Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Гепатоцитарные ядерные факторы и опухолевые маркеры при прогрессии гепатокарцином
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.14
Автореферат диссертации по медицине на тему Гепатоцитарные ядерные факторы и опухолевые маркеры при прогрессии гепатокарцином
На правах рукописи
РГ'Л .VI ' > •)
М&АТЛ
Варга Екатерина Владимировна
«Гепатоцитарные ядерные факторы и опухолевые маркеры при прогрессии гепатокарцином»
(14.00.14 - Онкология)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА 2002
Работа выполнена в НИИ Канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина РАМН
Научные руководители:
доктор биологических наук Н.В. Энгельгардт кандидат биологических наук Н.Л. Лазаревич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Б.П.Копнин доктор биологических наук В.Я.Бродский
Ведущая организация:
НИИ Физико-Химической Биологии им. А.Н.Белозерского, МГУ
Защита диссертации состоится «_» «_»2002г.
на заседании Диссертационного Совета (К.001.0.17.01) в Российском Онкологическом Научном Центре РАМН (Москва, 115478, Каширское ш., 24).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Онкологического Научного Центра РАМН.
Автореферат разослан «_» «_»2002г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук Ю.А.Барсуков
£чти11 0.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность проблемы
Отличительной особенностью карцином является то, что после возникновения трансформированного клона его рост долгое время может сдерживаться окружающей нормальной тканью. По мнению Вайнберга (Hanahan and Weinberg 2000), нормализующими факторами могут быть взаимодействия трансформированных клеток с внеклеточным матриксом, межклеточные взаимодействия с нормальными клетками через щелевые контакты и выделяемые нормальными клетками цитокины. Необходимо подчеркнуть, что все эти факторы поддерживают дифференцированный нормальный фенотип исходной ткани.
При эволюции трансформированного клона - его прогрессии -накапливаются мутации, обеспечивающие максимальную пролиферацию клеток, отбираются варианты, независимые от регуляторных систем организма-хозяина, и способные жить на территориях негомологичных тканей, то есть инвазивные и метастазирующие (Абелев 2000). Одновременно наблюдается снижение дифференцировки карцином - как по их морфологии, так и по способности синтезировать тканеспецифические маркеры. Однако, при детальном исследовании коллекции гепатокарцином мышей было показано, что полного исчезновения печень-специфических маркеров в них никогда не наблюдается (Khramkova et al. 1963, Куприна 1965).
Феноменологически процесс антигенного упрощения в гепатокарциномах описан достаточно полно, в то время как молекулярные механизмы, лежащие;в его основе, изучены гораздо хуже, также как и механизмы, обеспечивающие способность карцином к ре-дифференцировке. Между тем, такие исследования важны как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. Повышение уровня дифференцировки в карциномах (в том числе и в гепатоцеллюлярных карциномах (ГК) может увеличить чувствительность опухоли к терапии.
Настоящая работа посвящена исследованию молекулярных механизмов, определяющих снижение дифференцировки при прогрессии гепатоцеллюлярных карцином.
Тогда как для некоторых других тканей известны так называемые «мастер-гены», способные определять направление и уровень дифференцировки однозначным образом, фенотип печени формируется совокупным действием ряда регуляторов, так называемых гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ). Спектры экспрессии этих факторов тканеспецифичны, и их наибольшие количества обнаруживают в печени. Сайты связывания ГЯФ обнаруживают в регуляторных районах большинства известных гепатоспецифических генов. К ГЯФ относят пять семейств факторов: HNF1, С/ЕВР, HNF3, HNF4 и HNF6.
Экспрессия ГЯФ в печени взаиморегулируется, однако связи чрезвычайно сложны. В настоящее время четко показано, что многие из ГЯФ играют ключевые роли в раннем эмбриональном развитии (например, vHNF1 и HNF4 необходимы для формирования висцеральной энтодермы, a HNF3J} играет ключевую роль в закладке печени). Кроме того, недавно показано, что роль фактора HNF4 не ограничивается регуляцией тканеспецифичных генов, этот фактор также является эпителиальным морфогеном [Spath, 1998 #693]. Однако остается неясным, какова роль ГЯФ, и в частности, HNF4, при гепатоканцерогенезе.
В настоящей работе роль ГЯФ в прогрессии гепатоцеллюлярных карцином (ГК) - была исследована на созданной в нашем институте коллекции перевиваемых ГК мыши, полученных из химически индуцированных первичных опухолей. В эту коллекцию входят также две ГК единого происхождения, резко различающиеся по скорости роста и уровню дифференцировки.
1.2. Цели и задачи исследования Целью настоящей работы является исследование роли ГЯФ в прогрессии гепатоцеллюлярных карцином и поиск возможных путей реверсии злокачественного фенотипа. Было запланировано решение следующих экспериментальных задач:
1. Выяснить, как экспрессия гена HNF4 соотносится с уровнем дифференцировки перевиваемых ГК мыши.
2. Проанализировать, какие изменения в экспрессии опухолевых маркеров, ГЯФ, тканеспецифичных регуляторов и генов,
характерных для эпителиального фенотипа, произошли при скачкообразной прогрессии от медленнорастущей цифференцированной ГК к быстрорастущему недифференцированному варианту.
3. Исследовать роль HNF4 в произошедшей скачкообразной прогрессии.
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы
Научная новизна настоящей работы в значительной мере определяется использованной системой. Впервые проведен анализ жспрессии ГЯФ и тканеспецифических регуляторов в ГК мыши in vivo. Сроме того, в работе охарактеризована полученная в нашем институте юдель, включающая медленнорастущую дифференцированную ГК и ;е быстрорастущий дедифференцированный вариант.
В работе показано, что уровень экспрессии гена HNF4 четко оррелирует с уровнем дифференцировки ГК мыши. При :качкообразной прогрессии от медленнорастущей [ифференцированной ГК к быстрорастущему ^дифференцированному варианту происходит полное подавление кспрессии гена HNF4. Продемонстрировано, что эта прогрессия опровождается подавлением экспрессии маркеров ифференцировки - сывороточного альбумина (СА), трансферрина ГФН) и транстиретина (ТТР), подавлением экспрессии генов оннексина 32 и Е-кадхерина, характерных для эпителиального юнотипа и активацией транскрипции пролокомотивного рецептора аминина аЗ интегрина. В ходе исследуемой прогрессии произошло олное подавление экспрессии гелатоцитарных ядерных факторов NF1 и HNF6, и частичное подавление vHNF1, С/ЕВРа и HNF3y. роме того, снизились уровни транскрипции энтодермальных ядерных (акторов GATA4 и GATA6 и изменились уровни экспрессии санеспецифичных ядерных рецепторов FTF и COUP-TFI. Для ^следования роли HNF4 в произошедших изменениях проведена габильная трансфекция клеточной культуры дедифференцированной !патомы векторами, экспрессирующими HNF4. Показано, что сзогенная экспрессия HNF4 активирует транскрипцию патоцитарных ядерных факторов HNF1 и HNF3y и маркера
дифференцировки ТФН, таким образом, под воздействием HNF4 восстанавливается часть гепатоспецифических синтезов. При экзогенной экспрессии HNF4 морфология клеток меняется в сторону эпителиальной и активируется транскрипция гена коннексина 32, таким образом, восстанавливается часть эпителиальных свойств. Нами впервые показано, что при экзогенной экспрессии HNF4 происходит подавление транскрипции ядерного рецептора COUP-TFI и активация транскрипции HNF3y.
