Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Глиоваскулярные взаимоотношения в анапластических астроцитарных опухолях головного мозга (электронно-микроскопическое и иммуногистохимическое исследование)

На правах рукописи

МОЗЕРОВ Сергей Алексеевич

ГЛИОВАСКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В АНАПЛАСТИЧЕСКИХ АСТРОЦИТАРНЫХ ОПУХОЛЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА (электронно-микроскопическое и иммуногистохимическое исследование)

14.00.15 - патологическая анатомия, 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА 2005

Работа выполнена в Медицинском институте Пензенского государственного университета.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук Чаиркин И. Н.;

доктор медицинских наук, профессор Сосунов А. А.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Швалев В. Н.;

доктор медицинских наук, профессор Туманов В. П.;

доктор медицинских наук, профессор Райхлин Н. Т.

Ведущая организация - ГУ НИИ морфологии человека РАМН.

Защита состоится «_»_200_г., в «_» часов, на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации (117997, г. Москва, ул. Ост-ровитянинова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета (117997, г. Москва, ул. Островитянинова, д. 1).

Автореферат разослан «_»_2005_г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Щеголев А. И.

ОБЩАЯ характеристика работы

Актуальность темы. Кровоснабжение опухолевой ткани имеет огромное значение для ее прогрессии и прогноза. Известно, что для любой опухоли требуется образование новых сосудов, этот процесс необходим для роста опухоли более 0,2 см в диаметре (Demeule M, Regina A., 2004). В последнее время достигнут значительный прогресс в понимании механизмов неоангиогенеза, охарактеризованы индукторы и ингибиторы ангиогенеза, которые регулируют пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток (Hanahan, 1996). В то же время литературные данные показывают, что большее внимание уделяется морфологическому исследованию клеточного состава, строению опухолевых клеток, тканевому атипизму, наличию или отсутствию вторичных изменений в опухоли (некроз и кровоизлияние (Nafe R., Schlote W., 2004)), а ультраструктурное исследование сосудов и периваскулярной области практически не проводилось.

В настоящее время морфологическому изучению опухолей нервной системы посвящено большое число исследований (Wahl et. al, 1991; Rutten et. al, 1992; Pascual-Castroviejo et. al, 1995; Liberski, Kordek, 1997; Demuth Т., Berens M. E., 2004; Hartmann C, et al., 2005). Однако данный раздел онкологии остаётся одним из наименее изученных, что связано со сложностью структурной организации нервной системы (Zorzi et. al, 1992; Scarpelli et. al, 1994; Tomlinson et. al, 1994).

Наиболее распространенным видом опухолей головного мозга являются астроцитарные опухоли, отличающиеся значительной вариабельностью структуры в зависимости от степени анаплазии (Burger, Scheithauer, 1994; Escalone Zapata, 1994; Bertossi et. al, 1997). В последнее время в диагностике опухолей стали широко использоваться иммуногистохимические методы, основанные на выявлении белков, специфичных для клеток разного гистогенетического происхождения (Zorzi et. al, 1992; Luo, 1993; Huang et al., 1996). Несмотря на значительные достижения в этой области, многие вопросы остаются недостаточно выясненными: в частности, некоторые антигенные характеристики клеток пролиферирующих сосудов и гигантских клеток, распределение трех изоформ NO синтазы в тканях опухолей. Противоречивые данные относятся даже к выявлению глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) - иммуноположительные клетки

встречаются при всех опухолях астроцитарного ряда, но степень реакции различается и зависит не только от степени злокачественности опухоли, но и от местных тканевых особенностей строения опухолей (Березин, 1985; Burger P. С. et al., 1991; Коршунов А. Г., Лахтее-ва С. В., 1998).

В прогрессии опухолей головного мозга немаловажное значение придается пролиферации кровеносных сосудов (Jansen M.et al., 2004; Demeule Met al., 2004). Взаимосвязь опухолевых клеток с кровеносными сосудами, хотя и описана в ряде работ (Sumpio В. Е. et al., 2002), остается недостаточно выясненной, особенно методом имму-ногистохимии и электронной микроскопии.

Также в работе большое внимание уделяется важной проблеме, которая нередко становится основной причиной смерти больных -проблеме нарушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Морфологическому изучению нарушения гематоэнцефалического барьера при опухолях головного мозга посвящено большое число исследований (Bertossi M. et al., 1997; Demeule M. et al., 2004). Однако остается множество нераскрытых вопросов и самый главный из них: каковы структурные причины нарушения гематоэнцефалического барьера.

Цель исследования. Целью работы является изучение ультраструктурных и иммуногистохимических особенностей пролифери-рующих сосудов микроциркуляторного русла и периваскулярной области в анапластических астроцитарных опухолях головного мозга, а также исследование экспрессии белков промежуточных фила-ментов и других антигенных свойств опухолевой ткани астроцитом разной степени дифференцировки.

Задачи исследования. В связи с вышеизложенным были поставлены следующие задачи:

1. Электронно-микроскопически и иммуногистохимически исследовать структурные проявления нарушения гематоэнцефалического барьера при астроцитарных анапластических опухолях головного мозга.

2. Исследовать изменения в ультраструктуре эндотелиоцитов, перицитов и астроцитов (в области контактов отростков астроцитов с базальной мембраной эндотелия).

3. Электронно-микроскопически и иммуногистохимически изучить перифокальную зону при анапластическх астроцитарных опухолях головного мозга.

4. Изучить экспрессию ряда иммуногистохимических маркеров (ГФКБ, виментин, белок S-100, нейрофиламенты, коллаген IV типа, пролиферационный маркер К-67, онкопротеин р53) в анапластиче-ских астроцитарных опухолях головного мозга и в периопухолевой зоне.

5. Провести анализ экспрессии NO-синтазы (три изоформы) в опухолях головного мозга астроцитарного ряда.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований получены следующие основные новые данные:

♦ интерстициальный отек и набухание отростков и тел астроци-тов наиболее выражены в тех периваскулярных пространствах, где наблюдается значительное утолщение базальной мембраны со снижением ее электронной плотности;

♦ пролиферирующие кровеносные капилляры отличаются спаз-мированным просветом и усиленным развитием внеклеточного пе-риваскулярного компонента (резкое утолщение эндотелиальной ба-зальной мембраны и большое число волокон коллагена);

♦ в сосудистых клубках пролиферирующий эндотелий является виментин-иммунопозитивным и N0 синтаза (три изоформы) - имму-нонегативным;

♦ некоторые периваскулярные гигантские клетки глиобластом являются ГФКБ-иммунонегативными и не содержат промежуточные филаменты в цитоплазме перикариона;

♦ многие опухолевые астроциты в астроцитарных опухолях являются N0 синтаза (три изоформы) - иммунопозитивными. Максимальная степень иммунореактивности выявлена для индуцибельной формы N0 синтазы;

♦ в анапластических опухолях встречается большое число атипических клеток, которые теряют способность экспрессировать ГФКБ; характерный маркер для данного типа клеток.

• установлено, что в периопухолевой зоне возникает гиперплазия астроцитарной глии и многие ГКФБ-иммунопозитивные реактивные астроциты не экспрессируют виментин.

Научно-практическое значение работы. Результаты исследований значительно расширяют представления о межклеточных взаимосвязях в ткани опухолей головного мозга и периопухолевой зоне, структурных причинах нарушения гематоэнцефалического барьера и функционально неполноценного ангиогенеза. Полученные данные позволяют дифференцированно подходить к выбору иммуногисто-химических маркеров в диагностике конкретно взятой опухоли. Эти данные могут быть использованы патоморфологами при диагностике и дифференциальной диагностике опухолей головного мозга, а также материал может быть использован в учебных курсах гистологии, патологии и невропатологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ультраструктурная и иммуногистохимическая характеристика пролиферирующих кровеносных сосудов и неопластических астро-цитов в опухолевой ткани и периопухолевой зоне.

2. Экспрессия белков цитоскелета и других иммуногистохимиче-ских маркеров в анапластических опухолях головного мозга.

3. Закономерности экспрессии 3-х изоформ КО-синтазы в астро-цитарных опухолях головного мозга.

Апробация работы. Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции «Гистохимический анализ изменчивости и регенерации тканей» (г. С.-Петербург, 1997); конференциях молодых ученых Мордовского госуниверситета им. Н. П. Огарева (Саранск, 1997, 1998); Международном симпозиуме «Структура и функции вегетативной нервной системы» (г. Воронеж, 1998); Областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Пенза, 2000); Областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической медицины» (Пенза, 2004).

Внедрение в практику. Полученные данные позволяют дифференцированно подходить к выбору иммуногистохимических марке-

ров в диагностике конкретно взятой опухоли. Эти данные могут быть использованы патоморфологами при диагностике и дифференциальной диагностике опухолей головного мозга; также материал может быть использован в учебных курсах гистологии, патологии и невропатологии.

По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 211 страницах машинописи, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы, 87 рисунков. Список литературы включает 430 наименований, из которых 44 отечественных и 386 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования выполнены на материале астроцитарных опухолей головного мозга человека.

Использовали операционный материал, полученный из нейрохирургического отделения Областной клинической больницы им. Н. Н. Бурденко (г. Пенза), Республиканской клинической больницы (г. Саранск) и института нейрохирургии им. А. Л. Поленова (г. С.-Петербург).

После получения операционного материала кусочки ткани без видимого некроза и кровоизлияний фиксировали в фиксаторе в глута-ровом альдегиде на фосфатном буфере от 12 до 24 часов и заливали в эпон-аралдитовые блоки.

Количество изученных опухолей по отдельным нозологиям представлено в табл. 1.

Нозологическая Количество изученных случаев

форма опухоли Электронная микроскопия Иммуногистохимия

Астроцитома 13 58

- фибриллярная 3 23

- протоплазматическая 2 8

- пилоцитическая 3 12

- анапластическая 5 15

Глиобластома 9 17

Гемангиобластома 1 4

Всего опухолей 23 79

Электронно-микроскопическое исследование

Для разрешения поставленных задач мы забирали и фиксировали удаленные во время операций участки тканей исследуемых опухолей.

Фиксацию материала осуществляли погружением кусочков ткани в 2 %-м растворе параформа с 2 %-м раствором глутарового альдегида на 0,1M фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 12-24 часов при 14-5 °С. Затем материал промывали 0,15М (рН 7,2) фосфатным буфером (3 смены по 30 минут) и производили дополнительную постфиксацию в 1%-м растворе осмиевой кислоты на 0,2М фосфатном буфере (рН 7,2) - 2 часа (t 4-5 °С).

