Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Гормональный и инфекционный факторы канцерогенеза органов женской репродуктивной системы

На правах рукописи

БАБАЕВА Наталия Александровна

Гормональный и инфекционный факторы канцерогенеза органов женской репродуктивной системы

14.01.12. - онкология 14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор - член - корреспондент РАМН, профессор Солодкий В.А.)

Научные консультанты:

Член-корреспондент РАМН, профессор Солодкий Владимир Алексеевич Член-корреспондент РАМН, профессор Ашрафян Левой Андреевич

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, профессор, Серов Владимир Николаевич ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинаталогии им.В.И. Кулакова» Минздрава России, организационно - методический отдел, главный научный сотрудник

Доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Виктор Васильевич ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН, отделение гинекологии, заведующий отделением

Доктор медицинских наук, профессор Максимов Сергей Янович ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России, отделение онкогинекологии, руководитель отделения

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им.Н. И. Пирогова» Минздрава России

на заседании Диссертационного Со _ ____г__лого государственного

бюджетного учреждения «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения России (117997, Москва, улица Профсоюзная, 86)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения России (117997, улица Профсоюзная, 86)

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Цаллагова Земфира Сергеевна

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА 2013

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Последние десятилетия, несмотря на неоспоримые достижения современной медицины, отмечается неуклонный рост числа онкологических, в том числе и онкогинекологических заболеваний. С начала 2000-х годов в России ежегодно регистрируются более 450 000 новых случаев злокачественных новообразований. Рак молочной железы является ведущей онкологической патологией у женского населения России, составляя 20,5% всех злокачественных процессов у женщин, опухоли тела матки в 2010г. в России составили 7,1%, шейки матки - 5,3%, яичников - 4,7% (Давыдов М.И., Аксель Е.М, 2011).

В конце XX века рак органов женской репродуктивной системы (РОЖРС), включая рак молочной железы (РМЖ), яичников (РЯ) и эндометрия (РЭ), во всем мире стал одним из наиболее значимых факторов отрицательных демографических тенденций. Заболеваемость и смертность от этих новообразований стремительно растет. Так, с 1990 по 2000 год число заболевших РОЖРС увеличилось на 19,2%, а умерших - на 24,1%. Ежегодная заболеваемость РОЖРС в России составляет 100 на 100 тыс. женского населения, а смертность от него - 70 на 100 тыс. женского населения (Давыдов М.И., Аксель Е.М, 2011).

Следующий факт, требующий своего осмысления - это то, что у преимущественного числа женщин злокачественный процесс развивается на фоне менопаузы. По данным статистических исследований более чем у 78% больных злокачественный процесс диагностируется после 50 лет (Кузнецов В.В. 2007).

Бурное развитие теоретических и прикладных аспектов клинической онкогенетики и молекулярной медицины позволяет пересмотреть с новых позиций ряд уже установившихся понятий в отношении этиологии, патогенеза и принципов профилактики РОЖРС.

В этиологии патологических процессов в течение долгого времени доминировал принцип монокаузапьности. Этому способствовали открытия в микробиологии и вирусологии, которые наложили свой отпечаток в трактовке причин неинфекционных заболеваний. Вот уже более века в онкологии предпринимаются попытки сформировать четко обозначенную причину развития опухолевого процесса. В настоящее время не вызывает сомнений, тот факт, что при различных локализациях опухолей, причины, вызывающие развитие злокачественного процесса, различны и многообразны. На основе анализа современного состояния проблемы, можно выделить пять основных факторов инициации канцерогенеза в органах репродуктивной системы (Ашрафян JI.A., Киселев В.И., 2009):

1) герминальные мутации генов BRCA1 и BRCA2 (Breast Cancer Associated), обуславливающие наследственную предрасположенность к развитию ряда опухолевых заболеваний репродуктивных органов;

2) пониженное (меньше 2:1) соотношение "физиологического" и "канцерогенного" метаболитов эстрогенов: 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1) и 16а-гидроксиэстрона (16а-ОНЕ1), характеризующее состояние

з

гормонального (эстрогенного) баланса в женском организме и определяющее риск развития опухолей в эстроген - зависимых органах и тканях;

3) эпигенетические нарушения (аномальное метилирование) в опухоль - супрессорных генах, возникающие на ранних стадиях процесса опухолеобразования и способствующие повышению малигнизирующей активности клеток - мишеней;

4) хронические воспалительные заболевания в органе - мишени как одно из наиболее ранних событий в канцерогенезе;

5) инфекционный фактор.

С нашей точки зрения, учитывая варианты гомеостаза женской репродуктивной системы и особенности микробиоценоза в разные периоды жизни, наиболее значимые направления, требующие сегодня пристального внимания это эндокринологическое и инфекционное.

Говоря об эндокринологической части проблемы, следует указать на отсутствие до настоящего времени обоснованной концепции роли гормонального фактора в механизмах канцерогенеза у пациенток постменопаузального возраста. Очевидно, что понимание роли гормональной составляющей в постменопаузе, является ключом к формированию и развитию патогенетической профилактики спорадического рака.

Инфекционная составляющая канцерогенеза хорошо представлена на модели рака шейки матки (РШМ), где доказана причастность вируса папилломы человека (ВПЧ) к развитию злокачественного процесса (H.Zur-Hauzen, 1978, 1999, 1984). Появился ряд сообщений о значимости ВПЧ в развитии рака вульвы (Sutton G.P. et al, 1988; Ашрафян J1.A. с соавт. 2002, 2003, 2005). Наряду с этими данными, при, казалось бы, очевидности проблемы остается открытым вопрос, какие факторы, кроме вируса задействованы или являются необходимой составляющей вирусного канцерогенеза. Известно, что вирусоносительство в женской популяции широко распространено (от 35 до 55%) (Schiffman М.Е. et al, 1993; Parkin D.M., 2002), злокачественный же процесс развивается лишь в единичных случаях. В этом плане, мы считаем, чрезвычайно интересным и важным сопоставить данные об инфекционной составляющей при различных локализациях опухолей и их гормональном гомеостазе. Под термином «гормональный гомеостаз» в постменопаузе мы, прежде всего, понимаем два важных компонента:

- уровень рецепторов в органах-мишенях в постменопаузальном периоде;

- уровень экспрессии эстрогенных метаболитов (16а-ОНЕ1 и 2-ОНЕ1).

Многочисленные исследования свидетельствуют, что основным фактором,

стимулирующим клетки эстроген - зависимых органов (молочные железы, эндометрий, шейка матки, вульва) к патологическому росту в постменопаузе, является не сам уровень эстрадиола, а нарушение баланса его метаболитов, имеющих разную способность к активации клеточной пролиферации (Ашрафян JI.A., Киселев В.И., Муйжнек Е.Л., 2009, Clemons М., Goss Р., 2001, Aubom KJ. et al, 2003). К настоящему времени многочисленными исследованиями установлено, что в случае повышенного содержания 16а-гидроксиэстрона, патологические пролиферативные процессы в гормон - зависимых органах и тканях многократно

усиливаются. Нарушение гормонального баланса в организме, а именно нарушение соотношения 2- и 16а- гидроксипроизводных, становится актуальной эндокринологической составляющей канцерогенеза в женской популяции (Ашрафян J1.A., Киселев В.И., 2009; demons М„ 2001; Muti P., Bradlow HL., 2000).

Представляется важным на основе современных методологий, на одном клиническом материале обозначить эти два направления и убедиться в их реальной значимости и, исходя из полученных данных, сформировать концепцию облигатного предрака для органов репродуктивной системы и обозначить пути патогенетической профилактики.

Цель исследования: формирование этиопатогенетической концепции рака женской репродуктивной системы, исходя из наличия инфекционной и/или гормональной составляющей канцерогенеза и обоснование принципов патогенетической профилактики.

Задачи исследования

1. Изучить роль инфекционного и гормонального факторов в развитии склеротического лишая и рака вульвы (спектр инфекционных агентов, уровень метаболитов, уровень стероидных рецепторов, экспрессия белка Е 7).

2. Изучить экспрессию белка Е 7, как основного и раннего маркера канцерогенеза, при различных патологических процессах шейки матки.

3. Изучить роль инфекционного и гормонального факторов при атипической гиперплазии и раке эндометрия (спектр инфекционных агентов, уровень метаболитов, уровень стероидных рецепторов).

4. Изучить роль инфекционного и гормонального факторов при цистаденомах, пограничных опухолях и раке яичников (спектр инфекционных агентов, уровень метаболитов, экспрессия белка Е 7).

5. Изучить роль инфекционного и гормонального факторов при мастопатиях и раке молочной железы (спектр инфекционных агентов, уровень метаболитов, уровень стероидных рецепторов, экспрессия белка Е 7)

6. Обосновать концепцию облигатного предрака органов репродуктивной системы (вульва, шейка матки, эндометрий, яичники, молочная железа)

7. Обосновать принципы ранней диагностики и патогенетической профилактики рака репродуктивных органов.

Научная новизна

• в работе установлена роль инфекционной и гормональной составляющей при различных локализациях опухолей женской репродуктивной системы;

• определена значимость различных факторов канцерогенеза при различных нозологиях рака репродуктивных органов;

• сформулирована концепция облигатного предрака органов женской репродуктивной системы, исходя из сочетаний различных патогенетических факторов;

• разработаны пути патогенетической профилактики рака репродуктивных органов

Практическая значимость

Сформированная концепция облигатного предрака органов репродуктивной системы позволяет целенаправленно формировать группы повышенного риска развития злокачественных опухолей у женщин в постменопаузе. У данного контингента пациенток с высокой эффективностью могут быть реализованы принципы мониторинга, методы ранней диагностики и обоснованы принципы патогенетической профилактики.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гормональная составляющая постменопаузального канцерогенеза в органах репродуктивной системы у женщин зависит от рецепторного статуса органов-мишеней и особенностей метаболизма эстрогенов:

• высокий уровень эстроген - рецепторов в сочетании с высоким уровнем экспрессии 16а-ОНЕ1 формируют канцерогенез через этап гиперпластического процесса;

• низкий уровень эстроген - рецепторов или нормальные значения эстрогенных метаболитов формируют канцерогенез в условиях хронического воспаления на фоне атрофического процесса;

2. При спорадическом раке вульвы, шейки матки и яичников инфекционная составляющая канцерогенеза представлена различными генотипами вируса папилломы человека.

3. Ко-факторами, определяющими канцерогенез спорадического постменопаузального рака репродуктивных органов являются:

• при раке вульвы - уровень эстроген - рецепторов, низкий коэффициент соотношения метаболитов (2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1), наличие вируса папилломы человека, хроническое воспаление на фоне длительной дистрофии вульвы (склеротический лишай);

• при раке шейки матки - наличие вируса папилломы человека и высокий уровень метаболита 16а-ОНЕ1;

• - при раке эндометрия - уровень эстроген - рецепторов, низкий коэффициент соотношения метаболитов (2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1), хроническое воспаление на фоне длительной атрофии эндометрия;

• - при раке яичников - большое число овуляторных циклов, низкий коэффициент соотношения метаболитов (2-ОН/16а-ОНЕ1), хронический воспалительный процесс, сочетающийся с наличием папилломавирусной инфекции;

• - при раке молочной железы - уровень эстроген - рецепторов, низкий коэффициент соотношения метаболитов (2-ОН/16а-ОНЕ1);

4. Патогенетическая профилактика спорадического рака репродуктивных органов должна формироваться задолго до наступления постменопаузы и включать профилактику папилломавирусной инфекции, снижение числа овуляторных циклов, контроль индекса массы тела, а также предупреждение хронических воспалительных процессов на фоне длительной атрофии.

е

Апробация работы

Результаты исследований изложены на 4-ом Российском форуме «Радиология 2003» (Москва, 2003); на научно-практической конференции «Современные подходы к диагностике и лечению гинекологического рака» (Псков, 2004); на II Российском конгрессе по остеопорозу (Ярославль, 2005); на IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2005); на VII российском научном форуме «Радиология 2006» (Москва, 2006); на Всероссийской научно-практической конференции «Высокие медицинские технологии» (Москва, 2006); на 8-м Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва 3-6 октября, 2006); на 10 конференции «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2007); 15-th International meeting of the European Society of Gynecological Oncology (Berlin, 2007); на XVI Всероссийском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); Республиканской конференции с международным участием «Роль новых радиологических технологий в диагностике и лечении заболеваний молочных желез и органов малого таза у женщин» (Астана, 2012).

Апробация диссертации состоялась на научно-практической конференции ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России 10 декабря 2012 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 33 работы, из них 16 статей в ведущих рецензируемых периодических изданиях, 4 - в зарубежной печати, результаты работы отражены в монографии.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 294 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материал и методы исследования, 7 глав, в которых изложены результаты собственных исследований и наблюдений, заключение, выводы, практические рекомендации и указатель литературы. Работа иллюстрирована 53 рисунками, 47 таблицами. Библиография включает в себя 408 источников из них 152 отечественной и 256 - зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В данное исследование включены результаты комплексного обследования 1476 пациенток, проходивших обследование и лечение в ФГБУ РНЦРР МЗ России в период с мая 1997г. по май 2012г.: 100 женщин, находящихся в периоде

постменопаузы, без анамнестических данных о наличии рака любой локализации, составили группу контроля.

Сформированы следующие группы больных, с наличием предопухолевых заболеваний и опухолей женской репродуктивной системы различной локализации в постменопаузальном периоде:

- 80 больных раком вульвы;

- 110 пациенток со склеротическим лишаем вульвы;

- 125 больных раком шейки матки;

- 491 пациентка с наличием цервикальной интраэпителиальной неоплазии различной степени тяжести (легкая, средняя, тяжелая) (CIN I-III);

-100 больных раком эндометрия;

- 50 пациенток с атипической гиперплазией эндометрия;

-100 больных со злокачественными эпителиальными опухолями яичников;

- 50 пациенток с доброкачественными эпителиальными опухолями яичников;

- 50 пациенток с пограничными эпителиальными опухолями яичников;

- 120 больных спорадическим раком молочной железы;

- 100 пациенток с наличием узловых форм мастопатии.

Было проведено комплексное обследование с подробным изучением анамнеза жизни и заболевания, регистрацией морфометрических данных, осмотром, инструментальными и лабораторными обследованиями.

