Автореферат и диссертация по медицине (14.01.25) на тему:Характеристика биомаркеров воспаления в индуцированной мокроте больных хронической обструктивной болезнью легких на фоне базисной терапии

ФЕДОСЕНКО Сергей Вячеславович

JL_

ХАРАКТЕРИСТИКА^ИОМАРКЕРОВ ВОСПАЛЕНИЯ В ИНДУЦИРОВАННОЙ МОКРОТЕ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ НА ФОНЕ БАЗИСНОЙ

ТЕРАПИИ

14.01.25 — пульмонология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 ИЮН 2011

Томск-2011

4848364

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Черногорюк Георгий Эдинович

Зарипова Татьяна Николаевна Бородулина Елена Валентиновна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН.

Защита состоится «Уч> г. в часов на заседании

диссертационного совета Д208.096.02 при ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России по адресу: 634050, г. Томск, Московский тр., 2 О

о ■

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан « » \ 1 г.

9

Ученый секретарь диссертационного совета Тюкалова Л.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время представлено большое количество исследований относительно эффективности длительно действующих бронхолитических препаратов, включая тиотропия бромид, при ХОБЛ. Однако их результаты в большей степени отражают клиническую эффективность выбранного режима терапии.

Учитывая важность роли воспалительного компонента в патогенезе ХОБЛ, крайне актуальным становится поиск эффективных препаратов, обладающих способностью контролировать и подавлять воспаление, носящее характер системного при данной болезни.

В ряде исследований последних лет изучаются возможности снижения выраженности воспаления путем воздействия через мускариновую систему. Так, например, о вовлеченности мускариновых рецепторов в воспалительный ответ при ХОБЛ свидетельствуют данные исследования М. Profita и соавторов, в котором установлено существенное усиление экспрессии Мр и М3-холинорецепторов и; снижение экспресии М2-холинорецепторов у больных ХОБЛ по сравнению с курильщиками и здоровыми участниками исследования (р<0,05). Также было показано, что ингибирование М,- и М3-рецепторов предотвращает ацетилхолининдуцированное высвобождение

провоспалительного лейкотриена В4, а также может уменьшать инфильтрацию и активность нейтрофилов при ХОБЛ. Установлено, что М-холинолитики, блокируя мускариновые рецепторы в бронхах, препятствуют продукции воспалительных цитокинов эпителиоцитами и макрофагами, оказывая стабилизирующее действие на дыхательные пути [Визель А.А., 2009].

Предположение о наличии у М-холиноблокирующего препарата длительного действия тиотропия бромида противовоспалительных свойств возникло в связи с полученными результатами клинических плацебо контролируемых- исследований, продемонстрировавших способность долгосрочной терапии тиотропиумом увеличивать продолжительность периода до первого обострения, снижать выраженность симптомов обострений и частоты госпитализаций по поводу обострений ХОБЛ [Dusser D., 2006], что в последствии было подтверждено и результатами значимого для ХОБЛ исследования UPLIFT [Tashkin D.P., 2006].

В одном из экспериментальных исследований (В. Disse, 2001) была продемонстрирована способность тиотропиума подавлять высвобождение эйкозаноидов эпителиальными клетками, а также снижать выделение факторов хемотаксиса нейтрофилов и эозинофилов альвеолярными макрофагами [Disse В., 2001; Визель А.А., 2009]. Также было выявлено зависящее о дозы и длительности использования угнетающее воздействие тиотропия бромида на ацетилхолининдуцированную хемотаксическую активность воспалительных клеток с высокой экспрессией МЗ-холинорецепторов в экспериментальных работах F. Buhling и соавторов [Buhling F., 2007].

В то же время нет официальных данных клинических исследований о влиянии тиотропия бромида на факторы местного воспаления, развивающегося при ХОБЛ, затрагивающего дисбаланс в оксидант/антиоксидантной,

протеназ/антипротеиназной системах, что является одной из основ патогенеза данного заболевания.

Отсутствует информация о влиянии тиотропия на нейтрофильное звено воспаления, активность миелопероксидазы и катионного протеина нейтрофилов мокроты.

Недостаточно фактов о патогенетической обоснованности добавления тиотропиума в схему лечения пациентам, ранее получавшим комбинацию ИГКС и бета-2-агонстов.

В этой связи актуально изучение динамики морфофункциональных характеристик нейтрофилов и макрофагов в индуцированной мокроте у больных ХОБЛ в зависимости от выбранного режима фармакотерапии, поскольку нарушение функциональной активности эффекторных клеток лежит в основе формирования и поддержания неконтролируемого воспаления в бронхолегочном регионе, определяя тяжесть течения и прогноз болезни.

Цель исследования: Установить характеристику эффекторных клеток воспаления в индуцированной мокроте и динамику клинико-функционапьных показателей у больных ХОБЛ стабильного течения для обоснования эффективности базисной терапии.

Задачи исследования:

1. Оценить динамику клинико-функциональных характеристик течения ХОБЛ (респираторные симптомы, потребность в бета-2-агонистах короткого действия, показатели функции внешнего дыхания, толерантность к физической нагрузке, качество жизни, выраженность тревоги и депрессии) на фоне разных режимов базисной терапии (монотерапия тиотропия бромидом или его сочетание с ингаляциями комбинированного препарата, содержащего глюкокортикостероид и бета-2-агонист длительного действия).

2. Исследовать ассоциацию биомаркеров воспаления в индуцированной мокроте больных ХОБЛ (содержание нейтрофилов и макрофагов, цитоморфометрические характеристики нейтрофилов и макрофагов, активность миелопероксидазы и катионных протеинов нейтрофилов, активность протеиназ/антипротеиназной, оксидант/антиоксидантной систем) с клинико-функциональными показателями течения болезни (респираторные симптомы, потребность в бета-2-агонистах короткого действия, показатели функции внешнего дыхания, толерантность к физической нагрузке, качество жизни, выраженность тревоги и депрессии).

3. Изучить динамику показателей воспаления в индуцированной мокроте больных ХОБЛ (содержание нейтрофилов и макрофагов, цитоморфометрические характеристики нейтрофилов и макрофагов, активность миелопероксидазы и катионных протеинов нейтрофилов, активность протеиназ/антипротеиназной, оксидант/антиоксидантной систем) на фоне разных режимов базисной терапии (монотерапия тиотропия бромидом или его сочетание с ингаляциями комбинированного препарата, содержащего глюкокортикостероид и бета-2-агонист длительного действия).

4. Провести сравнительный анализ динамики клинико-функциональных характеристик и биомаркеров воспаления индуцированной мокроты у больных

ХОБЛ, применявших предшествующую терапию комбинацией флутиказона пропионат/сапметерол, в сравнении с пациентами, не получавшими базисную терапию, на фоне включения в схему лечения тиотропия бромида.

5. На основании систематизации полученных данных о динамике клинико-функциональных характеристик и биомаркеров воспаления индуцированной мокроты у больных ХОБЛ на фоне базисной терапии, включающей применение тиотропия бромида, сделать предложение по оптимизации фармакотерапии ХОБЛ в стабильный период с позиции клинической и патогенетической эффективности лечения.

Научная новизна. Впервые установлено, что биомаркеры воспаления в индуцированной мокроте больных ХОБЛ (содержание нейтрофилов и макрофагов, цитоморфометрические характеристики нейтрофилов и макрофагов, активность миелопероксидазы и катионных протеинов нейтрофилов, активность малонового диальдегида и каталазы), отражающие активность воспаления в бронхах, коррелируют с клинико-функциональными характеристиками болезни (выраженность респираторных симптомов, потребность в бета-2-агонистах короткого действия, параметры функции внешнего дыхания, толерантность к физической нагрузке, показатели качества жизни, выраженность тревоги и депрессии.

Впервые показано, что назначение тиотропия бромида в качестве регулярной поддерживающей терапии пациентам с ХОБЛ сопровождается положительной динамикой морфофункциональных характеристик ключевой для патогенеза ХОБЛ эффекторной клетки - нейтрофила бронхов. Это подтверждается увеличением размера нейтрофилов бронхолегочном регионе, ростом объема цитоплазмы в нем, уменьшением ядерно-цитоплазматического отношения, что характерно для стабильных, структурно и функционально зрелых нейтрофилов в отсутствии активного воспаления.

В данной работе впервые показана динамика показателей внутриклеточной цитоферментной активности нейтрофилов индуцированной мокроты у больных ХОБЛ на фоне применения тиотропия бромида. Выявлено, что лечение тиотропиумом сопровождается повышением содержания миелопероксидазы и катионных протеинов в нейтрофилах. Это обусловлено уменьшением активности экзоцитоза цитотоксических факторов агрессии эффекторной клеткой во внеклеточную среду под действием проводимой терапии.

Впервые продемонстрировано, что применение тиотропия бромида в качестве регулярной поддерживающей терапии при ХОБЛ сопровождается положительной динамикой цитоморфологических характеристик макрофагов индуцированной мокроты больных. Через 3 месяца лечения тиотропиумом клетки характеризуются более крупным размером, объем цитоплазмы в них преобладает над размером ядра, что отражается в снижении ядерно-цитоплазматического отношения и определяет улучшение функциональной активности макрофагов.

Впервые показано: положительные изменения морфофункциональных характеристик макрофагов и нейтрофилов индуцированной мокроты у пациентов с ХОБЛ, отражающие стабилизацию воспаления в бронхолегочном

регионе, наблюдаются при добавлении тиотропия бромида в схему регулярной поддерживающей терапии независимо от режима предшествующего лечения.

Впервые выявлено, что у больных тяжелой и крайне тяжелой ХОБЛ применение тиотропиума в сочетании с комбинацией ИГКС/бета-2-агонист длительного действия сопровождается существенно более выраженной положительной динамикой, связанной с увеличением размера нейтрофилов индуцированной мокроты и уменьшением их ядерно-цитоплазматического индекса, по сравнению с монотерапией тиотропия бромидом. Это подчеркивает патогенетическую обоснованность комплексного подхода к лечению пациентов с ХОБЛ тяжелого и крайне тяжелого течения.

Практическая значимость. В результате исследования показано, что тиотропия бромид, являясь высокоэффективным препаратом для длительной поддерживающей терапии больных клинически значимой ХОБЛ, целесообразен дня назначения как в режиме стартовой монотерапии, так и в качестве дополнения к ранее начатому лечению комбинацией ФП/САЛ. Результаты работы продемонстрировали положительное влияние регулярной терапии ТБ на характеристики клеточного воспаления в бронхиальном регионе при ХОБЛ, подчеркивая патогенетическую обоснованность применения тиотропиума. По результатам данного исследования показана практическая необходимость и целесообразность длительной терапии ТБ больных ХОБЛ на любой клинически значимой стадии независимо от предшествующего режима лечения.

Результаты настоящей работы могут быть рекомендованы для включения в учебные программы дипломной и последипломной подготовки врачей-терапевтов и пульмонологов. Данные результаты могут стать основой оптимизации методических рекомендаций терапии ХОБЛ в условиях первичного звена здравоохранения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Назначение тиотропия бромида в режиме монотерапии или в сочетании с комбинацией флутиказона пропионат/салметерол, обеспечивает положительную динамику клинико-функциональных характеристик болезни, что способствует повышению переносимости пациентом физической нагрузки, улучшению качества жизни и снижению выраженности соматогенных тревожно-депрессивных расстройств.

2. Включение тиотропия бромида в схему базисной терапии хронической обструктивной болезни легких позволяет получить дополнительные преимущества, связанные с положительной динамикой цитоморфологических характеристик нейтрофилов и макрофагов в индуцированной мокроте, а также с увеличением содержания миелопероксидазы и катионного протеина в цитоплазме нейтрофилов, что отражает уменьшение активности воспаления в бронхиальном дереве.

Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на XX Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2010), XIX Европейском ежегодном респираторном конгрессе (Вена, 2009), XX Европейском ежегодном респираторном конгрессе (Барселона, 2010), 9-й

Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке (Москва, 2008), 10-й Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке (Москва, 2009), на проблемной комиссии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава по пульмонологии, на заседаниях кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины. За результаты исследования, представленные в сборнике тезисов и в виде постерного доклада на Европейском ежегодном респираторном конгрессе, получен грант Европейского респираторного общества и фармацевтической компании Boehringer Ingelheim "The ERS COPD Research Travel Grant" в 2009 году.

Внедрение полученных результатов. Полученные результаты используются в работе отделения пульмонологии ОГУЗ Томская областная клиническая больница. Новые научные данные, полученные при выполнении исследования, используются в учебном процессе на кафедре госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, а также на кафедре внутренних болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 статьи в журналах из «Перечня ...» ВАК РФ. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ ранней диагностики хронической обструктивной болезни легких» от 16 февраля 2011г. (заявка №2010122238/15(031550) от 31 мая 2010г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 57 таблиц и состоит из введения, обзора литературы (первая глава), клинических групп и методов исследования (вторая глава), результатов клинико-функциональных исследований (третья глава), результатов исследования индуцированной мокроты (четвертая глава), обсуждения результатов (пятая глава), выводов, практических рекомендаций, списка литературы.

Библиографический указатель содержит 185 источников литературы, из которых 45 на русском языке, 140 на английском языке.

КЛИНИЧЕСКИЕ ГРУППЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с задачами, поставленными в работе, было спланировано и проведено стратифицированное открытое проспективное сравнительное исследование с курсом терапии тиотропия бромидом длительностью 3 месяца в параллельных группах.

Всего в рамках исследования были обследованы 104 человека.

