Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Глутатион S-трансфераза Р1-1 в норме и при раке легкого (свойства, функции, диагностические возможности)

од

(

Па правах рукописи

БУЛАВИН ДМИТРИЙ ВИКТОРОВИЧ

ГЛУТАТИОН Б-ТРАНСФЕРАЗА Р1-1 В НОРМЕ И ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО ( СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ, ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ).

14.00.16 - ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ 03.00.04 -БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Са н кт- П етер бур г 1996

Работа выполнена в Военно-медицинской академии

Научные руководители: доктор медицинских наук Л-И. КАР1ЩЕНК0 доктор медицшскчх наук, профессор В.Ю.ШАНИН

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,' профессор К.П.ХАИСОН

доктор медицинских наук, профессор А.М.ЗАЙЧИК

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова

, Защита состоится "Л" ¿ШЖ&ш г. в часов на заседании диссертационного совета Д 106.03.01 при Военно-медицинской академии (194175, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан " " ¿¿¿&икI, 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор В.Н.АЛЕКСАНДРОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема рака легкого - одна из наиболее актуальных в клинической онкологии. За послелнее десятилетие быстрый рост смертности от рака легкого отмечаемся во многих страниц Статистические показатели повышаются примерно на 10 % каждые 5 лег [Rubin С.Н. et а)., 1994). В России, п структуре заболеиаемоет онухолчми, новообразования легкого занимают в настоящее время первое меенч [Березкин Д.П., Филатов В.П., 1989). Неблагоприятные эпидемиологические данные, низкий уровень своевременно!! диагностики и неудовлетворительные результаты лечения диктуют необходимость поиска путей решения чиж сложной и важной проблемы [ Трахтеиберг А.Х. и др., 1987; Напалков НИ, Мерабншвили В.М., 1990; Белоусов В.В., 1991; Morgan G.W., Breit S.N., 1995, Pope С.А. et al., 1995).

В настояшее время большинство отечественных и зарубежных онколог он пришли к мнению, что успешное решение проблемы лечения больных раком легкого, в основном, определяется успехами ее своевременной диагностики [Трахтеиберг А.Х., Кузьмин И.В., 1985; Вагнер Р.И. и др., 1987; Doll R. et al., 1994]. В специализированных клиниках рак легкого удается отвергнуть или подтвердить почти в 100 % случаев. Тем не менее проблема диагностики остается не менее острой, чем 10-20 лет назад. Основная трудность заключается в том, что рак легкого не имеет патогноманичных симптомов. В последние годы активно изучают возможность использования для проведения ранней диагностики различных опухолевых маркеров - биологически активных вешеств, концентрация которых в сыворотке кропи увеличивается в процессе карциногенсза: антигенов, гормонов, ферментов, лишгдов, белков, метаболитов [ Голубев А.Г., Дильман П.И., 1983; Блохнна И.Г., Ткачева Г.А., 1988; Кассалык Л.С. н др., 1988; Габуния Р.И., Ткачева ГЛ., 1989 ; Shin

D.M. e( al.f 1994]. Некоторые из них содержатся в опухоли и появляются в кропи только при определенных условиях. Интересно отметить, что функции практически всех онкомаркеров неизвестны. Таким образом, изучение белка с определенными свойствами, и потенциально являющегося онкомаркером, предаапляет двухсторонний интерес. Одним из таких белков является фермент ксенобиотнко-метаболизирующей группы - глутатион S-трансфераза PI-I, активное изучение которого началось в конце 80-х голов. В настоящее время практически доказана его диагностическая ценность как онкомаркера, хотя производство диагностических наборов, по всей видимости, еще не обсуждалась. Свойства и функции глутатион S-трансферазы Р1-1 изучены крайне фрагментарно, что не позволяет создать целостного представления о роли лот белка в нормальной и опухолевой тканях легкого.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось определение свойств н возможных функций IT Р1-1 в нормальной и опухолевой тканях легкого, оценка диагностической эффективности определения содержания фермента в сыворотке крови больных раком легкого и достаточности проведенною хирургического лечения. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи;

1. Газрабогать методические подходы по выделению ГТ Р1-1 из изучаемого материала, определению биохимических свойств ГТ P1-I в ткани легкого, субклеточному распределению фермента в опухолевой ткани легкого и содержания белка в сыворотке крови методом иммунорадно.метрического анализа.

2. Сопоставить свойства ГТ Р1-1 в нормальной н опухолевой тканях и содержание фермента в сыворотке крови при различных патологических состояниях.

3. Оцешиь субклеточное распределение ГТ Р1-1 и значение фермента в дифференциальной диагностике опухолевых поражений легкого, оценке

эффективности проведенного хирургического лечения,

регулировании пролнферативной активности клеток посредством изменении активности ГТ и содержания восстановленного глутатиона (СБН).

