Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Гладкие миоциты миометрия в периоды его ускоренного роста в пренатальном онтогенезе, при беременности и миоме матки

На правах рукописи УДК: 618.141-006.36-06:618.214] - 007.61

БЕЗНУСЕНКО Галина Владимировна

ГЛАДКИЕ МИОЦИТЫ МИОМЕТРИЯ В ПЕРИОДЫ ЕГО УСКОРЕННОГО РОСТА В ПРЕНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ, ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ И МИОМЕ МАТКИ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология 14.00.01 - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

£

^ «Г

«Ч/

Работа выполнена в Ивановской государственной медицинской академии.

Научные руководители:

член-корреспондент АМТН, доктор медицинских наук, профессор А.А. Миронов;

доктор медицинских наук, профессор Г.И. Брехман.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.В. Банин, доктор медицинских наук, профессор М.В. Федорова

Ведущая организация:

Российский университет дружбы народов.

Защита состоится "..."................ 1997 года на заседании диссертационного совета Д 084.14.04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ. Автореферат разослан "..."..........1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор А.Н. ТИХОМИРОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Гладкие миоциты миометрия являются уникальными клетками, претерпевающими в процессе жизни женщины значительные структурные и функциональные изменения в зависимости от стимулов гормональной и негормональной природы. Наиболее значимыми для ГМК являются процессы - гиперплазия миометрия матки плода в антенатальном периоде и гипертрофии при беременности.

Для изучения локализации зон пролиферации в миометрии кажется логичным использование ситуаций, характеризующихся усиленной пролиферацией гладких миоцитов, например, в матке плода. Предполагают, что развитие мышечной оболочки стенки матки в эмбриогенезе происходит путем индукции дифференци-ровки окружающей мезенхимы в мышечную ткань процессом образования вторичных капилляров, что и объясняет ускоренный рост фетальной матки именно в период с 4-го по 5-й месяц внутриутробной жизни (Д.Л. Марфунин, 1988). Тесная связь процесса органогенеза матки с сосудами позволяет предполагать, что именно клетки сосудистого происхождения принимают в этом активное участие.

Строение ГМК при беременности представляет интерес для изучения состояния гладких миоцитов миометрия при обратимом процессе гипертрофии миометрия.

Исследование процессов гиперплазии и гипертрофии гладких миоцитов в периоды его ускоренного роста в онтогенезе может иметь значение для понимания основных клеточных механизмов развития миоматозного узла путем сопоставления его характеристик с естественными процессами роста, гипертрофии и инволюции миометрия с целью повышения эффективности диагностики, обоснования профилактических и лечебных мероприятий у больных миомой матки.

В настоящее время считается доказанным, что миома матки -не опухоль, а "доброкачественная гиперплазия" (Е.М. Вихляева, Л.Н. Василевская, 1981 и др.) и гипертрофия гладких мышечных клеток миометрия, выражающаяся в существенных изменениях ультраструктуры цитоплазмы и ядра (В.Г. Скопичев, В.И.Скопичева с соавт., 1989). Гипертрофия является одним из основных процессов, влияющих на скорость увеличения массы миоматозного узла (Г.А. Савицкий, 1994).

Миома матки - одно из наиболее частых заболеваний женской половой сферы, встречающееся у 10-27% гинекологических

больных (Е.М. Вихляева, Г.А.Паллади,1982; И.С, Сидорова, 1985). При лечении больных миомой матки используют консервативное воздействие, хирургическое лечение или сочетание обоих методов. Среди показаний к плановым операциям миома матки находится на первом месте, но этот метод лечения имеет существенные издержки. Поэтому возрастает актуальность дальнейшего поиска профилактических мер и патогенетических методов лечения, что в свою очередь требует дальнейшей разработки вопроса морфогенеза миомы матки. Однако рост миоматозной матки не всегда связан с "истинным ростом" узла, сопровождающимся гиперплазией и гипертрофией гладких мышечных клеток миометрия.

При морфологических исследованиях в ткани узла и миоматозной матки в целом нередко обнаруживается отек (Г.И. Брех-ман, 1986; A.C. Лесакова, 1971), обусловливающий "ложный" рост, который исследователи объясняют и нарушениями водно-электролитного баланса и микроциркуляции в ткани узла. В связи с этим изучение тканевого электролитного баланса позволяет лучше понять природу увеличения объема миоматозной матки при низкой пролиферативной активности. Этим объясняется наш интерес к особенностям тканевого водно-электролитного баланса миоматозной матки наряду с изучением ее морфологической картины.

ЦЕЛЬ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ:

- выявить общие клеточные механизмы гиперплазии и гипертрофии гладких мышечных клеток миометрия в периоды его ускоренного роста.

ЗАДАЧИ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выявить локализацию и клеточный состав зон пролиферации в периоды ускоренного роста миометрия в онтогенезе.

2. Изучить гистоархитектонику миометрия, внутриклеточный фенотип и форму миоцитов в миометрии, особенности этих показателей в условиях естественной гипертрофии при беременности и гиперплазии при фетальном развитии.

3. Расшифровать основные клеточные механизмы развития миоматозного узла на основании сопоставления его характеристик с естественными процессами роста, гипертрофии и инволюции миометрия.

4. Сопоставить показатели, характеризующие состояние общего тканевого и клеточного водно - электролитного баланса в миоматозной матке, с особенностями клеточного состава.

НАУЧНАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Впервые проведен комплексный морфологический анализ состояния гладкомышечных клеток (ГМК) миометрия при различных процессах, сопровождающихся увеличением объема мышечного компонента матки человека. Объективно уточнены данные о связи состояния артериолярного звена микроциркуляторного русла (прежде всего эндотелиального слоя) с изменениями фенотипа ГМК и синтеза межклеточного вещества в миоматозных узлах и феталь-ной матке.

Установлено, что перициты микроцирку ляторного русла миометрия являются источником роста соединительнотканного и мышечного компонентов тканевой системы фетальной матки и поверхностного слоя миоматозного узла. Эти данные были получены иммуногистохимическими методами, что позволило качественно и количественно представить клеточный состав зон пролиферации в миометрии.

Получены данные об общих морфологических проявлениях инволюции тканевой системы миометрия в послеродовом периоде.

Представлена и описана картина пространственной организации клеточной системы миометрия в периоды его ускоренного роста с помощью метода сканирующей электронной микроскопии химически диссоциированных препаратов (СЭМ ХДП).

Показана возможность оценки состояния водно-элекгро-литного баланса в миоматозной матке по показателям содержания электролитов в эритроцитах, плазме крови и моче. Обоснована необходимость коррекции водно-электролитного баланса у больных миомой матки.

Для проведения дифференциальной диагностики характера роста миоматозного узла ("ложный" или "истинный") была разработана методика, включающая в себя:

- определение концентрации ионов калия мочи, отражаюн щих отек узла, как наиболее частую причину "ложного" роста узла;

- проведение биопсий при лапаро- и гистероскопии с целью оценки выраженности васкуляризации и процессов неоваскулогене-за в поверхностных слоях узла, характеризующих "истинный" рост.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Периваскулярные зоны фетального миометрия и поверхностных слоев миоматозного узла являются зонами роста.

2. Механизм нарастания массы миометрия при беременности -резко выраженная клеточная гипертрофия, сочетающаяся только в первом триместре с пролиферативной активностью миоцитов.

3. Отек миоматозной матки как наиболее частое проявление ложного роста есть результат микроциркуляторных расстройств и изменений водно-электролитного баланса.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения доложены и обсуждены на Международных студенческих научных конференциях (Одесса, 1991; 1992); Всесоюзной научной студенческой конференции (Петрозаводск, 1990); конференциях молодых ученых ИГМИ им. A.C. Бубнова (Иваново, 1991,1992), на межкафедральной конференции 24 октября 1996 годавИГМА.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на страницах машинописи, со-

держит таблиц и рисунков. Она включает введение, обзор литературы, 4 раздела собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, указатель литературы. Список использованной литературы включает источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Миометрий плода в сроке гестации 12-14 недель был взят на исследование при выполнении по показаниям оперативного лечения у 5 больных миомой матки, имевших сочетание миомы матки с беременностью. Были исследованы 9 маток неродившихся детей женского пола при сроках 20-26 недель гестационного возраста ( из них 5 - после прерывании беременности путем малого кесарева сечения, 4 - методом амниоцентеза). Изучались также микрофрагменты ткани миометрия (размерами не более 0,3-0,5 см) из области разреза в нижнем сегменте при прерывании беременности путем малого кесарева сечения по медицинским (заболевания сердца, почек, психические заболевания) и социальным показаниям у 10 женщин при 4 сроках беременности 22-26 недель.

Проведен морфологический анализ 5 маток, удаленных по показаниям (ДВС-синдром, гнойно-септические осложнения раннего послеродового периода и др.), у женщин, находившихся в послеродовом периоде (6-12 сутки).

Всего было исследовано 47 больных миомой матки. По возрасту они распределялись следующим образом: до 30 лет было 4 (8,9%) больных, от 30 до 39 - 10 (21,3%), от 40 до 49 - 26 (55,3 %), от 50 до 52-7 (14,5%). Субсерозно-инстерстициальная миома диагностирована у 23 (48.9%), субмукозная - у 6 (12,8%), интерсти-циальная - у 11 (23,4%), множественные - у 10 (21,2%) больных.

Выбор методов морфологического исследования определялся поставленными задачами. Ткань фиксировали следующими способами: 1) 4% р-ра формальдегида; 2) 2,5% р-ра пнотаральде-гида; 3) метакарном (метанол:хлороформ: ледяная уксусная кислота - 6:3:1). Время и условия фиксации определялись особенностью применяемого метода. Образцы ткани фиксировались с помощью метода иммерсионной фиксации,

СВЕТООПТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ включал изучение полутонких срезов и суспензий клеток, полученных с помощью метода спиртово-шелочной диссоциации.

Для приготовления ПОЛУТОНКИХ СРЕЗОВ кусочки ткани размером 2x2 мм постфиксировали в 1% четырехокиси осмия в течение 1 часа, обрабатывали 1% раствором таниновой кислоты (Ро1узаепсез, США) в течение 40 мин. После отмывки в дистиллированной воде образцы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и абсолютном ацетоне и заливали в аралдит (Пика, Швейцария). После полимеризации на ультратоме ЬКВ-Ш (Швеция) готовили полутонкие срезы (1,5-2 мкм), которые окрашивали мети-леновым синим и просматривали в микроскопе МБИ-15 (ЛОМО, Россия).

Для изучения формы, размеров клеток, применялся метод СПИРТОВО-ЩЕЛОЧНОЙ ДИССОЦИАЦИИ (ОгекЬоу е! а1., 1984). Фиксированные кусочки ткани механически (с помощью пинцета) разделяли на более мелкие мышечные пучки; инкубировали в 1мл смеси 30% КОН и 96% этанола (1:1) при температуре +37° С. Через 20-40 мин, когда кусочки полностью диспергировались, суспензия клеток исследовалась в фазово-контрастном микроскопе.