Распределение больных по стадиям при различных локализациях рака органов женской репродуктивной системы было следующим: рак вульвы: I стадия - 21,3%, II стадия - 23,7%, III - 23,7%, IV стадия - 31,3%; рак шейки матки - I стадия - 34,8%, II стадия - 32,8% , III - 28, 0%, IV - 4,8%; рак эндометрия - I стадия - 71,0%, II стадия - 12,0%, III - 17,0%; рак яичников - I стадия - 28,0%, II стадия - 17,0%, III - 46,0%, IV стадия - 9,0%; и при раке молочной железы : I стадия - 25,0%, II стадия - 56,7%, III - 15,0%, IV стадия -3,3%.

Методы исследования

1 .Определение индекса массы тела (ИМТ) (индекс Ouetelet) проводилось по формуле - соотношение веса в килограммах к квадрату роста в метрах (кг/м2). ИМТ подразделялся на следующие категории: нормальный уровень -ИМТ 18,50-24,99, повышенный уровень - ИМТ 25,00-29,99 и ожирение - ИМТ >30,00.

2. Морфологическое исследование материала биопсий и послеоперационных препаратов осуществлялось в патоморфологической лаборатории ФГБУ РНЦРР МЗ России. При гистологической проводке по стандартной методике операционный материал фиксировали в 10% растворе формалина, заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Для детализации стромального компонента опухоли срезы окрашивали по Ван - Гизону. Для определения степени злокачественности опухоли оценивали структурную и клеточную атипию, а также митотический индекс.

3. Определение уровня эстроген - рецепторов иммуногистохимическим методом. Для морфологического исследования эстроген - рецепторов материал сразу после удаления фиксировали строго 24 часа в 10% нейтральном формалине, затем заливали в парафин. Иммуногистохимические реакции для выявления РЭ проводили на парафиновых срезах с моноклональными антителами Anti-human estrogen receptor, клон 1 Д 5, фирмы «Dakopatts». Реакцию считали отрицательной, если она регистрировалась в клетках от 0% до 5-10%, слабоположительной - 10-20%(+) (менее чем 1/3 клеток), умеренно выраженной - 20-40%(++) (более чем 1/3, но менее чем 2/3 клеток), резко выраженной - 50-100%(+++) (более чем 2/3 клеток).

4. Исследование уровня метаболитов эстрогенов и их соотношения. Для количественного определения соотношения метаболитов эстрогенов в моче (2 -гидроксиэстрон/16а - гидроксиэстрон) в настоящей работе был использован иммуноферментный набор ESTRAMET 2/16 ELISA. Тест основан на конкурентном методе твердофазного иммуноферментного анализа. С помощью набора ESTRAMET 2/16 определялась индивидуальная концентрация 2-гидроксиэстрона (20НЕ1) и 16а-гидроксиэстрон (16аОНЕ1) в моче. Принцип исследования основан на конкурентном методе твердофазного иммуноферментного анализа. Значения уровня метаболитов эстрогенов в моче у «здоровых» женщин: 16а-ОН: 0,6-10 нг/мл; 2-ОН: 20 нг/мл; 2-ОН/16а-ОН: 0,6-6; Среднее значение соотношения 2-ОН/16а-ОН для здоровых женщин соответствует 2.

5.ПЦР - диагностика. Для обнаружения вирусов и бактерий в образцах опухолевой и нормальной тканей нами использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Основные этапы исследования: выделение ДНК из исследуемого материала с использованием стандартных наборов GenePak DNA PCR test «Лаборатория Изоген», Россия. Детекция продуктов ПЦР проводили с использованием трансиллюминатора «ТСР-20-М» (Франция) с длиной волны 312 нм.

6.Тест Murex-Dipene Hybrid Capture II. способный дифференцировать две группы ДНК ВПЧ, явился еще одним методом изучения папилломавирусной инфекции в нашем исследовании. Первая группа - это типы ВПЧ 6, 11, 42, 43, 44 -т.н. низкой степени риска. Вторая группа-это типы ВПЧ 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 - т.н. высокой степени риска. Технология Digene Hybrid Capture II основана на обнаружении специфической последовательности ДНК (РНК), гибридизирующейся с РНК (ДНК) зондом, посредством высокоспецифичных IgG и IgM. Для обнаружения гибридов используется метод амплификации сигнала, позволяющий достичь высокой чувствительности, точности и гибкости, необходимых для рутинного скрининга и диагностики. Основные этапы теста: денатурация ДНК образца; гибридизация с РНК-зондом; захват гибридов; обнаружение гибридов; усиление сигнала.

7. Определение онкопротеина Е 7 ВПЧ высокого канцерогенного риска (16 и 18 генотипов). Онкобелок Е 7 определялся методом двухстадийного

иммуноферментного анализа. Диагностическая иммуноферментная система представляет собой набор реагентов для количественного определения белка ВПЧ 16 и 18 типа. Материал получали путем «соскоба» клеточного материала с поверхности опухоли. Результаты анализа учитывали спекгрофотометрически при длине волны 450 нм. Для определения концентрации Е 7 в исследуемых пробах строился калибровочный график по стандартным калибровочным образцам.

8. Определение экспрессии эстрогеновых рецепторов (ER) методом проведения полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени» с предварительной реакцией обратной транскрипции ЮТ-ПЦР). Реакция включала три этапа: 1. Пробоподготовка (выделение РНК). 2. Проведение обратной транскрипции (ОТ). 3. Проведение ПЦР. В работе использовали стандартные коммерческие реактивы ЗАО «НПФ» ДНК-Технология". Определение уровня экспрессии мРНК ESR1 относительно мРНК HPRT1 считали методом дельта-дельта Си-ти (ДД Ct). [ESR1]/[HPRT1] = Е " (c""ct2)) где [ESR1]/[HPRT1] -нормированное по HPRT1 значение экспрессии ESR1, измеряется в относительных единицах, показывает, сколько копий мРНК ESR1 приходится на 1 копию HPRT1; Е - эффективность амплификации, показывает прирост матрицы на каждом цикле амплификации.

9. Дополнительные методы обследования:

- Сонография органов малого таза и брюшной полости осуществлялась на ультразвуковом сканере «Voluson - 530D МТ» «Kretz Technic» (Германия). Для трансабдоминального исследования использовался датчик S - VAWA - 7, с частотой 3,5 - 5 МГц. Трансвагинальное исследование проводилось с применением внутриполостного датчика S - VDV5 - 8 В, с частотой 5 - 8,5 МГц.

- Исследование молочных желез включало: осмотр и пальпацию; сонографию молочных желез (Sonodiagnost Philips 360, Biomedica АЕ 530). Рентгенологическое исследование молочных желез проводили на аппаратах Mammo Diagnost, Philips (ЕС) и Senograph DMR+, General Electric (США). Традиционная маммография при необходимости дополнялась прицельной рентгенографией, а также рентгенографией с прямым увеличением изображения. При пальпируемых образованиях проводилась аспирационная тонкоигольная пункционная биопсия. При непальпируемых образованиях применяли прицельную пункцию под контролем рентгенографии с использованием системы «пистолет-игла» BARD MAGNUM. При выделениях из соска молочной железы применяли метод дуктографии с использованием одноразовых систем MD TECH с последующим цитологическим исследованием мазков-отпечатков.

10. Статистическая обработка данных. Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью известных статистических методов при использовании блока статистических программ "SPSS 13.0 for Windows". При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.

Результаты исследования

Рак вульвы

Проведено изучение уровня эстроген - рецепторов в ткани вульвы у 182 пациенток постменопаузального возраста, из них 64 пациентки с наличием рака вульвы (РВ), 54 пациентки со склеротическим лишаем вульвы (СЛВ) и 64 пациентки без признаков патологии вульвы.

Необходимо отметить существенные различия уровня рецепторов в нормальной и дистрофически измененной ткани вульвы. У трети пациенток к моменту формирования стойкой постменопаузы и на протяжении всего постменопаузального периода ткань вульвы сохраняет высокий уровень рецепторов вне зависимости от продолжительности постменопаузы. То есть состояние рецепторного аппарата в этом случае, вероятно, генетически детерминировано и в большей степени является отражением программы старения клетки. У пациенток со СЛВ складывается иная ситуация. Количество образцов с высоким уровнем рецепторов составляет всего 3,8%, в неизмененной ткани вульвы этот процент достоверно выше - 32,8% (р<0,01). По мере увеличения продолжительности постменопаузы растет количество эстроген - негативных образцов при склеротическом лишае, составляя в общей сложности 53,8% от всех исследований (Табл. 1).

Табл. 1 Уровень эстроген - рецепторов (ЕЙ) в ткани вульвы (%) в

зависимости от продолжительности постменопауэы у пациенток группы контроля, при склеротическом лишае и раке вульвы__

Продолжительность поспиено-пауэы Контрольная группе Склеротический лишай Рак вульвы

Число пациенток Уровень ЕЙ Число пациенток Уровень Е11

Число пациенток Уровень ЕЙ - + ++ +++ - + ++ +++

- + ++ +++

< 5 лет 20 45.4 15.0 5.0 34,6 9 33,3 44,5 11,1 11,1 12 95,4 3,0 1.6

5-15 лет 26 23,1 38,5 7,4 31,0 25 56,0 32,0 8,0 4,0* 29 89,7» 6,9 3,5

> 15лет 18 22,2 33,3 11,2 33,3 20 60,0* 35,0 5,0 23 97,0* 3,0 -

Всего 64 29,7 29,7 7,8 32,8 54 53,8* 35,2 7,2 3,8" 64 84,4* 12,4 3,2

*р<0,05 **р<0,01 в сравнении с группой контроля

При исследовании рецепторного статуса при РВ отмечено, что в подавляющем большинстве образцов отсутствуют эстроген - рецепторы (ЭР) в ткани вульвы - в 84,4%. Таким образом, в дистрофически измененной ткани вульвы резко снижается количество ЭР, а при злокачественной трансформации ткани вульвы, в большинстве наблюдений, ЭР отсутствуют. Анализируя результаты исследований необходимо отметить, что основной пул рецепторов в

нормальной и дистрофически измененной ткани вульвы сконцентрирован в базальном слое эпителия.

Представление об общем пуле эстрогенов в постменопаузе и интенсивности их периферического воздействия можно получить при измерении индекса массы тела, являющегося косвенным свидетельством гормонапьно-рецепторного баланса. Избыток массы тела в постменопаузе, как субстрат внегонадного синтеза эстрогенов, является маркером гиперэстрогении. Мы изучили индекс массы тела в группах пациенток со склеротическим лишаем (110 пациенток), раком вульвы (80 пациенток) и в группе контроля (100 пациенток). Среди больных РВ выявлено значительное превышение доли женщин с увеличением индекса массы тела, что составило 82,7%, из них с ожирением - 43,7%, при склеротическом лишае вульвы превышение индекса массы тела отмечено у 61,8% пациенток, тогда как в группе контроля он превышал норму лишь у 34,0%.

Учитывая тот факт, что жировая ткань является источником внегонадного синтеза эстрогенов, а при увеличении содержания 16а-ОНЕ1 патологические процессы в гормон - зависимых тканях усиливаются (Ашрафян Л.А., Киселев В.И., 2009г.), нами изучено соотношение ИМТ и эстрогенных метаболитов в исследуемых группах пациенток (Табл. 2).

При РВ средний уровень «физиологического» метаболита 2-ОНЕ1 на 34,3% ниже, чем в группе контроля, а уровень «канцерогенного» метаболита 16а-ОНЕ1 на 30,0% выше, чем в контрольной группе. Результаты исследования указывают на то, что и при СЛВ метаболизм эстрогенов ориентирован более на синтез «агрессивных» метаболитов. При РВ соотношение эстрогенных метаболитов демонстрирует достоверное (р<0,05) снижение, составляя 0,98, что на 53,3% меньше, чем у пациенток с нормально протекающей постменопаузой.

Табл. 2 Среднее соотношение эстрогенных метаболитов (2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1) в зависимости от ИМТ при склеротическом лишае и раке вульвы в сравнении с контрольной группой___

ИМТ Рак вульвы (N=80) Склеротический лишай вульвы (N=110) Контрольная группа (N=100)

нормальный ИМТ 18,50-24,99 1,14±0,21 1,86±0,27 2,14±0,34

повышенный ИМТ 25,00-29,99 1,08±0,16 1,56±0,2 2,03±0,24

ожирение ИМТ>30,00 0,98±0,18* 1,21±0,16 2,00±0,31

*р<0,05 в сравнении с группой контроля

Таким образом, очевидно, что при РВ имеет место повышенный синтез «агрессивных» метаболитов, особенно у пациенток с повышением ИМТ более 30, обладающих высоким пролиферативным потенциалом. У пациенток со СЛВ также выявлен дисбаланс производных эстрогенов и вследствие этого, определенные предпосылки для образования устойчивого пролиферативного

сигнала в ткани вульвы, что требует пристального динамического мониторинга данной категории пациенток.

В структуре заболеваний половой сферы у женщин, воспалительные процессы вульвы и влагалища занимают лидирующую позицию, составляя 55-70% (Серов В.Н., Прилепская В.Н., Роговская С.И., 2008г.). В постменопаузе проблема нарушения микробиоценоза вульво - вагинальной зоны усложняется тем, что изменяются многие гомеостатические параметры женского организма. Исходя из этого, особого интереса заслуживает изучение инфекционного фактора в патогенезе CJIB и РВ. В особенности, рассматривая вульву, влагалище и шейку матки как единую биологическую среду. Особое внимание в наших исследованиях было отведено роли папилломавирусной инфекции, в частности дифференцированному изучению частоты генотипов высокого и низкого онкологического риска и их сочетаний при СЛВ и РВ.

Исследования включали два независимых варианта идентификации ДНК ВПЧ в группе 110 пациенток со СЛВ, 80 больных РВ и в группе контроля (100 пациенток). У всех пациенток контрольной группы присутствовала та или иная инфекция, что не сопровождалось какими - либо клиническими проявлениями воспалительного процесса. Наиболее часто в группе контроля отмечено присутствие гарднерелл (24%). Практически в равной мере диагностирован стрептококк (10,0%), кишечная палочка (10,0%) и вирус простого герпеса II (11,0%). В группе больных со СЛВ с высокой частотой отмечено присутствие папилломавирусной инфекции высокого риска (72,4%), гарднерелл (60,3%), вируса простого герпеса II (25,9%). Значительно реже (12-14%) выявлен стрептококк, грибы кандида, уреаплазма и вирус папилломы низкого риска.

