+Foxp3+ Т-клетки и в одинаковой с ИЛ4-ДК степени индуцируют генерацию СОЯ^охРЗ* и CD4+IL-10+ Т-лимфоцитов, что свидетельствует о схожей толерогенной/супрессорной активности активированных ДК.

5. ИФН-ДК у больных с онкопатологией характеризуются увеличением доли незрелых/промежуточной степени зрелости и уменьшением зрелых ДК; повышением продукции IL-10 и уменьшением - IFN-y; снижением аллостимуляторной активности, ослаблением Thl- или возрастанием Th2-стимуляторной активности, а также уменьшением цитотоксической активности, что свидетельствует о задержке дифференцировки/созревания ДК и снижении способности ДК активировать/опосредовать реакции клеточного иммунитета. При этом спектр и выраженность указанных изменений при различных нозологических формах онкологических заболеваний варьирует от минимальных до выраженных.

6. ИФН-ДК при HBV-инфекции сходны с таковыми у доноров, тогда как у больных HCV-инфекцией, ЦП (независимо от природы вируса) и туберкулезом легких характеризуются признаками задержки

дифференцировки/созревания, смещением баланса в сторону продукции Th2-цитокинов и усилением ТЬ2-стимуляторной активности, что указывает на снижение способности ДК активировать реакции клеточного иммунитета при данных патологиях.

7. ИФН-ДК при физиологической беременности характеризуются признаками незрелости, смещением баланса в сторону продукции ТЬ2-цитокинов, снижением аллостимуляторной- в сочетании с усилением ТЬ2-стимуляторной активности и наличием цитотоксической активности против CD56+CD16+ NK-клеток, тогда как у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией не отличаются по количеству зрелых/активированных ДК от таковых у небеременных женщин и обладают сохранной аллостимуляторной-/ТЫ-стимулирующей активностью, что свидетельствует о толерогенных/супрессорных свойствах ДК при физиологической гестации и потери этой активности на фоне повышенного уровня ДГЭАС при надпочечниковой гиперандрогении.

8. ДГЭАС в культурах in vitro стимулирует созревание ИФН-ДК, продукцию IFN-y и TNF-a и Thl-стимуляторную активность ДК и подавляет их проапоптогенную активность против CD56+CD16+ NK-клеток, что свидетельствует об участии ДГЭАС в гормональной регуляции ДК и его возможной роли в изменении свойств ИФН-ДК у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.

9. Интерлейкин-2, комплекс провоспалительных цитокинов, двуцепочечная ДНК и полиоксидоний усиливают in vitro аллостимуляторную активность ДК больных злокачественными лимфомами и туберкулезом легких и цитотоксическую активность ИФН-ДК против TRAIL-резистентных опухолевых клеток у больных злокачественными глиомами и лимфомами, что обосновывает принципиальную возможность коррекции функциональной активности ДК у больных с онкопатологией и инфекционными заболеваниями.

10. Иммунотерапия на основе ИФН-ДК у больных ЗОГМ сопровождается индукцией специфического иммунного ответа (усилением пролиферативного ответа МНК и появлением реакции ГЗТ в ответ на опухолевые антигены). Отсутствие выраженных побочных реакций, улучшение показателей качества жизни и выживаемости свидетельствует о безопасности и клинической эффективности ДК вакцин в лечении больных с онкопатологией.

11. Использование вакцин на основе ИФН-ДК в качестве монотерапии у больных HBV- и герпесвирусной инфекцией характеризуется хорошей переносимостью, приводит к индукции антиген-специфического иммунного ответа и сопровождается прекращением репликации вируса/нормализацией биохимической активности при ХВГВ (соответственно, в 22 и 55% случаев) и

удлинением межрецидивного периода у пациентов с герпесвирусной инфекцией.

12.ИФН-ДК могут быть использованы в качестве новой технологической платформы для создания индивидуальных дендритноклеточных вакцин с целью генерации эффективного антигенспецифического иммунного ответа у больных онкологическими и инфекционными заболеваниями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хонина Н А., Центнер М.И., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Ступак В В., Никонов С.Д., Черных Е.Р., Останин А.А. Характеристика и механизмы иммунных нарушений у больных со злокачественными опухолями головного мозга//Вопросы онкологии - 2002 - Т. 48, № 2,- С. 196-201.

2. Черных Е.Р., Ступак В В., Центнер М. И., Хонина Н. А., Леплина О. Ю., Тихонова М.А., Никонов С.Д., Останин А.А. Комбинированная иммунотерапия в лечении злокачественных опухолей головного мозга //Медицинская иммунология,- 2002 - Т. 4, №4/5. - С. 583-592.

3. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Сычева Н.В., Останин А.А., Козлов Ю.П., Никонов С.Д., Ступак В.В. Новые клеточные технологии иммунотерапии в лечении злокачественных глиом головного мозга//Мат. Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения», Ленинск-Кузнецкий - 2003. - С. 306-307.

4. Останин А.А., Центнер М.И., Хонина Н.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Никонов С.Д., Ступак В.В., Черных Е.Р. Антигенспецифическая иммунотерапия в комплексном лечении больных со злокачественными опухолями головного мозга//Вопросы онкологии,- 2003. - Т. 49, № 2,- С. 170175.

5. Крючкова И.В., Лисуков И.А., Кулагин А.Д., Сизикова С.А, Гилевич А.В, Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Козлов В.А. Опыт использования талндомида и вакцины на основе аутологичных дендритных клеток у больного с рецидивом множественной миеломы после аутологнчной трансплантации стволовых кроветворных wieTOK//Abstracts of Russian-Norwegian Conference in Hematology. Saint-Petersburg. -2003. -P.48-50.

6. Леплина О.Ю., Хонина Н А., Останин А.А., Центнер М.И., Ступак Б.В., Никонов С.Д., Черных Е.Р. Комбинированная иммунотерапия в лечении злокачественных глиом головного мозга//Отчст ИКИ СО РАМН, Новосибирск. - 2003. - С. 97-101.

7. Леплина О.Ю., Ступак ВВ., Хонина Н.А, Центнер М.И., Козлов Ю.П., Останин А.А, Черных Е.Р. Ретроспективный анализ эффективности комбинированной иммунотерапии в комплексном лечении злокачественных

глиом головного мозга//Материалы VII международного симпозиума «Новые технологии в нейрохирургии»- Санкт-Петербург. - 2004. - С. 172.

8. Черных Е.Р., Ступак ВВ., Центнер МП, Хонина H.A., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Никонов С.Д., Останин A.A. Эффективность комбинированной иммунотерапии в комплексном лечении злокачественных глиом головного мозга//Сибирский онкологический журнал. - 2004. - № 2/3,-С. 85-88.