Для оценки ультраструктуры клеток применяли метод ТРАНСМИССИОННОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ (ТЭМ) ультратенких срезов. Блоки, с которых предварительно готовили но-лутонкие срезы (как описано выше), прицельно затачивали и ульт-ратомировали на ультратоме ЬКВ - III. Ультратонкие срезы контра- -

стировали уранилацетатом и цитратом свинца (Уикли, 1975) и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе ЭМВ-100 АК (НПО "Электрон", Суммы, Украина).

Для исследования рельефа эндотелиальной поверхности использовался метод СКАНИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ НАТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ (СЭМ). Препараты для СЭМ готовили по общепринятой методике (Волкова О.В. и др., 1987). Для объективного изучения трехмерной организации ткани миоматозных узлов и миометрия необходимо было обнажить поверхность клеток, замаскированную внеклеточным матриксом, что позволил разработанный в нашей лаборатории (Рехтер М.Д. и др., 1991) новый способ визуализации скрытых поверхностей клеток -метод СКАНИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ ХИМИЧЕСКИ ДИССОЦИИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ (СЭМ ХДП). Благодаря наличию простого информационного параметра он дает возможность индивидуализировать время химической диссоциации, что явилось определяющим преимуществом в выборе и применении этого метода при изучении миоматозных узлов с различной степенью фиброзирования стромы. Постфиксацию и обезвоживание проводили путем перехода через критичеЬкую точку из жидкой углекислоты в установке (HCP/Hitachi, Япония). Анализ объектов проводили в микроскопе S- 570 (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 20 кВ.

Для ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ фиксированные в метакарне образцы ткани обезвоживали в метаноле возрастающей концентрации, хлороформе и заливали в пара-пласт. Срезы депарафинировали в толуоле и регидратировали в метаноле нисходящей концентрации и воде. После регидратации срезы промывали в трех сменах 0.1 М фосфатного буфера. На приготовленных срезах с помощью моноклональных антител фирм "Boehringer Mannheim" (Германия) и "Dakopatts" (Дания) выявляли следующие антигены: гладкомышечный альфа-актин, виментин, проколлаген, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), 2А7 - антиген пролиферирующих перицитов. Выявление связавшихся антител проводили с помощью иммуноферментного анализа с использованием стрептавидин-биотиновых конъюгатов с перокси-дазой хрена или щелочной фосфатазой. Полученные препараты изучали в микроскопе "Opton-3" ("Karl Zeiss", Германия).

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ. На элекгронограммы накладывалась морфометрическая решетка. Для каждой клетки подсчитывалось число узлов решетки, приходя-6 щихся на цитоплазму (No), пучки микрофиламентов (Nf). Объемная

плотность микрофиламентов (Vp) в цитоплазме миоцитов оценивалась по формуле:

vF = (nf/nc ) 100%.

Морфологическому анализу подвергалось не менее 200 ГМК при исследовании кусочков ткани разных зон миоматозного узла, макроскопически неизмененного миометрия, маток плодов.

С помощью прибора "Интеграл" вычислялись: площадь клетки, площадь ядра, периметр клетки, периметр ядра, отношение площадей, отношение периметров, коэффициент формы ядра и коэффициент формы клетки.

На срезах, окрашенных антителами Anti-A-SMA и метиле-новым зеленым подсчитывалось число ГМК (коричневое окрашивание цитоплазмы), с помощью антител к антигену пролиферирую-щих клеток и пероксидазного коньюгата (черное окрашивание ядер) подсчитывалось количество пролиферирующих клеток, общее количество клеток (зеленое окрашивание ядер).

При стандартном увеличении в каждом случае исследовались 10 полей зрения, содержащих не менее 200 клеток. Для каждого вида клеточных элементов подсчитывалась доля (Ст ) в клеточной популяции по формуле:

Cm=(Nra/Nt) 100%,

где Nm - количество клеток данного вида, a Nm - общее количество клеток.

МЕТОД КОМПЛЕКСНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДНО-ЭЛЕКТРОЛИТНОГО БАЛАНСА. Концентрация ионов калия и натрия исследовали с помощью пламенного фотометра, ионов хлора меркуриметрическим методом с применением индикатора дифенил-карбазона. Содержание внеклеточной жидкости определяли по Robinsson (1950), тканевой жидкости, тканевых и внеклеточных ионов калия, натрия и хлора - методом Whittembury (1965). Исследования проведены в миометрии и в миоматозном узле, полученные данные сопоставлены с показателями концентрации ионов в эритроцитах, моче и крови.

Для всех исследуемых образцов определялись средние значения исследуемых признаков. По каждому признаку проводилось сравнение средних значений с использованием парного t-критерия Стьюдента. Статистическая обработка полученных данных производилась с использованием программы "Sigma Plotter".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гипертрофия и гиперплазия ГМК миометрия изучались при физиологически протекающих процессах: в пренатальном онтогенезе - миометрий матки плода, при беременности и в процессе послеродовой инволюции матки. Тканевая система гладких миоцитов миоматозного узла была использована как условная модель пролиферации и гиперплазии при состоянии, отличающемся от физиологической нормы.

НЕИЗМЕНЕННЫЙ МИОМЕТРИЙ представляет собой сложноорганизованную в пространстве гомогенную клеточную систему, главным элементом которой являются ГМК. При этом мы обнаружили, что основной популяцией ГМК в макроскопически неизмененном миомегрии являются веретеновидные и У-образные мио-циты сократительного фенотипа, экспрессирующие гладкомы-шечный А-актин, дающие слабоположительную реакцию на вимен-тин. Пролиферативная активность гладких миоцитов в интактном миометрии практически отсутствует.