Научная новизна. Получены данные по активности ГТ в нормальной и опухолевой тканях легких. Описан метод выделения ГТ Р1-1 т легочной и плацентарной тканей. Показано наличие двух форм ГТ Р1-1, имеющих одинаковые молекулярные массы, но различные изоэлектрическис точки. Доказано значимое увеличение процентного содержания формы 2 ГТ Р1-1 в опухолевой ткани. Охарактеризована возможность связывания целою спектра жирных кислот с обеими формами фермента, и подтверждено Статистически достоверное увеличение содержания ЖК с длиной углеродной Цепи С=18 и уменьшение ЖК с С=20 в опухолевой форме фермента. Продемонстрирована субклеточная локализация ГТ Р1-1: цитоплазма, ядро, цнтоплазматнческая мембрана. Описан способ определения содержания ГТ Р1-1 в сыворотке крови. Определен верхний уровень содержания фермента в сыворотке крови здоровых лиц. Подтверждено статистически достоверное увеличение содержания ГТ Р1-1 в сыворотке крови больных раком легкого. Оценена возможность определения содержания фермента для подтверждения радикальности выполненного хирургического лечения. Показана возможность связывания ГТ Р1-1 с ключевыми сигнал-передающими белками: рецептором эпидермального фактора роста (РЭФР) и фосфолипазой Су (РГСу). Описан механизм регулирования ферментативной активности ГТ Р1-1 посредством изменения его уровня фосфорилнрования по серину и треонину. Предложена одна из возможных функций фермента, связанная с регулированием пролнферативной активности клеток посредством изменения внутриклеточной концентрации вБИ.

Научная н практическая значимость. Полученные клинические ч экспериментальные данные расширяют теоретические и практически»

представления о роли ГТ Р1-) при онкологических поражениях легких. В настоящей работе показано, что ГТ Р1-1 как в нормальной, так и в опухолевой тканях представлена двумя формами, имеющими различные биохимические свойства и процентное содержание. Охарактеризованы особенности спектров ЖК, связывающиеся с формами ГТ Р1-1, и их изменение при опухолях легких. Показана субклеточная локализация фермеша в раиичных компартментах клетки, что может свидетельствовать о многообрашн функции ГТ Р1-1. Одной из таких функций может быть учаеше ГТ 1*1 — 1 в регулировании митотической активности клеток, опосредуя действие ростовых факторов (в частности, ЭФР) через регулирование виуфнклеточною содержания 0811. Данная функция проявляется при тпмененнн активности фермента, связанной с фосфатной модификацией ГТ I' I -1 по ссрину п треонину.

13 ходе исследования определены новые лабораторно-диагностнческие показатели, позволяющие проводить дифференциальную диагностику опухолевых поражении легких и оценку эффективности выполненного хирургически! о лечения.

Основные положения, выносимые на чащиту:

1. Па основании клинических и экспериментальных данных определяются свойства, субклеточная локализация и возможные функции ГТ РЫ в опухолевой и нормальной тканях леткою. Утверждается возможная роль данною фермента в регуляции пролиферашвион активности клеток посредством изменения внутриклеточного содержания С^Н.

2. Обосновывается диагностическая значимость определения содержания Г! 1*1 — 1 в сынор(>1ке крови при проведении дифференциальной диагностики злокачественных новообразований ле!ких. опенке эффективности выполненною хирургического деченн,.

Реализация и апробация работы. Результаты работы внедрены в практику научных исследовании, а также используются в учебной работе при проведении занятий со слушателями I и VI факультетов на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики.

По результатам работы оформлено 2 рационализаторских предложения, получена приоритетная справка по изобретению на способ диагностики рака легкого.

Результаты проведенных исследований доложены на III (Москва, 1993 г.) и IV (С.-Петербург, 1994 г.) Всесоюзных конгрессах по болезням органов дыхания; на научно-практической конференции "Возможности и перспеетипы диагностики и лечения в клинической практике" (Москва, 1992 г.); на конференции молодых ученых и специалистов ВМедА (г. С.-Петербург, 1993);

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 6 - в центральных изданиях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 175 источников. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 16 рисуиками. Машинописный текст диссертации составляет 133 страницы,

СОДЕРЖАНИЕРАЬОТЫ

М а! ej > и ал и и_мс нуи_>[

Геше/шс поставленных задач осуществлено на основе клннико-л.н'.ор'.норною обследования больных злокачественными новообразованиями

легких.

П качеетс материала для исследования использовали кровь, полученную пункцией jioKiCBoii вены, опухолевую и нормальную ткани, полученные шпраоперацмопно. Диагноз, стадию опухолевого заболевания, результаты кчинпчеекнх и специальных методов исследования оценивали по записям в историях болезни, па основании выписных или посмертных эпикризов. Ошакомлснне с указанными данными проводили после завершения всех нпдоч исследований. В соответствии с принятой классификацией ВОЗ по стадиям опухолевого процесса все больные были разделены на 3 группы: больные со II, III, н IV стадиями опухолевого процесса. Критериями, неполыусмымн для определения стадии рака легкого были размеры опухоли, поражения регионарных лимфатических узлов и наличие отдаленного метекпировання. Из обследованных больных раком легкого II стадия таболевания наблюдалась у 22 %, III - у 53 % и IV стадия у 25 % больных. Кроме указанной классификации все типы рака легкого были разделены в соответствии с гистологическим диагнозом на плоскоклеточный рак с и без ороювения (82%), аденокарципому (15%), мелкоклеточный рак легкого (3%). Н зависимости от локализации 'выделяли центральный (83%) и периферический ( 17 %) рак легкого.

Контрольную группу составили доноры и больные с заболеваниями легких oci т'лмтержленны.х признаков опухолевого поражения.

I T 14 -1 выделяли из плаценты методами аффинной п аннонообменной хромают рафии. В ка"сс1ве аффинного сорбента использовали GSH-сефарозу

6В, аннонообменную хроматографию проводили на колонке Mono Q ПК э/5 ("Pharmacia", Швеция).

Определение чистоты полученного фермента и разделение смеси белков для последующего иммуноблотинга проводили методом электрофореза в присутствии ДСН с использованием буферной системы Lneuuv.li ( 1970 ). Изоэлчктрическую точку ГТ 14-1 определяли методом изозлектрическогп фокусирования на пластинах "Scrvalyt Precotes" ("Sena", Германия) п соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя.

