Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Функциональная активность клеток иммунной системы при стрессе и старении

На правах рукописи

ГУМЕН Антонина Владимировна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ СТРЕССЕ И СТАРЕНИИ: МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ

14.00.53 - геронтология и гериатрия 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург- 2006

Работа выполнена в лаборатории фармакологии пептидов Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН, в отделе обшей патологии и патофизиологии ГУ Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Малинин Владимир Викторович

доктор биологических наук Рыбакина Елена Георгиевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кветная Татьяна Викторовна

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны РФ

Защита состоится .^г^/.^... 2006 г. в «.^5гчасов

на заседании диссертационного совета Д.601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Автореферат разослан ..» .... 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследование механизмов дисфункций иммунной системы при стрессе и старении, а также возможности коррекции стресс-индуцированных и возрастных нарушений функциональной активности иммунокомпетентных клеток, представляет собой одно из основных направлений развития современной иммунологии, иммунофизиологии и геронтологии.

В настоящее время изучение защитных реакций организма при стрессе становится все более актуальным. Хотя стресс как таковой не является патологией, стрессорная реакция сопровождает развитие практически любого патологического процесса и вызывает изменения функциональной активности клеток иммунной системы. В экспериментальных моделях и наблюдениях на людях в последние годы подтверждается возможность не только негативного, подавляющего, но и активирующего эффекта стрессорных воздействий на функции иммунной системы [Фролов Б.А. и соавт., 1993; Laue G. et al., 1998; Корнева Е.Г. и соавт., 2000; Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А., 2002,2005].

Реакции хронического стресса по своему физиологическому значению приближены к процессам старения: в последние годы экспериментально подтверждается представление о том, что возрастные изменения в организме в большой мере обусловлены снижением уровня активности защитных функций [Борисова A.M., 1999; Полякова В.О. и соавт., 2001; Uemura К. et al., 2002; Анисимов В.Н., 2003; Хавинсон В.Х. и соавт, 2003]. Поэтому экспериментальный стресс может быть использован в исследованиях в определенной степени и как модель старения.

При исследовании возрастных, а также стресс-индуцированных нарушений функций иммунной системы, информационно значимым является проведение анализа изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, определяющих уровень защиты организма. Один из таких показателей - изменение продукции мононуклеарными фагоцитами лимфоцит-активирующих факторов (ЛАФ), важнейшими компонентами которых являются цитокины интерлейкин-1 (ИЛ-1), ИЛ-б и фактор некроза опухолей-а (ФНО-а) [Rosenwasser L.J., Dinarello С.А., 1981; Симбирцев A.C. и соавт., 1987; Komeva Е.А. et al., 1997; Rybakina E.G. et al., 1997]. Представляется целесообразным и перспективным исследование изменения пррдук-пии

ЛАФ макрофагами при старении.

РОС- НАЦИОНАЛЬНА БИбЛИОТЕКЛ С.-Петербург

4 <»

}

Решающим для функционирования иммунной системы является свойство

!

ИЛ-1 - регулятора защитных функций организма и медиатора взаимодействия

%

нейроэндокринной и иммунной систем, усиливать пролиферацию тимоцитов и лимфоцитов, вызванную пектинами [ОтагеНо С.А., 1991, 1996; ТитЬиИ А.У, Ятег С Ь., 1999; Корнева Е.А. и соавт., 2000] Оценка комитогенного действия ИЛ-1 -одной из ключевых его функций, также позволяет получить важную информацию о состоянии защитных реакций при дестабилизирующих воздействиях, в том числе и при стрессе.

Информативным тестом, который может способствовать раскрытию механизмов нарушений защитных реакций организма при различных дестабилизирующих воздействиях, является анализ изменения цитотоксической активности натуральных киллерных (ПК) клеток - субпопуляции лимфоцитов, обладающих противовирусными и противоопухолевыми свойствами и отличающихся особой чувствительностью к действию стресса [Ьаискшк^ег М. е1 а1., 1999; Веп ЕПуаЪи Б. е! а!, 1999, 2000; (Зап X. ег а1., 2002; ЬЫЬага У. Ы а1., 2002; ЭЬашп Э.М ег а1., 2005].

В настоящее время актуальной проблемой остается поиск путей коррекции функций иммунной системы, в частности, функциональной активности иммунокомпетентных клеток, нарушенных при стрессе и старении.

Одним из перспективных направлений решения этого вопроса представляется использование синтетических пептидов, созданных на основе анализа аминокислотного состава эндогенных полипептадных регуляторов' вилона, эпиталона и кортагена, иммуномодулирующая, стресс- и геропротекторная активность которых показана в ряде лабораторных исследований и клинических наблюдений [Могогоу У.в., КЬауциоп У.КЬ., 1997; Киселева Е.П. и соавт., 1999; Юштшоп УКЬ. е! а1., 2001; Хавинсон В.Х. и соавт., 2002; Колосова Л.И. и соавт., 2002; Щеголев Б.Ф. и соавт., 2003; Хавинсон В.Х., Кветная Т.В., 2005]. Цель и задачи исследования

Целью работы явилось комплексное изучение изменений функциональной активности трех популяций иммунокомпетентных клеток при стрессе и старении и исследование возможности их коррекции короткими синтетическими пептидами.

В задачи работы входило: 1. Изучение стресс-индуцированных изменений цитотоксической активности

НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электроболевым раздражениям задних конечностей в двух режимах и действия коротких синтетических пептидов - вилона, эпиталона и кортагена.

2. Исследование изменений пролиферативной активности тимоцитов мышей, подвергнутых ротационному и комбинированному стрессорным воздействиям, и возможности их коррекции вилоном, эпиталоном и кортагеном, а также анализ модулирующего влияния этих пептидов на проявление комитогенного действия ИЛ-1р.

3. Сравнительное изучение особенностей продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей в норме и при ротационном стрессорном воздействии, а также модулирующего действия на нее вилона, эпиталона и кортагена. Научная новизна исследования

Проведенное исследование позволило выявить ряд характерных особенностей развития защитных реакций организма при стрессе и старении. Для этой цели использован комплекс тестов, характеризующих уровень активности защитных функций организма: изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами мышей и пролиферативной активности тимоцитов мышей.

Приоритетный характер носят полученные данные о том, что старение мышей сопровождается уменьшением чувствительности их перитонеальных макрофагов к активирующему действию ЛПС in vitro, а также снижением реакции клеток на иммуностимулирующий ротационный стресс, что выражается в угнетении продукции ЛАФ макрофагами старых мышей по сравнению с тем же показателем у молодых животных.

Впервые проведено комплексное исследование влияния коротких синтетических пептидов вилона, эпиталона и кортагена на функциональную активность трех популяций иммунокомпетентных клеток, измененную как при стимулирующем, так и угнетающем стрессорных воздействиях. Получены новые данные, подтверждающие стресс- и геропротекторное действие исследованных пептидов. Теоретическая и практическая значимость работы

Представленная работа, посвященная исследованию изменений ряда показателей защитных функций организма: цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами мышей и пролиферативной активности тимоцитов мышей, при стрессе и старении, а также действия на них коротких пептидов, носит фундаментальный характер. Основное теоретическое значение работы состоит в демонстрации изменения функциональной активности ряда популяций иммунокомпетентных клеток как мишеней для действия стресса, а также пептидных иммуномодуляторов. Результаты исследования расширяют сложившееся представление о возрастных изменениях функций иммунной системы.