МИОМЕТРИЙ ПЛОДА. В доступной нам литературе имеются единичные работы, посвященные изучению ультраструктуры клеток миометрия фетальной матки животных (/.К. Вгоёу, в-И. СипЬа, 1989). Сведений об изучении клеточного состава зон развития матки человека в онтогенезе не найдено.

Светооптический анализ показал, что паренхима матки плода на 12-14 неделях гестации представлена отдельными клетками, редко расположенными в аморфном межуточном веществе. Хотя четко ограниченных слоев будущего миометрия на этой стадии развития не наблюдалось, условно было выделено 3 слоя клеток, различавшихся своей ориентацией. Преимущественно циркулярная ориентация отмечалась в среднем слое; клетки наружного и внутреннего слоя располагаются радиально. Отмечался выраженный полиморфизм клеточной популяции - от клеток округлой формы, практически без отростков, до звездчатых с большим округлым ядром. Наибольший размер клеток не превышал 10-12 мкм, а ядерно-цитоплазматический индекс был высоким (около 0,5).

Как показала СЭМ ХДП, клетки располагались под разными углами друг к другу, иногда контактируя длинными отростками. Упаковка клеток среднего слоя была более плотной, чем внутреннего и наружного.

Результаты иммуногистохимического исследования свидетельствуют -о том, что пролиферативная активность клеток внут-

реннего слоя несколько выше, чем клеток других слоев. В общем клетки, экспрессирующие ядерный антиген пролиферирующих клеток (РСИА), распределяются равномерно в ткани фетапьного миометрия и не образуют отчетливых групп. В наружном слое матки наблюдались новообразованные сосуды, стенка которых была представлена эпителиоцитоподобными клетками, также активно экспрессирующими РСЫА.

Типичных гладкомышечных клеток на этой стадии развития идентифицировано не было, т.к. все клетки показывали отрицательную или иногда слабо положительную реакцию на БМ-актин. Клетки характеризовались также равномерным окрашиванием при выявлении виментина, что согласно мнению ,1.11.Вгос1у, 0.11. СипЬа (1989), свидетельствует о низкодифференцированности.

Совокупность вышеотмеченных признаков свидетельствует о том, что клетки матки плода 12-14 недель гестации можно охарактеризовать как мало- и недифференцированные мезенхимальные клетки.

На 20-22 и 24-26 неделях гестации отмечается только 2 слоя миометрия: наружный слой, лежащий под формирующимся мезо-телием, и внутренний, примыкающий к эндометрию.

В наружном слое выделялись две зоны: субсерозная (поверхностная), занимающая в среднем 5-10 % от всей толщины миометрия, и сосудистая, расположенная между поверхностной зоной наружного слоя и внутренним слоем. Сосудистая зона представляет собой зачаток будущего среднего (сосудистого ) слоя и занимала 40-50 % от толщины фетального миометрия.

Клеточный состав поверхностной зоны наружного слоя был представлен в основном (86,61%) удлиненными клетками, имеющими овальное ядро с хроматином, конденсированным около ка-риолеммы. Максимальный размер их составлял 15-20 мкм, а ядерно-цитоллазматический индекс 0, 278 ± 0,013. Цитоплазмати-ческие органеллы развиты незначительно, в цитоплазме имеются филаменты. На границе поверхностной и сосудистой зон встречались клетки второго типа, более удлиненные, с максимальным размером 20-40 мкм. Ядра их были овальными, хроматин диспергирован в нуклеарном матриксе. Ядерно-цитоплазматический индекс редуцирован до 0,142±0,060 (р< 0,05) по сравнению с этим же показателем у клеток первого типа. Филаменты в диаметре около 6-7 нм составляли более значительную долю общего объема цитоплазмы, чем у клеток первого типа.

Результаты иммуногистохимического исседования показали, что в поверхностной зоне наружного слоя наблюдаются как

PCNA- позитивные, так и РСМД-негативные клетки. Распределение их было равномерным, а количество РСЫА-положительных клеток составляло 12, 4% от общего числа клеток. При двойном окрашивании на РСЫА и Б М- актин: РСИА-положительные клетки были слабо положительны либо негативны на БМ-актин.

Таким образом, можно полагать, что в поверхностной зоне миометрия существует две субпопуляции клеток, различающиеся по степени дифференцированное™. Менее дифференцированные клетки эксперессируют антиген пролиферации (РСЫА) и, возможно, не имеют развитого сократительного аппарата. В субпопуляции более дифференцированных клеток хорошо выявляется БМ-акгин.

Клеточный состав сосудистой зоны наружного слоя миометрия наряду с вышеописанными типами клеток включал клетки от-ростчатой формы (У-образные и звездчатые).

По ультраструкгурным характеристикам (развитый синтетический аппарат, сравнительно слабо развитая система филаментов) данный тип клеток занимал промежуточное положение между фиб-робластами и гладкомышечными клетками, что позволило отнести их к синтетическому фенотипу ГМК. По данным иммуногистохи-мии РСИА - положительные клетки располагались преимуществено в стенке сосудов и периваскулярных зонах фетального миометрия. Эндотелий сосудов этого слоя и клетки, которые по месту расположения соответствовали перицитам, окрашивались особенно интенсивно. Интенсивность окраски в стенках артерирлярных и капиллярных сосудов была выше (+++), чем в венулах (++). Обращал на себя внимание тот факт, что площадь ядер РСИА- положительных клеток была в 2-3 раза больше по сравнению с РСМА-отрицательными клетками. В сосудистой зоне поверхностного слоя фетального миометрия этого срока гестации существует множество нефункционирующих, не имеющих просвета сосудов, стенка которых представлена одним слоем РСКА-положительных (+++) клеток, дающих также положительную реакцию на виментин (++). Очевидно, данные сосуды являются новообразованными. Вокруг таких сосудов наблюдались двуядерные клетки. Оба их ядра также были РСМА-положительными. В окружении венул двуядерные клетки не были выявлены.

