Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Характеристика и регуляция кардиального пейсмекерного канала I#3f#1/HCN, разработка научных подходов к созданию биологических пейсмекеров

ии^4Б3402

На правах рукописи

ЗАГИДУЛЛИН Науфаль Шамилевич

ХАРАКТЕРИСТИКА И РЕГУЛЯЦИЯ КАРДИАЛЬНОГО ПЕЙСМЕКЕРНОГО КАНАЛА УНОЧ, РАЗРАБОТКА НАУЧНЫХ ПОДХОДОВ К СОЗДАНИЮ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПЕЙСМЕКЕРОВ

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.06 - кардиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 2 МАР 2ССЭ

Санкт-Петербург - 2009

003463402

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», Федеральном Государственном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова»

Научные консультанты:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Цыган Василий Николаевич

доктор медицинских наук профессор Белевитин Александр Борисович

доктор медицинских наук профессор Васильев Андрей Глебович

доктор медицинских наук Войцицкий Анатолий Николаевич

доктор медицинских наук профессор Нифонтов Евгений Михайлович

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН, г. Москва.

Защита состоится «7» апреля 2009 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.03 при Военно-медицинской академии им С.М. Кирова по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Военно-медицинской академии им С.М. Кирова по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева 6.

Автореферат разослан «_»_2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Дергунов A.B.

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Широко известно, что частота сердечных сокращений (ЧСС) является важным фактором риска у больных с ишемической болезнью сердца и хронической сердечной недостаточностью [Шальнова С.А. и соавт., 2005; Gilman М. et al, 1993]. В связи с тем, что кардиальная проводящая система генерирует и синхронизирует сокращения сердца, её дисфункция может приводить к аритмиям и нарушениям проводимости различных степеней тяжести, вплоть до внезапной смерти. Ионный канал (If), активирующийся при гиперполяризации, регулируя ритм сердца, является определяющим для спонтанной диастолической деполяризации синоатриального узла (СА). Четыре изоформы данного канала HCN 1-4 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel) различаются не только своим распределением в тканях сердца и нервной системы, но и кинетикой, амплитудой и другими электрофизиологическими свойствами [Moosmang S. et al., 2001], и являются переносчиком не только ионов К+ и Na+ но и Са2+ [Yu X. et al., 2004]. В связи с тем, что кальций является важным внутриклеточным мессенджером, важной задачей представляется изучение электрофизиологических свойств тока ионов кальция через канал If. В последние годы интенсивно разрабатываются варианты трансплантации биологических пейсмекеров (БП), созданы селективные блокаторы канала If, что требует глубокого понимания особенностей механизмов его работы [Kehat I. et al., 2001; Barbutti A. et al., 2007]. Идентификация изоформы HCN, наиболее близкой по своим свойствам к нативному каналу If, является необходимой предпосылкой для создания искусственного биологического пейсмекера путем трансфекции клеток-кандидатов, который будет использован в терапевтических целях.

Несмотря на то, что изменение внеклеточного раствора в случае нативных кардиомиоцитов (КМЦ), в частности, повышение концентрации калия, меняет кинетику тока и проницаемость ионов через канал If [Leitch S.,

1995; Azene E. et al., 1999], подобные исследования в трансфицированных клетках, экспрессирующих некоторые изоформы HCN, проведены не были.

Р-субъединицы всех калиевых каналов обладают рядом важных свойств, модулирующих изменения проводимости, селективности и других параметров. Однако, по данным различных авторов, неоднозначным является воздействие р-субъединицы канала HCN MiRPl (MinK-related peptide), кодируемая геном KCNE2, на его электрофизиологические свойства: от снижения кинетики активации канала до увеличения плотности тока [Altomare С. et al., 2003; Qu J. et al., 2004]. Уточнение модулирующих свойств р-субъединицы канала HCN позволит создать биологические пейсмекеры с заданными характеристиками, которые могут быть использованы для лечения больных с различными поражениями синоатриального узла.

Другой способ получения биологических пейсмекеров заключается в использовании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые дифференцируются в различные ткани организма и, в том числе, в кардиомиоциты (КМЦ) и представляют собой удобную модель для исследования механизмов дифференцировки пейсмекерных клеток [Gassanov N. et al., 2004]. В настоящее время факторы дифференцировки КМЦ исследованы не достаточно.

Селекция КМЦ в направлении пейсмекерных клеток (ПК), в том числе с использованием факторов дифференцировки, таких как сосудистый цитокин эндотелии-1, нейрорегулин-1 и ретиноевая кислота, является перспективным направлением развития клеточных терапевтических стратегий для регенерации и/или репарации кардиальной проводящей системы и создания биологических пейсмекеров.

Цель исследования. Изучение механизмов функционирования и регуляции If/HCN канала и селекция пейсмекероподобных клеток из эмбриональных стволовых клеток. .

Задачи исследования:

1. На основании микроэлектродных экспериментов представить характеристику кардиоспецифических субъединиц каналов HCN1, HCN2 и HCN4. Определить HCN изоформу, наиболее близкую по электрофизиологическим параметрам нативному If току, в качестве кандидата для создания биологических пейсмекеров при поражении синоатриального узла сердца.

2. Определить патогенез нарушений электрофизиологических свойств изоформ HCN1, 2 и 4 при повышении уровня калия во внеклеточном пространстве.

3. В микроэлектродных и молекулярно-биологаческих исследованиях изучить влияние р-субъединицы калиевых каналов MiRPl на кардиоспецифические изоформы канала HCN1, 2 и 4 в моделях транс генной экспрессии изоформ в овариальных клетках китайских хомячков.

4. Установить патогенетические механизмы предсердного аритмогенеза путем исследования проведения ионов кальция через канал изоформы HCN2 при его трансгенной трансфекции в овариальных клетках китайских хомячков, человеческих предсердных и неонатальных крысиных кардиомиоцитах.

5. На модели эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced green fluorescent protein) под транскрипционным контролем атриумспецифичнош промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide), изучить возможности выделения по морфологическим критериям EGFP-ANP-позитивной сублишш клеток с фенотипом пейсмекертгх клеток.

6. Определить влияние факторов дифференцировки - эндотелина-1, пейрорегулина-1 и ретиноевой кислоты - на клетки EGFP-ANP-позитивиой сублинии эмбриональных стволовых клеток.

Научная новизна. В ходе решения поставленных задач получены следующие новые научные результаты:

Установлены электрофизиологические характеристики

кардиоспецифичных изоформ НСИ при их экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков. Получены прямые доказательства проводимости ионов Са2+ через канал НСШ, что может быть важным в лечении аритмий. Показана модуляция электрокардиофизиологических свойств кардиоспецифичных изоформ НСШ, НСШ и НСЫ4 0-субъединицей М1КР1.

Выделены трансгенные линии эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующие зеленый флюоресцирующий белок под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора, в том числе сублинии клеток со свойствами пейсмекерных клеток. Оценен эффект факторов дифференцировки эндотелина-1, нейрорегулина-1 и ретиноевой кислоты на линии эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок: эндотелин-1 увеличивает концентрацию пейсмекероподобных клеток, нейрорегулин-1 не влияет на данный показатель, а ретиноевая кислота в концентрациях 1О'7 - 10'9 обладает эмбриотоксическим действием, менее 10"9 - увеличивает концентрацию клеток, схожих с кардиомиоцитами предсердий.

Научно-практическая значимость работы;

1) В микроэлектродных экспериментах установлены электрофизиологические свойства кардиоспецифичных изоформ НСШ, НСШ и НСК4. Наиболее близкой по электрофизиологическим свойствам к нативному каналу ¡[ оказалась изоформа НСШ, что позволяет её считать кандидатом для создания биологических пейсмекеров.

2) Показано, что во внеклеточном растворе с высоким содержанием калия изоформы НСШ и, в первую очередь НСN4, замедляют активацию тока ионов через канал, что проявляется снижением частоты сокращений сердца. Данная модель исследования и полученные результаты могут быть

использованы при изучении влияния повышения уровня калия плазмы крови на состояние сердечно-сосудистой системы.

3) В микроэлектродных экспериментах показано модулирующее влияние Р-субъединицы калиевых каналов MinK-related peptide (MiRP)l на электрофизиологические свойства и экспрессию HCN канала. При создании биологического пейсмекера коэкспрессия Р-субъединицы MiRPl способна модулировать свойства канала в зависимости от выбранной изоформы HCN.

4) Проведение кальциевого тока через канал If/HCN, как важного клеточного мессенджера, может иметь значение для понимания механизмов развития некоторых сердечно-сосудистых заболеваний и состояний, а также в исследованиях аритмогенных свойств канала If.

5) Среди эмбриональных стволовых клеток, трансфицированных геном EGFP, кодирующим зеленый флюоресцирующий белок под контролем кардиоспецифичного промотора, возможно по морфологическим критериям выделение линии клеток, обладающих пейсмекероподобным фенотипом.

6) В связи с тем, что эндотелии-1 способствует дифференцировке кардиальных эмбриональных стволовых клеток в сторону пейсмекероподобного фенотипа, данный фактор роста может быть использован для увеличения количества пейсмекероподобных клеток в. этой клеточной популяции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Кардиоспецифичные изоформы HCN1, HCN2 и HCN4 при экспресс™ в овариальных клетках китайских хомячков обладают различной кинетикой активации. Наибольшим сходством с нативным If обладает изоформа HCN2.

2. В .экстраклеточном растворе с высоким содержанием калия в несколько раз возрастает амплитуда токов у всех изоформ; изоформы HCN1 и HCN4 замедляют активацию тока ионбв через канал, что может быть причиной отрицательного хронотропного действия при повышении уровня калия.

3. р-субъединица калиевых каналов MiR.Pl модифицирует функции канала ПСЫ: увеличивает плотность тока в НС№ и НСЖ, кинетику активации всех изоформ НСН экспрессию мембранных белков НШ2 и НСЫ4 и дифференцированно действует на вероятность нахождения канала в открытом/закрытом состояниях, доступность, вероятность открытия и, в то же время, увеличивает амплитуду открытия канала для всех изоформ.

4. Установлено проведение тока ионов Са2+ через изоформу НСШ и нативные крысиный и человеческий каналы

5. В эмбриональных стволовых клетках возможно выделение клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок ЕСРР под транскрипционным контролем атриумспецифичного промотора гена А№. В АМР-ЕОРР-позитивной линии клеток клетки, веретенообразной формы обладали электрофизиологическими характеристиками пейсмекерных клеток.

6. Эндотелии-1 направляет дифференцировку АЫР-ЕОЕР-позитивных клеток в сторону пейсмекероподобного фенотипа и увеличивает их количество в популяции. Нейрорегулин-1 не обладает таким действием. Ретиноевая кислота в низкой концентрации способствует дифференцировке АЫР-ЕОРР-позитивных клеток в сторону фенотипа предсердных клеток, а в более высоких - обладает тератогенным действием.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований были представлены на Всероссийском конгрессе молодых кардиологов (Москва, 2004), конгрессе Немецкого общества кардиологов (Манхайм, 2005), конгрессе Европейского общества кардиологов (Вена, 2007), Российских национальных конгрессах кардиологов (Москва, 2007, 2008), Конгрессе по кардиоваскулярной терапии и профилактике (Москва, 2008), проблемной комиссии по кардиологии Башкирского государственного медицинского университета, межкафедральном совещании в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том

числе 9 в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК, и из них 3 - в иностранных журналах.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры патологической физиологии и научно-исследовательского отдела передовых медико-биологических технологий Военно-медицинской Академии им. С.М. Кирова, на кафедрах нормальной физиологии и пропедевтики внутренних болезней Башкирского государственного медицинского университета.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 255 страницах компьютерного текста, содержит 105 рисунков, 30 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 270 наименований, включающего 5 отечественных и 265 зарубежных источников.

Выражаю искреннюю и сердечную благодарность руководителю лаборатории клинической и молекулярной кардиофизиологии Кельнской университетской клиники (Германия) проф. У. Хоппе и сотрудникам лабораторий за предоставленную возможность выполнения экспериментальной части работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена с использованием человеческих предсердных кардиомиоцитов, полученных интраоперационно, крысиных неонатальных вентрикулоцитов, овариальных клеток китайских хомячков (ОККХ) и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), полученных из крысиных бластоцист. Практическая часть исследования выполнена в основном в Кельнской университетской клинике. Дизайн исследования представлен на рисунке 1, а методы исследования и количество экспериментов - в таблице I.