Установленное иммуномодулирующее, а в ряде случаев нормализующее действие коротких пептидов на измененную при действии стресса различной природы, длительности и интенсивности, а также при старении, функциональную активность иммунокомпетентных клеток экспериментальных животных, является предпосылкой для дальнейшего исследования стресс- и геропротекторных свойств этих препаратов. Полученные новые результаты являются фундаментальной основой для дальнейшего обоснования применения вилона, эпиталона и кортагена в клинической практике с целью коррекции стресс-индуцированных и возрастных нарушений функций иммунной системы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Электроболевое раздражение задних конечностей крыс приводит к стимуляции или угнетению цитотоксической активности НК-клеток селезенки в зависимости от временного режима воздействия Вилон, эпиталон и кортаген модулируют цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электрораздражению задних конечностей в двух режимах. Эпиталон оказывает нормализующее действие на цитотоксичность спленоцитов, измененную в результате обоих видов электроболевых воздействий, восстанавливая ее до уровня базальной активности.

2. В реакции бласттрансформации мышиных тимоцитов, стимулированных Кон А, вилон и эпиталон вызывают повышение пролиферативной активности клеток, угнетенной при комбинированном стрессорном воздействии, а при аппликации стимулирующего ротационного стресса - не влияют на нее. Кортаген не изменяет интенсивность пролиферации тимоцитов у животных, подвергнутых обоим видам стресса.

3. При ротационном и комбинированном стрессорных воздействиях на мышей эпиталон и кортаген потенцируют комитогенное действие ИЛ-1р. Вилон обладает таким свойством только при комбинированном стрессе.

4. Продукция ЛАФ стимулированными ЛПС перитонеальными макрофагами старых, 19-20-ти месячных мышей на 62,5% слабее, чем клетками молодых, 2-х месячных животных. Ротационный стресс индуцирует образование ЛАФ макрофагами старых мышей менее выражено, чем клетками молодых животных.

5. Вилон, эпиталон и кортаген индуцируют продукцию ЛАФ макрофагами молодых мышей; вилон обладает таким же действием на макрофаги старых мышей. Вилон и кортаген повышают чувствительность к ЛПС макрофагов старых мышей, восстанавливая активность этих клеток, сниженную при старении.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на 5-м Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003), на 3-м Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), 2-м Российском Симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 6-м Международном конгрессе Международного общества по нейроиммуномодуляции (Афины, Греция, 2005). Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов и выводы. Библиографический список использованной литературы содержит 193 источника, в том числе 89 отечественных и 104 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 17 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общие условия работы. Необходимым условием работы было тщательное соблюдение стерильности и принятие строгих мер, предотвращающих возможность бактериального загрязнения препаратов и растворов.

Экспериментальные животные. Эксперименты выполнены на 22-х взрослых крысах-самцах массой 160-180 г, 196 взрослых мышах-самцах гибридах I поколения

линии (СВАхС57ВЬб)Рь из них 144 - молодых, 2-х месячных животных массой 18-22 г и 52 - старых, 19-20-ти месячных массой 24-30 г. До введения в эксперимент животных в течение 3-5-ти дней приучали к экспериментальной обстановке. Эксперименты начинали в 10 часов утра.

Модели экспериментального стресса. В работе использованы четыре модели экспериментального стресса на мышах и крысах. На мышах:

- ротационный стресс (вращение животных со скоростью 78 об/мин в пластиковом контейнере в течение 1 часа, при этом 10-минутные вращения автоматически прерывались 5-минутными паузами);

- комбинированный стресс (охлаждение животных после 12-часового голодания при 4-5°С в течение 2-х час в индивидуальных металлических контейнерах с последующей их иммобилизацией при комнатной температуре в течение 18 час).

На крысах:

- электроболевое раздражение (стимуляция задних конечностей животных в области голеностопного сустава постоянным током в 1,5 мА, продолжительность импульса - 1 сек, 4 импульса в мин в случайном порядке, 2 раза в день по 30 мин - в 10 и 16 час);

- электроболевос раздражение (однократная стимуляция задних конечностей животных в области голеностопного сустава при том же режиме в течение 1 часа).

Результаты исследований, полученные при использовании экспериментальных, стрессированных животных, сравнивали с данными, полученными от интактных животных и контрольных животных, находящихся в тех же условиях опыта, что и животные экспериментальной группы, но не подвергающихся стрессорному воздействию.

Интенсивность стрессорной реакции оценивали путем регистрации эрозий слизистой секреторной части желудка и изменений массы тимуса н селезенки стрессированных животных.

Через 5 мин после завершения ротационного и комбинированного стрессорных воздействий отделяли тимус у мышей; через 1 час - из брюшной полости мышей извлекали перитонеальные клетки, 90-95% которых составляли резидентные макрофаги. Селезенку у крыс извлекали через 2 часа после прекращения одноразового электроболевого раздражения и через 20 час после завершения аппликации двухэтапного стресса.

Исследуемые пептиды. В работе применяли короткие синтетические пептиды (Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН), созданные на основе аминокислотного анализа биологически активных веществ пептидной природы из тимуса, эпифиза, коры головного мозга и синтезированные методом целенаправленного конструирования: соответственно, Lys-Glu (вилон), Ala-Glu-Asp-Gly (эпиталон) и Ala-Glu-Asp-Pro (кортаген).

Определение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс.

Спленоциты, выделенные из селезенок крыс и отмытые в среде RPMI-1640, разводили в этой среде с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург) из расчета 1 х 107 клеток/мл.

В качестве мишеней для НК-клеток селезенки использовали клетки миелолейкоза человека К-562 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) Клетки-мишени метили 3Н-уридином (В/О «Изотоп», Россия) — 3 мл суспензии К-562, содержащей 7 х 105 клеток/мл, смешивали с ЗОмкКи'Н -уридина. Смесь инкубировали в СОг-инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа и 100% влажности в течение 4-х час. По окончании инкубации клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальиой сыворотки, из расчета 2 х 105 клеток/мл с добавлением 20 мкг/мл РНКазы (Sigma).

В каждую лунку планшетов (Sarstedt, USA) вносили суспензии эффекторов и клеток-мишеней в соотношении эффектор:мишень 50:1. Препараты пептидов добавляли в концентрациях: 1 х 103, 0.5 х103,0.25 х 103, 0.125 х 103 и 0.0625 х 103 нг/мл. Планшеты с добавленными клетками инкубировали в течение 20 час в СОг-инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа и 100% влажности. После инкубации содержимое ячеек переносили на бумажные фильтры при помощи 12-канального харвестера (Scatron, USA) Реакцию учитывали количественно с помощью сцинтилляционного ß-счетчика (Beckman, USA) по уровню меченого уридина в нелизированных, опухолевых клетках-мишенях в течение 1 мин (с.р.т.). Цитотоксическую активность НК-клеток селезенки в % рассчитывали по формуле:

Специфическая Среднее число импульсов (с.р.т.) в тест-ячейке . ,„„

цитотоксичность ^ Среднее число импульсов (с.р.т.) в контроле )х10°

Определение влияния исследуемых пептидов иа пролиферацию тимоцитов

мышей, стимулированных митогепом и препаратом ИЛ-ip. Тимоциты получали из

тимусов мышей после их гомогенизирования, отделения клеток от стромы

и отмывания. Реакцию бласттрансформации тямоцитов (РБТТ) определяли

по способности препарата рекомбинантного ИЛ-1р (рИЛ-ip, PeproTech ЕС, UK) со

специфической активностью 1,0 х 109 ед/мг белка, в дозе 250 нг/мл оказывать

комитогенное действие на пролиферацию тимоцитов, стимулированных

Кошсанавалином А (Кон A, Sigma) в субоптимальной дозе 0,75 мкг/мл. Пептиды

вносили в суспензии тимоцитов в диапазоне концентраций 2.5 х 10"' - 2.5 х 10"' нг/мл.