9. Ступак В В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин A.A., Козлов Ю.П., Никонов С.Д., Черных Е.Р. Опыт использования частично-зрелых дендритных клеток в лечениин больных злокачественными глиомами головного мозга // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии,- 2004. -№ 3-4. - С. 107-109.

10. Ступак В В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин A.A., Козлов Ю.П., Никонов С.Д., Черных Е.Р. Возможность генерации и клиническое использование вакцин на основе частично-зрелых дендритных клеток у больных злокачественными опухолями головного мозга // Тезисы докладов на 16-ом Пленуме Ассоциации нейрохирургов России, Екатеринбург. - 2004. - С. 101-102.

11. Леплина О.Ю., Центнер М.И., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Останин A.A., Козлов Ю.П., Ступак В.В., Черных Е.Р. Фенотипическая и функциональная характеристика антигенпрезентирующих клеток при злокачественных глиомах //Материалы XIII Всероссийской научно-практической конференции «Нейроиммунология», Санкт-Петербург. - 2004,- №2. - С. 60.

12. Леплина О.Ю., Ступак В В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Центнер М.И., Козлов Ю.П., Останин A.A., Черных Е.Р. Эффективность комбинированной иммунотерапии в комплексном лечении злокачественных глиом головного мозга//Материалы ХШ Всероссийской научно-практической конференции «Нейроиммунологая», Санкт-Петербург. - 2004,- №2. - С. 110.

13. Леплина О.Ю., Ступак В В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Центнер М.И., Козлов Ю.П., Останин A.A., Черных Е.Р. Характеристика антигенпрезентирующих клеток у больных злокачественными глиомами//14-ая научно-практическая конференция врачей «Актуальные вопросы современной медицины», Новосибирск. - 2004. - С. IX-9-10.

14. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Останин A.A., Никонов С.Д., Ступак В.В., Козлов Ю.П. Способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга//Патент на изобретение №2262941, приоритет от 05.01.2004 г.

15. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В В., Никонов С.Д, Останин A.A., Черных Е.Р. Частично-зрелые дендритные клетки как потенциальная основа для индукции противоопухолевого ответа у больных

злокачественными глиомами//Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7. -№4.-С.365-374.

16.Леплина О.Ю., Сахно Л.В., Тихонова М.А., Никонов С.Д., Жданов O.A., Останин A.A., Черных Е.Р. Характеристика частично-зрелых дендритных клеток у больных туберкулезом легких/Щитокины и воспаление. - 2005.— Т.4., № 2- С.86 (Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет», Новосибирск. 2005 г).

17. Леплина ОТО, Сахно Л.В., Тихонова М.А., Жданов O.A., Никонов С.Д., Останин A.A., Черных Е.Р. Дендритные клетки в лечении прогрессирующих форм туберкулеза легких//Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск,- 2005,- С. 132-133.

18. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак ВВ., Останин A.A., Черных Е.Р. Генерация частично зрелых дендритных клеток и их использование в лечении злокачественных глиом головного мозга// Материалы конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий». Новосибирск. - 2005,- С. 19-20.

19. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В В., Останин A.A., Черных Е.Р. Дендритные клетки в комбинированной иммунотерапии злокачественных глиом головного мозга//Научный отчет ГУНИИКИ СО РАМН. - Новосибирск. - 2006. - С. 256-259.

20. Крючкова И.В., Кулагин А.Д., Сизикова С.А., Денисова В В., Гилевич A.B., Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Лисуков И.А. Иммунотерапия с использованием дендритных клеток у больных множественной миеломой после аутологичной трансплантации периферических стволовых клеток//Научный отчет ГУНИИКИ СО РАМН, Новосибирск. - 2006. - С. 253-256.

21. Леплина ОТО., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Распай Ж.М., Никонов С.Д., Старостина Н.М., А.А.Останин, Черных Е.Р. Фенотипическая характеристика дендритных клеток при различных патологиях //Медицинская иммунология. - 2006. - Т.8. - №2-3. - С. 420-421. («Материалы 10 всероссийского научного форума» Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»),

22. Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А, Распай Ж.М., Никонов С.Д., Жданов O.A., Останин A.A., Черных Е.Р. Фенотипические особенности дендритных клеток у больных туберкулезом легких/Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири, Красноярск - 2006 - С. 79-81.

23. Леплина О.Ю., Тихонова М.А, Козлов Ю.П., Ступак В.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Характеристика дендритных клеток у больных злокачественными глиомами головного мозга//Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири, Красноярск. - 2006 - С. 97-99.

24. .Leplina O.Yu, Tikhonova M.A.,.Kozlov Yu.P, Stupak V.V., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Dendritic cells in the combined immunotherapy of malignant brain gliomas//«Internationa! conférence Basic Science for Biotechnology and Medicine» - Novosibirsk, Russia - 2006. - P. 38

25. Леплина О.Ю., Ступак B.B, Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Никонов С.Д., Тихонова MA., Сычева Н.В, Останин А.А, Черных Е.Р. IFNa-индуцированные дендритные клетки в лечении больных злокачественными глиомами головного мозга//Клеточные технологии в биологии и медицине. -2007.-№2.-С. 92-98.

26. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В В., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика IFNa-индуцированных дендритных клеток у больных злокачественными глиомами головного мозга//Бюллютень СО РАМН. - 2007,- (№2) Т.124. - С. 27-33.

27. Ступак В В., Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Применение дендритных клеток в комплексной иммунотерапии больных злокачественными глиомами головного мозга// Материалы всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения», Санкт-Петербург. - 2007 . - С. 246.

28. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Ступак В В., Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Останин А.А. IFN-a-индуцированные дендритные клетки в лечении больных злокачественными глиомами головного мозга.//Медицинская иммунология. -2007. - Т.9. - №. 2-3. - С. 290-291. (Материалы 11 всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»),

29. Леплина О.Ю., Ступак В.В., Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Иммунотерапия злокачественных опухолей головного мозга.// BULLETIN of the International Scientific Surgical Association. - 2007. - V. 2(№1) -P.75-77.

30. Леплина О.Ю., Тихонова M.A., Старостина H.M., Григорьева A.E., Останин A.A., Черных Е.Р. Фенотипические и функциональные свойства дендритных клеток у больных хроническими вирусными гепатитами и циррозом печени// Медицинская иммунология. - 2007. - Т.9. - №. 2-3. - С.233-234. (Материалы 11 всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»),

31. Сахно Л.В., Распаи Ж.М., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Курганова Е.В., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Функциональные свойства IFN-a -индуцированных дендритных клеток у больных туберкулезом легких// Медицинская иммунология. - 2007. - Т.9. - №. 2-3. -С.245-246. (Материалы 11 всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»),

32.Леплина О.Ю., Григорьева А.Е., Тихонова М.А., Старостина H M., Останин А.А, Черных Е.Р. Генерация дендритных клеток у больных хроническими вирусными гепатитами и циррозами печени//Материалы III Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск. - 2007. -С.38.

33. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Григорьева А.Е., Старостина Н.М., Останин

A.А., Черных Е.Р. Характеристика дендритных клеток у больных хроническими вирусными гепатитами и гепатитами с исходом в цирроз// Омский научный вестник - 2007 - №3 - С. 97. (Материалы межрегиональной научно-практической конференции « Дни иммунологии в Сибири»),

34.Распай Ж.М., Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Никонов С.Д., Жданов О.А., Черных Е.Р. Интерферон-a -индуцированные дендритные клетки в лечении больных туберкулезом легких //Омский научный вестник - 2007 - №3 - С. 117 (Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири»),

35.Насонова Г.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Сергеевичева

B.В., Лисуков И.А., Останин А.А.. Черных Е.Р. Свойства IFN-a-индуцированных дендритных клеток у больных злокачественными лимфомами/Юмский научный вестник - 2007 - №3 - С. 242 (Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири»),

36. Леплина О.Ю., Ступак В В., Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Иммунотерапия злокачественных опухолей головного мозга// Bulletin of the International Scientific Surgical Association.- 2007,- Vol. 2, N 1.-P.75-77.

37. Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Тихонова M A., Распай Ж.М., Гилева И.П., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика дендритных клеток, генерируемых в присутствии интерферона -а у больных туберкулезом легких//Проблемы туберкулеза. - 2007. - №3 - С.42-46.

38. Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Распай Ж..М., Тихонова М..А., Курганова Е.В., Гилева И.П., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Функциональные свойства IFN-a-индуцированных дендритных клеток у больных туберкулезом легких//Медицинская иммунология. - 2008,- Т. 10, №2-3,-С. 151-158.

39. Леплина О.Ю., Насонова Г.В, Тихонова М.А., Крючкова И.В., Лисуков И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика IFNa-индуцированных дендритньк клеток у больных злокачественными лимфомами//Гематология и трансфузиология. - 2008 - №3- С. 24-29.

40. Chernykh E, Stupak V., Leplina O., Shevela E., Pendurin I., Nikonov S., Ostanin A. Dendritic cell-based immunotherapy for patients with malignant glioma// Bone Marrow Transplantation. - 2008.-V.41.-S.1.-P. 161

41. Черных Е.Р, Курганова E.B., Леплина О.Ю, Сахно Л.В, Тихонова М.А, Останин A.A. Дегидроэпиандростерон сульфат усиливает дифференцировку и созревание дендритных клеток//Российский иммунологический журнал. -2008. - Т.2 (11). -№2-3. - С. 126.

42.Хонина H.A., Селедцова Н.В., Леплина О.Ю., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Иммуномодулирующее влияние дегидроэпиандростерона сульфата на функции дендритных клеток беременных//Российский иммунологический журнал - 2008. - Т.2 (11), №2-3. - С. 299.

43. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Курганова Е.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на генерацию и свойства IFN-a-индуцированных дендритных клеток//Сибирский медицинский журнал. - 2008. - №3. - С. 101-102.

44. Leplina O.Yu., Stupak V.V., Pendurin I.V., Nikonov S.D., Ostanin A.A. Chernykh E R Dendritic cell immunotherapy of malignant gliomas // Abstractbook EHRLICH II -2nd World Conference on Magic Bullets Celebrating the 100th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich. - Nürnberg, October 3-5 - 2008 - P. 178.

45. Леплина О.Ю., Тихонова M.A., Сахно Л.В., Тыринова Т.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Эффект дегидроэпиандростерона сульфата на созревание и функциональные свойства ИНФ-а-индуцированных дендритных клеток// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т.148. -№7.-С. 80-85.

46. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Борисова А.Е., Старостина Н.М., Останин A.A., Черных Е.Р., Козлов В.А. Фенотип и функции дендритных клеток у больных хроническими вирусными гепатитами//Медицинская иммунология. - 2009. -Т.2/3. - С. 191-196..

47. Леплина О.Ю., Насонова Г.В., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Лисуков И.А., Останин А.А, Черных Е.Р. «IFNa-индуцированные дендритные клетки у больных множественной миеломой»//Сибирский онкологический журнал. -2009. -№6(36). -С.37-43..

48. Леплина О.Ю., Селедцова Н.В., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Хонина H.A., Останин A.A., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Эффект дегидроэпиандростерона сульфата на ТЫ/ТЬ2-стимуляторную активность дендритных клеток// Вестник НГУ. - 2009. - Т.7. - №2. - С.3-8.

49.Черных Е.Р., Селедцова Н.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Тыринова Т.В., Курганова Е.В., Хонина H.A., Останин A.A., Пасман Н.М. Дендритные клетки как возможные регуляторы иммунной перестройки при беременности //Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 6 - С. 541-548.

50. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Ступак В В., Пендюрин И.В., Никонов С.Д., Тихонова М.А., Останин A.A. Клеточные технологии в лечении злокачественных глиом головного мозга//«Клеточные технологии. Теоретические и прикладные аспекты», Сборник трудов под ред. Козлова

B.А., Сенникова СВ., Черных Е.Р., Останина A.A.- Новосибирск: Наука,

2009,- С. 240-276.

51. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Ступак ВВ., Мишинов С.В., Пендюрин И.В., Останин A.A. Опухоль-ингибирующая активность интерферон-а индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и больных злокачественными опухолями головного мозга//Материалы конференции «Поленовские чтения», Санкт-Петербург. -

2010,- С. 295.

52. Леплина О.Ю., Тыринова Т В., Тихонова М.А., Ступак В В., Мишинов С.В, Пендюрин И.В., Останин A.A. Черных Е.Р. Противоопухолевая активность интерферон-индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и больных с опухолями головного мозга //Медицинская иммунология. -2010. - Т.12- №3. - С. 199-206.

53.Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тыринова Т В., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Останин A.A. Участие дегидроэпиандростерона сульфата и прогестерона в регуляции толерогенной активности интерферон-а- индуцированных дендритных клеток в культуре in уИго//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2011. - Т. 151. - №2. - С. 168-171.

54. Леплина О.Ю., Тихонова М.А, Насонова Г В., Мишинов С В., Ступак В В., Крючкова ИВ.,Останин А.А, Черных Е.Р. Характеристика функциональной активности интерферон-индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и больных злокачественными заболеваниями//Цитокины и воспаление. - 2010. - Т.9. - №3. - С. 78 .