Результаты проведенной работы способствуют лучшему пониманию роли ГЯФ в прогрессии ГК и разработке возможных путей ре-дифференцировки ГК и реверсии злокачественного фенотипа.
1.4. Апробация работы
Диссертация апробирована 18 января 2002 года на совместной научной конференции лабораторий иммунохимии опухолей, цитогенетики, механизмов канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза. Материалы диссертации докладывались на 27-ой Ежегодной Конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (27 th FEBS Annual Meeting), 2001 г. Лиссабон, Португалия и Специальной Конференции Американской Ассоциации Раковых Исследований «Мышиные модели Канцерогенеза» (American Association for Cancer Research Special Meeting "Mouse Models of Cancer"), 2000r„ La Jolla, USA.
1.5. Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2.1. Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 12 рисунков. Состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение» и выводов. Список литературы содержит 212 источников, в том числе 8 в отечественных журналах.
2.2. Результаты исследований.
2.2.1. Экспрессия HNF4 коррелирует с уровнем дифференцировки гепатоцеллюлярных карцином.
HNF4 играет существенную роль в поддержании гепатоцитарного фенотипа. Он не только раньше других ГЯФ появляется в онтогенезе, но и в значительной степени определяет уровни их экспрессии. Инактивация гена HNF4 у мышей приводит к существенным нарушениям в формировании висцеральной эндодермы и вызывает смерть эмбрионов на ранней стадии развития (Chen et al. 1994; Duncan et al. 1997). Во многих клеточных пиниях дедифференцированных гепатом экспрессия этого фактора подавлена. Мы решили проверить, как экспрессия гена HNF4 коррелирует с уровнем дифференцировки гепатоцеллюлярных карцином (ГК) in vivo. Для этого мы использовали коллекцию перевиваемых ГК мышей, полученных из первичных опухолей, индуцированных химически. Эти ГК расположили в условный дифференцировочный ряд по морфологическим признакам и скорости роста:
1) мГК-1 - дифференцированная крупноклеточная частично трабекулярная, частично солидная карцинома. Эта опухоль -медленнорастущая, интервалы между пассажами составляют 5-7 месяцев.
2) мГК-2 - дифференцированная трабекулярная карцинома с солидными участками. Интервалы между пассажами также составляют 5-7 месяцев.
3) ГК-3 - дифференцированная опухоль, состоявшая из клеток разного размера, сохранившая дольчатое строение. На тканевом срезе ГК-3 заметно много митозов. Интервалы между пассажами составляют 2-3 месяца.
4) ГК-4 - дифференцированная карцинома, однако, с менее регулярным дольчатым строением, чем ГК-3. Клетки в среднем более мелкие, чем в мГК-1, мГК-2 и ГК-3. Интервалы между пассажами составляют 3-4 месяца.
5) ГК-5 - низкодифференцированная опухоль, полностью потерявшая дольчатую структуру. Она состоит из пластов плотных сплющенных клеток с ядрами неровной формы. Пласты клеток разделяются полостями с кровью. Интервалы между пассажами составляют в среднем 2 месяца.
6) 6ГК. Опухоль мГК-1 на третьем пассаже в одной из мышей резко увеличила скорость роста. Полученная быстрорастущая низкодифференцированная ГК (6ГК) - резко анапластическая опухоль, потерявшая балочную структуру. Клетки 6ГК разной формы и размера, преимущественно мелкие, растут массивами, разделенными тяжами внеклеточного матрикса. Интервалы между пассажами составляют 2-3 недели (Энгельгардт и др! 2000).
Характерной чертой 6ГК является очень слабая связь клеток друг с другом и с внеклеточным матриксом. При механическом диспергировании из нее получается суспензия клеток, способная расти in vitro. Полученная культура 6ГК, НЗЗ, состоит из клеток преимущественно веретеновидной формы с прозрачной цитоплазмой и овальными ядрами. На пластике клетки растут диффузно, образуя трехмерные скопления и легко отрываются от подложки. В исходной опухоли мГК-1 и в мГК-2 клетки чрезвычайно прочно связаны друг с другом и с матриксом, клеточных культур из них получить не удалось (Энгельгардт, Кудрявцева и др. 2000).
При Нозерн-блот гибридизации тотальной клеточной РНК из ГК с зондом к HNF4 значительные количества мРНК этого гена были обнаружены в пробах из опухолей с дольчатым строением: в мГК-1, несколько меньшие количества в мГК-2 и ГК-3, кроме того, слабый сигнал был обнаружен в ГК-4, в дедифференцированных ГК-5, 6ГК и культуре НЗЗ выявить сигнал не удалось (рис. 1).
Для более детальной характеристики дифференцировочного статуса ГК мы проверили уровни экспрессии СА и ТФН, которые являются маркерами дифференцировки гепатоцитов. Показано, что для экспрессии гена ТФН существенен сайт связывания HNF4 (Sladek et al. 1990), а основным регулятором СА является HNF1 (Cereghini et al. 1988), ген-мишень HNF4 (Kuo et al. 1992). Такие же
закономерности, что и для транскрипции гена НЫР4, были выявлены и при анализе уровней транскрипции генов СА и ТФН (рис. 1).
Таким образом, в проанализированной нами коллекции гепатокарцином существует прямая корреляция между морфологическими признаками дифференцировки, экспрессией гепатоспецифических маркеров дифференцировки СА и ТФН и статусом гепатоцитарного регулятора НЫР4.
В дальнейшем мы перешли к изучению свойств скачкообразной прогрессии от мГК-1 к 6ГК, в результате которой произошло значительное увеличение скорости роста (интервалы между пассажами составляют 5-7 месяцев для мГК-1 и 2-3 недели для 6ГК), полная утрата полярности клеток, резкое ослабление межклеточных контактов и связи с внеклеточным матриксом, значительное снижение или прекращение экспрессии дифференцировочных маркеров СА и ТФН, и репрессия гена НЫР4. Были также использованы культура НЗЗ и дифференцированная медленнорастущая мГК-2.
ю го
Ю ^Г
1 I
167 157 480 481 НЗЗ 452 421 136 160 139 140
НЫР4
ТФН
СА
99 VI
Рис. 1. Нозерн-блот гибридизация 15 мкг суммарной клеточной РНК из разных ГК с зондами к НЫР4, ТФН, СА. Числами обозначены номера опытных животных, от которых получены пробы ГК. Для контроля количества приведена 28Б РНК.