Для иммунизации использовали 100 мкг фермента, разведенною 1 : I полным (для первой иммунизации), или неполным (для бустерпых иммунизаций) адыовантами Френнда. Общий об тем вводимой смеси составил 1 мл. Реиммушшшш производили каждые две недели. Иммунотен вводили подкожно, выполняя 4-6 инъекции вдоль позвоночника кролика. Забор крови для проверки авидиости антител производили через неделю после каждой реиммунизации.

Авидность антител определяли методом точечного блотинга ijo следующей методике: нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) смачивали раствором 20 мМ Ыа-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,14 М NaCI (ПБС) и высушивали на фильтровальной бумаге. Наносили гто 3 мкд раствора антигена в соответствующем разведении. После полного впитывания раствора свободные сайты блокировали 1 % раствором бычье! о сывороточного альбумина, растворенного в ИБС в течение 30 мни. Раствор сливали и добавляли сыворотку кролика, содержащую тестируемые поликлональиые антитела к ГТ P1-I и разведенную ПБС 1.250 или 1:500 . После часовой инкубации проводили отмывку НЦМ раствором ПБС, содержащим 0,05% Tvveen 20 (ПБСТ), три раза по 5 мин. В качеств вторых антител использовали козьи антитела против иммуноглобулинов критик;}, конъюгнроваиные с пероксидазой хрена ("Sigma",США) в разведении 1.1000

которые инкубировали в течение 30 мин. После отмывки добавляли окрашивающую смесь, содержащую 0,015 % Н2О2 и 0,025 % 3,3'-дпаминобсизилин ("Serva", Германия).

Аффинность антител определяли методом иммуноблотинга [Towbin П. et al., 1979]. После электрофоретического разделения белков перенос на ПЦМ осуществляли при силе тока из расчета 0.8 мА fia 1 см^ геля в течение 1 ч полусухим методом с использованием аппарата "Multíphore" ("Pharmacia", Швеция ). Буфер для переноса содержал 20% метанола. НЦМ отмывали двукратной инкубацией с раствором ПБСТ по 10 мин. Проявление проводили по методике для точечного блотинга.

Мммунопрсципитацию осуществляли методом Fu (1992).

Йодирование фермента проводили с использованием йодогена.

Содержание карциноэмбрионального антигена и нейрон-специфической эиолазы определяли диагностическими наборами фирмы "Roche" (Швейцария) в соответствии с инструкцией.

Концентрацию белка определяли по методу Pelersoii G.L. (1977). Определение активности ГТ проводили по методу Habig W.U. и соавт. (1974), основанному на ферментативном взаимодействии ГТ с 1-хлор-2,4-динигробензолом (ХДПБ) в присутствии GSH с образованием продукта, имеющего максимум светопоглощения при длине волны 340 нм. Концентрацию GSH определяли в реакции с 5,5-дпти'о-бис(-2-шпробензойной) кислотой.

Для определения содержания фермента в сыворотке крови использовали жндкофазный вариант нммунорадиометрического анализа (ИРМА) в присутствии йодированного конкурентного лиганда. Система состояла из 100 мкл тестируемой сыворотки крови человека; 200 мкл сыворотки кролика, содержащей поликлональные антитела к Г'Г Р1-1, в разведении 1:400; 200 мкл раствора ГТ-Р1-1-[1'25], имеющих счет 8000-10000 ими./мин. Инкубацию

проводили в течение 24 ч. при 4® С. Для осаждения иммунных комплексов добавляли 1 мл 20 % раствора полиэтиленгликоля 6000. После центрифугирования при 2500 g в течение 30 мин. сунериаташ тщательно отбирали и у-активность осадка просчитывали на счетчике "Гамма".

Экстрагирование жирных кислот из ГТ PI-1 проводили по методу Фольча (1957). Газохроматографическнй анализ проводили на сорбенте Gas Chrom Q с использованием газового хроматографа "Цвет-570" с пламенно-ионизаннонным детектором в режиме программирования температуры.

Субклеточное распределение фермента исследовали методом непрямой иммунофлюориепенцнн. Проводку тканей осуществляли с применением изопропнлового спирта. В качестве вторых антител использовали котьи антитела против иммуноглобулинов кролика, меченные ФИТЦ.

В работе использовали клетки тпидермалыюй карциномы человека линии А-431, полученные из Банка клеточных культур (Институт цитологии РАН) Клетки культивировали в среде Игла с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота. Метаболическое меченне клеток А-431 [32р]орто-фосфорной кислотой проводили с помощью инкубации монослоя клеток в течение 10-12 ч в бесфосфорной среде ДМЕ, содержащей 100 мк Ci/мл [32р]орто-фосфата. В кажду ю чашку добавляли по 1 Мл среды с изотопом.

Статистическую обработку результатов проводили на ПВЭМ IBM PC AT с помошыо прикладного пакета статистических программ "STATGRAPH1CS" с использованием методов общей статистики, корреляционного анализа и метода сравнения двух величин по критерию Стьюдента.

I'fiVjibiiHbi исследования и их обсуждение

1! процессе выделения фермент был очишеи в 862 раза, выход составил 56 % Для иммунизации использовали белок, который элюнровался с колонки Mono Q HR 5/5 при 150-200 мМ NaCI. Мри определении гомогенности полученною белка он образовывал одну полосу с молекулярным весом 22500 /1а при электрофорезе в присутствии ДС'Н. При изоэлектрическом фокусировании очищенный фермент также был представлен монобелком с р!Ч7.