55. Тыринова Т.В,.Леплина О.Ю, Мишинов С.В, Ступак В В., Пендюрин И.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Цитотоксическая активность IFN-a-индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и больных опухолями головного мозга// Цитокины и воспаление. - 2010. - Т.9. - №3. -

C.80.

56. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Селедцова Н.В., Тихонова М.А., Останин A.A., Пасман Н.М. Участие дендритных клеток в реализации иммуномодулирующего эффекта дегидроэпиандростерона у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией// Цитокины и воспаление. - 2010. - Т.9. -№3. - С.82 .

57. М.А.Тихонова, О.Ю.Леплина, Н.И.Борисенкова, А.А.Останин, Е.Р.Черных. Возможность использования 4-цветной цитофлюориметрии для количественного определения циркулирующих дендритных клеток в

периферической крови здоровых доноров// Цитокины и воспаление. - 2010. -Т.9. - №3. - С.73 .

58.Туrínova T.V., Leplina O.Yu., Mishinov S.V., Stupak V.V., Pendyurin I.V., Ostanin A.A., Chemyckh E.R. Cytotoxic activity of IFN-a-indused dendritic cells in healthy donors and patients with brain gliomas//DC2010: Forum on Vaccine Science -11-th international Simposium on Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology -26-30 Sept. 2010 - Lugano, Switzeland- Poster Sesión Abstract. - P05-030.

59. Леплина О.Ю, Желтова О.И., Борисова A.E.. Старостина Н.М, Останин A.A., Черных Е.Р. Вакцины на основе дендритных клеток в лечении герпетической инфекции// Вестник Уральской медицинской академической науки. -2011.-№2/2 (35).-С. 38-39.

60. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Никонов С.Д., Жданов O.A., Останин A.A., Черных Е.Р. Роль PD-1/B7-H-1-сигнального пути в нарушении антигенспецифического ответа у больных туберкулезом легких// Иммунология. - 2011. - Т.32. - № 2. - С.89-93.

61. Насонова Г.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Экспрессия В7-Н1 на IFN-a-индуцированных дендритных клетках у больных злокачественными лимфомами//Материалы всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири», Абакан. -2ÓÍ1.-C.101-Í03.

62. Тыринова ТВ., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин A.A., Черных Е.Р. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата и прогестерона на цитотоксическую активность интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток в культуре in vitro// Материалы всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири», Абакан. - 2011. -С. 214-216.

63.Мишинов С .В., Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Останин A.A., Ступак ВВ., Пендюрин ИВ. Анализ взаимосвязи выживаемости больных и цитотоксической активности интерферн-альфа-индуцированных дендритных клеток при внутримозговых опухолях// Российский нейрохирургический журнал. - 2011. - T.III., специальный выпуск, - С.324-325 (Материалы конференции «Поленовские чтения», Санкт-Петербург).

64. Леплина О.Ю., Тыринова ТВ., Тихонова М.А, Останин A.A., Черных Е.Р. Сравнительная характеристика дендритных клеток, генерируемых в присутствии ИЛ-4 и ИФН-D// Материалы 8-й отчетной конференции НИКИ СО РАМН, Новосибирск. - 2011. - С. 38-39.

Подписано к печати 21.10.2011 формат - 60x84 1/16, Усл. печ. л. 2

Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 332 Типография ООО "ЮГУС-ПРИНТ", ИНН 5402467637, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4

Актуальность исследования

Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками (АПК), играют центральную роль в поддержании врожденного иммунитета и обеспечивают взаимосвязь между врожденным и приобретенным иммунитетом благодаря способности инициировать антигенспецифический иммунный ответ и детерминировать его направленность. ДК обладают уникальной способностью активировать как CD4, так и СЭ8-клетки. При этом стимулирующий эффект ДК в 10-100 превышает стимулирующее действие макрофагов и других антиген-презентирующих клеток в силу более высокого уровня экспрессии костимуляторных молекул, медленной внутриклеточной деградации антигена и длительной презентации антигена на поверхности клеток. Кроме того, ДК являются единственными АПК, которые способны активировать наивные Т-клетки [181, 206].

Наряду со способностью к индукции Т-клеточного ответа, ДК могут также ингибировать иммунный ответ. Толерогенные свойства ДК обусловлены различными механизмами - снижением экспрессии HLA-DR и костимуляторных молекул, необходимых для эффективной активации Т-клеток и усилением экспрессии поверхностных коингибиторных молекул и рецепторов (В7-Н1, ILT-2, ILT-3, ILT-4, CD209, CD200R и HLA-G), индуцирующих апоптоз или анергию Т-клеток; усилением продукции супрессивных цитокинов (IL-10, TGF-p), ингибирующих функции эффекторных Т-клеток и селективно активирующих ТЬ2-ответ [221, 89], а также способностью ДК к генерации регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+T per) [255]. Наличие толерогенной активности ДК в большей степени свойственно незрелым ДК и может индуцироваться рядом факторов -иммуносупрессивными цитокинами, простагландином Е2, гистамином, витамином D3, молекулой HLA-G, а также глюкокортикоидами [184, 42, 269, 99].

Недавние исследования также показали, что ДК могут подавлять пролиферацию и оказывать непосредственный цитотоксический эффект на клетки опухолевых линий [281, 53]. Противоопухолевая активность ДК опосредуется с участием различных молекул семейства фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a, lymphotoxin-al(32, FasL, TRAIL), а также перфорина и/или гранзима [281, 139] и имеет, по-видимому, большое значение, поскольку высвобождающиеся опухолевые антигены могут сразу же презентироваться дендритными клетками Т-лимфоцитам, обеспечивая более ранний запуск специфического иммунного ответа. При этом, вовлечение различных молекулярных механизмов позволяет ДК преодолеть «резистентность» опухолевых клеток к лизису.

Изменения в количественном содержании и функциональной активности ДК выявлены при хронических вирусных и бактериальных инфекциях, онкопатологии, патологии беременности [79, 208, 292, 294]. Так, рядом исследований было показано, что опухолевый процесс и хронические инфекционные заболевания сопровождаются снижением количества миелоидных ДК и угнетением их стимуляторной активности, что рассматривается в качестве одного из возможных механизмов персистенции инфекции и ускользания опухоли от иммунного надзора [19, 69, 300, 271, 273, 58]. С другой стороны имеются данные, что при физиологической беременности ДК приобретают толерогенные свойства, а снижение этой активности ассоциируется с угрозой преждевременного прерывания беременности [238, 66].