28Э <; &
■: !< ? • I . :<■> -Щ
2.2.2. Прогрессия сопровождается снижением уровня дифференцировки и утратой эпителиальных свойств.
При прогрессии от мГК-1 к 6ГК произошло подавление транскрипции таких классических маркеров гепатоспецифической дифференцировки, как СА и ТФН. Кроме того, мы обнаружили различия в экспрессии еще одного маркера дифференцировки, транстиретина (ТТР), который транскрибируется на высоком уровне в обеих мГК и не выявляется в 6ГК и НЗЗ (рис. 2). Гены этих маркеров в основном регулируются совместным действием гепатоцитарных ядерных факторов.
Помимо тканеспецифических функций, при прогрессии от мГК-1 к 6ГК оказались затронуты и эпителиальные свойства опухоли. мГК-1 -опухоль с ярко выраженным трабекулярным строением, а клетки 6ГК не обладают полярностью. По наблюдениям Е.И. Кудрявцевой, мГК-1 и мГК-2 обладают чрезвычайно регидным строением: образцы имеют гораздо более плотную фактуру, чем печень, клетки очень прочно связаны друг с другом и с внеклеточным матриксом. В образцах 6ГК, напротив, клетки слабо связаны друг с другом и с матриксом, благодаря чему было легко получить суспензию клеток и перевести ее в культуру in vitro (Энгельгардт и др. 2000). Эти различия опухолей мГК-1 и 6ГК могут быть объяснены тем, что при прогрессии меняется спектр экспрессии некоторых генов, характерных для эпителиального фенотипа. Поэтому мы решили исследовать уровни транскрипции некоторых генов, определяющих эпителиальные свойства гепатоцитов.
В пласте эпителиальных клеток гомотипическую адгезию, а также латеральную полярность обеспечивают белки межклеточных контактов кадхерины, для гепатоцитов самым важным является Е-кадхерин. Методом ОТ-ПЦР мы показали, что уровень мРНК гена Е-кадхерина в мГК-1 очень высок по сравнению с таковым в печени, несколько меньший уровень мГК-2. В быстрорастущем варианте 6ГК и культуре НЗЗ транскрипция этого гена заметно снижена (рис. ЗА). Вероятно, повышение уровня Е-кадхерина в мГК-1 и мГК-2 по сравнению с печенью отражает большее количество клеточных контактов в этих опухолях. В результате исследуемой прогрессии
экспрессия Е-кадхерина подавляется, что ведет к заметному снижению количества контактов между клетками.
Цитоплазматическим партнером Е-кадхерина является р-катенин, который в комплексе с еще несколькими белками осуществляет физическую связь между цитоскелетом и межклеточным контактом. Через это взаимодействие межклеточные контакты могут влиять на форму клетки (Aberle et al. 1996). По результатам ОТ-ПЦР с соответствующими праймерами, уровень мРНК гена р-катенина по сравнению с печенью заметно повышен в мГК-2, мГК-1 и ее производных 6ГК и НЗЗ (рис. ЗА). Таким образом, хотя экспрессия Е-кадхерина подавлена в 6ГК по сравнению с мГК-1, транскрипция р-катенина остается на прежнем уровне. Показано, что если р-катенин не задействован в контактах, стабилизируется в цитоплазме и транслоцируется в ядро в комплексе с факторами TCF/LEF, то этот белок может действовать как транскрипционный фактор, активирующий экспрессию генов, задействованных в пролиферации. Регуляторами этих процессов, помимо Е-кадхерина, являются ряд факторов, в частности LEF-1, способствующий его гранслокации в ядро (Gumbiner 1995; Huber et al. 1996; Miller and Moon 1996). Планируемая проверка уровней экспрессии фактора LEF-1 в нашей системе позволит выяснить возможность перемещения р-катенина в ядро.
Коммуникативные связи в организованном эпителиальном пласте обеспечивают щелевые контакты. Сх32 (коннексин 32) является основным белком щелевых контактов, который экспрессируют гепатоциты (Iwai et al. 2000), и часто утрачивается при трансформации (Krutovskikh et al. 1991; Hennemann et al. 1992). При анализе методом Нозерн-блот гибридизации с зондом к Сх32 высокие уровни экспрессии этого гена (большие, чем в нормальной печени) 5ыли выявлены в мГК-1 и мГК-2 (рис. ЗБ), что согласуется с наблюдениями о том, что обе мГК характеризуются чрезвычайно трочными межклеточными связями. Нам не удалось обнаружить даже ;ледовых сигналов в пробах из 6ГК и НЗЗ (рис. ЗБ). Подавление
Рис. 2. Экспрессия маркера дифференцировки ТТР в мГК-2, мГК-1, 6ГК и НЗЗ. Нозерн-блот гибридизация тотальной клеточной РНК с зондом к ТТР. Для контроля количества приведена 28Б РНК.
А
-О
X СМ ТФ |_ 1_ и П с 2 2 ю I
л
I СМ ТФ 1_ I- и: со с 5 5 ю X
Е-кадхерин [.■
р- катенин
НРЯТ ^ ц
Сх32
аЗ
28Б
Рис. 3. Транскрипция генов, характерных для эпителиального фенотипа печени в мГК-2, мГК-1, 6ГК и НЗЗ. А). ОТ-ПЦР с праймерами к Е-кадхерину и р-катенину. Для контроля количества РНК приведен ОТ-ПЦР с праймерами к НРЯТ. Б) Нозерн-блот гибридизация тотальной клеточной РНК с зондами к Сх32 и аЗ субъеденице интегрина. Для контроля количества приведена 28Б РНК
экспрессии Сх32 в 6ГК и НЗЗ ведет к тому, что клетки образуют крайне мало щелевых контактов друг с другом. На линии гепатомы крысы МН1С1 показано, что важную роль в регуляции гена Сх32 играет НМР1 (Р|'ес1тоск( е( а1. 2000). Наши исследования показали, что в мГК-1 и мГК-2 ген НЫР1 транскрибируется на высоком уровне, а в 6ГК и НЗЗ экспрессия этого гена подавлена (см. 2.2.3.). Это позволяет предположить, что падение экспрессии Сх32 в описанной системе стало следствием репрессии НЫР4 и вызванного этим подавления НЫР1.
Связь клеток с внеклеточным матриксом обеспечивают соответствующие рецепторы, интегрины. Рецептор а301 преимущественно связывается с деградированными стромальными компонентами, экспрессия аЗ субъеденицы интегрина характерна для эмбриональных гепатоцитов и для дедифференцированных гепатом (Уо1реэ е{ а1. 1993; Соиуе1агс1 е1 а1. 1998). При Нозерн-блот гибридизации с соответствующей пробой транскрипты гена аЗ субъеденицы интегрина не были выявлены в обоих мГК, слабый сигнал обнаружен в 6ГК и сильный сигнал в пробе из НЗЗ (рис. ЗБ). Таким образом, при прогрессии в исследуемой системе активируется транскрипция аЗ субъеденицы интегрина. Можно предполагать, что в культуре клетки НЗЗ освобождаются от некого сдерживающего влияния организма, что позволяет им экспрессировать больше «агрессивных» рецепторов матрикса.
