Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Геропротекторное действие вилона на органы иммунной системы крыс различного возраста

рГь од

Санкт-Петербургский Институт ^ 7 uJi 1Ш биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

На правах рукописи

князькин

Игорь Владимирович

ГЕРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ВИЛОНА НА ОРГАНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ КРЫС РАЗЛИЧНОГО ВОЗРАСТА

14.00.53 - геронтология и гериатрия 14.00Л5 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2002

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор И.М. Кветной доктор медицинских наук профессор Н.М. Аничков

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук профессор А.Л. Арьев Доктор медицинских наук профессор М.Г. Рыбакова

Ведущее учреждение: Военно-медицинская академия

Защита состоится 2002 г. в ^часов

на заседании Диссертационного Совета Д 601.001.01 в Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург, проспект Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург, проспект Динамо, д. 3.).

Автореферат разослан ^^ . 2002 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

Л.С.Козина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Современные достижения медицины в развитых странах приводят к постепенному увеличению средней продолжительности жизни, в результате чего население этих стран прогрессивно стареет [Гаврилов, Гаврилова, 1991; Коркушко с соавт., 1993; Меленьтьев с соавт., 1995]. Основной задачей геронтологии и гериатрии является сохранение здоровья и работоспособности у пожилых и старых людей. В этой связи разработка новых геропротекторных лекарственных средств, способных предупредить преждевременное старение как всего организма, так и наиболее важных, ключевых органов или систем становится все более актуальной.

В последние годы разработаны потенциальные геропротекторы пептидной природы - извлеченные из тканей молодых здоровых животных комплексные пептиды, а также подобные им по свойствам синтетические короткие пептиды [Кузник с соавт., 1998; Морозов с соавт., 2000; Ха-винсон, Морозов, 2001].

Учитывая большую и часто решающую роль в патогенезе различных заболеваний, которую играет иммунная система, в Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН разработан и синтезирован иммуномодулятор вилон (дипептид Lys-Glu), обладающий ти-момиметическим и иммуномодулирующим действием [Хавинсон с соавт., 1997, 1999; Морозов с соавт., 2000]. Результаты клинических испытаний вилона, проведенных на больных туберкулезом, хроническим гепатитом и другими заболеваниями, свидетельствуют о перспективности изучения данного пептида в качестве препарата, возможно, обладающего репаративными и общерегуляторными свойствами, оказывающего влияние на клеточный и гуморальный иммунитет, неспецифическую резистентность организма, процессы антиоксидантной защиты и регенерацию тканей.

Учитывая эти обстоятельства, можно с достаточно большой уверенностью рассматривать вилон в качестве потенциального геропротекто-ра. Проведение специальных исследований в этом направлении является своевременным и актуальным.

Цель и задачи исследования.

Целью данного исследования явилось изучение геропротекторного действия вилона на важнейшие органы иммунной системы - тимус и селезенку у крыс различного возраста.

Учитывая, что детальное изучение механизмов действия геропротек-торов может быть более полно обеспечено при проведении использова-

нии органотипических культур тканей и на моделях преждевременного старения, вызываемого слабым ионизирующим излучением, для достижения цели исследования были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

- создать реконструкцию гистологической модели органотипической культуры селезенки;

- определить структурно-функциональные изменения, происходящие в эксплантатах селезенки у крыс разного возраста, в условиях физиологической инкубации и при действии вилона;

- оценить репаративное и общерегуляторное влияние вилона на структурно-функциональную организацию тимуса и селезенки при моделировании преждевременного старения (после радиационного воздействия).

Научная новизна работы.

Впервые проведено подробное морфо-функциональное изучение изменений, происходящих в эксплантатах селезенки, полученных от крыс разного возраста, как в условиях физиологической инкубации, так и при действии дипептидного иммуномодулятора вилона. Впервые показано, что вилон обладает способностью поддерживать морфологическую сохранность и усиливать процесс регенерации органотипической культуры селезенки, с большей выраженностью эффекта у старых животных. Показано усиление резистентности клеток к неблагоприятным условиям внешнего микроокружения под действием вилона. Также установлено, что вилон нивелирует фазовые морфофункциональные изменения в тимусе и селезенке, вызываемые искусственным преждевременным старением, способствуя при этом восстановлению нарушений микроциркуляции и гемодинамики и ускоряя дифференцировку иммунокомпетентных клеток.

Практическая значимость работы.

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о перспективности применения вилона в гериатрической практике, в частности для профилактики и коррекции возрастных нарушений ангио- и иммуногенеза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Синтетический дипептид вилон поддерживает морфологическую сохранность и регенерацию клеток органотипической культуры селезенки крыс, причем у старых животных этот эффект более выражен. Вилон усиливает резистентность клеток к неблагоприятным условиям внешнего микроокружения.

2. Вилон нивелирует фазовые морфо-функциональные изменения в тимусе и селезенке, вызываемые искусственным преждевременным старением (в результате слабого гамма-облучения), способствует компенсации связанных с этим микроциркуляторных нарушений и гемодинами-ческих расстройств в названных органах, ускоряет дифференцировку Ти В-лимфоцитов и усиливает миграцию лейкоцитов.