Длч ИРМА использовали антитела, которые определили не более 30 иг Г Г 14-1 в реакций точечного блогинга. Способность антител прецинитировапэ ГТ PI-I проверяли в реакции иммунопрецнингации. Как иммуноирсиншпат, так и суиериатаиты, полученные из поджелудочной железы, почек, легких, давали в реакции иммуноблотннга с поликлопальным» антителам« одну полосу окрашивания, имеющую тот же молекулярный «ее. чю и IT P1-I (рис.1).

Исследование общей активности IT в реакции конъюгации с ХД1Ш в шпозольной фракции тканей лет кого было проведено у 16 больных раком легкого, представленные 111 и IV стадиям заболевания. Средняя активность шпозольной фракции, полученной m нормальной и опухолевой тканей больных плоскоклёгочным раком легкою, в реакции коньки ации с ХД1Ш составила 0,969 А 0,170 и 2.258 ± 0.42Р мкМ/мин на мг общею белка (р<0,05). Аналогичные показатели у больных аденокарцнномой легкою составили 0,715 ± 0,192 и 1,868 0,278 мкМ, мин на мг общего белка (р- 0.01 ) соответственно. Среднее увеличение активное! и ГТ п опухолевой ткани больных плоскоклеточным раком лежого составило 2.3 раза. Данный показатель у больных аденокарцнномой был 2,1) раза. Сташсшчески достоверных различий меж чу активностью ГТ п тканях при различных формах рака легкого: плоскоклеточного рака н алепокаршшомм. по:п чено не

Рис. I. Проверка аффинности no.niicioiiaihiibix aumiinic.i к IT !'/-! мспюОом ишпчмй'штиига. По оси абсцисс: значения молекулярных масс. По оси ординат: дорожки: I-маркеры молекулярной массы; 2-ГТ Р1-1 после очистки на аффинной колонке; 3 -иммуноблот супернатанта, полученною из почек;

4-из поджелудочной железы;

5-из легких; 6-нммунолрецнпн-тат из I мл супернатанта, полученного из почек; 7-иммунопреципитат из 1 мл супернатанта, полученного нз легких.

было. При изучении особенностей клинико-морфелогических признаков:

возраста, пола, статуса курения, стадии заболевания, наличием отдаленного

мстастазирования, особенностей проводимой терапии и активностью ГТ в

постмитохондриальной фракции не было выявлено статистически значимой

зависимости.

Для изучения биохимических свойств ГТ Р1-1 использовали белок, полученный при хроматографии на анионообменной колонке Mono Q HR 5/5. Все пики белков тестировались на наличие активности с ХДНБ и на присутствие ГТ PI-1 методом точечного блотинга. ГТ Р1-1 нормальной и опухолевой тканей представлена двумя формами, элюируемыми с анионообменной колонки при 120-140 мМ NaCI (форма I) и при 180-200 мМ NaCl (форма 2). Вместе с тем, в некоторых случаях отмечалось появление дополнительного пика ГТ Р1-1, элюируемого при 100-120 мМ Nad (форма 1а).

Изучение гомогенности и молекулярного веса полученных форм проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ЛСП. Изучаемые белки образовывали одну полосу с молекулярной массой - 22500 Да. При изоэлектрическом фокусировании было установлено, что формы 1 и )а имеют одинаковую нзоэлектричсскую точку с рf 4,7. Форма 2 имеет более кислую изоэлектрическую точку <pl -1,5).

I ¡сс.тедопаннс специфической активности обеих форм ГТ P1-I показало ее увеличение в опухолевой ткани по сравнению с нормальной. Активность формы I в нормальной и опухолевой тканях составила соответственно 380 ± -11 н 456 1 58 мкМ/ммн мг белка. Данные значения для формы 2 ГГ Р1-1 были 157 » 20 и 195 t 25 мкМ/мин мг белка. Проведено определение процентного содержания двух форм ГТ PI-1 в нормальной и опухолевой тканях легкого. Для этого подсчитывали площади инков, соответствующих формам ГТ Р1-I, полученных при хроматографии на колонке Mono Q HR 5/5 с последующим расчетом процентной доли каждого нз них. В нормальной ткани содержание формы I ГТ Р1-1 было 77,05 ± 1,81°о, формы 2 - 22,95 i 1,81 %. В раковой ткани эти показатели составили 66,48 ± 2,88 "о и 33,52 ±-?.88 % дчя формы I и формы 2 соответственно. Таким образом, отмечается сгашсшчсскм достоверное снижение процент hoi о содержания формы 1 и у «сличение формы 2 (р<0,05) в раковой ткани.

Ингибиторами активности ГТ P1-I могут быть жирные кислоты, связывающиеся с ферментом в области Ьтдрофобиого кармана. Нами проанализирован спектр ЖК, связывающихся с формой 1 и-формой 2. I iponeiiriioe соотношение различных ЖК в обеих формах обобщено в таблице I. Как видно из таблицы, форма I и форма 2 ГТ P1-I. выделенные нз опухолевой ткани, имеют повышенное процентное содержание ЖК с длиной утлеродной цени 018, по сравнению с фермешом, локализованным в

нормальной ткани, за счет уменьшения содержания ЖК с длиной углеродной цепи С=20. При этом не обнаружено значительных различий в содержании ЖК между формами I и 2, как в норме, так и при раке легкого.

Таблица 1.