Электрофизиологические методы. Для определения I/HCN токов в кардиомиоцитах и эмбриональных стволовых клетках использованы 2 варианта метода микроэлектродных экспериментов (МЭ): «вся клетка» (whole cell) и «один канал» (single channel). Первый вариант позволяет записывать электрофизиологические характеристики всех каналов мембраны клетки, а второй - только единичных каналов. В варианте «один канал» представлены также 2 типа: «прикрепленный к клетке», в котором активность канала записывается непосредственно на мембране и «вне клетки», когда с помощью

пипетки отрывают кусочек мембраны клетки.

Рис. 1. Дизайн исследования. КМЦ - кардиомиоциты, МЭ - микроэлектродные эксперименты, ЭСК - эмбриональные стволовые клетки, ОККХ - овариальные клетки китайских хомячков, ПНУП - предсердньш натрийуретический пептид, УЗФБ - усиленный зеленый флюоресцирующий белок, ПД - потенциал действия, ЭТ-1 - эндотелии-1, НР-нейрорегулшг-1, РК-ретииоевая кислота.

В исследованиях типа «вся клетка» использован усилитель Axopatch 200В (Axon instruments, Foster City, США) с шагом 10 кГц и фильтром 2 кГц. Записи токов были проведены при комнатной температуре (21-23°С). Внешний раствор содержал КС1 (5 или 100 ммоль), NaCl (135 или 40 ммоль), СаС12 (2 ммоль), глюкозу (10 ммоль), MgCl2 (1 ммоль), HEPES (10 ммоль); рН был оттитрован до 7,4 с помощью NaOH. При записи If тока в стволовых

Таблица 1. Методы исследования и количественные параметры экспериментов

Методы/культуры клеток и задачи ОККХ (свойства HCN нзоформ) ОККХ (Р-Субьеяинииа) ОККХ (проведение кальция) КМЦ ушек прсдсерди н Крысиные неонатальны е КМЦ ANP-EGFP -позитивные ЭСК ЭСК (влияние ЭТ-1, НР-1 и РК)

МЭ «вся клетка» HCNI(9), HCN2(11), HCN4 (10); HCNlt(18), HCN2t (11), HCN4t (12); всего 61 клетка HCN1(17),HCN2(H), HCN4(9); HCNl'(lO). HCN2*(14), HCN4*(6); всего 57 клеток - - - (¡28) С РК на 6-8 день (10/10)î, на 14-16 день (14/10)}

МЭ «один канал», тип «прикрепленный к клетке» HCN1 (80 записей, 4 клетки, HCN2 (140, 7), HCN4 (160, 8) IlCNl (80 записей, 4 клетках), HCN204O, 7), HCN4( 160, 8), IICN1 »( 100, 5), HCN2?(100, 5), HCN4»(80, 4) НСЖ (80 записей, 4 клеткЬ); НСК2 при Са2* 2 ммоль (120, 6) 3 сердца, 80 записей, 4 клетки 36 сердец, 80 записей, 4 клетки -

МЭ «один канал», тип «вне клетки» - - НСЫ2 приКа+10 ммоль (120 записей, 6 клетки), НСТ^2 при К+ 1 ммоль (80, 4), 2 ммоль (100, 5), 4 ммоль (120, 6), 7 ммоль (120, 6) - - - - -

Иммуноцитохимия, антитела к — — — - — а-актину, [ антитропонину I коннексинам .40, «43, -45

Планиметрический анализ — — — 130 клеток 163 клеток

Анализ белка методом Вестерн блот HCN1, HCN2, ÏÎCN4; HCN 1/2/4 +KCNE2 — коннексины-40, -43, -45 коинексины -40, -45

Прим: ОККХ - овариапьные клетки китайских хомячков; ANP-EGFP - atrial natiuretic peptidc-enhanced green fluorescent protein (предсердный натрийуретический пептид -усиленная версия зеленого флюоресцирующего белка); ЭТ-1 -эвдотелин-1, НР-1 - нейрорегулин-1, РК - ретшюевая кислота, ЭСК - эмбриональные стволовые клетки, КМЦ - кардиомиоюты f - HCN изоформы в высококалисвом растворе; * - HCN изоформы с коэкспрессией р-су&ъединицы; Î - в скобках количество клеток в контроле/при экспозиции с РК.

клетках к внешнему раствору для блокирования 1КЬ ICaL и It0 токов были добавлены, соответственно, ВаС12 (2 ммоль), CdCI2 (200 нмоль) и 4-аминопиридин (4 ммоль). Растворы в микропипетках с электродом (сопротивление 2-4 оМ) во всех опытах содержали К-глютамат (130 ммоль), KCI (15 ммоль), NaCI (5 ммоль), MgCl2 (1 ммоль), HEPES (10 ммоль) и Mg-АТФ (5 ммоль); рН был отрегулирован до 7,3 с КОН.

Величина If/HCN тока в экспериментах «вся клетка» была измерена при подаче тестового потенциала в диапазоне от - 30 до - 150 мВ (в некоторых экспериментах - до - 180 мВ) с увеличивающимся шагом 10 мВ между потенциалами в течении 2,45 - 3 с как разница между «мгновенным» током в начале гиперполяризации (рис. 2А) и плато в конце гиперполяризиции. Быстрая активация тока была получена при пульсовой деполяризации + 20 мВ. Вычислялись следующие параметры: амплитуда тока, равная разнице между мгновенным» током в начале гипердеполяризации и максимумом тока, измеряемая в пА; плотность тока, равная соотношению амплитуды тока и емкости клетки в пА/пФ; кинетика активации (г) в мс в точке, соответствующей 66,6% от максимума амплитуды. В некоторых экспериментах записывался также потенциал действия. Полученные данные по каждому их этих параметров в последующем были использованы для построения следующих графиков: соотношение напряжение/сила тока, нормализованное по силе тока; соотношение напряжение/сила тока, кинетика активации (т/напряжение). По нормализованным данным по формуле Больцмана I = Imax/(l+exp(-(V,est-Vi/2)/s), где I - плотность тока, Imax - максимальная плотность тока, Vtost -использованное тестовое напряжение, Vi,2 - точка полуактивации и s - фактор уклона кривой, вычислялись следующие параметры: точка полуактивации (VI/2), соответствующая напряжению, при котором кривая активации находилась между верхним и нижним «плато»; точка наклона (s-факгор) -угол наклона кривой, определяемый в точке полуактивацйи.Потенциал действия

(ПД) инициировали короткими деполяризующими импульсами (2 мс, 500-800 пА). В ПД определялись следующие параметры (рис. 2Б): потенциал покоя (ПП), овершут, длительность 90% потенциала действия (ДПД9о).

Рис. 2А. Запись HCN тока при гиперполяризации импульсом - 130 мВ в течение 3 секунд от потенциала покоя - 30 мВ с последующей деактивацией импульсом + 20 мВ. Двухсторонней стрелкой показана точка вычисления силы тока канала, а односторонней - вычисляемая точка активации (в мс). 2Б. Запись потенциала действия (ПД) и его параметры. Овершут -позитивное отклонение пика ПД, ПП - потенциал покоя метки, ДПД90 - длительность 90% потенциала действия.

При МЭ типа «один канал» экстраклеточный раствор содержал КС1 (130 ммоль), NaCI (10 ммоль), ЭДТА (5 ммоль), HEPES-KOH (10 ммоль), рН оттитрован до 7,4 с помощью КОН. Боросиликатные пипетки с сопротивлением 7-10 мВ были заполнены раствором с КС1 (70 ммоль), NaCI (70 ммоль), MgC]2 (1 ммоль), HEPES-KOH (5 ммоль), рН 7,4 с КОН. Для записей токов типа "вырезанная мембрана" внешний раствор был идентичен внутрипипеточному. Усилитель Axopatch 200В, дигитайзер Digidata 1200 interface (Axon Instruments) были использованы для генерации импульсов, записи данных (10 кГц) и фильтрации (2кГц). Записи токов были проведены при комнатной температуре (21-23°С). Продолжительность деполяризации равна 3 секундам с ПП - 30 мВ. При регистрации кальциевого тока через канал ИСК в варианте «вне клетки» как пипеточный, так и внешний раствор содержали (ммоль): KG1 (160 ммоль), MgCl2 (1 ммоль), HEPES (10 ммоль), ЭДТА (1 ммоль); рН 7,4 с КОН. Для кальциевых записей «вне клетки» как внутрипипеточный, так и внеклеточный растворы содержали соответственно:

А

Б

ДПД»

Са2+-глютамат (2 или 20 ммоль) и ТЕА-бромид (136 или 100 ммоль),; рН был оттитрован до 7,4 с ТЕА-ОН. Для записей типа «прикрепленный к клетке» был использован следующий состав внутрипипеточного раствора (ммоль): К-глютамат (1, 4, 7, 10 ммоль) или Ыа'-глютамат (10 или 100 ммоль) и/или Са-глютамат (2 и 20 ммоль) и НЕРЕБ (10 ммоль). Общая осмолярность 140 ммоль достигалась добавлением ТЕА-бромида (рН оттитрован до 7,4 с ТЕА-ОН). Внеклеточный раствор состоял из: К-гаотамат (140 ммоль), М§-глютамат (1 ммоль), Са-глютамат (ОД ммоль), НЕРЕБ (10 ммоль).

Для регистрации тока Са2+ через 1г канал с целью блокирования кальциевого Ь- и Т-типов, натрий-кальциевого обменного, плазма-мембранного АТФ-кальциевого и емкостного кальциевого каналов к внеклеточному раствору были добавлены блокаторы кальциевых каналов: соответственно нифедипин (10 мкмоль), эфонидипин (10 мкмоль), КВ-1179435 (10 мкмоль), 6-карбоксиэозин (10 мкмоль) и 8КЕ-96365 (10 мкмоль). В некоторых экспериментах в экстрацеллюлярный раствор добавлялся 8-бром-аденозин 3'5'-циклический монофосфат и блокатор ивабрадин в концентрации 10 ммоль.

В МЭ типа «один канал» ток линейной утечки и емкостный ток вычитались с помощью средних токов неактивных импульсов. Открытие и закрытие каналов определялись с помощью половинно-амплитудного критерия. Вероятность открытия (Роткр), определяемая как возможность для канала быть открытым в период активных дорожек, и доступность - как фракция импульсов, содержащих, по меньшей мере, одно открытие, вычислялись при наличии одного или более каналов. Количество каналов в месте контакта с мембраной было определено путем деления амплитуды максимального тока на амплитуду одного канала. Амплитуда одного канала была определена при измерении всех амплитуд единичного канала на вершине распределения Гауса. Среднее время нахождения канала в закрытом состоянии

(СВЗС) и средняя первая латенция (СПЛ - время от тестового импульса до первого открытия) были вычислены при наличии только 1 канала в патче.

Молекулярно-биологические методы. Электропорацию плазмид в ЭСК проводили с помощью электропоратора BioRad (Gen Puiser, США).

Для трансфекции овариальных клеток китайских хомячков (ОККХ) плазмидами pAdCGI-HCNl, pAdCGI-HCN2, pAdCGI-HCN4, содержащими соответственно гены HCN1, HCN2 и HCN4, а также репортерный ген EGFP (enhanced green fluorescent protein), кодирующий зеленый флюоресцирующий белок, использовался набор «Lipofectamin plus» («Lipofectamin», США). Для изучения влияния Р-субъединицы MIRP1 на свойства канала HCN ОККХ котрансфицировали плазмидами AdcGI-HCN (1, 2 или 4) и AdcRl-KCNE2, причем последняя кодировала красный флюоресцирующий белок (RFP).

Для качественного и количественного анализа мембранных белков, трансфицированных ОККХ, использовали метод Вестерн блоттинга. Для определения изоформ HCN1, HCN2 и HCN4 применяли соответственно специфические моноклональные анти-HCNl, aimi-HCN2 и аити-НСМ4 антитела (Alomone Labs, Израиль). После стандартного Вестерн блоттинга (BioRad Tankblot system, нитроцеллюлозная мембрана) с иммуноцитохимическоим окрашиванием белков антитела визуализировали методом усиленной химической люминесценции (Amersham Pharmacia Biotech, США).