3. Вилон является перспективным препаратом для практического применения в гериатрии, в частности для коррекции нарушений ангио- и иммуногенеза.

Связь с научно-исследовательской работой Института.

Диссертация выполнена по основному плану научно-исследовательских работ Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ современного состояния проблемы старения органов иммунной системы и способов его предупреждения; глава 2 содержит описание материалов и методов, примененных в данном исследовании; глава 3 является изложением результатов собственных исследований; глава 4 посвящена обсуждению полученных результатов.

Текст диссертации изложен на 135 страницах, содержит 5 таблиц и иллюстрирован 34 рисунками. Список литературы содержит 200 работ, из них 124 отечественных и 76 - иностранных авторов.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Апробация и реализация диссертации.

Материалы диссертации доложены на IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002); VI Европейском конгрессе по клинической геронтологии (Москва, 2002); Валенсийском форуме по геронтологии (Валенсия, Испания, 2002); VI Всероссийской конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002); Научной конференции профессорско-преподавательского состава, молодых ученых и студентов Санкт-Петербургской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Санкт-Петербург, 2002).

Результаты диссертации внедрены в научный, клинический и педагогический процессы в Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и ге-

ронтологии СЗО РАМН, НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, НИИ онкологии им. H.H. Петрова МЗ РФ, Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При изучении геропротекторного действия вилона проведены три серии исследований:

Серия 1. Исследование влияния вилона на динамику структурно-функциональной организации селезенки в процессе естественного старения (метод органотипических культур).

Работа проведена на эксплантатах селезенки крыс линии Вистар трех возрастных труп: 3 сут (молодые), 21 сут (зрелые) и 2 лет (старые). В опытных группах к культуральной среде добавляли 20 нг/мл вилона.

Проведено два вида экспериментов:

- культивирование эксплантатов - 0,5 мм в питательной среде в течение

3 сут в «физиологических» условиях;

- инкубирование эксплантатов более 1 мм на протяжении 5 сут («переживающие» органотипические культуры).

В физиологических условиях были исследованы эксплантаты селезенки от всех трех возрастных групп, в переживающих культурах — фрагменты селезенки от зрелых и старых животных.

Эксплантаты фиксировали в кислой жидкости Буэна и по Карновско-му и проводили светооптическое и электронно-микроскопическое исследование (микроскопы Jenamed-2, Zeiss и JEM-1 OOS, JEOL).

Серия 2. Исследование действия вилона на структурно-функциональную организацию тимуса и селезеики в радиационной модели преждевременного старения.

Работа выполнена на 30 самцах крыс линии Вистар. Животные были разделены на 6 групп: 1 и 1а - интактные крысы; 2 и 2а - облученные крысы; 3 и За - облученные животные, которым вводился вилон.

Гамма-облучение выполнено на аппарате ЛУЧ-1 (источник 60Со; мощность дозы 17,166 г 10"4 Гр/с). Животные получали ежедневную дозу 1,25 Гр в течение 5 сут.

Вилон вводили подкожно через 24 ч после первого сеанса облучения по 0,5 мкг (в 0,5 мл физиологического раствора) в течение 10 сут. Животным групп 2 и 2а вводили эквивалентное количество физиологического раствора.

Забой животных и выделение органов проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг): животных 1, 2 и 3-й групп - на 14-е сут от начала облучения, а животных групп 1а, 2а и За - на 21-е сут.

Кусочки тимуса и селезенки фиксировали (см.выше), готовили тонкие, полу- и ультратонкие среды, которые изучали в световом (Jenamed-2, Zeizz) и электронном (JEM-100S, JEOL) микроскопах.

Серия 3. Исследование действия вилоиа на клеточную репарацию тимуса и селезенки в радиационной модели преждевременного старения.

Работа выполнена на 42 самцах крыс линии Вистар в возрасте 2 месяцев. Животные были разделены на 4 группы: 1 -я- контроль; 2-я - введение вило-на; 3-я - гамма-облучение 6 Гр; 4-я - гамма-облучение 6 Гр + введение вилона. Общее однократное гамма-облучение выполнено на кобальтовом аппарате ГУБ 20000 при мощности дозы 200 рад/мин. Физиологический раствор (группы 1 и 3) и вилон (группы 2 и 4) вводили внутрибрюшинно через 24 ч после облучения по 0,5 мкг в течение 4 последующих дней.

Забой животных проводили под нембуталовым наркозом на 8-е сут после облучения (начало периода репаративной регенерации). Кусочки тимуса и селезенки фиксировали, готовили срезы и подвергали их световой и электронной микроскопии (см. выше).

Во всех сериях исследований гистологические срезы окрашивали гематоксилином-эозином, а полутонкие срезы - метиленовым синим - азу-ром II - основным фуксином. Изучение пролиферативной активности клеток проводили нммуноцитохимическим методом с использованием мышиных моноклональных антител к PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen, Novocastra) и набора для выявления мышиных иммуноглобулинов (ICN, США). Иммуноглобулин-содержащие клетки идентифицировали набором для выявления крысиных иммуноглобулинов (BioGenex).

Для изучения функциональной активности интерфазных клеток использовали метод избирательной импрегнации ядрышковых организаторов [Howell, Black, 1980] в модификации H.H. Мамаева с соавт. (1984). Апоптоз-ные ядра выявляли по методу Мозера [Moser, 1995].