Учитывая уникальные свойства ДК, в частности их способность индуцировать антигенспецифический иммунный ответ, а также обладать эффекторной цитотоксической функцией, эти клетки рассматриваются в качестве перспективных мишеней терапевтических воздействий. В частности, обсуждается возможность их применения для индукции противоопухолевого и противоинфекционного иммунного ответа. Действительно, исследования на животных [16] и клинические испытания у человека [252, 180, 166, 57] показали, что вакцинация миелоидными ДК, презентирующими вирусные или опухолевые антигены, позволяет восстановить специфический иммунный ответ. С другой стороны, поскольку ДК могут проявлять толерогенные свойства, сферой их приложения могут стать аутоиммунные заболевания, патология беременности и трансплантация органов и тканей [159].

Низкое содержание ДК в периферической крови (менее 1%) долгое время сдерживало возможности изучения и клинической апробации ДК. Поэтому разработка методов генерации ДК in vitro стала важным шагом на пути изучения ДК и проведения клинических испытаний дендритно-клеточных вакцин. Исследования в указанном направлении также показали, что источником ДК могут быть не только костномозговые клетки [254, 228], но и моноциты периферической крови, способные дифференцироваться в миелоидные ДК при культивировании в присутствии ростовых факторов [264]. Анализ генерируемых in vitro ДК позволил более детально охарактеризовать фенотип и функциональные свойства ДК на различных этапах их дифференцировки и созревания [161]. Кроме того, эти исследования показали существенное влияние условий культивирования на функциональные свойства ДК, свидетельствуя о важной роли микроокружения в регуляции ДК [109, 32].

Традиционно ДК генерируют путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) в присутствии двух ключевых цитокинов - гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 (IL-4) [264]. GM-CSF индуцирует дифференцировку в миеломоноцитарном направлении, a IL-4 ингибирует созревание моноцитов в сторону макрофагальной линии [259]. Генерируемые таким образом незрелые миелоидные дендритные клетки (ИЛ4-ДК) обладают высокой способностью к захвату антигена, но слабой стимуляторной активностью в отношении Т-клеток. Дальнейшее культивирование ДК в присутствии TNF-a, IL-1, LPS, С040-лиганд или коктейля факторов ведет к дозреванию ДК и повышению их способности стимулировать Т-клеточный иммунный ответ [125]. Однако, является ли такой путь генерации физиологичным - остается спорным вопросом, поскольку локальная продукция высоких концентраций IL-4 in vivo в ответ на различные стресс-факторы представляется маловероятной. Кроме того, генерируемые in vitro ИЛ4-ДК обладают низкой миграционной активностью и в условиях дефицита ростовых факторов могут подвергаться обратной трансформации в моноциты.

Наряду с традиционным протоколом, Santini с соавт. продемонстрировали, что частично зрелые ДК можно генерировать при замене IL-4 интерфероном-а [202, 231, 230, 232, 235, 234]. Такой путь генерации представляется более физиологичным, поскольку IFN-a является ранним медиатором врожденного иммунного ответа и продуцируется в больших количествах в ответ на стимуляцию инфекционными антигенами и провоспалительными цитокинами. Кроме того, интерферон-a индуцированные ДК (ИФН-ДК) имеют ряд особенностей, делающих эти клетки «привлекательными» в плане потенциального клинического использования. Так, ИФН-ДК генерируются быстрее по времени, характеризуются высокой способностью к захвату антигена, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов, имеют более высокую миграционную активность, более активно стимулируют CD8 Т-лимфоциты и индуцируют сбалансированный иммунный ответ, поскольку наряду с выраженной Thl-стимулирующей способностью обладают умеренной Т112-стимулирующей активностью [204, 230, 45].

Учитывая также, что интерфероны способны усиливать цитотоксическии потенциал ДК [167, 53, 201] и ИФН-ДК по некоторым данным обладают более выраженной цитотоксической активностью [139], применение этого типа ДК при опухолевых и вирусных заболеваниях представляется весьма перспективным.

Несмотря на возрастающий интерес к ИФН-ДК, свойства этих клеток, особенно активированных ИФН-ДК, охарактеризованы недостаточно. Это касается спектра и уровня продуцируемых ДК цитокинов, экспрессии ряда поверхностных молекул и способности ДК активировать Th и Th2 ответ. В литературе практически отсутствуют сравнительные данные о цитотоксической и толерогенной активности ИЛ4-ДК и ИФН-ДК. Кроме того, допуская, более высокую экспрессию «проапоптогенных» молекул на ИФН-ДК, нельзя исключить, что эти ДК будут оказывать более выраженное ингибирующее действие на Т-клетки. Имеются отдельные сообщения, что ИФН-ДК продуцируют более высокий уровень IL-10 и индуцируют дифференцировку регуляторных Т-клеток 1-го типа [120, 45], что может обусловливать более высокий толерогенный потенциал этих клеток. Неисследованным остается также вопрос, насколько эффективно могут генерироваться ИФН-ДК при различных патологических состояниях и отличаются ли ИФН-ДК в таком случае по функциональной активности. Наконец, большой интерес представляет клиническая апробация ИФН-ДК в качестве адьювантной клеточной терапии, направленной на активацию специфического иммунного ответа у больных с опухолевыми и инфекционными заболеваниями.

Учитывая выше изложенное, была сформулирована цель работы: на основании сравнительной характеристики ИФН-ДК и ИЛ4-ДК, анализе свойств ИФН-ДК при физиологических и патологических состояниях, оценке возможности их регуляции in vitro и клинической апробации у больных с внутримозговыми опухолями и хроническими вирусными инфекциями обосновать возможность использования ИФН-ДК в лечении онкологических и инфекционных заболеваний.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку поверхностных маркеров (стадиоспецифические, активационные, костимуляторные, коингибиторные, проапотогенные молекулы) в популяции ИФН-ДК и ИЛ4-ДК в группе здоровых доноров.

2. Провести сравнительное исследование функциональной активности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (продукция цитокинов в культурах ДК, аллостимуляторная активность ДК, Thl- и Th2 - стимулирующая активность ДК), генерируемых у здоровых доноров.

3. Оценить цитотоксическую и цитостатическую активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК здоровых доноров против клеток опухолевых линий.

4. Исследовать способность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК к индукции регуляторных Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов.

5. Охарактеризовать поверхностные маркеры и функциональную активность ИФН-ДК у больных с онкологическими заболеваниями (злокачественные опухоли головного мозга, гемобластозы).

6. Исследовать фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у больных с хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких)

7. Исследовать in vitro влияние цитокинов и иммуноактивных факторов (интерлейкин-2, смесь провоспалительных цитокинов, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека) на аллостимуляторную активность и цитотоксический потенциал ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями.

8. Изучить фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у женщин с физиологической гестацией и беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.