В качестве контролей использовали культуры тимоцитов без препаратов пептидов

и без митогена.

Культивирование клеток проводили в 96-луночных планшетах (Flow laboratories, UK) в среде RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург), содержащей 10% фетапьной сыворотки теленка, 100 ЕД/мл пенициллина, 2 мМ глутамина в течение 72 час при 37°С

в атмосфере 5% углекислого газа и 100% влажности. Через 56 час после начала культивирования в лунки вносили меченый тритием тимидин (ГШ IX, Санкт-Петербург) в дозе 5 мкКИ/мл и через 16 час клетки переносили на фильтры с помощью полуавтоматического харвестера (Scatron, USA). Количественную оценку включения меченого тимидина в ДНК делящихся клеток в течение 1 мин (с.р.т.) проводили на ß-счетчике (Beckman, USA).

Определение активности лимфоцит-активирующих факторов в инкубатах перитонеяльных макрофагов мышей. Перитонеальные макрофаги суспендировали в среде Игла, содержащей 15% фетальной сыворотки («Биолог», Санкт-Петербург), пенициллин (100 ЕД/мл) и 2 мМ глугамина (Sigma) в концентрации 3 млн клеток/мл и инкубировали в течение 18 час при 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислый газ и 100% влажность в 24-луночной плате для культивирования клеток (Scientific flow laboratories, UK). Для активации клеток и индукции образования ими ЛАФ использовали ЛПС Е. coli (Sigma) в концентрации 200 мкг/мл, а также пептиды в конечных концентрациях 0.0025 нг/мл, 0.025 нг/мл и 0.25 нг/мл.

Лимфоцит-акгивирующие свойства инкубатов макрофагов оценивали по их способности оказывать комитогенное действие на пролиферацию мышиных тимоцитов, стимулированных Кон А в субоптимальной дозе 0.625 мкг/мл. За единицу активности ЛАФ принималась такая его концентрация (в мл), которая вызывала усиление пролиферации тимоцитов, равное 50% от значения еб максимальной стимуляции при действии Кон А в субоптимальной дозе.

Статистическая обработка результатов. Результаты исследования обработаны статистически с применением критерия t Сгьюдента. Данные представлены в виде средних значений ± ошибка среднего. Различия считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Цитотокснческая активность натуральных киллерных клеток селезенки крыс после электроболевого раздражения задних конечностей и действия пилона, эпнталона и кортагена

В первом подразделе работы исследованы стресс-индуцированные изменения цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электроболевым раздражениям задних конечностей в двух режимах, а также возможность их коррекции с помощью коротких синтетических пептидов - вилона, эпиталона и кортагена.

Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки нестрессированных крыс под действием коротких пептидов

Установлено, что спленоциты интактных и контрольных животных (подвергнутых ложному электроболевому раздражению), оказывают цитотоксическое действие на клетки опухолевой линии К-562, обычно используемые для проведения такого рода исследований [Фрейдлин И.С., 1998; Ярилин A.A., 1999] (рис. 1). Специфическая активность спленоцитов интактных животных при соотношении эффекторгмишень = 50:1 составляла 30±5%, контрольных животных - 32±6%. Вилон и эпиталон усиливали цитотоксическое действие НК-клеток селезенки нестрессированных (интактных и контрольных) крыс во всем диапазоне использованных концентраций (0.0625 х 103 — 1.0 х 103 нг/мл). Кортаген, напротив, не вызывал достоверного увеличения цитотоксической активности НК-клеток селезенки, а в концентрации 0.0625 х 103 нг/мл даже подавлял ее (рис. 1).

Интакт Контроль 10 0 5

0 25 0125 0 0625

ш Вилон в Эпиталон □ Кортаген

Рис. 1. Модулирующее действие вилона, эпиталона и кортагена на цитотоксическую активность НК-клеток селезенки нестрессированных крыс.

Примечание: по оси абсцисс - концентрация пептидов (х * 103 нг/мл); по оси ординат -% специфической цитотоксичности;

* - р<0,05 по сравнению с цитотоксической активностью НК-клеток интактных и контрольных животных.

Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых двукратному (по 30 мин каждое) электрораздражению задних конечностей, под действием коротких пептидов

Через 20 час после окончания повторного 30-минутного электроболевого раздражения задних конечностей крыс, цитотоксическая активность НК-клеток селезенки существенно возрастала до 57±7% по сравнению с уровнем цитотоксичности спленоцитов интактных и контрольных животных.

При добавлении в инкубационную среду вилона в концентрациях от 0.125 х 1О3 до 1.0 х 103 нг/мл и эпиталона во всех использованных концентрациях происходило снижение цитотоксической активности НК-клеток. При концентрациях эпиталона 0.5 х 103, 0.25 х 103 и 0.0625 х 103 нг/мл цитотоксическая активность НК-клеток практически возвращалась к уровню базальной активности спленоцитов интактных и контрольных крыс. Кортаген только в концентрациях 0.125 х 103 и 0.5 х 103 нг/мл вызывал снижение цитотоксичности НК-клеток до 38 - 39±7%.

Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых однократному (в течение 1 часа) электрораздражению

задних конечностей, под действием коротких пептидов Однократное длительное электрораздражение задних конечностей через 2 часа после прекращения процедуры стрессирования приводило к существенному снижению цитотоксической активности НК-клеток селезенки (с 39±5% у интактных и 37±7% у контрольных животных до 5±1% у стрессированных). Вилон вызывал повышение цитотоксической активности НК-клеток, сниженной в результате электроболевого воздействия. Эпиталон также усиливал цитотоксичность НК-клеток, восстанавливая ее до значений базальной активности клеток у интактных и контрольных животных Кортаген повышал нарушенную в результате электроболевого воздействия цитотоксическую активность НК-клеток селезенки до значений базального уровня у интактных и контрольных животных, а при трех использованных концентрациях (1.0 х 103, 0.25 х 103 и 0.125 х 103 нг/мл) - достоверно выше этих уровней.

Таким образом, пептиды вилон и эпиталон (в отличие от кортагена) при внесении их в суспензию спленоцитов нестрессированных крыс в использованных концентрациях вызывают повышение цитотоксической активности НК-клеток селезенки. Концентрации пептидов выбраны, исходя из данных экспериментов, в которых были исследованы их иммуномодулирующие эффекты в условиях in vitro [Морозов В.Г. и соавт., 2000].