На полутонких и ультратонких срезах клетки, погибающие путем некроза или в форме апоптоза, определяли по стандартным морфологическим критериям [Wyllie, 1987,1988].

Количественные плотности PCNA-позитивныхядер (NpCNA), интерфазных клеток, содержащих ядрышковые организаторы (NAgN0R) и погибших клеток по ядрам, импрегнированным по методу Мозера (NA+H), определяли по стандартной методике с пересчетом на 1 мм2 площади среза.

Морфометрические исследования по определению NpCNA, NA+H и NAgN0R выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений IMSTAR с применением прикладных лицензионных программ Morphostar-2 и Colquant-2 (Imstar S.A.).

Для статистической обработки полученных результатов использовали í-тест Стьюдента для малых выборок и непараметрический ¿/-критерий Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Действие вилона на морфофункциональные характеристики и жизнеспособность клеток органотипической культуры селезенки крыс разного возраста.

Действие вилона на эксплантаты селезенки молодых (,3 cvm) крыс. Светооптическое исследование эксплантатов, полученных от молодых крыс, и подвергнутых воздействию вилона, показало, что по сравнению с контрольной группой число делящихся клеток увеличено. Более выражены целостность мезотелия и активно функционирующие островки экстрамедуллярного эритропоэза и гранулопоэза.

Действие вилона на эксплантаты селезенки зрелых (21 cvm) крыс. В строме красной пульпы появляются островки из молодых дифференцирующихся ретикулярных и плазматических клеток. Большая часть про-лиферирующих клеток сконцентрирована в 100 мкм периферической зоне, однако в отличие от контрольной группы, отдельные ядра с интенсивной реакцией на PCNA обнаруживаются даже в центральных зонах органотипической культуры среди полей погибшей ткани. Количественная плотность пролиферирующих клеток на 1 мм2 снижается до 4912 ± 246 (без вилона 6549 ± 508; р < 0,01), а плотность погибших клеток - до 11546 ± 478 (без вилона 15919 ± 567). В то же время количественная плотность клеток с ядрышковыми организаторами увеличивается до 3536 ±101 (без вилона 2714 ± 120), а на соответствующих серийных срезах выявляются скопления иммуноглобулин-позитивных клеток в виде небольших групп (в контроле единичные Ig-позитивные клетки).

При культивировании эксплантатов от зрелых животных в экстремальных условиях большая их часть погибла в течение 5 сут. Косвенные признаки показывают, что в результате добавления вилона эксплантаты селезенки погибли позже: в периферических зонах выявляются небольшие скопления или даже поля «недавно погибших клеток», среди которых выявляются единичные ретикулярные клетки с хорошо сохранившейся ультраструктурной организацией.

Действие вилона на эксплантаты селезенки старых (2 года) крыс. При введении вилона зона регенерации расширяется. Ретикулярные клетки выявляются в двух модификациях: единично рассеянные клетки и относительно крупные ретикулярные комплексы. Цитоплазма клеток в таких

комплексах сохранена, присутствуют ультраструктурные признаки внутриклеточной формы регенерации. При нммуноокрашивании на PCNA определяется расширение зоны локализации пролиферирующих клеток, по данным компьютерного анализа их количественная плотность увеличивается на 25% и составляет 1745 ± 770 клеток на 1 мм2. Клетки с идентифицируемыми ядрышковыми организаторами выявляются не только по периферии, но и в более глубоких зонах. Их содержание превышает уровень контрольной группы более чем на 50%.

При культивировании эксплантатов селезенки старых крыс в условиях переживаюей культуры в контрольной группе практически все эксплантаты на 5 сут погибают. В 6 из 9 эксплантатов обнаруживается тотальный некроз по всей площади срезов. Электронно-микроскопически визуализируется некроз капсулы и подкапсулыюй зоны с гомогенизацией фибриллярных структур. Иммуногистохимическая реакция на РСЫА не регистрируется. При окрашивании на ядрышковые организаторы реакцию дают единичные клетки в периферических зонах двух эксплантатов и локальное скопление выживших клеток в одном случае. При введении вилона гистоархитектоника периферических зон эксплантатов сохранена лучше, а деструктивные изменения выражены меньше. В субкапсулярных участках выявляются мигрирующие клетки с хорошо сохранившейся ультраструктурной организацией ядер и цитоплазмы. Ретикулярные клетки в красной пульпе формируют ор-ганоидные структуры в виде атипичных ретикулярных тяжей. В клеточных элементах в центре располагаются плотно упакованные клетки. Матрикс цитоплазмы этих клеток светлый. Ядра овальные, иногда с инвагинатами, содержат 1 -2 фибриллярных ядрышка. В цитоплазме - единичные плоские цистерны зернистого эндоплазматического ретикулума, лггзосомы и многочисленные рибосомы и полисомы, свидетельствующие об интенсивно протекающих процессах внутриклеточной регенерации. Небольшие клеточные элементы образуют микрокапсулу вокруг тяжей. При окрашивании на ядрышковые организаторы в периферических зонах культуры обнаруживается характерная сеточка из функционирующих интерфазных клеток. Клетки с ядрышковыми организаторами выявлены в 7 из 10 эксплантатов, их количественная плотность 1209 ±356 клеток на 1 мм2, что более чем в 3 раза выше, чем в контрольной группе.