Спектр инфекций, сопутствующих РВ достаточно многообразен: чаще всего определялся стрептококк (78,8%) и грибы рода Candida (60,0%). В 47,5% образцов встречалась кишечная палочка, в 41,3% - хламидии. У 31,3% больных отмечено присутствие вируса простого герпеса II. Следует особо отметить, что в большинстве образцов при СЛВ - 86,3% и при РВ - 83,7%, выявлено присутствие вируса папилломы человека высокого и низкого канцерогенного риска.

Таким образом, доминирующими инфекционными агентами при СЛВ являются вирус папилломы человека высокого риска, гарднерелла и вирус простого герпеса II типа, тогда как при РВ лидирующие позиции занимают вирусы папилломы человека низкого риска, стрептококк и кандида.

Анализируя частоту сочетаний различных инфекций, установлено, что, как в образцах ткани вульвы при СЛВ, так и в образцах опухолевой ткани в подавляющем числе наблюдений имеется присутствие двух и более инфекционных агентов. При РВ микробные ассоциации отмечены в 82,5% наблюдений, при склеротическом лишае - у 74,5% пациенток, значительно меньше этот показатель у пациенток контрольной группы - 41,0%.

Проведено дифференцированное изучение частоты генотипов высокого и низкого онкологического риска и их сочетаний при СЛВ, РВ и в группе контроля (Рис.1). Как свидетельствуют данные исследования, при склеротическом лишае имеется весьма широкий и разнообразный спектр генотипов ВПЧ. 16 и 18 генотипы у пациенток со СЛВ определялись в 14,3% и 22,4% наблюдений

соответственно. Вирус папилломы человека 55 генотипа также выявлен в 22,4% наблюдений. Гораздо чаще диагностировались 52 (60,3%) и 83 (44,8%) генотипы. Из генотипов низкого риска в большей степени встречаются 53,66 и 42.

впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч впч

16 18 31 33 35 39 45 51 52 55 59 68 83 6 11 42 43 44 66 О рак вульвы 13 склеропчвскиЛ лииай вульаы

Рис. 1 Частота (в %) выявления различных генотипов вируса папилломы человека при склеротическом лишае и раке вульвы

С наибольшей частотой при РВ выявлялись 6 и 11 генотипы. Исследованиями выявлены следующие ассоциации: 18 генотипа с 55 (1 образец), с 59 (1 образец), с 83 (1 образец); 55 генотипа с 59 (1 образец), 59 и 83 генотипа (1 образец). Наряду с этим, не отмечено ни одного наблюдения ассоциации какого-либо генотипа с 16 генотипом. Как правило, 16 генотип выявлялся изолированно. Генотипы 16 и 18, трактуемые, на модели рака шейки матки, как высокого онкологического риска, при раке вульвы выявлены в 43,8% наблюдений.

При I стадии заболевания в большинстве образцов (58,8%) характерно наличие 6/11 генотипов (при р<0,05). С равной частотой (11,8%) отмечено присутствие 16, 18 и 83 генотипов. При I стадии выявлено также сочетание 59 с 83 генотипом ВПЧ.

Изучена частота выявления различных генотипов, в зависимости от стадии РВ и дифференцировки опухоли. Из проведенного анализа можно сделать следующие заключения: 1. При низкодифференцированном варианте плоскоклеточного РВ у трети пациенток (30,8%) не удается установить присутствие ВПЧ, тогда как при высокой дифференцировке опухоли, ВПЧ -негативных наблюдений значительно меньше - 10,7%. 2. При высокодифференцированных вариантах опухоли чаще выявляется 6/11 и 18 генотипы (42,9 и 32,1% соответственно), чем это имеет место при неороговевающем раке (23,1 и 11,5% соответственно). 3. В группе больных, с высокодифференцированной формой опухоли (ороговевающий рак) определялось сочетание генотипов, в то время как, у пациенток с наличием рака низкой дифференцировки определялась моноинфекция.

Таким образом, нашими исследованиями показано, что в генезе РВ принимают участие несколько генотипов ВПЧ. Причем, наибольшее значение при этом имеют ВПЧ 6/11 типов, которые, как известно, относятся к генотипам низкого риска. Вероятно, что в онкогенной трансформации плоскоклеточного

эпителия принимают участие вирусы разных генотипов, имеющие не одинаковую органную тропность.

Следующим этапом наших исследований стало изучение уровня экспрессии онкобелка Е 7 при различных поражениях вульвы для определения интеграции ДНК ВПЧ в клеточный геном. После инфицирования ВПЧ в клетках нарушается нормальный процесс дифференцировки. Условия, при которых вирус способен проникнуть и взаимодействовать с базальными клетками, наиболее ярко проявляются при СЛВ. Наличие онкобелка Е 7 в пробах из опухоли может рассматриваться как однозначное свидетельство вирус - ассоцированного злокачественного процесса. Неоспоримым достоинством Е 7, как маркера является то, что в норме этот белок в тканях не синтезируется. В нашей работе иммуноферментный анализ выполнен в 60 образцах РВ (48 больных с наличием ВПЧ в опухоли и 12 больных без ПЦР данных за наличие ВПЧ) и в 52 образцах при СЛВ (40 пациенток с наличием ВПЧ и 12 пациенток без ПЦР данных за его наличие).

Из 48 больных с вирусассоцированным РВ у 34 имели место 16 и 18 генотипы. Причем, отбирались больные преимущественно I - II стадий. Как и следовало ожидать, положительные результаты получены лишь в образцах, где имелись генотипы 16 и 18 - в 56,7% наблюдений. Значения онкобелка Е 7 были весьма вариабельны и колебались в диапазоне 0,06-12 п£/т1. При вирус -независимых опухолевых процессах онкобелок Е 7 не определялся. При СЛВ имелась похожая картина: онкобелок Е 7 был выявлен только у пациенток с идентифицированными при ПЦР - диагностике 16 и 18 генотипами ВПЧ - в 30,7% . Однако, в 5 наблюдениях с наличием ВПЧ 16 типа и в 8 наблюдениях при ВПЧ 18 типа, онкобелок выявлен не был, а концентрации Е 7 были значительно ниже (до 5,0 п{*/т1), чем у пациенток с наличием опухолей вульвы. Этот факт объясняется, тем, что вирус папилломы у данной категории пациенток находится еще в эписомальной форме и не интегрирован в ДНК.

:менопауза :

... ^ ) К <| II Я | | » < с кр 1М1 * •1 3 Г |М» > 111 !П1 х....

;:;Иэм«нвнив»1 ПК« об то цад «аавуяьаьг;;:

Рис. 2 Этапы злокачественной трансформации при раке вульвы в постменопаузальном периоде

Изучение синтеза онкобелка Е 7 в вирусиндуцируемых опухолях и предраковых заболеваниях актуально с диагностической, лечебной и прогностической точек зрения. Специфичность теста на белок Е 7 позволяет использовать его в ранней диагностике РВ, в особенности при возникновении его на фоне предшествующих дистрофических заболеваний. Все вышесказанное может быть отражено следующей схемой (Рис. 2).

Рак шейки матки

Исследованиями установлено, что в той зоне шейки матки, где наблюдается активная экспрессия вирусных белков, отмечен высокий уровень синтеза 16а - ОНЕ1, сравнимый с таковым в клетках молочных желез при раке (Aubom К, 1991). Следует отметить, что нормальные клетки эпителия шейки матки не способны к превращению эстрадиола в 16 - гидроксиэстрон. Активная репликация ВПЧ индуцирует образование агрессивного метаболита в инфицированных им клетках (Ашрафян Л.А., Киселев В.И, 2008; Чуруксаева О.Н., 2010г.). Исходя из вышесказанного, нами проанализированы средние уровни метаболитов 2-ОНЕ1 и 16а-ОНЕ1 у женщин постменопаузального периода при РШМ (125 пациенток), дисплазии шейки матки I - III степени (CIN

1-III) - 198 пациенток, в сравнении с группой контроля (100 пациенток).

Выявлено, что в группе пациенток с наличием дисплазий различной

степени тяжести данные количественного определения уровней метаболитов и их соотношения достоверно не отличались от показателей возрастной нормы. Соотношение метаболитов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1, которое является маркером риска развития эстроген - зависимых опухолей, также было снижено лишь на 7,1%, по сравнению с группой контроля. Обращаясь к группе больных РШМ, наблюдается иная картина - средний уровень «физиологического» метаболита

2-ОНЕ1 был на 35,3% ниже, чем в группе контроля, а уровень «агрессивного» метаболита 16а-ОНЕ1 - на 35,2% выше, чем в контрольной группе. Результаты исследования демонстрируют, что при РШМ метаболизм эстрогенов в значительной степени ориентирован на синтез «канцерогенных» метаболитов.

Табл. 3 Среднее соотношение эстрогенных метаболитов (2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1), в зависимости от ИМТ при раке шейки матки и CIN I - III степени_

ИМТ Рак шейки матки (N=125) CIN I - III (N=198) Контрольная группа (N=100)

Нормальный ИМТ 18,50-24,99 1,12±0,18 2,00±0,35 2,14±0,39

Повышенный ИМТ 25,00-29,99 1,08±0,16 1,88±0,40 2,03±0,29

Ожирение ИМТ>30,00 0,78±0,19* 1,76±0,29 2,00±0,31

*р<0,05 в сравнении с группой контроля

Оценено среднее соотношение эстрогенных метаболитов у пациенток при РШМ и дисплазиях в зависимости от ИМТ (Табл. 3).

При РШМ отмечено значительное снижение коэффициента соотношения метаболитов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 по сравнению с группой контроля, причем при повышении ИМТ, а, в особенности, при ожирении, данные различия становятся все более очевидны. При ИМТ более 30 у больных РШМ определяется снижение соотношения метаболитов эстрогенов на 61,0% в сравнении с группой контроля. Таким образом, еще раз подтверждается тот факт, что при РШМ имеет место повышенный синтез «агрессивных» метаболитов, особенно у пациенток с превышением ИМТ. Что касается группы женщин в постменопаузе с наличием CIN различных степеней тяжести, исследование соотношения метаболитов не продемонстрировало столь значимых различий в сравнении с группой контроля. Следует заключить, что при превышении ИМТ, а, следовательно, и метаболических нарушений, в сочетании с другими инициирующими факторами, происходит активизация процессов клеточной пролиферации, постепенно приводя к развитию злокачественной неоплазии эпителия шейки матки.

В нашей работе оценена роль ВПЧ в развитии цервикапьных

интраэпителиальных неоплазий и РШМ. Проведено исследование ВПЧ высокого и низкого риска в 3 группах пациенток: 100 пациенток контрольной группы, 491 пациентки с цервикальной интраэпителиальной неоплазией шейки матки (CIN I-III), 125 больных раком шейки матки. В контрольную группу были включены пациентки, у которых клинически, кольпоскопически и цитологически не была выявлена патология шейки матки.

Учитывая интерес исследователей к изучению роли онкобелка Е 7, обладающего выраженным трансформирующим действием на клетку, проведено выявление онкобелка Е 7 в качестве маркера развития неоплазии шейки матки. Проводилось выявление онкобелка Е7 к ВПЧ 16 и 18 генотипов.

Каждая из трех групп пациенток была разделена на четыре подгруппы, в

зависимости от детекции ВПЧ и онкобелка Е 7:1. ВПЧ+/ Е 7+; 2. ВПЧ +/ Е 7-; 3. ВПЧ -/ Е 7+; 4.ВПЧ -/Е 7-.

Рис. 3 Результаты исследования на ВПЧ (ПЦР - диагностика) и иаличие онкобелка Е 7 у пациенток контрольной группы

3

Отметим, что интеграция ДНК ВПЧ в геном клеток сопровождается двумя молекулярными событиями: 1 .Встраивание вирусной ДНК в хромосому всегда сопровождается нарушением структуры гена Е 2, который является репрессором Е 7. 2. При интеграции ДНК вируса синтез белка Е 2 прекращается вследствие нарушения структуры соответствующего гена и активируется синтез белка Е 7 (Киселев В.И., 2004г.). То есть, факт интеграции вирусной ДНК может быть зарегистрирован или изучением структуры гена Е 2 (эти методы в стадии разработок) или измерением уровня синтеза онкобелка Е 7. Таким образом, измерение уровня онкобелка Е 7 позволяет уточнить характер вирусной инфекции, возможность ее регрессии и/или злокачественной трансформации в случае интеграции ВПЧ в клеточный геном.

По существующим эпидемиологическим данным, доля ВПЧ - носителей в женской популяции варьирует от 20% до 60% (Cancer Stats, 2006; Cuzick J, 2006; Castle РЕ, 2005; Goldie SJ, 2000). Однако чаще всего поражение носит транзиторный характер, и в значительном числе случаев регрессирует, даже при дисплазиях различной степени тяжести. Исследованиями доказано, что рак шейки матки развивается последовательно, путем перехода из дисплазии в преинвазивный (in situ), затем в микроинвазивный, и, наконец, в инвазивный рак (Ostor AG, 1993).

В группе контроля (Рис. 3) выявлен факт достаточно широкого носительства папилломавирусной инфекции. Случаи выявления ВПЧ среднего и низкого риска отмечались только в группе CIN - 9 наблюдений (выявили 33 генотип) и в контрольной группе, где с наибольшей частотой обнаруживались вирусы 6 и 11 генотипов (16 наблюдений), а также по 5 случаев 33, 52, 83 генотипы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в большинстве наблюдений в контрольной группе отсутствовала вирусная инфекция - 70,0% женщин. Однако в 27% наблюдений имело место вирусоносительство, а у 3 женщин (3,0%) отмечено присутствие в образцах онкобелка Е 7.

Рис. 4 Результаты исследования на ВПЧ (ПЦР - диагностика) и наличие онкобелка Е 7 у пациенток с дисплазиями шейки матки различной степени выраженности (CIN I-III)

Доля пациенток с наличием дисплазий шейки матки различных степеней тяжести, у которых был выявлен ВПЧ высокого онкогенного риска и определялся онкобелок Е 7 в цервикальном материале (ВПЧ +Е 7+), составила 27,5% (Рис. 4). При исследовании материала на Е 7 16 типа этот показатель составил 56,4% от общего количества обследованных в группе дисплазий, при исследовании Е 7 18 типа - 43,6%. В процессе анализа полученных данных, выявлена статистически достоверная взаимосвязь между фактом наличия CIN и выявлением онкобелков Е7. Для Е7 16 - р=0,403, для Е7 18 - р= 0,315. Эта группа пациенток представляет ВПЧ - зависимый процесс канцерогенеза. То, что белок Е 7 обнаруживается у значительного числа ВПЧ - положительных пациенток с дисплазиями, свидетельствует о значимости его влияния на процессы клеточной трансформации.