Среди них под наблюдением находилось 78 пациентов обоего пола (15 женщин и 63 мужчины), страдающих стабильной ХОБЛ II-IV стадий, в возрасте от 40 до 75 лет, средний возраст 61,1±1,1 год. Из них 21 человек с ХОБЛ II стадии, ранее не получавших базисную терапию (группа 1). 30 больных ХОБЛ III-IV стадии, также ранее не получавших поддерживающую терапию (группа 2) и 27 пациентов с III-IV стадиями ХОБЛ, применявших ранее фиксированную комбинацию ФП/САЛ на протяжении не менее 6-ти

месяцев (группа 3). Группа контроля представлена 26 мужчинами-добровольцами, средний возраст 36,4±1,9 лет (группа 4) (рис. 1).

Визит! Визит 2 Визит 3 Визит 4

Рис. 1. Схема исследования.

Примечания:

Визит 1: подписание информированного согласия пациента на участие в клинико-фармакологическом исследовании, сбор анамнеза, физикапьное обследование, оценка функции внешнего дыхания (спирография с проведением пробы на обратимость бронхообструкции), проведение теста с 6-минутной ходьбой, сбор индуцированной мокроты, заполнение специальных медицинских вопросников SF-36 и HADS а также соответствующих разделов регистрационной карты, заполнение информационной формы для лечащего врача об участии пациента в исследовании.

Визит 2 и Визит 3: физикальное обследование, оценка клинического статуса и сбор анамнеза за предшествующий месяц терапии ТБ, проведение подробного инструктажа по использованию препарата Спирива и участию в исследовании, заполнение соответствующих разделов регистрационной карты, заполнение индивидуальной регистрационной карты Визит 4: физикальное обследование, оценка функции внешнего дыхания (спирография с проведением пробы на обратимость бронхообструкции), проведение теста с 6-минутной ходьбой, сбор индуцированной мокроты, заполнение специальных медицинских вопросников SF-36 и HADS а также соответствующих разделов регистрационной карты, заполнение информационной формы для лечащего врача о завершении участия пациента в исследовании.

Критерии включения: лица мужского или женского пола в возрасте 2 40 лет и < 75 лет; документально подтвержденный диагноз хроническая обструктивная болезнь легких II-IV стадии длительностью как минимум 12 месяцев перед началом исследования; отсутствие предшествующей базисной терапии (для группы 1) или получение на протяжении 6 месяцев и более комбинированного препарата иГКС / ДЦБА (для группы 2); отсутствие обострений ХОБЛ на протяжении 4 недель, предшествующих визиту 1; наличие 1 или более эпизодов обострения ХОБЛ на протяжении предшествующих 12 месяцев; получение от пациента до участия в исследовании письменного информированного согласия, подписанного с указанием даты.

Критерии исключения: в исследование не включались пациенты с диагнозом бронхиальная астма, пациенты, имеющие любое значимое заболевание, способное повлиять на возможность пациента принимать в нем участие, а также пациенты с декомпенсированным течением ХЛС, с наличием

жизнеугрожающей бронхиальной обструкции, муковисцидоза, активного туберкулеза, пациенты с декомпенсированным течением сахарного диабета, пациенты с перенесенным инфарктом миокарда, госпитализацией по поводу ХСН, аритмии, требующей хирургического или медикаментозного лечения, в течение последнего года, пациенты с подтвержденной закрытоугольной глаукомой, подтвержденной клинически манифестной гиперплазией предстательной железы, подтвержденной хронической почечной недостаточностью, пациенты с гиперчувствительностью к антихолинергическим препаратам и другим веществам, входящим в систему доставки исследуемого препарата, пациенты с подтвержденной гипокалиемией, тиреотоксикозом, по поводу которых не проводилось лечение, беременные и кормящие грудью пациентки, пациентки, способные к деторождению и не применяющие приемлемые с медицинской точки зрения методы контрацепции, пациенты, у которых на протяжении 4-х недель, предшествовавших визиту 1, наблюдалось обострение ХОБЛ и/или респираторная инфекция, пациенты ранее получавшие тиотропиум.

Методы исследования

Клинико-анамнестические методы. С целью выяснения анамнеза проводился анализ медицинской документации, помимо этого было проведено интервьюирование пациентов. Проводился объективный осмотр пациента. Диагноз «хроническая обструктивная болезнь легких» верифицировался на основании следующих критериев, изложенных в GOLD (пересмотр 2007г.): наличие анамнеза, характерного для ХОБЛ, типичных клинических симптомов заболевания и функциональных параметров. Количественная оценка степени выраженности клинических симптомов (одышка, кашель, количество мокроты, частота ночного удушья, число свистящих хрипов) представлялась в баллах (04 балла) по шкале, предложенной Ю.Л. Куницыной и Е.И. Шмелевым (2002). Суммированием баллов и вычислением средней величины определялось значение клинического индекса (КИ) до и после проведенной терапии, разница между клиническим индексом до и после курса лечения обозначалась как динамика клинического индекса (дКИ).

Функциональные методы. 1) Оценка функции внешнего дыхания: анализ показателей спирометрии (спирограф «Jager MasterScope»), соответственно требованиям ATS (American Thoracic Society - Американское Торакальное Общество) [Miller M.R., 2005]; 2) оценка толерантности к физической нагрузке: тест с 6-минутной ходьбой (6MWD— 6 min walking distance) проводился в соответствии с протоколом [Enright P.L., Sherill D.L., 1998], дополненный измерением сатурации крови кислородом с помощью пульсоксиметра. С учетом пола, массы, роста и возраста вычислялись должные показатели пройденной дистанции.

Лабораторные методы: Исследование индуцированной мокроты проводилось не позднее 2 часов после получения материала, на протяжении всего этого времени образцы мокроты хранились при температуре 4 °С.

Для цитологического исследования мокроты использовались мазки, окрашенные модифицированным методом Е.В. Пигаревского, В.Н. Мезинг,

принципом которого является избирательная окраска катионного протеина прочным зеленым при рН 8,1-8,2 [Пигаревский Е.В., 1981]. Определялось процентное содержание нейтрофилов, макрофагов, эозинофилов, лимфоцитов. С этой целью дифференцировалось 100 клеток. Количество клеток бронхиального эпителия с признаками плоскоклеточной метаплазии, количество цилиндрического и плоского эпителия, степень дегенерации клеток в индуцированной мокроте оценивалось по бальной шкапе (0-3 балла). Фагоцитирующие нейтрофилы и нейтрофилы, подвергшиеся апоптозу, оценивались в процентах.

Проводился цитохимический анализ нейтрофилов индуцированной мокроты с определением содержания миелопероксидазы (МПО), катионного протеина (КП), с применением компьютерной морфометрии для количественной оценки внутриклеточных включений. Для определения содержания МПО в нейтрофилах применялся метод Грэхема-Кнолля. В качестве красителя для мазков индуцированной мокроты использовался азур-1. При цитохимическом исследовании катионных белков применялся модифицированный метод Е.В. Пигаревского, В.Н. Мезинг (1981), принципом которого является избирательная окраска катионного протеина прочным зеленым при рН 8,1-8,2. Метод компьютерной морфометрии осуществлялся следующим образом. В световом микроскопе при увеличении хЮОО цифровой фотокамерой Sony DSC-S70, с максимальным разрешением, производили фотографирование нейтрофилов в мазках индуцированной мокроты. После чего скенограмму импортировали в программу Adobe Photoshop, затем с помощью пакета программ Photoshop SC определяли площадь нейтрофила (mkmj), площадь цитоплазмы нейтрофила, занимаемой гранулами внутриклеточных включений (мкм2), количество внутриклеточных включений (единицы оптической плотности).

В индуцированной мокроте биохимическими методами исследовалось содержание показателей протеиназ/антипротеиназной системы: эластазы, трипсиноподобных протеиназ, ai-протеиназного ингибитора, а2-макроглобулина, кислотостабильных ингибиторов; оксидант/ антиокидантной системы: малонового диальдегида, каталазы, супероксиддисмутазы [Оглоблина О.Г., Платонова Л.В., Пасхина Т.С., 1984; Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С., 1979; Камышников B.C., 2005; Королюк М.А. и др., 1988; Брусов О.С. и др., 1976].

Заполнение медицинских вопросников: оценка тяжести состояния пациента по Госпитальной шкале тревоги и депрессии (HADS); оценка качества жизни с помощью вопросника "SF-36 Health Status Survey" (SF-36). Статистические методы. Для статистической обработки результатов исследования был использован пакет программ Statistica for Windows version 6.0. При сравнении частот качественных признаков использовался критерий у2 или 2-сторонний критерий Фишера. Для оценки различия средних в попарно не связанных выборках применяли U-критерий Манна-Уитни. Для сравнения показателей в трёх связанных группах проводили анализ Фридмана. Для оценки вероятностей использовали программу Statcalc version 6.

Качественные данные представлены в виде абсолютных или относительных (%) частот, количественные в виде М±ш, где М - среднее арифметическое, ш - ошибка среднего. Разницу значений считали значимой при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клинико-анамнестические характеристики ХОБЛ и их динамика на фоне терапии тиотропия бромидом

При анализе и сравнении клинико-анамнестических данных, полученных при включении больных в исследование и через 3 месяца терапии ТБ, выявлено, что во всех группах на всех стадиях заболевания происходит значительный регресс основной клинической симптоматики - уменьшилась интенсивность кашля, сократилась продукция мокроты, снизалась интенсивность одышки, стали более редкими или исчезли вовсе эпизоды дистанционно слышимых хрипов в груди и ночного удушья (р<0,05). Значительно уменьшился клинический индекс, как суммарный показатель выраженности респираторных симптомов (р<0,001) - в группе пациентов со II стадией ХОБЛ (группа 1) на 48%, в группе пациентов с I1I-IV стадиями ХОБЛ, ранее не получавших базисную терапию (группа 2), на 47%, в группе пациентов с III-IV стадиями ХОБЛ, получавших ранее ФП/САЛ, а в течение основного этапа исследования ТБ и ФП/САЛ (группа 3), на 37% (табл. 1).

Таблица 1

Динамика клинических показателей на фоне 3-месячного курса лечения ТБ у больных ХОБЛ стабильного течения (М±ш). __

Показатель ХОБЛ Нет., ТБ, п=21, Группа 1 ХОБЛ IH-IVct., ТБ, п=28, Группа 2 ХОБЛ III-IVct., ТБ+ФП/САЛ, п=26, Группа 3

До терапии После терапии До терапии После терапии До терапии После терапии

Кашель, баллы 2,19±0,16 1,05*0,16 2,4±0,11 1,14±0,14 2,07±0,12 1,35±0,13

р"=0,0001 р'=0,00004 р'=0,0003

Мокрота, баллы 1,33±0,14 | 0,67±0,15 1,2±0,12 | 0,86±0,1 1,37±0,11 | 0,88±0,08

р*=0,0014 р'=0,018 р'=0,0033

Одышка, баллы 1,86±0,1б | 1,33±0,1 2,4±0,09 | 1,36±0,12 2,37±0,15 | 1,б±0,15

р'=0,0033 р'=0,00001 р"=0,0003

Ночное удушье, баллы 1,43±0,22 | 0,62±0,2 2,0±0,19 | 0,93±0,2 2,15±0,19 | 1,27±0,2

р'=0,0033 р'=0,001 р'=0,0004

Хрипы в груди, баллы 1,9±0,15 | 0,81±0,13 2,33±0,09 | 1,0±0,1 2,11±0,14 | 1,23±0,15

р"=0,0001 р"=0,00001 р'=0,0001

Клин. индекс, баллы 1,73±0,11 0,89±0,09 2,07±0,07 1,07±0,08 2,01±0,08 1,27±0,1

р'=0,0001 р'=0,00001 р'=0,0001

Примечание: - сравнение показателей в одной и той же группе до и после лечения (критерий Вилкоксона).

Важным достижением терапии ТБ явилось уменьшение суточного потребления КДБА в группе 1 в среднем на 3,2 дозы, в группе 2 - на 5,5 доз, в группе 3 - на 5,1 доз (р<0,01) (рис. 2).

Группа 1 Группа 2 Группа 3

Рис.2. Динамика потребности в КДБА «гто-требованию» за период исследования. На фоне 3-месячной терапии ТБ во всех группах пациентов было достигнуто достоверное улучшение ФВД, выраженное в увеличении значений пре- и постбронходилатационных показателей ОФВ]. ПреОФВ, увеличился в группе 1 на 0,24±0,08 л (р=0,002), в группе 2 на 0,19±0,037 л (р=0,0001) и в группе 3 на 0,115±0,03 л (р=0,001). Показатель постОФВ! стал выше в группе 1 на0,16±0,04 л (р=0,006), в группе 2 на 0,275±0,08 л (р=0,0001) и в группе 3 на 0,147±0,04 л (р=0,005) (табл. 2).

Таблица 2

Динамика показателей функции внешнего дыхания у пациентов с ХОБЛ на фоне терапии ТБ (М±т). __

Показатель ХОБЛ Ист., ТБ, п=20, Группа 1 ХОБЛ III-IVct., ТБ, п=28, Группа 2 ХОБЛ IH-IVCT., ТБ+ФП/САЛ, п=25, Группа 3

До терапии После терапии До терапии После терапии До терапии После терапии

преОФВ i, л 1,68±0,09 1,88±0,04 0,94±0,06 1,14±0,04 0,98±0,01 1,1±0,03

р=0,002 р=0,0001 р=0 001

преОФВ i, % 62,02±2,83 68,73±1,9 29,4±1,51 | 35,34±2,0! 35,49±0,8 38,35±0,97

р=0,0012 р=0,0001 р=0,018

постОФВ 1, л 1,79±0,09 | 1,97±0,03 1,13=ь0,07 | 1,42±0,12 1,14±0,08 | 1,33±0,1

р'=0,006 р'=0,0001 р'=0,005

постОФВ ь % 62,83±2,39 67,4± 1,97 35,14±1,39 | 43,54±3,44 40,44±1,82 | 45,7±1,3

р'=0,008 р'=0,00004 р'=0,004

Примечание: - сравнение показателей в одной и той же группе до и после лечения

(критерий Вилкоксона),

Для исследования физических возможностей у больных ХОБЛ использовался 6МШ)-тест (тесте с 6-минутной ходьбой), как наиболее простой и весьма информативный для оценки толерантности к физической нагрузке. После проведенной 3-месячной терапии ТБ во всех 3-х группах получено статистически значимое увеличение пройденного пути в тесте с 6-минутной ходьбой (коэффициент достоверности между значениями до и после терапии ТБ во всех 3-х группах был < 0,05) (рис. 3).