В проведенных исследованиях лимфоидная ткань в органотипической культуре селезенки в процессе ее культивирования практически полностью погибала, что свидетельствует о высокой чувствительности лимфоид-ных клеток к факторам стресса, связанным с недостатком поступления веществ, необходимых для жизнедеятельности клеток.

По данным количественного анализа объективно регистрируемым эффектом влияния вилона на эксплантаты молодых (3 сут) животных являет-

ся усиление пролиферативной активности клеток в зонах регенерации и снижение количественной плотности погибших спленоцитов. Для органо-типической культуры зрелых (21 сут) крыс характерно статистически значимое снижение числа погибших клеток и увеличение числа активно функционирующих стромальных элементов. Возможно, усиление регенерации мезотелиального пласта под влиянием вилона и достаточно тонкая капсула у молодых животных способствуют активизации восстановительных процессов в субкапсулярной зоне и снижению гибели клеток, обусловленной недостатком кислорода.

Отличительной характеристикой действия вилона на органотипичес-кую культуру селезенки зрелых животных является значительное снижение пролиферативной активности спленоцитов. Активизация восстановления мезотелиальной выстилки под влиянием вилона гистологически хорошо выражена и у животных этой возрастной группы, что подтверждается снижением миграции клеток за пределы эксплантатов.

Появление в пульпарных тяжах при действии вилона молодых дифференцирующихся ретикулярных и плазматических клеток может свидетельствовать о выходе части обновляющихся клеток из цикла пролиферации, их дифференцировке и функциональном созревании. Прямым доказательством этому может служить статистически значимое увеличение числа клеток с ядрышковыми организаторами, а косвенным - появление скоплений иммуноглобулинпозитивных клеток на серийных срезах этих эксплантатов.

Между пролиферативной активностью и гибелью клеток в эксплантатах существуют значимые отрицательные корреляционные связи, что дополнительно подтверждает эффективность действия вилона на изучаемые объекты. Для эксплантатов от старых крыс клеточная форма регенерации путем пролиферации играет менее существенную роль, чем для молодых животных.

Даже при физиологических условиях культивирования на 3 сут инкубации большая часть клеток в эксплантатах погибает, а в процессы регенерации включаются, в основном, клетки субкапсулярной зоны и самой капсулы. В результате регистрируется относительно низкое содержание про-лиферирующих клеток. Вместе с тем, в эксплантатах от старых животных даже в контрольной группе по ядрышковым организаторам определяется достаточно большое число функционирующих клеток.

Смещение поля корреляционной связи между РСЫА-позитивными и функционирующими клетками при действии вилона в сторону клеток с позитивной реакцией на ядрышковые организаторы указывает на специфическую направленность регенерационного процесса в этот период онтогенеза.

Таким образом, вилон активирует процессы регенерации у животных всех трех возрастных групп, но выраженность и характер регистрируемых в органотипической культуре эффектов зависят от возраста животных и времени культивирования исследуемых фрагментов этого органа.

Полученные данные о стимулирующем действии вилона на пролифе-ративные и регенераторно-адаптационные процессы в условиях стресса свидетельствуют о целесообразности его применения для лечения и/или коррекции ишемических состояний различной этиологии и патогенеза. Специфическое действие вилона на органотипическую культуру старых животных предполагает перспективность применения этого препарата в геронтологии.

Действие вилона на иммунный гомеостаз животных в модели преждевременного старения (фракционированное гамма-облучение в сублетальных дозах).

Тимус. На 14 сут после начала облучения при светооптическом исследовании заметно некоторое полнокровие сосудов. В мозговом веществе незначительно повышено содержание лимфоцитов. Введение физиологического раствора существенных отличий относительно контроля не вызвало. Усилена интенсивность реакции РСЫА вдоль септальных перегородок по сравнению с облученными животными, получавшими физиологический раствор. Среди наиболее выраженных изменений в тимусе наблюдается отслоение участков наружной ядерной мембраны, набухание матрнкса митохондрий с лизисом крист, нарушение тесных контактов между отдельными тимоцитами. Облучение не уменьшает числа делящихся тимоцитов, находящихся на разных стадиях митоза. В цитоплазме макрофагов пояляются крупные цитолизосомы. Ультраструктурные изменения в стенках кровеносных сосудов связаны с увеличением плотности цитоплазмы одних эндотелиальных клеток и отеком цитоплазмы других, разрыхлением базальной мембраны и периваскулярных пространств. Цитоплазма эндотелиальных клеток образует многочисленные тонкие выросты в просвет сосудов. Наблюдается появление в цитоплазме вакуолей и обеднение ее митохондриями. Цитоплазма перицитов и их отростки выглядят уплотненными. В тучных клетках пролисходит образование обширных вакуолей, в которых одновременно может находиться до 10 секреторных гранул с различной степенью электронной плотности, отражающей разные стадии лизиса. В ретикуло-эпителиальных клетках заметно отслоение наружной мембраны, расширение мембран эндоплазматического ретикулума, появление многочисленных мелких вакуолей, набухание и лизис крист митохондрий. Мелкие секреторные гранулы в небольшом количестве встречаются в перинуклеарном пространстве.