В клинической практике это означает, что если у ВПЧ - положительной пациентки выявлен онкобелок Е 7, следовательно, на субклеточном уровне уже запущены процессы клеточной трансформации, что требует активной лечебно -диагностической тактики в отношении данной больной.

Интерес представляет подгруппа пациенток, в цервикальных пробах которых определялся онкобелок Е 7, однако ВПЧ 16/18 генотипов при ПЦР -диагностике выявлены не были. Доля таких наблюдений была 2%. Эта ситуация нам до конца не ясна, но учитывая то, что онкобелок Е 7 высоко специфичен для ВПЧ, являясь продуктом его «жизнедеятельности», можно предположить, что образцы из данной группы тоже являются ВПЧ - положительными и полностью укладываются в схему, описанную нами для предыдущей группы больных. Таким образом, в группе больных с дисплазиями удельный вес пациенток с Е 7 положительными пробами составил 29,5%. То есть, треть пациенток с дисплазиями имеют интегрированный вариант вируса с экспрессией белка Е 7, что, с позиций предрака шейки матки, формирует облигатное состояние.

Среди пациенток с наличием дисплазии имелась подгруппа, в которой в цервикальных пробах определялся ВПЧ высокого онкогенного риска, а онкобелки Е 7 16 и 18 типов не были выявлены при иммуноферментном анализе цервикальных проб - 39,7%. Состояние ВПЧ в клетках эпителия шейки матки в данной подгруппе соответствует эписомальному варианту вирусной инфекции и является значительно более благоприятным в отношении малигнизации.

В следующей подгруппе женщин - 30,8% - с наличием CIN и отсутствием вирусной инфекции, по данным ПЦР - диагностики экспрессия онкобелка Е 7 не определялась. Данная подгруппа пациенток по новому формирует наше понимание причин развития цервикальных неоплазий, в основе которых не только вирусная индукция, но множество других причин, способных стимулировать патологическую пролиферацию. В подавляющем числе наблюдений при CIN (70,5%) отсутствует интеграция ДНК ВПЧ в геном плоского эпителия шейки матки.

Иными словами, одна и та же морфологическая картина при дисплазиях, по-видимому, может формироваться в результате различных причин, среди которых доля ВПЧ - составляющей, по данным наших исследований, - 29,5%.

Далее мы изучили соотношение частоты Е 7- положительных наблюдений в зависимости от степени дисплазии. Как мы и предполагали, частота Е 7-положительных проб увеличивалась от CIN I к CIN III (рис.5).

Важным фактом, следующим из полученных результатов, является то, что у части пациенток с легкими диспластическими изменениями плоского эпителия (CIN 1) в 10,9% наблюдений уже отмечается присутствие белка Е 7, что диктует необходимость принятия более решительных мер вторичной профилактики рака. Второй момент, который следует отметить, - это практически одинаковая частота Е 7 положительных проб при CIN II и CIN III (31,2% и 37,9%), при этом процент наблюдений с Е 7+ для CIN3 относительно невысок, если учесть, что в клинической практике этой группе пациенток, как правило, выполняется хирургическое лечение начиная с конизации шейки матки и заканчивая экстирпацией матки.

300 250 200 150 100 50 О

10,9%

QN1

37,9%

CIN 2

■ Е7+ □ Е7-

CIN3

Рис. 5 Соотношение Е 7 - и Е 7 + проб в зависимости от степени дисплазии (CIN I-III)

Очевидно, что в группе дисплазии дифференцируются две биологические модели процесса. В одном случае, где экспрессия белка Е 7 отсутствует, диспластические изменения, по-видимому, индуцированы неблагоприятным биоценозом влагалищной среды и как ответная реакция - патологической пролиферацией плоского эпителия. В этом варианте пролиферация является частью контролируемого регенераторного процесса и отражает состояние хронического воспаления. В другом случае, где отмечен синтез белка Е 7, - уже запущен начальный этап канцерогенеза. С появлением этого белка, как уже было отмечено, включаются разнообразные механизмы, обеспечивающие неконтролируемую пролиферацию. Присутствие белка Е 7, даже без серьезных морфологических изменений эпителия шейки матки, важный и тревожный признак развивающегося злокачественного процесса. По сути дела белок Е 7 отражает биохимический этап канцерогенеза.

Нами были обследованы 125 пациенток с морфологически верифицированным диагнозом плоскоклеточного рака шейки матки.

□ Е7+ВПЧ-

■ Е7+ВПЧ+

О Е7-ВПЧ+

0 Е7-ВПЧ-

Рис. 6 Результаты исследования на ВПЧ (ПЦР - диагностика) и наличие онкобелка Б 7 при раке шейки матки

Как представлено на рисунке 6, в группе больных РШМ частота детекции 16 и 18 генотипов ВПЧ составила 71,6%. При этом, экспрессия белка Е 7 имела место в 90,8% наблюдений. Различия между этими показателями, возможно, могут быть объяснены способностью иммуноферментного анализа идентифицировать экспрессию онкобелка Е 7 других генотипов ВПЧ. Тогда с уверенностью можно говорить о высокой его чувствительности (практически 100%). Онкобелок Е 7 16 генотипа в нашем исследовании обнаружен у 55,8% больных РШМ, а онкобелок Е 7 18 типа - у 15,8%. Эти данные сопоставимы с данными литературы, где ВПЧ 16 типа выявляется у 50-60% больных цервикапьным раком, а ВПЧ 18 - у 15-20%. У 4,1% больных РШМ в цервикальном материале обнаружен ВПЧ высокого онкогенного риска, при этом онкобелок Е 7 выявлен не был (ВПЧ + Е7 -). Возможно, это та группа больных, где за развитие цервикального рака отвечают ВПЧ высокого онкогенного риска, не относящиеся к генотипам, которые регистрируются используемой нами тест -системой. Соответственно в этих случаях в процессе канцерогенеза вирус будет продуцировать типоспецифические онкобелки Е 7. Вопрос этот неоднозначен и требует дальнейшего изучения.

Среди обследованных больных с наличием РШМ, в 5,1% образцов не было выявлено ВПЧ, а так же не определялась экспрессия онкобелка Е7, что предполагает ВПЧ - независимый характер развития цервикального рака.

На основании проведенных исследований при раке шейки матки и дисплазиях различной степени тяжести, становится очевидным, что для запуска механизмов канцерогенеза недостаточно лишь инфицирования эпителиальных клеток ВПЧ. Один из основных путей малигнизации заключается в том, что ВПЧ модифицирует клеточный метаболизм, создавая условия для формирования «агрессивных» метаболитов эстрогенов, активизирующих опухолевую трансформацию клеток, за счет активации онкобелка Е 7. Создается «порочный круг», в котором онкопротеин Е 7 активизирует патологическую пролиферацию и блокирует механизмы иммунологической защиты клетки. В конечном итоге, механизм канцерогенеза при РШМ в постменопаузе может быть отражен следующей схемой (Рис. 7):

■■•Л '■р< ф

;т + ......

м ашйни тш

Рис. 7 Этапы злокачественной трансформации при раке шейки матки в постменопаузальном периоде

Рак эндометрия.

Общеизвестно, что эндометрий является гормоночувствительной тканью, находящейся под воздействием половых гормонов, таких как эстрогены и прогестерон. Если для репродуктивного периода полнее очевидно, что гормональный ответ осуществляется посредством воздействия на специфические рецепторы, являющиеся необходимым периферическим звеном эндокринной функции, то в постменопаузе эти два звена претерпевают значительные изменения вследствие изменения спектра секретируемых гормонов, а так же снижения уровня рецепторов.

Табл. 4 Уровень эстроген - рецепторов (%) в ткани эндометрия при атипической гиперплазии и раке эндометрия (иммуногистохимический метод)_

Группа пациенток Число пациенток Уровень рецепторов

ЕИ- ЕН+ ЕЛ++ ЕИ+++

Рак эндометрия 100 30,0 10,0 20,0 40,0

Атипическая гиперплазия эндометрия 50 26,0 12,0 18,0 38,0

Контрольная группа 64 44,9 21,8 11,5 21,8

р<0,1

В наших исследованиях был изучен рецепторный статус опухоли у 100 больных с наличием аденокарциномы эндометрия в постменопаузальном периоде методом иммуногистохимии и у 82 больных раком эндометрия - методом полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени» с предварительной

реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Так же было изучено состояние рецепторного аппарата эндометрия при атипической гиперплазии (АГЭ) у 50 женщин, находящихся в постменопаузе. В качестве группы контроля была исследована ткань эндометрия в состоянии атрофии у 64 женщин постменопаузального возраста.

В клинической практике принято считать положительным значением данные, соответствующие ЭР+++ (50% - 100%). Полученные результаты (Табл. 4) свидетельствуют о значительном повышении количества эстроген - позитивных образцов в группе больных РЭ. В наших исследованиях уровень эстроген -рецепторов при раке эндометрия в два раза превышал данные по контрольной группе (40,0% против 21,8%). Состояние рецепторного аппарата при атипической гиперплазии было близким, по уровню рецепторов, к РЭ.

Рис. 8 Относительный уровень экспрессии генов (мРНК) эстрогеновых рецепторов (ЕвИ) методом полимеразной цепной реакции с предварительной реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).

Следующим этапом нашего исследования стало изучение уровня экспрессии генов (мРНК) эстрогеновых рецепторов (ЕБЯ) при раке эндометрия методом полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени» с предварительной реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) (Рис. 8).

Во всех образцах опухоли имелась экспрессия мРНК эстрогеновых рецепторов, однако уровень экспрессии был весьма вариабелен.

Основным результатом проведенного исследования явилось то, что экспрессия была прослежена и в тех образцах, где данные иммуногистохимического метода в отношении уровня эстрогеновых рецепторов были отрицательные, а так же, из рисунка 8 видно, что уровень экспрессии был наивысшим при умереннодифференцированном варианте опухоли. Это, по-видимому, связано с тем, что иммуногистохимический метод отражает количественно уровень белка рецептора, в то время, как метод ОТ-ПЦР дает информацию о генетическом фрагменте, ответственном за экспрессию этого белка.

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что при всех вариантах РЭ присутствует гормональная составляющая. Причем, эстрогеновый рецептор способен взаимодействовать с любым лигандом, у

которого "молекулярный диапазон" близок к эстрогенам. Молекулярная формула метаболита 16а-ОНЕ-1 в этом смысле, очевидно наиболее приближена. Таким образом, по-видимому, для реализации гормонального эффекта в присутствии такого «агрессивного» метаболита как 16а-ОНЕ-1, достаточно минимального уровня эстрогеновых рецепторов.

Согласно концепции Я.В.Бохмана о двух основных патогенетических вариантах РЭ, в 60-70% наблюдений превалирует так называемый гормонозависимый вариант, характеризующийся выраженными эндокринно-обменными нарушениями. Разделение рака эндометрия на два патогенетических варианта по сути дела обозначило некую концептуальную составляющую в отношении цепочки тех гомеостатических нарушений, в результате которых формируются условия для возникновения и развития злокачественного процесса в эндометрии. Во всяком случае, для I патогенетического варианта основные нарушения сконцентрированы внутри метаболического синдрома.

Одним из проявлений эндокринно-обменных нарушений является ожирение, чему нередко сопутствуют инсулинорезистентность и гиперинсулинемия, являющиеся основным патогенетическим звеном развития метаболического синдрома. На материале наших исследований данная теория наглядно подтверждается при оценке индекса массы тела и соотношения метаболитов эстрогенов в группе больных раком эндометрия (100 больных), атипической гиперплазией эндометрия (50 пациенток), в сравнении с контрольной группой женщин в постменопаузе (100 женщин). У 62 больных раком эндометрия определялся повышенный индекс массы тела, а у 42 женщин этой группы имелось ожирение. При этом в контрольной группе повышенный индекс массы отмечен лишь у 34 женщин, а ожирение - у 14. Из 50 пациенток с наличием АГЭ, повышение ИМТ имелось у 66% женщин, а у 40% из них отмечено наличие выраженного ожирения.

Таб. 5 Среднее соотношение метаболитов эстрогенов (2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1) в зависимости от ИМТ у пациенток с атипической гиперплазией и раком эндометрия_

ИМТ Рак эндометрия (N=88) Атипическая гиперплазия эндометрия (N=32) Контрольная группа (N=100)

нормальный ИМТ 18,50-24,99 1,38±0,2 1,67±0,21 2,14±0,39

повышенный ИМТ 25,00-29,99 1,12±0,25 1,34±0,3 2,03±0,29

ожирение ИМТ>30,00 0,95±0,21* 1,22±0,23 2,00±0,31

*р<0,05 в сравнении с группой кошроля

Таким образом, такой ключевой фактор метаболического синдрома, как ожирение, приводит к запуску механизма гормонального канцерогенеза, которые в данном случае сопряжены не столько с избыточной продукцией классических

эстрогенов, сколько с особенностями метаболизма стероидов в постменопаузе, с образованием «агрессивных» метаболитов, и их влиянием на ткани-мишени, в том числе, на эндометрий.

Для доказательства наших предположений мы изучили уровень метаболитов в моче (16а-ОНЕ1, 2-ОНЕ1) и их соотношение, в зависимости от ИМТ у пациенток при РЭ - у 88 больных, АГЭ - у 32 пациенток и в контрольной группе у 100 женщин (Табл. 5). По мере нарастания ИМТ снижается коэффициент соотношения метаболитов. В то же время в группе пациенток с наличием АГЭ и в группе контроля данное соотношение подвержено меньшим колебаниям.

Полученные данные еще раз подтверждают тезис о том, что соотношение 2-ОНЕ1 к 16а-ОНЕ1 можно считать адекватным маркером и диагностическим критерием при определении риска и прогноза развития гормонально индуцируемого варианта рака эндометрия. Что касается II патогенетического варианта, то понимание истинных механизмов канцерогенеза до настоящего времени не было. Пытаясь объяснить этот путь канцерогенеза, мы изучили возможную инфекционную составляющую при раке эндометрия.

В связи с этим была изучена роль ВПЧ в генезе пролиферативных заболеваний и рака эндометрия. С этой целью были исследованы образцы ткани эндометрия 68 больных раком эндометрия, 35 больных атипической гиперплазией эндометрия и 52 пациенток контрольной группы с атрофией эндометрия.

Результаты данного фрагмента исследования свидетельствуют, о том, что при ПЦР-диагностике вирус папилломы человека в ткани РЭ выявлен лишь в 7 образцах, при АГЭ ВПЧ выявлен у 3 пациенток. В контрольной группе ВПЧ в образцах ткани эндометрия выявлен у 5 женщин.