9. Оценить влияние гормона дегидроэпиандростерона сульфата на экспрессию поверхностных маркеров и функциональную активность ИФН-ДК доноров.

10. Оценить безопасность и эффективность иммунотерапии с использованием ИФН-ДК в лечении больных злокачественными опухолями головного мозга.

11. Провести апробацию ИФН-ДК-вакцин у больных с хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В, герпесвирусная инфекция).

Научная новизна

Исследование свойств LPS-активированных интерфероном-а ДК в сравнении со стандартно генерируемыми ИЛ4-ДК показало, что популяция ИФН-ДК характеризуется более высоким содержанием клеток, экспрессирующих CD 14, CDllc/CD123 и TRAIL, и меньшим количеством CD83+ клеток. При этом ИФН-ДК отличаются более высокой продукцией IFN-y, IL-2, IL-17, IL-1(3, IL-10, IL-5, G-CSF и МСР-1, более активно индуцируют генерацию CD3+IFNy+ Т-клеток и способны активировать CD3+IL4+ Т-клетки. Кроме того, ИФН-ДК проявляют более выраженную цитостатическую активность против TRAIL-чувствительных опухолевых клеток и более высокую цитотоксическую активность в культурах TRAIL-резистентных опухолевых линий. Сравнение способности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК индуцировать регуляторные Т-клетки позволило получить новые данные о толерогенном/супрессорном потенциале анализируемых ДК. В частности, показано, что в отсутствие активации LPS интактные ИФН-ДК индуцируют не только генерацию CD4+FoxP3+, но также CD8+FoxP3+ и CD4+IL-10+-клеток, тогда как после активации LPS, ИФН-ДК теряют способность индуцировать генерацию CD4+FoxP3+- и обладают сходной с ИЛ4-ДК стимулирующей активностью в отношении CD8+FoxP3+ и CD4+IL-10+-клеток. В работе впервые исследована возможность генерации и свойства ИФН-ДК при различных онкологических и инфекционных заболеваниях. Продемонстрировано, что популяция ДК больных с онкопатологией (злокачественные внутримозговые опухоли, злокачественная лимфома, множественная миелома) и хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких) отличается повышенным содержанием незрелых ДК и ДК промежуточной степени зрелости и уменьшением доли зрелых ДК; смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону ТЬ2/противовоспалительных цитокинов; снижением аллостимуляторной активности; уменьшением стимулирующей активности в отношении CD3+IFNy+ Т-клеток и/или усилением способности активировать CD3+IL4+ Т-клетки и угнетением цитотоксической противоопухолевой активности (у больных онкологического профиля). Выраженность указанных изменений существенно варьирует при различных нозологических формах заболеваний. Впервые изучены свойства ИФН-ДК, генерируемых у женщин с физиологической и осложненной беременностью. Показано, что ИФН-ДК при физиологической беременности отличаются признаками незрелости, смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону ТЬ2-цитокинов, снижением аллостимуляторной и доминированием ТЪ2-стимуляторной активности и наличием цитотоксической активности против активированных NK-клеток. В то же время ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (с повышенным уровнем ДГЭАС) обладают более зрелым фенотипом ДК, сохранной аллостимуляторной активностью и способностью активировать Thl-ответ. При этом анализ влияния ДГЭАС на ИФН-ДК in vitro позволил получить новые данные о стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку/созревание ИФН-ДК, продукцию IFN-y и TNF-a, Thl-стимуляторную активность ДК и ингибирующем эффекте на способность ИФН-ДК индуцировать гибель CD56+CD16+ клеток. Впервые проведена клиническая апробация вакцин на основе ИФН-ДК и показана их безопасность и эффективность в индукции иммунного и клинического ответа у больных злокачественными опухолями головного мозга и хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В и герпесвирусная инфекция).

Теоретическая и практическая значимость

Сравнение фенотипа клеток в популяциях LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК позволило выявить ряд особенностей, которые свидетельствуют о менее зрелом, «промежуточном» фенотипе ИФН-ДК и их более высоком цитотоксическом потенциале, ассоциированном с экспрессией молекулы TRAIL. В свою очередь, выявленные функциональные отличия ИФН-ДК, в частности, их более высокая цитокин-продуцирующая активность и способность к индукции CD3+IFNy+ Т-клеток при сохранении умеренной ТЪ2-стимуляторной активности, а также более высокая цитостатическая и цитотоксическая активность против опухолевых клеток при сходной способности к индукции регуляторных Т-клеток, указывают на более высокий потенциал ИФН-ДК в индукции/опосредовании иммунного ответа. Выявленные при онкологических и инфекционных заболеваниях фенотипические и функциональные изменения ИФН-ДК свидетельствуют о нарушении дифференцировки/созревания ДК и снижении их способности индуцировать и опосредовать реакции клеточного иммунитета при данных патологиях. При этом взаимосвязь нарушений ИФН-ДК со степенью злокачественности (у больных ЗОГМ) и угнетением антигенспецифического ответа (у больных ТБ) свидетельствует о патогенетической значимости дисфункций ДК при данных патологических состояниях. Исследования свойств ИФН-ДК при физиологической и осложненной надпочечниковой гиперандрогенией беременности показало, что в условиях физиологической гестации ИФН-ДК приобретают толерогенные/супрессорные свойства, которые утрачиваются на фоне повышенного уровня ДГЭАС при надпочечниковой гиперандрогении. При этом способность ДГЭАС индуцировать in vitro созревание ДК и активировать их иммуностимулирующую активность свидетельствует о важной роли гормонов в регуляции ИФН-ДК, и, в частности, значении ДГЭАС в ослаблении толерогенных/супрессорных свойств ДК. Выявленные отличительные свойства ИФН-ДК обосновывают перспективы их использования в качестве ДК-вакцин для иммунотерапии. При этом установление принципиальной возможности генерации ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями, а также возможности коррекции дисфункций ИФН-ДК, в частности, усиление их аллостимуляторной активности и повышении цитотоксической активности in vitro с помощью различных медиаторов/соединений (интерлейкин-2, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека), является важной составляющей практической значимости работы. Значение работы в прикладном аспекте заключается также в разработке протокола иммунотерапии на основе ИФН-ДК и его клинической апробации у больных со злокачественными опухолями головного мозга и хроническими инфекциями (хроническим вирусным гепатитом В и герпесвирусной инфекцией). При этом полученные результаты о хорошей переносимости и отсутствии побочных эффектов/осложнений при проведении иммунотерапии на основе ИФН-ДК, а также данные об индукции специфического иммунного ответа, который сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями, прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности (соответственно, в 22 и 55%) при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции свидетельствуют о безопасности и терапевтическом потенциале ИФН-ДК-вакцин и обосновывают принципиальную возможность их использования в лечении онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активированные ИФН-ДК отличаются от ИЛ4-ДК менее зрелым фенотипом, повышенной экспрессией проапоптогенных молекул, а также более высоким уровнем продукции цитокинов (с преобладанием Thl/провоспалительных цитокинов), Thl- стимуляторной и цитотоксической активности.