Режимы электроболевого раздражения конечностей, известного в литературе как «foot-shock» [Endo Y., Shiraki К., 2000; Bruijnzeel A.W., 2001], были отработаны специально для проведения настоящего исследования. При использовании этих моделей стресса установлено, что стресс-обусловленные изменения функциональной активности спленоцитов зависят от временного режима электроболевого воздействия кратковременное двукратное (по 30 мин каждое) электроболевое раздражение при условии забора материала через 20 час, приводит к стимуляции цитотоксической активности НК-клеток селезенки, а длительное однократное воздействие с удалением селезенки через 2 часа после его окончания, вызывает подавление цитотоксичности спленоцитов.

Установлено, что вилон, эпиталон и кортаген обладают модулирующим действием на цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, нарушенную в результате элехтроболевых воздействий в различном режиме Отличительной особенностью действия эпиталона является то, что он в трех использованных концентрациях восстанавливает до базального уровня цитотоксическую активность НК-клеток селезенки, повышенную после двукратного электроболевого воздействия, и в четырех концентрациях - сниженную после жесткого однократного электрораздражения, оказывая нормализующее действие на нарушенную функциональную активность спленоцитов.

В литературе представлены лишь единичные данные, подтверждающие нормализующее действие эпиталона на функции клеток, измененные при стрессе: эпиталон в концентрации 100 нг/мл восстанавливает до базального уровня активность нейтральной сфингомиелиназы - ключевого фермента трансдукции сигнала ИЛ-ip по сфингомиелиновому пути, подавленную при иммуносупрессирующем стрессорном воздействии [Khavinson V.Kh. et al., 2002].

Сравнивая эффекты действия вилона, эпиталона и кортагена в норме и при стрессе, необходимо подчеркнуть, что все три исследованных пептида оказывают модулирующее (а эпиталон - нормализующее) действие на проявления функциональной активности НК-клеток. нарушенной в результате стрессорного воздействия, повышая сниженную и понижая повышенную активность и проявляя, таким образом, стресс-протекторные эффекты.

Кортаген, не изменяющий цитотоксическую активность НК-клеток контрольных животных, обладает наиболее выраженным эффектом действия в отношении подавленной цитотоксичности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых жесткому однократному электороболевому стрессу, проявляя себя как наиболее мощный

стимулятор нарушенной цитотоксической активности НК-клеток селезенки Необходимо подчеркнуть, что наибольшую значимость как потенциальных лекарственных средств приобретают те пептиды, которые не вмешиваются в нормально протекающие физиологические процессы, но оказывают корригирующее действие в условиях измененных функций иммунной системы. В настоящем исследовании таким пептидом является кортаген.

Пролиферативвая активность тимоцитов мышей, стимулированных Конканавалином А и ннтерлейкином-1 р, при ротационном и комбинированном стрессе, а также действии вилоиа, эпиталона и кортагена Следующим этапом работы явилось исследование изменения пролиферативной активности тимоцитов мышей, подвергнутых ротационному и комбинированному стрессорным воздействиям, и возможности их коррекции вилоном, эпиталоном и кортагеном, а также анализ модулирующего влияния этих пептидов на проявление комитогенного действия цитокина ИЛ-ip - одного из ключевых свойств этого важнейшего регулятора защитных функций организма.

В работе использованы две модели экспериментального стресса на мышах (CBAxC57BLe)Fi, применение которых позволило провести сравнительное исследование эффектов кратковременного, нетравмирующего ротационного воздействия и изменений пролиферативной активности тимоцитов при сильном и длительном комбинированном воздействии [Корнева Е.А. и соавт , 2000].

Установлено, что после аппликации ротационного стресса не отмечается появления деструкций секреторного отдела слизистой желудка, практически не изменяется масса тимуса и селезенки. Аппликация комбинированного стресса индуцировала изменения со стороны тимико-лимфатической системы' в 1,9 раза снижалась масса тимуса ив 1,36 раза - масса селезенки. В слизистой желудка образовывалось большое количество эрозий (11,3 ± 2,6 на мышь).

Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов нестрессироваяных мышей При исследовании возможного прямого митогенного действия вилона, эпиталона и кортагена на РБТТ установлено, что ни один из исследуемых пептидов в диапазоне концентраций 2.5 х 10"1; 2 5 х 10"3; 2.5 х 10"5; 2.5 х 10'7 и 2.5 х 10'9 нг/мл не проявляет прямого митогенного эффекта: в отсутствие лектина и рИЛ-ip они не индуцируют РБТТ. Полученные результаты соответствуют данным литературы, подтверждающим отсутствие прямого митогенного действия вилона и эпиталона [Григорьев Е.И. и соавт., 2003].

Из трех исследованных пептидов только вилон в концентрациях 2.5 х 10"5 и 2 5 х 10"7 нг/мл обладал как комитогенным действием на пролиферацию мышиных тимоцитов, стимулированных Кон А в субоптимальной дозе, так и потенцирующим эффектом в отношении комитогенного действия рИЛ-1р.

Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов мышей при ротационном стрессорном воздействии

Установлено, что ротационный стресс стимулирует пролиферативную активность тимоцитов мышей, вызванную действием Кон А в субоптимальной дозе и усиленную комитогенным действием рИЛ-1 р (в отсутствие исследуемых пептидов). Добавление к инкубируемым тимоцитам вилона не приводило к достоверному изменению интенсивности РБТТ у стрессированных животных, стимулированных Кон А или Кон А + рИЛ-1 р. Эпиталон при сочетанном действии на клетки Кон А и рИЛ-1(3 усиливал РБТТ (в среднем на 90-120%) в широком диапазоне концентраций от 2.5 х 10"3 до 2.5 х 10"'. При инкубации тимоцитов с Кон А + рИЛ-1Р, кортаген усиливал РБТТ в концентрациях 2 5 х 10"5 и 2.5 х 10"' нг/мл. Оба пептида в присутствии только Кон А (без рИЛ-1 Р) не вызывали изменения интенсивности РБТТ у стрессированных животных.

Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов мышей при комбинированном стрессорном воздействии

В отличие от ротационного стресса, комбинированное воздействие, вызванное охлаждением и иммобилизацией мышей, вызывало снижение уровня РБТТ на 46% при инкубации клеток с Кон А и на 68% - при инкубации тимоцитов с Кон А + рИЛ-1 р Внесение с инкубационную среду вилона, в 4-х из 5-ти использованных концентраций, приводило к повышению интенсивности РБТТ у стрессированных животных при инкубация клеток с Кон А, а также с Кон А совместно с рИЛ-1 р. Эпиталон был эффективен в качестве стимулятора РБТТ стрессированных животных в концентрациях 2.5 х 10"' и 2.5 х 10"9 нг/мл при инкубации тимоцитов с Кон А, и во всех использованных концентрациях при инкубации с Кон А + рИЛ-1р (рис. 2). Добавление к клеткам кортагека не вызывало изменения интенсивности РБТТ у стрессированных животных при инкубации тимоцитов с Кон А. При инкубации клеток с Кон А + рИЛ-1 р, кортаген во всем диапазоне концентраций усиливал РБТТ стрессированных животных.

Рис. 2. Влияние эпиталона на пролиферацию мышиных тимоцитов, стимулированных Конканавалином А в субоптимальной дозе (0,75 мкг/мл) и Конканавалином А + интерлейкин-1 р после комбинированного стрессорного воздействия.