Интенсивность экспрессии клеткамй РСИА- антигена не зависела от диаметра артерий, но была связана с их локализацией. Артерии и капилляры, расположенные ближе к поверхностной зоне, имели в своем составе большее количество РСИА- положительных клеток, чем артерии, примыкающие к внутреннему слою. Клетки Ю мышечных пучков сосудистой зоны давали положительную реак-

цию на БМ-актин и отрицательную на виментин, среди них встречались единичные РСЫА-положительные клетки. Клеточные элементы соединительнотканных прослоек, не относящиеся к сосудам и их ближайшему окружению, давали отрицательную реакцию на оба эти антигена.

Клетки внутреннего слоя миометрия фетальной матки .2026 недель гестации по своим характеристикам были сходны с клетками поверхностной зоны наружного слоя. Как отличительную особенность их можно было отметить лишь меньшую фракцию сократительных филаментов. Они зкспрессировали РСИА-антиген чаще, чем клетки субсерозной зоны, но все же не так интенсивно, как клетки сосудистой.

Сопоставление структурных и цитохимических характеристик клеток сосудистой зоны миометрия и сравнение их с клетками другой локализации позволяют обсуждать субпопуляцию клеток сосудистой зоны в качестве основного пролиферативного пула миометрия. Расположение этих клеток на границе между наружным и внутреним слоями может свидетельствовать о том, что они являются источником миометрия. Важно подчеркнуть также, что максимальной пролиферативной активностью отличаются клетки, расположенные непосредственно около сосудов или в их стенках. Наши результаты дают основание полагать, что интенсивно пролиферирующие перициты новообразованных сосудов являются своеобразным "камбием" для популяций соединительнотканных и гладких мышечных клеток миометрия.

Полученные нами результаты подтверждают правильность предположений Г.А. Савицкого с соавт. (1976) о тесной связи процесса органогенеза матки с сосудами и позволяют конкретизировать тип клеток, принимающих в этом активное участие.

МИОМЕТРИЙ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ. Изучение строения ГМК при беременности было нами предпринято для изучения процесса гипертрофии миометрия. Известно, что во время беременности увеличение массы матки происходит в основном за счет гипертрофии, а не гиперплазии ГМК. В связи с этим представля лось важным сравнить характеристики ГМК этих двух различных морфогенетических процессов.

В ходе беременности только начальный этап характеризуется интенсификацией пролиферативной активности. В сроках 12-14 недельной беременности наряду с гипертрофией ранее существовавших клеток выражены процессы гиперплазии из относительно малодифференцированных клеток, расположенных в соединительной ткани между мышечными пучками в периваскулярных зонах.

Именно в этих периваскулярных зонах располагалась основная масса клеток, экспрессирующих антиген пролиферируюших перицитов (2А7).

' По данным СЭМ ХДП большинство клеток миометрия контактировали "конец а конец" и "бок в бок" как непосредственно, так и с помощью цитоплазматических "мостиков". Иногда наблюдалось нахлестывание отростков клеток на соседние ГМК. Не обнаруживалось отдельных ГМК, все они были расположены группами. Поверхность миоцита гофрирована в перинуклеарной зоне.

Гладкие миоциты миометрия при беременности гетеро-морфны: звездчатые, Y-образные, веретеновидные. Встречаются миоциты, по внешнему виду напоминающие фибробласты или ма-лодифференцированные мезенхимальные клетки или крупные перициты. Звездчатые клетки крупнее, чем типичные фибробласты и приближаются по своему внешнему виду к ГМК; встречаются они около многочисленных сосудов микроциркуляторного русла, в зонах, клетки которых обнаруживали положительную реакцию на ядерный антиген пролиферируюших клеток. Большая часть гладких мышечных клеток миометрия этого срока беременности положительно окрашивались при реакции, выявляющей SM-актин. Реакция на виментин была отрицательной или слабо положительной.

По ультраструкгурным признакам клетки миометрия при беременности в сроках 20-26 недель можно идентифицировать как ГМК синтетического и промежуточного фенотипов (по классификации Campbell, Campbell, (1985)). Типичные гладкие миоциты миометрия при этом сроке беременности не экспрессировали PCNA. Это были крупные клетки, в которых в равной мере были хорошо представлены как компоненты синтетического аппарата (развитый эндоплазматический реггикулум, полисомы), так и пучки сократительных (акгиновых) филаментов.

Таким образом, можно заключить, что к началу второго триместра беремености в увеличении массы миометрия принимают участие два механизма - пролиферация клеток и гипертрофия ранее существовавших. Относительный вклад каждого из этих механизмов оценить сложно, поскольку дочерние клетки также могут подвергаться гипертрофии. В более поздние сроки беременности пролиферативный потенциал миометрия становится незначительным, и мышечная масса увеличивается почти исключительно за счет гипертрофии.