2. При онкологических и инфекционных заболеваниях ИФН-ДК имеют признаки задержки дифференцировки/созревания и нарушения функциональной активности, наличие и выраженность которых существенно варьирует в зависимости от нозологической формы заболевания и может корригироваться in vitro рядом цитокинов или иммуноактивных факторов.

3. ИФН-ДК являются мишенями гормональной регуляции и опосредуют иммуностимулирующий эффект ДГЭАС, повышенный уровень которого у беременных с гиперандрогенией обусловливает снижение толерогенного потенциала ДК, характерного для физиологической беременности.

4. Использование ДК-вакцин характеризуется хорошей переносимостью, является безопасным, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями; прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции.

Объем и структура диссертации Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 250 страницах машинописного текста, включающего 49 таблиц, 18 рисунков, 3 схемы. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 306 литературных источников, в том числе 293 иностранных. Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии НИКИ СО РАМН, руководитель - профессор Черных Е.Р. в рамках НИР 032: «Структурно-функциональная характеристика клеток иммунной системы и разработка клеточных биотехнологий

ВЫВОДЫ

1. По сравнению с LPS-активированными ИЛ4-ДК популяция генерированных in vitro ИФН-ДК характеризуется более высоким содержанием клеток, экспрессирующих CD 14, CDllc/CD123 и TRAIL и меньшим количеством CD83+ клеток, что в совокупности с высокой эндоцитарной активностью ИФН-ДК свидетельствует об их промежуточной степени зрелости и более выраженном цитотоксическом потенциале.

2. ИФН-ДК обладают более высокой, чем ИЛ4-ДК цитокин-продуцирующей активностью (продукция IFN-y, IL-2, IL-1J3, TNF-a, IL-10, IL-5, MCP-1 и G-CSF), более активно индуцируют генерацию CD3+IFNy+ Т-клеток и способны активировать CD3+IL4+ Т-клетки, что обусловливает их высокий потенциал в индукции/регуляции иммунного ответа.

3. ИФН-ДК более эффективно ингибируют пролиферацию TRAIL-резистентных опухолевых клеток НЕр-2 и обладают большей цитотоксической активностью против TRAIL-чувствительных клеток Jurkat, что свидетельствует о более высоком противоопухолевом потенциале этих ДК по сравнению с ИЛ4-ДК. При этом отсутствие прямой взаимосвязи между цитотоксической и цитостатической активностью ИФН-ДК указывает на возможное вовлечение различных механизмов в реализацию данных эффектов.

4. В отсутствие стимуляции LPS ИФН-ДК обладают более высокой способностью к индукции регуляторных Т-клеток, о чем свидетельствует более высокое содержание не только CD4+Foxp3+ , но и CD8+FoxP3+ и CD4+IL-10+ Т-клеток в культурах СКЛ, индуцированных ИФН-ДК. После активации LPS ИФН-ДК теряют способность индуцировать CD4+Foxp3+ Т-клетки и в одинаковой с ИЛ4-ДК степени индуцируют генерацию CD8+FoxP3+ и CD4+IL-10+ Т-лимфоцитов, что свидетельствует о схожей толерогенной/супрессорной активности активированных ДК.

5. ИФН-ДК у больных с онкопатологией характеризуются увеличением доли незрелых/промежуточной степени зрелости и уменьшением зрелых ДК; повышением продукции 1Ь-10 и уменьшением - ШЫ-у; снижением аллостимуляторной активности, ослаблением ТЫ- или возрастанием ТЬ2-стимуляторной активности, а также уменьшением цитотоксической активности, что свидетельствует о задержке дифференцировки/созревания ДК и снижении способности ДК активировать/опосредовать реакции клеточного иммунитета. При этом спектр и выраженность указанных изменений при различных нозологических формах онкологических заболеваний варьирует от минимальных до выраженных.

6. ИФН-ДК при НВУ-инфекции сходны с таковыми у доноров, тогда как у больных НСУ-инфекцией, ЦП (независимо от природы вируса) и туберкулезом легких характеризуются признаками задержки дифференцировки/созревания, смещением баланса в сторону продукции ТЬ2-цитокинов и усилением ТЬ2-стимуляторной активности, что указывает на снижение способности ДК активировать реакции клеточного иммунитета при данных патологиях.

7. ИФН-ДК при физиологической беременности характеризуются признаками незрелости, смещением баланса в сторону продукции ТЬ2-цитокинов, снижением аллостимуляторной- в сочетании с усилением ТЬ2-стимуляторной активности и наличием цитотоксической активности против С059+С016+ ЫК-клеток, тогда как у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией не отличаются по количеству зрелых/активированных ДК от таковых у небеременных женщин и обладают сохранной аллостимуляторной-/ТЫ -стимулирующей активностью, что свидетельствует о толерогенных/супрессорных свойствах ДК при физиологической гестации и потери этой активности на фоне повышенного уровня ДГЭАС при надпочечниковой гиперандрогении.

8. ДГЭАС в культурах in vitro стимулирует созревание ИФН-ДК, продукцию IFN-y и TNF-a и Thl-стимуляторную активность ДК и подавляет их проапоптогенную активность против CD59+CD16+ NK-клеток, что свидетельствует об участии ДГЭАС в гормональной регуляции ДК и его возможной роли в изменении свойств ИФН-ДК у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.

9. Интерлейкин-2, комплекс провоспалительных цитокинов, двуцепочечная ДНК и полиоксидоний усиливают in vitro аллостимуляторную активность ДК больных злокачественными лимфомами и туберкулезом легких и цитотоксическую активность ИФН-ДК против TRAIL-резистентных опухолевых клеток у больных злокачественными глиомами и лимфомами, что обосновывает принципиальную возможность коррекции функциональной активности ДК у больных с онкопатологией и инфекционными заболеваниями.

10. Иммунотерапия на основе ИФН-ДК у больных ЗОГМ сопровождается индукцией специфического иммунного ответа (усилением пролиферативного ответа МНК и появлением реакции ГЗТ в ответ на опухолевые антигены). Отсутствие выраженных побочных реакций, улучшение показателей качества жизни и выживаемости свидетельствует о безопасности и клинической эффективности ДК вакцин в лечении больных с онкопатологией.