Культивирование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). При культивировании ЭСК линии D3 использовались средовые культуры: модифицированная среда Далбекко (МСД), содержащая глюкозу (4500 мг/л), фетальную телячью сыворотку (ФТС) в концентрациях 10%, 15%, 20%; L-глютамин (2 ммоль); пенициллин (50 ед/мл) или стрептомицин (50 нг/мл); неэссенциальные аминокислоты (0,1 ммоль, GibcoBRL-Life Technologies, Гайтерсбург, США). Для создания эмбрионального тельца (ЭТ) из ЭСК последние выдерживались в так называемых «висящих каплях» объемом 20

мкл с концентрацией 400 клеток в капле в течение 2 суток. Полученные ЭТ инкубировали в жидкой среде в течении 5 суток, затем переносили на чашки Петри, где они прикреплялись ко дну и начинали дифференцироваться в различные клеточные ростки. Из выросших ЭТ с помощью методики изоляции клеток из сердечной ткани [Isenberg I. et al., 1982] изолировали отдельные кардиомиоциты на разных стадиях дифференцировки: на ранней стадии развития, когда появляются первые спонтанно сокращающиеся клетки (от 7+3 до 7+5 суток), на промежуточной (от 7+6 до 7+8 суток) и поздней (от 7+9 до 7+12 суток) стадиях. Изолированные кардиомиоциты переносили на новые чашки Петри, где в течении первых 12 часов они прикреплялись к поверхности и возобновляли ритмичные сокращения. Участки спонтанно сокращающихся и флюоресцирующих клеток были рассечены с помощью скальпеля в период от 7+4 до 7+28 суток. Морфологическую характеристику и процентное содержание клеток различной формы определяли при осмотре 130 последовательно изолированных флюоресцирующих клеток.

Иммуноцитохтшя изолированных ANP-EGFP-позитивных клеток. После формирования ЭТ единичные, энзиматически разъединенные ANP-EGFP-позитивные клетки платировали на предметные стекла. С целью подтверждения кардиальной природы изолированных клеток клеточную стенку разрушали путем спиртового лизирования и на стекло наносили первичные антитела против структурных белков кардиомиоцитов: мышиные моноклональные антитела, распознающие а-актин, козлиные поликлональные антитропониновые антитела (Sigma, ФРГ), козлиные анти-коннексин-40 антитела, мышиные анти-коннексин-43 моноклональные антитела (SantaCruz, США), кроличьи анти-коннексин-45 антитела (Chemicon International, США), анти-minK или анти-MiRP-l поликлональные антитела. В качестве вторичных антител были использованы козлиные антимышиные IgM, козлиный антикроличий IgG, R-фикоэритрин коньюгированный анти-мышиный IgG и R-фикоэритрин-коньюгированный антимышиный IgG. Визуализация клеток

проводилась с помощью конфокального микроскопа (Leica Mycrosystems, Германия).

Изоляция нашивных клеток. Для исследования тока кальция через If канал были использованы нативные кардиомиоциты, изолированные интраоперационно из ушек предсердий 4 пациентов по методике UC.Hoppe (1999). Для определения кальциевого тока в If в вентрикулоцитах их изолировали из сердец новорожденных крыс (в «возрасте» 1-3 суток) по стандартной методике [Qu J. et al., 2001].

Статистическая обработка полученного материала была выполнена с помощью одностороннего критерия Стьюдента, линейной и сигмоидальной регрессии с помощью формулы Больцмана. Различия с уровнем вероятности р<0,05 считались достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Электрофизиологическая характеристика кардиоспецифических HCN1, HCN2, НСМ изоформ

При микроэлектродных экспериментах (МЭ) типа «вся клетка» при тестовых гиперполяризующих импульсах от - 30 до - 180 мВ при физиологических (К+=5 ммоль) концентрациях ионов внешнего (экстраклеточного) раствора и в растворе с высоким содержанием калия (К+=100 ммоль) было проведено изучение кардиоспецифных изоформ канала HCN, экспрессированных в овариальных клетках китайских хомячков.

На рисунке 3 представлены записи кардиоспецифических изоформ HCN при тестовом потенциале - 140 мВ: наибольшей кинетикой активации обладал ток изоформы HCN1, за ним следовал HCN2 и наименьшей - HCN4 (tHcni= -54,6±7,6, thcn2= - 152,96±12, thcn4= - 456,3±23,2). При этом в парах HCN1-HCN2, HCN2-HCN4 и HCN1-HCN4 достоверная разница параметра х определялась при всех тестируемых потенциалах (р<0,01).

В то же время, разница в плотности тока, вычисляемая как отношение силы тока к емкости клетки, при сравнении всех трех изоформ оказалась

несколько менее существенной, чем при сравнении кинетики активации. Так, разница в плотности тока в паре HCN1-HCN2 оказалась достоверной только в самом начале гиперполяризационного протокола - от - 40 до - 90 мВ (р<0,05). В паре HCN2-HCN4, наоборот, плотность тока достоверно различалась при более негативных потенциалах - от -100 до -150 мВ (р<0,05 и р<0,01), что связано с более быстрым достижением плато (насыщением) у изоформы HCN4 в сравнении с другими изоформами. При сравнении потенциалов в паре HCN1-HCN4 значения различались при всех тестовых потенциалах, при которых ток вообще регистрировался (р<0,001). При этом активация тока изоформы HCN4

начиналась значительно позже, чем двух других изоформ (-50--бОмВ

против ~ 40 мВ, табл. 2). При нормализации кривых токов по максимальному значению регрессионный сигмоидальный анализ по уравнению Больцмана кривых активации токов изоформ подтвердил полученные данные: изоформа HCN1 обладала минимальным среди этих трех кардиоспецифичных каналов показателем половинной активации (Vi/2= - 90,03±4,4 мВ). Изоформа HCN2, несмотря на то, что имела показатель половинной активации чуть меньший, чем у изоформы HCN4 (- 106,92±2,2 мВ против - 108,82±1,8 мВ; р>0,05), обладала наименьшим фактором уклона (s-факторнсш 10,18±0,6 против s-фактораПсх2 10,18±0,59; р>0,05 и против 5-фактораНш413,55±0,67; р<0,05), то есть самой вертикальной кривой активации.

При сравнении плотности тока между изоформами в растворе с высоким содержанием калия можно отметить схожую кинетику активации для изоформ HCN1 и HCN2 (р>0,05 при всех потенциалах) и резкие отличия изоформы HCN4 от HCN1 и HCN2 почти при всех регистрируемых потенциалах, что значительно отличается от экспериментов с физиологическим экстрацеллюлярным раствором.

HON1 *

Рис. 3. Сравнение кинетики активации изоформ HCN1, HCN2 и HCN4 при тестовом потенциале - 140 мВ.

Таблица 2. Параметры нормализованных кривых активации

Параметры HCN1 HCN2 HCN4

N 9 11 10

s-фактор 13,88±2,44 10,18±0,6f 13,55±0,7

Vj/2, мВ - 90,03± 4,4**Ш -106,92±2,2 -108,82±0,7

Активация тока -30 — 40мВ -30— 40мВ -50 — 60 мВ

Прим: * — достоверность различий между параметрами изоформ НСЫ1 и НСЫ2, I — между НС№ и нет и}- между НСМ и НСЩ* - р<0,05; **, %% - Р<0,01, - р<0,001).

При сравнении электрофизиологических параметров в физиологическом и растворе с высоким содержанием калия определялась следующая динамика: во всех трех изоформах примерно в 2-3 раза возросла плотность тока, причем достоверность различий, увеличивающаяся с ростом напряжения тестового сигнала, оказалась больше в случае изоформы ЖЛЧ2 и особенно НСЫ4 (табл. 3). При нормализации плотности тока по максимальному значению после увеличения концентрации К+ изменения электрофизиологических свойств изоформ несколько различались между собой. Следует отметить отсутствие достоверных изменений в угле наклона кривой активации (в-фактор) во всех изоформах с тенденцией к уплощению кривой (р>0,05).

В изоформе НСМ произошел достоверный сдвиг кривой активации влево к более негативным значениям (У1д(К+5)= - 90,03±4,4, У1я(К+100)= — 108,8±4,75; р<0,05) и напряжение первой активации тока смещалось несколько влево (с - 30 — 40 мВ к - 40 мВ — 50 мВ). Повышение концентрации уровня К+ не сказалось на характере кривой активации изоформы НСК2 (Ут(К+5)= — 106,92±2,2, У|/2(К+100)= - 104,63±4,4; р<0,05). Уклон кривой активации и первая активация тока также не изменились в сравнении с физиологическим раствором (р>0,05). В изоформе НСЖ изменения кривой активации оказались наибольшими: произошел значительный (на - 34 мВ) сдвиг влево (Уь'2(К15)= -108,82±0,7, Уш(К+Ю0)= - 152,96±3,1; р<0,001) - рис. 4. Соответственно, первая активации тока стала начинаться с - 70— 80мВ в отличии от - 50 до -бОмВ в контроле.

Таблица 3. Параметры HCN изоформ в низко- и высококалиевом растворах

Параметры HCN1 HCN2 HCN4

К+5 К+100 К+5 К+100 К+5 К+100

N 9 18 11 11 10 12

s-фактор 13,88±2 17,68+2 10,18+0,6 14,26±2 13,55+0,7 13,8+0,8

V ш, мВ -90,03 ±4* -108,8±5 -106,92± - 104,63+4 - 108,8±1Ш -152,96±3

Активация -30— 40мВ -40--50мВ -30— 40мВ -30--40мВ -50—60 мВ -70— 80мВ

При данных изменениях электролитного внеклеточного раствора, в отличие от плотности тока, кинетика активации в изоформах НСИ1 и НСШ в сравнении с контрольным (физиологическим) не изменилась.

Для изучения свойств отдельных изоформ HCN каналов на мембране клеток вне зависимости от его экспрессии на мембране использованы исследования типа «один канал» в варианте «прикрепленный к клетке» (cell attached). Время записи сигнала после импульса было выбрано таким образом, чтобы соответствовать времени регистрации в экспериментах типа «вся клетка» для возможности последующего сравнения полученных результатов.

-200 -180 -160 -140 -120 -100 -80 -SO -40 -20

Напряжение (мВ)

Рис. 4. Нормализованное по плотности тока соотношение плотности тока/напряжения для изоформы HCN4 в физиологическом растворе и с высоким содержанием калия.

Таким образом, при анализе электрофизиологических характеристик токов кардиоспецифичных HCN каналов изоформа HCN1 показала самую быструю кинетику активации, далее следовала HCN2 и самой «медленной» изоформой оказалась HCN4. Кроме того, изоформа HCN1 превосходила HCN2 и особенно HCN4 по плотности тока. Ток HCN4 активировался гораздо позже других изоформ (- 50- - бОмВ) и значительно раньше достигал порога насыщения (при -130мВ). По литературным данным [Hoppe UC., 1999], нативный If ток обладал средней кинетикой активации (т= - 220 мс), активировался при - 60 мВ, показатель полуактивации составил - 89,3±0,7 мВ, фактор наклона -12,7 ±0,7 мВ и был более сходен с током HCN2. Одним из вариантов создания биологического пейсмекера может быть трансгенная трансфекция мезенхимальных клеток геном, экспрессирующим необходимый ионный канал с последующей имплантацией компетентных клеток в область синоатриального узла [Barbutti А. et al., 2007]. Сравнение полученных нами электрофизиологических параметров HCN изоформ (табл. 2) с вышеуказанными параметрами нативного тока If показало наибольшее сходство If тока с HCN2, что позволяет считать её оптимальным кандидатом для создания биологического пейсмекера.

В отличии от плотности тока при исследовании «вся клетка», в данном варианте в парах HCN1-HCN2, HCN2-HCN4, HCN1-HCN4 было найдено

небольшое количество достоверных изменений (табл. 4). Средняя первая латенция была минимальна у НОЛ, имела тенденцию к увеличению в НСШ и НСЫ4, что соответствует кинетике активации в данных изоформах при исследовании с помощью метода «вся клетка». Среднее время нахождения канала в открытом положении было значительно меньше у изоформ НС1Ч1 и НСШ в сравнении с изоформ ой НСЖ (р<0,05), в то же время нахождения каналов в закрытом состоянии достоверно не изменилось для всех сравниваемых изоформ.