Для обезвоживания кусочки постепенно проводили через спирты возрастающей концентрации до абсолютного этанола (50, 70, 96, 100% - 3 смены по 30 минут), затем использовали две смены ацетона.

Перед заливкой проводили пропитку материала в смеси эпоксидных смол с ацетоном в соотношении 1:1 в течение 24 часов. Для полного замещения органических растворителей кусочки помещали в чистую заливочную смесь без ацетона на 30 минут при t 60-50 °С. Полимеризацию проводили в течение 2 суток при 60-50°С.

Перед приготовлением ультратонких срезов делали полутонкие срезы, окрашенные толуидиновым синим по J. Lynn (1965).

После обнаружения в полутонких срезах наиболее интересных участков и прицельной заточки пирамидки получали ультратонкие срезы на ультрамикротоме Ultrocut-Reichert. Контрастировали ура-нилацетатом и цитратом свинца по J. Venable, R. Coggeshal (1965) и просматривали в электронном микроскопе ЭБМ-100 при ускоряющем напряжении 75-80 кв.

Иммуногистохимическое исследование

Материал фиксировали в 4%-м параформальдегиде и 0,25%-м глу-таровом альдегиде на ОД М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 4 часов. После традиционного обезвоживания кусочки ткани заливали в парафин. С полученных таким образом блоков на микротоме готовились срезы толщиной по 5-7 микрон. Срезы снимались специальной кисточкой в ванночку на воду, температура которой была 36-38,5 °С. В дальнейшем переносились на чистые предметные стёкла, предварительно обработанные белком. Затем срезы подвергались сушке в термостате при температуре 37-50 °С в течение суток и охлаждались до комнатной температуры. Процесс дальнейшей обработки срезов включал в себя депарафинирование и регидратацию, которые заключались в следующем: ксилол 2 - смены по 1,5 минуты каждая, абсолютный спирт - 1 минута, 90%-й спирт - 1 минута, 70%-й спирт - 1 минута, 50%-й спирт - 1 минута. Далее срезы промывались в нескольких сменах фосфатного буфера.

Для иммуногистохимического исследования использовали первичные антитела против:

ГКФБ - поликлонал из кролика DAKO (Z 0334) 1:1000, виментин - поликлонал из овцы Affinity Biologicals Inc. (CAVM-AP) 1:1000,

коллаген 4 моноклонал (Клон ]У-4Н12) Calbiochem 1:1000, SI00 бета-поликлонал из кролика DAKO (А 5110) 1:500, енолаза нейрональная моноклон (клон NSE-P2) BD Biosciences Phanningen 1:1000,

нейрофиламенты 200 поликлонал из кролика SIGMA (N4112)1:1000,

нейрофиламенты 160 моноклонал (Клон NN18) SIGMA 1:1000.

nNOS polyclonal from rabbit ALEXIS (ALX-210-529) 1:500, eNOS polyclonal from rabbit ALEXIS (ALX-210-505) 1:1000, iNOS polyclonal from rabbit ALEXIS (ALX-210-503) 1:200, P53 monoclonal (clone 80) BD Biosciences Pharmingen 1:250, Ki-67 monoclonal (Clone Ki67) Chemicon 1:500. MIB polyclonal (RB4537/4538) Abgent 1:100.

В связи с тем, что проведение иммуногистохимической реакции встречает ряд трудностей, необходимо создать определённые оптимальные условия, которые, с одной стороны, повысили бы эффективность взаимодействия антигена с антителом, а с другой, свели бы к минимуму неспецифическое окрашивание - фон. С этой целью использовали целый набор приёмов обработки срезов перед их инкубацией с первыми специфическими антителами. Для этого в методику были включены ещё два этапа. Первый - инкубация с 0,1%-м раствором протеолитического фермента трипсина («Sigma», США) при температуре 37,5 °С в течение 20 минут. Второй - инкубация срезов в 10%-м растворе неимунной сыворотки крупного рогатого скота, приготовленной на фосфатном буфере в течение 20 минут при комнатной температуре.

Процент разведения растворов определялся опытным путём. После инкубации в сыворотке срезы не промывались и не высушивались, а обводились вокруг фильтровальной бумагой. В связи с тем, что на части материала в качестве маркера антител использовалась пероксидаза хрена, в методику включался ещё один этап - ингибиро-вание эндогенной пероксидазы.

Срезы инкубировались с 0,2%-й перекисью водорода на фосфатном буфере в течение 20 минут при комнатной температуре. После инкубации срезы подвергались двухкратной промывке в фосфатном буфере по 5 минут.

Иммуногистохимический анализ опухолей был проведён «непрямым» пероксидазным методом, когда в качестве метки «вторых» антител использовалась пероксидаза хрена (фирма «Sigma», США).

Результаты собственных исследований

1. Характеристика кровеносных сосудов в опухолевой ткани.

Основное внимание в данной части работы будет уделено ультраструктуре пролиферирующих кровеносных сосудов и окружающих клеток в опухолях. Сосудистый компонент в строении нейроэкто-дермальных новообразований может быть сложного состава, обусловленного разнообразием строения кровеносных сосудов в различных опухолях одного гистогенеза и даже в различных участках одной и той же опухоли.

Эндотелий капилляров центральной нервной системы отличается от эндотелия других сосудов наличием плотных межклеточных контактов, малой пиноцитозной активностью и отсутствием пор и фе-нестр. Именно такие структурные особенности эндотелия наряду с периваскулярными клетками и астроцитарной периваскулярной оболочкой, как полагают (Kimelberg Н. К., 2004; Banks W. А, 2005), определяют барьерную функцию кровеносных капилляров центральной нервной системы.

Собственное электронно-микроскопическое исследование показало значительное изменение в строении стенки капилляров при ана-пластических опухолях астроцитарного ряда. Изученные новообразования отличались значительной пролиферацией кровеносных сосудов. Выраженность пролиферации кровеносных сосудов прямо зависела от степени анаплазии опухолей. В опухолях происходит разрастание мелких сосудов со значительной перестройкой структуры их стенки вследствие беспорядочного размножения клеток (в основном эндотелиальных).

В исследованных опухолях мы часто обнаруживали набухание эндотелиальных клеток, выстилающих просвет кровеносного сосуда, который при этом максимально суживался или практически перекрывался.

Морфология эндотелиальных клеток отличалась выраженным полиморфизмом. Размеры, форма и степень осмиофилии цитоплазмы значительно варьировались. Ядра эндотелиоцитов также отличались разнообразием форм - от округлых до веретено- и палочковидных, наиболее часто встречались овальные ядра. Отдельные клетки имели

неправильные «контуры» ядер и отличались глубокими инвагинациями ядерной оболочки.

Встречались многоядерные эндотелиоциты с ядрами разнообразной формы и величины, а также эндотелиальные клетки с сегментированными ядрами, разделенными узкими перемычками.

Значительная вариабельность была отмечена со стороны ядерного хроматина: в отдельных клетках он был гомогенно диспергированный, в других находился в виде крупных глыбок обычно вблизи ка-риолеммы, изредка встречались крупные ядрышки.

Сужение просвета микрососудов в основном было связано с большими размерами эндотелиальных клеток, причем их люминаль-ная поверхность имела незначительное число выростов. Только единичные микрососуды имели переплетающиеся выросты люминаль-ной поверхности эндотелиальных клеток.

Электронно-микроскопически эндотелиальные клетки отличались низкой электронной плотностью цитоплазматического матрикса и . многочисленными органеллами, в частности большим числом митохондрий, многие из которых были с редуцированными кристами. Особенностью эндотелиальных клеток в опухолевой ткани глиобла-стом и анапластических астроцитом является наличие хорошо развитого белоксинтетического аппарата, который зачастую находился в периферических отделах клеток. В эндотелиоцитах находились большое количество свободных рибосом и рибосом, связанных с расширенными, беспорядочно расположенными мембранами эндоплазма-тической сети, а также крупный пластинчатый комплекс Гольджи, хотя встречаются капилляры, в которых цитоплазма набухших эндо-телиальных клеток как бы гомогенизирована, «запустевшая». В ней обнаруживаются лишь мелкие единичные цистерны эндоплазматиче-ского ретикулума и набухшие митохондрии.

Отдельные эндотелиальные клетки содержали осмиофильные структуры тельца Вейбеля-Паладе - органеллы, связанные с плазмо-леммой и содержащие фактор Виллебранда. Они имели вид овальных, ограниченных элементарной мембраной, осмиофильных образований размером от 0,3 до 1,5 мкм. Эти тельца часто находились в крупных отростках клеток и располагались без какой-либо связи с другими органеллами. Органеллы скапливались в основном в пери-

ферических отделах клеток. Количество телец Вейбеля-Паладе увеличивалось в наиболее злокачественных опухолях (большее количество обнаруживалось в глиобластомах).

В неизмененных микрососудах опухолей эндотелиальные клетки содержали большое количество пиноцитозных пузырьков, обычно находящихся на аблюминальной поверхности. В то же время в про-лиферирующих микрососудах, в цитоплазме эндотелиальных клеток, микропиноцитозные везикулы отсутствовали.

Отростки клеток, в безъядерной части цитоплазмы, различались по ультраструктуре цитоплазмы, некоторые содержали большое число микротрубочек и филаментов, другие - преимущественно вытянутые, узкие цистерны зернистой эндоплазматической сети. Электронная плотность цитоплазматического матрикса отростков также значительно изменялась и соответствовала как «темным» гиперхром-ным, так и «светлым» клеткам.

Таким образом, эндотелиальные клетки, в основном в пролифери-рующих кровеносных сосудах, также подвержены значительным изменениям.

Проведенное исследование показало, что эндотелиальные клетки, в анапластических астроцитарных опухолях, обычно формировали специализированные плотные контакты разной протяженности друг с другом, нарушения межэндотелиальных соединений не было обнаружено.

В скоплениях пролиферирующих клеток стенок кровеносных сосудов часто встречались апоптически измененные клеточные профили. Они отличались высокой степенью конденсации ядерного хроматина и наличием фрагментации цитоплазмы на отдельные, окруженные мембранами осмиофильные образования.

Характерным признаком большинства микрососудов в глиобла-стомах является значительное изменение периваскулярной области. Особенно ярко такие изменения были выражены около сосудов мик-роциркуляторного русла. Здесь, во-первых, происходило значительное утолщение нередко до нескольких микрометров базальной мембраны эндотелия. Во-вторых, отростки астроцитов выглядели утолщенными, вероятно, за счет их набухания; в-третьих, повышалось число коллагеновых волокон.

Иногда даже рядом расположенные сосуды значительно различались по строению базальной мембраны, в одних она имела вид тонкой осмиофильной пластинки, в других наблюдалось значительное утолщение нередко до нескольких микрометров. Степень электронной плотности материала базальной мембраны неодинакова, встречаются участки с низкой электронной плотностью и участки с высокой степенью электронной плотности.