Примечание: по оси абсцисс - концентрация эпиталона в пробах, 2.5 х 10("х' нг/мл; по оси ординат - включение 3Н-тимидина, % к контролю; И - р<0,05 по сравнению с уровнем РБТТ у интактных и контрольных животных; * - р<0,05 по сравнению с тем же показателем у стрессированных животных.

Установленное в работе потенцирующее действие всех трех пептидов на комитогенную активность ИЛ-1р находится в русле теории континуума регуляторных пептидов [Ашмарин И.П., Обухова М.Ф, 1986], согласно которой именно взаимное модулирующее действие пептидных биорегуляторов и обеспечивает множественность оттенков их биологических эффектов и влияние на физиологические функции организма Оно согласуется с результатами исследования, в котором было продемонстрировано свойство вилона и эпиталона усиливать сигнальные эффекты ИЛ-1Р в иммунокомпетентных и нервных клетках [Хавинсон В.Х. и соавт., 2002; КЬауимоп У.КЬ. ег а1., 2002].

Таким образом, вилон не изменяет интенсивность РБТТ у животных, подвергнутых действию ротационного стресса, однако повышает интенсивность РБТТ, сниженную в результате комбинированного стрессорного воздействия, при инкубации клеток с Кон А, а также с Кон А + рИЛ-1р. В отличие от вилона, эпиталон в условиях как ротационного, так и комбинированного стресса вызывает усиление РБТТ

при стимуляции клеток Кон Л и усиливает комитогенное действие рИЛ-lß при ротационном и комбинированном стрессорных воздействиях (рис. 2). Кортаген при инкубации тимоцитов с Кон А не изменяет интенсивность РБТТ у мышей как после ротационного, так и после комбинированного стресса, однако при инкубации тимоцитов сочетано с Кон А + рИЛ-lß, кортаген в концентрациях 2.5 х 10'5 и 2.5 х 10"9 нг/мл усиливает РБТТ мышей после ротационного стрессорного воздействия и при всех концентрациях - после аппликации комбинированного стресса.

Выбор использованного диапазона доз обусловлен современной точкой зрения на высокую биологическую активность пептидов в чрезвычайно малых концентрациях [Сазанов JI.A , Зайцев С.В , 1992; Кременпова A.B., 1998]. Поэтому особый интерес представляют полученные в настоящем исследовании данные о том, что активность пептидов и тенденции их действия проявлялись при слабом разведении исходных препаратов и сохранялись в условиях их экстремально низких концентраций 2.5 х 10"7, 2.5 х 10"' нг/мл.

Продукция лимфоцит-актнвнрующих факторов перитонеальными макрофагами мышей при старении, стрессе и действии вилона, кортагена и эпиталоиа

Старение, так же как и стресс, сопровождается нарушениями работы иммунной системы [Борисова A.M. и соавт., 1999; Полякова В.О и соавт., 2001; Uemuia К. et al., 2002; Анисимов В Н., 2003; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003] Поэтому исследование изменения защитных функций при стрессе целесообразно сочетать с анализом этих изменений при старении Задачей третьего этапа работы явилось исследование особенностей продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей в норме и при стрессе, а также модулирующего действия на нее коротких пептидов. Влияние коротких пептидов на продукцию ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей

Резидентные перитонеальные макрофаги как молодых, 2-х месячных, так и старых, 19-20-ти месячных мышей не продуцировали ЛАФ без дополнительной стимуляции. При стимуляции клеток ЛПС in vitro установлено, что продукция ЛАФ у старых мышей выражена на 62,5% слабее, чем у молодых животных (рис. 3).

Вилон, добавленный к клеткам в дозах 0.0025, 0.025 и 0.25 нг/мл, стимулировал продукцию ЛАФ макрофагами молодых и старых мышей как без дополнительной активации клеток, так и при стимуляции их ЛПС (рис 3). Макрофаги молодых мышей также отвечали продукцией ЛАФ на внесение в инкубационную среду кортагена в дозах 0.0025 и 0 025 нг/мл и эпиталона во всех использованных дозах. Однако, в отличие от вилона, оба пептида при всех использованных концентрациях

не стимулировали выделение ЛАФ макрофагами старых мышей. Интенсивность и вектор изменения ЛПС-индуцированной продукции ЛАФ макрофагами молодых и старых мышей под действием пептидов были различными. Стимуляция макрофагов молодых мышей ЛПС, сопровождающаяся добавлением к клеткам эпиталона, во всех использованных дозах приводила к снижению продукции ЛАФ макрофагами, а при добавлении кортагена - только в дозе 0 25 нг/мл Внесение в суспензию макрофагов старых мышей эпиталона сочетало с ЛПС не вызывало изменения ЛАФ-активности инкубатов клеток, в то время как добавление в среду кортагена приводило к ее увеличению.

Рис. 3. Изменение продукции лимфоцит-активирующего фактора перитонеальными макрофагами молодых (А) и старых (Б) мышей под действием вилона.

Примечание: по оси абсцисс - концентрация вилона, нг/мл; по оси ординат -ЛАФ-акгивность, ед/мл х 10"3;

* - р<0,05, ** - р<0,01 по сравнению с тем же показателем продукции ЛАФ (не стимулированной или стимулированной ЛПС) без добавления пептида;

# - р<0,01 по сравнению с показателем ЛПС-индуцированной продукции ЛАФ у старых мышей.

Таким образом, все три исследованных пептида в отсутствие ЛПС индуцируют продукцию ЛАФ макрофагами молодых мышей, при этом наиболее мощным ее индуктором является вилон. Однако только вилон, в отличие от кортагена и эпиталона, обладает таким же действием и на макрофаги старых животных.

Продемонстрированное в работе менее выраженное выделение ЛАФ Макрофагами, стимулированными ЛПС in vitro, у старых, чем у молодых животных, является показателем снижения резерва функциональной активности этих клеток при старении. Результаты исследования согласуются с данными литературы, свидетельствующими не только о развитии с возрастом количественного дефицита I иммуиокомпетентных клеток, но также о снижении их функциональной активности

[Борисова А.М. и соавт., 1999; Полякова В.О. и соавт., 2001; Uemura К. et al., 2002]. Существенным результатом работы стало выявление того, что вилон и кортаген повышают чувствительность к ЛПС макрофагов старых мышей, восстанавливая, функциональную активность этих клеток, сниженную при старении, и проявляя, таким образом, геропротекторные свойства. Отличительной особенностью кортагена является то, что он увеличивает ЛПС-ицдуцированную продукцию ЛАФ макрофагами старых мышей, но не инициирует этот процесс в отсутствие ЛПС.

Полученные результата позволяют также заключить, что изменение продукции ЛАФ макрофагами является одним из возможных механизмов нарушения функций иммунной системы при старении и открывают перспективу их коррекции короткими пептидными иммуномодуляторами.

Влияние коротких пептидов на стресс-индуцированную продукцию ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей

При изучении продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей в норме и ее изменения после ротационного «рессорного воздействия установлено, что в отличие от клеток контрольных животных, макрофаги молодых мышей через 1 час после прекращения аппликации стресса продуцировали ЛАФ без дополнительной стимуляции.

Показано, что стимуляция ЛПС макрофагов, полученных от молодых стрессироваяных животных, вызывала достоверное увеличение продукции ими ЛАФ I по сравнению с тем же показателем у клеток, не стимулированных ЛПС.