В ПОСЛЕРОДОВОМ ПЕРИОДЕ был исследован миометрий маток, удаленных при ДВС-синдроме, поэтому "чистота" на-12 блюдаемых изменений может вызывать сомнения. Несмотря на это,

основные особенности строения миоцитов в послеродовом периоде охарактеризовать можно. Несколько рядом лежащих ГМК объединяются в комплексы, пучки, внутри которых они располагаются параллельными рядами. Сами же комплексы ориентированы под различными углами друг к другу. Наблюдается разобщение миоцитов, нарушение их контактных взаимодействий: отдельные гладкие мышечные клетки располагались в рыхлом соединительнотканном матриксе. Фенотип ГМК варьирует в широких пределах от синтетического до сократительного, причем процент гладкомышечных клеток сократительного типа больше, по сравнению с миометрием беременной матки.

Наличие макрофагов, лимфоцитов, тучных клеток в определенной мере было обусловлено тем патологическим состоянием (ДВС-синдром, гнойно-септические процессы), при котором производился забор материала, поэтому интерпретация увиденного была бы не бесспорна. По мнению F. Hell, J.E. Ericsson (1983), изучавших механизмы послеродовой инволюции матки на крысах,явля-ется аутофагия. Механизм редукции миометрия послеродовой матки у человека на ультраструктурном уровне описан не был. При изучении нами миометрия послеродового периода не удалось выявить значительного увеличения собственного лизосомального аппарата ГМК - морфологической предпосылки усиленной аутофагии. В цитоплазме гладких миоцитов наблюдались зоны повышенной и пониженной электронной плотности, которые можно расценивать как фокальный внутриклеточный некроз или проявления апоптоза.

Предполагают, что увеличение интенсивности апоптоза связано с ростом количества клеток с ультраструкгурными признаками терминальной дифференцировки, которая является одним из индукторов апоптоза (W. Busch, В. Lauer 1984). К концу 1П триместра беременности в клеточной популяции миометрия начинают преобладать гладкие миоциты сократительного фенотипа, т.е. более дифференцированные формы. Учитывая некоторые морфологические признаки (парциальные некрозы в цитоплазме ГМК, маргина-цию нуклеарного хроматина и т.д.), можно предполагать, что апоптоз является одним из механизмов снижения числа гладких миоцитов в миометрии послеродового периода.

Возможно, что биологический смысл нарушения клеточных взаимодействий в данный период связан с индукцией апоптоза и выходом клеток из системы межклеточных связей. При инволюции матки в фибробластах обнаруживаются вакуоли, содержащие фибриллы коллагена. Возможно, что картина отражает захват фибрилл коллагена извне или процесс кринофагии, при котором синтезиро-

ванный, но еще не выделенный путем секреции проколлаген задерживается внутри клетки и подвергается деградации.

Нами был также проведен сравнительный анализ клеточного состава, морфологических характеристик и локализации про-лиферирующих клеточных элементов в МИОМЕ МАТКИ. Поскольку в основе этого патологического образования, очевидно, лежат процессы гипертрофии и гиперплазии гладких миоцитов, его возможно использовать в качестве естественной "модели" для изучения этих процессов.

Наши результаты показывают, что пролиферативная активность миоцитов, которая отмечается преимущественно в поверхностных слоях узла, не достигает уровня, характерного для миометрия плода. Однако здесь появляются ГМК, сходные по ультраструктурным характеристикам и форме с ГМК и мезенхимальными клетками фетальной матки. Эти клетки имеют звездчатую форму, синтетический или промежуточный фенотип, т.е. сочетают в себе черты как ГМК, так и фибробластов, и локализуются в зонах, где идентифицируются клетки, экспрессирующие антигены, свойственные пролиферируюшим перицитам. У нас сложилось мнение, что эти клетки представляют собой промежуточные формы родственных клеток мезенхимапьного происхождения на разных стадиях и направлениях дифференцировки. Вероятно, что при определенных условиях они способны изменять свой фенотип.

В отличие от "интактного" миометрия миоматозный узел характеризуется резким усилением гетерогенности клеточного состава. Достоверно увеличено по сравнению с недрами узла и зоной макроскопически неизмененного миометрия количество отросчатых клеток. Среди миоцитов периферической зоны миоматозного узла преобладают ГМК синтетического фенотипа.

Известно, что основным механизмом "истинного" роста узла служит повышение пролиферативной активности клеток. С помощью иммуногистохимических методов нам удалось показать, какие именно клетки пролиферируют и где. Ими оказались ГМК синтетического и промежуточного фенотипа, фибробласты и перициты, расположенные преимущественно в периваскулярных зонах поверхностных слоев узла. В недрах узла отмечались лишь единичные клетки, экспрессирующие ядерный антиген пролиферирующих клеток. Усиление синтеза внеклеточных компонентов соединительной ткани (коллаген, эластин) приводит к "замуровыванию" ГМК в соединительнотканном матриксе и нарушению контактных взаимодействий между ГМК. Доминирование одних факторов над другими

зависит от типа миомы, места расположения, длительности существования и темпов роста.

Гладкомышечные клетки синтетического фенотипа миома-тозного узла чаше вступают в митотический цикл, чем клетки макроскопически неизмененного миометрия. Хотя в миоматозных узлах митозы редки, достаточно много клеток экспрессирует ядерный антиген пролиферируюших клеток, показывающий, что клетка вступает в S-фазу митотического цикла, который прерывается или растягивается во времени. Результатом такого незавершенного митоза являются многоядерные (2-3- ядерные) клетки и ГМК с крупным ядром (возможно полиплоидным), которые мы наблюдали в суспензии.