Возможно, что низкая электронная плотность материала базаль-ной мембраны отдельных кровеносных сосудов может свидетельствовать о нарушении клеток, ее производящих. Интересной особенностью являлся тот факт, который подтверждал данную теорию: процессы интерстициального отека и набухание отростков и тел астро-цитов наиболее выражены в тех периваскулярных пространствах, где наблюдалось значительное утолщение базальной мембраны со снижением ее электронной плотности.

Электронно-плотный материал «утолщенной» базальной мембраны часто определялся между пролиферирующими клетками стенки сосудов, что приводило к «нарушению целостности» ее контуров.

Коллагеновые волокна обычно располагались со стороны астро-цитарных отростков, окружающих периваскулярное пространство, в некоторых сосудах их количество было значительным. Развитие волокон коллагена вокруг сосудов значительно изменялось - от небольшого их числа до образования больших прослоек, располагающихся и в широких межклеточных пространствах,окружающих сосуды астроцитов. Около сосудов нередко определялись клетки без ба-зальной мембраны, окруженные широкими пространствами, заполненные волокнами коллагена.

Высокое содержание коллагена подтверждалось и иммуногисто-химически - большая часть кровеносных сосудов и клубки пролифе-рирующих капилляров в тканях анапластических астроцитарных опухолей отличались высокой иммунореактивностью на коллаген IV. Положительная реакция на коллаген IV отмечалась также в перива-скулярном пространстве. Возможно, что усиленный синтез коллагена связан с несостоятельностью новообразованных кровеносных сосудов и связанной с этим гипоксией.

Можно отметить, что выраженность изменений периваскулярной оболочки прямо коррелировала со степенью анаплазии опухолей;в анапластических астроцитомах и глиобластомах было значительно больше периваскулярного соединительно-тканного компонента в сравнении с низкозлокачественными опухолями.

Межклеточный матрикс имел практически всегда низкую электронную плотность. «Просветление» внеклеточного матрикса может быть связано как с особенностями его организации, большого содержания гиалуроновой кислоты, так и с отеком.

При электронно-микроскопическом исследовании астроцитом с выраженной атипией опухолевой ткани (Ш-ГУ степени) на малых увеличениях микроскопа отмечается большое сходство их субмикроскопического строения со строением доброкачественных астроцитом (ЬП степени). Прежде всего, обращает на себя внимание характерная рыхлость расположения опухолевых клеток и их отростков, между которыми выражены разные по величине свободные межклеточные пространства. Даже в местах более тесного расположения опухолевых клеток их цитоплазматические тела обычно на большем протяжении своей периферии не соприкасаются непосредственно с телами прилежащих клеток. Обычно широкие межклеточные пространства на разном протяжении заняты многочисленными клеточными отростками, которые на поперечных ультратонких срезах представлены округлыми или неправильно-овальной или продолговатой лентовидной формы профилями. На поперечных или косых срезах отростков в их цитоплазме видны мелкие митохондрии, гладкостенные везикулы и глиофибриллы. В тех же отростках опухолевых клеток, в которых ультратонкий срез прошел вдоль их продольной оси, видны продольные укладки глиофибриллярных структур.

Форма опухолевых клеток анапластических астроцитом самая различная, но в основном можно различать не совсем правильную округлую, овальную или угловатую форму с небольшим числом первичных отростков. Опухолевые клетки значительно различались по степени осмиофильности цитоплазматического матрикса.

Цитоплазма опухолевых клеток, в разных участках одной опухоли, может существенно отличаться своим строением. В одних опухолевых клетках на большем протяжении ультратонкого среза цито-

плазма выполнена нежно-хлопьевидными уплотнениями цитоплаз-матического матрикса, на фоне которого располагаются единичные рибосомы или полисомы, единичные небольшие гладкостенные везикулы. В целом везикулярный компонент цитоплазмы опухолевых клеток атипических астроцитом слабо выражен.

Цитоплазма отдельных опухолевых клеток относительно бедна органоидами, в них отмечают явления набухания или конденсирования. Низкая степень «насыщенности» рибосомами шероховатого эн-доплазматического ретикулума, относительно небольшое количество свободных рибосом также было типично для многих клеток, особенно глиобластом.

Однако некоторые опухолевые астроциты характеризовались гиперплазией гладкого эндоплазматического ретикулума, узкие цистерны и канальцы которого нередко образовывали крупные скопления, занимающие значительную часть перикариона клеток. В области пластинчатого комплекса Гольджи находилось большое число полиморфных везикул с электронно-светлым содержимым. В околоядерной области и начальных отделах крупных отростков часто определялись липидные капли, нередко образующие большие скопления. Около липидных включений встречались и неправильной формы осмиофильные образования.

Также анализ ультраструктуры опухолевых клеток показал, что большинство из них астроцитарного происхождения, так как содержат большое число глиофиламентов, образующих компактные скопления и нередко высокоосмиофильные агрегаты - волокна Розента-ля. Большая часть периваскулярных астроцитов, содержащих глио-филаменты, были в состоянии набухания.

Значительная вариабельность была отмечена со стороны ядерного хроматина - в отдельных клетках он был гомогенно диспергированный, в других находился в виде крупных глыбок обычно вблизи ка-риолеммы, изредка встречались крупные ядрышки. Обращала внимание «изрезанность» контуров ядер большинства клеток вследствие глубоких инвагинаций ядерной оболочки.

В опухолевых клетках одних наблюдений встречается большое количество небольших митохондрий правильной овальной формы со сравнительно хорошо сформированными кристами. Кристы часто

полностью пересекают плотный митохондриальный матрикс от стенки к стенке. В опухолевых клетках других наблюдений чаще встречаются митохондрии неправильной овально вытянутой формы с булавовидными расширениями на обоих концах или с одной стороны.

Матрикс большинства митохондрий нежно-хлопьевидный уплотненный, причем в участках митохондрий, лишенных крист, он менее плотен и светлее, и более плотный по периферии в зоне расположения крист.

При набухании митохондрии округляются, матрикс их просветляется, кристы укорачиваются и как бы разбухают, внутрикристное пространство становится шире.

Среди астроцитом с выраженной атипией опухолевой ткани встречаются опухолевые клетки, в цитоплазме которых располагаются митохондрии гигантских размеров.

Характерно, что в пределах ультратонкого среза опухолевой клетки мы обычно обнаруживаем тесно прилежащие к ее плазматической мембране отростки других опухолевых клеток. Иногда в таких отростках осмиофильные структуры формировали сетевидные образования. По данным субмикроскопических исследований макроглиаль-ных и других опухолей мозга мы не встречали в публикациях описаний подобных структур.

Некоторые гигантские клетки в расширенных цистернах эндо-плазматической сети содержали слабоосмиофильный гомогенный материал.

Перифокальная зона опухолей головного мозга астроцитарного ряда

Перифокальная зона является продуктом жизнедеятельности опухолевых клеток и в то же время предохраняет ткань мозга от непосредственного контакта с очагом злокачественного роста.

По нашим данным, в ближайших к очагу опухоли участках мозга отмечаются гиперплазия астроцитов (реактивной астроглии) и выраженный отек.

Отек проявляется скоплением жидкости как вокруг кровеносных сосудов, так и диффузно между миелиновыми волокнами, что приводит к их разрежению.

При отеке мозга также наблюдаются набухание и пролиферация различных видов клеток глии. Изменение со стороны астроцитов проявляется в виде разрыхления контуров клеток, увеличения объема клеток и распада отростков. Олигодендроциты также подвергаются набуханию, при этом тела олигодендроцитарных клеток увеличиваются и подвергаются гидропической дистрофии, часто в цитоплазме появляются многочисленные лизосомы.

При электронно-микроскопическом исследовании перифокальной зоны опухолей обнаруживались капилляры диаметром от 4 до 8 мкм и более крупные кровеносные сосуды с нормальным строением их стенок. Стенка многих капилляров была сформирована одним слоем эндотелиальных клеток, к которым снаружи в виде чехла на всем их протяжении сравнительно плотно прилежала однослойная базальная мембрана, к которой тесно прилежат отростки астроцитов. Базальная мембрана представлена тонким слоем нежно-фибриллярного уплотненного материала толщиной 20-45 нм, который окутывает слой выстилающих просвет сосуда эндотелиальных клеток на всем протяжении. Иногда в расщеплениях базальной мембраны в плоскости ультратонкого среза встречались фрагменты перицита.

Практически во всех опухолевых клетках отмечаются изменения со стороны митохондрий. Они утрачивают свою овальную форму, матрикс их становится светлее, и наблюдается разрыв митохондри-альной мембраны.

В участке мозга, непосредственно примыкающем к опухоли, выявляются выраженные изменения - очаги размягчения и демиелини-зации. Кроме того, определяется область повреждения с различной величины полостями округлой формы и заполненными отечной жидкостью.

При исследовании кровеносных сосудов периопухолевой ткани мы не выявили заметной гиперплазии эндотелиальных клеток, формирующих однослойную выстилку просветов сосудов. Стыкующиеся между собой эндотелиальные клетки, накладываясь друг на друга истонченными узкими участками периферии цитоплазмы, формируют плотные контакты, в цитоплазме эндотелиоцитов отмечается повышенное количество микропиноцитозных пузырьков.

Иммуногистохимическая характеристика опухолей астроцитарного ряда

Степень иммунореактивности и число ГКФБ-иммунопозитивных клеток глиобластом и анапластических астроцитом значительно колебались от опухоли к опухоли, при этом были выявлены противоречивые данные: чаще при нарастании анаплазии число ГФКБ-по-зитивных клеток в опухоли уменьшается (~70-80%), реже наблюдается повышение реакции (^О—30%). Но в то же время выявлена интересная закономерность: вблизи пролиферирующих микрососудов и очагов некроза количество иммунопозитивных клеток и степень реакции возрастают.

Нередко в мультиформных глиобластомах встречались участки, представленные пролифератами из новообразованных кровеносных сосудов, которые были иммунонегативны на ГФКБ, однако рядом с ними нередко в прямом контакте находились иммунопозитивные клетки. Это означает, что типичных астроцитов в этих клубках нет.