При изучении остального микробиологического спектра возбудителей в ткани эндометрия исследуемых групп, лишь в 1 образце ткани при РЭ был выявлен вирус простого герпеса.

Таб. 6 Частота выявления ВПЧ (%) в образцах опухолевой и нормальной ткани эндометрия с использованием метода ПЦР

Группа Исследования Число пациенток ВПЧ - позитивные образцы ткани ВПЧ - негативные образцы ткани

Рак эндометрия 68 11,7% 88,3%

Атипическая гиперплазия эндометрия 35 8,6% 91,4%

Контрольная группа 52 9,6% 90,4%

р>0,05

Тот факт, что частота выявления папилломавирусной и бактериальной инфекции достоверно низка, как в образцах опухоли, так и при атипической гиперплазии, свидетельствует о том, что инфекционный фактор, как вирусный,

так и бактериальный, не играет существенной роли в патогенезе рака и предрака эндометрия.

Таким образом, обобщая наши данные, можно сказать, что ведущая роль в патогенезе РЭ принадлежит гормональной составляющей. Для формирования процессов опухолеобразования уровень экспрессии рецепторов может быть достаточно низким, но вполне достаточным для реализации канцерогенного эффекта «агрессивных» метаболитов. Этот путь канцерогенеза вполне логически вписывается в концепцию I патогенетического варианта (Я.В.Бохман, 1972). Развитие концепции II патогенетического варианта было связано с исследованиями, которые начались в РНЦРР с 1986 года по настоящее время. В многочисленных работах была показана, морфологическая неоднородность того фона, на котором формируются начальные этапы злокачественного процесса при раннем (микроинвазивном) раке эндометрия.

I тин

V_

II тип

§ - опухоль

—V

I вариант

- гиперплазия

III тип

Ü- норма

- атрофия

Рис. 9 Соотношение различных вариантов рота опухоли прн раке эндометрия в постменопаузальном периоде

При начальном раке можно обозначить три типа макро- и микроскопически определяемых процесса (Рис. 9). При I и II типе явно прослеживается гормональная составляющая, выраженная в наличии гиперпластического фона. При III типе роста развитие злокачественного процесса формируется на фоне абсолютной атрофии, что указывает на явное отсутствие сколь-нибудь существенного гормонального компонента. И именно при этом варианте РЭ особую значимость приобретает функциональное состояние атрофии и хроническое воспаление, следствием которого становится патологическая пролиферация, индуцируемая стволовыми (прогениторными) клетками, имеющими к этому времени целый ряд генетических поломок. Таким сегодня нам представляется второй вариант канцерогенеза при РЭ, что отражено на рисунке 10.

Атипическая гиперплазия эндометрия

писаний

рецепторов

Высокий уровень ЧВо-ОН

МЕНОПАУЗА

II вариант рака эндометрия

менопауза:

Рис. 10 Компоненты, формирующие канцерогенез эндометрия в постменопяузалыюм периоде

Рак яичников.

Несмотря на большое количество публикаций, доказывающих или опровергающих причастность папилломавирусной инфекции к злокачественной трансформации эпителиальной ткани яичников, до настоящего времени не существует единого мнения на этот счет. Данные факты подтолкнули нас к изучению ряда принципиальных моментов, обосновывающих и формирующих позиции инфекционной составляющей в канцерогенезе эпителиального РЯ. Предметом изучения в настоящем разделе явились образцы ткани яичников 98 больных эпителиальным раком яичников (ЗЭОЯ), 42 пациенток с пограничными опухолями яичников (ПЭОЯ), 48 женщин с доброкачественными опухолями яичников (ДЭОЯ), в сравнении с образцами ткани 60 женщин контрольной группы, с отсутствием патологии в ткани яичников. В группе больных злокачественными эпителиальными опухолями яичников были выделены подгруппы: пациентки с наличием серозного рака яичников - 76 больных и с муцинозными опухолями - 22 женщины.

Мы изучили спектр бактериальных и вирусных агентов в образцах ткани яичников. При ПЦР-диагностике в образцах опухолевой и нормальной тканей яичников микоплазменная урогенитальная инфекция не была выявлена. Изучение частоты хламидийной и уреаплазменной урогенитапьной инфекции в образцах ЗЭОЯ, ПЭОЯ и ДЭОЯ так же наглядно продемонстрировало низкий уровень их выделения, который составил 5,1% и 3,0% образцов при ЗЭОЯ и 2,4% и 2,4% -при ПЭОЯ соответственно. В контрольной группе и при ДЭОЯ положительных результатов установлено не было.

Частота определения вируса Эпштейн - Барр (ВЭБ-инфекция) в группе ЗЭОЯ составила 39,8% наблюдений и была значительно выше по сравнению с

контрольной группой - 11,7%. При ПЭОЯ частота ВЭБ - инфекции составила 19,0%, при ДЭОЯ - 6,3%. Надо отметить, что, в контрольной группе отмечалось повышение частоты детекции вируса простого герпеса II типа (30%), которая была в четыре раза выше, чем у больных ЗЭОЯ (8,2%) (р<0,05). Значения частоты цитомегаповирусной инфекции в группах были практически равные - 3% и 4,8%, 2% и 5% случаев соответственно (р>0,05).

Полученные результаты, свидетельствуют о том, что с наибольшей частотой в опухолевой ткани определяется ВЭБ-инфекция, которая, как правило, носит сочетанный характер. Так, ассоциация ВЭБ с ВПЧ отмечена в 27,5% наблюдений при ЗЭОЯ, а изолированное течение инфекционного процесса - в 10,2% случаев. При этом чаще встречалось сочетание ВЭБ-инфекции с 52 (17,6%), 55 (13,2%) и 18 (6,1%) генотипами ВПЧ. При пограничных опухолях сочетание ВЭБ - и ВПЧ -инфекции с 52 серотипом имелось в 12,5% и с 55 - в 8,3% наблюдений. Таким образом, ассоциация ВЭБ и ВПЧ, по нашим данным отмечавшаяся в 28,0% случаев, может оказывать взаимопотенциирующее влияние, приводя к выраженным нарушениям генетического гомеостаза клетки.

Следующим этапом наших исследований явилось изучение вируса папилломы человека в тканях опухолей яичников различного гистогенеза в сравнении с группой контроля. При ДНК-диагностике ВПЧ в 76,5% случаев злокачественных опухолей яичников ВПЧ был положительным. В нормальной же ткани яичников лишь 8% случаев зарегистрированы позитивные результаты (р<0,05).

Причем, частота выявления ВПЧ в образцах серозного (п=76) и муцинозного (п=22) РЯ имела практически одинаковые значения - 75,3% и 77,3% соответственно (р>0,05). При пограничных опухолях яичников процент ВПЧ негативных и ВПЧ - позитивных образцов был примерно одинаков (45,8% и 54,2% соответственно), тогда как при ДЭОЯ ВПЧ не был идентифицирован в 65,4% наблюдений. Тот факт, что ВПЧ при различных вариантах РЯ выявляется статистически достоверно выше, чем в нормальных тканях, а так же наличие ВПЧ в 54,2% наблюдений при пограничных опухолях яичников, позволяет предположить его существенную роль в возникновении и развитии неоплазий яичников.

Нами установлено, что с наибольшей частотой эпителиальный РЯ ассоциируется с ВПЧ-18 (30,6%), ВПЧ-52 (30,6%), ВПЧ-55 (27,6%), ВПЧ-83 (18,4%), ВПЧ-39 (17,3%) генотипами (рис. 11).

При пограничных опухолях отмечалась такая же тенденция, как и при злокачественных опухолях: в наибольшем числе наблюдений присутствовали ВПЧ 18 и 83 генотипов (16,7%), 39 и 52 генотипа -12,5%. ВПЧ с низким онкогенным потенциалом определялись лишь в образцах ткани при ДЭОЯ. Так ВПЧ 11 генотипа выявлялся в 5,8% случаев, 6 генотипа - в 3,8%, а 53 генотипа - в 1,9%. Как правило, в большинстве случаев (54,2%) определялось сочетание двух и более генотипов ВПЧ высокого онкологического риска. Доля пациенток с наличием 16 и 18 генотипов при ПЭОЯ составила 18,8%, а при ДЭОЯ - лишь у 1 пациентки в ткани яичников определялся ВПЧ 18 генотипа.

□ ДЭОЯ ИПЭОЯ пзэоя

Рис. 11 Частота выявления генотипов ВПЧ (%) в образцах ткани при злокачественных, пограничных н доброкачественных опухолях яичников методом Г1ЦР

Обнаружено, что муцинозный РЯ с наибольшей частотой сочетается с ВПЧ 18 (77,2%) генотипом (р<0,01), а при серозном РЯ в большинстве овариальных проб выявлено присутствие ВПЧ 52 (36,8%) и 55 (32,9%) типов (р<0,01). Разница статистически достоверна.

Оценивая результаты наших исследований в отношении роли ВПЧ в генезе эпителиальных опухолей яичников, хотелось бы отметить три основных обстоятельства. Первое, это то, что ВПЧ 18, 52, 55, 83 и 39 генотипов, обладает высоким онкогенным потенциалом в отношении эпителиального РЯ. Второе -несмотря на низкую частоту выявления ПВИ 73, 31, 51, 45, 33, 66, 68 и 16 генотипов, все же нельзя отрицать их роль в канцерогенезе эпителиальных опухолей яичников. По-видимому, ВПЧ 35, 58, 59, 6, 11, 42, 53 и 54 генотипов, необходимо трактовать как типы низкого онкологического риска для развития ЗЭОЯ. Третьим обстоятельством является то, что, основываясь на различных результатах исследования ВПЧ при серозных и эпителиальных вариантах РЯ, следует предполагать различную значимость того или иного генотипа в зависимости от гистогенеза опухоли.

В исследовании проанализирован уровень экспрессии онкобелка Е 7 методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием широкой панели моноклональных антител для ВПЧ 18 генотипа в 61 овариальных пробах при раке яичников (из них 20 образцов ткани были ВПЧ-18 позитивны и 41 образец - ВПЧ - негативен), в 18 - при пограничных опухолях яичников и в 15 образцах ткани при доброкачественных опухолях яичников.

Прежде всего, стоит обратить внимание на результаты, касающиеся ВПЧ-18 позитивных образцов. Из 20 образцов ткани больных РЯ 1-1У стадий, продукция онкобелка Е 7 отмечена у 14 пациенток (70,0%), при этом в большинстве случаев при ранних стадиях заболевания. Отсутствие онкопротеина отмечено лишь у 6 (30%) пациенток, ВПЧ+ по 18 серотипу, с распространенными стадиями

заболевания. Что касается ДЭОЯ из 2 ВПЧ - 18 позитивных образцов ткани, ни в одном не было обнаружено синтеза онкобелка Е 7. При ПЭОЯ, из 8 ВПЧ - 18 позитивных проб, в 2 не было отмечено присутствие онкопротеина Е 7.

Можно предположить, что синтез онкобелка Е 7, начинающийся в клинической стадии, соответствующей предраковым изменениям, по мере прогрессирования заболевания имеет тенденцию к снижению.

Анализ образцов ткани яичников ВПЧ - негативных по 18 генотипу, у пациенток с ДЭОЯ (13 пациенток) и ПЭОЯ (10 пациенток), продемонстрировал отсутствие синтеза онкобелка Е 7 у 100% пациенток.

Таким образом, продукция вирусного белка Е 7 в тканях ЗЭОЯ, происхождение которого полностью связано с жизненным циклом интегративной формы вируса папилломы человека, наряду с ее отсутствием при доброкачественных процессах, является еще одним доказательством участия ВПЧ в канцерогенезе при раке яичников. Тот факт, что в ткани яичников имеет место продукция ВПЧ-18 Е 7 протеина при ЗЭОЯ и ПЭОЯ, позволяет нам рассматривать папилломавирусную инфекцию в качестве экзогенного ко-канцерогенного фактора овариального канцерогенеза. Все полученные нами результаты, с большой долей вероятности, позволяют предположить инициирующее влияние инфекционных агентов, таких как ВПЧ и ВЭБ, в канцерогенезе эпителиального РЭ, ведущее в совокупности с эндогенными модифицирующими факторами (гормональный, генетический и иммунный), к появлению злокачественной опухоли яичников.

Нами был проанализирован ИМТ и состояние баланса метаболитов эстрогенов при раке, пограничных и доброкачественных опухолях яичников.

Индекс массы тела исследован у 100 больных раком яичников, у 50 пациенток с наличием пограничных опухолей и 50 пациенток с наличием цистаденом яичников. Проанализированы так же результаты измерения уровня метаболитов эстрогенов у 80 больных раком яичников, 38 пациенток с пограничными и 46 пациенток с доброкачественными опухолями яичников.

Таб. 7 Средний уровень соотношения метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 в зависимости от индекса массы тела при злокачественных, пограничных и доброкачественных опухолях яичников___

ИМТ ЗЭОЯ (N=80) ПЭОЯ (N=38) ДЭОЯ (N=46) Контрольная группа (N=100)

нормальный ИМТ 18,50-24,99 1,20±0,19 1,64±0,32 2,02±0,34 2,14±0,39

повышенный ИМТ 25,00-29,99 0,88±0,31ф 1,12±0,20 1,86±0,25 2,03±0,29

ожирение ИМТ >30,00 1,11±0,19* 1,22±0,20 1,56±0,27 2,00±0,31

*р<0,05 в сравнении с группой контроля

При анализе полученных данных по подгруппам отмечается наибольшее количество пациенток с превышением массы тела среди больных раком яичников

- 81,0%, из них ожирение имелось у 31,0% пациенток. При пограничных опухолях яичников данный показатель был выше нормы у 70,0% пациенток, а у женщин с наличием доброкачественных опухолей яичников - у 56,0%, в сравнении с группой контроля отмечаются выраженные различия в группах пациенток с нормальным ИМТ (р<0,05).