Необходимо отметить, что приведенные здесь данные по эпителиальным свойствам опухолей и культур являются частью отдельного, более детального исследования.
Таким образом, прогрессия от мГК-1 к 6ГК сопровождается утратой морфологических признаков дифференцировки, подавлением экспрессии маркеров гепатоспецифической дифференцировки и изменением спектра экспрессии белков, задействованных во взаимодействиях с матриксом и между клетками.
2.2.3. Прогрессия сопровождается изменением спектров экспрессии многих тканеспецифичных регуляторов.
Итак, описываемая нами прогрессия ГК сопровождается резким снижением уровня дифференцировки, в частности утратой маркеров
СА, ТФН и ТТР. Мы предположили, что причиной этого являются изменения в спектре экспрессии тканеспецифических регуляторов. Для проверки этого предположения мы провели сравнение уровней мРНК известных к настоящему времени ГЯФ, важных для развития печени ранних энтодермальных факторов GATA 4 и 6 и некоторых тканеспецифичных ядерных рецепторов, влияющих на фенотип гепатоцитов (факторы COUP-TF и FTF), в мГК-1 и 6ГК.
В мГК-2, мГК-1, 6ГК, НЗЗ и в нормальной печени в сравнимых количествах транскрибируются гены С/ЕВРр и С/ЕВР5 (рис. 4Б), важные для контроля метаболических генов и для регуляции пролиферативного ответа при повреждениях в печени. Кроме того, во всех пробах мы обнаружили примерно равные количества мРНК гена HNF3P, необходимого для закладки печени, и его гена-мишени HNF3a (рис. 4В). Эти данные строго указывают на гепатоцитарное происхождение опухоли 6ГК и ее культуры НЗЗ.
Однако экспрессия остальных ГЯФ при прогрессии от мГК-1 к 6ГК оказалась изменена. При этом уровни мРНК всех проверенных ГЯФ в мГК-1 были сравнимы с таковыми в печени (рис. 4А, Б и В). Как уже упоминалось, прогрессия от мГК-1 к 6ГК сопровождается репрессией гена HNF4. В 6ГК и НЗЗ полностью подавлена транскрипция гена-мишени HNF4, HNF1 (Kuo et al. 1992), важного для регуляции большого количества гепатоспецифических генов (Cereghini 1996) (рис. 4А). Кроме того, прогрессия сопровождается полным подавлением экспрессии гена HNF6, который может активировать транскрипцию гена HNF4 (Samadani and Costa 1996), и, в свою очередь, может быть активирован посредством HNF4 (Lahuna et al. 2000) (рис.4Б и В). При прогрессии оказался частично подавлен фактор С/ЕВРа, который необходим для полностью дифференцированного состояния гепатоцитов (Greenbaum et al. 1995; Flodby et al. 1996) и, по-видимому, важен для высокого уровня транскрипции гена HNF4 во взрослых гепатоцитах (Bailly et al. 2001) (рис. 4Б). Кроме того, в 6ГК и НЗЗ подавлена экспрессия HNF3y (рис. 4А и В). Фактор VHNF1 необходим для раннего эмбрионального развития и для экспрессии HNF4 в висцеральной энтодерме
мГК-2 мГК-1 6ГК
134 139 140 147 136 160 453 471 НЗЗ 452 421 425
нырзу:
НЫР4
НЫР1
•Ж -;,Г л V
28Э
^ Я с **
I Ш ?;"!> ^ • V-» < Й§
XI
X СМ то >= >= £ 2
с 5 5 ю X
Рис. 4. Экспрессия ГЯФ в печени, мГК-2, мГК-1, 6ГК и НЗЗ. А) Нозерн-блот гибридизация тотальной клеточной РНК с зондами к НЫРЗу, НЫР4 и НЫР1. Числами обозначены номера опытных животных, от которых получены пробы ГК. Для контроля количества приведена 28Э РНК. Б) Нозерн-блот гибридизация тотальной клеточной РНК с зондами к vHNF1, НЫРб, С/ЕВРр и С/ЕВР5. Для контроля количества приведена 28Э РНК. В) ОТ-ПЦР с праймерами куНЫР"!, С/ЕВРа, НИРЗа, Н^Зр, НЫРЗу и НЫР6. Для контроля количества РНК приведен ОТ-ПЦР с праймерами к НРЯТ.
В
х СМ тф и 1- 1_ со с 5 5 ю X
Н^б
С/ЕВРа Н^За
с/еврр «л
С/ЕВР5 -
Щ ь V-
28Э .-1
НМРЗу
Н^б „„„ НРГП -..»/**.«»
(Coffinier et ai. 1999). Его транскрипция полностью подавлена в 6ГК и частично в НЗЗ (рис. 4Б и В).
Мы сравнили уровни транскрипции ранних энтодермальных факторов GATA6, необходимого для формирования висцеральной энтодермы и экспрессии HNF4, и его мишени GATA4 в исследуемой системе гепатом. Уровни мРНК этих генов в мГК-1 примерно такие же как в печени. При прогрессии транскрипция GATA6 значительно подавляется, a GATA4 - подавляется полностью (рис. 5).
Кроме того, мы исследовали уровни транскрипции некоторых ядерных рецепторов, важных для формирования фенотипа печени. Гепатоспецифичный регулятор FTF, важный для экспрессии альфа-фетопротеина и возможный активатор HNF4, сохраняется в мГК-1, но полностью подавлен в 6ГК и НЗЗ (рис. 5). Факторы COUP-TF являются функциональными антагонистами HNF4. Показано, что эти факторы могут связываться с теми же сайтами, что и HNF4, и таким образом подавлять транскрипцию некоторых генов (см. обзор (Locker 2001). Транскрипция гена COUP-TFI в результате прогрессии активируется (рис. 5). Другой представитель этого семейства, COUP-TFII, транскрибируется на приблизительно равном уровне во всех проверенных пробах (рис. 5).
Поскольку произошедшая прогрессия была скачкообразной, а изменения, сопровождавшие ее, были чрезвычайно резкими, скорее всего, причиной прогрессии послужило качественное изменение в экспрессии неких ключевых регуляторов. Качественные изменения произошли в экспрессии генов HNF1, HNF4, HNF6, GATA4 и FTF. Взаимная регуляция тканеспецифических факторов в печени чрезвычайно сложна, данные о взаимосвязях, полученные на различных экспериментальных моделях, часто неоднозначны. Единственная установленная жесткая связь, наблюдаемая на всех стадиях развития и на всех клеточных линиях, существует между экспрессией HNF4 и транскрипцией HNF1 (Kuo et al. 1992). Единственный фактор, по-видимому обладающий морфогенными свойствами - это опять же HNF4 (Spath and Weiss 1998). Поэтому мы предположили, что репрессия гена HNF4 - очень важный этап в прогрессии от мГК-1 к 6ГК.