Таблица 4. Параметры токов НСИ1, НСЫ2 и НСЖ

в микроэлектродных исследованиях типа «один канал» при - 90 мВ

Параметры/ N измерений HCN1 HCN2 HCN4

80 (4 клеток) 140 (7 клеток) 160 (8 клеток)

Доступность (%) 99,25±0,7 94,33±2,5 98,13+1,8

Роткр (%) 18Д9±6,7 22,45±0,48 21,89±5,2

СВОС (мс) 1,27+0,19* 0,71±0,Щ 2,39±0,48

СВЗС (мс) 17,93+11,68 24,12±2,9 15,57±5,8

СПЛ (мс) 179,8+94,8 328,4±116,6 402,77±127,3

Амплитуда (пА) -1,92± 0,3 -1,82±0,2 -2,04+0,13

Прим.: доступность — фракция импульсов, содержащих, по крайней мере, одно открытие канала. Вероятность открытия (Роткр.) - возможность для канала быть открытым в период активной фазы канала (вычислялась при наличии одного или более каналов). СВОС -среднее время для канала в отрытом состоянии, СВЗС — в закрытом, СПЛ (средняя первая латенция) - время до первого открытия в дорожке, п - количество экспериментов. Для сравнения групп был использован двусторонний тест Стьюдента, * — достоверность различий между параметрами изоформ HCN1 и HCN2, f — между HCN2 и HCN4 (* — р<0,05; К-р<0,01).

Полученные нами электрофизиологические характеристики изоформ в целом соответствуют литературным данным [Chen J. et al., 2001; Ludwig A. et al. 2001; Ulens C. et al., 2001]. В то же время, в нашей работе можно отметить определенный сдвиг параметров Vi/2HCN2 (- 106,92±2,21 мВ) и ViqHOSM (108,82 ±0,67 мВ) в сторону отрицательных значений.

В клинической практике нередко встречаются случаи почечной недостаточности с повышенной концентрацией калия в крови, а также передозировки калий-содержащих препаратов, которые могут приводить к значительной брадикардии, вплоть до остановки сердца в диастоле [Vuckovic К. et al., 2004; Walter R.B. et al., 2002], однако неясными оставались механизмы отрицательного хронотропного эффекта указанного нарушения электролитного состава на ЧСС. В наших исследованиях было показано, что в высококалиевом растворе значительно возрастает плотность тока в изоформе HCN1 и особенно HCN4. Кроме того, определялся значительный сдвиг кривой активации кривой влево, т.е. к более негативным значениям. Учитывая факт высокой плотности изоформы HCN4 в клетках синоатриального узла [Biel М. et al., 2001], сдвиг кривой активации к более негативным потенциалам способен значительно увеличить порог активации, а также время достижения потенциала действия.

Модуляция HCN-тока ß-субъединицей MiRPl (KCNE2)

Овариальные клетки китайских хомячков, трансфицированные изоформами HCN1,2 и 4 (зеленое свечение), в качестве контроля, и коэкспрессированные с ß-субъединицей MiRPl (зеленое + красное) в опытной группе, выявлялись под микроскопом с помощью флюоресцентной лампы с последующими МЭ типа «вся клетка» и «один канал».

В МЭ типа «вся клетка» при гипердеполяризующих импульсах от - 20 до -180 мВ ни при одном напряжении плотность тока в контроле и при коэкспрессии KCNE2 не показала достоверной разницы. При нормализации данных по плотности тока и регрессионном анализе по формуле Больцмана кривые активации в обеих группах были практически идентичны, и параметры нормализованной. кривой также не отличались между собой (VI/2HCN1= -108,6±3, V1/2HCN1+KCNE2= - 113,6±1; р>0,05; 8-факгорНст= 15,9±2,4, s-факторнсш+ксж2= 18,8±1,6; р>0,05 - табл. 5).

Таблица 5. Параметры кривой активации изоформ НСШ, НСШ и НСК4

и при коэкспрессии гена КС1ЧЕ2

Показатели НСШ нею нем

Контроль +КСЫЕ2 Контроль +КС№2 Контроль +КСЫЕ2

N 17 10 11 14 9 6

Уш (мВ) -108,6±3 -113,6±1 -103,1±2 -107,1±1 -151,9±2 -145,5±3

з-фактор 15,9±2,4 18,8±1,б 19,72±1,4 20,46±1,6 12,26±1,2 12,48±1,6

Первая актив., мВ -30--40 -30--40 -30—40 -30--40 -50—60 -50—60

При сравнении кинетики активации в обеих группах клеток в опытной группе ток нарастал быстрее контрольной. На рисунке 5 показано, что достоверность разницы достигалась в диапазоне физиологической активации от -70 до -90мВ (тНсх1= - 342,8±52, т„См+КС1ЧЕ2= - 237±37,3 при - 90 мВ; р<0,05).

-НО -120 -100 -во -во

Напряжение (мВ)

Рис. 5. Кинетика активации тока НСШ (полые круги) в сравнении с НСШ+КСЫЕ2 (черные круги). Достоверные различия получены в диапазоне от — 70 до -90мВ (* — р<0,05).

При исследовании клеток в варианте «один канал» (табл. 6, рис. 6) полученные результаты оказались несколько противоречивыми: с одной стороны, достоверно снизилась доступность (74,47±12% против 99,25±0,7% в контроле, р<0,01) и увеличилась средняя первая латенция (с 179,8±94,8 до 652,6±14,7 мс; р<0,01), то есть в целом уменьшилась активность канала, но, с другой стороны, увеличилась амплитуда открытий (с - 1,9±0,3 до - 2,62±0,2 пА; р<0,05).

нем

НСМ1+КСМЕ2

Рис. 6. Примеры записи НСМ1 и НС1\П-КСМЕ2 токов с помощью микроэлектродного метода «один канал». Визуально можно отметить снижение активности канала (уменьшение количества открытий) при увеличении амплитуды и среднего времени нахождения канала в открытом состоянии.

Таблица 6. Электрофизиологические параметры НСШ, НСЫ2 и НСЖ изоформ при МЭ типа «один канал», котрансфицированные с КСМЕ2

Параметры НСШ НСШ+ КС№2 НШ2 НС№+КС №2 НС№ НСЖ+КС№ 2

а измерений 80 100 140 100 160 80

Дост. (%) 99,25±0,7 75,5±12* 94,33±2,5 56.8Ш6* 98ДЗ± 1,8 98,2±0,9

Ротор (%) 18,19±6,7 15,6±5 22,5±0,5 52,1±7* 21,9±5,2 15,2±4,7

свос. (мс) 1,27±0,2 3,1±0,5* 0,71±0,] 3,4±0,8 * 2,39±0,5 1,1 ±0,2*

СВЗС (мс) 17,93±11 25,2±14 24,12±2,9 12,2±1* 15,57±5,8 25,76±10,6

СПЛ (мс) 179,8±4,8 652,6±15* 328,4±117 264,3±146 402,8±127 343±81

Ампл. (пА) -1,92± 0,3 - 2,6±0,2* -1,82±0,2 -2,6±0,1» -2,04±0,1 - 2,9±0,2*

Наконец, при Вестерн Блот анализе мембранных белков клеток, трансфицированных генами HCN1 и HCN1+KCNE2, не было найдено достоверных различий по плотности белков HCN1 (р>0,05; рис. 7).

На рисунке 8 представлены примеры записи тока HCN2 и при коэкспрессии с KCNE2 методом «вся клетка». Плотность тока при коэкспресии с KCNE2 превосходила плотность тока в контроле, по достоверные различия были получены в диапазоне от - 120 до - 150 мВ (72,8±15,8 против 142,9±24,4 мВ при-140 мВ; р<0,01).

-100 Кб

-120 кб

- 140 кб

Рис. 7. Вестерн Блот анализ плотности мембранных белков ОККХ при экспрессии ИСШ (А), НС№ (Б), НСШ(В) и при коэкспрессии КС1МЕ2 (справа). Достоверность различий в парах' выявлена в изоформах НСЫ2 и НСЫ4 (р<0,05).

При нормализации данных по плотности тока и построении сигмоидальной регрессии по уравнению Больцмана показано, что (3-субъединица не влияла на показатели кривой активации изоформы НСК2 (У1/2(НСМ2)= - 103,1±2 против - У1/2(НС№+КС№2)=107,1±1, 8-факторНСШ=19,72±1,4 против в-фактор НС№+КСШ2=20,46, р>0,05) - табл. 5. Изменения кинетики активации данной изоформы оказались схожими с

НОЛ: в целом скорость активации увеличилась, но достоверность установлена только в диапазоне физиологической активации (от - 70 до - 90мВ, р<0,05).

HCN2+KCNE2

1 sec

-150mVL:

Рис. 8. Кривые тока изоформы HCN2 и IICN2 с коэкспреесированным геном KCNE2. Достоверность разлитой показана при потенциалах — 140 мВ и — 150 мВ (р<0,05).

Анализ записей токов методом «один канал» в клетках, трансфицированных генами HCN2 и HCN2+KCNE2, показал, что изменения, индуцированные Р-субъединицей, частично совпали с тенденциями, характерными для изоформы HCN1: выросла амплитуда открытий канала с -1,82*0,2 до - 2,59±0,1 мВ (р<0,05), СВОС - с 0,71±0,1 до 3,4±0,8мВ (р<0,01), снизилась доступность с 94,33±2,5 до 56,81±1,6% (р<0,001), однако, в отличии от HCN1, СВЗС уменьшилось с 24,12±2,9 до 12,2±1 мс (р<0,01) и возросла Роткр. с 22,45±0,5 до 52,07±7,3; р<0,01 (табл. 6).

При Вестерн Блот анализе мембранных белков клеток, трансфицированных HCN2 и HCN2+KCNE2, плотность белка во второй группе возросла на 63% (р<0,01) - рис. 7. При экспрессии HCN4 и HCN4 с KCNE2 в ОККХ плотность тока в опытной группе была выше в контроле, при этом достоверность различий была получена в диапазоне от - 110 до - 170 мВ (29,7±4,2 против 72,7±12 мВ при - 140 мВ; р<0,001).

При нормализации данных по плотности тока и получении сигмоидальной регрессии по уравнению Больцмана показано, что в изоформе НСЖ, аналогично НСШ и НСШ, Р-субъединица не оказала влияния на кривую активации (Уш(НШ4)= - 151,9±2 против У1/2(НСМ4+КСЖ2)=145,5±3, к(НСШ)=12,26±1,3 против (НСШ+КСЫЕ2)= =12,48±1,6; р>0,05) - табл. 5. По аналогии с НСК1 и НСЫ2, скорость активации значительно уменьшилась при всех тестовых потенциалах (при -140 мВ Тном=1315±268,8 против тНам+ксш2= =499±81,3; р<0,05).

Анализ записей токов методом «один канал» в (ЖКХ, трансфицированных генами НСШ и НСЫ4+КСЫЕ2, показал, что изменения, индуцированные Р-субъединицей, не были схожими с теми, что были найдены при анализе НСШ и НСЛЧ2 изоформ. В частности, доступность практически не изменилась (соответственно 98,13±1,8% против 98,2±0,9%; р>0,05), снизилось СВОС (2,39±0,5 против 1,11±0,2 мс; р<0,05), однако так же, как и в остальных изоформах, увеличилась амплитуда (- 2,04±0,1 против - 2,96±0,2; р<0,05) -табл. 6.

Наконец, при Вестерн Блот анализе мембранных белков клеток, трансфицированных генами НСЖ и НС№Н-КС№12, плотность белка НСШ во второй группе возросла на 56% (р<0,01) - рис. 7.

0>и I. и соавт. (2004) впервые показали, что белок МШР-1, кодируемый КСЫЕ2, может быть также р-субъединицей канала НСН. В различных клеточных системах были получены несколько противоречивые данные о воздействии белка МШР-1 на свойства изоформ НСИ [Акотаге С. е1 а1., 2003; БесИег К., 2003]. Собственные результаты соответствуют данным (}и 1. е1 а1. (2000) в отношении изоформы НСШ и несколько расходятся с данными Аиошаге С. е1 а1. (2003) и БесЬег Ы.е1 а1.(2003) в отношении НСЖ и НСШ. Полученные данные позволяют варьировать электрофизиологическими свойствами НСМ канала при создании соответствующего биологического пейсмекера.

Доказательства проведения кальция через НСЮ и нативный канал

В конфигурации «один канал» в варианте «вне клетки» нам удалось зарегистрировать активность канала НСЫ при его экспрессии в ОККХ. Ток имел время- и вольтажзависимость по аналогии с МЭ типа «вся клетка» для токов [/НСК Симпатическая стимуляция клеток с помощью цАМФ (1 ммоль) значительно увеличила вероятность открытия НСN2 канала с 24,7+11,1% до 51,0±14,1% (р<0,05) без изменения амплитуды одиночных каналов. Кроме того, продемонстрировано значительное снижение вероятности открытия НСШ канала при добавлении в его раствор ингибитора ^ тока ивабрадина в концентрации 50 мкмоль (25,8±7,1% против 6,08±3,5%; р<0,05).