Кратковременный ротационный стресс также индуцировал продукцию ЛАФ перитонеальными макрофагами старых мышей, которая была менее выражена, чем у макрофагов молодых животных (1,9 х 103 ед/мл и 3,0 х 103 ед/мл, соответственно). Так же, как и при использовании клеток молодых мышей, дополнительная стимуляция ЛПС макрофагов старых животных после аппликации ротационного стрессорного воздействия приводила к увеличению продукции ими ЛАФ по сравнению с реакцией клеток, не стимулированных ЛПС.

Установлено, что действие вилона, добавленного в дозах 0.0025, 0.025

и 0.25 нг/мл к макрофагам мышей обеих возрастных групп, подвергнутых действию ротационного стресса, сопоставимо с его стимулирующим эффектом действия на продукцию ЛАФ клетками нестрессированных животных. Билон и кортаген усиливают вызванную стрессом и ЛПС-ивдуцированную продукцию ЛАФ макрофагами старых мышей, сниженную по сравнению с тем же показателем у молодых животных, однако кортаген, в отличие от вилона, не обладает таким же эффектом в отношении клеток молодых стрессированных животных, продукцию ЛАФ которыми он либо не изменяет, либо подавляет. Эпиталон оказывает угнетающее действие на стресс- и ЛПС-индуцированную продукцию ЛАФ макрофагами молодых мышей и практически не изменяет ее у клеток старых животных.

Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что старение мышей сопровождается не только уменьшением чувствительности их перитонеальных макрофагов к активирующему действию ЛПС in vitro, но также и снижением их реакции на ротационный стресс, что выражается в угнетении продукции ЛАФ макрофагами старых мышей по сравнению с тем же показателем у молодых животных. Вектор изменения ЛПС-индуцированной продукции ЛАФ макрофагами, как молодых, так и старых стрессированных мышей под действием пептидов сопоставим с тем же показателем у макрофагов животных обеих возрастных групп, не подвергнутых действию стресса. Вилон и кортаген в этих сериях экспериментов проявляли стресс-протекгорные эффекты.

Таким образом, впервые показано различное по своей направленности модулирующее действие пептидов вилона, кортагена и эпиталона на продукцию ЛАФ стимулированными ЛПС макрофагами молодых и старых мышей, как нормальными, нестрессированными, так и подвергнутыми действию кратковременного ротационного стресса.

Результаты работы, раскрывающие особенности изменения функциональной активности различных популяций иммунокомпетентных клеток в условиях различных видов стресса и при старении являются фундаментальной предпосылкой для разработки способа использования коротких пептидов с целью коррекции возрастных и стресс-индуцированных нарушений защитных функций организма.

ВЫВОДЫ

1. Двукратное, по 30 мин каждое, с промежутком в 6 час электроболевое раздражение задних конечностей крыс чЛ^згаг через 20 час приводит к стимуляции

I цитотоксической активности НК-клеток селезенки, а однократное воздействие

в течение 1 часа, через 2 часа после окончания вызывает ее подавление.

2. Пептиды вилон и эпиталон в диапазоне концентраций 1.0 х 105 нг/мл -0.0625 х 103 нг/мл повышают цитогоксическую активность НК-клеток селезенки нестрессированных крыс и снижают цитотоксичность НК-клеток, повышенную после двукратного электрораздражения. Вилон, эпиталон и кортаген усиливают цитогоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, подавленную после однократного электроболевого воздействия. Эпиталон оказывает нормализующее действие на цитотоксичность спленоцитов, измененную в результате электроболевых воздействий в двух режимах, восстанавливая ее до уровня базальной активности.

3. Вилон в концентрациях 2.5 х 10"5 и 2.5 х 10"7 нг/мл оказывает комитогенное действие на индуцированную Кон А пролиферацию тимоцитов мышей (СВАхС57В1>б)р1 и потенцирует комитогенное действие ИЛ-1р. Эпиталон и кортаген не проявляют этих эффектов.

4. В реакции бласттрансформации мышиных тимоцитов, стимулированных Кон А, вилон в концентрациях 2.5 х (10"', 10'3, 10~7, 10"9) нг/мл и эпиталон в концентрациях 2.5 х 10"' и 2.5 х 10"9 нг/мл вызывают повышение цролиферативной активности клеток, угнетенной при комбинированном «рессорном воздействии, а при аппликации

д ротационного стресса - не влияют на нее. Кортаген не изменяет интенсивность

пролиферации тимоцитов у животных, подвергнутых обоим видам стресса.

5. Эпиталон и кортаген в диапазоне концентраций 2.5 х 10"' - 2.5 х 10"' нг/мл

потенцируют комитогенное действие ИЛ-1(3 в реакции бласттрансформации тимоцитов

мышей, подвергнутых как ротационному, так и комбинированному стрессорным

воздействиям Вилон обладает таким свойством только при комбинированном стрессе.

6. Продукция ЛАФ стимулированными ЛПС перитонеальными макрофагами старых, 19-20-ти месячных мышей на 62,5% слабее, чем клетками молодых, 2-х месячных животных. Ротационный стресс индуцирует образование ЛАФ макрофагами старых мышей менее выражено, чем клетками молодых животных.

7. Вилон, эпиталон и кортаген в дозах 0.00025, 0.025, 0.25 нг/мл индуцируют продукцию ЛАФ макрофагами молодых мышей; из трех исследованных пептидов только вилон обладает таким же действием на макрофаги старых мышей. Вилон и кортаген в тех же дозах повышают чувствительность к ЛПС макрофагов старых мышей, восстанавливая активность этих клеток, сниженную при старении.

8. Вилон во всех дозах усиливает вызванную стрессом и ЛПС-индуцированную на фоне стресса продукцию ЛАФ макрофагами старых и молодых мышей; кортаген обладает таким действием только в отношении клеток старых животных.

9. Изменение функциональной активности НК-клеток селезенки крыс, тимоцитов и перитонеальных макрофагов мышей является информативным показателем развития стресс-ивдуцированных и возрастных нарушений функций иммунной системы. Короткие синтетические пептиды могут рассматриваться как модуляторы нарушенных функций иммунной системы, обладающие стресс- и геропротекторными свойствами.

Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН и лично к.м.н. С.Н. Шанину, И А. Козинец и З.А. Венскаускас за помощь в проведении экспериментальной части работы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние иммуномодулирующих пептидов на функциональную активность НК-клеток при стрессе / А.В. Гумен, С.Н. Шанин, В.В. Малинин // Аллергология и иммунология. - 2003. - Т. 4, № 2. - С. 72.

2. Влияние коротких пептидов на продукцию лимфоцит-акгивирующих факторов макрофагами у мышей разного возраста / А.В. Гумен, С.Н. Шанин, И.А. Козинец, В.В. Малинин, В.Г. Морозов // П Российский Симпозиум по химии и биологии пептидов. - Санкт-Петербург, 25-27 мая 2005. - С. 40.