Были проанализированы средние уровни и соотношение метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 при различных опухолях яичников в сравнении с группой контроля для определения значимости дисбаланса соотношения 2-й 16а

- гидроксипроизводных эстрогенов в процессах опухолеобразования в ткани яичников. (Табл. 7),

В контрольной группе наблюдается некоторая, вполне объяснимая, тенденция к снижению соотношения метаболитов при увеличении ИМТ. При РЯ наиболее низкое соотношение выявлено при повышенном ИМТ (25,00-29,99). В группах ПЭОЯ и ДЭОЯ наибольшее снижение данного соотношения отмечено при ИМТ более 30,0, что коррелирует с показателями, полученными для группы контроля. Как при ожирении, так и среди пациенток с нормальным ИМТ, показатели коэффициента снижены не столь значительно. То же касается наблюдений при пограничных и доброкачественных опухолях яичников. Мы предполагаем, что это объясняется длительным бессимптомным течением опухолей яичников (70% выявляется при 3-4 стадиях заболевания), которое сопровождается такими симптомами как слабость, апатия, снижение аппетита и, как следствие, потеря массы тела. Таким образом, на момент установки диагноза, многие больные значительно теряют в весе.

Учитывая многообразие клинических и морфологических форм опухолей и вариантов течения рака яичников, нельзя не остановиться на других этиопатогенетических моментах. Многочисленные эпидемиологические исследования указывают, что на частоту рака яичников оказывают существенное влияние ряд репродуктивных факторов: длительность репродуктивного периода, число доношенных беременностей, длительность лактационного периода. Отмечено, что риск рака яичников снижается с каждой доношенной беременностью на 13-19% и возрастает при раннем менархе и позднем наступлении менопаузы, а также позднем возрасте первой беременности и при бесплодии. Все эти факторы приводят к увеличению количества овуляторных циклов у данной категории больных. Проведенный нами ретроспективный анализ анамнестических данных в группе больных раком яичников в сравнении с группой контроля подтверждает эти данные (Табл. 8).

Интегрируя фактор воспаления, сопровождающий каждую овуляцию, с целым рядом молекулярно-биологических и тканбвых перестроек можно с определенной достоверностью описать вероятную модель канцерогенеза при спорадическом раке яичников. Локальное повреждение эпителия яичников на фоне овуляции сопровождается воспалением и сопутствующими изменениями, предрасполагающими клетки поверхностного эпителия к генетическим повреждениям и злокачественной трансформации. Свободные радикалы могут

прямо или опосредованно реагировать с ДНК эпителиальных и стромальных клеток и вызывать различные генетические и эпигенетические нарушения ее молекулярной структуры.

Таб. 8 Сравнительная характеристика длительности репродуктивного периода, возраста менархе и менопаузы, репродуктивной функции, длительности лактации, частота бесплодия и приема КОК в группе больных раком яичников и в контрольной

Группы пациенток Возраст менархе Возраст менопаузы Число беремен ностей Число родов Длительность лактации Частота бесплодия Частота применения оральны] контрацептивов Длительность репродуктивного периода

Рак яичников (N=100) 10,3±0,9 лет 51,3±1,3 лет 3,8±0,9 1,3±0,6 0,4±0,1 лет 7,0±0,3% 4,0±0,4% 40,6±2,8 лет

Группа контроля (N=100) 12,3±1,2 лет 49,2±1,2 лет 5,3±0.5 2,9±0,8 1,0±0,2 лет 2,0±0,4% 12,0±1,4°Л 36,2±1,8 лет

р<0,0001

Кроме того, в условиях длительного тканевого повреждения, стимулируются процессы репарации тканей за счет активного деления стволовых клеток, что также повышает вероятность приобретения ими мутаций. К моменту наступления менопаузы на фоне длительных постовуляторных репаративных процессов эпителиальной выстилки яичника могут образовываться мутантные раковые стволовые клетки, инициирующие процессы канцерогенеза. Немаловажным фактором, способствующим трансформации и малигнизации поверхностного эпителия яичников, является воздействие эстрогенных метаболитов в постменопаузальном периоде, на различных звеньях возникновения опухоли, вследствие доказанных нашими исследованиями, имеющихся гормонально - обменных нарушений, а так же наличие ВПЧ -инфекции, в качестве ко-фактора, стимулирующего процессы канцерогенеза. И наконец, последнее, понимание совокупности гормональных и микробиологических изменений позволит нам целенаправленно и эффективно восстановить нарушенный баланс гормонов, предотвратить неблагоприятное воздействие эстрогенных метаболитов и инфекционных агентов и выделить группы риска для более активного наблюдения. Что, в конечном итоге, позволит добиться более значительного прогресса в профилактике и лечении данной патологии. Таким образом, этапы канцерогенеза на модели яичников могут формироваться в следующей последовательности (рис. 12).

Травм» пр^внргр зггитрлия -■ уррпи'чёскре воспаление -

Рис. 12. Этапы канцерогенеза на модели яичников

Рак молочной железы

На сегодняшний день достигнут существенный прогресс в вопросах патогенеза, диагностики и лечения рака молочной железы. Если для "гормонозависимого" варианта рака молочной железы вполне очевидна схема взаимодействия гормон - рецептор, то при "гормононезависимом" варианте или в постменопаузе эти два звена претерпевают значительные изменения: смещается спектр секретируемых гормонов, падает уровень рецепторов. Общеизвестно, что с возрастом падает реактивность тканей к действию гормонов, вследствие снижения числа специфических рецепторов в клетках, реагирующих на действие того или иного гормона (Hess G., 1982). Проблема заключается в том, насколько синергичны процессы формирования гормональной и рецепторной недостаточности в постменопаузе, с одной стороны, а с другой, - каков принцип "реанимации" стероидных рецепторов в тканях-мишенях при развитии гиперпластических процессов и злокачественной опухоли. С нашей точки зрения, наиболее значимые направления в патогенезе рака молочной железы, которые требуют сегодня пристального внимания, это эндокринологическое и инфекционное.

Проведено изучение уровня эстроген - рецепторов в ткани молочной железы с помощью иммуногистохимического исследования у 68 пациенток с наличием рака молочной железы (РМЖ), 50 пациенток с узловыми формами мастопатии (УФМ) и 64 пациентки постменопаузального периода, имеющих картину инволютивных (соответствующих возрасту) изменений. В группе контроля в 62,3% случаев среди женщин постменопаузального возраста рецепторы эстрогенов не определялись. В группе пациенток с УФМ получены эстроген -негативные результаты у 52,0% пациенток.

У 32 больных имелся "гормонозависимый" и у 36 - "гормононезависимый" рак молочной железы, по данным иммуногистохимического исследования.

Таб. 10 Уровень эстроген - рецепторов (%) в ткани молочной железы при раке молочной железы, узловых формах мастопатии и в контрольной группе (иммуногистохимический метод)_

Группы пациенток Число пациенток Уровень рецепторов

ЭР- ЭР+ ЭР++ ЭР+++

РМЖ 68 47,0% 14,0% 21,5% 19,0%

УФМ 50 52,0% 18,0% 12,0% 18,0%

Контрольная группа 64 62,3% 18,7% 1,9% 17.1%

р<0,1

Следует отметить, что примерно одинаковая доля образцов ткани молочной железы при раке, узловых формах мастопатии и в группе контроля сохраняла высокий, клинически значимый уровень рецепторов. По нашему мнению, в этой группе создаются наибольшие предпосылки для возникновения и развития рака молочной железы, что требует более тщательного динамического мониторинга за состоянием молочных желез у этих пациенток.

В то же время мы посчитали необходимым дополнить иммуногистохимическое исследование методикой полимеразной цепной реакцией в «режиме реального времени» с предварительной реакцией обратной транскрипции у 14 пациенток в группе больных "гормононезависимого" рака. Стоит отметить то, что изучались образцы, которые по данным иммуногистохимического метода в отношении уровня ЭР были отрицательны. Во всех образцах опухоли отмечена экспрессия мРНК эстрогеновых рецепторов, однако уровень экспрессии был весьма вариабелен. Наше объяснение этого факта сводится к тому, что иммуногистохимический метод отражает количественно уровень белка рецептора, в то время, как метод ОТ-ПЦР дает информацию о генетическом фрагменте, ответственном за экспрессию этого белка. Таким образом, при РМЖ всегда запущена генетическая программа синтеза белка эстрогенового рецептора. Причем, эстрогеновый рецептор способен взаимодействовать с любым лигандом, у которого "молекулярный диапазон" близок к эстрогенам. Очевидно, что молекулярная формула метаболита 16а-ОН в этом смысле наиболее близка.

Для доказательства наших предположений в настоящей работе изучен ИМТ у 120 больных РМЖ, 100 пациенток с УФМ и у 100 пациенток группы контроля.

Полученные нами данные подтверждают наличие метаболических нарушений у больных РМЖ, включенных в исследование. В группе пациенток с наличием РМЖ лишь у 23 пациенток (19,1%) имелся нормальный ИМТ, у 48 больных (40%) он был повышен, а у 49 (40,9%), свидетельствовал о наличии ожирения различной степени выраженности. В группе пациенток с УФМ, так же отмечена тенденция к повышению ИМТ - так у 33 пациенток отмечено превышение нормальных показателей и у 30 пациенток данной группы имелось

ожирение. Нормальные показатели ИМТ были лишь у 37 женщин, что значительно отличается от группы контроля. При анализе данных ИМТ в группе больных РМЖ, следует отметить, что в 106 наблюдениях - 94,8% пациенток РМЖ - отмечено превышение показателей ИМТ, что достоверно отличается от показателей группы контроля (р<0,05).

С целью изучения уровня метаболитов и коэффициента их соотношения, мы обследовали 86 больных раком молочной железы, 50 пациенток с узловыми формами мастопатии и 100 пациенток контрольной группы, определяя уровень метаболитов в моче (2-ОНЕ1, 16а-ОНЕ1) и их соотношение.

Средний уровень метаболита 16а-ОНЕ1 в группе пациенток РМЖ оказался более, чем в 4 раза выше, чем в группе контроля - на 76,0%, а в сравнении с группой пациенток с УФМ - на 35,6%. В то же время уровень 2-ОНЕ1 в группе больных РМЖ был в 19,4% ниже, чем в группе контроля и на 68,9% ниже, чем при УФМ. Соотношение метаболитов в группах также демонстрировало существенные, статистически достоверные (р<0,05), различия. Если в контрольной группе и у пациенток с УФМ величина 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 была примерно одинакова и укладывалась в нормальные значения для пациенток постменопаузального периода, то при РМЖ этот показатель был снижен более чем в 5 раз. Полученные данные статистически достоверны (р для 16а -ОНЕ1 = 0,013 и р для 2-ОНЕ1= 0,001) и свидетельствуют о том, что в группе больных РМЖ метаболизм эстрона через систему цитохромов Р450 чаще ориентирован на продукцию «агрессивного» метаболита 16а-ОНЕ1, в отличие от контрольной группы и группы женщин с УФМ.

Таб. 11 Средний уровень соотношения метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 в зависимости от индекса массы тела при раке молочной железы и узловых формах мастопатии

ИМТ Рак молочной железы (N=86) Узловые формы мастопатии (N=50) Контрольная группа (N=100)

нормальный ИМТ 18,50-24,99 0,80±0,28+ 2,24±0,48 2,14±0,39

повышенный ИМТ 25,00-29,99 0,52±0,12** 2,17±0,42 2,03±0,29

ожирение ИМТ >30,00 0,39±0,09** 1,99±0,26 2,00±0,31

*р<0,05, **р<0,01 в сравнении с группой контроля

Обращает на себя внимание то, что при РМЖ даже в группе больных с нормальным ИМТ, в отсутствии клинически выраженных проявлений метаболического синдрома, отмечен низкий (0,8) коэффициент соотношения метаболитов (Табл. 11). Отчетливо прослеживается и следующая тенденция: по мере нарастания ИМТ снижается соотношение метаболитов, о чем свидетельствует более высокий уровень экспрессии 16а-ОНЕ1. При значении соотношения уровня метаболитов 20НЕ1/16а-0НЕ1 менее 1, пациенток в контрольной группе и при доброкачественных процессах не выявилось. Напротив, при РМЖ данное соотношение было получено у большинства пациенток.

Коэффициент более 2 имел место значительной доли пациенток контрольной группы - 82, в то время как при РМЖ он отмечен лишь в 4 случаях. Все данные статистически достоверны - Р = 0,0006. Таким образом, низкое соотношение 2-ОНЕ1 к 16а-ОНЕ1 можно считать фактором риска развития РМЖ.

Низкий коэффициент соотношения метаболитов при высоком ИМТ может служить признаком высокого риска развития в будущем опухолей репродуктивных органов, что наиболее отчетливо показано результатами исследований в отношении РМЖ и РЭ. Понимание и учет этих фактов формирует совершенно новые принципы профилактики, мониторинга и ранней диагностики рака репродуктивных органов. Полученные результаты могут дополнить и расширить понимание механизмов возникновения опухоли при так называемом «гормонозависимом» РМЖ.

Следующий этап исследований был связан с изучением инфекционной составляющей при РМЖ. Опираясь на данные литературы о возможной связи ВПЧ и герпес - вирусов с возникновением РМЖ и отсутствие данных о возможном участии бактериальных агентов в промоции канцерогенеза при РМЖ, нами был изучен спектр вирусных инфекций в ткани молочной железы у 68 больных РМЖ 1-1У стадий, 48 пациенток с УФМ и у 50 пациенток контрольной группы.

ВПЧ был выявлен в 7,4% образцов опухолевой ткани молочной железы - у трех пациенток со второй стадией РМЖ и у двух пациенток с первой стадией РМЖ. В группе пациенток с УФМ ВПЧ был выявлен так же в 14% образцов опухоли молочной железы. Доля ВПЧ-положительных образцов в группе контроля была так же не велика и составила 12%. Полученные данные позволяют Заключить, что наличие папилломавирусной инфекции не играет существенной роли в этиопатогенезе РМЖ, вследствие отсутствия достоверных различий (р>0,1) в исследуемых группах.

Эпштейн -Барр вирус (ВЭБ) был выявлен при ПЦР - диагностике в 1 образце ткани при раке молочной железы (1,5%). Ни у одной из пациенток с узловыми формами мастопатии и в контрольной группе не было выявлено ВЭБ - инфекции. Цитомегаловирус и вирус простого герпеса II не определялись в ткани опухоли молочной железы у пациенток как при злокачественных и доброкачественных новообразованиях молочных желез так и в контрольной группе.