У животных, которым вводили вилон, на 14 сут от начала облучения выраженных изменений со стороны тимоцитов не отмечено. В корковом веществе тимуса они располагаются, тесно прилегая друг к другу, имеют относительно одинаковые по размеру ядра с 1-2 ядрышками. Ободок цитоплазмы очень тонкий, встречаются единичные митохондрии, в которых хорошо просматриваются кристы. Среди тимоцитов - большое число клеток на разных стадиях деления. Заметных нарушений в течении митоза не обнаружено. Часто встречаются макрофаги, иногда в их цитоплазме видны фагоцитированные клетки на поздних стадиях деградации. Со стороны кровеносных сосудов отмечается уменьшение отека цитоплазмы эндотелиальных клеток и периваскулярных пространств. В междольковой соединительной ткани появляются эозинофильные лейкоциты. В ретикуло-эпителиальных клетках происходит слабо выраженное отслоение кариолеммы, уменьшение вакуолизации цитоплазмы, встречаются отдельные вакуоли с гранулярным содержимым.

На 21 сут от начала облучения объемная плотность тучных клеток возрастает у всех облученных животных. У крыс, получавших инъекции физиологического раствора, тимоциты имеют очень узкий ободок цитоплазмы, в которой находится ограниченное число рибосом и митохондрий. Среди делящихся тимоцитов не отмечено появления клеток с патологически протекающими митозами. Митохондрии в делящихся клетках умеренной плотности с хорошо сохранившимися кристами. В кровеносных капиллярах сохраняется отечность цитоплазмы эндотелиальных клеток и периваскулярных пространств. Отсутствуют признаки активности трансэндотелиального транспорта. Заметно сужение просвета мелких капилляров.

У животных, получавших вилон, обращает на себя внимание скопление тучных клеток не только в междольковой соединительной ткани, но и в корковом веществе долек тимуса. Эти клетки содержат в своей цитоплазме секреторные гранулы разных размеров и электронной плотности. При электронно-микроскопическом исследовании в корковом веществе тимуса заметны гранулярные лейкоциты (преимущественно полиморфноядерные, реже эозинофильные), а также плазматические клетки, располагающиеся небольшими группами.

Таким образом, в радиационной модели преждевременного старения в тимусе животных, получавших вилон, выявляется быстрое восстановление структуры сосудистой стенки и формирование периваскулярного пространства. Инфильтрация коркового вещества зернистыми лейкоцитами и плазматическими клетками при этом, возможно, связана именно с интенсификацией репаративных процессов, так как известно, что гранулоциты чувствительны к активации различными гуморальными и клеточными факторами.

Селезенка. Через 14 сут от начала облучения в селезенке вокруг центральной артерии селезенки Отмечается опустошение фолликулов и их фраг-ментирование. Количество РСИА-позитивных клеток снижается, так объемная плотность пролиферирующих клеток в фолликулах с 0,138 ± 0,009 (в контроле) сокращается до 0,082 ± 0,004 Введение вилона частично компенсирует снижение PCNА, довод я его до уровня 0,090 ±0,05.

Иммуноглобулин в-позитивные клетки в селезенке контрольных животных сосредоточены преимущественно в маргинальной зоне между белой и красной пульпой и в субкапсулярной области. Объемная доля их (г,г0) заметно возрастает к 21 сут после начала облучения (с 0,026 ± 0,001 до 0,040 ± 0,004; р < 0,01). Введение вилона нормализует этот показатель.

Проведенное функционально-морфологическое исследование показало способность вилона интенсифицировать репаративные процессы в органах иммунной системы после многократного облучения. При этом продемонстрировано стимулирующее влияние вилона как на клеточный, так и на гуморальный иммунитет. Ультраструктурное исследование позволило установить, что восстановление структурно-функциональной организации в тимусе после лучевых повреждений на фоне введения вилона протекает быстрее. Поскольку известно, что процесс созревания Т- и В- лимфоцитов происходит под влиянием специализированного микроокружения, то можно предположить, что вилон активизирует именно эти механизмы

Полученные данные позволяют считать, что вилон обладает модулирующим действием на тимус, он нивелирует фазовые колебания структурно-функциональных показателей после фракционированного облучения.

В селезенке животных, получавших вилон, отмечается более высокое содержание иммуноглобулинов. Компьютерный анализ микроскопических изображений показал, что у облученных животных, получавших вилон, усиливается активность рибосом, что указывает на усиление проли-феративного потенциала клеток.

Таким образом, данные проведенного исследования структурно-функциональной организации центральных органов иммунитета после фракционированного облучения (модель преждевременного старения) показали, что вилон стимулирует иммунитет и способен усиливать репарационные процессы в органах иммунной системы.

Действие вилона на репаративные процессы (пострадиационное восстановление) в тимусе и селезенке.

Тимус. У животных, которым вводили вилон, дольки значительно крупнее, чем у животных контрольной группы. Корковое вещество широкое

благодаря активной пролиферации кортикальных тимоцитов, популяция которых представлена преимущественно мелкими и средними лимфоцитами. Эпителиальные клетки значительно гиперплазированы. Тимусные тельца Гассаля многочисленны и в большинстве случаев имеют хорошо окрашенные ядра клеток. Сосуды вилочковой железы растянуты и полнокровны.