3. Изменение пролиферативной активности тимоцитов мышей и цитотоксической активности НК-клеток селезенки при стрессе и их коррекция короткими иммуномодулирующими пептидами / С.Н. Шанин, А.В. Гумен, И.А. Козинец,

B.В. Малинин, Е.Г. Рыбакина // Третий Российский Конгресс по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем». - Москва, 9-12 ноября 2004. -С. 109

4. Продукция лимфоцит-активирующих факторов макрофагами мышей при старении и действии коротких иммуномодулирующих пептидов / А.В. Гумен, И.А. Козинец,

C.Н. Шанин, В.В. Малинин, Е.Г. Рыбакина // Патогенез. - 2006. - Т. 4, № 1. - С. 45-46.

5. Продукция лимфоцит-активирующих факторов макрофагами мышей при стрессе и старении модулирующее действие синтетических пептидных биорегуляторов / А.В. Гумен, Е Г. Рыбакина, И.А. Козинец, С.Н. Шанин, В.В. Малинин // Медицинская Иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3 - С. 133-134.

6. Цитотоксическая активность натуральных киллерных клеток селезенки крыс при стрессе и ее коррекция короткими иммуномодулирующими пептидами / А.В. Гумен, С.Н. Шанин, И А. Козинец, В.В. Малинин, Е.Г. Рыбакина // Цитокины и воспаление. - 2006. - Т. 5, № 2. - С. 37-41.

7. LAF production during aging and its correction / A.V. Gumen, S.N. Shanin, I.A Kozinets, V.V. Malinin, E.G. Rybakina // The 6-th Meeting of the International Society for Neuroimmunomodulation. - Athens, Greece, September 25-28,2005. - P. 89.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ - Интерлейкин

Кон А - Конканавалив А

ЛАФ - Лимфоцит-активирующий фактор

ЛПС - Липополисахарид

НК-клеткя - Натуральные киллерные клетки

РБТТ - Реаклия бластгрансформации тимоцитов

рИЛ-lß - Рекомбинантный интерлейкин-1 бета

ФИО - Фактор некроза опухолей

ГУМЕН A.B. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ СТРЕССЕ И СТАРЕНИИ: МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ // Автореф. дис.

_канд. биол. наук: 14.00.53., 14.00.36. - СПб., 2006. - 23 с._

Подписано в печать 22.05.2006. Формат 60*84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ 60 .

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ «ЛЭТИ» Издательство СПбГЭТУ «ЛЭТИ» 197376, С -Петербург, ул. Проф. Попова, 5

I»

г

/*

/урлз

1814923

Актуальность проблемы

Исследование механизмов дисфункций иммунной системы при стрессе и старении, а также возможности коррекции стресс-индуцированных и возрастных нарушений функциональной активности иммунокомпетентных клеток, представляет собой одно из основных направлений развития современной иммунологии, иммунофизиологии и геронтологии.

В настоящее время изучение защитных реакций организма при стрессе становится все более актуальным. Хотя стресс как таковой не является патологией, стрессорная реакция сопровождает развитие практически любого патологического процесса и вызывает изменения функциональной активности клеток иммунной системы. В экспериментальных моделях и наблюдениях на людях в последние годы подтверждается возможность не только негативного, подавляющего, но и активирующего эффекта стрессорных воздействий на функции иммунной системы [Фролов Б.А. и соавт., 1993; Lauc G. et al., 1998; Корнева Е.Г. и соавт., 2000; Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А., 2002, 2005].

Реакции хронического стресса по своему физиологическому значению приближены к процессам старения: в последние годы экспериментально подтверждается представление о том, что возрастные изменения в организме в большой мере обусловлены снижением уровня активности защитных функций [Борисова A.M., 1999; Полякова В.О. и соавт., 2001; Uemura К. et al., 2002; Анисимов В.Н., 2003; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003а]. Поэтому экспериментальный стресс может быть использован в исследованиях в определенной степени и как модель старения.

При исследовании возрастных, а также стресс-индуцированных нарушений функций иммунной системы, информационно значимым является проведение анализа изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, определяющих уровень защиты организма. Один из таких показателей - изменение продукции мононуклеарными фагоцитами лимфоцит-активирующих факторов (ЛАФ), важнейшими компонентами которых являются цитокины интерлейкин-1 (ИЛ-1), ИЛ-6 и фактор некроза опухолей-а (ФНО-а) [Rosenwasser L.J., Dinarello С.А., 1981; Симбирцев А.С. и соавт., 1987; Korneva Е.А. et al., 1997; Rybakina E.G. et al., 1997b]. Представляется целесообразным и перспективным исследование изменения продукции ЛАФ макрофагами при старении.

Решающим для функционирования иммунной системы является свойство ИЛ-1 - регулятора защитных функций организма и медиатора взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем, усиливать пролиферацию тимоцитов и лимфоцитов, вызванную лектинами [Dinarello С.А., 1991, 1996; Turnbull A.V., Rivier C.L., 1999; Корнева Е.А. и соавт., 2000]. Оценка комитогенного действия ИЛ-1 - одной из ключевых его функций, также позволяет получить важную информацию о состоянии защитных реакций при дестабилизирующих воздействиях, в том числе и при стрессе.

Информативным тестом, который может способствовать раскрытию механизмов нарушений защитных реакций организма при различных дестабилизирующих воздействиях, является анализ изменения цитотоксической активности натуральных киллерных (НК) клеток — субпопуляции лимфоцитов, обладающих противовирусными и противоопухолевыми свойствами и отличающихся особой чувствительностью к действию стресса [Laudenslager М. et al., 1999; Ben Eliyahu S. et al., 1999, 2000; Gan X. et al., 2002; Ishihara Y. et al., 2002; Shanin S.N. et al., 2005].

В настоящее время актуальной проблемой остается поиск путей коррекции функций иммунной системы, в частности, функциональной активности иммунокомпетентных клеток, нарушенных при стрессе и старении.

Одним из перспективных направлений решения этого вопроса представляется использование синтетических пептидов, созданных на основе анализа аминокислотного состава эндогенных полипептидных регуляторов: вилона, эпиталона и кортагена, иммуномодулирующая, стресс-и геропротекторная активность которых показана в ряде лабораторных исследований и клинических наблюдений [Morozov V.G., Khavinson V.Kh., 1997; Киселева Е.П. и соавт., 1999; Khavinson V.Kh. et al., 2001; Хавинсон B.X. и соавт., 2002а, б, в; Колосова Л.И. и соавт., 2002; Щеголев Б.Ф. и соавт., 2003; Хавинсон В.Х., Кветная Т.В., 2005]. Цель и задачи исследования

Целью работы явилось комплексное изучение изменений функциональной активности трех популяций иммунокомпетентных клеток при стрессе и старении и исследование возможности их коррекции короткими синтетическими пептидами. В задачи работы входило:

1. Изучение стресс-индуцированных изменений цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электроболевым раздражениям задних конечностей в двух режимах и действия коротких синтетических пептидов — вилона, эпиталона и кортагена.

2. Исследование изменений пролиферативной активности тимоцитов мышей, подвергнутых ротационному и комбинированному стрессорным воздействиям, и возможности их коррекции вилоном, эпиталоном и кортагеном, а также анализ модулирующего влияния этих пептидов на проявление комитогенного действия ИЛ-1 р.

3. Сравнительное изучение особенностей продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей в норме и при ротационном стрессорном воздействии, а также модулирующего действия на нее вилона, эпиталона и кортагена. Научная новизна исследования

Проведенное исследование позволило выявить ряд характерных особенностей развития защитных реакций организма при стрессе и старении. Для этой цели использован комплекс тестов, характеризующих уровень активности защитных функций организма: изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами мышей и пролиферативной активности тимоцитов мышей.