Для получения прямых доказательств проведения тока Са2+ через НСМ канал была проведена регистрация открытий канала в режиме «вне клетки» в моноионном растворе с Са2+, как единственным ионным носителем в его физиологической концентрации (2 ммоль). При гипердеполяризации ток ионов кальция через изоформу НСШ обладал небольшой амплитудой - 0,87±0,1 пА и низкой вероятностью открытия 3,02±0,5% (при - 110 мВ). Амплитуда канала прогрессивно увеличивалась при более негативных потенциалах. Проводимость канала, вычисленная с помощью уравнения линейной регрессии, составила 8,9±1,2 пС для 2 ммоль Са2+. Увеличение концентрации Са2+ до 20 ммоль привело к снижению проводимости до 5,78±1,1 пС.

Для дальнейшего подтверждения проводимости Са2+ через НСИ использовались эффекты прямой стимуляции цАМФ или его подавление ингибитором ^ канала ивабрадином. Кальциевый ток через ЮГС2 канал значительно активировался цАМФ, увеличивая вероятность открытия (3,02+0,5% в контроле против 8,66+2,3% в присутствии цАМФ 10 мкмоль при -110 мВ; р=0,027), сокращая среднюю первую латенцию и среднее время открытия, в то время как амплитуда тока осталась неизменной (рис. 9). Более того, вероятность открытия НСШ канала при проведении ионов кальция уменьшилась при добавлении ивабрадина в концентрации 10 ммоль (3,67±1,1%

без ивабрадина против 1,16+0,9% с ивабрадином при - 110 мВ, р=0,033). Следовательно, проведенные исследования позволили установить проведение Са2+ через канал НСШ.

-35 Т_

Контроль -110

-т«г

цАМФ(ЮмкМ) Ивабрадин (10 мМ) -110 "Зп5 -110 г

-35 Т_

1 пА Г

50мс

Рис. 9. Одноканальная активность НСЫ2-Са2+ тока (2 ммоль) значительно увеличилась при добавлении цАМФ (в центре, 10 ммоль) и снизилась - ивабрадина (справа, 10 ммоль).

Для подтверждения наличия тока в нативных клетках были проведены дополнительные одноканальные исследования кальциевого 1{ тока в моноэлектролитном растворе на моделях человеческих предсердных КМЦ и КМЦ желудочков неонатальных крыс при инактивации всех других вольтажзависимых кальциевых каналов. Одноканальные записи при физиологических мембранных потенциалах показали амплитуду открытий 0,79+0,01 пА и вероятность открытия 3,53±1,59% (при - 90 мВ).

Влияние проводящих катионов и К+ на НСЫ-канал и проводящие свойства 1нач-са2+ ДО сих пор было неизвестно. Поэтому нами проведен анализ проводимости Са2* в присутствии или Клв. МЭ типа «прикрепленный к клетке». Увеличение концентрации Са2+ от 2 до 20 ммоль снизило проводимость канала ^Са2тм 7,9±0,9 пС, ^Са20тм 4,59+0,7 пС; р=0,04) и обратный потенциал в позитивном направлении (У^-с^тм 15,3+4,23мВ, Угеу.

слоим 50,4±6,2 мВ; p=0,008). В сравнении с только HCN2-Ca2+ проведением, проводимость HCN2-Na+-Ca2+ была меньше (6,43±0,4 пС, Na+ 100 ммоль, Са2+ 2 ммоль; р>0,05), в то время как НСШ-Кт-Са2*-проводимостъ увеличилась (10,9±0,48 пС, К+4 ммоль, Ca2t 2 ммоль; р<0,05).

Проводимость HCN2-K4" в отсутствии экстрацеллюлярного Са2+ с ростом концентрации калия значительно выросла (1 ммоль К+ 10,0±1,2 пС, 4 ммоль К+ 12,8±1,0 пС, 7 ммоль К+ 15,2±0,5 пС, 10 ммоль К+ 21,0±0,6 пС; р>0,05; рис. 10), в то время как смешанная К+-Са2+-проводимость не изменялась при различной экстрацеллюлярной концентрации К+ (1 ммоль К+ 9,23±0,9 пС, 4 ммоль К+ 10,9±0,48 пС, 7 ммоль К+ 10,8±0,45 пС, 10 ммоль К+ 11,5±0,29 пС; р>0,05).

Считается, что через If канал осуществляется проведение тока ионов К+ и Na+. Впервые Yu X. et al. (2004) определили внутриклеточный подъем концентрации Са2+, индуцированный гипердеполяризацией, который был блокирован блокаторами If тока Cs+ и затебрадином, однако до настоящего времени прямое проведение кальция через HCN канал не было показано. Нами был зарегистрирован ток в МЭ типа «один канал» с ионами Са2+ в растворе как с единственным носителем тока в изоформе HCN2, которая является доминантной изоформой HCN [Biel М. et al., 2002]. HCN2/If кальциевый ток показал небольшую амплитуду и очень низкую вероятность открытия по сравнению с K+-Na+. Перфузия с цАМФ значительно снизила среднее время его закрытия и увеличила вероятность открытия без изменения амплитуды, а уменьшение активности с селективным блокатором If ивабрадином подтвердило факт проведения именно Са2+. В наших экспериментах был также продемонстрирован кальциевый ток через нативные If каналы в вентрикулоцитах неонатальных крыс и человеческих предсердных КМЦ. Несмотря на небольшую величину, кальциевый ток через HCN/If может иметь функциональное значение, так как было установлено, что даже небольшие изменения концентрации Са2+ могут влиять на транскрипцию различных белков [Benitach JP. et al., 2007] и играть патогенетическую роль в развитии

некоторых заболеваний, сопровождающихся увеличением плотности тока If и HCN, например, при фибрилляции предсердий и сердечной недостаточности [Hoppe UC. et al., 1998; Lai L.P. et al„ 1999].

Рис. 10. HCN2 одиоканальные характеристики при разных концентрациях К+ (тип «прикрепленный к клетке»). Показаны одноканальные амплитуды HCN2 тока как функция от тестовых потенциалов. Проводимость вычислялась на основании индивидуальных данных без (слева) и с 2 ммоль Са + (справа) для концентраций К+ 1/4/7/10 мкмоль.

Электрофизиологическая и морфологическая идентификация пейсмекероподобных клеток в эмбриональных стволовых клетках мышей Эмбриональные стволовые клетки мышей, трансфицированные с помощью плазмид, несущих промотор гена ANP (atrial natriuretic peptide), кодирующего ген EGFP (enhanced green fluorescent protein) под контролем кардиоспецифичного промотора, культивировались в «висящих каплях» до получения так называемых эмбриональных телец (ЭТ). Флюоресценция ANP промотора проявлялась на 6+4 сутки (полный «возраст»: 6 суток до формирования эмбрионального тельца и 4 суток после), реже - на 6+3 в виде формирования скоплений клеток с ярким свечением. Через 24 часа после начала свечения все ареалы в ЭТ начинали сокращаться. Двухмерная планиметрическая калькуляция показала, что EGFP-позитивные участки из ЭТ на поздних стадиях развития (от 6+20 суток) составили 18+3,3% всех клеток. На всех стадиях развития ЭТ флюоресценция вследствие кардиальной

Тестовый потенциал -160 -130 -100 -70

Тестовый потенциал -160 -130 -100 -70

без Са2+

с Са2+

специфичности человеческого гена ANP определялась только в сокращающихся ареалах.

Для дальнейшего подтверждения кардиальной природы EGFP-экспрессирующих клеток проведено иммунное окрашивание (иммуноблоттинг) ЭТ и отдельных клеток, полученных из ЭСК. Среди EGFP-позитивных клеток 91% были позитивны к антителам против а-актинина. Дополнительное окрашивание антителами, специфичными к кардиальному тропонину I, показало позитивную реакцию к 83% EGFP-позитивным клеткам, изолированным из 21-28- суточных ЭТ. Следовательно, иммуноцитохимическое исследование подтвердило кардиоспецифичную экспрессию гена-репортера в ANP-EGFP-трансфицированных ЭСК.

Для идентификации и характеристики пейсмекерных клеток, полученных из ЭСК в период терминальной дифференцировки (6+>9 сут), проведена регистрация потенциала действия и тока If. If ток присутствовал в 74% всех EGFP-позитивных клетках со средней плотностью тока 20,4±2,0 пА/пФ при тестовом импульсе - 150 мВ.

Затем под микроскопом от ЭТ были отделены участки, в которых большая часть клеток флюоресцировала и сокращалась. После энзиматической диссоциации трипсином была изучена морфология клеток. Полученные флюоресцирующие клетки по форме можно разделить на веретенообразные, круглые и тре(много)угольные клетки (рис. 11). Все веретенообразные EGFP-экспресссирующие клетки (п=22) обладали фенотипом пейсмекерных клеток (рис. 12). Эти веретенообразные кардиомиоциты энергично сокращались с частотой 173±14 уд/мин, генерировали спонтанный синусонодальный ПД, синхронный с сокращениями (потенциал покоя - 45,5±2,2 мс; медленная диастолическая деполяризация; овершут 19±3 мВ; ПДДю 111,3±1,7 мс) - табл. 7. Все треугольные клетки показывали ПД, схожий с ПД в предсердных клетках, но с более негативным потенциалом покоя (- 68,7±2,1 мВ), более позитивными овершутами (37±1,8 мВ) и более короткой продолжительностью

(ПДД90 48,0±2,1 мс). В соответствии с этими различиями по частоте сокращений и ПД все веретенообразные клетки характеризовались значительно большей плотностью If тока (34,5±2,4 пА/пФ при -150 мВ), более ранней активацией (от - 50 до - бОмВ) и более быстрой кинетикой активации тока (т 395,3±30,7 мс при - 150 мс) в сравнении с тре-/многоугольными клетками (12,8±0,7 пА/пФ при - 150 мВ; первая активация - от - 80 до - 90 мВ; т 681,1±30,3 мс при - 150 мВ; р<0,001; рис. 12). Эти особенности If тока и ПД подтверждают пейсмекероподобный фенотип веретенообразных клеток.

".¿Üb''

у щ

20 цт

Рис. 11. Веретенообразная (слева) и треугольная (справа) формы EGFP-позитивных клеток. Конфокальная фотография (Leica Microsystems, ФРГ).

Таблица 7

Электрофизиологические параметры веретенообразных и тре(много)угольных

клеток

Параметры Веретенообразные клетки Тре(много)угольные клетки

п клеток 22 77

Потенциал покоя (мВ) -50--60 -80--90

Плотность тока 1г (пА/пФ при -150 мВ) 34,5±2,4** 12,8 ±2,4

Кинетика активации т (мс) 395,3 ±30,7*** 681,1 ±30,3

Овершут (мВ) ПД 19±3*** 37±1,8

ДПД% (МС) 111,3±1,7*** 48,0±2,1

ПП (мВ) потенциала действия — 45,5±2.2*** -68,7±2,1

Прим.: ** —р<0,01; ***-р<0,001.

Рис. 12. Электрофизиологичсские характеристики 1г тока кардиомиоцитов, полученных из ЕОЕР-позитивных клеток (А) Веретенообразные клетки показывают высокую плотность 1г тока (34,5±2,4 пА/пФ при — 150 мВ) и быструю активадионную кинетику (х=395.3±30,7 мс при — 150 мВ). (Б) Плотность тока была значительно меньше у тре(много)угольных клеток (12,8 пА/пФ при -150 пА/пФ), так же как и активациоиная кинетика (т=681.1±30,3 мс при — 50 мВ; р<0,001). Показаны скалированме (В) и протокол (Г) микроэлектродного исследования «вся клетка» 1гтока.

Нами было показано, что среди КМЦ, полученных из ЭСК и экспрессирующих ЕвРР, можно выделить сублинии клеток с определенными морфологическим и электрофизиологическими параметрами. Наиболее распространенным типами клеток был тре(много)угольные с электрофизиологическими характеристиками предсердных клеток. Кроме того, идентифицирована сублиния клеток веретенообразной формы с пейсмекероподобным фенотипом. Помимо конфигурации потенциала действия, два вышеуказанных клеточных субтипа сильно различались по величине и кинетике тока I,. Экспрессия ЕвРР под контролем кардиоспецифического промотора способствует идентификации ПК, полученных из ЭСК, по морфологическим признакам, что позволяет

оптимизировать селекцию пейсмекероподобных клеток для получения биологических пейсмекеров.

Основываясь на свойствах ПД, не были обнаружены ЕОБР-позитивные клетки с электрофизиологическими свойствами клеток миокарда желудочков сердца.