Введение вилона интактным животным также приводило к активизации эпителиальных клеток и лимфоцитов тимуса, что характеризовалось укрупнением и конденсацией хроматина в ядре, более выраженной извитой структурой эндоплазматического ретикулума, увеличением количества рибосом и митохондрий, появлением пиноцитозных пузырьков.

Наиболее существенный эффект отмечен в пролиферативной активности тимоцитов. На фоне снижения суммарной клеточной плотности в корковом веществе тимуса, обусловленного увеличением содержания более крупных по размеру лимфобластов, 1рсНА достигает 37 %. Не исключено, что эти данные отражают влияние вилона на дифференциров-ку и скорость миграции морфологически зрелых Т-лимфоцитов из коркового слоя тимуса в мозговое вещество.

На 8 сут после облучения отмечается нарушение структурной организации тимуса. Выражены атрофические изменения. Количество долек и их размеры значительно уменьшены. Деление на корковое и мозговое вещество стирается, граница между слоями фактически исчезает. Соотношение между паренхимой и стромой нарушено в сторону увеличения последней. Строма набухшая, отечная, с обильной жировой инфильтрацией. Кортикальные тимоциты представлены преимущественно большими и средними лимфоцитами. Часто обнаруживаются фигуры митозов и деструкция лимфоцитов, ядра которых находятся в состоянии кариопик-ноза и кариорексиса. В тимических тельцах отмечается распад и дегенерация клеток. Клеточность в корковом веществе тимуса снижена почти вдвое, а РСЫА-позитивные ядра сосредоточены преимущественно в периферической зоне редуцированных долек. Вместе с тем происходит увеличение числа тучных клеток в соединительнотканных перегородках. Высокий индекс PCNA и гиперплазия тучных клеток свидетельствуют о начавшемся периоде пострадиационного восстановления вилочковой железы. Менее выраженные инволютивные изменения определяются при микроскопическом анализе препаратов тимуса животных, которым после облучения вводили вилон (табл .1). Возрастает и количество тучных клеток в тимусе.

Таблица 1

Основные морфофункциональные характеристики тимуса и селезенки крыс по данным компьютерного анализа микроскопических изображении (1 мм2)

Группа Тимус Селезенка

ИтаРС Крсш* М2 1рсыл Ммс НрсМА|Х10^ Мрс^Ю"1 N,£0

Контроль 292±9 75±3 2б±1 18±2 22±2 81±8 728+44

Вилон 268±2* 99±12* 37±4* 22±7 24±7 54 715+78

Облучение 170±11*** 54±8* 33±7 44+11* 48±3* 36±3 328±34*

Облучение + вилон 128±6»** § 71±6 55±3** § 71±18* 196±70" 59±10* 558±38" §5

Примечание: *р<0,05, <0,01, ***р<0,001 посравнениюс контролем;

§ р< 0,05, §§ р< 0,01 по сравнению с группой облученных животных, не получавших вилона.

РСЫА, -экстрамедуллярная зона селезенки. РСЫА2 - фолликулы селезенки

Таким образом, после общего однократного гамма-облучения в дозе 6 Гр вилон усиливает пролиферативную активность тимоцитов, ускоряя диф-ференцировку Т- и В-лимфоцитов и усиливая миграцию лейкоцитов.

Селезенка. Гистоструктура селезенки животных, получавших вилон, сохраняет типичное строение, однако происходит значительное увеличение объема белой пульпы. Фолликулы гиперплазированы, содержат большое количество лимфоцитов. В красной пульпе ярко выражена лимфоци-тарная инфильтрация. Сосуды умеренно полнокровны.

У облученных животных отмечается значительное сокращение количества лимфоцитов и атрофия периартериальных муфт. На месте лимфатических фолликулов обнаруживаются единичные скопления пикнотизи-рованных, частично распадающихся лимфоцитов, плазматических и ретикулярных клеток. Стенки кровеносных сосудов белой пульпы и соединительнотканых трабекул отечные, частично гомогенизированые за счет плазматического пропитывания. Эндотелий их набухший и местами вакуолизирован. Красная пульпа умеренно полнокровна.

В селезенке облученных животных определяется очень низкий уровень пролиферативной активности как в экстрамедуллярных зонах, так и в редуцированных лимфатических фолликулах. Количество ^в-позитивных клеток также снижено более чем в два раза по сравнению с контролем.

Строение селезенки животных, которым после облучения вводили вилон, характеризуется атрофией лимфоидных фолликулов, в них обнаруживаются пикнотизированные лимфоциты, плазматические и ретикулярные клетки. Стенки кровеносных сосудов отечные, эндотелий набухший, местами вакуолизирован. Красная пульпа насыщена эритроцитами.

Ультраструкгурные изменения в лимфоцитах селезенки у животных опытных групп во многом идентичны таковым, описанным для Т-лим-фоцитов тимуса.