GATA4
л
INt-
fflLLLCO с 5 2 ю X
GATA6 ттВ
FTF COUP-TFI COUP-TFII HPRT
*Й
Ч) м iltt
ю' -ц
на **
Рис. 5. Экспрессия ранних энтодермальных факторов и ткане-специфических регуляторов в печени, мГК-2, мГК-1, 6ГК и НЗЗ. ОТ-ПЦР с праймерами к GATA4, GATA6, FTF, COUP-TFI и COUP-TFII. Для контроля количества РНК приведен ОТ-ПЦР с праймерами к HPRT.
,..( Щ
Из возможных активаторов транскрипции гена НЫР4 при |рогрессии от мГК-1 к 6ГК утрачиваются (полностью или в начительной мере) факторы уНЫР1, НЫР1, С/ЕВРа, HNF6, САТА4, ЗАТА6 и РТР. Можно предполагать, что именно совокупное юдавление экспрессии этих регуляторов определяет падение уровня ШР4 при прогрессии. Однако в таком случае должен существовать екий фактор, регулирующий экспрессию всего этого набора канеспецифичных активаторов транскрипции. Существует и другая озможность: в данной системе какой-то один из перечисленных егуляторов обладает способностью определять уровень экспрессии 1ЫР4. Эту возможность мы планируем проверить в дальнейшей аботе.
2.2.4. Экзогенная экспрессия HNF4 восстанавливает часть гепатоспецифических функций
Исходя из предположения, что репрессия HNF4 является важным этапом для прогрессии от мГК-1 к 6ГК, мы решили провести стабильную трансфекцию культуры 6ГК, НЗЗ, вектором, экспрессирующим HNF4, и выяснить, какая часть утраченных функций при этом восстанавливается. Мы осуществили две попытки трансфекции. Сначала мы использовали вектор pLEN4S-HNF4 (предоставленный проф. J.E.Darnell Jr.), который обеспечивает довольно низкий уровень экспрессии трансгена. После 2-3 месяцев культивирования в трансфицированных клонах наблюдается значительное снижение уровня экспрессии HNF4, что свидетельствует о существовании отбора в пользу клеток, неэкспрессирующих HNF4 (рис. 6). Затем мы использовали вектор CMV HNF4-Flag (Stoffel and Duncan 1997), который обеспечивал более высокий уровень экспрессии трансгена. Для того, чтобы избежать последствий отбора против экспрессирующих HNF4 клеток, мы анализировали трансфицированные клоны на ранних пассажах. Однако, уровень экспрессии трансгена во всех экспериментах по трансфекции оказался существенно ниже, чем в мГК-1.
Во всех трансфицированных клонах мы наблюдали восстановление транскрипции гена-мишени HNF4, HNF1, полностью подавленного в 6ГК и НЗЗ (рис. 6 и 7). Под воздействием экзогеннного HNF4 восстанавливается уровень экспрессии маркера дифференцировки ТФН (рис. 6). Однако нам не удалось выявить активации транскрипции генов CA (данные не представлены) и ТТР (рис. 6). Вероятно, это связано с тем, что помимо сайтов HNF1 и HNF4 для экспрессии генов ТТР и CA важны сайты связывания факторов HNF3 и С/ЕВР, а для CA - еще сайт GATA4 (см. обзоры (Cereghini 1996; Locker 2001). Таким образом, падение уровня экспрессии генов С/ЕВРа и GATA4 в 6ГК, НЗЗ и трансфицированных клонах определяют репрессию генов ТТР и CA.
К нашему удивлению, под воздействием экзогенного HNF4 в трансфицированных клонах активировалась также транскрипция гена HNF3y (рис. 7). В настоящее время сведений о регуляции экспрессии
Ё £
2 ю
НЫР1
Н№4
ТФН
ттр ,:■»
О.
со го I
с: со
с
м-
СЧ1 (N1
4 4
х I
• »ж <-300 //-«.<• <-200
<-300 <-200
НРРТ •
<-зоо <-200
<-300 <-200
<-300 <-200
Рис. 6. Частичное восстановление транскрипции гепато-специфичных генов при экзогенной экспрессии НЫР4 (первая трансфекция). НЗЗРиго -контрольная культура, Н4-2 - клон №2, трансфицированный р1.ЕЫ43-НЫР4, 6п„ 14п. -номера пассажей. ОТ-ПЦР с праймерами к НЫР4, НЫР1,ТФН и ТТР. Для контроля количества РНК приведен ОТ-ПЦР с праймерами к НРРТ.
НЫР4
О м т- П Ю " • -1 _1 X ^ и. и. и.
НЫР1
НЫРЗу
Сх32
«А
СОУР-ТР! Ф ^
НРРТ &
Рис. 7. Изменение уровня транскрипции ткане-специфичных и эпителиальных генов при экзогенной экспрессии НЫР4 (вторая трансфекция). К-Р1 -контрольная культура, Р1-1, Р1-3, Р1-5 - клоны, трансфицированные СМ\/ НЫР4-Р1ад. ОТ-ПЦР с праймерами к НМР4, НИР1, НЫРЗу, СОиР-ТР1 и Сх32. Для контроля количества РНК приведен ОТ-ПЦР с праймерами к НРРП".
этого гена очень мало. Известно, что ни инактивация гена HNF3a, ни инактивация гена HNF3P не изменяют уровня экспрессии HNF3y (Duncan et al. 1998; Kaestneret al. 1999). В настоящей работе мы впервые получили свидетельства того, что HNF4 активирует экспрессию гена HNF3y.
Кроме того, мы обнаружили, что под воздействием HNF4 в трансфицированных клонах происходит подавление транскрипции гена ядерного рецептора COUP-TFI (рис. 7). Это первое свидетельство того, что HNF4 является прямым или опосредованным регулятором COUP-TFI.
Таким образом, под воздействием экзогенной экспрессии HNF4 в культуре НЗЗ произошел сдвиг в сторону приобретения более дифференцированного гепатоспецифического фенотипа.
2.2.5. HNF4 влияет на эпителиальные свойства клеток.
Под воздействием экзогенной экспрессии HNF4 в культуре НЗЗ, трансфицированной pLEN4S-HNF4 (первая трансфекция), произошли морфологические изменения: в процессе культивирования некоторые клоны (например, Н4-2) стали образовывать эпителиальные островки (рис. 8Б), что говорит о вероятной реорганизации цитоскелета и, возможно, всего комплекса клеточных контактов (фокальных, плотных и щелевых), а также внеклеточного матрикса. Исходная культура НЗЗ и контрольная НЗЗ-Puro при визуальной оценке не имели морфологических различий; обе культуры отличались ярко выраженной способностью к трехмерному росту, их клетки слабо контактировали друге другом и не обладали полярностью (рис. 8А).
К сожалению, из-за невысокого уровня экспрессии трансгена и того, что в процессе культивирования уровень экспрессии трансгена существенно падает, анализ механизмов эпителизации на молекулярном уровне был затруднен.