Процентное содержание жирных кислот, связанных с формой I и формой 2 ГТ Р1-1, в нормальной н опухолевой тканях.,___

Наименование Кол-во С Норма Опухоль

жирной кислоты и 2-х форма 1 форма 2 форма 1 форма 2

святей

Лаурнновая С12-0 1,36 ±0.27 0.40± 0,12 0.36 ±0,21 0,33 ±0,14

р=0,104 р-0,05

Миристнмовая С14-0 6.28'* 1.27 4.77 ± 0.09 4,00 ±0.55 4,18 ±0,50

Пальмитиновая С 16=0 13,10 ± 1.21 10.60±1,36 11.63 ± 1,46 13.03 ± 1.72

Пальмитоолепновая С16=1 1.02 ±0.36 0.60± 0.18 1.47 ±0.42 0,93 ± 0,36

Стеариновая С18= 0 11.45 ± 1.55 10,0011.13 25.10 ±3.58 18,70 ±2.79

р=0.068 р-0,2

Олеиновая. С18Т. 1.1,53± 4.35 16.90±3.25 28.73 ± 4,36 19,08± 3,87

лшюлевая и 18=2, р-0,161

дшюлеиовая 18=3

Арамшовая С20~0 39.441 4.66 39.40il.47 17,13± 032 20,80± 1,49

р-0,028 р=0,059

Арахи.тононая С20-4 !5.7б± 2.32 21.57±1,68 10,37± 1,01 14,98± 3,19

р=0.261

Прицеленные жачення р рассчитаны относительно формы I ГТ [4-1 нормальной ткани.

Полчченнме результаты доказывают, что уменьшение специфической активности формы 2 ГТ Р1-1 не происходит в результате изменения спектра или количества связываемых ЖК, а является следствием, по всей видимости, других и ¡менений фермента.

Для опенки распределения ГТ Р1-1 нами был отработан метод иммунофдюоресцентного анализа. Исследования проводили на биопснином и послеоперационном материалах. Результаты исследования опухолевой ткани показали, что ГТ Р1-1 содержится в повышенном количестве при всех гистологических типах рака легкого. Степень экспрессии ГТ Р1-1 в плоскоклеточном раке возрастала с увеличением днфференцированности опухоли.

Иммунофлюоресцентный анализ тканей легкого при рахчичных формах рака в настоящем исследовании показал, что ГТ Р1-1 содержится преимущественно в цитоплазме. В отдельных клетках данный фермент был обнаружен связанным с цитопдазматической мембраной и ядром. В соответствии с полученными результатами, ГТ Р1-1 содержится в трех субклеточных компартментах: в цитоплазме, на цитоплазматической мембране и в ядре.

Для определения содержания ГТ Р1-1 использовали жидкостной вариант ИРМА. Йодированный фермент содержал менее 5% кислоторастворимой радиактивностн при осаждении раствором 6% "ГХУ. При проведении калибровки, линейная зависимость отмечалась в диапазоне от 1,5 до 22,5 нг/мл. При содержании в сыворотке более 22,5 нг/мл ГТ Р1-1, ее разводили (в адекватное число раз) и измерение повторяли. Эритроцитарная ГТ р иммунологически не отличается от ГТ Р1-1, поэтому гемолизированиую сыворотку исключали из исследования. В таких случаях оказывалась достаточной визуальная оценка сыворотки, так как такой подход позволяет определить 3,5-5,0 шй гемоглобина в мл сыворотки (ЫМии У. е1 а1., 1989]. Гемолиз, определяющий такую концентрацию гемоглобина, не сказывается на содержании ГТ Р1-1.

На первом этане работы было проведено определение содержания ГТ РЫ в сыворотке крови доноров (п=30). Содержание фермента в сыворотке

крови доноров составило 5,35 ± 0,41 иг/мл (X ± т). Па основании лого исследования было установлено, что верхний уровень содержания ГТ 14-I, определенный данным методом, в сыворотке крови здоровых люден составляет 9,85 иг/мл (среднее значение содержания Г'Г Р1-1 у доноров 2 50(стандартнос отклонение у доноров - 2,25 нг/мл)).

Па втором этапе исследования определялся уровень содержания ГТ !'Г1 в сыворотке крови больных с различной патологией легких: у больных с доброкачественными новообразованиями легких 6,30 ±0.73 нг/мл, острой пневмонией - 6.18 ± 0,80 нг/мл, гнойно-деструктивными заболеваниями легких 6,90 1 0.84 нг/мл, хроническими неснепифическими заболеваничми (хроническим бронхитом 5,60 * 1,17 нг/мл, хронической пневмонией 6,70 ± 0,90 нг/мл, бронхиальной астмой 7,20 ± 0,80 нг/мл ), плоскоклеточным раком без ороговения 15.90 ± 1,90 нг'мл, плоскоклеточным раком с ороговением 20,50 ± 2,90 нг/мл, аденокарциномой 23,30 ± 7.40 нг/мл. Сопоставление уровня содержания П" РЫ с клеточной структурой опухоли не показало существенных различий. Повышенное содержание ГТ РЫ было выявлено у 87 % (20 из 23) больных плоскоклеточным раком с ороговением, 79 % (19 из 24) плоскоклеточным раком без ороговения, трех из четырех больных аденокарциномой. При центральном раке легкого повышенный уровень фермента иаблюдллся у 84 % больных, а при периферическом - в 5 случаях из 8. Обращает па себя внимание, то что в последней группе преобладали больные со 11-ой стадиен опухолевого процесса (5 из 8).