Таким образом, компьютерный анализ микроскопических изображений препаратов тимуса и селезенки выявил значительные различия в состоянии облученных животных, получавших вилон и не получавших его. Вилон, существенно не влияя на биосинтетические процессы в цитоплазме клеток, статистически значимо усиливает пролиферативную активность Т-лимфоцитов. Возможно, именно этот эффект способствует стимуляции пострадиационного восстановления критических органов в модели преждевременного старения. К числу ведущих патогенетических звеньев, усиливающих первоначальные повреждения клеток и тканей, относятся и ранние сосудистые реакции.

В исследуемый период после облучения еще не происходит полной репарации систем, неоходимых организму для выживания. Наблюдаемая

«гиперрегенерация» тучных клеток и тимоцитов у облученых животных после введения вилона дает основание предположить, что вилон усиливает пролиферативную активность выживших после гамма-облучения стволовых клеток костного мозга. Результаты исследования микроскопических препаратов селезенки показывают, что введение вилона оказывает стимулирующее влияние на ее лимфоидный аппарат.

ВЫВОДЫ

1. Синтетический дипептид вилон обладает выраженным активирующим и стабилизирующим действием на морфо-функциональные характеристики органотипической культуры селезенки крыс. При этом в культурах, полученных от старых животных, специфическая направленность его действия более выражена. Названные эффекты проявляются в морфологической сохранности и регенерации клеток и в усилении их функциональной активности.

2. Вилон оказывает стимулирующее действие на стромальное микроокружение и значительно усиливает жизнеспособность клеток в «переживающей» органотипической культуре клеток селезенки. В условиях стрессового воздействия, вызывающего гибель части клеток культуры, вилон снижает уровень спонтанной клеточной гибели, повышает пролиферативный потенциал и усиливает резистентность клеток к неблагоприятным условиям внешнего микроокружения, тем самым способствуя регенерации ткани.

3. В модели преждевременного старения, вызванного фракционированным гамма-облученнем в сублетальных дозах, вилон модулирует иммунный гомеостаз животных, стимулирует репаративные процессы в вилочковой железе, нивелирует вызываемые облучением фазовые морфо-функциональные изменения в тимусе и селезенке, что ускоряет компенсацию микроциркуляторных расстройств в этих органах.

4. После общего однократного гамма-облучения в дозе 6 Гр вилон стимулирует пострадиационное восстановление тимуса и селезенки, в том числе повышает пролиферативную активность тимоцитов, ускоряя дифференцировку Т- и В-лимфоцитов и усиливая миграцию лейкоцитов.

5. Вилон обладает геропротекторными свойствами. Его применение в гериатрии является целесообразным для коррекции возрастных нарушений ангио- и иммуногенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Князькин И.В., Полякова В.О. Действие вилона на тимус и селезенку в радиационной модели преждевременного старения. // Успехи геронтологии. 2002,9, 105-109.

2. Князькин И.В., Южаков В.В., ЧалисоваН.И., Григорьев Е.И. Функциональная морфология органотипической культуры селезенки крыс различного возраста при действии вилона // Успехи геронтологии. 2002, 9, 110-115.

3. Князькин И.В. Действие вилона на центральные органы иммунной системы в радиационной модели преждевременного старения. В кн.: Материалы IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 2002). М., 2002, 123-124.

4. Князькин И.В. Зезюлин П.Н, Быков Н.М, Аничков Н.М. Сравнительное действие вилона на структуру эксплантатов селезенки молодых и старых крыс. В кн.: Научная конференция профессорско-преподавательского состава, молодых ученых и студентов Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. СПб., 2002,46-47.

5. Князькин И.В., Аничков Н.М. Геропрогекторное действие вилона (ди-пептида LYS-GLU) В кн.: Научная конференция профессорско-преподавательского состава, молодых ученых и студентов Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. СПб., 2002,48.

6. Knyazkin I.V. Immunomodulation effect of dipeptide vilon in radiation model of premature ageing. In: Valencia Forum on Gerontology, Valencia, Spain, 2002. Valencia, 2002, 234-235.

7. Князькин И.В., Южаков В.В., Чалисова Н.И., Григорьев Е.И. Действие вилона (Lys-Glu) на органотипическую культуру селезенки молодых и старых крыс. Материалы VI Всероссийской конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002). Медицинская иммунология, 2002 (в печати).

8. Knyazkin I., Zezjulin P., Bykov N., Trofimov A. Dipeptide vilon as immunomodulator in radiation model of premature ageing. In: VI European Congress on Clinical Gerontology, Moscow, 2002. M„ 2002 (в печати).

Князькин И.В. Геропротекгорное действие вилона на органы иммунной системы крыс различного возраста// Автореф. дне. ... канд. мед. наук: 14.00.53,14.00.15—СПб., Издательство «Тема», 2002. —17 с.

Подписано к печати 12.03.02 Отпечатано в типографии «Тема» Лицензия ЛП №000148 от 14.0499 Гарнитура «Тайме» Печать офсетная. Формат 84x108/32 Заказ № 18 Тираж 150 экз.

Актуальность проблемы. Успешное развитие и прогресс медицины в развитых странах приводит к постепенному увеличению средней продолжительности жизни и, в силу этого, к прогрессивному старению населения этих стран [Гаврилов, Гаврилова, 1991; Коркушко с соавт., 1993; Меленьтьев с соавт., 1995]. Основная задача геронтологии и гериатрии -сделать жизнь пожилых и старых людей более здоровой и активной -становится все более актуальной. Один из путей решения этой проблемы -разработка новых геропротекторных лекарственных средств, способных задержать старение как всего организма, так и наиболее важных, ключевых органов или систем [Котельников с соавт., 1997; Практическая гериатрия, 1995].