Приоритетный характер носят полученные данные о том, что старение мышей сопровождается уменьшением чувствительности их перитонеальных макрофагов к активирующему действию ЛПС in vitro, а также снижением реакции клеток на иммуностимулирующий ротационный стресс, что выражается в угнетении продукции ЛАФ макрофагами старых мышей по сравнению с тем же показателем у молодых животных.

Впервые проведено комплексное исследование влияния коротких синтетических пептидов вилона, эпиталона и кортагена на функциональную активность трех популяций иммунокомпетентных клеток, измененную как при стимулирующем, так и угнетающем стрессорных воздействиях. Получены новые данные, подтверждающие стресс- и геропротекторное действие исследованных пептидов. Теоретическая и практическая значимость работы

Представленная работа, посвященная исследованию изменений ряда показателей защитных функций организма: цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами мышей и пролиферативной активности тимоцитов мышей, при стрессе и старении, а также действия на них коротких пептидов, носит фундаментальный характер. Основное теоретическое значение работы состоит в демонстрации изменения функциональной активности ряда популяций иммунокомпетентных клеток как мишеней для действия стресса, а также пептидных иммуномодуляторов. Результаты исследования расширяют сложившееся представление о возрастных изменениях функций иммунной системы.

Установленное иммуномодулирующее, а в ряде случаев нормализующее действие коротких пептидов на измененную при действии стресса различной природы, длительности и интенсивности, а также при старении, функциональную активность иммунокомпетентных клеток экспериментальных животных, является предпосылкой для дальнейшего исследования стресс- и геропротекторных свойств этих препаратов. Полученные новые результаты являются фундаментальной основой для дальнейшего обоснования применения вилона, эпиталона и кортагена в клинической практике с целью коррекции стресс-индуцированных и возрастных нарушений функций иммунной системы. Основные положения, выносимые на защиту

1. Электроболевое раздражение задних конечностей крыс приводит к стимуляции или угнетению цитотоксической активности НК-клеток селезенки в зависимости от временного режима воздействия. Вилон, эпиталон и кортаген модулируют цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электрораздражению задних конечностей в двух режимах. Эпиталон оказывает нормализующее действие на цитотоксичность спленоцитов, измененную в результате обоих видов электроболевых воздействий, восстанавливая ее до уровня базальной активности.

2. В реакции бласттрансформации мышиных тимоцитов, стимулированных Кон А, вилон и эпиталон вызывают повышение пролиферативной активности клеток, угнетенной при комбинированном стрессорном воздействии, а при аппликации стимулирующего ротационного стресса - не влияют на нее. Кортаген не изменяет интенсивность пролиферации тимоцитов у животных, подвергнутых обоим видам стресса.

3. При ротационном и комбинированном стрессорных воздействиях на мышей эпиталон и кортаген потенцируют комитогенное действие KJI-ip. Вилон обладает таким свойством только при комбинированном стрессе.

4. Продукция ЛАФ стимулированными ЛПС перитонеальными макрофагами старых, 19-20-ти месячных мышей на 62,5% слабее, чем клетками молодых, 2-х месячных животных. Ротационный стресс индуцирует образование ЛАФ макрофагами старых мышей менее выражено, чем клетками молодых животных.

5. Вилон, эпиталон и кортаген индуцируют продукцию ЛАФ макрофагами молодых мышей; вилон обладает таким же действием на макрофаги старых мышей. Вилон и кортаген повышают чувствительность к ЛПС макрофагов старых мышей, восстанавливая активность этих клеток, сниженную при старении.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на 5-м Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003), на 3-м Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), 2-м Российском Симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 6-м Международном конгрессе Международного общества по нейроиммуномодуляции (Афины, Греция, 2005). Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Структура и объем диссертации

выводы

1. Двукратное, по 30 мин каждое, с промежутком в 6 час электроболевое раздражение задних конечностей крыс Wistar через 20 час приводит к стимуляции цитотоксической активности НК-клеток селезенки, а однократное воздействие в течение 1 часа, через 2 часа после окончания вызывает ее подавление.

2. Пептиды вилон и эпиталон в диапазоне концентраций 1.0 х 103 нг/мл — 0.0625 х 103 нг/мл повышают цитотоксическую активность НК-клеток селезенки нестрессированных крыс и снижают цитотоксичность НК-клеток, повышенную после двукратного электрораздражения. Вилон, эпиталон и кортаген усиливают цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, подавленную после однократного электроболевого воздействия. Эпиталон оказывает нормализующее действие на цитотоксичность спленоцитов, измененную в результате электроболевых воздействий в двух режимах, восстанавливая ее до уровня базальной активности.

3. Вилон в концентрациях 2.5 х 10"5 и 2.5 х 10"7 нг/мл оказывает комитогенное действие на индуцированную Кон А пролиферацию тимоцитов мышей (CBAxC57BL6)Fi и потенцирует комитогенное действие ИЛ-1 р. Эпиталон и кортаген не проявляют этих эффектов.

4. В реакции бласттрансформации мышиных тимоцитов, стимулированных Кон А, вилон в концентрациях 2.5 х (10"1, 10"3, 10"7, 10'9) нг/мл и эпиталон в концентрациях 2.5 х 10"1 и 2.5 х 10"9 нг/мл вызывают повышение пролиферативной активности клеток, угнетенной при комбинированном стрессорном воздействии, а при аппликации ротационного стресса - не влияют на нее. Кортаген не изменяет интенсивность пролиферации тимоцитов у животных, подвергнутых обоим видам стресса.

5. Эпиталон и кортаген в диапазоне концентраций 2.5 х 10"1 - 2.5 х 10'9 нг/мл потенцируют комитогенное действие RJI-ip в реакции бласттрансформации тимоцитов мышей, подвергнутых как ротационному, так и комбинированному стрессорным воздействиям. Вилон обладает таким свойством только при комбинированном стрессе.

6. Продукция ЛАФ стимулированными ЛПС перитонеальными макрофагами старых, 19-20-ти месячных мышей на 62,5% слабее, чем клетками молодых, 2-х месячных животных. Ротационный стресс индуцирует образование ЛАФ макрофагами старых мышей менее выражено, чем клетками молодых животных.

7. Вилон, эпиталон и кортаген в дозах 0.00025, 0.025, 0.25 нг/мл индуцируют продукцию ЛАФ макрофагами молодых мышей; из трех исследованных пептидов только вилон обладает таким же действием на макрофаги старых мышей. Вилон и кортаген в тех же дозах повышают чувствительность к ЛПС макрофагов старых мышей, восстанавливая активность этих клеток, сниженную при старении.

8. Вилон во всех дозах усиливает вызванную стрессом и ЛПС-индуцированную на фоне стресса продукцию ЛАФ макрофагами старых и молодых мышей; кортаген обладает таким эффектом действия только в отношении клеток старых животных.

9. Изменение функциональной активности НК-клеток селезенки крыс, тимоцитов и перитонеальных макрофагов мышей является информативным показателем развития стресс-индуцированных и возрастных нарушений функций иммунной системы. Короткие синтетические пептиды могут рассматриваться как модуляторы нарушенных функций иммунной системы, обладающие стресс- и геропротекторными свойствами.