Наибольшее число ГФКБ-позитивных клеток находилось вблизи пролиферирующих кровеносных сосудов. Здесь же отмечается увеличение количества, и интенсивность реакции на ГФКБ более выражена в гигантских многоядерных клетках и гемистоцитических аст-роцитах, а в небольших по размерам перикариона клетках реакция на ГФКБ слабая или вообще отсутствует. В пролиферирующих «сосудистых клубках», представленных большим числом переплетающихся капилляров с большим числом окружающих их клеток, реакция на ГКФБ отсутствовала и проявлялась только в астроцитах, находящихся по их периферии. Следует отметить, что если судить по иммуно-гистохимическим реакциям на ГФКБ, астроциты отсутствуют в клеточных пролифератах сосудистых стенок мелких и крупных сосудов. Только изредка в больших разрастаниях клеточных стенок обнаруживались клетки с положительной реакцией на ГФКБ. Возможно, это были астроциты, окруженные разрастающимися клетками стенок сосуда.

Интенсивная реакция определялась в клетках, образующих пери-васкулярные оболочки. Как правило, продукт реакции хорошо выявлялся не только в телах клеток, но и в их отростках.

При сравнительном анализе астроцитарных опухолей разной степени злокачественности на виментин также была выявлена прямая корреляция между степенью анаплазии опухолей и интенсивностью иммуногистохимической реакции. Максимальная выраженность реакции (по числу иммунопозитивных клеток и степени окраски) выявлена в глиобластомах, причем опухоли с гигантскими многоядерными клетками содержали большое число иммунопозитивных преимущественно гигантских опухолевых клеток. Часть эндотелия в пролиферирующих кровеносных сосудах и сосудах без признаков пролиферации была виментин +.

Представляет интерес, что гигантские виментин-позитивные клетки в гигантоклеточных глиобластомах часто находились в непосредственной близости от эндотелия, нередко контактируя с вимен-тин-позитивными эндотелиальными клетками.

Особенно часто гигантские виментин-иммунопозитивные клетки определялись около пролиферирующих кровеносных сосудов, образующих переплетающиеся клубки с крупными эндотелиальными клетками.

В высокоанапластических астроцитомах число клеток с иммуно-позитивной реакцией на виментин было значительно больше (+++), чем в малозлокачественных опухолях (+), виментин-содержащие ас-троциты обычно располагались или по одиночке среди иммунонега-тивных клеток или, что наблюдалось чаще, находились в скоплениях разной величины, разделенных участками опухолевой ткани без им-мунопозитивных клеток. Степень иммунореактивности астроцитов (если судить по степени окраски) варьировалась от светло-коричневого до темно-коричневого цвета.

Нередко в гигантоклеточных глиобластомах встречались участки, представленные крупными клетками с оптически «пустой» цитоплазмой. Такие клетки не давали положительной реакции на ГФКБ и виментин, однако, рядом с ними нередко в прямом контакте находились иммунопозитивные клетки.

Уже отмечалось, что большинство кровеносных сосудов имело хорошо выраженную периваскулярную астроцитарную оболочку и розетковидные астроцитарные структуры (как в высокоанапластиче-

ских формах опухолей, так и доброкачественных), состоящие из им-мунопозитивных клеток и на ГФКБ и на виментин.

Наоборот, иммунореактивность на виментин в «сосудистых клубках» была выражена интенсивно, и большинство клеток в сосудистых клубках были виментин-позитивны. Отдельные клетки в сосудистых клубках были виментинегативны. Интенсивную реакцию на виментин давали также интимальные клетки в пролиферирующих сосудах с тонкими стенками.

Яркой особенностью гигантоклеточных глиобластом является наличие в опухолевой ткани большого количества гигантских клеток самой разнообразной формы и величины. Встречаются гигантские многоядерные клетки самого различного вида. В многоядерных клетках расположение ядер и структура последних могут быть разнообразны. В большинстве случаев ядра в одной и той же гигантской клетке самой разнообразной формы, величины и структуры. Иногда они равномерно располагаются по всему клеточному телу, иногда имеет место как бы нагромождение ядер в одном полюсе клетки. Большинство таких клеток иммунопозитивны на ГФКБ и виментин.

Если сравнивать интенсивность иммуногистохимической реакции (число иммунопозитивных клеток и интенсивность их окраски) в ткани опухолей на ГФКБ и виментин, то, по нашему мнению, в первом случае число иммунопозитивных клеток было несколько меньше (по сравнению с реакцией на виментин). Можно также отметить, что при обработке препаратов на ГФКБ чаще выявлялись разветвленные клеточные отростки.

В периопухолевой зоне увеличивалось количество астроцитов, т. е. возникала гиперплазия астроглии (реактивная астроглия), количество и степень иммунопозитивных клеток на ГФКБ были значительно выше, чем виментин-иммунопозитивных клеток. Также выявлено, что интенсивность реакции была значительно выше в высокоанапластич-ных опухолях (+++), чем в доброкачественных астроцитомах (+).

Для выявления в ткани анапластических астроцитарных опухолей кровеносных сосудов использовали моноклональные антитела против коллагена IV. С помощью данного маркера коллаген IV равномерно определялся по всей толще стенки кровеносных сосудов, а также вокруг сосудов положительно реагировал соединительно-

тканный компонент. Интенсивная реакция отмечалась как в артериях большого диаметра, так и в клубках пролиферирующих капилляров.

Интерес представляет тот факт, что в опухолевой ткани изредка выявлялась слабоположительная реакция на нейрофиламенты. Возможно, что в ткани глиобластом встречаются участки, состоящие из клеток нейронального происхождения, - это могут быть зрелые нервные клетки или их эмбриональные предшественники нейробласты.

Нейронспецифическая енолаза (NSE) выявлялась практически во всех опухолях, однако распределение фермента сильно варьировалось не только от опухоли к опухоли, но и в различных участках в пределах одной опухоли. Некоторые клетки реагировали более интенсивно в сравнении с соседними участками.

Нейрофиламенты и являются маркерами нейронов, и различие в экспрессии нейрофиламентов и говорит о том, что они реагируют на разные антигены, так как такая закономерность была во всех астроцитарных опухолях без зависимости от степени анаплазии.

В работе была изучена иммунореактивность на три изоформы NO синтазы. Иммунопозитивные клетки на все 3 изоформы можно было обнаружить практически во всех изученных случаях астроци-тарных опухолей, однако в высокоанапластических астроцитомах и глиобластомах их число и степень окраски были значительно выше (+++), чем в доброкачественных (+). Следует отметить, что в неопухолевой ткани пМОБ-позитивные клетки не выявлялись.

В опухолевой ткани анапластических астроцитом и глиобластом многие астроциты были иммунореактивны на эндотелиальную форму N0 синтазы. Реакция эндотелия на эту форму N0 синтазы различалась в разных сосудах и зависела от характера их пролиферации. В сосудах с тонкой эндотелиальной выстилкой без пролиферации интимальных клеток реакция на eNOS была обычно положительной и, наоборот, в сосудистых клубках с массивной пролиферацией клеток реакция была отрицательной.

Аналогичная закономерность в отношении реагирования эндотелия была отмечена и при реакции на iNOS. Использование антител на nNOS не давало положительной реакции эндотелиальных клеток.

В астроцитомах с низкой степенью злокачественности наблюдались единичные NOS-позитивные клетки, которые располагались в опухолевой ткани разрозненно. Реакция наблюдалась в основном в телах астроцитов, отростки практически не окрашивались.

В высокоанапластичных астроцитомах положительная реакция наблюдалась гораздо чаще. Иммунопозитивные клетки располагались в опухоли либо поодиночке, либо в виде скоплений на фоне отрицательно реагирующих клеток.

iNOS-иммунореактивные клетки часто находились около фокусов некроза и в периваскулярных розетках анапластических форм опухолей. Интересно также, что митотически делящиеся клетки, особенно в глиобластомах, нередко были iNOS-иммунопозитив-ными.

Отмечена прямая зависимость между размером анапластических астроцитов и интенсивностью иммуногистохимической реакции: в крупных и гигантских клетках степень окраски была выше, чем в мелких клетках. При этом положительная реакция была как в доброкачественных астроцитомах, так и в злокачественных.

Интерес вызывают гигантские клетки с эксцентрично расположенными ядрами и резко NOS-положительной (на все 3 изоформы) цитоплазмой. Данные клетки располагались либо поодиночке, либо группами среди мелких иммунонегативных клеток.

Белок S-100 бета - это белок, типичный для нейроглии. Проведенное исследование показало, что в большинстве изученных опухолей имеются $-100-иммунореакгивные клетки. Какой-либо зависимости от степени злокачественности опухоли установить не удавалось. Иммунопозитивные клетки даже в одном поле зрения значительно отличались по форме и размерам и встречались как маленькие, так и гигантские многоядерные $-100-иммунопозитивные клетки. S-100 определялся преимущественно в телах и только в некоторых крупных отростках. Интенсивная реакция была отмечена в ядрах клеток.

Иммуноположительные клетки локализовались вне всякой зависимости от их расположения по отношению к сосудам и другим структурным компонентам клетки, и степень их окраски была различной. Иммуноположительная, слабая реакция отмечалась во многих клетках. Однако по сравнению с реакцией на ГФКБ и виментин

количество S-100-положительно реагирующих клеток было значительно меньше.

В пролиферирующих сосудистых клубках, представленных большим числом переплетающихся капилляров с большим числом окружающих их клеток, реакция на белок S-100 отсутствовала.

Несмотря на многочисленные исследования, показывающие, что белок S-100 в нервной ткани в основном сосредоточен в астроцитах ((до 85-90%) Bottiger et al., 2001; Мотин и др., 2002; Heizmann et al., 2002), проведенное нами исследование показывает, что в астроци-тарных опухолях зачастую клетки, положительно реагирующие на ГФКБ, иммунонегативны на белок S-100 и, наоборот, положительно реагирующие клетки на белок S-100 не дают положительную окраску на ГФКБ.

Для изучения закономерностей экспрессии онкобелка р53 в аст-роцитарных глиомах были изучены опухоли с различной степенью злокачественности.

Следует отметить, что нередко в пределах одной и той же опухоли в одних клетках наблюдалась выраженная иммунореактивность ядер, в других же выявлялась более слабая реакция.

В доброкачественных астроцитомах выявлялись единичные р53-позитивные клетки, равномерно разбросанные на значительном расстоянии друг от друга. Анапластические астроцитомы и глиобласто-мы отличались от предыдущих опухолей большей степенью положительной экспрессии онкопротеина р53: в большинстве случаев ана-пластических опухолей выявлялись очаговые скопления окрашенных ядер.

Экспрессия на пролиферационный маркер Ki-67 в опухолях давала противоречивые данные. Проведенное нами исследование показало, что реакция на пролиферационный маркер Ki-67 была выше в доброкачественных астроцитарных опухолях по сравнению с анапла-стическими астроцитомами и глиобластомами, что не соответствует литературным данным о митотической активности в опухолях (Са-valla et al., 1997; Coons et al., 1997; Cunningham et al., 1997; Madsen, Schroder, 1997; Schifferal., 1997).