11. Использование вакцин на основе ИФН-ДК в качестве монотерапии у больных HBV- и герпесвирусной инфекцией характеризуется хорошей переносимостью, приводит к индукции антигенспецифического иммунного ответа и сопровождается прекращением репликации вируса/нормализацией биохимической активности при ХВГВ (соответственно, в 22 и 55% случаев) и удлинением межрецидивного периода у пациентов с герпесвирусной инфекцией.

12. ИФН-ДК могут быть использованы в качестве новой технологической платформы для создания индивидуальных дендритноклеточных вакцин с целью генерации эффективного антигенспецифического иммунного ответа у больных онкологическими и инфекционными заболеваниями

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование позволило охарактеризовать ДК, генерируемые в условиях замены интерлейкина-4 интерфероном-а и сравнить интерферон-индуцированные ДК по фенотипу и функциональной активности с ДК, генерируемыми в «стандартном» протоколе с IL-4. Причем впервые проведена сравнительная характеристика ИФН-ДК и ИЛ4-ДК, активированных LPS. Полученные данные позволили заключить, что ИФН-ДК имеют отличительные особенности, ряд из которых делает эти клетки привлекательными для использования в клинической практике. В отличие от ИЛ4-ДК, LPS-активированные ИФН-ДК сохраняют промежуточный по степени зрелости фенотип, т.к. характеризуются более высоким содержанием клеток, экспрессирующих CD14, CDllcCD123 и меньшим количеством зрелых CD83+ клеток и обладают высокой эндоцитарной активностью. При этом ИФН-ДК характеризуются сходной экспрессией костимуляторных молекул (CD86) и молекул главного комплекса гистосовместимости (HLA-DR), а также сравнимой аллостимуляторной активностью, что свидетельствует об их сохранной и аналогичной с ИЛ4-ДК антигенпрезентирующей функции. По сравнению с ИЛ4-ДК, популяция ИФН-ДК характеризуется более высокой цитокин-продуцирующей функцией, в том числе способностью продуцировать IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-ip, IL-10, IL-5, G-CSF и MCP-1 и оказывает более выраженный стимулирующий эффект на Thl и ТЪ2-клетки. В то же время супрессорная/толерогенная активность ИФН-ДК, в частности, способность индуцировать генерацию CD4+FoxP3+, CD8+FoxP3+ и CD4+IL10+ регуляторных Т-клеток, не превышает таковую у ИЛ4-ДК. Наконец, отличительным свойством ИФН-ДК является более выраженная цитотоксическая активность против опухолевых клеток, ассоциированная с более высокой экспрессией молекулы TRAIL.

Исследование ИФН-ДК у больных онкологическими и инфекционными заболеваниями показало принципиальную возможность получения этих клеток в культуре in vitro. Тем не менее, при ряде патологий генерируемые ДК отличались признаками задержки дифференцировки и созревания, что проявлялось увеличением в популяции ИФН-ДК клеток с фенотипом незрелых ДК и ДК промежуточной степени зрелости (CD14+, CDla+, CD83+CDla+, CD11+CD123+) и снижением доли клеток, экспрессирующих молекулы зрелых и активированных ДК (CD83+, CD83+CDla", CD25+). Кроме того, ИФН-ДК у больных с онкопатологией и инфекционными заболеваниями характеризовались снижением продукции цитокинов с Thl/провоспалительной и/или усилением секреции ТЬ2/противовоспалительных цитокинов, ослаблением Thl -стимулирующей активности и/или усилением ТЬ2-стимулирующей активности, а также снижением цитотоксической активности (у больных с онкопатологией). В целом, выявленные изменения свидетельствовали о снижении стимулирующей активности ДК и приобретении ими толерогенных/супрессорных свойств, ассоциированных с повышенной продукцией IL-10, снижением Thl- и усилением Th-2 стимуляторной активности. Эти изменения у больных с онкопатологией ДК были наиболее выражены у пациентов злокачественной лимфомой, а среди пациентов с инфекционными заболеваниями - в группе с вирусным гепатитом Сиу больных туберкулезом легких со сниженным антигенспецифическим ответом.

Исследование влияния различных иммуноактивных препаратов (интерлейкина-2, комплекса провоспалительных цитокинов, двуцепочечной ДНК и полиоксидония) на функции ДК показало, что обработка ДК этими препаратами на этапе созревания в культуре in vitro значимо усиливала аллостимуляторную активность ДК у больных со злокачественными лимфомами и туберкулезом легких. Культивирование ДК с интерлейкином-2, полиоксидонием и препаратом ДНК усиливало цитотоксическую активность ДК у больных онкологическими заболеваниями. Полученные результаты обосновывают принципиальную возможность коррекции дисфункций ИФН-ДК у больных с онкопатологией и инфекционными заболеваниями (при наличии таковых).

Для более детального изучения толерогенных свойств ДК и возможности их регуляции в отдельной серии исследований были изучены свойства ДК у беременных с физиологической гестацией и надпочечниковой гиперандрогенией. Результаты этих исследований показали, что ДК беременных отличались признаками задержки созревания, смещением баланса в сторону продукции ТЪ2-цитокинов, снижением аллостимуляторной и усилением ТЬ2-стимуляторной активности, т.е. обладали толерогенным/супрессорным фенотипом. В то же время, ДК беременных с ГА были близки по своим параметрам к таковым у небеременных женщин. При этом ДГЭАС в культуре ДК здоровых беременных и доноров индуцировал дифференцировку/созревание ДК, усиление их аллостимуляторной и ТЫ-стимулирующей активности и снижение проапоптогенной активности в отношении С016+С056+ ЫК-клеток. Эти исследования позволили заключить, что ИФН-ДК являются мишенями гормональной регуляции и повышенный уровень ДГЭАС у беременных с гиперандрогенией обусловливает снижение толерогенного потенциала ДК, характерного для физиологической беременности.

Итогом заключительного раздела работы стала оценка безопасности и эффективности иммунотерапии на основе ИФН-ДК в лечении больных злокачественными опухолями головного мозга и хроническими вирусными инфекциями (ХВГВ и герпесвирусная инфекция). Проведенные исследования показали хорошую переносимость и безопасность вакцин на основе ДК. При этом было продемонстрировано, что вакцинация ИНФ-ДК индуцировала развитие антигенспецифического ответа как у больных ЗОГМ, так и пациентов с герпесвирусной инфекцией. При этом иммунотерапия с использованием ИФН-ДК сопровождалась положительными клиническими эффектами, которые проявлялись улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями; прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции.

В целом, полученные результаты обосновывают возможность и перспективность использования ИФН-ДК в качестве клеточной основы для создания индивидуальных лечебных вакцин, которые могут быть использованы в комплексной терапии больных с онкопатологией или хроническими вирусными заболеваниями для индукции/усиления противоопухолевого или противоинфекционного иммунного ответа.