Гипертрофия гладких миоцитов в миоме матки значительно менее выражена, чем при беременности. ГМК глубоких слоев узла также имеют признаки апоптоза, сходные с таковыми при послеродовой инволюции. Полученные нами данные при изучении тканевого материала позволяют констатировать, что изменения морфологических характеристик не выходят за рамки трансформации фенотипа клеток, наблюдаемой при физиологических процессах гипертрофии и гиперплазии, наблюдаемых при нормальных физиологических процессах. Исключением является лишь состояние стромы, содержащей преимущественно грубые волокна коллагена.

Известно, что размеры миоматозной матки во многом обусловлены нарушениями водно-электролитного баланса в тканях миометрия и узлов, с чем связывают "ложный" рост миомы матки. В многочисленных работах (Г.М. Вихляева, Г.А. Паллади, 1982; Г.И. Брехман, A.A. Миронов, 1986 и др.) дается описательная картина отека, однако, в доступной нам литературе количественных данных по исследованию водно- электролитного баланса в тканях и клетках миоматозной матки и сопоставления с морфологическими характеристиками не было найдено.

У больных миомой матки в эритроцитах и моче содержание ионов Na+ достоверно выше, чем у практически здоровых женщин. Эти данные соответствуют результатам исследований Боровской В.Д. (1975).

При этом концентрация ионов натрия в эритроцитах больных миомой матки была выше на 20,7% (р < 0,01), тогда как концентрация ионов калия эритроцитов не имела достоверных различий с контрольной группой женщин. Следовательно, соотношение натрия и калия изменялось в сторону преимущественного накопления натрия в эритроцитах и, вероятно, способствовало задержке воды в

них. Это обеспечивало сферуляцию эритроцитов, описанную В.Д. Боровской (1975) и Е.М. Вихляевой (1982).

Выделение ионов натрия с мочой было на 27,8 % меньше, в то время как ионов калия выводилось в среднем на 20,4% больше, чем у практически здоровых женщин. Следовательно, у больных миомой матки наблюдается относительное увеличение концентрации ионов натрия в эритроцитах и уменьшение их выделения с мочой.

Концентрация 1Ма+ в ткани и клетках миоматозного узла достоверно ниже по сравнению с неизмененным миометрием и поверхностными слоями узла, несмотря на присутствие отека в недрах узла. Этот факт, на наш взгляд, также можно объяснить особенностями микроциркуляции, а именно, наличием нефункционируюших сосудов в недрах узла и бессосудистых зон, что исключает "сосудистую составляющую" в цифровых показателях концентрации ионов электролитов в ткани.

Учитывая высокую частоту сочетания синдрома артериальной гипертензии и миомы матки у наблюдаемых больных и влияние экстрагенитальной патологии на содержание электролитов в эритроцитах, плазме и моче, представлял интерес сравнительный анализ корреляционных связей между этими показателями и состоянием водно-электролитного баланса в миоматозной матке у больных с артериальной гипертензией и без гипертензионного синдрома.

При отсутствии артериальной гипертензии обнаружена положительная корреляционная связь между К+ плазмы и К+ в тканях и клетках миометрия (г = +0,72 и +0,74 ) и отрицательная с клеточной водой в глубоких слоях узла (г = -0,77).

Корреляционные связи плазмы и тканевыми показа-

телями водно-электролитного обмена у данной группы больных были слабыми, за исключением К в клетках глубоких слоев узла (г = -0,54). Выявлена прямая корреляционная связь между концентрацией К+ эритроцитов и Ма+ ткани и клеточной воды (г=+0,62;+0,68).

Концентрация К+ в моче у данной группы больных коррелировала с содержанием тканевой и клеточной воды в миоматозном узле (г = -0,76; -0,67 соответственно), с Иа+ и К+ клеток, с К+ ткани (г= +0,74; +0,73; +0,78 соответственно). Концентрация Иа+ мочи не была показательной.

При сочетании миомы матки с артериальной гипертензией отмечалась прямая корреляция между К+ эритроцитов и тех же

ионов в ткани и клетках глубоких слоев узла (г = +0,73;+0,86 соответственно), обратная связь с содержанием Na+ ткани и клетки узла (г = -0,86; -0,70 соответственно), а также с содержанием СГ ткани миоматозной матки (г = -0,73).

Выявлена связь между концентрацией в моче и содержанием тканевой и клеточной воды (г = +0,72; +0,74 соответственно). У больных с артериальной гипертензией между концентрацией Na+ эритроцитов, Na+ ткани и клеток миоматозной матки и СГ в ткани и клетке миомегрия существует корреляционная связь (г = +0,87; +0,76; и +0,94; +0,90 соответственно).

К+ мочи коррелирует с клеточной и тканевой водой миоматозной матки (г = -0,74; -0,74 соответственно). При отсутствии артериальной гипертензии эта зависимость не была показательной.

Итак, у больных с артериальной гипертензией концентрация Na+ в эритроцитах отражает содержание Na+, К+, СГ в тканях и клетках миоматозной матки. Эти показатели находятся в прямой корреляционной зависимости. А концентрация К+ в моче находится в прямой связи с содержанием клеточной и тканевой воды миома-тозного узла у данной группы больных и в обратной связи при отсутствии артериальной гипертензии.

Таким образом, показана реальная возможность, оценивая показатели водно-электролитного баланса еще на предоперационном этапе, дифференцировать миоматозные узлы с "ложным" типом роста, обусловленным нарушениями микроциркуляции и отеком, от узлов с "истинным" ростом, связанным с пролиферацией и гиперплазией миошггов.