Группа 1 Группа 2 Группа 3

Рис 3. Динамика дистанции, пройденной пациентами в тесте с 6-минугной ходьбой.

Выраженность тревоги и депрессии, качество жизни у пациентов с ХОБЛ По результатам заполнения вопросника госпитальной шкалы тревоги и депрессии (HADS) все 3 группы пациентов имели субклинически выраженную тревогу и достоверно между собой по этому показателю не различались (р>0,05). Выраженность депрессии в группах 1 и 3 была также субклинической (между собой группы не различались, р>0,05), а в группе 2 (пациенты с III-IV стадиями ХОБЛ без базисной терапии) депрессия характеризовалась как клинически выраженная. При повторном заполнении вопросника после проведенной терапии ТБ уровень тревоги у больных достоверно уменьшился в группах 2 и 3 до нормального уровня (р<0,05), а уровень депрессии снизился в группе 2 до субклинически выраженных значений, в группе 3 - до нормальных значений (р<0,05) (рис. 4).

Группа! Группа 2 Группа 3

Рис 4 Динамика выраженности тревоги и депрессии на фоне терапии обострения ХОБЛ.

На начало исследования все 3 группы больных по большинству показателей качества жизни, представленных в вопроснике SF-36, достоверно не различались (р>0,05). При повторном заполнении вопросника через 3 месяца терапии ТБ были отмечены значимые положительные изменения в оценке пациентами качественных характеристик собственной жизни. Так, по результатам вопросника, общее состояние здоровья достоверно улучшилось у пациентов групп 1 (II стадия ХОБЛ без предшествующей базисной терапии) и 3 (III-IV стадии ХОБЛ, на предшествующей терапии ФП/САЛ) (р<0,05). Также во всех 3-х группах после 3-х месяцев лечения ТБ выросли показатели физического функционирования, ролевого функционирования, обусловленного физическим и эмоциональным состоянием (р<0,05), также уменьшилась выраженность общего восприятия физической боли (р<0,05). Отметим также

увеличение значения показателя психического здоровья у больных в Группах 1 и 2 (р<0,05), увеличение жизненной активности в группе 2 (больные ХОБЛ III-IV стадий без предшествующей терапии) (р<0,05).

Таким образом, назначение длительной поддерживающей терапии тиотропиумом больным ХОБЛ как в качестве монотерапии, так и в сочетании с фикисрованной комбинацией ФП/САЛ, независимо от наличия или отсутствия предшествующего базисного лечения позволяет существенно улучшить основные составляющие качества жизни у пациентов любой степени тяжести.

Результаты исследования индуцированной мокроты В индуцированной мокроте пациентов с ХОБЛ подавляющее большинство клеток было представлено нейтрофилами, как в начале исследования, так и через 3 месяца терапии ТБ. В начале исследования больные ХОБЛ на всех стадиях отличались от здоровых некурящих более выраженной дегенерацией нейтрофилов индуцированной мокроты, большей интенсивностью бактериальной обсемененности, большим количеством эозинофилов в мокроте, а также большим содержанием апотозных нейтрофилов (р<0,05).

При оценке индуцированной мокроты больных ХОБЛ через 3 месяца терапии ТБ мы не получили статистически значимой динамики внутри групп по большинству показателей за исключением достоверного снижения интенсивности бактериальной обсемененности (р<0,05) в группе 2 (больные ХОБЛ III-IV стадий, получавшие во время исследования терапию ТБ и ФП/САЛ). Являясь мощным и длительно расширяющим бронхи препаратом, нормализуя секрецию и качество мокроты, ТБ способствует улучшению дренажной функции легких, снижая, тем самым, и бактериальную нагрузку.

В нашей работе мы подтвердили важность роли нейтрофилов при ХОБЛ, обнаружив корреляционные отношения между их количеством в индуцированной мокроте и некоторыми клинико-функциональными характеристиками. Количество нейтрофилов в мокроте прямо коррелирует с выраженностью кашля, частотой эпизодов ночного удушья, и обратно соотносится с сатурацией кислорода до и после проведения теста с 6-минутной ходьбой, с показателями пре- и постбронходилатационных OOBi (табл. 3).

Таблица 3

Корреляции количества нейтрофилов и макрофагов в индуцированной мокроте с

клиническими и спирометрическими показателями при ХОБЛ в стабильный период болезни

Пары анализируемых показателей п г Р

Нейтрофилы (количество, %) <-> кашель (баллы) - до терапии 65 0,21 0,04

Нейтрофилы (количество, %) «-» ночное удушье (эпизоды) - до терапии 55 0,34 0,01

Нейтрофилы (количество,%)+-> сатурация 02 до 6-мин ходьбы - до терапии 55 -0,29 0,02

Нейтрофилы (количество,%)<-► сатурация Ог после б-мин ходьбы - до терапии 55 -0,33 0,01

Нейтрофилы (количество,%)<-► преОФВ) - до терапии 54 -0,43 0,001

Нейтрофилы (количество,%) *-* преОФВ i (%) - до терапии 54 -0,46 0,0004

Нейтрофилы (количество,%) <-> постОФВ1-до терапии 52 -0,28 0,04

Нейтрофилы (количество,%)*-► постОФВ) (%) - до терапии 52 -0,39 0,004

Цитохимическое исследование нейтрофилов индуцированной мокроты В рамках цитохимического исследования нейтрофилов индуцированной мокроты определялось содержание миелопероксидазы (МПО) и катионного протеина (КП) до и после терапии ТБ. При сравнении активности нейтрофильной миелопероксидазы и катионного протеина в индуцированной мокроте больных ХОБЛ и практически здоровых некурящих добровольцев в начале исследования было обнаружено, что нейтрофилы в мокроте здоровых лиц отличались большим содержанием данных ферментов (р<0,05 для всех групп). После проведенного курса лечения ТБ уровень МПО внутри клеток стал существенно выше во всех группах (получена статистически значимая динамика, р<0,05) и различия с группой здоровых некурящих добровольцев при повторном исследовании оказались статистически незначимыми (р>0,05 для всех групп) (табл. 4).

Таблица 4

Динамика содержания миелопероксидазы в нейтрофилах индуцированной мокроты больных ХОБЛ.

До терапии ТБ* 1 После терапии ТБ*

ХОБЛ Ист., ТБ, п=21, Группа 1 121,62±7,38 92,33±5,59

р=0,00002

ХОБЛ III-IVct., ТБ, п=27, Группа 2 126,43±5,13 94,23±6,95

р=0,0008

ХОБЛ III-IVct., ТБ+ФП/САЛ, п=27, Группа 3 129,95±6,01 84,73±6,68

р=0,002

* Ферменты оценивались в единицах оптической проницаемости - большему значению показателя соответствует меньшая концентрация фермента.

Также через 3 месяца лечения ТБ значительно повысилось и содержание катионного протеина в нейтрофилах мокроты пациентов с ХОБЛ всех групп (р<0,05). Оказалось, что активность катионного протеина в нейтрофилах индуцированной мокроты групп 1 и 3 была достоверно выше, чем в группе здоровых некурящих добровольцев (р<0,05). При сравнении активности катионного протеина в нейтрофилах мокроты здоровых некурящих лиц и группы 2 статистически значимых различий получено не было (р=0,41) (табл. 5).

Таблица 5

Динамика активности катионного протеина в нейтрофилах индуцированной мокроты у пациентов с ХОБЛ до и после терапии (М±т).__

Активность КП, Ед. опт. До терапии ТБ* После терапии ТБ*

прониц.

ХОБЛ Нет., ТБ, п=21, 82,57*3,54 61,2±2,32

Группа 1 р=0,0008

ХОБЛ III-IVct., ТБ, п=27, 89,23±2,69 71,23±2,94

Группа 2 р=0,01

ХОБЛ III-IVct., ТБ+ФП/САЛ, п=27, Группа 3 86,28±4,31 | 65,67±3,4

р=0,00001

* Ферменты оценивались в единицах оптической проницаемости - большему значению

показателя соответствует меньшая концентрация фермента.

Участие нейтрофилов с исследуемыми цитохимическими характеристиками в генезе ХОБЛ подтверждается установленными статистически достоверными соотношениями с клиническими характеристиками ХОБЛ. В частности, на это указывают связи концентрации катионных протеинов в нейтрофилах индуцированной мокроты с потребностью в бета-2-агонистах короткого действия, выраженностью депрессии, показателями качества жизни (ролевое функционирование, обусловленное физическим состоянием (RP), психическое здоровье (МН)), показателями функции внешнего дыхания (значения пре- и постбронходилатационных ОФВ1), толерантностью к физической нагрузке (дистанция в тесте с 6-минутной ходьбой) (табл. 6).

Таблица 6

Корреляции цитохимических показателей нейтрофилов индуцированной мокроты с __клиническими и вентиляционными показателями при ХОБЛ

Пары анализируемых показателей п г Р

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты *-» потребность в КДБА - до терапии 53 0,4 0,002

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты*-* Депрессия - до терапии 53 0,43 0,0014

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты»-» депрессия - после терапии 52 0,34 0,012

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты** Дистанция в тесте с 6-мин. ходьбой - до терапии 53 -0,45 0,0012

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты *->RP - до терапии 53 -0,32 0,02

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты«-»МН - до терапии 53 -0,30 0,03

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты*-* преОФШ - до терапии 52 -0,39 0,004

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты*-» преОФШ (%) - до терапии 52 -0,4 0,003

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты*-* преОФШ - после терапии 51 -0,29 0,03

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты*-» преОФВ1 (%)-после терапии 51 -0,33 0,01

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты*-» постОФШ - до терапии 51 -0,44 0,0012

Концентрация катионных протеинов в нейтрофилах мокроты*-* постОФШ (%) - до терапии 51 -0,46 0,001

Концентрация миелопероксидазы в нейтрофилах мокроты *-» Дистанция в тесте с 6-мин. ходьбой - до терапии 53 -0,54 0,001

Результаты компьютерной цитоморфометрии нейтрофилов индуцированной мокроты больных ХОБЛ

Мы также обратили внимание на то, что помимо "накопления" ферментов в цитоплазме нейтрофилов вследствие 3-х месяцев терапии ТБ сами клетки отличались более крупным размером, увеличенным объемом цитоплазмы и низким отношением площади ядра к площади цитоплазмы. Действительно, до начала исследования нейтрофилы ИМ больных ХОБЛ отличались от нейтрофилов группы здоровых некурящих лиц - у больных они были мелкими с малым содержанием цитоплазмы и высоким ядерно-цитоплазматическим индексом (р<0,05). Такие нейтрофилы у пациентов с ХОБЛ можно охарактеризовать как функционально неактивные клетки, готовящиеся к апоптозу. Однако после 3-х месяцев лечения ТБ было обнаружено увеличение размера нейтрофилов и значимое уменьшение ядерно-цитоплазматического соотношения вследствие увеличения содержания цитоплазмы в клетках (р<0,05) (табл. 7).

Таблица 7

Динамика результатов цитоморфометрического исследования нейтрофилов индуцированной мокроты больных ХОБЛ до и после терапии ТБ (М±т)._

Показатель ХОБЛ Ист., ТБ, п=21, Группа 1 ХОБЛ III-IVct., ТБ, п=28, Группа 2 ХОБЛ III-IVct., ТБ+ФП/САЛ, п=22, Группа 3

До терапии После терапии До терапии После терапии До терапии После терапии

Площадь клетки, мкм2 59,53±3,4 68,19±3,65 58,96±3,б 61,64±3,04 53,13±2,12 64,61±2,45

р'=0,008 р=0,84 р"=0,001

Площадь цитоплазмы, мкм2 29,94±2,05 | 43,43±2,53 29,34±1,95 | 37,76±2,07 25,22±1,67 | 41,88±2,23

р'=0,00008 р'=0,0008 р'=0,00001

Ядерно-цитоплазмати -чесхий индекс 1,07±0,07 | 0,61±0,048 1,07±0,07 | 0,71 ±0,06 1,24±0,09 | 0,61 ±0,07

р'=0,00008 р'=0,00004 р'-0,000007

- сравнение показателей в одной и той же группе до и после лечения (критерий Вилкоксона).

Отмечены корреляции между размером нейтрофилов индуцированной мокроты, площадью их цитоплазмы, величиной ядерно-цитоплазматического индекса и клинико-функциональными характеристиками ХОБЛ. В частности, выявлена обратная корреляция размера нейтрофилов и их цитоплазмы с отхождением мокроты за сутки, с клиническим индексом совокупности респираторных симптомов, отражающим тяжесть течения ХОБЛ (р<0,05).

Результаты компьютерной цитоморфометрии макрофагов индуцированной мокроты больных ХОБЛ Интересные данные были получены нами при анализе отношений между количеством макрофагов в индуцированной мокроте клинико-функциональными характеристиками ХОБЛ. Так большему количеству макрофагов в мокроте соответствует меньшая частота эпизодов ночного удушья, меньшее значение клинического индекса, отражающего совокупную тяжесть респираторных симптомов, а также более высокие значения сатурации

кислорода до и после ходьбы в тесте с б-минутной ходьбой, и более высокие показатели функции внешнего дыхания (значения пре- и постОВФ)).