Результаты трансфекции плазмидой CMV HNF4-Flag (второй трансфекции) мы анализировали на 2-3 пассаже. Такое короткое время культивирования не позволило увидеть морфологические изменения в культурах, однако дало возможность наблюдать весьма четкие эффекты на молекулярном уровне. Во всех
Рис. 8. Восстановление эпителиальной морфологии при экзогенной экспрессии Н1ЧР4 (первая трансфекция). А. Клетки контрольной культуры НЗЗ-Риго с морфологией, свойственной нетрансфицированным клеткам НЗЗ. Ув. х400 Б. Типичный островок эпителиальных клеток в клоне Н4-2. Ув. х400
проанализированных клонах мы наблюдали значительную активацию транскрипции гена HNF1, что свидетельствовало в пользу того, что трансген был функционально активен (рис. 7). Во всех анализированных клонах мы наблюдали значительную индукцию гена Сх32 (рис. 7). Эти результаты согласуются с данными о том, что в клетках гепатомы крысы HNF1 активирует транскрипцию гена Сх32 (Piechocki et al. 2000). Вероятно, активация гена Сх32 в нашем случае происходит именно благодаря индукции HNF1.
Для выяснения механизмов влияния HNF4 на эпителиальные свойства клеток, представляется важным проверить, происходит ли активация гена Е-кадхерина в HNF4 трансфицированных клонах. На возможность такой активации указывают данные о том, что при экзогенной экспрессии HNF1 (Goomer et al. 1994) или HNF4 (Spath and Weiss 1998) происходит индукция транскрипции гена Е-кадхерина в некоторых клеточных линиях. Однако в нашей системе
восстановление межклеточных контактов происходит, видимо, не за счет Е-кадхерина: по данным Е.И. Кудрявцевой, при иммунохимическом выявлении моноклональными антителами Е-кадхерина в клетках Н4-2, образующих эпителиальные островки, окрашивание этого белка не наблюдается.
Таким образом, в трансфицированных НЫР4 клонах частично восстанавливается эпителиальная морфология и активируется экспрессия белка щелевых контактов Сх32.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Наши результаты показали, что экспрессия фактора Н№4 коррелирует с уровнем дифференцировки ГК мышей. При скачкообразной прогрессии ГК мыши происходит подавление экспрессии НЫР4 и ряда других ГЯФ, а также изменение уровня экспрессии некоторых тканеспецифических регуляторов. Под воздействием экзогенной экспрессии НЫР4 в культуре дедифференцированной 6ГК происходит восстановление ряда гепатоспецифических синтезов и частичное восстановление эпителиальных характеристик клеток. Наши данные подтверждают гипотезу, что НЫР4 является координатором гепатоспецифических функций и эпителиальных свойств клеток. Полученные результаты позволяют сделать следующие ниже выводы.
выводы
1. В настоящей работе впервые исследованы уровни экспрессии гепатоцитарного ядерного фактора НЫР4 в перевиваемых гепатоцеллюлярных карциномах мышей разного уровня дифференцировки. Показано, что экспрессия НЫР4 коррелирует с уровнем дифференцировки гепатокарцином.
2. Исследованы изменения транскрипции ряда печень-специфических трансфакторов при скачкообразной прогрессии от медленнорастущей дифференцированной гепатомы к быстрорастущему дедифференцированному варианту. Показано, что прогрессия ГК сопровождается подавлением экспрессии ГЯФ уНт, НЫР1, С/ЕВРа, НЫРЗу, и Н^б, эндодермальных факторов САТА4 и САТА6 и тканеспецифического регулятора РТР, а также с активацией экспрессии тканеспецифического регулятора СОиР-ТР1. Кроме того, прогрессия гепатоцеллюлярных карцином сопровождается утратой эпителиальной морфологии, коррелирующей с подавлением экспрессии генов Сх32, Е-кадхерина, и активацией транскрипции гена аЗ субъеденицы интегрина.
3. Впервые показано, что экзогенная экспрессия НЫР4 активирует транскрипцию гена НЫРЗу.
4. Впервые показано, что экзогенная экспрессия НЫР4 подавляет транскрипцию гена С01)Р-ТР1.
5. Экзогенная экспрессия НЫР4 в культуре быстрорастущей дедифференцированной гепатомы восстанавливает как экспрессию части гепатоспецифических генов, так и эпителиальные свойства. Полученные результаты позволяют заключить, что НЫР4 является важнейшим координатором гепатоспецифической дифференцировки и эпителиального морфогенеза.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Е.В. Варга, О.А. Черемнова, Д.А. Овчинников, А.Ю. Шапигузов, Е.И. Кудрявцева, О.В. Морозова, Н.В. Энгельгардт и Н.Л. Лазаревич. (2001) Экспрессия тканеспецифических генов при прогрессии гепатокарцином мыши. "Генетика", т. 37, N 6, с. 803-810.
2. Е.В.Варга, И.Ф.Кустова и Н.Л.Лазаревич. Влияние ретиноевой кислоты на экспрессию альфа-фетопротеина и гепатоцитарных ядерных факторов в клонах крысиной гепатомы. (1999) Молекулярная биология, т.ЗЗ, вып. 2, стр. 235-242
3. E.V. Varga, О.А. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, E.I. Kudrjavtseva, O.V. Morozova, D.I. Fleichman, N.V. Engelhardt and N.L. Lazarevich. Steroid family nuclear receptor HNF4 expression increases differentiation level in a hepatocellular carcinoma. 27 th FEBS Annual Meeting, the FEBS Journal (2001), v. 268, Suppl. 1, p. 68.
4. N.Lazarevich, E.Varga, O.Cheremnova, D.Ovchinnikov, E.Kudrjavtseva, O.Morozova, N.Engelhardt.Tumor progression on a new model of mouse transplantable hepatocarcinomas: comparative analyses of main properties and gene expression. 7th European Meeting on Hepatocarcinogenesis "From Basic Science to Treatment", October 1215, 2001, Castiadas, Italy, Abstract book, 88.
5. E.V.Varga, O.A.Cheremnova, D.A.Ovchinnikov, E.I. Kudrjavtseva, O.V.Morozova, A.Y.Shapiguzov, N.V.Engelhardt and N.L.Lazarevich. New model of hepatocellular carcinoma progression: the key role of HNF4 gene switch-off. American Association for Cancer Research "Mouse Models of Cancer" November 29-December 3, 2000, La Jolla, USA, Abstract book, A30.
6. E.V. Varga, E.I. Kudryavtzeva, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, O.V. Morozova, N.V. Engelhardt and N.L.Lazarevich. The re-expression of liver-specific genes in dedifferentiated hepatocarcinoma variant. The American Society for Cell Biology 39th Annual Meeting, Washington, USA December 1999, MCB
7. E.V. Varga, E.I. Kudrjavtseva, N.V. Engelhardt, O.V. Morozova, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov and N.L. Lazarevich. Decrease of HNF4 mRNA level correlates with rapid progression of
HCC. 34th Annual Meeting of European Association for the Study of the Liver. Naples, Italy, 8-12 April, 1999. Journal of Hepatology, 186
!. E.V.Varga, I.F.Kustova and N.L.Lazarevich. The influence of retinoic acid on alpha-fetoprotein and hepatocyte nuclear factors genes expression in rat hepatoma clones. International Summer School on "Molecular Mechanisms of Transcellular Signalling: from Membrane Receptors to Transcription Factors". Island of Spetsai, Greece, August 16-28, 1998. Abstract book, p. 81.