Также проводилось исследование на другой пролиферационный маркер - МШ. Исследование показало наличие положительной реакции в ядрах лишь единичных клеток. Отмечено, что чем выше была степень анаплазии опухоли, тем в большей степени выявлялась позитивная реакция на МШ в ядрах опухолевых клеток. В сравнении с доброкачественными астроцитомами, где положительная реакция на пролиферативные маркеры либо вовсе не выявлялась, либо выявлялась в единичных опухолевых клетках, при анапластической астроци-томе частота положительно реагирующих клеток на МЮ возрастает.

В работе также проводился анализ ангиобластом (гемангиобла-стом). Диффузная виментин-положительная реакция отмечалась в эндотелиальных клетках сосудов (как пролиферирующих, так и неизмененных), а также полигональных клетках, расположенных как по периферии, так и в центральной части опухоли. На ГФКБ положительно реагировали стромальные клетки опухоли.

В отличие от глиобластом, где имеется выраженный ГФКБ + пе-риваскулярный соединительно-тканный компонент, положительная реакция на коллаген IV выявлялась только в стенке кровеносных сосудов.

Обсуждение

В настоящем исследовании основное внимание обращалось на пролиферирующие сосуды, поскольку процессы ангиогенеза имеют огромное значение для морфогенеза любой опухоли и без развития собственных кровеносных сосудов опухоли не достигают размера более 2 мм (Alberts et al., 2004). Известно, что интенсивность их пролиферации в опухолях головного мозга имеет прямую зависимость от степени анаплазии опухолей, что особенно ярко выражено в аст-роцитарных опухолях (Bertossi et. al., 1997; Burger, Scheithauer, 1994; DeAngelis, 2001; Demeule et al., 2004), и поэтому в работе большое место уделено анализу материала глиобластом и анапластических астроцитом.

Во всех изученных опухолях умеренной или высокой степени анаплазии обнаруживалось большое число пролиферирующих кровеносных сосудов. Обычно они располагались компактно, и в разных

участках опухоли число пролиферирующих сосудов могло значительно различаться.

Подобные пролиферации часто обнаруживаются вокруг очагов некроза, и, по-видимому, они указывают на неполноценность вновь образованных сосудов, которые не способны обеспечить достаточный кровоток и питание ткани опухоли.

Следует обратить внимание на то, что большое число вновь образованных сосудов микроциркуляторного русла определялось только при электронно-микроскопическом исследовании. На гематоксилин-эозиновых препаратах они не идентифицируются или выглядят как округлые образования неясной природы, и только сопоставление электронно-микроскопических препаратов с полутонкими срезами позволяет отнести маленькие клеточные агрегаты, как они выглядят в световом микроскопе, с кровеносными сосудами.

Эндотелиальные клетки, образующие однослойную выстилку или «конгломераты» из пролиферирующих клеток, отличались большим числом осмиофильных гранул Вейбеля-Паладе. Эти гранулы определись как в околоядерной области, так и в крупных клеточных отростках. По данным ряда авторов (Miyagami, Nakamura, 1996), эти тельца преобладают в эндотелии микрососудов в периферических отделах опухолей и в периопухолевой зоне,и с увеличением степени злокачественности увеличивается число таких телец. Наши данные подтверждают данные исследования.

С патологией кровеносных сосудов, в частности с нарушением пористости их стенки, связывают развитие отека мозговой ткани -типичного признака многих опухолей, имеющего большое значение для клинического течения опухоли и прогноза. Структурно, по мнению ряда авторов, это выражается в появлении фенестр, увеличении пиноцитоза в аблюминальной поверхности эндотелия, нарушений базальной мембраны (Hirano et al., 1994; Bertossi et al., 1997; Sumpio et al., 2002; Jansen, 2004).

В изученных опухолях астроцитарного ряда нами также были обнаружены выраженные изменения сосудистой стенки. В эндотелии пролиферирующих микрососудов опухолей мы не обнаружили пи-ноцитозные пузырьки, так же как фенестры и нарушенные межэндо-телиальные контакты, наоборот, эндотелиальные клетки отличались

значительными размерами и толстыми отростками. Все изученные эндотелиальные клетки, ограничивающие просвет сосудов, были связаны друг с другом плотными контактами.

Большое внимание привлекает наружная оболочка вновь образованных сосудов. Из данных литературы известно, что при опухолях головного мозга астроцитарного ряда вокруг кровеносных сосудов утолщается базальная мембрана и происходит ее «расщепление» (Bertossi et al., 1997; Sumpio et al, 2002; Jansen, 2004). Как показало проведенное исследование, характерным признаком большинства кровеносных сосудов в глиобластомах являлось значительное утолщение базальной мембраны эндотелия, нередко до нескольких микрометров , и обильное развитие периваскулярной соединительной ткани, отделяющей сосуды от окружающих опухолевых клеток. Гомогенный материал утолщенной базальной мембраны нередко достигал размеров нескольких микрометров, в нем определялись участки низкой электронной плотности, клеточные отростки, волокна коллагена, что, возможно, и послужило основанием для термина «расщепление» базальной мембраны.

Необходимо обратить внимание, что утолщенная мембрана, прилежащая к эндотелию кровеносных капилляров, может быть следствием изменения не только самих эндотелиальных клеток, но и других клеточных элементов, в частности перицитов и гладкомышечных клеток в мелких артериолах.

Представляет интерес, что большинство пролиферирующих микрососудов было окружено не только утолщенной базальной мембраной, но и большим числом волокон коллагена. Последние обычно лежали ближе к астроцитарным периваскулярным отросткам и практически отсутствовали около интимальных клеток сосудов.

Не совсем ясно происхождение периваскулярного коллагена в опухолевой ткани. Следует рассмотреть несколько возможностей. Во-первых, это активизация синтеза коллагена клетками, которые способны его продуцировать в норме фибробластами. Такая возможность вероятна в более крупных сосудах - артериолах или венулах. Значительно сложнее объяснить процесс коллагенообразования вокруг капилляров, где, как известно, фибробласты отсутствуют. Здесь коллаген-синтетическую способность, возможно, могут проявлять

измененные адвентициальные клетки, нельзя исключить, что часть трансформированных астроцитов также способна к экспрессии белка коллагенов.

Особенностью эндотелиальных клеток в анапластических астро-цитарных опухолях являлось то, что они содержали выраженный бе-локсинтетический аппарат. Поэтому не исключено, что они также принимают участие в образовании коллагена.

В работе было установлено, что гигантские клетки часто обнаруживаются около пролиферирующих сосудов. Обычно гигантские клетки рассматриваются как производные трансформированных аст-роцитов. Однако мы показали, что к стенке некоторых пролифери-рующих сосудов прилежат ГФКБ-иммунонегативные гигантские клетки, такие же клетки определяются и вблизи сосудов, т. е. не все гигантские клетки являются ГКФБ+.

Ультраструктурные исследования подтверждают иммуногисто-химические данные о неравномерном содержании глиальных фила-ментов в клетках, когда наряду с клетками, содержащими большие скопления компактно лежащих филаментов, имелись клетки с немногочисленными диффузно расположенными филаментами. А также встречались гигантские клетки и клетки, похожие на астроциты, не имеющие в цитоплазме глиофиламентов, возможно, что часть из них содержит ГКФБ в нефибриллярной форме в виде протофибрил.

Следует отметить, что вопрос о происхождении гигантских клеток, особенно находящихся в некоторой близости от пролифери-рующих кровеносных сосудов, вызывает большой интерес и до сих пор остается дискутабельный (Mischel et al, 2003; Doolittle, 2004; Merlo A., 2003; Pulford et al., 2004).

Следует отметить, что, несмотря на выраженную активацию ан-гиогенеза, он во многом «несовершенен» и поэтому в ткани опухоли отмечаются застойное полнокровие, сужение просвета, явления стаза, тромбоза, а также гиперплазия эндотелия. Известно: при опухолях стенка отдельных сосудов подвергается гиалинозу и склерозу; встречаются также периваскулярные кровоизлияния и воспалительные инфильтраты (Земская, Лещинский, 1985).

Большинство опухолевых клеток в изученных астроцитарных опухолях содержало большое число глиальных филаментов, при

этом в доброкачественных астроцитомах (I-II степени) было больше клеток с большим количеством глиофиламентов. Они обнаруживались и в околоядерной области, и в клеточных отростках разной величины. Часто обнаруживались компактные, осмиофильные скопления филаментов - розенталевские волокна.

По данным некоторых авторов наблюдается закономерность в экспрессии ГФКБ и виментина в опухолях разной степени злокачественности: в менее дифференцированных опухолях (глиобластомы и аннапластические астроцитомы) увеличивается число виментин-им-муноположительных клеток, в астроцитомах - относительно больше клеток иммуноположительных на ГФКБ (Березин, Белик, 1990; Вяльцева и др., 1996).

Проведенное исследование также показало, что число ГФКБ-им-мунопозитивных клеток примерно на 20-30 % уменьшалось, а число виментин-иммунопозитивных клеток возрастало также на 20-30 %, с увеличением степени злокачественности. Характерной чертой гли-областом является их резко выраженная склонность к некрозам коа-гуляционного типа, и особенно характерны милиарные некрозы, которые бывают различной величины (Bell, 2001; DeAngelis, 2001). Собственное исследование показало, что такие некрозы обычно окаймлены зоной мелких опухолевых клеток вытянутой формы, дающие интенсивную реакцию на ГФКБ и виментин.

В настоящем исследовании впервые показано, что некоторые гигантские клетки, расположенные около сосудов, были иммунонега-тивны на глиальный фибриллярный кислый белок.

Представляют большой интерес природа и происхождение проли-ферирующих клеток в стенке вновь образованных кровеносных сосудах. Традиционно данные клетки рассматривались как эндотелиаль-ные. Однако в последнее время появились данные, что, по крайней мере, их часть может являться гладкомышечными клетками и перицитами (Stiles et al., 1997; Du Plessis et al., 2004). Иммуногистохимически нами выявлено, что только часть клеток в пролиферирующих кровеносных сосудах, положительно реагирует на виментин.

При ультраструктурном исследовании не всегда представлялось возможным однозначно установить гистогенетическую принадлежность клеток в пролиферирующих сосудах. Более правомерно счи-

тать, что в разных сосудах может быть разное соотношение между числом пролиферирующих клеток разной природы: в одних размножаются преимущественно эндотелиальные клетки, в других - перициты или гладкомышечные элементы.