Данные литературы, касающиеся оценки инфекционной составляющей при неоплазиях молочной железы, более всего обосновывают участие в опухолевой трансформации ткани молочной железы ММТУ - ретровируса, родственного вирусу опухолей молочных желез мышей. В нашей работе была изучена частота выявления данного вируса в опухолевой ткани молочной железы при раке и УФМ, в сравнении с группой контроля. При детекции вируса ММТУ в 20-ти образцах ткани молочной железы при раке (29,4%) и в 10 образцах (20,8%) при УФМ были получены положительные результаты. При этом в нормальной ткани данный вирус выявлен не был ни в одном образце. Полученные данные не выявили достоверную разницу в детекции ММТУ при РМЖ, УФМ в сравнении с группой контроля (р>0,05), что позволяет высказаться о сомнительной роли ММТУ в патогенезе как доброкачественных, так и злокачественных опухолей

молочной железы, вследствие чего, его определение не может использоваться для ранней диагностики рака молочной железы.

Таким образом, подводя итог исследованиям гормонального и инфекционного факторов в патогенезе РМЖ, следует отметить наиболее важные моменты. Первое, это то, что при РМЖ у преимущественного числа больных имеются проявления метаболического синдрома; второй факт - при РМЖ имеется высокий уровень продукции агрессивного метаболита 16а-ОНЕ1 и низкая экспрессия 2-ОНЕ1; третьим является тот факт, что во всех образцах РМЖ определяется экспрессия мРНК эстрогеновых рецепторов и, наконец, четвертое -в патогенезе РМЖ инфекционный фактор не несет выраженной значимости.

Учитывая клиническое разнообразие рака молочной железы, мы считаем вправе представить этапность канцерогенеза при данной локализации рака в виде следующей схемы (Рис. 13), принимая во внимание, что она строго детерминирована для пациенток постменопаузального возраста и не в состоянии дать исчерпывающую траковку всего спектра факторов злокачественной трансформации для ткани молочной железы.

Принципы патогенетической профилактики и ранней диагностики опухолей женской репродуктивной системы На основании полученных нами результатов нами выделен ряд важных факторов, определяющих некоторую общность в патогенезе опухолей женской репродуктивной системы, что диктует необходимость комплексного подхода к ранней диагностике и профилактике рака репродуктивных органов.

В настоящее время, основываясь на большом количестве исследований, соотношение метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1считается универсальным диагностическим биомаркером при определении риска развития

Инвопштивно-атрофичоскив процессы

Патологическая пролиферация

Высокий уровень 16й-ОН

МЕНОПАУЗА

Рис. 13. Компоненты, формирующие постменопаузальпом периоде

канцерогенез молочной железы

рака эстроген - зависимых органов (Ашрафян JI.A., Киселев В.И., 2004, 2008, 2009гг).

В ходе проведенных исследований установлено, что в группах больных раком органов женской репродуктивной системы коэффициент соотношения метаболитов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 был в два раза, и даже более, ниже показателей группы контроля. В постменопаузе, на фоне снижения синтеза эстрогенов яичниками, происходит усиление синтеза эстрогенов в жировой ткани путем ароматизации. Анализируя показатели коэффициента соотношения метаболитов при раке органов женской репродуктивной системы различной локализации в зависимости от ИМТ, мы видим, что коэффициент соотношения метаболитов находится в обратной зависимости от ИМТ - при увеличении массы тела, а, следовательно, количества жировой ткани, отмечается снижение данного соотношения. Таким образом, у большинства больных раком ОЖРС, особенно при наличии метаболического синдрома, в отличие от здоровых пациенток, метаболизм эстрогенов, который осуществляется через систему цитохромов Р-450, ориентирован на синтез «канцерогенных» метаболитов, что, в свою очередь, создает предпосылки для образования устойчивого комплекса гормон — рецептор, индуцирующего длительный пролиферативный сигнал.

Итак, одним из ключевых моментов гормонального гомеостаза в постменопаузе становится взаимодействие системы эстрогенный метаболит и эстроген-рецептор, формируя гиперпластическую или инволютивную направленность тканей-мишеней.

Представляется очевидным, что в постменопаузе формируются четыре варианта состояния гормональной системы. При первом, протекающем на фоне высокой экспрессии 16а-гидроксиэстрона, при сохраненном рецепторном статусе, формируется патогенетическая база гиперпластических процессов. Остальные три варианта ассоциируются с инволютивными, атрофическими процессами, низким индексом массы тела, остеопенией и остеопорозом.

Определяя вероятную модель канцерогенеза в постменопаузе, мы столкнулись с тем, что вся физиология постменопаузы формирует ряд существенных нарушений, способствующих увеличению фактора хронической патологической пролиферации (Рис. 14).

При этом можно выделить два основных вектора:

- вектор, способствующий развитию пролиферативных процессов через систему гормональной регуляции (сохраненный рецепторный статус, высокий уровень экспрессии агрессивных метаболитов);

- вектор, индуцирующий пролиферацию через этап инволютивно -атрофических процессов, с нарушением трофики тканей, её травматичностью, с явлениями хронического воспаления, выраженными нарушениям микробиоценоза, индуцирующие мутированные стволовые клетки органов-мишеней.

Учет этих особенностей постменопаузы формирует дифференцированные подходы к реализации профилактических мероприятий и в этом смысле профилактика приобретает патогенетическую направленность.

вярнянт

I ViiapiinuT

Рис. 14 Варианты формирования гормонального гомеостаза в постменопаузалыюм периоде

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости блокировки указанного ключевого пути патологической пролиферации в гормон — зависимых органах. Одним их способов является применение антиметаболических препаратов, обладающих антиэстрогенным эффектом, вследствие стимуляции выработки 2-ОНЕ1.

В рамках нашей работы было важно выяснить, можно ли каким-то образом повысить в организме уровень 2-ОНЕ1 и тем самым блокировать один из ключевых путей патологической пролиферации в гормонзависимых тканях? В многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях было показано, что активно действующий компонент индинола - индол-3-карбинол, а также его физиологический метаболит - 3,3'-дииндолилметан (DIM) обладают выраженным антиэстрогенным эффектом, стимулируя образование в гормонзависимых тканях антипролиферативного 2-гидроксиэстрона и улучшая таким образом соотношение 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 в пользу первого (Bradlow HL, 1994; Michnovicz JJ, 1998; Chatterji U., 2004; Brandi G., 2012). Имеются данные, указывающие и на прямое ингибирование со стороны I3C и DIM сигнальных каскадов, опосредуемых эстрадиол - активируемыми эстрогеновыми рецепторами (ERa) (Meng Q., 2000; Но JN, 2012).

Опираясь на эти данные, была предпринята попытка изменить уровень экспрессии эстрогенных метаболитов в сторону усиленной продукции антипролиферативного метаболита 2-ОНЕ1 (2-гидроксиэстрона) у больных РМЖ, преследуя, как бы две цели: предупреждение новых очагов рака в контралатеральной молочной железе и предупреждение рецидива заболевания и метастазирования.

С этой целью 68 больных РМЖ в течение 6 месяцев получали индинол в дозировке 2 капсулы 2 раза в день (400мг в сутки) и в интервале 3 и 6 мес. у них определялся уровень 2-гидроксиэстрона и 16а-гидроксиэстрона в моче.

Результаты исследования свидетельствуют (Рис. 15), что заметное улучшение в метаболизме эстрогенов проявляется уже после 3-х месяцев приема: существенно снизился уровень 16а-ОНЕ1 (с 18,63 нг/мл до 12,00нг/мл) и возрос уровень экспрессии 2-ОНЕ1 (с 7,8 нг/мл до 11,31 нг/мл), а коэффициент соотношения метаболитов увеличился более чем в 2 раза: с 0,42 до начала лечения до 0,94 через 3 мес. Последующие 3 месяца приема привели к полному восстановлению нормального соотношения метаболитов. Коэффициент 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 достиг 2,31 (р<0,05).

До лечения Через 3 месяца Через 6 месяцев

Рис. 15 Средний уровень и соотношение метаболитов у больных раком молочной железы при приеме индинола в динамике

При этом экспрессия 16а-ОН снизилась в 3 раза по сравнению с данными до начала лечения. Иными словами, для достижения полного «метаболического» эффекта необходим длительный, не менее полугода, прием препарата. Этот факт вполне вписывается в механизм фармокинетики таргетных препаратов, эффект действия которых сопряжен с формированием нормальных физиологических процессов и формирует благоприятную перспективу в патофизиологии рака молочной железы и делают ещё один шаг в реализации патогенетической терапии и профилактике этого заболевания.

Учитывая простоту определения уровня метаболитов в моче, а так же невысокую стоимость, данное исследование может использоваться при формирования групп риска по возникновению пролиферативных заболеваний ОЖРС, а так же для их мониторинга.

Проведенными исследованиями продемонстрирована ключевая роль вирусной инфекции в патогенезе большинства опухолей женской репродуктивной системы - РВ, РШМ, РЯ. При таких локализациях, как РЭ и РМЖ, значение вирусной составляющей в канцерогенезе не столь велико. Особенно важным представляется исследование ВПЧ, а главное, онкопротеина Е 7, при

цервикальных интраэпителиальных неоплазиях, вследствие неуклонного роста больных дисплазиями шейки матки в различные периоды жизни женщин.

Это, прежде всего, связано с увеличением доли инфекционных заболеваний, передающихся половым путем и возрастанием частоты ВПЧ инфекции. Прогресс молекулярной биологии сформировал новое понимание начальных этапов канцерогенеза в развитии неоплазий шейки матки и обозначил новые перспективы в ранней диагностике этого заболевания.

Рис. 14. Соотношение инфицировянности ВПЧ (%) и детекции онкобелка Е7 (%) у больных со злокачественными новообразованиями органов женской репродуктивной системы

Полученные данные свидетельствуют о том, что в группе больных с дисплазиями шейки матки имеются значительные качественные различия в молекулярно-биологических критериях. Причем, у части больных эти различия не пропорциональны степени тяжести морфологических проявлений. Иными словами, ориентир на молекулярно-биологические критерии при цервикальных неоплазиях позволяет намного конкретнее судить о злокачественной направленности дисплазии, что неминуемо должно учитываться при формировании принципов терапии и последующего мониторинга. По нашему мнению, иммуноферментный анализ на онкобелок Е 7 открывает совершенно новые перспективы в проблеме ранней диагностики РШМ и РВ. РВ и СЛВ не являются столь частыми заболеваниями, как CIN и РШМ. Однако, тот факт, что показатели запущенности при РВ наиболее высоки, а наличие выраженной экстрагенитальной патологии пациенток РВ и СЛВ, часто не позволяет провести радикальное лечение, делает поиск адекватных маркеров раннего канцерогенеза при данных нозологиях наиболее актуальным. Учитывая механизм экспрессии онкобелка Е 7, можно уверенно обозначить его, как истинный и самый ранний маркер канцерогенеза при наличии ВПЧ инфекции. Высокая чувствительность и низкая стоимость дают возможность вполне реально рассматривать его в качестве теста ранней диагностики процессов малигнизации. Эта модель исследований совершенно по - новому формирует принципы отбора пациенток для последующей уточняющей диагностики и мониторинга. Ориентир на ранние

сигнальные маркеры канцерогенеза усилит эффективность ранней диагностики РШМ и РВ и сделает более целенаправленной вторичную профилактику.

Выводы

1. В постменопаузе следует дифференцировать 4 варианта гормонального гомеостаза, который формируется с учетом уровня эстроген - рецепторов в органах - мишенях и экспрессии эстрогенного метаболита 16а-гидроксиэстрона, определяющего патогенетическую базу, на основе которой развивается спорадический рак репродуктивных органов:

• I (ЕЛ+ 16а-ОНЕ1+) гиперэстрогенный или гиперпластический вариант;

• II (ЕЯ- 16а-ОНЕ1-) гипоэстрогенный атрофический вариант;

• III (ЕЛ+ 16а-ОНЕ1-) атрофический вариант;

• IV (ЕЯ- 16а-ОНЕ1+) атрофический вариант.

2. В этиопатогенетической модели рака вульвы наиболее значимы два аспекта:

• эндокринологический, выражающийся в развитии постменопаузального метаболического синдрома (коэффициент 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1= 0,98) и принципах формирования эстроген - рецепторов в ткани вульвы (пул рецепторов сконцентрирован в базальном слое эпидермиса вульвы, что отмечается лишь в 3,8% наблюдений);

• инфекционный, связанный с персистенцией папилломавирусной инфекции (76,2% наблюдений) в эстроген - чувствительном базальном слое эпителия на фоне глубоких изменений вульво - вагинального микробиоценоза.

3. Анатомо-функциональные нарушения при склеротическом лишае, в сочетании с метаболическим синдромом, выраженными нарушениями микробиоценоза вульвы (вирус папилломы человека) и высоким уровнем эстроген - рецепторов в базальном слое эпителия формируют патогенетическую основу предрака вульвы.

4. Сочетание папилломавирусной инфекции и высокого уровня экспрессии 16а-гидроксиэстрона формирует патогенетическую базу рака шейки матки. Любой вариант эндоцервикоза и, в особенности, цервикальной интраэпителиальной неоплазии на фоне экспрессии онкобелка Е 7 является облигатным предраком шейки матки.

5. В этиопатогенетической модели рака эндометрия наиболее значимы следующие аспекты:

• низкая частота (11,7%) вирус - положительных образцов при раке эндометрия в сравнении с контрольной группой (9,6%) свидетельствует об отсутствии роли папилломавирусной инфекции в этиологии рака эндометрия;

• высокая экспрессия 16а-гидроксиэслрона (коэффициент 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1=0,95) при наличии эстрогеновых рецепторов формирует промоторный вариант гормонального канцерогенеза. При втором, гормонально независимом, варианте заболевания, злокачественный процесс формируется на фоне атрофии эндометрия.

6. Высокий уровень 16а-гидроксиэстрона на фоне сохраненного рецепторного аппарата эндометрия в постменопаузе формирует

патогенетическую базу облигатного предрака - I патогенетический вариант заболевания. Атрофию эндометрия на фоне хронического воспаления следует рассматривать как облигатный предрак, соответствующий II патогенетическому варианту заболевания.

7. В этиопатогенетической модели рака яичников наиболее значимы следующие аспекты:

• овуляторный фактор. В группе больных раком яичников частота овуляторных циклов в 2,8 раз выше, чем в контрольной группе;

• инфекционный фактор. Злокачественные эпителиальные опухоли яичников в 76,1% наблюдений сочетаются с папилломавирусной инфекцией. При этом с наибольшей частотой отмечено присутствие ВПЧ 18 (30,6%), 52 (30,6%), 55 (27,6%), 83 (18,4%) и 39 (17,3%) генотипов и реже 73, 31, 51, 45, 33, 66, 68 и 16 генотипов. При этом, онкобелок Е7 18 генотипа в ВПЧ-18 позитивных образцах опухолевой ткани яичников зарегистрирован в 70% наблюдений.