I. E.V.Varga, N.L.Lazarevich, I.F.Kustova, T.L.Eraiser. Retinoic acid treatment induces the expression of some liver-specific genes in alpha-fetoprotein-negative clones of rat hepatoma McA-RH 7777. 8 IMP Spring Conference on "Genes", May 22-24, 1997, Vienna, Austria. Abstract book.
'0. E.V.Varga, I.F.Kustova and N.L.Lazarevich. Alpha-fetoprotein gene expression increases under retinoic acid treatment in rat hepatoma clones. "From Basic Cancer Research to Clinical Application", XXV Meeting of the International Society of Oncodevelopmental Biology and Medicine, September 19-24, 1997, Montreux, Switzerland. Tumor Biology, 1997, 18 (suppl. 2), 106.
Оглавление диссертации Варга, Екатерина Владимировна :: 2002 :: Москва
Введение
Список сокращений
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Печень и гепатоцеллюлярные карциномы
1.2. Как образуется печень?
1.3. Гепатоцитарные ядерные факторы: структура, спектры экспрессии, влияние на тканеспецифическую экспрессию
1.3.1. Семейство HNF
1.3.2. Семейство С/ЕВР
1.3.3. Семейство HNF
1.3.4. Семейство HNF
1.3.5. Семейство HNF
1.3.6. Спектры экспрессии ГЯФ: совокупность в печени и органах 31 близких по происхождению
1.4. ГЯФ: роль в онтогенезе и регуляция
1.4.1. Семейство HNF
1.4.2. Семейство С/ЕВР
1.4.3. Семейство HNF
1.4.4. HNF
1.4.4. HNF
1.4.5. Ранние энтодермальные факторы GATA 4 и
1.4.6. Взаиморегуляция ГЯФ
1.5. ГЯФ при патологических состояниях
Введение диссертации по теме "Онкология", Варга, Екатерина Владимировна, автореферат
Актуальность проблемы
Отличительной особенностью карцином является то, что после возникновения трансформированного клона его рост долгое время может сдерживаться окружающей нормальной тканью. По мнению Вайнберга [НапаЬап, 2000], нормализующими факторами могут быть взаимодействия трансформированных клеток с внеклеточным матриксом, межклеточные взаимодействия с нормальными клетками через щелевые контакты и выделяемые нормальными клетками цитокины. Необходимо подчеркнуть, что все эти факторы поддерживают дифференцированный нормальный фенотип исходной ткани.
При эволюции трансформированного клона - его прогрессии -накапливаются мутации, обеспечивающие максимальную пролиферацию клеток, отбираются варианты, независимые от регуляторных систем организма-хозяина, и способные жить на территориях негомологичных тканей, то есть инвазивные и метастазирующие [Абелев, 2000]. Одновременно наблюдается снижение дифференцировки карцином - как по их морфологии, так и по способности синтезировать тканеспецифические маркеры. Однако, при детальном исследовании коллекции гепатокарцином мышей было показано, что полного исчезновения печень-специфических маркеров в них никогда не наблюдается [КЬгашкоуа, 1963; Куприна, 1965].
Феноменологически процесс антигенного упрощения в гепатокарциномах описан достаточно полно, в то время как молекулярные механизмы, лежащие в его основе, изучены гораздо хуже, так же как и механизмы, обеспечивающие способность карцином к ре-дифференцировке. Между тем, такие исследования важны как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. Повышение уровня дифференцировки в карциномах (в том числе и в гепатоцеллюлярных карциномах (ГК) может увеличить чувствительность опухоли к терапии.
Настоящая работа посвящена исследованию молекулярных механизмов, определяющих снижение дифференцировки при прогрессии гепатоцеллюлярных карцином.
Тогда как для некоторых других тканей известны так называемые «мастер-гены», способные определять направление и уровень дифференцировки однозначным образом, фенотип печени формируется совокупным действием ряда регуляторов, так называемых гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ). Спектры экспрессии этих факторов тканеспецифичны, и их наибольшие количества обнаруживают в печени. Сайты связывания ГЯФ обнаруживают в регуляторных районах большинства известных гепатоспецифических генов. К ГЯФ относят пять семейств факторов: HNF1, С/ЕВР, HNF3, HNF4 и HNF6.
Экспрессия ГЯФ в печени взаиморегулируется, однако связи чрезвычайно сложны. В настоящее время четко показано, что многие из ГЯФ играют ключевые роли в раннем эмбриональном развитии (например, vHNFl и HNF4 необходимы для формирования висцеральной энтодермы, a HNF3P играет ключевую роль в закладке печени). Кроме того, недавно показано, что роль фактора HNF4 не ограничивается регуляцией тканеспецифичных генов, этот фактор также является эпителиальным морфогеном [Spath, 1998]. Однако остается неясным, какова роль ГЯФ, и в частности, HNF4, при гепатоканцерогенезе.
В настоящей работе роль ГЯФ в прогрессии гепатоцеллюлярных карцином (ГК) - была исследована на созданной в нашем институте коллекции перевиваемых ГК мыши, полученных из химически индуцированных первичных опухолей. В эту коллекцию входят также две ГК единого происхождения, резко различающиеся по скорости роста и уровню дифференцировки. Дели и задачи исследования
Целью настоящей работы является исследование роли ГЯФ в прогрессии гепатоцеллюлярных карцином и поиск возможных путей реверсии злокачественного фенотипа. Было запланировано решение следующих экспериментальных задач:
1. Выяснить, как экспрессия гена HNF4 соотносится с уровнем дифференцировки перевиваемых ГК мыши.
2. Проанализировать, какие изменения в экспрессии опухолевых маркеров, ГЯФ, тканеспецифичных регуляторов и генов, характерных для эпителиального фенотипа, произошли при скачкообразной прогрессии от медленнорастущей дифференцированной ГК к быстрорастущему дедифференцированному варианту.
3. Исследовать роль HNF4 в произошедшей скачкообразной прогрессии.
Научная новизна и практическая значимость работы
Научная новизна настоящей работы в значительной мере определяется использованной системой. Впервые проведен анализ экспрессии ГЯФ и тканеспецифических регуляторов в ГК мыши in vivo. Кроме того, в работе охарактеризована полученная в нашем институте модель, включающая медленнорастущую дифференцированную ГК и ее быстрорастущий дедифференцированный вариант.