Уже отмечалось, что изменения в периопухолевой зоне имеют большое клиническое значение и нередко определяют прогноз заболевания. В периопухолевой зоне анапластических астроцитом и гли-областом большое число отростчатых клеток, дающих интенсивную реакцию на ГФКБ, которые можно считать реактивными астроцита-ми. Количество ГФКБ+ клеток возрастает с увеличением степени злокачественности. Напротив, реакция на виментин не всегда была положительной в периопухолевой зоне и встречались участки как с реактивными виментин-отрицательными клетками, так и виментин-положительными клетками, в которых продукт реакции выявлялся в телах и отростках клеток. Такие наблюдения могут отражать разное состояние клеток и неоднородность популяции реактивных астроци-тов как клеток, экспрессирующих ГФКБ в больших количествах.

Реактивные астроциты периопухолевой зоны нередко группировались вблизи кровеносных сосудов, где их отростки формировали периваскулярную манжетку. С чем связана такая особенность в расположении реактивных астроцитов не выяснено. Можно предположить, что кровеносные сосуды - клетки их стенки или проникающие агенты из крови - вызывают изменения фенотипа окружающих аст-роцитов. Интимальная оболочка большинства кровеносных сосудов в периопухолевой зоне была иммунопозитивна на виментин, однако, окружающие сосуды астроциты не всегда были виментин-иммуно-позитивны.

В периопухолевой зоне анапластических астроцитом, и особенно глиобластом, картина гиперплазии астроцитарной глии значительно более выражена, особенно по ходу сосудов. Увеличивается число реактивных ГКФБ-положительных клеток, по сравнению с количеством виментин-положительных клеток. Это может свидетельствовать о том, что «типичные» реактивные астроциты - зрелые клетки, так как, уже отмечалось выше, виментин появляется на более ранних сроках созревания клеток.

По литературным данным (Preusser et al., 2005; Huber et al., 2005), моноклональное антитело Ki-67 узнает ядерные антигены только пролиферирующих клеток. Данные нашего исследования показывают, что степень реакции не всегда зависит от степени анаплазии опухоли; так как несмотря на то, что в анапластических астроцитомах и глиобластомах число митотически делящих клеток было выше, чем в доброкачественных астроцитомах, степень реакции была ниже.

Параллельно проводилось исследование на другой пролифераци-онный маркер - МШ. Исследование показало наличие положительной реакции в ядрах лишь единичных клеток. Отмечено, что чем выше была степень анаплазии опухоли, тем в большей степени выявлялась позитивная реакция на МШ в ядрах опухолевых клеток.

Таким образом,наше исследование показывает, что антитело Ki-67 не всегда может служить достоверным пролиферационным маркером в отличие от пролиферационного маркера - МГО.

Заключение

По результатам эпидемиологических исследований, проведенных в экономически развитых странах в течение последних 10-20 лет, наблюдается тенденция неуклонного роста заболеваемости первичными и метастатическими опухолями головного мозга, заболеваемость первичными доброкачественными и злокачественными опухолями головного мозга в настоящее время составляет 10,9-12,8 на 100 тысяч населения (Chozick et al., 1994). Среди первичных опухолей головного мозга приблизительно 60% - злокачественных, 40% -доброкачественных (Danks et al., 1995).

В связи с этим значительным ростом числа онкологических больных во всем мире в настоящее время растет интерес к неоваскулоге-незу в опухолевой ткани, так как кровоснабжение опухоли имеет большое значение в ее прогрессии.

Основное внимание в данной части работы будет уделено ультраструктуре пролиферирующих кровеносных сосудов и окружающих их клеток в опухолях. В работе показаны электронно-микроскопические и иммуногистохимические особенности ангиогенеза в опухолях головного мозга. Как уже отмечалось, наиболее ярко эти процессы происходят в анапластических опухолях астроцитарного ряда

(анапластическая астроцитома и глиобластома). Поэтому основная часть работы посвящена именно данным опухолям.

Часть работы посвящена изучению морфологических основ нарушения гематоэнцефалического барьера. Известно, что гематоэнце-фалический барьер принимает участие в обеспечении нормального функционирования центральной нервной системы. Гематоэнцефали-ческий барьер имеет своеобразную структуру и характерное взаимоотношение отдельных клеточных элементов, выполняя барьерную и транспортную функции. Для гематоэнцефалического барьера характерны плотное соединение эндотелиоцитов, отсутствие пор и фене-страций в капиллярах головного мозга, целостность цитоплазматиче-ских мембран, обилие пиноцитозных везикул в цитоплазме эндоте-лиоцитов, близкое соприкосновение астроцитов и эндотелиальных клеток (Kim et al., 2005; Sobaniec-Lotowska, 2005; Melgar et al., 2005).

Многие авторы указывают на прорыв гематоэнцефалического барьера при опухолях головного мозга, структурно это выражается в появлении фенестр, нарушении межэндотелиальных соединений. Некоторые авторы свидетельствуют о полном отсутствии гематоэнцефалического барьера (Wahl S.M., et al., 1991; Steuer et al., 2005).

Наше исследование показало отсутствие структурных вышеперечисленных нарушений при анапластических опухолях головного мозга астроцитарного ряда. В эндотелиальных клетках пролифери-рующих микрососудов мы вообще не обнаружили микропиноцитоз-ные пузырьки на аблюминальной поверхности клеток.

Нами выявлено, что отек ткани головного мозга наиболее выражен в тех периваскулярных областях, где имелось значительное утолщение базальной мембраны со снижением ее степени электронной плотности.

Как уже отмечалось выше, возможно, что низкая электронная плотность материала базальной мембраны, отдельных кровеносных сосудов может свидетельствовать о нарушении клеток ее производящих. Как мы считаем, причиной нарушения гематоэнцефалическо-го барьера служит разрыхление базальной мембраны. Это доказывалось еще тем, что интерстициальный отек и набухание отростков и тел астроцитов наиболее были выражены в тех периваскулярных

пространствах, где наблюдалось значительное утолщение базальной мембраны со снижением ее электронной плотности.

Изученные анапластические астроцитарные опухоли отличались значительной пролиферацией кровеносных сосудов. Выраженность пролиферации кровеносных сосудов прямо зависела от степени ана-плазии опухолей. В опухолях происходит разрастание мелких сосудов со значительной перестройкой структуры их стенки вследствие беспорядочного размножения клеток.

При гистологическом исследовании в глиобластомах отмечали, во-первых, увеличение числа новообразованных тонкостенных кровеносных сосудов, заполненных кровью, и, во-вторых, образование «сосудистых клубков», представляющих собой конгломераты крупных эндотелиальных клеток и перициов зачастую без просвета.

По-видимому, образование «сосудистых клубков» связано с тем, что эндотелиоциты в недостаточном количестве выделяют протеазы (например активатор плазминогена), которые необходимы, для того, чтобы разрушить базальную мембрану материнского капилляра или венулы и проложить себе путь для дальнейшего роста; или за счет повышенного синтеза факторов (кислый фактор роста фибробластов и основной фактор роста фибробластов), стимулирующих пролиферацию фибробластов и выработку ими большого количества коллагена и компонентов аморфного вещества базальной мембраны, что также затрудняет нормальный рост капилляров, но не останавливает пролиферацию эндотелиоцитов.

Имеется информация об иммунологических и иммуногистохими-ческих свойствах опухолевых клеток (Janish et al., 1986; Cervos Navarro et al., 1999). Степень иммунореактивности и число ГФКБ-позитивно реагирующих клеток глиобластом значительно колебались от опухоли к опухоли, при этом были выявлены противоречивые данные: чаще при нарастании анаплазии число ГФКБ-позитив-ных клеток в опухоли уменьшается, реже наблюдается повышение реакции. Но в то же время выявлена интересная закономерность: вблизи пролиферирующих микрососудов и очагов некроза количество иммунопозитивных клеток и степень реакции возрастают.

Иммуногистохимическое изучение кровеносных сосудов опухолей показало, что эндотелиальные клетки сосудов обладали выра-

женнои иммунореактивностью на виментин, что подтверждает способность этого маркера выявлять мезенхимальную дифференцировку клеток. Однако с нарастанием анаплазии опухоли в пролиферирую-щих микрососудах не все клетки были виментинпозитивны.

Особенно часто гигантские виментин-иммунопозитивные клетки определялись около пролиферирующих кровеносных сосудов, образующих переплетающиеся клубки с крупными эндотелиальными клетками.

Показательной была реакция сосудов на коллаген IV. С помощью этих маркеров можно выявить даже самые мелкие новообразованные сосуды в опухолях, которые не улавливаются с использованием классических методик.

В работе была изучена иммунореактивность на три изоформы N0 синтазы. Иммунопозитивные клетки можно было обнаружить практически во всех изученных опухолях, однако, в высокоанапластиче-ских астроцитомах и глиобластомах их число и степень окраски были значительно выше. При анализе опухолей выявлена вариабельная реакция астроцитов на 3 изоформы NO-синтазы. Степень иммуноре-активности опухолевых клеток находилась в прямой зависимости от степени анаплазии опухоли. Следует отметить, что в неопухолевой ткани - nNOS-позитивные клетки.

Несмотря на многочисленные исследования (Bottiger et al, 2001; Donato, 2001; Du Plessis et al., 2004), показывающие, что белок S-100 в нервной ткани в основном сосредоточен в астроцитах, проведенное нами исследование показывает, что зачастую клетки, положительно реагирующие на ГФКБ, иммунонегативны на белок S-100 и наоборот, положительно реагирующие клетки на белок S-100 не дают положительную окраску на ГФКБ. Возможно что экспрессия белка в нормальной нервной ткани совсем иная, не такая, как в опухолях.

По мнению ряда авторов (Graf et al., 1999; Fuller et al., 2001), накопление в нейронах промежуточных нейрофиламентов может рассматриваться в качестве маркеров нейрональной дифференцировки опухолевых клеток. Нейрофиламенты обнаруживают в нейробласто-мах, ганглиоглиомах, первичных герминогенных опухолях, медул-лобластомах и пинеобластомах.

Собственное исследование показало, что в опухолевой ткани гли-областом и анапластических астроцитом выявлялась слабоположительная реакция на нейрофиламенты. Возможно, что в ткани глиоб-ластом встречаются участки, состоящие из клеток нейронального происхождения - это могут быть зрелые нервные клетки или их эмбриональные предшественники - нейробласты.

Исследование степени экспрессии на пролиферационный маркер Ш-67, выявляемый митотическую активность опухолевых клеток, показал, что не всегда можно доверять данному маркеру. Часто более высокая иммунореактивность обнаруживалась в доброкачественных астроцитомах, где митотическая активность ниже.

ВЫВОДЫ

1. Электронно-микроскопически в опухолевой ткани глиобластом и анапластических астроцитом в пролиферирующих сосудах установлено отсутствие нарушений межэндотелиальных соединений (области простых и специализированных контактов между соседними клетками имеют неизмененную ультраструктуру, сохраняется большое число плотных контактов между эндотелиальными клетками).