Таблица 8

Корреляции количества макрофагов в индуцированной мокроте с клиническими и спирометрическими показателями при ХОБЛ в стабильный период болезни _

Пары анализируемых показателей п г Р

Макрофаги (количество,%)«-» ночное удушье (эпизоды) - до терапии 55 -0,32 0,015

Макрофаги (количество, %) «-> индекс симптомов (баллы) - до терапии 55 -0,30 0,02

Макрофаги (количество,%)«-> сатурация Ог до 6-мин ходьбы - до терапии 55 0,35 0,01

Макрофаги (количество,%)<-> сатурация О2 до 6-мин ходьбы - после терапии 45 0,34 0,02

Макрофаги (количество,%)<-» сатурация 02 после 6-мин ходьбы - после терапии 45 0,37 0,01

Макрофаги (количество,%)<-> преОФВ] - до терапии 54 0,28 0,03

Макрофаги (количество,%)«-> преОФВ 1 - после терапии 44 0,31 0,03

Макрофаги (количество,0/»)*-» преОФВ 1 (%) - после терапии 44 0,30 0,04

Макрофаги (количество,%) «-> постОФВ1 - до терапии 52 0,27 0,04

Макрофаги (количество,%)<-» постОФВ! (%) - до терапии 52 0,29 0,03

При цитоморфометрическом исследовании макрофагов ИМ мы обнаружили, что на начало исследования макрофаги мокроты здоровых лиц отличались от макрофагов больных ХОБЛ большими размерами клеток и значимым преобладанием площади цитоплазмы над размером ядра (р<0,05 для всех групп). Ядерно-цитоплазматическое отношение для данных клеток в группе здоровых добровольцев было достоверно ниже по сравнению с ядерно-цитоплазматическим индексом макрофагов больных ХОБЛ (р<0,05 для всех групп). Подобные результаты вполне закономерны, если исходить из концепции, что на фоне активного хронического воспаления, вследствие недостаточности собственных тканевых макрофагов наблюдается существенная миграция в ткань моноцитов из периферической крови. Отталкиваясь от этой концепции, клетки, обнаруженные в мокроте при клинически выраженной ХОБЛ, макрофагами как таковыми не являются. Эти малые, с небольшим содержанием цитоплазмы клетки - не что иное, как призванные на фронт воспаления моноциты, которые, однако, в силу своей морфологической и функциональной незрелости оказываются неспособными обеспечивать полноценный завершенный эффероцитоз клеток (в том числе и нейтрофилов).

После курса лечения ТБ отмечалось статистически значимое увеличение размера макрофагов, площади цитоплазмы в них в мокроте во всех группах пациентов (р<0,05). Также закономерно уменьшилось и среднее значение ядерно-цитоплазматического соотношения для макрофагов во всех группах (р<0,05) (табл. 9).

Таблица 9

Динамика результатов цитоморфометрического исследования макрофагов индуцированной мокроты больных ХОБЛ до и после терапии ТБ (М±т)._

Показатель ХОБЛ Нет., ТБ, п=21, Группа 1 ХОБЛ III-IVct., ТБ, п=28, Группа 2 ХОБЛ III-IVct., ТБ+ФП/САЛ, п=22, Группа 3

До терапии После терапии До терапии После терапии До терапии После терапии

Площадь клетки, мкм2 256,63 ±27,84 339,54 ±32,86 213,97 ±13,04 283,87 ±18,22 265,84 ±17,25 338,41 ±17,81

р'=0,001 р'=0,0001 р'=0,01

Площадь цитоплазмы, мкм2 168,68 ±24,3 263,45 ±29,91 131,14 ±9,65 210,98 ±13,94 166,65 ±12,07 272,11 ±13,59

р "=0,001 р'=0,0001 р'=0,00002

Ядерно-цитоплазма-тический индекс 0,62±0,04 | 0,32±0,02 0,68±0,04 | 0,34±0,018 0,65±0,05 | 0,28±0,01

р'=0,00004 р"=0,00003 р'=0,00002

- сравнение показателей в одной и той же группе до и после лечения (критерий Вилкоксона).

Данные изменения, выявленные при исследовании макрофагов индуцированной мокроты у больных ХОБЛ, мы считаем важным критерием и следствием снижения активности воспаления в бронхолегочном регионе на фоне терапии ТБ. Снижение активности воспаления в бронхах, с одной стороны, уменьшает приток функционально неспособных к макрофагоцитозу моноцитов, а, с другой стороны, создает условия для созревания и полноценной дифференцировки локального пула альвеолярных макрофагов.

Данное утверждение подтверждается и выявленными корреляциями между размером макрофагов, величиной их ядерно-цитоплазматического отношения и некоторыми клинико-функциональными характеристиками ХОБЛ. Так, большему размеру макрофагов в индуцированной мокроте соответствует меньший клинический индекс, отражающий тяжесть респираторных симптомов ХОБЛ, а меньшему значению ядерно-цитоплазматического индекса в макрофагах индуцированной мокроты -большая частота эпизодов ночного удушья.

Биохимическое исследование индуцированной мокроты Измерение активности протеолитических ферментов рассматривается как показатель интенсивности воспалительного процесса. Однако при ХОБЛ происходит нарушение динамического равновесия "протеиназы - ингибиторы", что приводит к деструкции связи коллаген-эластин, нарушению вентиляционной функции легких [Веремеенко К.Н., 1994; Волкова Л.И., 2004].

В нашей работе мы не получили статистически значимых изменений активности протеиназ-антипротеиназ (эластазы, трипсиноподобных протеиназ, кислотостабильных ингибиторов) в мокроте больных ХОБЛ за 3-месячный период лечения ТБ (р>0,05). Поскольку тиотропиум не оказывает специфического прямого влияния на протеиназ-антипротеиназную активность мокроты, и речь идет о пациентах, включенных в исследование в стабильный

период течения ХОБЛ, отсутствие значимых колебаний активности в данной системе ферментов, на наш взгляд, лишь подчеркивает стабильность заболевания, поддерживаемую адекватной терапией.

Нами не получены данные свидетельствующие о влиянии ТБ на такие показатели оксидант/антиоксидантной системы как МДА, катал аза в индуцированной мокроте. Во всех группах на всех стадиях заболевания уровень этих ферментов достоверно не изменился (р>0,05). Однако подавляющее большинство пациентов продолжало курить. Некоторыми исследователями подтверждается, что на фоне курения отмечается стабильно высокий уровень МДА [Altuntas Е., 2003; Hanta I., 2006]. В связи с этим отсутствие статистически значимого снижения концентрации малонового диальдегида в индуцированной мокроте у исследованных нами пациентов может быть объяснено продолжающимся действием факторов табачного дыма.

В то же время мы выявили корреляции активности каталазы и МДА с некоторыми клинико-функциональными характеристиками ХОБЛ. Так, активность малонового диальдегида обратно соотносится с такими показателями качества жизни, как психическое здоровье и жизненная активность. Активность каталазы мокроты прямо коррелирует с клиническим индексом, потребностью в бета-2-агонистах короткого действия и выраженностью депрессии, обратно коррелирует с сатурацией кислорода до и после теста с 6-минутной ходьбой, дистанцией, пройденной пациентом при ходьбе, показателем физического функционирования (PF) (табл. 10).

Таблица 10

Корреляции активности каталазы и МДА в индуцированной мокроты с клинико-_функциональными характеристиками при ХОБЛ

Пары анализируемых показателей п г Р

Активность каталазы «-» клинический индекс- до терапии 57 0,28 0,03

Активность каталазы *-* клинический индекс - после терапии 53 0,29 0,03

Активность каталазы <-> сатурация кислорода до 6-минугной ходьбы - до терапии 57 -0,31 0,01

Активность каталазы «-» сатурация кислорода после 6-минугной ходьбы - до терапии 57 -0,44 0,0005

Активность каталазы *-» потребность в КДБА - после терапии 53 0,27 0,04

Активность каталазы <-» дистанция в тесте с 6-минутной ходьбой - после терапии 53 -0,3 0,03

Активность каталазы «-» выраженность депрессии - после терапии 53 0,32 0,02

Активность каталазы «-► PF - после терапии 53 -0,28 0,04

Подобные взаимоотношения между каталазой и клинико-функциональными показателями могут быть объяснены тем, что оксидативный стресс на фоне активного воспаления в бронхах при ХОБЛ сопровождается компенсаторным ростом активности антиоксидантных ферментов, в том числе и каталазы. Таким образом, повышение активности каталазы индуцированной

мокроты может расцениваться как маркер воспалительной активности в бронхолегочном регионе.

Выводы

1. При назначении тиотропия бромида в качестве длительной поддерживающей терапии как пациентам с ХОБЛ II-IV стадий, ранее не получавшим базисную терапию (в режиме монотерапии), так и больным ХОБЛ III-IV стадий, получающим фиксированную комбинацию флутиказона пропионат/салметерол (в режиме сочетанной терапии) происходит уменьшение выраженности основных симптомов заболевания, существенно снижается суточная потребность в бета-2-агонистах короткого действия, улучшаются показатели ФВД, увеличивается толерантность к физической нагрузке, снижается уровень тревоги и депрессии (при тяжелой и очень тяжелой ХОБЛ), улучшаются показатели качества жизни пациентов с ХОБЛ II-IV стадий.

2. Биомаркеры воспаления в индуцированной мокроте больных ХОБЛ (содержание нейтрофилов и макрофагов, цитоморфометрические характеристики нейтрофилов и макрофагов, активность миелопероксидазы и катионных протеинов нейтрофилов, активность малонового диальдегида и каталазы), отражающие активность воспаления в бронхах, коррелируют с клинико-функциональными характеристиками болезни (выраженность респираторных симптомов, потребность в бета-2-агонистах короткого действия, параметры функции внешнего дыхания, толерантность к физической нагрузке, показатели качества жизни, выраженность тревоги и депрессии).

3. Назначение тиотропия бромида в качестве регулярной поддерживающей терапии пациентам с ХОБЛ как в режиме монотерапии, так и в сочетании с фиксированной комбинацией флутиказона пропионат/салметерол, сопровождается положительной динамикой биомаркеров воспаления в бронхолегочном регионе - повышением содержания миелопероксидазы и катионных протеинов в нейтрофилах, увеличением размера нейтрофилов и макрофагов, объема цитоплазмы этих клеток, снижением ядерно-цитоплазматического отношения.

4. При назначении титропия бромида пациентам с ХОБЛ не выявлена значимая динамика протеиназ-антипротеиназной и оксидант-антиоксидантной активности индуцированной мокроты.

5. Положительная динамика клинико-функциональных показателей при добавлении тиотропия бромида в схему регулярной поддерживающей терапии наблюдается у пациентов с ХОБЛ независимо от режима предшествующего лечения (как у пациентов, не имеющих анамнеза регулярной поддерживающей терапии, так и больных ХОБЛ, ранее получавших фиксированную комбинацию флутиказона пропионат/салметерол).

6. Положительные изменения морфофункциональных характеристик макрофагов и нейтрофилов индуцированной мокроты, отражающие

стабилизацию воспаления в бронхолегочном регионе, отмечены во всех группах пациентов с ХОБЛ независимо от режима предшествующего лечения при добавлении тиотропия . бромида . в схему регулярной поддерживающей терапии.

Практические рекомендации

1. При выборе стартовой терапии больных клинически выраженной ХОБЛ стабильного течения следует отдавать предпочтение тиотропия бромиду, учитывая патогенетическую обоснованность его назначения, а также высокую клиническую эффективность и благоприятный профиль безопасности.

2. Всем пациентам со стабильной ХОБЛ, ранее применявшим в качестве поддерживающей терапии комбинацию флутиказона пропионат / салметерол, следует добавить тиотропия бромид в схему регулярного лечения при отсутствии индивидуальных противопоказаний.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Контролируемая активация калликреин-кининовой системы в бронхиальном регионе как фактор толерантности развития ХОБЛ у длительно курящих / С.В. Федосенко, Г.Э. Черногорюк, О.Е. Акбашева О Б. и др. // Сборник научных трудов IX Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке: Влияние Космической погоды на биологические системы в свете учения А Л. Чижевского». - Москва, РУДН. - 2008. - С. 167-168.

2. Апоптоз нейтрофилов в регионе асептического воспаления как проявление системной реакции при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) / Н.А. Кириллова, С.В. Федосенко, Г.Э. Черногорюк и др. II Научные труды X международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации: инновационные технологии в биологии и медицине». - Москва. - 2009. - с. 773.

3. Antiproteases system activation in bronchial region as a factor of tolerance to COPD in healthy long term smokers (тезис) / С.В. Федосенко, Г.Э. Черногорюк, О.Е. Акбашева, Н.С. Ямкина // Сборник тезисов XIX Европейского ежегодного респираторного конгресса. -Вена.-2009.-С. 599-600.

4. The high antioxidant response as a factor of tolerance to COPD in healthy long term smokers / С.В. Федосенко, Г.Э. Черногорюк, M.C. Санжаровская и др. // Сборник тезисов XIX Европейского ежегодного респираторного конгресса. - Вена. - 2009. - С. 641.

5. Состояние про- и антиоксидантной системы в индуцированной мокроте больных хронической обструктивной болезнью легких при лечении тиотропия бромидом и его комбинацией с серетидом / Е.А. Горбаченко, М.Ф. Малышкин, Клименгьева, С.В. Федосенко, Г.Э.Черногорюк // Сборник научных трудов X Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации: инновационные технологии в биологии и медицине». - Москва, РУДН. - 2009. - С. 93-94.