Для сравнения диагностических возможностей определяли содержание двух других опухолевых маркеров: нейрон-специфической энолазы (ЫБЁ) и каршннпмбриоиалытого антигена (СГА). Результаты исследований представлены в таблице 2. из которой видно.что статистически достоверные различия отмечались при определении содержания ГТ Р1-1 (р < 0,001) и кярннно »мбриопатыюго антигена при плоскоклеточном раке без ороговения

(р < 0,01). При этом процент больных, имеющих повышенный уровень карцнноэмбрмонального антигена, не превышал 32 %, тогда как данное значение для ГТ Р1-1 составило 79 %.

Таблица 2.

Содержание ГТ Р1-1, нейрон-специфической энолаэы и карцнно-эмбрноналыюго антигена в сыворотке крови больных плоскоклеточным

Больные ГТР 1-1 нг/мл Нейрон- Карциио-

специфическая эмбрноиальныЛ

энолаза, Ед антиген, Ед

Нсопухолсвая 6,5 ±0,5 .. 9,9 ± 3,2 2,8 ±0,4

патология

Опухолевая патология:

плоскоклеточный рак с

ороговением 14,6 ±2,1 69,0 ± 37,0 10,2 ± 3.3

р<0,001 р=0,03 р=0.008

плоскоклеточныП рак 20,4 ± 3.4 8.8 ± 1,8 13,2 ±7,8

без ороговения р<0,001 р=0,82 р=0,08

Представляет интерес, что из 11 больных с предварительным диагнозом рака легкого, который впоследствии был отвергнут, в 10 случаях установлен нормальный уровень ГТ Р1-1 в сыворотки крови. С другой стороны, из 6 наблюдений, в которых первоначальный диагноз доброкачественного процесса был трансформирован при дальнейшем обследовании в рак легкого, 4 имели повышенное содержание фермента. Таким образом, содержание ГТ Р1-1 в сыворотке крови выше 9,85 нг/мл требует всестороннего исследования больного с целью исключения злокачественной природы изменений в легких.

Повышение уровня фермента при неопухолевых заболеваниях легких отмечалось только в 8,3 % случаев. При ретроспективном изучении историй болезни этих пациентов ( п = 8 ) в одном наблюдении удалось установить

эрозию шейки матки, в 1 - цирроз печени. Учитывая литературные данные [ТЫкЫёа е( а1., 1989], нельзя исключить, что в этих случаях повышение содержания ГТ Р1-1 было обусловлено этими заболеваниями.

Полученные результаты позволили рассчитать чувствительное гь, специфичность и точность метода диагностики рака легкого ял основании определения содержания ГТ Р1-1, карциноэмбрионального антигена и нейрон-специфической энолазы. Наиболее чувствительным и точным методом диагностики рака легкого является определение содержания ГТ Р1-1 п сыворотке крови (83% и 88,1%) соответственно. Большей специфичностью отличается метод, основанный на измерении содержания нейрон-специфической энолазы (97%, для ГТ Р1-1 - 91,7%). С целыо нахождения наиболее оптимального сочетания серологических маркеров при диагностике опухолевых поражений легкого, нами оценена чувствительность, специфичность и точность различных комбинаций ГТ Р1-1 и двух других маркеров.

Таблица 3.

Чувствительность, специфичность и точность метода диагностики рака легкого, основанного на определении содержания различных опухолевых

маркеров.

Маркеры чувствительность специфичность точность

ГТР1-1 83% 92 °/<. 88 %

СЕЛ 38 % 76% 58%

^Е 32 % 97 % 67%

ГТР1-1 + СЕЛ 88 % 74% 81 %

ГТР1-1 + ^Е 82 % 89% 86%

ГТРЫ+^Е+СЕА 91 % 71 % 81 %

Одновременное определение всех трех маркеров приводит лишь к незначительному увеличению чувствительности, в то время как специфичность и точность уменьшается б сравнении с аналогичными

показателями дня ГТ Р1-1. Таким образом, является оправданным и достаточным проведение серодиагностики опухолевого поражения легких, основываясь на определении только одного маркера - ГТ Р1-1.

При исследовании образцов сыворотки крови больных с внелегочиой патологией отмечалось неселективное увеличение содержания ГТ Р1-1 у онкологических больных с различными типами опухолей. При опухолях органов ЖК'Г, больные аденокарциномой желудка имели более высокий уроиень содержания ГТ Р1-1 (24,6 ± 3,7 нг/мл), по сравнению с плоскоклеточным неорогопевающим раком пищевода (16,3 ± 2,2 нг/мл), карциномой прямой кишки (15,9 ± 4,3 нг/мл) и раком печени (13,5 нг/мл). В одном наблюдений больная с аденокарциномой молочной железы имела повышенное содержание фермента (17,1 нг/мл). У одного из двух больных с аденоматозпым полипом слизистой оболочки прямой кишки имело место повышенное содержание ГТ Р1-1 (14,6 и 8,25 нг/мл).

С целью изучения возможности использования ГТ Р1-1 для оценки эффективности проводимого хирургического лечения было исследовано изменение уровня ГТ Р1-1, у 23 больных в динамике, в том числе у 16 по схеме: день поступления, сутки после операции, 18-20 сутки после операции. Через сутки после операции было отмечено три тенденции изменения содержания фермента: резкий подъем, сохранение на том же уровне, падение. Характерно, что первая проявлялась при распространенном опухолевом процессе, после сложных и травматических оперативных вмешательств, сопровождавшихся прохождением через ткань опухоли с последующей резекцией оставшегося участка; а также после пробных торакотомий, сопровождавшихся энергичными попытками удалить опухоль. На момент выписки в изменении содержания ГТ Р1-1 выявлено две тенденции: падение или сохранение на уровне, ' близком к норме; дальнейший рост. Нами прослежена судьба этих 16 больных в течение полугода. Из 5 больных второй

группы 3 умерли от прогрессировапия опухолевого процесса, у 2 клинически определяется генерализация поражения. Из 11 больных первой группы в настоящее время все живы, данных за рецидив заболевания не получено.