Проведенное в последние годы детальное изучение механизмов гормональной регуляции привело к разработке нового класса геропротекторов пептидной природы - комплексных пептидов, извлеченных из тканей молодых здоровых животных, а также сконструированных на их основе искусственных коротких пептидов [Кузник с соавт., 1998; Морозов с соавт., 2000; Хавинсон, Морозов, 2001].

Учитывая решающую роль иммунной системы в патогенезе различных заболеваний, в Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН был разработан и синтезирован иммуномодулятор вилон (дипептид Lys-Glu), обладающий иммуномодулирующим действием [Хавинсон с соавт., 1997, 19996; Морозов с соавт., 2000]. Клинические испытания вилона, проведенные на больных туберкулезом, хроническим гепатитом и другими заболеваниями, свидетельствуют о наличии у этого пептида общерегуляторных свойств, оказывающих влияние на клеточный и гуморальный иммунитет, неспецифическую резистентность организма, процессы антиоксидантной защиты и регенерацию тканей [Морозов с соавт., 2000; Хавинсон, Морозов,

2001]. В этой связи следовало с большой вероятностью ожидать наличие у вилона геропротекторных свойств, изучению которых и посвящена данная работа.

Цель и задачи исследования.

Целью данного исследования явилось изучение геропротекторного действия вилона на важнейшие органы иммунной системы - тимус и селезенку у крыс различного возраста.

Учитывая, что детальное изучение механизмов действия геропротекторов может быть более полно обеспечено при проведении использовании органотипических культур тканей и на моделях преждевременного старения, вызываемого слабым ионизирующим излучением, для достижения цели исследования были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

- создать реконструкцию гистологической модели органотипической культуры селезенки;

- определить структурно-функциональные изменения, происходящие в эксплантатах селезенки у крыс разного возраста, в условиях физиологической инкубации и при действии вилона;

- оценить репаративное и общерегуляторное влияние вилона на структурно-функциональную организацию тимуса и селезенки при моделировании преждевременного старения (после радиационного воздействия).

Научная новизна работы.

Впервые проведено подробное морфофункциональное изучение изменений, происходящих в эксплантатах селезенки, полученных от крыс разного возраста, как в условиях физиологической инкубации, так и при действии дипептидного иммуномодулятора вилона. Впервые показано, что вилон обладает способностью поддерживать морфологическую сохранность и усиливать процесс регенерации органотипической культуры селезенки, с большей выраженностью эффекта у старых животных. Показано усиление резистентности клеток к неблагоприятным условиям внешнего микроокружения под действием вилона. Также установлено, что вилон нивелирует фазовые морфофункциональные изменения в тимусе и селезенке, вызываемые искусственным преждевременным старением, способствуя при этом восстановлению нарушений микроциркуляции и гемодинамики и ускоряя дифференцировку иммунокомпетентных клеток.

Практическая значимость работы.

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о перспективности применения вилона в гериатрической практике, в частности для профилактики и коррекции возрастных нарушений ангио- и иммуногенеза.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ современного состояния проблемы старения органов иммунной системы и способов его предупреждения; глава 2 содержит описание материалов и методов, примененных в данном исследовании; глава 3 является изложением результатов собственных исследований; глава 4 посвящена обсуждению полученных результатов.

ВЫВОДЫ

1. Синтетический дипептид вилон обладает выраженным активирующим и стабилизирующим действием на морфофункциональные характеристики органотипической культуры селезенки крыс. При этом в культурах, полученных от старых животных, специфическая направленность его действия более выражена. Названные эффекты проявляются в морфологической сохранности и регенерации клеток и в усилении их функциональной активности.

2. Вилон оказывает стимулирующее действие на стромальное микроокружение и значительно усиливает жизнеспособность клеток в «переживающей» органотипической культуре клеток селезенки. В условиях стрессового воздействия, вызывающего гибель части клеток культуры, вилон снижает уровень спонтанной клеточной гибели, повышает пролиферативный потенциал и усиливает резистентность клеток к неблагоприятным условиям внешнего микроокружения, тем самым способствуя регенерации ткани.

3. В модели преждевременного старения, вызванного фракционированным гамма-облучением в сублетальных дозах, вилон модулирует иммунный гомеостаз животных, стимулирует репаративные процессы в вилочковой железе, нивелирует вызываемые облучением фазовые морфо-функциональные изменения в тимусе и селезенке, что ускоряет компенсацию микроциркуляторных расстройств в этих органах.

4. После общего однократного гамма-облучения в дозе 6 Гр вилон стимулирует пострадиационное восстановление тимуса и селезенки, в том числе повышает пролиферативную активность тимоцитов, ускоряя дифференцировку Т- и В-лимфоцитов и усиливая миграцию лейкоцитов.

5. Вилон обладает геропротекторными свойствами. Его применение в гериатрии является целесообразным для коррекции возрастных нарушений ангио- и иммуногенеза.