Влияние факторов дифферепцировки эндотелина-1, нейрорегулина-1 и ретиноевой кислоты на ЕСГР-АРМ-позитивные линии в ЭСК

В ЭСК пейсмекероподобные клетки составляют лишь небольшую часть, и поэтому нами исследовано воздействие некоторых известных факторов дифференцировки ЭТ-1 [СоигсУе Ь.а е! а1., 1995], НР-1 [ЯепзсЫег Б., 1999] (НР-1) и РК [Оовтапс! М.К. е! а!., 2003] на концентрацию пейсмекероподобных и предсердноподобных клеток. Проведенные исследования позволили получить новые данные о функционировании и регуляции 1/НСЫ канала, а также разработать перспективные направления по созданию биологических пейсмекеров. До настоящего времени не сообщалось о факторах, способствующих дифференцировке ЭСК в клетки предсердий, в частности, в клетки центральной проводящей системы. Для тестирования эффектов эндотелина-1 на сублинии веретенообразных и тре(много)угольных клеток нами проведено культивирование ЕОРР-экспрессиругощих ЭТ от начала платирования в течении 14 дней в присутствии ЭТ-1 в концентрации 10"7 моль.

При планиметрическом анализе БОБР-позитивных клеток в присутствии ЭТ-1 наблюдались изменения экспрессирующего паттерна флюоресценции в виде увеличения количества малоинтенсивных флюоресцентных областей в эмбриональных тельцах при уменьшении общей площади флюоресценции по сравнению с контролем (р<0,05). ЭТ-1 существенно увеличил процент веретенообразных клеток (от 18,3±1,7% до 30,3±2,1%; р<0,001) и уменьшил процент тре(много)угольных клеток с 60,3±4,2% до 39,2±3,5%; р<0,001. Исходя из соотношения концентрация/ответ, концентрация эндотелина,

способная увеличить долю веретенообразных (пейсмекероподобных клеток) до 50%, составила 1*10"9 моль (рис. 13). Инкубация веретенообразных и тре(много)угольных клеток в присутствии ЭТ-1 не влияла на ПД и свойства 1С тока, а также морфологические параметры самих клеток.

Рис. 13. Дозозависимый эффект ЭТ-1 на дифференцировку пейсмекероподобных клеток. Б-образная (сигмоидальная) зависимость процента пейсмекерных клеток от концентрации ЭТ-1 (от 10"пдо Ю^моль). Половинное увеличения концентрации данных клеток было получено при концентрации ЭТ-1 1,1* 10"9 моль.

Затем ЭТ инкубировали с ЭТ-1 и антагонистами эндотелиновых рецепторов А (ВС>123,10"6 ммоль) и рецепторов В (ВС>788,10'6 ммоль). Подсчет доли клеток с различными морфологическими характеристиками показал, что оба вещества нивелировали эффекты ЭТ-1 (рис. 14). Таким образом, ЭТ-1 сдвигает дифференцировку ЕОРР-позитивных КМЦ, полученных из ЭСК, в направлении пейсмекерных клеток с эндотелин-рецепторной зависимостью без изменения их электрофизиологических свойств.

Влияние ЭТ-1 на развитие кардиальной проводящей ткани подтверждено иммуноцитохимическим методом и Вестерн Блот анализом коннексинов -маркерами проводящей системы в сердце. Экспозиция ЭТ вместе с ЭТ-1 значительно повысила интенсивность окрашивания анти-коннексина-40 -маркера ранней дифференцировки проводящей системы у мышей - в сравнении с контролем. Кроме того, инкубация эмбриональных телец с ЭТ-1 и

анти-коннексином-45 - маркером мышиного еинусново узла и проводящей системы - усилила концентрацию данного белка, в то время как экспрессия коннексина-43 - маркера рабочего миокарда - осталась без динамики. Эти изменения нивелировались культивированием ЭТ совместно с ЭТ-1 и антагонистами рецепторов эндотелина А В<3123 или В ВС>788. С другой стороны, инкубация с ЭТ-1 и ЭТ-1 с антагонистами эндотелиновых рецепторов А и В не изменяли уровень белков коннексина-43.

30

•3 20

10

*

I

Контроль ЭТ-1 ВС3123 В0788 НР-1 ЭТ-1+НР-1

Рис. 14. Эффект эндотелина-1 (ЭТ-1) и нейрорегулина-1 (НР-1) на дифференцировку АМР-ЕОРР-экспрессирующих эмбриональных стволовых клеток. Доля веретенообразных клеток значительно увеличилась при инкубации ЭТ с ЭТ-1 в сравнении с контролем. Этот эффект нивелировался экспозицией с антагонистами эндотелиновых рецепторов А ВСЩЗ и В В<2788. НР-1 не оказал достоверного эффекта на дифференцировку АЫР-НСЯ'Р-почитивпых клеток. Эффект экспозиции комбинации ЭТ-1 и НР-1 был сравним с эффектом ЭТ-1 в отдельности (* — р<0,05).

Для изучения эффектов нейрорегулина-1 (НР-1) на электрофизиологические свойства АИР-БОБР позитивных клеток он добавлялся в среду в течение 14 дней с момента платирования ЭТ. В отличие от ЭТ-1, НР-1 практически не оказывал влияния на дифференцировку АЫР-ЕСРР-позитивных клеток (концентрация веретенообразных клеток 15,1±1,6%; треугольных - 57,4±2,7%; р>0,05 в сравнении с контролем, рис. 14). Так же, как и при экспозиции с ЭТ-1, все веретенообразные клетки показывали

свойства ПК, в то время как треугольные - предсердных клеток. НР-1 не изменил концентрацию коннсксинов-40, -43 и -45 в ЭСК. Культивирование эмбриональных телец в среде, содержащей как ЭТ-1, так и НР-1, привело к схожим изменениям клеточной дифференцировки (веретенобразные клетки 28,6+3,6%; треугольные клетки 37,5%; р>0,05 в сравнении с эндотелином), а уровень данных белков при Вестерн Блот анализе был таким же, как и при культивировании клеток только с ЭТ-1.

Для тестирования время- и дозозависимости кардиальной дифференцировки от концентрации ретиноевой кислоты (РК) ЭТ культивировали при трех различных концентрациях данного вещества (10"5,10" 7, 10"9 моль) в течение 1-5 дней, что соответствует от 6+1 до 6+5 суткам «полного» возраста ЭСК и 6-10 (от 6+6 до 6+10 суток) после платирования. Все электрофизиологические исследования проводились на единичных клетках в «возрасте» от 14 до 16 суток.

При культивировании ЭТ-1 в среде с высокой концентрацией РК (10"5 моль) в первые 5 сутки после платирования флюоресценция клеток резко снижалась или отсутствовала вовсе. Большинство ЭТ не сокращалось и прекращало развитие. На 6-10 суток происходило снижение степени флюоресценции и сократительной активности клеток в течение 3-4 суток от начала экспозиции РК. РК в концентрациях 10"7 и 10"9 суток не изменяла спонтанной активности ЭТ, независимо от продолжительности инкубации. Однако при экспозиции с РК в данных двух концентрациях в течение 1-5 суток зеленая флюоресцирующая зона значительно увеличилась в сравнении с контролем. Двухмерная планиметрическая калькуляция показала, что АЫР-БОБР-позитивная зона при концентрации вещества 10"9 ммоль составила 25,1+2,5% от ЭТ (п=48, р<0,05 против контроля), при концентрации 10"7 ммоль - 22,2+2,5% (п=54, р<0,05 против контроля) против 16,1+1,4% в контрольной группе (п=61). Экспозиция с РК на 6-10 сутки развития при данных концентрациях не привела к достоверным изменениям экспрессии белка БОБР.

Независимо от времени инкубации РК, в ANP-EGFP-позитивных клетках не было отмечено достоверных изменений в плотности If тока.

У куриц кардиальная проводящая система развивается в тесной ассоциации с формирующимися коронарными артериями, при этом было показано, что ЭТ-1 способен индуцировать дифференцировку нитей Пуркинье [Gourdie R.G. et al., 1995; Schiaffino S., 1997], однако для млекопитающих до последнего времени в развитии кардиальной системы такой устойчивой связи не было найдено. Экспозиция ЭСК с ЭТ-1 привела к увеличению доли веретенообразных клеток с пейсмекероподобными электрофизиологическими характеристиками. Использование блокаторов рецепторов к ЭТ-1 нивелировало данный эффект. Хотя для НР-1 такой связи между дифференцировкой коронарных артерий и проводящей системы в желудочках найдено не было [Carraway K.L. et al., 1995], это вещество, экспрессированное в вентрикулярные эндокардиальные клетки, вызывало формирование эктопической проводящей системы [Renscher S., 2002]. В наших исследованиях нейрорегулин не оказывал влияния на предсердные и пейсмекероподобные клетки.

Известно, что ЧСС является независимым фактором риска смерти и сердечно-сосудистых событий [Шальнова С.А. и соавт., 2005; Gilman М. et al., 1993]. Ионный канал If/HCN является определяющим в автоматической импульсации синоатриального. узла и, соответственно, критически важным в регуляции сердечного ритма [DiFrancesco D., 2002]. Наши исследования позволили получить основополагающие сведения о данном канале, что представляется перспективным для развития стратерии модуляции ритма сердца и лучшего понимания механизмов пейсмекерной активности.

Существующие электрокардиостимуляторы (ЭКС) обладают определенными недостатками, такими как отсутствие адаптивности к физической нагрузке, зависимость от заряда батареек и т.п. [Freudenberger RS. et al., 2005]. Проведенные исследования и полученные результаты являются

необходимой предпосылкой создания биологических пейсмекеров на основе клеток, вырабатывающих If ток, которые будут способны замещать или работать совместно с ЭКС для более надежного и физиологического контроля ритма сердца. Одним из вариантов их создания является использование генетически модифицированных клеток, способных создавать ПД при их трансплантации в сердце [Barbutti А. et al., 2002; Cohen I. et al., 2005].

В МЭ была получена электрофизиологическая характеристика токов кардиоспецифических HCN каналов. Изоформа HCN1 показала самую быструю кинетику активации, далее следовала HCN2, и самой «медленной» изоформой оказалась HCN4. Наибольшим сходством с нативиым If током обладала изоформа HCN2, что позволяет считать её оптимальным кандидатом для создания данного варианта биологического пейсмекера. Кроме того, было установлено, что изоформа HCN4 ответственна за отрицательный хроиотропный эффект при повышении уровня внеклеточного калия.

В отличие от разрозненных и противоречивых литературных данных [Altomare С. et al., 2003; Decher N. et al.,2003], в нашем исследовании было показано модулирующее влияние ß-субъединицы калиевых каналов KCNE2 на свойства всех кардиоспецифичных каналов: увеличение плотности тока в изоформах HCN1, HCN2; ускорение кинетики активации всех изоформ; увеличение экспрессии канала на поверхности кардиомиоцитов в изоформах HCN2 и HCN4. ß-субъединица KCNE2 дифференцированно влияла на вероятность открытия, доступность, вероятность открытия/закрытия, но во всех изоформах увеличила амплитуду канала.

Известно, что изменения концентрации кальция, а также степень экспрессии генов HCN могут иметь значение при некоторых заболеваниях, например, при фибрилляции предсердий и сердечной недостаточности [Cerbai Е. et al., 1997; Hoppe UC., 1998]. Поэтому полученные нами доказательства тока ионов кальция через HCN2 и нативные крысиный и человеческий If каналы при гиперполяризующих потенциалах проливают свет на некоторые

патофизиологические процессы, связанные с tyHCN током и функционированием пейсмекерных клеток.

Одними из самых перспективных клеток-кандидатов для создания БП являются пейсмекероподобные эмбриональные стволовые клетки [Barbutti А. et al., 2002]. Нами получены ЭСК, экспрессирующие ANP-EGFP и обладающие веретенообразной формой и пейсмекероподобным фенотипом, селекция которых по морфологическим признакам позволит в будущем избежать дополнительного электрофизиологического тестирования при проведении трансплантации биологических пейсмекеров.

Таким образом, проведенные исследования позволили получить новые данные о функционировании и регуляции канала I/HCN, а также разработать перспективные направления по созданию биологических пейсмекеров.

ВЫВОДЫ

1. Изоформы кардиального тока If HCN1, HCN2 и HCN4 при трансгенной экспрессии, по данным микроэлектродных исследований, обладают различной кинетикой активации. Самая высокая скорость активации присуща изоформе HCN1, средняя - HCN2 и низкая - HCN4. Наибольшим сходством с нативным If обладает изоформа HCN2, что позволяет считать её оптимальным кандидатом для создания биологического пейсмекера путем трансфекции клеток-носителей.