2. Нарушение трансэндотелиального транспорта в пролифери-рующих кровеносных микрососудах проявляется в отсутствии мик-ропиноцитозных пузырьков в отростках эндотелиальных клеток.

3. Установлено, что интерстициальный отек и набухание отростков и тел астроцитов наиболее выражены в тех периваскулярных пространствах, где наблюдается значительное утолщение базальной мембраны со снижением ее электронной плотности.

4. Иммуногистохимически выявлено, что с увеличением степени злокачественности в анапластических астроцитарных опухолях головного мозга количество клеток экспрессирующих ГКФБ и вимен-тина возрастает, причем количество ГФКБ-позитивных клеток меньше, чем количество виментин-позитивных клеток.

5. Иммунореактивность на S-100 выражена в меньшей степени (степень окраски и число иммунопозитивных клеток) в анапластиче-ских опухолях головного мозга астроцитарного ряда в сравнении с реакцией на ГКФБ и виментин.

6. Установлена неравномерная реакция клеток на виментин в пролиферирующих клетках стенки кровеносных сосудов в астроци-тарных опухолях (доброкачественных астроцитомах, анапластиче-ских астроцитомах и глиобластомах), что может свидетельствовать о разной гистогенетической их природе или неодинаковой степени дифференцировки.

7. В пролиферирующих кровеносных сосудах глиобластом выявлено наличие периваскулярных гигантских клеток, которые иммуно-гистохимически не давали положительной реакции на ГКФБ, а на ультраструктурном уровне в них отсутствовали глиофиламенты.

8. Установлено, что опухолевые астроциты во всех астроцитар-ных новообразованиях являются иммунопозитивными на три изо-формы (нейрональную, индуцибельную и эндотелиальную) N0 син-тазы с максимальной реакцией (увеличение количества иммунопози-тивных клеток) на индуцибельную форму фермента. Также установлено, что в высокоанапластических астроцитомах и глиобластомах их число и степень окраски были значительно выше, чем в доброкачественных астроцитомах.

9. Выявлено, что N0 синтаза - иммунореактивные клетки на все три изоформы преимущественно локализуются около пролифери-рующих кровеносных сосудов и участков некроза и многие митоти-чески делящиеся клетки являются N0 синтаза - иммунопозитивны-ми. В нормальной периопухолевой ткани положительная реакция была только на ¡N08 и eNOS, а на ^ОЯ не давало положительной реакции.

10. Установлено, что в периопухолевой зоне анапластических ас-троцитарных опухолей (аналластические астроцитомы и глиобла-стомы) ГКФБ-иммунопозитивные реактивные астроциты не экспрес-сируют виментин, а также интенсивность реакции была значительно выше в высокоанапластичных опухолях (+++), чем в доброкачественных астроцитомах (+).

11. Выявлено, что в доброкачественных астроцитомах степень иммунореактивности на антитело Ш-67 выше, чем в злокачественных астроцитомах и глиобластомах, что может свидетельствовать о незавершенности митотического цикла в низкоанапластических опухолях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследований значительно расширяют представления о межклеточных взаимосвязях в ткани опухолей головного мозга и периопухолевой зоне, межклеточных основах нарушения гематоэн-цефалического барьера и функционально неполноценного ангиогене-за. Полученные данные позволяют дифференцированно подходить к выбору иммуногистохимических маркеров в диагностике конкретной опухоли. Эти данные могут быть использованы патоморфологами при диагностике и дифференциальной диагностике опухолей головного мозга; материал также может быть использован в учебных курсах гистологии, патологии и невропатологии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Экспрессия NO-синтазы астроцитами in vivo и in vitro / А. А. Сосунов, И. Н. Чаиркин, Л. Р. Одыванова, С. А. Мозеров // Гистологический анализ пластичности и регенерации тканей. - С.-Петербург, 1997.

2. Одыванова Л. Р. Экспрессия NO-синтазы астроцитами в культуре клеток / Л. Р. Одыванова, К. Кодина-Жанет, С. А. Мозеров // Тезисы докладов второй конференции молодых ученых. - Саранск: Изд-во НИИ регионологии, 1997.

3. Мозеров С. А. Экспрессия глиального фибриллярного кислого белка и виментина при опухолях головного мозга астроцитарного ряда / С. А. Мозеров, Л. Р. Одыванова, И. Н. Чаиркин // Тезисы докладов второй конференции молодых ученых. - Саранск: Изд-во НИИ регионологии, 1997.

4. Иммуногистохимическое исследование экспрессии трех изо-форм NO-синтазы в опухолях головного мозга /С. А. Мозеров, А. А. Сосунов, А. В. Ховряков, И. Н. Чаиркин, Л. Р. Одывано-ва // Тезисы докладов третьей конференции молодых ученых. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 1998.

5. Чаиркин И. Н. Астроцитарные опухоли головного мозга и висцеральная патология / И. Н. Чаиркин, С. А. Мозеров // Тезисы докладов второго Международного симпозиума «Структура и функ-

ции вегетативной нервной системы». - Воронеж: Изд-во Московской мед. академии, 1998.

6. Мозеров С. А. Иммуногистохимическая диагностика астрог-лиальных опухолей головного мозга / С. А. Мозеров, И. Н. Чаир-кин // Материалы конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». -М.: Изд-во Московской мед. академии, 1998.

7. Ultrustracture and immunohistochemistny of blood vessels in glioblastomas (Иммуногистохимическое и ультраструктурное исследование глиобластом) / Chovrykov A., Sosunov S., Chairkin L, Moze-rov S. // Abstract of the 14 International Medical Sciences Student Congress. - Istanbul, Turkey, 1998 (Тезисы 14 международного медицинского студенческого конгресса. - Стамбул, Турция, 1998).

8. Ультраструктурные особенности опухолей головного мозга астроцитарного ряда / С. А. Мозеров, А. А. Сосунов, И. Н. Чаиркин, С. П. Кемайкин // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. - Пенза: Изд-во ПТУ, 2000.

9. Иммуногистохимические особенности опухолей головного мозга астроцитарного ряда / С. А. Мозеров, А. А. Сосунов, И. Н. Ча-иркин, С. П. Кемайкин // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. - Пенза: Изд-во 111 У, 2000.

10. Экспрессия глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) в опухолях головного мозга / И. Н. Чаиркин, С. А. Мозеров, А. А. Сосунов, Пат С. (Берлин), С. П. Кемайкин // Морфология. -С.-Петербург, 2000.

11. Мозеров С. А. Мышечные и нервные ткани: Учеб. пособие. -Пенза: Изд-во ПГУ, 2000.

12. Мозеров С. А. Нарушение гематоэнцефалического барьера и экспрессия глиального фибриллярного кислого белка в опухолях голового мозга // Известия вузов. Поволжский регион // Медицинские науки.-2003.-№34 (12).

13. Мозеров С. А. О состоянии гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) при опухолях головного мозга // Известия вузов. Поволжский регион // Медицинские науки. - 2003. -№ 4 (7).

14. Изменение эндотелиоцитов и базальной мембраны пролифе-рирующих микрососудов при глиобластомах //И. Н. Чаиркин, С. А. Мозеров, Г. Гуски (Берлин), Цервос-Наварро (Барселона) // Морфологические ведомости. - 2004. -№ 1-2.

15. Мозеров С.А Экспрессия глиального фибриллярного белка в опухолях головного мозга астроцитарного происхождения и в пе-риопухолевой ткани // С. А. Мозеров, И. Н. Чаиркин // Морфологические ведомости. - 2004. - № 1-2.

16. Патоморфологическая диагностика глиобластом /С. А. Мозеров, А. Н. Мялин, А. В. Сергеев, У. В. Баулина // Актуальные вопросы современной клинической медицины. - Пенза: Изд-во ПГУ,

2004.

17. Мозеров С. А. Улътраструктурные основы нарушения гема-тоэнцефалического барьера при анапластических опухолях астроци-тарного ряда / С. А. Мозеров, А. А. Сосунов, И. Н. Чаиркин // Морфологические ведомости. - 2005. - № 1.

18. Чаиркин И. Н. Иммуногистохимическое исследование экспрессии NO-синтазы в опухолях головного мозга астроцитарного ряда/ И. Н. Чаиркин, С. А. Мозеров // Морфологические ведомости. -

2005.-№1.

МОЗЕРОВСергей Алексеевич

ГЛИОВАСКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В АНАПЛАСТИЧЕСКИХ АСТРОЦИТАРНЫХ ОПУХОЛЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА

(электронно-микроскопическое и иммуногистохимическое исследование)

14.00.15 - патологическая анатомия, 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Редактор Т. В. Веденева Технический редактор Н. А. Вьялкова

Корректор Н. А. Сидельникова Компьютерная верстка М. Б. Жучковой

ИД №06494 от 26.12.01 Сдано в производство 27.04.2005. Формат 60х84 1/16. Бумага писчая. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,32. Заказ № 332. Тираж 100.

Издательство Пензенского государственного университета. 440026, Пенза, Красная, 40.

im m

'. i*i JlfJTt« I

£.î3«tj % ' / V

В настоящее время морфологическому изучению опухолей нервной системы посвящено большое число исследований (Wahl et. al, 1991; Rutten et. al, 1992; Pascual-Castroviejo et. al, 1995; Liberski, Kordek, 1997; Demuth T., Berens M. E., 2004; Hartmann C, et al., 2005). Однако данный раздел онкологии остаётся одним из наименее изученных, что связано со сложностью структурной организации нервной системы (Zorzi et. al, 1992; Scarpelli et. al, 1994; Tomlinson et. al, 1994).

Наиболее распространенным видом опухолей головного мозга человека, как известно, являются астроцитарные опухоли, отличающиеся значительной вариабельностью структуры в зависимости от степени анаплазии (Burger , Scheithauer, 1994; Escalone Zapata, 1994; Bertossi et. al, 1997). В последнее время в диагностике опухолей начали использоваться некоторые иммуногистохимические методы, основанные на выявлении белков, специфичных для клеток разного гистогенетического происхождения (Zorzi et. al, 1992; Luo, 1993; Huang et al., 1996). Несмотря на значительные достижения в этой области, многие вопросы остаются недостаточно выясненными: в частности, некоторые антигенные характеристики клеток пролиферирующих сосудов и гигантских клеток, распределение трех изоформ NO синтазы в тканях опухолей. Противоречивые данные относятся даже к выявлению глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) - иммуноположительные клетки встречаются при всех опухолях астроцитарного ряда, степень реакции различается и зависит не только от степени злокачественности опухоли, но и от местных тканевых особенностей строения опухолей (Березин, 1985; Burger Р. С. et al., 1991; Коршунов А. Г., Лахтеева C.B., 1998).