Роль ГТ Р1-1 в настоящее время еще окончательно не определена. Тем не менее, показано, что экспрессия данного нзофермента коррелирует с содержанием РЭФР, с-тус [БиоЬтеуег Т. е1 а!., 1991). В настоящее время нет работ, в которых рассматривается непосредственное взаимодействие ГТ Р1-1 с тем или иным белком, входящим в систему регулирования митотнческой активности клетки.

Нами была исследована возможность взаимодействия ГТ Р1-1 с РЭФР и ферментом, участвующим в передаче мптотического сигнала с рецептора -ФЛ Су. В качестве подхода был использован метод конреципнгацйонного осаждения белков, связанных с РЭФР и ФЛ Су, специфическими поликлональными антителами, с последующим выявлением ГГ Р1-1 в реакции иммуноблотинга. Результаты копрецнпнтационного осаждения показывают, что часть фермента связывается с РЭФР и ФЛ Су. При этом антитела к фосфотнрозину так же прецнпитируют ГТ Р1-1. Осаждение ГТ Р1-1 антителами к ФТир является еще одним подтверждением факта ее взаимодействия с РЭФР и ФЛ Су, так как они оба фосфорилируются по тирозину. Однако, остается пока неизвестной возможная зависимость между связыванием 1Т Р1-1 и статусом фосфорилироваиия РЭФР и ФЛ Су по отдельным аминокислотным остаткам. Увеличение данного связывания под влиянием ЭФР указывало бы на участие ГТ Р1-1 в процессах передачи или регулирования мптотического сигнала с рецептора на ядре.

Интересно отметить, что сам фермент не фосфорилируется по тирозину. Для исследования возможности фосфатной модификации фермента по серину и треонину использовали метаболическое мечепие клеток линии А-

431 с [32р]орто-фосфорной кислотой. Результаты исследований

представлены на рис.2 из которого видно, что ГТ Р1-1 имеет достаточно высокий уровень . фосфорилирования по серипу и треонину в нестимулнрованных клетках А-431. Степень фосфорилирования значительно снижается при стимулировании клеток с ЭФР (около 47 % от

походного уровня по результатам денситометрии).

, . , Рис.2. Автограф иммуиопреципитата

антителами к ¡Т¡4-1, полученного из лизаша метаболически меченных клеток линии А--131. Дорожки: 1 - клетки стимулированы ЭФР( 100 нг/мл) в течение '30 мин. с последующей отмывкой ростового фактора с цитоплаз-матическом мембраны 0,1 М натрий - ацетатным буфером, рН 4,5; 2 - клетки стимулированы ЭФР (100 нг/мл) в течение 30 мин;

1 2 3 3- несгимулированные клетки.

Интересно отметить, что фосфорилирование фермента при диссоциации лиганд-рецепторного комплекса с последующей отмывкой ЭФР не возвращается к уровню нестимулированных клеток (около 53 %).

Для изучения влияния ЭФР на активность ГТ Р1-1 нами исследована активность постмитохондриальной фракции в реакции конъюгации с ХДНБ в интактных и стимулированных клетках линии А-431. Полученные данные выявляют зависимость между увеличением активности ГТ Р1-1 и уменьшением содержания ОБИ. Так, при добавлении ЭФР уже через 5 минут отмечалось статистически достоверное снижение содержания ОБИ и увеличение активности ГТ. Данные различия были максимальными при 15-30 минутной инкубации клеток. Таким образом, при действии митотического фактора - ЭФР в клеточной культуре А-431 происходит активация ГТ, что

приводит к повышенному метаболизму GSI1. Деплецмя GSH

вызывает гибель клетки [М.С.Lasso De La Vega et al.,1991], при ком происходит гнперполяризапня и фрагментация хроматина, чго является морфологическим проявлением аиоптоза [Raían R.R. et al., 1994]. Искусственное добавление циклических нуклеотндов приводит к увеличению активности ГТ. При лом неизвестно, как ведет себя статуе фосфорнлнрования фермента. ЭФР так же вызывает увеличение уровня циклических нуклеотидов в клетках линии Л-431, одновременно индуцируя их гибель. Вместе с тем, активация рецепторов факторов роста приводит к увеличению метаболизма GSH [Kang Y.J., Enger D.M.,1992], Эти данные подтверждают гипотезу, что изменение уровня GSH является ранним ответом на стимулирование рецептора факторов роста [Shaw J.P., Chon I.N., 1986]. Может ли данное уменьшение содержания GSH, вызванное активацией ГТ Р1-1. быть критическим для жизнедеятельности клетки, пока неизвестно. В данном случае описан только один каскат, направленный на деилецию GSII, связанный с активацией ГТ PI-I. Однако, уменьшение содержания GSH под влиянием ЭФР может быть связано с изменением активности н других ферментов метаболизма глутатиона: гамма-глутамилграспетндазы, глугатионредуктазы, глутатиопперокендазы.

и 1.1 К С) д ы.

I. Г.тматион S-трансфераза PI-1 в нормальной и опухолевой тканях легкого представлена двумя формами, имеющими одинаковый молекулярный вес. но разные изоэлектрическис точки. Обе формы сорбируют целый спектр жирных кислот с длиной углеродной цепи от С ! 2 до С20. В опухолевой ткани ГТ PI-I содержит большее процентное содержание ЖК с С-18 при уменьшении доли ЖК с С-20.