6. The improvement of the macrophages morphological characteristics in bronchial region in stable COPD patients under the influence of tiotropium bromide / С.В. Федосенко, Г.Э. Черногорюк, Н.А. Кириллова и др. // Сборник тезисов XX Европейского ежегодного респираторного конгресса. - Барселона. - 2010г. - с. 719. >

7. Влияние тиотропия бромида на цитоморфометрические характеристики макрофагов индуцированной мокроты у больных хронической обструктивной болезнью легких / Н.А. Кириллова, Г.Э. Черногорюк, С.В. Федосенко и др. // Сборник трудов XX Национального конгресса по болезням органов дыхания. - 2010. - с. 435.

8. Федосенко, С В. Влияние тиотропия бромида на качество жизни больных ХОБЛ тяжелого и очень тяжелого течения // С.В. Федосенко, Г.Э. Черногорюк, Н.А. Кириллова // Сборник трудов XX Национального конгресса по болезням органов дыхания. - 2010. -с. 439.

9. Федосенко, С.В. Влияние тиотропия бромида на морфофункциональные свойства нейтрофилов и макрофагов бронхиального дерева при хронической обструктивной болезни легких стабильного течения (статья) / С.В. Федосенко, Г.Э. Черногорюк, Е.П. Рослякова // Научно-практический журнал «Пульмонология». - Выпуск 5. -

2010.-С. 56-60.

10. Федосенко, С.В. The influence of tiotropium bromide on neutrophiles function of bronchial region in COPD patients / С.В. Федосенко, Г.Э. Черногорюк, Е.П. Рослякова // Сборник тезисов XX Европейского ежегодного респираторного конгресса, Барселона, сентябрь 2010г., с. 719.

11. Активация антипротеиназ в бронхиальном регионе - фактор толерантности формирования хронической обструктивной болезни легких у здоровых злостных курильщиков / Г.Э. Черногорюк, А.А. Михайлова, С.В. Федосенко и др. II Бюллетень СО РАМН. - Том 30. - №3. - 2010. - С. 124-129,

12. Федосенко, С.В. Влияние лечения тяжелой хронической обструктивной болезни легких тиотропия бромидом на коморбидные соматогенные тревожно-депрессивные расстройства / С.В. Федосенко, Н.А. Кириллова // Бюллетень сибирской медицины. -

2011. -ЛИ.- С. 92 -96.

Список сокращений

ГКС - глкжокортикостероиды

ДДБА - длительно действующие бета-2-агонисты

ЖЕЛ - жизненная емкость легких

ИГКС - ингаляционные глкжокортикостероиды

ИМ - индуцированная мокрота

КДБА - коротко действующие бета-2-агонисты

КП - катионный протеин

КИ - клинический индекс

КСИ - кислотостабильные ингибиторы

МПО - миелоперокендаза

МДА - малоновый диальдегид

ai. МГ - альфа 2 -макроглобулин

ОФВ,- объем форсированного выдоха

cti-ПИ - альфа 1 -протеиназный ингибитор

ТБ - тиотропия бромид

ТПП - трипсиноподобные прочеиназы

ФЖЕЛ - форсированная жизненная емкость легких

ФП/САЛ - флутиказона пропионат / салметерол

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

GOLD - Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease

6MWD - 6 min walking distance, тест с 6-минугной

Подписано в печать 12.05.2011г. Усл. печ. листов 0,75. Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ № 178 Тираж 100 экземпляров

Несмотря на внедрение в реальную клиническую практику ступенчатой схемы лечения ХОБЛ, рекомендованной GOLD, проблема выбора стартовой1 терапии сохраняет свою актуальность. Согласно GOLD препаратами выбора являются длительно действующие бронхолитические средства: антихолинергические (тиотропия бромид) и бета-2-адренергические (салметерол, формотерол) препараты, назначение которых показано уже со второй стадии ХОБЛ. Однако глобальная инициатива по ХОБЛ не регламентирует первоочередность назначения той или иной группы названных препаратов, что, по всей видимости, связано с противоречивостью данных, полученных при проведении многоцентровых клинических исследований. Кроме того, «общий подход к лечению ХОБЛ стабильного течения'должен быть индивидуализирован с целью ослабления симптомов и улучшения качества жизни», поскольку «показано, что ни одно из лекарств для ХОБЛ в долговременной перспективе не позволяет предупредить снижение функции легких (уровень доказательности А)» [95].

Уже более 10 лет в терапии ХОБЛ применяется МЗ-холиноблокирующий бронхолитический препарат тиотропия бромид, обеспечивающий длительный (24 часа) бронхорасширяющий эффект, сопряженный со стойким контролем симптомов заболевания, улучшением функции легких, снижением частоты обострений и улучшением качества жизни больных [138].

В исторически сложившейся модели фармакотерапии'ХОБЛ в России менее популярно изолированное назначение длительно действующих В2-агонистов (ДДБА). Значительно шире используются комбинированные препараты, содержащие ДДБА и ИГКС. Отчасти это связано и с поздней диагностикой, а, значит, несвоевременным началом лечения (на III или даже IV стадии заболевания). В' этот период становится оправданным постоянное применение ингаляционных глюкокортикостероидов. Также ИГКС могут быть показаны и больным со II стадией заболевания, если в ответ на терапию отмечается значительный; прирост ОФВ \ [20]. ИЕКС оказывают противовоспалительный эффект, воздействуя преимущественно? на; эозинофильное. звено воспаления; и обусловливая снижение: выраженности? деструктивных явлении, имеющих место при ХОБЛ, а также уменьшают количество обострений ХОБЛ [15].

Доказано, что сочетанное применение ИЕКС и В2-агонистов более, рационально, так как имеет место- феномен повышения- чувствительности? рецепторов к последним, что .объясняет более выраженный бронхолитический эффект и позволяет снизить суточную дозу ИГКС [20].

Среди комбинированных препаратов наиболее популярны комбинации будесонид/формотерол и* флутиказон/салметерол.

В настоящее время представлено большое количество, исследований относительно эффективности длительно действующих бронхолитических препаратов, включая тиотропия бромид, при ХОБЛ. Однако их результаты в-большей степени, отражают клиническую эффективность выбранного режима терапии;

Учитывая важность роли воспалительного компонента в, патогенезе ХОБЛ, крайне актуальным становится поиск эффективных препаратов;, обладающих способностью контролировать и подавлять воспаление, носящее характер системного при данной болезни.

В'ряде исследований»последних лет изучаются возможности снижения выраженности воспаления путем воздействия через мускариновую систему. Так, например, о вовлеченности мускариновых рецепторов в воспалительный ответ при- ХОБЛ свидетельствуют данные исследования M. Profita и соавторов; в котором установлено существенное усиление экспрессии'Мг и Мз-холинорецептбров и снижение экспрессии М2-хол инорецепторов у больных ХОБЛ по сравнению с курильщиками и здоровыми: участниками исследования (р<0,05). Также было показано, что ингибирование- M г и Мз-рецепторов предотвращает ацетилхолининдуцированное высвобождение провоспалительного лейкотриена В4, а также может уменьшать инфильтрацию* и активность нейтрофилов;. при ХОБЛ. Установлено; что М-холинолитики, блокируя мускариновые рецепторы в бронхах, препятствуют продукции воспалительных, цитокинов эпителиоцитами- и макрофагами, оказывая стабилизирующее действие на дыхательные пути [13]л

Предположение о наличии у М-холиноблокирующего препарата длительного? действия- тиотропия бромида; противовоспалительных свойств; возникло в связи с полученными результатами' клинических плацебо контролируемых исследований, продемонстрировавших способность, долгосрочной: терапии тиотропиумом увеличивать продолжительность периода- до первого обострения- снижать, выраженность симптомов обострений и частоты госпитализаций по поводу обострений ХОБЛ [84]; что в- последствии было подтверждено и результатами значимого для; ХОБЛ исследования UPLIFT [164].

В одном, из экспериментальных исследований (В; Disse, 2001) была продемонстрирована способность тиотропиума подавлять высвобождение эйкозаноидов эпителиальными; клетками; а; также снижать выделение факторов, хемотаксиса нейтрофилов и эозинофилов* альвеолярными макрофагами [13]. Также было; выявлено зависящее о дозы-; и длительности^ использования угнетающее воздействие тиотропия бромида на ацетилхолининдуцированную хемотаксическую активность воспалительных клеток с высокой экспрессией МЗ-холинорецепторов в экспериментальных работах F. Buhling и соавторов [64].

В то же время нет официальных данных клинических исследований о влиянии тиотропия бромида на. факторы местного воспаления, развивающегося при ХОБЛ, затрагивающего дисбаланс в оксидант/антиоксидантной, протеиназ/антипротеиназной системах, что является-одной из основ патогенеза данного заболевания.

Отсутствует информация о влиянии тиотропия на нейтрофильное звено воспаления, активность миелопероксидазы и катионного протеина нейтрофилов мокроты.

Недостаточно фактов о патогенетической обоснованности добавления тиотропиума в схему лечения пациентам, ранее получавшим комбинацию ИГКС и бета-2-агонстов.

Отмеченные выше обстоятельства обосновывают актуальность данного исследования.

Цель исследования

Установить характеристику эффекторных клеток воспаления в индуцированной мокроте и динамику клинико-функциональных показателей у больных ХОБЛ стабильного течения для обоснования эффективности базисной терапии.

Задачи исследования

1. Оценить динамику клинико-функциональных характеристик течения ХОБЛ (респираторные симптомы, потребность в бета-2-агонистах короткого действия, показатели функции внешнего дыхания, толерантность к физической нагрузке, качество жизни, выраженность тревоги и депрессии) на фоне разных режимов базисной терапии (монотерапия^ тиотропия бромидом или его сочетание с ингаляциями комбинированного препарата, содержащего глюкокортикостероид и бета-2-агонист длительного действия).

2. Исследовать ассоциацию биомаркеров воспаления в индуцированной мокроте больных ХОБЛ (содержание нейтрофилов и макрофагов, цитоморфометрические характеристики нейтрофилов и макрофагов, активность миелопероксидазы и катионных протеинов нейтрофилов, активность протеиназ/антипротеиназной, оксидант/антиоксидантной систем) с клинико-функциональными показателями течения болезни (респираторные симптомы, потребность в бета-2-агонистах короткого действия, показатели функции внешнего дыхания, толерантность к физической нагрузке, качество жизни, выраженность тревоги и депрессии).

3. Изучить динамику показателей воспаления в индуцированной мокроте больных ХОБЛ (содержание нейтрофилов* и макрофагов, цитоморфометрические характеристики нейтрофилов и макрофагов, I

I ! активность миелопероксидазы и катионных протеинов нейтрофилов, активность протеиназ/антипротеиназной, оксидант/антиоксидантной систем) на фоне разных режимов базисной терапии (монотерапия тиотропия бромидом или его сочетание с ингаляциями комбинированного препарата, содержащего > глюкокортикостероид и бета-2-агонист длительного действия). ^ 4. Провести сравнительный, анализ динамики клиникофункциональных характеристик и биомаркеров воспаления индуцированной мокроты у больных ХОБЛ, применявших предшествующую терапию комбинацией флутиказона пропионат/салметерол, в сравнении с пациентами, не получавшими базисную терапию, на фоне включения в схему лечения тиотропия бромида.

5. На основании систематизации полученных данных о динамике клинико-функциональных характеристик и биомаркеров воспаления индуцированной мокроты у больных ХОБЛ на фоне базисной терапии, включающей применение тиотропия бромида, сделать предложение по оптимизации фармакотерапии ХОБЛ в стабильный период с позиции клинической и патогенетической эффективности лечения.

Научная новизна

Впервые установлено, что биомаркеры воспаления в индуцированной мокроте больных ХОБЛ (содержание нейтрофилов и макрофагов, цитоморфометрические характеристики нейтрофилов- и макрофагов, активность миелопероксидазы и катионных протеинов нейтрофилов, активность малонового диальдегида и каталазы), отражающие активность воспаления в бронхах, коррелируют с клинико-функциональными характеристиками болезни (выраженность респираторных симптомов, потребность в бета-2-агонистах короткого действия, параметры функции внешнего дыхания, толерантность к физической нагрузке, показатели качества жизни, выраженность тревоги и депрессии:

Впервые показано, что назначение тиотропия бромида в качестве регулярной поддерживающей терапии пациентам с ХОБЛ сопровождается положительной динамикой морфофункциональных характеристик ключевой для патогенеза ХОБЛ эффекторной клетки — нейтрофила бронхов. Это подтверждается увеличением размера нейтрофилов в5 бронхолегочном регионе, ростом объема цитоплазмы в нем, уменьшением ядерно-цитоплазматического отношения, что характерно для стабильных, структурно и функционально зрелых нейтрофилов в отсутствии активного воспаления.

В данной работе впервые показана динамика показателей внутриклеточной цитоферментной активности нейтрофилов индуцированной мокроты у больных ХОБЛ на фоне применения тиотропия бромида. Выявлено, что лечение тиотропиумом сопровождается повышением содержания миелопероксидазы и катионных протеинов в нейтрофилах. Это обусловлено уменьшением активности экзоцитоза цитотоксических факторов агрессии эффекторной клеткой во внеклеточную среду под действием проводимой терапии.

Впервые продемонстрировано, что применение тиотропия бромида в качестве регулярной поддерживающей терапии при ХОБЛ сопровождается положительной динамикой цитоморфологических характеристик макрофагов индуцированной мокроты больных. Через 3 месяца лечения тиотропиумом клетки характеризуются более крупным размером, объем цитоплазмы в них преобладает над размером ядра, что отражается в снижении ядерно-цитоплазматического отношения и определяет улучшение функциональной активности макрофагов.

Впервые показано: положительные изменения морфофункциональных характеристик макрофагов и нейтрофилов индуцированной мокроты у пациентов с ХОБЛ, отражающие стабилизацию воспаления в бронхолегочном регионе, наблюдаются при добавлении тиотропия бромида в схему регулярной поддерживающей терапии независимо от режима предшествующего лечения.