ВЫВОДЫ

1. Ткань миометрия плода к 12-14 неделям внутриутробного развития представлена, в основном мезенхимными (малодифференцированными) клетками, в которых отсутствует актин, специфический для гладких мышечных клеток (ГМК).

Последующее развитие фетального миометрия связано с дифференцировкой клеток в миоцнты синтетического и сократительного фенотипов. Морфология этих клеток, некоторое иммуно-гистохимические характеристики (экспрессия специфического антигена) и периваскулярная локализация зон пролиферации позволяют предполагать существование общей клетки-предшественника гладких миоцитов и перицитов.

2. К началу второго триместра беременности масса миометрия увеличивается главным образом за счет пролиферации

ГМК синтетического фенотипа в периваскулярных зонах. В более поздние сроки беременности (20-26 недель) основным механизмом увеличения массы миометрия является выраженная, гипертрофия гладких миоцитов, интенсивно экспрессирующих специфический актин. Ядерный антиген пролиферирующих клеток (РСЫА) практически не выявляется, что свидетельствует об отсутствии пролиферации.

3.Структурные механизмы увеличения массы миоматозных узлов матки ("истинный" рост) включают нарушение нормальной гистоархитектоники миометрия, повышение пролиферативной активности ГМК, преимущественно в периваскулярных зонах поверхностных слоев узлов, а также пролиферацию фибробластов и перицитов.

В поверхностных и глубоких слоях узла отмечается умеренная гипертрофия гладких мышечных клеток с признаками дистрофии и увеличение доли неклеточных компонентов соединительной ткани.

4.Макроскопически неизмененный миометрий миома-тозной матки отличается от ткани узла упорядоченной архитектоникой мышечных пучков, преобладанием веретеновидных ГМК сократительного фенотипа, практически не экспрессирутощих РСЫА.

Сопоставление характеристик ГМК миоматозных узлов с характеристиками клеток в условиях физиологического роста матки показывает, что пролиферативная активность миоцитов узлов не достигает уровня, характерного для фетального миометрия, а их гипертрофия менее выражена, чем при беременности.

5. При так называемом "ложном" росте миоматозного узла увеличение его объема связано не только с гистогенетическими механизмами, но и. в значительной мере, с нарушениями микроциркуляции, тканевого и клегачного видно-элеюролитною баланса.

. 6. Системные показатели содержания электролитов у практически здоровых женщин и больных миомой матки различаются лишь по отношению к концентрации На (в эритроцитах) и К (в моче).

Соотношения системных показателей содержания электролитов и их тканевых концентраций заметно различаются в миома-ппных узлах и в макроскопически неизмененном миомефии.

7. Корреляции между системными и тканевыми показателями у больных миомой матки зависят от наличия артериальной ги-пертензии. У больных с гипертензивным синдромом отмечаются

положительные корреляции между содержанием Na+ в эритроцитах и концентрациями Na+, К+ и СГ в ткани миоматозной матки.

При гипертензии концентрация К+ в моче положительно коррелирует также с содержанием клеточной и тканевой воды в глубоких слоях миоматозного узла; при отсутствии гипертензии отмечается отрицательная корреляция.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется использование метода СЭМ ХДП для изучения формы клеток и пространственной организации клеточной системы миометрия.

2. С целью объективного определения источника развития клеток в условиях интенсивной пролиферации целесообразно использовать моноклональные антитела (Anti-PCNA, 2А7) при выявлении специфичных антигенных детерминант, указывающих на клеточное происхождение.

3. При проведении дифференциальной диагностики типа роста миоматозных узлов ("ложный" или "истинный") у больных миомой матки, имеющих высокий риск оперативного лечения (экстрагенитальная патология) рекомендуется применять комплекс методов:

а) определение концентрации Na+ эритроцитов и К+ мочи;

б) оценка васкуляризации поверхностных зон миоматозных узлов в биоптатах, полученных при гистеро- или лапароскопии.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морфологический анализ состояния сосудов микроцир-куляторного русла в лейомиомах матки при артериальной гипертензии: Тез. докл. IV Всероссийского съезда онкологов,- Ростов-на-Дону,- 1995. - С.271-273 /соавт. А.Г. Зирин, A.A. Миронов, М.Д. Рехтер, Г.И. Брехман/.

2. Морфологические особенности организации клеточной системы миомы матки в различных слоях миоматозного узла в сравнении с макроскопически неизмененным миометрием: Тез. докл. IV Всероссийского съезда онкологов,- Ростов-на-Дону.- 1995. - С.273-275 /соавт. А.Г. Зирин, A.A. Миронов, М.Д.Рехтер, Г.И. Брехман/.

3. Трехмерная организация клеточной системы миомы матки и макроскопически неизмененного миометрия //Владимирский медицинский вестник.- Владимир - 1995. - С.73-76.

4. Ультраструкгура и пространственная организация глад-комышечных клеток в миоме матки и макроскопически неизмененного миометрия: Тез. 61-й студенческой научной конференции,-Одесса.-! 992,- С22.

Лицензия 020275 от 13.11.96 г.

Подписано в печать 06.02.97. Формат 60x84/16. Бумага для множит, техники. Печать офсетная. Усл.печл. 1,16. Уч.-изд.л. 1,09. Тираж 100 экз. Зак. 69 Российский государственный медицинский университет. Адрес университета: 117869, Москва, ул.Островитянова. д. 1. Подразделение оперативной полиграфии Владимирского государственного университета.

Адрес университета и подразделения оперативной полиграфии: 600026 Владимир, ул.Горького, 87.