В прогрессии опухолей головного мозга немаловажное значение придается пролиферации клеток кровеносных сосудов (Jansen M.et al., 2004; Demeule Met al., 2004). Взаимосвязь опухолевых клеток с кровеносными сосудами описана в ряде работ (Sumpio В. Е. et al., 2002), однако остается недостаточно выясненной, особенно методом иммуногистохимии и электронной микроскопии.

Морфологическому изучению нарушения компонентов гематоэнцефалического барьера при опухолях головного мозга посвящено большое число исследований (Bertossi M. et al., 1997; Demeule M. et al., 2004). Однако остается множество нераскрытых вопросов, и самый главный из них: каковы структурные причины нарушения гематоэнцефалического барьера.

Целью работы является изучение ультраструктурных и иммуногистохимических особенностей клеток пролиферирующих сосудов микроциркуляторного русла и периваскулярной области в анапластических астроцитарных опухолях головного мозга человека, а также исследование экспрессии белков промежуточных филаментов и других антигенных свойств опухолевой ткани астроцитом разной степени дифференцировки.

Задачи исследования.

1. Электронно-микроскопически и иммуногистохимически исследовать структурные проявления нарушения компонентов гематоэнцефалического барьера при астроцитарных анапластических опухолях головного мозга человека.

2. Исследовать изменения в ультраструктуре эндотелиоцитов, перицитов и астроцитов (в области контактов отростков астроцитов с базальной мембраной эндотелия).

3. Электронно-микроскопически и иммуногистохимически изучить перифокальную зону при анапластических астроцитарных опухолях головного мозга на нейрохирургическом материале.

4. Изучить экспрессию ряда иммуногистохимических маркеров (ГФКБ, виментин, белок 8-100, нейрофиламенты, коллаген IV типа, пролиферационный маркер Кл-67, онкопротеин р53) в анапластических астроцитарных опухолях головного мозга и в периопухолевой зоне.

5. Провести анализ экспрессии >Ю-синтазы (три изоформы) в опухолях головного мозга астроцитарного ряда.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное морфологическое исследование анапластических астроцитарных опухолей головного мозга на разных уровнях структурной организации. Установлено что, интерстициальный отек и набухание отростков и тел астроцитов наиболее выражены в тех периваскулярных пространствах, где наблюдается значительное утолщение базальной мембраны со снижением ее электронной плотности. Это является причиной нарушения гематоэнцефалического барьера.

Электронно-микроскопически и иммуногистохимически впервые выявлено что, пролиферирующие кровеносные капилляры отличаются суженным просветом и усиленным развитием внеклеточного периваскулярного компонента (резкое утолщение эндотелиальной базальной мембраны и большое число волокон коллагена), таким образом, периваскулярный компонент уплотняется и, это является компенсаторным механизмом для предупреждения дальнейшего нарушения гематоэнцефалического барьера.

Изучение и сопоставление операционного и аутопсийного материала показало что, в сосудистых клубках пролиферирующий эндотелий является виментиниммунопозитивным и N0 синтаза (три изоформы) — иммунонегативным, что говорит о мезенхимальном происхождении пролиферирующего эндотелия и о не способности пролиферирующего эндотелия продуцировать N0.

Впервые выявлены морфологические особенности периваскулярных гигантских клеток глиобластом, иммуногистохимически установлено, что часть из них являются ГФКБ-иммунонегативными и электронно-микроскопически не содержат промежуточные филаменты в цитоплазме перикариона.

На основе последовательного анализа выявлено что, многие опухолевые астроциты в астроцитарных опухолях являются N0 синтаза (три изоформы) -иммунопозитивными. При этом в высокоанапластических астроцитомах положительная реакция наблюдалась гораздо чаще, чем в низкоанапластических. Максимальная степень иммунореактивности выявлена для индуцибельной формы N0 синтазы.

На фоне выраженной неоднородности морфологической картины впервые установлено что, в анапластических опухолях встречается большое число гигантских атипических клеток, которые теряют способность экспрессировать ГФКБ, характерный маркер для данного типа клеток. Напротив реакция на виментин практически всегда была положительной. Данная закономерность указывает на то, что данные клетки идут по пути дедифференцировки, так как виментин появляется на более ранних сроках созревания клеток.

Установлено, что в периопухолевой зоне анапластических астроцитом и глиобластом гиперплазия астроцитарной глии более выражена по сравнению с доброкачественными астроцитомами и многие ГКФБ-иммунопозитивные реактивные астроциты не экспрессируют виментин. Это свидетельствует о том, что реактивные астроциты зрелые клетки.

Научно-практическое значение работы. Результаты исследований значительно расширяют представления о межклеточных взаимосвязях в ткани опухолей головного мозга и периопухолевой зоне. Изучены структурные основы нарушения гематоэнцефалического барьера и функционально неполноценного ангиогенеза. Полученные данные позволяют дифференцированно подходить к выбору иммуногистохимических маркеров в диагностике астроцитарных опухолей головного мозга человека. Эти данные используются патоморфологами при диагностике и дифференциальной диагностике опухолей головного мозга. Материал может быть использован в учебных курсах гистологии, патологической анатомии и нейрохирургии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Особенности ультраструктурной организации и иммуногистохимической характеристики пролиферирующих кровеносных сосудов и неопластических астроцитов в опухолевой ткани и периопухолевой зоне.

2. Структурные основы нарушения гематоэнцефалического барьера при анапластических астроцитарных опухолях головного мозга человека.

3. Экспрессия белков цитоскелета и других иммуногистохимических маркеров в анапластических астроцитарных опухолях головного мозга человека.

4. Закономерности экспрессии 3-х изоформ NO-синтазы в астроцитарных опухолях головного мозга человека.

Апробация работы. Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции «Гистохимический анализ изменчивости и регенерации тканей» (г. С.-Петербург, 1997); конференциях молодых ученых Мордовского госуниверситета им. Н. П. Огарева (Саранск, 1997, 1998); Международном симпозиуме «Структура и функции вегетативной нервной системы» (г. Воронеж, 1998); Областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Пенза, 2000); Областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической медицины» (Пенза, 2004).

Внедрение в практику. Полученные результаты исследования позволяют дифференцированно подходить к выбору иммуногистохимических маркеров в диагностике анапластических астроцитарных опухолей головного мозга в практике патологоанатомов, онкологов. Эти данные используются при чтении лекций и на практических занятиях по гистологии и патологической анатомии в Казанском государственном медицинском университете, Саратовском государственном медицинском университете, Пензенском медицинском институте.

По материалам диссертации опубликовано 23 научные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 217 страницах машинописи, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы, 87 рисунков. Список литературы включает 430 наименований, из которых 44 отечественных и 386 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. Электронно-микроскопически в пролиферирующих сосудах опухолевой ткани глиобластом и анапластических астроцитом выявлено отсутствие нарушений межэндотелиальных соединений (показано^ что области простых и специализированных контактов между соседними клетками имеют не измененную ультраструктуру, сохраняется? большое число плотных контактов между эндотелиальными клетками):

2. Доказано нарушение трансэндотелиального транспорта: в пролиферирующих кровеносных микрососудах проявляющееся в отсутствии микропиноцитозных пузырьков в цитоплазме эндотелиальных клеток.

3. Установлено, что межклеточный отек и набухание отростков и тел астроцитов наиболее выражены в тех периваскулярных пространствах, где наблюдается значительное утолщение базальной мембраны со снижением ее электронной; плотности, что свидетельствует о нарушении клеток ее производящих и является ведущей причиной нарушения гематоэнцефалического барьера.

4. Иммуногистохимически выявлено, что с увеличением степени злокачественности в анапластических астроцитарных опухолях головного мозга количество - клеток экспрессирующих ГКФБ и виментин возрастает, причем количество ГФКБ-позитивных клеток меньше, чем количество виментин-позитивных клеток.

5. Установлена неравномерная реакция клеток на виментин в пролиферирующих клетках стенки кровеносных сосудов в астроцитарных опухолях (доброкачественных астроцитомах, анапластических астроцитомах и глиобластомах), что может свидетельствовать о разной гистогенетической их природе или неодинаковой степени дифференцировки.

6. В периваскулярном пространстве пролиферирующих кровеносных сосудов глиобластом и анапластических астроцитом выявлено наличие гигантских клеток, которые иммуногистохимически не давали положительной реакции на ГКФБ, а на ультраструктурном уровне в них отсутствовали глиофиламенты, что свидетельствует о том, что данные клетки не астроцитарного происхождения.

7. Установлено, что опухолевые астроциты во всех астроцитарных новообразованиях являются иммунопозитивными на три изоформы (нейрональную, индуцибельную и эндотелиальную) N0 синтазы с максимальной реакцией (увеличение количества иммунопозитивных клеток и степени окраски) на индуцибельную форму фермента. Выявлено, что в высокоанапластических астроцитомах и глиобластомах число иммунопозитивных клеток и степень окраски были значительно выше, чем в доброкачественных астроцитомах.

8. Выявлено, что N0 синтаза - иммунореактивные клетки на все три изоформы преимущественно локализуются около пролиферирующих кровеносных сосудов и участков некроза и многие митотически делящиеся клетки являются N0 синтаза — иммунопозитивными, что свидетельствует в прямом их участии гиперпродукции N0 в васкуляризации опухолей мозга. В нормальной периопухолевой ткани положительная реакция была только на ¡N08 и еЖ)8, а на п>Ю8 не давало положительной реакции.

9. Установлено, что в периопухолевой зоне анапластических астроцитарных опухолей (анапластические астроцитомы и глиобластомы) ГКФБ-иммунопозитивные реактивные астроциты не экспрессируют виментин, а также интенсивность реакции была значительно выше в высокоанапластичных опухолях (+++), чем в доброкачественных астроцитомах (+).

10.' Выявлено, что в доброкачественных астроцитомах степень иммунореактивности на антитело Кл-67 выше, чем в анапластических астроцитомах и глиобластомах, что может свидетельствовать о низкой митотической активности в низкоанапластических опухолях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследований значительно расширяют представления о межклеточных взаимосвязях в ткани опухолей головного мозга и периопухолевой зоне межклеточных основах нарушения гематоэнцефалического барьера и функционально неполноценного ангиогенеза. Полученные данные позволяют дифференцированно подходить к выбору иммуногистохимических маркеров в диагностике конкретно взятой опухоли. Эти данные могут быть использованы патоморфологами при диагностике и дифференциальной диагностике опухолей головного мозга, а также материал может быть использован в учебных курсах гистологии, патологии и невропатологии.