Впервые выявлено, что у больных тяжелой и крайне тяжелой ХОБЛ применение тиотропиума в сочетании- с комбинацией ИГКС/бета-2-агонист длительного действия сопровождается существенно, более выраженной положительной'динамикой, связанной с увеличением размера нейтрофилов индуцированной мокроты и уменьшением их ядерно-цитоплазматического индекса, по сравнению с монотерапией тиотропия . бромидом. Это подчеркивает патогенетическую обоснованность комплексного подхода к лечению пациентов с ХОБЛ тяжелого и крайне тяжелого течения.

Практическая значимость работы

В результате исследования показано, что тиотропия бромид, являясь высокоэффективным препаратом для длительной поддерживающей терапии больных клинически значимой ХОБЛ, целесообразен для назначения как в режиме стартовой монотерапии, так и в качестве дополнения к ранее начатому лечению комбинацией' ФП/САЛ. Результаты работы продемонстрировали положительное влияние регулярной терапии ТБ на характеристики клеточного воспаления в бронхиальном регионе при ХОБЛ, подчеркивая патогенетическую обоснованность применения тиотропиума. По результатам данного исследования показана практическая необходимость и целесообразность длительной терапии ТБ больных ХОБЛ на любой клинически значимой стадии независимо от предшествующего режима лечения.

Положения, выносимые на защиту

1. Назначение тиотропия бромида в режиме монотерапии или в сочетании с комбинацией флутиказона пропионат/салметерол, обеспечивает положительную динамику клинико-функциональных характеристик болезни, что способствует повышению переносимости пациентом физической нагрузки, улучшению качества жизни и снижению выраженности соматогенных тревожно-депрессивных расстройств.

2'., Включение тиотропия бромида в- схему базисной? терапиго хронической, обструктивной болезни легких, позволяет 'получить дополнительные преимущества; связанные: с положительной динамикой цитоморфологичсских характеристик неитрофилов и макрофагов в индуцированной мокроте, а также с увеличением содержания* миелопероксидазы и катионного: протеина в цитоплазме неитрофилов, что отражает уменьшение активности воспаления в бронхиальном, дереве. •

Апробация работы

Материалы, исследования^ доложены и обсуждены- на XX Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2010),.XIX Европейском ежегодном респираторном! конгрессе (Вена; 2009), XX Европейском; ежегодном респираторном конгрессе (Барселона,. 2010); 9-й Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке (Москва, 2008), 10-й Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI- веке (Москва, 2009), на проблемной комиссии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава по пульмонологии, на заседаниях кафедры госпитальной: терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины. За результаты исследования, представленные в. сборнике тезисов^ и в; виде постерного доклада на Европейском ежегодном респираторном, конгрессе, получен грант Европейского респираторного общества и фармацевтической компании Boehringer Ingelheim "The ERS COPD Research Travel Grant" в 2009 году.

Внедрение результатов исследования

Полученные результаты используются в работе отделения пульмонологии ОГУЗ Томская областная клиническая больница. Новые научные данные, полученные при выполнении исследования, используются в. учебном процессе: на. кафедре госпитальной^ терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, а также на кафедре внутренних болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 статьи в журналах из «Перечня .» ВАК РФ. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ ранней диагностики хронической обструктивной болезни легких» от 16 февраля 2011г. (заявка №2010122238/15(031550) от 31 мая 2010г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 57 таблиц и состоит из введения, обзора литературы (первая глава), клинических групп и методов исследования (вторая глава), результатов клинико-функциональных исследований (третья глава), результатов исследования индуцированной мокроты (четвертая глава), обсуждения результатов (пятая глава), выводов, практических рекомендаций, списка литературы.

Выводы, полученные в, совокупности предшествующих исследований, обосновывают ключевую, роль ТБ в постоянной регулярной терапии?больных с ХОБЛ при любой клинически значимой стадии болезни. В то же время, j полученные результаты в большей степени- подчеркивают способность ТБ обеспечивать длительный бронхорасширяющий. эффект, однако есть все основания полагать, что постоянная' терапия больных ХОБЛ ТБ сопровождается уменьшением воспаления в бронхиальном регионе. В частности на это указывают результаты клинических плацебо контролируемых исследований, продемонстрировавших способность долгосрочной терапии тиотропиумом увеличивать продолжительность периода до первого обострения, снижать выраженность симптомов обострений, и частоты госпитализаций по поводу обострений ХОБЛ [84], что в последствии было подтверждено и результатами крупнейшего в истории изучения ХОБЛ клинического исследования UPLIFT [164]'.

Кроме того в серии экспериментальных исследований in vitro и на лабораторных животных была продемонстрирована способность тиотропия бромида подавлять высвобождение эйкозаноидов эпителиальными клетками, а также снижать выделение факторов хемотаксиса нейтрофилов! • и эозинофилов альвеолярными макрофагами [13]. Также было выявлено дозо-и времязависимое угнетающее воздействие тиотропия бромида на ацетилхолининдуцированную хемотаксическую активность воспалительных клеток с высокой экспрессией МЗ-холинорецепторов в экспериментальных работах F. Buhling и соавторов [64]. В. свою очередь исследователи из Магдебурга (Германия) подчеркивают способность ТБ подавлять воспалительную реакцию посредством воздействия на мускариновые рецепторы клеток-эффекторов и снижения секреции медиаторов более чем на

70%, что может быть одним из объяснений влияния ТБ на частоту обострений ХОБЛ [64].

Еще в одном экспериментальном исследовании было доказано, что ТБ обеспечивает зависящее от дозы угнетение пролиферации фибробластов и миофибробластов, что объясняет положительное влияние препарата на процесс ремоделирования при ХОБЛ [145, 13].

Изучив эффекты ТБ в эксперименте на мышах, японские авторы делают вывод о том, что ТБ обладает противовоспалительным эффектом в отношении воспаления, вызванного табачным дымом и опосредованного АЦХ [154].

Важная роль повышения холинергического тонуса в воспалении и ремоделировании бронхиальной стенки при ХОБЛ была подтверждена молекулярными фармакологами из Нидерландов, которые показали, что АЦХ играет ключевую роль в воспалении и ремоделировании легких, а ТБ способен противостоять этим процессам [185].

В то же время отсутствие официальных данных клинических исследований о влиянии тиотропия бромида на факторы местного воспаления, развивающегося при ХОБЛ, включая его влияние на нейтрофильное звено воспаления, активность миелопероксидазы и катионного протеина нейтрофилов мокроты, недостаточность фактов о патогенетической обоснованности добавления тиотропиума в схему лечения пациентам, ранее получавшим комбинацию ИГКС и бета-2-агонстов — все это обосновывает актуальность дальнейших клинических исследований в этой области.

Исходя из этого, целью настоящего исследования явилось установление характеристики эффекторных клеток воспаления в индуцированной мокроте и динамики клинико-функциональных показателей у больных ХОБЛ стабильного течения для обоснования эффективности базисной терапии.

Для решения поставленных задач методом случайной выборки были набраны 3 группы больных (всего 78 человек): пациенты со стабильной ХОБЛ II стадии, ранее не получавшие базисную терапию (группа 1, п=21), пациенты со стабильной ХОБЛ III-IV стадий, ранее не получавшие базисную терапию ХОБЛ (группа 2, п=30), пациенты со стабильной' ХОБЛ III-IV стадий, применявшие ранее фиксированную комбинацию ФП/САЛ на протяжении не менее 6-ти месяцев (группа 3, п=27). Группа контроля представлена 26 мужчинами-добровольцами, средний возраст 36,4±1,9 лет (группа 4).

Исследование длительностью 3 месяца предполагало назначение всем пациентам ТБ (Спирива, Boehringer Ingelheim) 1 раз в сутки в дозе 18мкг ингаляционно, включало 2 визита с полным обследованием пациентов (до и после курса лечения) и 2 промежуточных визита. Для практически здоровых некурящих добровольцев (контрольная группа) обследование проводилось однократно.

В рамках исследования использовались клинико-анамнестические и функциональные методы, базирующиеся на современных руководствах по диагностике и лечению ХОБЛ, методы оценки качества жизни, а также цитологические, цитохимические и биохимические методы исследования маркеров хронического воспаления в бронхиальном регионе.

При анализе и сравнении клинико-анамнестических данных, полученных при включении больных в исследование и через 3 месяца терапии ТБ, выявлено, что во всех группах на всех стадиях заболевания происходит значительный регресс основной клинической симптоматики: уменьшилась интенсивность кашля, сократилась продукция мокроты, снизалась интенсивность одышки, стали более редкими или исчезли вовсе эпизоды дистанционно слышимых хрипов в груди и ночного удушья (р<0,05). Значительно уменьшился клинический индекс, как суммарный показатель выраженности респираторных симптомов (р<0,001) — в группе нативных пациентов со II стадией ХОБЛ (группа 1) на 48%, в группе пациентов с III-IV стадиями ХОБЛ, ранее не получавших базисную терапию (группа 2), на 47%, в группе пациентов с III-IV стадиями ХОБЛ, получавших ранее ФП/САЛ, а в течение основного этапа исследования ТБ и ФП/САЛ (группа 3), на 37%. Уменьшение выраженности основных респираторных симптомов на фоне лечения ТБ связано с блокадой М, и М3 холипорецепторов, следствием которой, прежде всего, является мощная и длительная бронходилатация.

Оценивая состояние больных до и после исследования, мы тщательно выясняли их суточную потребность в КДБА. С одной стороны, данный показатель весьма объективно отражает клиническое состояние пациента и характеризует качество получаемой базисной терапии, с другой стороны, высокая потребность в бета-2-агонистах зачастую является причиной развития ассоциированных с ними побочных эффектов. Поэтому важным достижением терапии ТБ явилось уменьшение суточного потребления КДБА в группе 1 в среднем на 3,2 дозы, в группе 2 - на 5,5 доз, в группе 3 - на 5,1 доз (р<0,01).

Необходимо отметить, что пациенты со II стадией ХОБЛ как до, так и после лечения по ряду клинико-анамнестических критериев отличались от пациентов с III-IV стадиями ХОБЛ (в частности, первые демонстрировали меньшую выраженность одышки, имели меньше эпизодов ночного удушья и дистанционно слышимых хрипов, характеризовались более низким клиническим индексом и потребностью в КДБА, имели меньшее количество обострений ХОБЛ и связанных с ними госпитализаций за предшествующий год, а также меньшую частоту обострений ХОБЛ за 3 месяца терапии ТБ) (р<0,05). Данные различия клинических показателей между группами были ожидаемы (поскольку группа 1 отличалась от групп 2 и 3 менее тяжелыми пациентами) и соответствовали задачам исследования — оценить клиническую эффективность ТБ в различных фармакотерапевтических режимах у пациентов с ХОБЛ разных степеней тяжести.

В качестве важных критериев эффективности терапии ТБ у пациентов с ХОБЛ в данном исследовании мы рассматривали значения пре- и: постбронходилатационных показателей ОФВг (преОФВ! и постОФВ)); а также их динамика на фоне лечения ТБ. На начало исследования группа Г (пациенты со II стадией ХОБЛ без базисной терапии) достоверно отличалась от групп 2 и 3 более высокими значениями (как абсолютными, так и по отношению к должным величинам) преОВФь и постОФВ! (р<0,05). Подобные различия наблюдались и по ФЖЕЛ — в группе 1 значения ФЖЕЛ (абсолютные и по отношению к должным величинам) были выше, чем в группах 2 и 3. Все это также объясняется менее тяжелым течением заболевания и не противоречит цели и задачам исследования. Кроме того, в данном исследовании нас более всего интересовала динамика скоростных показателей выдоха на фоне проводимой терапии ТБ.

На фоне 3-месячной терапии ТБ во всех группах пациентов было достигнуто достоверное' улучшение ФВД, выраженное в увеличении значений пре- и постбронходилатационных показателей ОФВ]. ПреОФВ) увеличился в группе 1 на 0,24±0,08 л (р=0,002), в группе 2 на 0,19±0,037 л (р=0,0001) и в группе З на 0,115±0,03 л (р=0,001). Показатель постОФВ] стал выше в группе 1 на 0,16±0,04 л (р=0,006), в группе 2 на 0,275±0,08 л (р=0,0001) и в группе 3 на 0,147±0,04 л (р=0,005). Следует отметить, что группа 1 через 3 месяца терапии ТБ по-прежнему отличалась более высокими значениями пре- и пост ОФВ1 (р<0,05).

Достигнутые во всех группах положительные изменения ФВД обусловлены в первую очередь основным эффектом ТБ — способностью эффективно и длительно расширять бронхи, улучшая вентиляционные показатели. Дополнительный вклад в увеличение вентиляционных показателей вносит уменьшение объема продуцируемой мокроты и улучшение ее реологии за счет блокады М3-холинорецепторов [179, 180].

Также отметим, что пациенты с ХОБЛ III-IV стадий, ранее не получавшие базисную терапию (группа 2) по динамике пре- и постОФВ! достоверно не отличались от пациентов с ХОБЛ III-IV стадий, ранее применявших ФП/САЛ (группа 3), что подчеркивает равную реализацию бронхорасширяющего эффекта ТБ независимо от предшествующей терапии ХОБЛ.

Для исследования физических возможностей у больных ХОБЛ использовался 6MWD-TecT (тесте с 6-минутной ходьбой), как наиболее простой и весьма информативный для оценки толерантности к физической нагрузке. В результате исследования было показано, что после проведенной 3-месячной терапии ТБ во всех Зтх группах получено статистически значимое увеличение пройденного пути в тесте с 6-минутной ходьбой (коэффициент достоверности между значениями до и после терапии ТБ во всех 3-х группах был меньше 0,05), что, безусловно, является отражением улучшения функции внешнего дыхания.