8. У 76% больных раком яичников имеется высокая экспрессия 16а-гидроэксиэстрона (коэффициент 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 = 1,11).

9. В этиопатогенетической модели рака молочной железы наиболее значимы следующие аспекты:

• низкая частота (7,4%) ВПЧ - положительных образцов при раке молочной железы по сравнению с контрольной группой (12%) и отсутствие герпес -вирусов в обеих группах, свидетельствует о сомнительной роли ДНК-содержащих вирусов в этиопатогенезе рака молочной железы. Невысокая частота выявления вируса ММТУ (29,4%) в ткани опухоли молочных желез больных раком молочной железы, свидетельствует о сомнительной роли данного вируса в этиопатогенезе рака молочной железы.

• у преимущественного числа больных раком молочной железы (72,5%) коэффициент соотношения метаболитов (2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1) соответствует 0,52, в то время, как в контрольной группе это показатель 2,1, что свидетельствует о доминировании промоторного варианта гормонального канцерогенеза.

10. Высокий уровень 16а-гидроксиэстрона на фоне сохраненного рецепторного статуса в эпителии молочной железы в постменопаузе формирует патогенетическую базу облигатного предрака.

11. Ранняя диагностика рака репродуктивных органов может быть обеспечена жестким мониторингом лиц, имеющих патогенетически значимые факторы риска (высокий уровень метаболита 16а-ОНЕ1, экспрессия белка Е7, хронические воспалительные процессы в органах репродуктивной системы на фоне атрофии).

12. Основные направления патогенетической профилактики спорадического рака репродуктивных органов складываются из информации об экспрессии эстрогенных метаболитов (коэффициент соотношений 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1), уровнях эстроген - рецепторов (для вульвы, эндометрия и молочной железы) и инфекционного (вирус папилломы человека) компонентов (вульва, шейка матки и яичники). Важным фактором профилактики рака репродуктивных органов

являются мероприятия по предупреждению постменопаузальной атрофии (заместительная гормональная терапия).

Практические рекомендации

1. Эффективное проведение профилактических осмотров с целью раннего выявления облигатного предрака и раннего рака репродуктивных органов среди женщин постменопаузального периода, может быть обеспечено учетом комплекса патогенетических критериев (длительность овуляторного периода, коэффициент соотношения метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1, инфекционный фактор (вирус папилломы человека, онкобелок Е7).

2. При неблагоприятном коэффициенте соотношения метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1, с преобладанием «агрессивного» компонента, свидетельствующем о возможной промоции неопластических процессов, следует проводить регулярный жесткий мониторинг органов-мишеней с использованием современных методов ранней диагностики. Наряду с этим, целесообразно усилить меры патогенетической профилактики.

3. Современная патогенетическая профилактика рака репродуктивных органов в постменопаузе должна подразумевать предупреждение инволютивно -атрофических процессов, а так же широкое и длительное использование таргетных (индинол, промисан) препаратов.

4. Исследование онкобелка Е 7 должно стать обязательным компонентом обследования среди пациенток с наличием интраэпителиальных неоплазий шейки матки. Положительные результаты детекции онкобелка Е 7, даже при отсутствии данных за наличие цервикапьной интраэпителиальной неоплазии, являются признаком интеграции вирусной ДНК в геном клетки и свидетельствуют о необходимости применения более радикальных методов лечения и последующего жесткого мониторинга. Отсутствие экспрессии онкобелка Е 7 в цервикапьных пробах больных с дисплаэиями шейки матки, позволяет широко использовать консервативные и органосохраняющие варианты лечения.

5. Современная профилактика спорадического рака репродуктивных органов должна формироваться с раннего репродуктивного периода, и подразумевает максимальное снижение числа овуляторных циклов (неоднократные роды, длительная лактация, прием комбинированных оральных контрацептивов), профилактику папилломавирусной инфекции, контроль индекса массы тела. На этапе ранней постменопаузы целесообразно широкое использование заместительной гормональной терапии при явно атрофическом (II, III, IV) варианте постменопаузы.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Бабаева H.A., Степанова Е.В., Антонова И.Б., Ивашина C.B. Крауроз (склеротический лишай) как предрак вульвы.// «Вопросы онкологии» 2004, №3, Т. 50, С. 320-326.

2. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Степанова Е.В., Бабаева H.A. Рак вульвы — этиопатогенетическая концепция.// «Российский онкологический журнал» 2004, №5, С. 22-25

3. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Огрызкова B.JI., Бабаева H.A., Саратян A.A., Аснис Н.П., Полубенцев Д.Ю., Басова И.О. Современные принципы первичной и уточняющей диагностики рака эндометрия.// «Практическая онкология», 2004, №1, Т.5. С.16-18.

4. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Бабаева H.A., Степанова Е.В., Ивашина C.B. Склеротический лишай (крауроз) как предрак вульвы. // «Вестник российского научного центра рентгенорадиологии», 2004 (URL: http:// vestnik.rncrr.ru)

5. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Бабаева H.A., Степанова Е.В. Лечение склеротического лишая вульвы.// «Вестник российского научного центра рентгенорадиологии», 2004 (URL: http://vestnik.rncrr.ru)

6. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Бабаева H.A., Степанова Е.В. Уровень эстроген - рецепторов в ткани вульвы при склеротическом лишае.// «Вестник российского научного центра рентгенорадиологии», 2004 (URL: http://vestnik.rncrr.ru)

7. Ашрафян JI.A., Бабаева H.A., Антонова И.Б. Харченко Н.В, Акопова Н.Б., Ивашина C.B., Степанова Е.В. Оценка минеральной плотности кости и индекса массы тела при дистрофии вульвы. // «Журнал Российского общества акушеров-гинекологов» 2004, №1, С. 31-35

8. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Ивашина C.B., Мухтарулина C.B., Бабаева H.A., Басова И.О., ВПЧ-ассоциированные новообразования женского генитального тракта: Роль гормонального фактора в канцерогенезе.// Материалы научно-практической конференции «Современные подходы к диагностике и лечению гинекологического рака», Псков, 2004, С.9-10

9. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Степанова Е.В., Бабаева H.A., Мухтарулина C.B. Роль папилломавирусной инфекции в канцерогенезе неопластических процессов женского генитального тракта на примере рака вульвы.// Материалы научно-практической конференции «Современные подходы к диагностике и лечению гинекологического рака», Псков, 2004, С.6-9

10. Ашрафян Л.А., Киселев В.И., Харченко Н.В., Степанова Е.В., Бабаева H.A. Рак вульвы - этиопатогенетическая концепция.// Материалы III Съезда онкологов и радиологов СНГ часть I, Минск, 2004, С.84-86

11. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Степанова Е.В., Бабаева H.A., Ивашина C.B., Саратян A.A. Рак вульвы: этиопатогенетическая концепция.// Материалы IX Российского онкологического конгресса, Москва, 2005, С.81-82

12. Ашрафян JI.A., Степанова Е.В., Ивашина C.B., Бабаева H.A. Значение уровня минерализации кости и уровня эстроген - рецепторов в тканях -

мишенях при определении патогенетического варианта постменопаузы.// Материалы II Российского конгресса по остеопорозу, Ярославль, 2005, С. 35-36 13. Ашрафян Л.А., Бабаева H.A., Саратян A.A., Парфенова Н.В., Овчинникова О. А. Результаты периферической денситометрии у больных раком эндометрия в постменопаузе.// Материалы II Российского конгресса по остеопорозу, Ярославль, 2005, С. 70

14. Ашрафян JI.A., Антонова И.Б., Чазова H Л., Моцкобили Т. А., Бабаева H.A., Альбицкий И.А. Некоторые особенности воздействия тамоксифена на эндометрий у пациенток в постменопаузе.// «Вопросы онкологии», 2005, №2 Т. 51, С. 200-205

15. Ашрафян JI.A., Антонова И.Б., Моцкобили Т.А., Чазова H.JI., Бабаева H.A., Басова И.О. Роль сонографии и гистероскопии в уточнении состояния эндометрия у женщин постменопаузального периода на фоне приема антиэстрогенов.// «Журнал акушерства и женских болезней», 2005, Спецвыпуск, T. LIV, С. 79-80

16. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Бабаева H.A., Ивашина C.B., Хунова JI.3. Состояние рецепторного аппарата вульвы при склеротическом лишае. // «Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина»,

2006, №1, С. 88-94

17. Ашрафян JI.A., Харченко Н.В., Киселев В.И., Свешников П.Г., Степанова Е.В., Бабаева H.A. Рак вульвы: этиопатогенетическая концепция.// Москва: Молодая гвардия, 2006, -192 с.

18. Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Бабаева H.A., Бударина С.О., Басова И.О., Онкобелок Е 7 как диагностический маркер цервикапьных интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки// // Материалы 8-го Всероссийского научного форума «Мать и дитя» 3-6 октября, Москва, 2006, С. 323

19. Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Бударина С.О., Бабаева H.A., Басова И.О., Хунова Л.З. Молекулярно-биологические аспекты злокачественных трансформаций цервикапьных интраэпителиальных неоплазий.// Материалы юбилейной конференции «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний», Москва, 2007, С. 440-442

20. Ashrafyan L.A., Antonova I.В., BabaevaN.A., Basova I.O., Budarina S.O. Oncoprotein E7 as a marker of malignant transformation cervical intraepithelial neoplasia.//15-th international meeting of the European Society of Gynecological Oncology, Berlin, Germany, 2007, P. 211

21. Ашрафян Л. А., Антонова И.Б., Огрызкова В Л., Бабаева H.A., Басова И.О., Моцкобили Т.А., Мягкова A.A.// Клинико-морфологическое обоснование микроинвазивного рака эндометрия.// «Сибирский онкологический журнал», 2007, №1, С. 8-15.

22. Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Басова И.О., Бабаева H.A., Ивашина C.B. Рак вульвы, эндометрия, яичников в постменопаузе - роль инфекционного фактора.// «Опухоли женской репродуктивной системы»,

2007, №4, С. 72-78

23. Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Бабаева H.A., Ивашина C.B., Моцкобили Т.А., Мягкова A.A. Влияние патогенетического типа постменопаузы на

возникновение рака женских половых органов.// «Вестник Российской ассоциации радиологов», 2011, №4, С. 270

24. Ашрафян JI.A., Антонова И.Б., Моцкобипи Т.А., Бабаева H.A. Влияние тамоксифена на ткань эндометрия у женщин постменопаузального возраста.// «Вестник Российской ассоциации радиологов», 2011, №4, С. 269

25. Ashrafyan L.A., Antonova I.В., Babaeva N.A. Metabolites of estrogens at endometrial cancer and breast cancer.// 17-th international meeting of the European Society of Gynecological Oncology, Milan, 2011, P. 113

26. Ашрафян JI.A., Ивашина C.B., Когай H.В., Моцкобили Т.А., Бабаева H.A., Огрызкова В.А. Возможности соноэластометрии для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей яичников.// «Опухоли женской репродуктивной системы», 2012, № 2, С. 55-59

27. Ашрафян JI.A., Антонова И.Б., Ивашина C.B., Бабаева H.A., Мягкова A.A., Алешикова О.И., Люстик A.B. Молекулярно - биологические и ультразвуковые методы в оценке лекарственной терапии у больных раком шейки матки и раком яичников.// Опухоли женской репродуктивной системы», 2012, № 4, С. 120-125

28. Ашрафян Л.А., Антонова И.Б, Бабаева H.A., Моцкобили Т.А., Ивашина C.B., Мягкова A.A., Алешикова О.И. Значение метаболитов эстрогенов в патогенезе рака эндометрия.// Материалы Республиканской научно-практической конференции с международным участием «Роль новых радиологических технологий в диагностике и лечении заболеваний молочных желез и органов малого таза у женщин», Астана, 2012, С. 60-62

29. Ашрафян Л.А., Боженко В.К., Антонова И.Б., Бабаева H.A., Алешикова О.И., Кудинова Е.А., Мельникова Н.В. Молекулярно-биологические факторы в качественной оценке раннего канцерогенеза шейки матки // Материалы Республиканской конференции с международным участием «Роль новых радиологических технологий в диагностике и лечении заболеваний молочных желез и органов малого таза у женщин», Астана, 2012, С. 57-60

30. Ashrafyan L.A., Antonova I.B., Babaeva N.A., Aleshikova O.I., Khunova L.Z. Diagnostic and predictive value of oncoprotein E7 in cervical intraepithelial neoplasia.// «EUROGIN 2012», Prague, Czech Republic, 2012, P. 177.

31. Бабаева H.A., Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Моцкобили T.А., Ивашина C.B., Мягкова A.A. Клинико-морфологическая концепция микроинвазивиого рака эндометрия.// «Онкология», 2013, № 1, С. 78-83

32. Бабаева H.A., Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Люстик A.B. Роль папилломавирусной инфекции при раке женской репродуктивной системы в постменопаузальном периоде.// «Вестник российского научного центра рентгенорадиологии», 2013 (URL: http:// vestnik.rncrr.ru)

33. Бабаева H.A., Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Моцкобили Т.А., Люстик A.B. Роль метаболитов эстрогенов в патогенезе рака молочной железы, эндометрия и яичников.// «Вестник российского научного центра рентгенорадиологии», 2013 (URL: http:// vestnik.rncrr.ru)

Список используемых сокращений

РОЖРС - рак органов женской репродуктивной системы

РВ - рак вульвы

РШМ - рак шейки матки

РЭ - рак эндометрия

РЯ - рак яичников

РМЖ - рак молочной железы

УФМ - узловые формы мастопатии

CJIB - склеротический лишай вульвы

2-ОНЕ1 - 2 - гидроксиэстрон

16а-ОНЕ1 - 16а-гидроксиэстрона

ЕР (ER) - эстроген - рецепторы

ВПЧ - вирус папилломы человека

ИМТ - индекс массы тела

CIN I—III - цервикальная интраэпителиапьная неоплазия шейки матки I—III степени

АГЭ - атипическая гиперплазия эндометрия

ЗЭОЯ - злокачественные эпителиальные опухоли яичников

ПЭОЯ - пограничные эпителиальные опухоли яичников

ДЭОЯ - доброкачественные эпителиальные опухоли яичников

ВЭБ - вирус Эпштейн - Барр

ИФА - иммуноферментный анализ

MMTV - Mouse Mammary Tumor Virus

Подписано в печать 21.03.13. Формат 60x84/16. Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 198. Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24

2012497584

2012497584