2. Опухолевые клетки при раке легкого различных гистологических типов содержат значительное количество ГТ PI-1, которая имеет преимущественно цитоплазматическую локализацию. Вместе с тем, отдельные клетки содержат данный фермент в ядре и на цитогшазматической мембране.

3. fio описанным свойствам ГТ Р1-1 является органонеспецифическим общим онкологическим маркером. Определение ГТ Р1-1 в сыворотке крови больных с заболеваниями легких позволяет диагностировать не только злокачественные поражения, но и патологические процессы с повышенным риском онкологической трансформации. Повышение уровня фермента выше 9,85 нг/мл, должно определить более направленный поиск рака легких, а в случае стойкого негативного результата и раковых поражений других органов.

4. Определение содержания ГТ Р1-1 в сыворотке крови позволяет проводить мониторинг эффективности выполненного хирургического лечения. Отсутствие тенденции к снижению содержания данного фермента до уровня нормальных значений в течение трех недель после хирургического лечения позволяет говорить о недостаточности проведенного лечения и возможной последующей генерализации опухолевого процесса.

5. ГР1-1 взаимодействует как с РЭФР, так и с ФЛ Су. ГТ Р1-1 является фосфопротеином и фосфорилирована по треонину и серину. Отсутствие фосфорилирования по тирозину свидетельствует о том, что ГТ Р1-1 не является субстратом для тирозинкиназы рецептора и, таким образом, не взаимодействует по данному домену с РЭФР. Стат>с фосфорлирования ГТ Р1-1 изменяется под влиянием различных факторов: в частности. ЭФР приводит к дсфосфорилированию фермента в клетках линии А-431. При пом происходит активация ГТ Р1-1, что уменьшает содержание г нуфиклеючною восстановленною глутатиона.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Полученные результаты н их теоретическое содержание позволяют считать практически целесообразными следующие направления клинпко-экспериментальных исследований по представленной в диссертации тематике.

1. Исследование содержания ГТ Р1-1 в сыворотке крови можно рекомендовать как скринннговый метод при профилактическом обследовании различных категорий люден, так как данный белок, на основании полученных данных, является органонеспецифическпм общим онкологическим маркером.

2. В дифференциально-диагностическом обследовании больных раком легкого целесообразно использовать определение содержания ГТ Р1-1 в сыворотке кровн, являющегося адекватным показателем опухолевого поражения легких. Увеличенное содержание ГТ Р1-1 в течение трех недель после хирургического лечения рака легкого позволяет говорить об неадекватности проведенного лечения и возможности последующею манифестации опухолевого процесса. Данный показатель следует рассматривать как прогностически неблагоприятный признак исхода хирургического лечения рака легкого.

3. В качестве одного из направлений в патогенетической терапии при лечении рака легкого необходимо оценить эффективность средств, направленных на изменение активности ГТ в клетке. При этом может достигаться двусторонний эффект. С одной стороны, ннактнвапня фермента, метаболизируюшего противоопухолевые препараты и снижающего их эффективность при лечении злокачественных новообразований, позволит значительно повысить их противораковую активность. С другой стороны, изменение активности фермента приводит к изменению содержания

внутриклеточного восстановленного глутатиона, являющегося одним из факторов в регуляции пролнфератнвнон активности клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Выделение глутатион S-трансферазы я человека методом аффинной хроматографии //Материалы XII науч. конф. молодых ученых и специалистов академии /Воен.-мед. акад.-СПб.,1992.-С.86-87 (соавг. Смирнов В.В., Удинцев A.B.).

2. Возможности ферментативной диагностики неопластических процессов легких II Труды третьего национального конгресса по болезням органов дыхания:.М.1992.С.604 (соавт. Булавин В.В., Скорняков В.И., Маньков Ю.У.).

3. Опенка особенностей ферментативной диагностики при неопластнческнх заболеваниях И Возможности и перспективы диагностики и лечения в клинической практике: Тез. докл.науч.-пракг. конф., 9 дек. . 1992.:М. 1992.С.266-267 (соавт. Булавин В.В., Скорняков В.И., Головач И.И.).

4. Субклеточное распределение ферментов системы глутатиона в ткани головного мозга крысы // Цитология.-1993.-T.35.N.6/7.-C.58-63 (соавт. Кожемякин JI.A., Смирнов В,В., Удинцев A.B.).

5. Глутатион S-трансфераза человека в норме и при неопластических процессах / Изд-во "Медицина", Редкол. жури. "Клинич. лаб. диагностика", дата депои-иия 05.10.93.М.1993.С.19 (соавт. Булавин В В., Смирнов В В.).

6. Диагностические возможности исследования уровня глутатион S-трансферазы л при раке легкого // Труды 4-го национального конгресса по болезням органов дыхапня:.М.1994.С.674 (соавт. Осипов Э.В., Салнйчук P.1I).

7. Оценка эффективности определения глутатион S-трансферазы л как диагностического маркера рака легкого // Вопр. Оикол -1995.-Т.41, N.1.-C.33-38 (соавт. Кожемякин Л.А., Морозов В И., Осипов Э.В., Золотарев Д.В.).

8. Глутатион S-трансфераза PI -1 в нормальной и опухолевой тканях легкого: свойства, функции и возможные механизмы регуляции активности // Биохимия.-199б.-Т.61, вып.6.-С.1(Н8-1030 (соавт. Карпищенко А.И., Губанов А.И., Решетов A.B.).

Тип. Bh'Uiü/ü.JQ* /а г /СО,