В начале исследования пациенты с III-IV стадиями ХОБЛ с базисной терапией ФП/САЛ (группа 3) демонстрировали достоверно более низкую сатурацию кислорода до и после нагрузочного теста по сравнению с пациентами с III-IV стадиями ХОБЛ без базисной терапии (группа 2) (р<0,05). Однако данная группа больных (группа 3) показала значимый прирост показателей сатурации кислорода (как до так и после нагрузки) через 3 месяца сочетанной терапии ТБ и ФП/САЛ (р<0,05). Данное улучшение на фоне применения ТБ вполне объяснимо, поскольку обусловлено повышением легочной вентиляции. Отметим, что в конце исследования по этим показателям Группа 3 достоверно не отличалась от группы 2 (р>0,05). В группах 1 и 2 динамика сатурации кислорода за 3 месяца лечения не была достоверной (р>0,05).

Всем пациентам до начала исследования предлагалось заполнить вопросник госпитальной шкалы тревоги и депрессии (ЕШЭ8). По результатам заполнения вопросника все 3 группы пациентов имели субклинически выраженную тревогу и достоверно между собой по этому показателю не различались (р>0,05). Выраженность депрессии в группах 1 и 3 была также субклинической (между собой группы не различались, р>0,05), а в группе 2 (пациенты с 1П-1У стадиями ХОБЛ без базисной терапии) депрессия характеризовалась как клинически выраженная. При повторном заполнении вопросника после проведенной терапии ТБ уровень тревоги у больных достоверно уменьшился в группах 2 и 3 до нормального уровня (р<0,05), а уровень депрессии снизился в группе 2 до субклинически выраженных значений, в группе 3 - до нормальных значений (р<0,05).

Анализируя выраженность тревоги и депрессии у пациентов с ХОБЛ, мы обратили внимание на наличие прямой корреляционной связи между уровнем тревоги и депрессии и тяжестью респираторных симптомов. Оказалось, что более тяжелой клинической картине заболевания (как по некоторым отдельным симптомам, так и по клиническому индексу) соответствует более высокие значения тревоги и депрессии.

Уровень тревоги и депрессии у больных хроническими заболеваниями связан с целым комплексом переживаний за собственное настоящее и будущее. Выраженность тревоги и депрессии напрямую зависит от общего состояния больного, его работоспособности, способности обслуживать себя. Уменьшение выраженности одышки, повышение толерантности к физической нагрузке при длительном применении тиотропиума - вот, что, в первую очередь, благоприятно сказывается на настроении больных, способствует устранению депрессивного и тревожного состояния.

Комплексно качество жизни у пациентов с ХОБЛ оценивалось с помощью вопросника 8Б-36. Данный вопросник, валидизированный в странах Европы и США, является весьма объективным средством для определения качества жизни больных, позволяет выявлять проблемы в различных областях человеческой жизни и быта. Но особую ценность использование вопросника ББ-Зб представляет для оценки динамики качества жизни на фоне проводимой длительной терапии.

На начало исследования все 3 группы больных по большинству показателей качества жизни, представленных в вопроснике ББ-Зб, достоверно не различались (р>0,05). При повторном заполнении вопросника через 3 месяца терапии ТБ были отмечены значимые положительные изменения в оценке пациентами качественных характеристик собственной жизни. Так, по результатам вопросника, общее состояние здоровья достоверно улучшилось у пациентов групп 1 (II стадия ХОБЛ без предшествующей базисной терапии) и 3 (Ш-1У стадии ХОБЛ, на предшествующей терапии ФПУСАЛ) (р<0,05). Также во всех 3-х группах после 3-х месяцев лечения ТБ выросли показатели физического функционирования, ролевого функционирования, обусловленного физическим и эмоциональным состоянием (р<0,05), также уменьшилась выраженность общего восприятия физической боли (р<0,05). Отметим также увеличение значения показателя психического здоровья у больных в группах 1 и 2 (р<0,05), увеличение жизненной активности в группе 2 (больные ХОБЛ Ш-ГУ стадий без предшествующей терапии) (р<0,05).

Таким образом, назначение длительной поддерживающей терапии тиотропиумом больным ХОБЛ как в качестве монотерапии, так и в сочетании с фиксированной комбинацией ФП/САЛ, независимо от наличия или отсутствия предшествующего базисного лечения позволяет существенно улучшить основные составляющие качества жизни у пациентов любой степени тяжести. выраженности респираторных симптомов и клинического индекса в целом у больных ХОБЛ как до, так и после терапии ТБ, соответствовали более низкие значения основных показателей качества жизни.

Дальнейший анализ включал в себя индуцирование и цитологическое исследование мокроты у пациентов со стабильной ХОБЛ. Наше исследование подтвердило данные ряда авторов о том, что получение индуцированной мокроты (ИМ) — неинвазивная и безопасная процедура [67].

Эта методика забора мокроты была выбрана по ряду причин. Во-первых, индуцированная мокрота это техника, которая предоставляет образец воспалительной среды больших и малых воздушных путей и, таким образом, обеспечивает идеальные пробы клеток из более широкой зоны, чем в | случаях, например, с биопсиями. Известно, что больные ХОБЛ } продуцируют мокроту самопроизвольно [106]. А ингаляцию гипертоническим раствором соли в настоящее время используют для сбора мокроты из воздушных путей от субъектов, кто не продуцирует мокроту самопроизвольно [54].

Из литературных данных известно, что клеточно-биохимические показатели самопроизвольно индуцируемой мокроты адекватно отражают процесс воспаления в бронхолегочном регионе. Однако, клеточная жизнеспособность в спонтанной мокроте ниже, чем в индуцированной и качество образцов беднее, особенно у пациентов с более тяжелым заболеванием [62].

Мокроту удалось получить у всех пациентов, включенных в исследование. Ни у кого из пациентов не возникло осложнений в процессе получения ИМ.

При проведении цитологического исследования индуцированной мокроты мы обращали особое внимание на содержание в мазках макрофагов, нейтрофилов, оценивали бактериальную обсемененность и степень дегенерации нейтрофилов. Стабилизация нейтрофилов, уменьшение их количества и увеличение количества полноценных макрофагов, снижение бактериальной контаминации - все это может свидетельствовать об угасании активности воспаления в бронхолегочном регионе.

В данной работе обнаружено, что в индуцированной мокроте пациентов с ХОБЛ подавляющее большинство клеток представлено нейтрофилами, как в начале исследования, так и через 3 месяца терапии ТБ. В начале исследования больные ХОБЛ на всех стадиях отличались от здоровых некурящих более выраженной дегенерацией нейтрофилов индуцированной мокроты, большей интенсивностью бактериальной обсемененности, большим количеством эозинофилов в мокроте, а также большим содержанием апотозных нейтрофилов (р<0,05).

Отметим, что в группе пациентов с тяжелой и очень тяжелой ХОБЛ индуцированная мокрота отличалась большим количеством нейтрофилов по сравнению со здоровыми пациентами (р<0,05). При этом содержание нейтрофилов у пациентов с ХОБЛ II стадии (группа 1) до лечения ТБ было ниже, чем у пациентов с ХОБЛ Ш-1У стадий (группы 2 и 3) (р<0,05). Также группа 1 характеризовалась меньшей бактериальной обсемененностью мокроты по сравнению с группой 2 и более высоким содержанием макрофагов в мокроте (почти в 3 раза) в сравнении с группой 3 (р<0,05). Полученные на старте исследования результаты были ожидаемы и согласовались с результатами, описанными национальных и международных исследований в этой области — более тяжелой ХОБЛ соответствует большая обсемененность мокроты бактериями, обилие нейтрофилов (высокая активность нейтрофильно-бактериального воспаления) и небольшое количество макрофагов (рассогласование нейтрофильной и макрофагальной фаз воспаления).

При сравнении индуцированной мокроты больных ХОБЛ через 3 месяца терапии ТБ с мокротой практически здоровых некурящих добровольцев мы получили достоверные различия по тем же показателям, что и в начале исследования. Также отметим отсутствие статистически значимой динамики внутри групп по большинству показателей за исключением достоверного снижения интенсивности бактериальной обсемененности* (р<0^05) в группе 2 (больные ХОБЛ 1Н-1У стадий, получавшие во время исследования терапию ТБ и ФП/САЛ). Являясь мощным и длительно расширяющим бронхи препаратом, нормализуя секрецию и качество мокроты, ТБ способствует улучшению дренажной функции легких, снижая, тем самым, и бактериальную нагрузку.

В нашей работе целый раздел исследований посвящен изучению нейтрофилов индуцированной мокроты, поскольку именно эта клетка является ключевой фигурой в реализации и закреплении порочного круга воспаления при ХОБЛ. Известно, что нейтрофил происходит из костного мозга, где дифференцируется в течение периода от 7 до 10 дней от промиелобласта до зрелой клетки. В течение этого периода нейтрофил производит свой полный набор преформированной нейтрофильной эластазы и протеиназ и запасает ферменты внутри первичных или азурофильных гранул [87]. С этого времени далее не существует продукции этих ферментов. Зрелый нейтрофил выпускается в циркуляцию, где имеет короткий период жизни, на протяжении которого, он привлекается к воспаленным участкам или стареет и устраняется. Постоянное пополнение нейтрофилов — сложный ход событий, результатом которого является миграция клеток в ткани в ответ на присутствие в них стимулирующего фактора, например бактериального агента, ирритантов табачного дыма. Процесс миграции связан с активацией нейтрофилов, которая ведет к мобилизации азурофильных гранул и их экзоцитозу с выделением энзимного содержимого [138]. Исчерпывая вследствие экзоцитоза свой ферментативный запас, такой нейтрофил не только создает условия для мощного воспалительного ответа в тканях, но и фактически теряет собственную функциональную активность. Обилие опустошенных мелких нейтрофилов, практически не содержащих миелопероксидазу и катионный протеин, -типичная картина в индуцированной мокроте при тяжелом/очень тяжелом течении ХОБЛ. Последующая судьба таких клеток — гибель путем апоптоза или некроза.

В нашей работе мы также подтвердили важность роли нейтрофилов при ХОБЛ, обнаружив корреляционные отношения между их количеством в индуцированной мокроте и некоторыми клинико-функциональными характеристиками. Количество нейтрофилов в мокроте прямо коррелирует с выраженностью кашля, частотой эпизодов ночного удушья, и обратно соотносится с сатурацией кислорода до и после проведения теста с 6-минутной ходьбой, с показателями пре- и постбронходилатационных ОФВ,.

В рамках цитохимического исследования нейтрофилов индуцированной мокроты определялось содержание миелопероксидазы (МПО) и катионного протеина (КП) до и после терапии ТБ. При сравнении активности нейтрофильной миелопероксидазы и катионного протеина в индуцированной мокроте больных ХОБЛ и практически здоровых некурящих добровольцев в начале исследования было обнаружено, что нейтрофилы в мокроте здоровых лиц отличались большим содержанием данных ферментов (р<0,05 для всех групп). После проведенного курса лечения ТБ уровень МПО внутри клеток стал существенно выше во всех группах (получена статистически значимая динамика, р<0,05) и различия с группой здоровых некурящих добровольцев при повторном исследовании оказались статистически незначимыми (р>0,05 для всех групп). Также через 3 месяца лечения ТБ значительно повысилось и содержание катионного протеина в нейтрофилах мокроты пациентов с ХОБЛ всех групп (р<0,05). Оказалось, что активность катионного протеина в нейтрофилах индуцированной мокроты Групп 1 и 3 была достоверно выше, чем в группе здоровых некурящих добровольцев (р<0,05). При сравнении активности катионного протеина в нейтрофилах мокроты здоровых некурящих лиц и группы 2 статистически значимых различий получено не было (р=0,41).

С прогностической точки зрения, концентрация нейтрофильных внутриклеточных цитоферментов — миелопероксидазы и катионных протеинов — достаточно точный биомаркер активности воспаления в бронхолегочном регионе, чувствительный к проводимой базисной-терапии. В частности, на это указывают и выявленные корреляции с клинико-функциональными характеристиками ХОБЛ, а именно, связи концентрации катионных протеинов, миелопероксидазы в нейтрофилах индуцированной мокроты с потребностью в бета-2-агонистах короткого действия, выраженностью депрессии, показателями функции внешнего дыхания и качества жизни, толерантностью к физической нагрузке. Так, меньшей концентрации миелопероксидазы и катионных протеинов в нейтрофилах индуцированной мокроты соответствует более высокая потребность в КДБА, более выраженная депрессия, худшие показатели качества жизни и функции внешнего дыхания.

Мы также обратили внимание на то, что помимо "накопления" ферментов в цитоплазме нейтрофилов вследствие 3-х месяцев терапии ТБ сами клетки отличались более крупным размером, увеличенным объемом цитоплазмы и низким отношением площади ядра к площади цитоплазмы. Действительно, до начала исследования н'ейтрофилы ИМ больных ХОБЛ отличались от нейтрофилов группы здоровых некурящих лиц — у больных они были мелкими с малым содержанием цитоплазмы и высоким ядерно-цитоплазматическим индексом (р<0,05). Такие нейтрофилы у пациентов с ХОБЛ можно охарактеризовать как функционально неактивные клетки, готовящиеся к апоптозу. Однако после 3-х месяцев лечения ТБ у всех групп пациентов независимо от сопутствующей терапии мы получили увеличение среднего размера нейтрофилов и значимое уменьшение ядерноцитоплазматического соотношения вследствие увеличения содержания цитоплазмы в клетках (р<0,05).