2. Основным патогенетическим механизмом отрицательного хронотропного эффекта на сердце при гиперкалиемических состояниях является увеличение в 2-4 раза амплитуды токов всех изоформ HCN и смещение кривой активации тока в сторону отрицательных значений в изоформах HCN1 и HCN4.

3. Р-субъединица калиевых каналов MiRPl (Mink-related peptide) может быть использована для модификации электрофизиологических свойств биологического пейсмекеров. В исследованиях типа «вся клетка» MiRPl

увеличивает плотность тока в HCN2 и HCN4, кинетику активации всех HCN изоформ, экспрессию мембранных белков HCN2 и HCN4, а типа «один канал» дифференцированно действует на вероятность нахождения каналов в открытом/закрытом состояниях, доступность, вероятность открытия, однако увеличивает амплитуду открытий канала всех изоформ.

4. Одним из патогенетических механизмов предсердного аритмогенеза может быть проведение тока ионов кальция в экспериментальных моделях через канал HCN2 при трансгенной экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков, а также через канал If нативных крысиных и человеческих кардиомноцитов при физиологической экстраклеточной концентрации кальция с низкими амплитудой, вероятностью открытия и проводимостью, подтвержденное активацией канала с циклическим аденозинмонофосфатом и ингибированием с блокатором канала If ивабрадипом.

5. Из эмбриональных стволовых клеток получены клетки, экспрессирующие зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced green fluorescent protein) под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide) по морфологическим признакам веретенообразной формы, обладающие электрофизиологическими характеристиками пейсмекерных клеток, которые MOiyr быть использованы при создании биологических пейсмекеров.

6. Инкубация ANP-EGFP-позитивных клеток с фактором дифференцировки эндотелином-1 направляет их дифференцировку в сторону пейсмекероподобного фенотипа и увеличивает их дозозависимое абсолютное и относительное количество. Нейрорегулин-1 не оказывает действие на дифференцировку предсердных кардиомноцитов. Ретиноевая кислота способствует дифференцировке эмбриональных стволовых клеток в сторону фенотипа предсердных клеток.

7. Разработаны научные подходы к созданию биологических пейсмекеров на основе изоформы HCN2, обладающей электрофизиологическими свойствами нативного канала If, а также ANP-EGFP-позитивных пейсмекероподобных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток, для их использования при лечении некоторых сердечнососудистых заболеваний, в частности, синдрома слабости синусового узла.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Изоформа HCN2, как наиболее близкая по своим характеристикам к нативному току If, является оптимальной для конструирования биологических пейсмекеров.

2. Для изучения некоторых патологических состояний, таких как электролитный дисбаланс, может быть использовано микроэлектродное исследование трансгенно трансфекцированных изоформ HCN в овариальных клетках китайских хомячков.

3. При создании биологических пейсмекеров необходимо учитывать возможности дифференцированного действия р-субъединицы калиевых каналов MiRPl на электрофизиологические свойства различных изоформ HCN.

4. Для создания биологических пейсмекеров при поражении синоатриального узла сердца с помощью морфологических критериев возможно идентифицировать пейсмекероподобные клетки в эмбриональных стволовых клетках среди клеток, экспрессирующих EGFP под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора. Возможно увеличение пула данных клеток in vitro при их инкубации с фактором дифференцировки эндотелином-1 в концентрации от 10"5 до 10'7 моль. Для предупреждения тератогенного действия следует использовать ретиноевую кислоту в концентрации от 10~7 до 10"9 моль.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Загидуллин, Н.Ш. Кардиальный пейсмекерный канал If и способы его модуляции / Н.Ш. Загидуллин // Терапевтический архив. - 2006. - № 4. - С. 2-9.

2. Загидуллин, Н.Ш. Перспективы создания биологических пейсмскеров / Н.Ш. Загидуллин, Ш.З. Загидуллин // Вестник Российской военно-медицинской академии. -

2007. -№11. -С. 23-34.

3. Снижение частоты сердечных сокращений при стабильной стенокардии напряжения: Р-адреноблокаторы и ¡^ингибиторы / Н.Ш. Загидуллин, G. Michels, UC. Норре, Ш.З. Загидуллин // Клиническая фармакология и терапия. - 2008. - № 3, Т. 17. - С. 1-6.

4. Идентификация пейсмекерных клеток из эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующих предсердный натрийуретический пептид / Н.Ш. Загидуллин, UC. Норре, N. Gassanov, F. Ег//Кардиология. -2008. 10. - С. 38-44.

5. Белевитин, А.Б. Перспективы создания биологических пейсмекеров / А.Б. Белевитин, Н.Ш. Загидуллин, В.Н. Цыган // Вестник Российской военно-медицинской академии. -

2008.-№4 (24).-С. 29-34.

6. Загидуллин Н.Ш! Электрофизиологическая характеристика кардиоспецифических изоформ If канала / Н.Ш. Загидуллин, Ш.З. Загидуллин // Казанский медицинский журнал. -2009. - № 2. - С. 23-30.

7. Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype / N. Gassanov, F. Er, N. Zagidullin, UC. Hoppe // FASEB J. - 2004. -№18,T. 14-C. 1710-1712.

8. Retinoid acid-induced effects on atrial and pacemaker cell differentiation and expression of cardiac ion channels / N. Gassanov, F. Er, N.S. Zagidullin, UC. Hoppe // Differentiation. -2008. -№ 9, Vol. 86. -P. 971-980.

9. Direct evidence for calcium-conductance of HCN channels and human native If at physiological calcium concentrations / G. Michels, MC. Brandt, N. Zagidullin [et al.] // Cardiovascular Research. 2008. -№ 1, Vol. 78. -P. 466-475.

10. Загидуллин, Н.Ш. Эндотелии модулирует дифференциацию эмбриональных стволовых клеток мышей, экспрессирующих натрийуретический пептид в направлении пейсмейкерного фенотипа / Н.Ш. Загидуллин // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых-кардиологов. - Москва, 2005. - С. 36.

11. Загидуллин, Н.Ш. Перспективы использования If блокаторов в лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы / Н.Ш. Загидуллин // Consilium Medicum. - 2007. - № 9. -С. 23-26.

12. ß-субъединица KCNE2 разшчается в модуляции изоформ HCN канала / Н.Ш. Загидуллин, М. Брандт, Л. Мотлох [и др.] H Материалы национального конгресса кардиологов Российской Федерации (Москва). - Кардиоваскулярная терапия и профилактика - 2007. - X» 7. - С. 34.

13. Загидуллин, Н.Ш. Возможности конструкции биологических водителей ритма сердца при поражении синусового узла / II.Ш. Загидуллин, Ш.З. Загидуллин // Медицинский вестник Башкортостана. - 2008. -№ 1. - С. 34-39.

14. Прямые доказательства проведения кальция через HCN канал и человеческий нативный 1{ канал при физиологических концентрациях ионов кальция / Н.Ш. Загидуллин, Ш.З. Загидуллин, G. Michels, UC. Hoppe. // Материалы национального конгресса кардиологов Российской Федерации (Москва). - Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. - № 4, Прил. 2. — С. 111.

15. Частота сердечных сокращешш как фактор риска при остром коронарном синдроме / Н.Ш. Загидуллин, Е.О. Травникова, Ш.З. Загидуллин [и др.] // Материалы Всероссийской конференции кардиоваскулярная терапия и профилактика и реабилитация (Москва). - Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. - № 4, Прил. 2.-С. 6.

16. Электрофизиологическая характеристика кардиоспецифических изоформ If канала / Н.Ш. Загидуллин, Ш.З. Загидуллин, G. Michels, UC. Hoppe // Матер. Российского нац. конгресса кардиологов Российской Федерации (Москва). - Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008 .-№ 7, Т. 6. - С. 141-142.

17. Значение частоты сердечных сокращений как фактор риска при остром коропарном синдроме / Е.О. Травникова, Н.Ш. Загидуллин, Ш.З. Загидуллин, Р.Х. Зулкарнеев // Материалы XVII конференции студентов и молодых ученых. - Уфа, 2008; - С. 34.

18. Электрофизиологическая характеристика кардиоспецифических изоформ If канала. Матер, национального конгресса кардиологов Российской Федерации. Москва. / Н.Д1. Загидуллин, Ш.З. Загидуллин, G. Michels, UC. Hoppe // Материалы Российского национлыюго конгресса кардиологов Российской Федерации (Москва). -Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008.-№ 7, Т. 6. - С. 142.

19. Прямые доказательства проведения кальция через HCN канал и человеческий нативный If канал при физиологических концентрациях ионов кальция / * Н.Ш. Загидуллин, ЩД Загидуллин, G: Michels, UC. Hoppe // Материалы национального конгресса кардиологов Российской Федерации (Москва). — Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. - № 7, Т. 6. - С. 142.

20. Endothelin induziert Differenzierung von ANP-EGPP experimierenden embryonalen Stammzellen zum Schriflmacherphanotyp / N. Gassanov, F. Er, N.Sh. Zagidullin, UC. Hoppe // Abstract of Congress of German Society Cardiology (Manheim). - Zeitschrift Kardiolidie. -2005.-№4.-P. 73-74.

21. Retinoid acid-induced effects on atrial and pacemaker cell differentiation and expression of cardiac ion channels / N. Gassanov, F. Er, N.Sh. Zagidullin [et al.] // Abstract of European Congress of Cardiologists (Stockholm).-Clin. Res. Cardiol. - 2007. - Suppl. l.-P. 23.

22. Direct evidence for calcium-conductance of HCN channels and human native If at physiological calcium concentrations / G. Michels, M.C. Brandt, N.S. Zagidullin [et al.]. II Abstract of European Congress of Cardiologists (Stockholm). - Clin. Res. Cardiol. - 2007. -Suppl. l.-P. 47.

список сокращений:

БП - биологические пейсмекеры

ДПДдо - длительность 90% потенциала действия

КМЦ - кардкомиоциты

МЭ - микроэлекгродиые эксперименты

НР-1 -нейрорегулнп-1

ОККХ - овариальные клетки китайских хомячков

ПД - потенциал действия

ПК - пейсмекерные клетки

ПП - пот енциал покоя

PK - ретиноевая кислота

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

ЭТ — эмбриональное тельце

ЭТ-1 - эндотелии-1

ANP - atrial natriuretic peptide (предсердный натрийуретический пептид)

EGFP - enhanced green fluorescent protein (зеленый флюоресцирующий белок)

HCN - hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel (канал, активирующийся при

гиперноляризации и модулируемый циклическим аденозинмонофосфатом)

MinK - MinK-related peptide (белок, относящийся к семейству MinK)

ЗАЩДУЛЛИН Науфаль Шамилевич

Характеристика и регуляция кардиального пейсмекерного канала 1^НС1Ч, разработка научных подходов к созданию биологических пейсмекеров

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.06 - кардиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Актуальность проблемы. Широко известно, что частота сердечных сокращений (ЧСС) является важным фактором риска у больных с ишемической болезнью сердца и хронической сердечной недостаточностью [Шальнова С.А. и соавт., 2005; Gilman М. et al, 1993]. В связи с тем, что кардиальная проводящая система генерирует и синхронизирует сокращения сердца, её дисфункция может приводить к аритмиям и нарушениям проводимости различных степеней тяжести, вплоть до внезапной смерти. Ионный канал (If) активирующийся при гиперполяризации, регулируя ритм сердца, является определяющим для спонтанной диастолической деполяризации синоатриального узла (СА). Четыре изоформы данного канала HCN 1-4 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel) различаются не только своим распределением в тканях сердца и нервной системы, но и кинетикой, амплитудой и другими электрофизиологическими свойствами [Moosmang S. et al., 2001] и являются переносчиком ионов не только К+ и Na+ но и Са2+ [Yu X. et al., 2004]. В связи с тем, что кальций является важным внутриклеточным мессенджером, важной задачей представляется изучение электрофизиологических свойств тока ионов кальция через канал If. В последние годы интенсивно разрабатываются варианты трансплантации биологических пейсмекеров (БП), созданы селективные блокаторы канала If, что требует глубокого понимания особенностей механизмов его фунционирования [Kehat I. et al., 2001; Barbutti A. et al., 2007]. Идентификация изоформы HCN, наиболее близкой по своим свойствам к нативному каналу If, является необходимой предпосылкой путем трансфекции клеток-кандидатов для создания искусственных биологических пейсмекеров, которые будут использованы в терапевтических целях при поражении СА узла.