Отмечены корреляции между размером, нейтрофилов индуцированной мокроты, площадью их цитоплазмы, величиной ядерно-цитоплазматического индекса и клинико-функциональными характеристиками ХОБЛ. Властности, выявлена обратная корреляция размера нейтрофилов и их цитоплазмы с отхождением мокроты за сутки, с клиническим индексом совокупности респираторных симптомов, отражающим тяжесть течения ХОБЛ. Также обнаружена обратная корреляция между размером цитоплазмы нейтрофилов индуцированной мокроты и показателем психического здоровья (МН). Большему значению ядерно-цитоплазматического индекса в нейтрофилах мокроты соответствует более выраженная тревога у пациентов с ХОБЛ.

Увеличение содержания МПО и КП в цитоплазме нейтрофилов, увеличение объема цитоплазмы и размеров самих нейтрофилов обусловлено снижением активности экзоцитоза, что, в свою очередь, мы связываем со снижением интенсивности местного воспаления под действием терапии ТБ. Снижение интенсивности экзоцитоза нейтрофильных ферментов с мощным^ цитотоксическим потенциалом во внеклеточную среду - важное свидетельство подавления активности воспалительного процесса, возможно, создающее условия для предотвращения дальнейшего прогрессирования болезни.

Согласно литературным данным несколько механизмов вовлечены в развитие болезни: приток воспалительных клеток в легкие (ведущее к хроническому воспалению воздушных путей), дисбаланс между протеолитической и антипротеолитической активностью (результатом чего является деструкция здоровой легочной ткани) и оксидативный стресс. Увеличивающееся количество данных поддерживает еще один важный механизм, вовлеченный в развитие ХОБЛ: повышенное содержание апоптозных клеток в легких, что может быть пиковым событием в патогенезе заболевания [81]. Высокая концентрация апоптозных лейкоцитов, в частности нейтрофилов, может вести к накоплению в регионе воспаления веществ с выраженными в отношении тканей разрушающими свойствами: кислородных метаболитов и протеолитических энзимов [110]. Это обясняет тот факт, что апоптозные клетки всех типов1 могут быть способны изменять (разрушать) ткани, если не удаляются без промедления [171].

Апоптозные клетки (в том числе и нейтрофилы) должны своевременно распознаваться и удаляться макрофагами. Если это поглощение апоптозных клеток макрофагами не происходит до стадии мембранной нестабильности, то в окражающие ткани поступают вещества с агрессивными свойствами в отношении биологических структур органа. Следует отметить, что завершенный эффероцитоз возможен только при условии высокой активности макрофагов. Внешне полноценные, способные к фагоцитозу макрофаги — крупные клетки со значительным преобладанием размеров цитоплазмы над размерами ядра, а, значит, с низким ядерно-цитоплазматическим индексом.

Интересные данные были получены нами при анализе отношений между количеством макрофагов в индуцированной мокроте клинико-функциональными характеристиками ХОБЛ. Так большему количеству макрофагов в мокроте соответствует меньшая частота эпизодов ночного удушья, меньшее значение клинического индекса, отражающего совокупную тяжесть респираторных симптомов, а также более высокие значения* сатурации кислорода до и после ходьбы в тесте с 6-минутной ходьбой, и более высокие показатели функции внешнего дыхания (значения пре- и постОВФО.

При цитоморфометрическом исследовании макрофагов ИМ мы обнаружили, что на начало исследования макрофаги мокроты здоровых лиц отличались от макрофагов больных ХОБЛ большими размерами клеток и значимым преобладанием площади цитоплазмы над размером ядра (р<0,05 для всех групп). Ядерно-цитоплазматическое отношение для данных клеток в группе здоровых добровольцев было достоверно ниже по сравнению с ядерно-цитоплазматическим индексом макрофагов больных .ХОБЛ (р<0,05 для всех групп). Подобные результаты вполне закономерны, если исходить из концепции, что на фоне-активного хронического воспаления, вследствие недостаточности собственных тканевых макрофагов наблюдается существенная миграция в ткань моноцитов из периферической крови. Отталкиваясь от этой концепции, клетки, обнаруженные в мокроте при клинически выраженной ХОБЛ, макрофагами как таковыми не являются. Эти малые, с небольшим содержанием цитоплазмы клетки — не что иное, как призванные на фронт воспаления моноциты, которые, однако, в силу своей морфологической и функциональной1 незрелости оказываются неспособными обеспечивать полноценный завершенный эффероцитоз клеток (в том числе и нейтрофилов).

После курса лечения ТБ отмечалось статистически значимое увеличение среднего размера макрофагов, площади цитоплазмы в них в мокроте во всех группах пациентов (р<0,05). Также закономерно уменьшилось и среднее значение ядерно-цитоплазматического соотношения для макрофагов во всех группах (р<0,05). Данные изменения, выявленные при исследовании макрофагов индуцированной мокроты у больных ХОБЛ, мы считаем важным критерием, и следствием снижения активности воспаления в бронхолегочном регионе на фоне терапии ТБ. Снижение активности воспаления в бронхах, с одной стороны, уменьшает приток функционально неспособных к макрофагоцитозу моноцитов, а, с другой стороны, создает условия для созревания и полноценной дифференцировки локального пула альвеолярных макрофагов. Данное утверждение подтверждается и выявленными корреляциями между размером макрофагов, величиной их ядерно-цитоплазматического отношения и некоторыми клинико-функциональными характеристиками ХОБЛ. Так, большему размеру макрофагов в индуцированной мокроте соответствует меньший клинический индекс, отражающий тяжесть респираторных симптомов ХОБЛ, а меньшему значению ядерно-цитоплазматического индекса в макрофагах индуцированной мокроты - большая частота эпизодов ночного удушья.

Особый интерес в исследовании заболеваний< легких, в том числе и ХОБЛ, имеет оценка системы «протеиназы - ингибиторы». Одновременное присутствие в трахеобронхиальном секрете протеолитических ферментов и их ингибиторов создает динамическую систему взаимодействия факторов, направленных с одной стороны на противомикробную защиту (протеолиз белков микроорганизмов), с другой - на нейтрализацию собственных протеиназ с целью предупреждения аутолиза тканевых белков [2].

Измерение активности протеолитических ферментов рассматривается как показатель интенсивности воспалительного процесса. Однако при ХОБЛ происходит нарушение динамического равновесия "протеиназы -ингибиторы", что приводит к деструкции связи коллаген-эластин, нарушению вентиляционной функции легких [12, 14].

A.A. Смотрова, 2009г. указывает на существенное снижение активности эластазы, трипсиноподобных протеиназ и повышение активности антипротеиназ ( al-протеиназный ингибитор, а2-макроглобулин) у больных с обострением ХОБЛ по мере стабилизации состояния и разрешения обострения. Также она отмечает снижение активности кислотостабильных ингибиторов в мокроте у больных ХОБЛ на момент выписки из стационара по сравнению с результатами, полученными при поступлении пациентов в клинику в состоянии обострения средне-тяжелой или тяжелой степени [34]. В нашей работе мы не получили статистически значимых изменений активности протеиназ-антипротеиназ в мокроте больных ХОБЛ за 3-месячный период лечения ТБ (р>0,05). Возможно отсутствие достоверной положительной динамики протеиназ-антипротеиназную активности мокроты связано с тем, что пациенты включались в исследование в стабильный период течения ХОБЛ. Отсутствие значимых колебаний активности в данной системе ферментов, на наш взгляд, лишь подчеркивает стабильность заболевания, поддерживаемую адекватной терапией.

Нами не получены данные свидетельствующие о влиянии ТБ на такие показатели оксидант/антиоксидантной системы как МДА, каталаза в индуцированной мокроте. Во всех группах на всех стадиях заболевания уровень этих ферментов достоверно не изменился (р>0,05). Однако подавляющее большинство пациентов продолжало курить. Некоторыми исследователями подтверждается, что на фоне курения отмечается стабильно высокий уровень МДА [51, 101]. В связи с этим отсутствие статистически значимого снижения концентрации малонового диальдегида в индуцированной мокроте у исследованных нами пациентов может быть объяснено продолжающимся действием факторов табачного дыма.

В то же время мы выявили корреляции активности каталазы и МДА с некоторыми клинико-функциональными характеристиками ХОБЛ. Так, активность малонового диальдегида обратно соотносится с такими показателями качества жизни, как психическое здоровье и жизненная активность. Активность каталазы мокроты прямо коррелирует с клиническим индексом, потребностью в бета-2-агонистах короткого действия и выраженностью депрессии, обратно коррелирует с сатурацией кислорода до и после теста с 6-минутной ходьбой, дистанцией, пройденной пациентом при ходьбе, показателем физического функционирования (РБ). Подобные взаимоотношения между каталазой и клинико-функциональными показателями могут быть объяснены тем, что оксидативный стресс на фоне активного воспаления в бронхах при ХОБЛ сопровождается компенсаторным ростом активности антиоксидантных ферментов, в том числе и каталазы. Таким образом, повышение активности каталазы индуцированной мокроты может расцениваться как маркер воспалительной активности в бронхолегочном регионе.

В конце исследования мы просили пациентов охарактеризовать изменения, произошедшие с ними за предшествующий(е) месяц(ы). Подавляющее большинство пациентов, получавших ТБ, отвечали типовыми фразами: ."я чувствую, что лечение мне помогает", "у меня уменьшилась одышка", "мне стало* легче дышать", "я преодолеваю больший» путь по лестнице без одышки", "я стал больше работать по дому", "я перестал чувствовать себя обузой", "у меня появился интерес к жизни". Действительно, самое худшее для пациента с хроническим заболеванием, подобным ХОБЛ, - ощущение собственной неполноценности и ожидание того, что завтрашний день будет хуже, тяжелее предыдущего. В этом отношении, ТБ, обладая сравнительно высоким профилем безопасности и возможностью сочетанного применения с другими группами препаратов, предназначенных для лечения ХОБЛ, демонстрирует выраженный и устойчивый бронходилатационный эффект, гарантируя стабильное удовлетворительное состояние больного в долгосрочной перспективе.

Таким образом, выполненное исследование предоставило новую научную информацию, о клинической эффективности тиотропия бромида и его влиянии на качество жизни у пациентов со стабильной ХОБЛ, а также о патогенетической целесообразности его назначения как в случае стартовой терапии, так и в качестве дополнения к ранее начатому лечению фиксированной комбинацией флутиказона пропионата и салметерола. Это обусловлено реализацией противовоспалительного эффекта при регулярном применении тиотропиума. Показано влияние тиотропия бромида на морфофункциональные характеристики эффекторных клеток, играющих ключевые роли в формировании и поддержании воспаления в бронхах при хронической обструктивной болезни легких Выводы

1. При назначении тиотропия бромида в качестве длительной поддерживающей терапии как пациентам с ХОБЛ П-1У стадий, ранее не получавшим базисную терапию (в режиме монотерапии), так и больным ХОБЛ III-IV стадий, получающим фиксированную комбинацию флутиказона пропионат/салметерол (в режиме сочетанной терапии) происходит уменьшение выраженности основных симптомов заболевания, существенно снижается суточная потребность в бета-2-агонистах короткого действия, улучшаются показатели ФВД, увеличивается толерантность к физической нагрузке, снижается уровень тревоги и депрессии (при тяжелой и очень тяжелой ХОБЛ), улучшаются показатели качества жизни пациентов с ХОБЛ II-IV стадий.

2. Биомаркеры воспаления в индуцированной мокроте больных ХОБЛ (содержание нейтрофилов и макрофагов, цитоморфометрические характеристики нейтрофилов и макрофагов, активность миелопероксидазы и катионных протеинов нейтрофилов, активность малонового диальдегида и каталазы), отражающие активность воспаления в бронхах, коррелируют с клинико-функциональными характеристиками болезни (выраженность респираторных симптомов, потребность в бета-2-агонистах короткого действия, параметры функции внешнего дыхания, толерантность к физической нагрузке, показатели качества жизни, выраженность тревоги и депрессии).

3. Назначение тиотропия бромида в качестве регулярной поддерживающей терапии пациентам с ХОБЛ как в режиме монотерапии, так и в сочетании с фиксированной комбинацией флутиказона пропионат/салметерол, сопровождается положительной динамикой биомаркеров воспаления в бронхолегочном регионе -повышением содержания миелопероксидазы и катионных протеинов в нейтрофилах, увеличением размера нейтрофилов и макрофагов, объема цитоплазмы этих клеток, снижением ядерно-цитоплазматического отношения.

4. При назначении титропия бромида пациентам с ХОБЛ не выявлена значимая динамика протеиназ-антипротеиназной и оксидант-антиоксидантной активности индуцированной мокроты.

5. Положительная динамика клинико-функциональных показателей при добавлении тиотропия бромида в схему регулярной поддерживающей терапии наблюдается у пациентов с ХОБЛ независимо от режима предшествующего лечения (как у пациентов, не имеющих анамнеза регулярной поддерживающей терапии, так и больных ХОБЛ, ранее получавших фиксированную комбинацию флутиказона пропионат/салметерол).

6. Положительные изменения морфофункциональных характеристик макрофагов и нейтрофилов индуцированной мокроты, отражающие стабилизацию воспаления в бронхолегочном регионе, отмечены во всех группах пациентов с ХОБЛ независимо от режима предшествующего лечения при добавлении тиотропия бромида в схему регулярной поддерживающей терапии.

Практические рекомендации:

1. При выборе стартовой терапии больных клинически выраженной ХОБЛ стабильного течения следует отдавать предпочтение тиотропия бромиду, учитывая патогенетическую обоснованность его назначения, а также высокую клиническую эффективность и благоприятный профиль безопасности.

2. Всем пациентам со стабильной ХОБЛ, ранее применявшим в качестве поддерживающей терапии комбинацию флутиказона пропионат / салметерол, следует добавить тиотропия бромид в схему регулярного лечения при отсутствии индивидуальных противопоказаний.