Несмотря на то, что изменение внеклеточного раствора в случае нативных кардиомиоцитов (КМЦ), в частности, повышение концентрации калия, меняет кинетику тока и проницаемость ионов через канал If [Leitch S., 1995; Azene E. et al., 1999], подобные исследования в трансфицированных клетках, экспрессирующих некоторые изоформы HCN, проведены не были.

Р-субъединицы всех калиевых каналов обладают рядом важных свойств, модулирующих изменение проводимости, селективности и других параметров. Однако, по данным различных авторов, неоднозначным является воздействие Р-субъединицы канала HCN MiRPl (MinK-related protein, белок, относящийся к семейству MinK), кодируемый геном KCNE2, на его электрофизиологические свойства: от снижения кинетики активации канала до увеличения плотности тока [Altomare С. et al., 2003; Qu J. et al., 2004]. Точное знание модулирующих свойств Р-субъединицы канала HCN позволит создать биологические пейсмекеры с заданными электрофизиологическими характеристиками, которые могут быть использованы для лечения больных с различными поражениями синоаурикулярного узла.

Другой способ получения биологических пейсмекеров заключается в использовании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые дифференцируются в различные клетки организма и, в том числе, в кардиомиоциты (КМЦ), и представляют собой удобную модель для исследования механизмов дифференцировки пейсмекерных клеток [Gassanov N. et al., 2004]. В настоящее время факторы дифференцировки КМЦ исследованы не достаточно.

Селекция КМЦ в направлении пейсмекерных клеток (ПК), в том числе с использованием факторов дифференцировки, таких как сосудистый цитокин эндотелии-1, нейрорегулин-1 и ретиноевая кислота, является перспективным направлением развития клеточных терапевтических стратегий для регенерации и/или репарации кардиальной проводящей системы и создания биологических пейсмекеров.

Цель исследования. Изучение механизмов функционирования и регуляции If/HCN канала и селекция пейсмекероподобных клеток из эмбриональных стволовых клеток.

Задачи исследования:

1. На основании микроэлектродных экспериментов представить характеристику кардиоспецифических субъединиц каналов HCN1 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel), HCN2 и HCN4. Определить HCN изоформу, наиболее близкую по электрофизиологическим параметрам нативному If току, в качестве кандидата для создания биологических пейсмекеров при поражении синоатриального узла.

2. Определить патогенез нарушений электрофизиологических свойств изоформ HCN1, 2 и 4 при повышении уровне калия.

3. В микроэлектродных и молекулярно-биологических исследованиях изучить влияние Р-субъединицы калиевых каналов MiRPl (MinK-related peptide) на кардиоспецифические изоформы канала HCN1, 2 и 4 в моделях трансгенной экспрессии изоформ в овариальных клетках китайских хомячков.

4. Установить патогенетические механизмы предсердного аритмогенеза путем исследования проведение ионов кальция через канал изоформы HCN2 при его трансгенной трансфекции в овариальных клетках китайских хомячков и в человеческих предсердных и неонатальных крысиных кардиомиоцитах.

5. На модели эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced green fluorescent protein) под транскрипционным контролем атриумспецифичного промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide), изучить возможности выделения по морфологическим критериям EGFP-ANP-позитивной сублинии клеток с фенотипом пейсмекерных клеток.

6. Определить влияние факторов дифференцировки - эндотелина-1, нейрорегулина-1 и ретиноевой кислоты - на клетки EGFP-ANP-позитивной сублиний эмбриональных стволовых клеток.

Научная новизна. В ходе решения поставленных задач получены следующие новые научные результаты:

Установлены электрофизиологические характеристики кардиоспецифичных изоформ HCN при их экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков. Получены прямые доказательства проводимости ионов Са через канал HCN2, что может быть важным в определении патогенетических механизмов предсердных аритмий и возможностей их лечения. Показана модуляция электр окардио физиологических свойств кардиоспецифичных изоформ HCN1, HCN2 и HCN4 р-субъединицей MiRPl.

Для создания биологического пейсмекера выделены трансгенные линии эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующие EGFP под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора, в том числе линии клеток со свойствами пейсмекерных клеток. Оценен эффект факторов дифференцировки эндотелина-1, нейрорегулина-1 и ретиноевой кислоты на линии эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующие EGFP под контролем кардиоспецифичного промотора: эндотелии-1 увеличивает концентрацию пейсмекероподобных клеток, нейрорегулин-1 не влияет на

7 О данный показатель, а ретиноевая кислота в концентрациях 10" — 10" обладает эмбриотоксическим действием, в концентрации менее 10"9 — увеличивает концентрацию клеток, схожих с кардиомиоцитами предсердий.

Научно-практическая значимость:

1) В микроэлектродных экспериментах установлены электрофизиологические свойства кардиоспецифичных изоформ HCN1, HCN2 и HCN4. Наиболее близкой по электрофизиологическим свойствам к нативному каналу If оказалась изоформа HCN2, что позволяет считать её кандидатом для создания биологических пейсмекеров.

2) Показано, что в растворе с высоким содержанием калия в изоформе HCN1 и, в первую очередь, в HCN4 происходит замедление активации тока через канал, что проявляется снижением ЧСС. Данная модель исследования и полученные результаты могут быть использованы при изучении влияния гиперкалиемии плазмы крови на состояние сердечно-сосудистой системы.

3) В микроэлектродных экспериментах показано модулирующее влияние р-субъединицы калиевых каналов MinK-related peptide (MiRP)l на электрофизиологические свойства и экспрессию HCN канала. При создании биологического пейсмекера коэкспрессия Р-субъединицы MiRPl способна модулировать свойства канала в зависимости от выбранной изоформы HCN.

4) Присутствие кальциевого тока в канале I/HCN, как важного клеточного мессенджера, может иметь значение для понимания механизмов развития некоторых сердечно-сосудистых заболеваний и состояний, а также в исследованиях аритмогенных свойств канала If.

5) Среди эмбриональных стволовых клеток, трансфицированных геном EGFP под контролем кардиоспецифичного промотора, по морфологическим критериям возможно выделение линии клеток, обладающих пейсмекероподобным фенотипом.

6) В связи с тем, что эндотелии-1 способствует дифференцировке кардиальных эмбриональных стволовых клеток в сторону пейсмекероподобного фенотипа, данный фактор роста может быть использован для увеличения количества пейсмекероподобных клеток в данной клеточной линии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Кардиоспецифичные изоформы HCN1, HCN2 и HCN4 при экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков обладают различной кинетикой активации.

2. В растворе с высоким содержанием калия в несколько раз возрастает амплитуда токов у всех изоформ; изоформы HCN1 и HCN4 замедляют активацию тока ионов через канал, что может быть причиной отрицательного хронотропного действия при гиперкалиемии.

3. Р-субъединица калиевых каналов MiRPl модифицирует функции канала HCN: увеличивает плотность тока в HCN2 и HCN4, кинетику активации всех изоформ HCN, экспрессию мембранных белков HCN2 и HCN4 и дифференцировано действует на вероятность нахождения канала в открытом/закрытом состояниях, доступность, вероятность открытия и, в то же время, увеличивает амплитуду открытия канала для всех изоформ.

4. Установлено проведение тока ионов Са через изоформу HCN2 и нативные крысиный и человеческий токи канала If.

5. В эмбриональных стволовых клетках возможно выделение клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced fluorecsent protein) под транскрипционным контролем атриумспецифичного промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide). В ANP-EGFP-позитивной линии клеток клетки веретенообразной формы обладали электрофизиологическими характеристиками пейсмекерных клеток.

6. Эндотелии-1 направляет дифференцировку ANP-EGFP-позитивных клеток в сторону пейсмекероподобного фенотипа и увеличивает их количество в популяции. Нейрорегулин-1 не обладает таким действием. Ретиноевая кислота в низкой концентрации способствует дифференцировке ANP-EGFP-позитивных клеток в сторону фенотипа предсердных клеток, а в более высоких - обладает тератогенным действием.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований были представлены на Всероссийском конгрессе молодых кардиологов (Москва, 2004), конгрессе Немецкого общества кардиологов (Манхайм, 2005), конгрессе Европейского общества кардиологов (Вена, 2007), Российских национальных конгрессах кардиологов (Москва, 2007, 2008), Конгрессе по кардиоваскулярной терапии и профилактике (Москва, 2008), обсуждены на заседании проблемной комиссии по кардиологии Башкирского государственного медицинского университета и межкафедральном совещании Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 9 - в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК, и из них 3 - в иностранных журналах.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 244 страницах компьютерного текста, содержит 105 рисунков, 30 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 270 наименований, включающего 5 отечественных и 265 зарубежных источников.

221 ВЫВОДЫ

1. Изоформы кардиального тока If HCN1, HCN2 и HCN4 при трансгенной экспрессии, по данным микроэлектродных исследований, обладают различной кинетикой активации. Самая высокая скорость активации присуща изоформе HCN1, средняя - HCN2 и низкая - HCN4. Наибольшим сходством с нативным If обладает изоформа HCN2, что позволяет считать её оптимальным кандидатом для создания биологического пейсмекера путем трансфекции клеток-носителей.

2. Основным патогенетическим механизмом отрицательного хронотропного эффекта на сердце при гиперкалиемических состояниях является увеличение в 2-4 раза амплитуды токов всех изоформ HCN и смещение кривой активации тока в сторону отрицательных значений в изоформах HCN1 и HCN4.

3. Р-субъединица калиевых каналов MiRPl (Mink-related peptide) может быть использована для модификации электрофизиологических свойств биологического пейсмекеров. В исследованиях типа «вся клетка» MiRPl увеличивает плотность тока в HCN2 и HCN4, кинетику активации всех HCN изоформ, экспрессию мембранных белков HCN2 и HCN4, а типа «один канал» дифференцированно действует на вероятность нахождения каналов в открытом/закрытом состояниях, доступность, вероятность открытия, и в то же время увеличивает амплитуду открытий канала всех изоформ.

4. Одним из патогенетических механизмов предсердного аритмогенеза может быть проведение тока ионов кальция в экспериментальных моделях через канал HCN2 при трансгенной экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков, а также через канал If нативных крысиных и человеческих кардиомиоцитов при физиологической экстраклеточной концентрации кальция с низкими амплитудой, вероятностью открытия и проводимостью, подтвержденное активацией канала с циклическим аденозинмонофосфатом и ингибированием с блокатором канала If ивабрадином.

5. Из эмбриональных стволовых клеток получены клетки, экспрессирующие зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced green fluorescent protein) под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide) по морфологическим признакам веретенообразной формы, обладающие электрофизиологическими характеристиками пейсмекерных клеток, которые могут быть использованы при создании биологических пейсмекеров.

6. Инкубация ANP-EGFP-позитивных клеток с фактором дифференцировки эндотелином-1 направляет их дифференцировку в сторону пейсмекероподобного фенотипа и увеличивает с дозозависимым эффектом их абсолютное и относительное количество. Нейрорегулин-1 не оказывает действие на дифференцировку предсердных кардиомиоцитов. Ретиноевая кислота способствует дифференцировке эмбриональных стволовых клеток в сторону фенотипа предсердных клеток.

7. Разработаны научные подходы к созданию биологических пейсмекеров на основе изоформы HCN2, обладающей электрофизиологическими свойствами нативного канала If, а также ANP-EGFP-позитивных пейсмекероподобных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток, для их использования при лечении некоторых сердечно-сосудистых заболеваний, в частности, синдрома слабости синусового узла.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Изоформа HCN2, как наиболее близкая по своим характеристикам к нативному току If, является оптимальной для конструирования биологических пейсмекеров.

2. Для изучения некоторых патологических состояний, таких как электролитный дисбаланс, может быть использовано микроэлектродное исследование трансгенно трансфекцированных изоформ HCN в овариальных клетках китайских хомячков.

3. При создании биологических пейсмекеров необходимо учитывать возможности дифференцированного действия Р-субъединицы калиевых каналов MiRPl на электрофизиологические свойства различных изоформ HCN.

4. Для создания биологических пейсмекеров при поражении синоатриального узла сердца с помощью морфологических критериев возможно идентифицировать пейсмекероподобные клетки в эмбриональных стволовых клетках среди клеток, экспрессирующих EGFP под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора. Возможно увеличение пула данных клеток in vitro при их инкубации с фактором

5 7 дифференцировки эндотелином-1 в концентрации 10" до 10" моль. Для предупреждения тератогенного действия следует использовать ретиноевую

7 9 кислоту в концентрации от 10" до 10* моль.