В работе показано, что уровень экспрессии гена HNF4 четко коррелирует с уровнем дифференцировки ГК мыши. При скачкообразной прогрессии от медленнорастущей дифференцированной ГК к быстрорастущему дедифференцированному варианту происходит полное подавление экспрессии гена HNF4. Продемонстрировано, что эта прогрессия сопровождается подавлением экспрессии маркеров дифференцировки - сывороточного альбумина (СА), трансферрина (ТФН) и транстиретина (ТТР), подавлением экспрессии генов коннексина 32 и Е-кадхерина, характерных для эпителиального фенотипа и активацией транскрипции пролокомотивного рецептора ламинина аЗ интегрина. В ходе исследуемой прогрессии произошло полное подавление экспрессии гепатоцитарных ядерных факторов HNF1 и HNF6, и частичное подавление vHNFl, С/ЕВРа и HNF3y. Кроме того, снизились уровни транскрипции энтодермальных ядерных факторов GATA4 и GATA6 и изменились уровни экспрессии тканеспецифичных ядерных рецепторов FTF и COUP-TFI. Для исследования роли HNF4 в произошедших изменениях проведена стабильная трансфекция клеточной культуры дедифференцированной гепатомы векторами, экспрессирующими НИР4. Показано, что экзогенная экспрессия Н№4 активирует транскрипцию гепатоцитарных ядерных факторов ММР1 и РШРЗу и маркера дифференцировки ТФН, таким образом, под воздействием НЫР4 восстанавливается часть гепатоспецифических синтезов. При экзогенной экспрессии НИР4 морфология клеток меняется в сторону эпителиальной и активируется транскрипция гена коннексина 32, таким образом, восстанавливается часть эпителиальных свойств. Нами впервые показано, что при экзогенной экспрессии Н№4 происходит подавление транскрипции ядерного рецептора СОЦР-ТР1 и активация транскрипции ЬШРЗу.
Результаты проведенной работы способствуют лучшему пониманию роли ГЯФ в прогрессии ГК и разработке возможных путей ре-дифференцировки ГК и реверсии злокачественного фенотипа.
Список сокращений
ГК -гепатоцеллюлярная карцинома 6ГК - быстрорастущая ГК мГК - медленнорастущая ГК ГЯФ - гепатоцитарные ядерные факторы РЕРСК - фосфоенолпируват-карбоксикиназа СА - сывороточный альбумин ТАТ - тирозин-аминотрансфераза ТТР - транстиретин ТФН - трансферрин
ЭС клетки - эмбриональные стволовые клетки а.о. - аминокислотные остатки п.н. - пара нуклеотидов т.н. - тысяча нуклеотидов т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
Заключение диссертационного исследования на тему "Гепатоцитарные ядерные факторы и опухолевые маркеры при прогрессии гепатокарцином"
выводы
1. Впервые исследованы уровни экспрессии гепатоцитарного ядерного фактора Н№4 в химически индуцированных гепатоцеллюлярных карциномах мышей. Показано, что экспрессия Н№4 коррелирует с уровнем дифференцировки гепатокарцином.
2. Исследованы изменения в экспрессии генов, происходящие при скачкообразной прогрессии от медленнорастущей высокодифференцированной гепатомы к быстрорастущему дедифференцированному варианту. Показано, что прогрессия сопровождается подавлением экспрессии ГЯФ уН№1, НМ-Ч, С/ЕВРа, НОТЗу, Н№4 и НЫТб, энтодермальных факторов ОАТА4 и вАТАб и ткане-специфического регулятора БТР, а также с активацией экспрессии ткане-специфического регулятора СОИР-ТР!
3. Утрата эпителиальной морфологии, происходящая при прогрессии гепатоцеллюлярных карцином, сопровождается подавлением экспрессии генов коннексина32, Е-кадхерина, и активацией транскрипции гена аЗ субъеденицы интегрина.
4. Экзогенная экспрессия Н1\ПР4 в культуре быстрорастущей дедифференцированной гепатомы восстанавливает экспрессию части гепато-специфических генов, в их числе Н№1 и ТФН. Впервые показано, что экзогенная экспрессия НОТЧ активирует транскрипцию гена ЬЮТЗу и подавляет транскрипцию гена СОЦР-ТР1.
5. Экзогенная экспрессия Н№4 в культуре быстрорастущей дедифференцированной гепатомы ведет к частичному восстановлению эпителиальных свойств клеток, сопровождающемуся активацией экспрессии гена коннексина32. Полученные результаты позволяют заключить, что ЕЮТ4 является важнейшим координатором гепато-специфической дифференцировки и эпителиального морфогенеза.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2002 года, Варга, Екатерина Владимировна
1. Abe, К., Н. Niwa, К. Iwase, М. Takiguchi, М. Mori, S.l. Abe, K.l. Yamamura (1996). ''Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies." Exp Cell Res 229( 1): 27-34.
2. Abelev, G.I. (1965). "Antigenic structure of chemically-induced hepatomas." Prog Exp Tumor Res 7: 104-57.
3. Abelev, G.I. (1993). "Alpha-fetoprotein biology." Sov. Sci. Rev. D. Phvsicochem. Biol. 11: 85-109.
4. Abelev, G.I., S. Perova, N.I. Khramkova, Z.A. Postnikova, I. lrlin (1963).
5. Production of embrional alpha-globulin by the transplantable mouse hepatomas." Transplant. Bull 1: 174-180.
6. Aberle, H., H. Schwartz, R. Kemler (1996). "Cadherin-catenin complex: protein interactions and their implications for cadherin function." J Cell Biochem 61(4): 514-23.
7. Adjei, A.A. (2001). "Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy." J Natl Cancer Inst 93( 14): 1062-74.
8. Ambrosino, C., M.R. Ruocco, X. Chen. M. Mallardo, F. Baudi, S. Trematerra, 1.
9. Ang, S.L., J. Rossant (1994). "HNF-3 beta is essential for node and notochord formation in mouse development." Cell 78(4): 561-74.
10. Ang, S.L., A. Wierda, D. Wong, K.A. Stevens, S. Cascio, J. Rossant, K.S. Zaret1993). "The formation and maintenance of the definitive endoderm lineage in the mouse: involvement of HNF3/forkhead proteins." Development 119(4): 1301-15.
11. Ayer, D. (1999). "Histone deacetylases: transcriptional repression with SINers and NuRDs." Trends Cell Biol 9: 193-198.
12. Bach, I., Z. Galcheva-Gargova, M.G. Mattei, D. Simon-Chazottes, J.L. Guenet, S. Cereghini, M. Yaniv (1990). "Cloning of human hepatic nuclear factor 1 (HNF1) and chromosomal localization of its gene in man and mouse." Genomics 8(1): 155-64.
13. Bach, I., M.G. Mattei, S. Cereghini, M. Yaniv (1991). "Two members of an HNF1 homeoprotein family are expressed in human liver." Nucleic Acids Res 19(13): 3553-9.
14. Bach, 1., M. Pontoglio, M. Yaniv (1992). "Structure of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 1 (HNF1)." Nucleic Acids Res 20(16): 4199-204.
15. Bailly, A., M.E. Torres-Padilla, A.P. Tinel, M.C. Weiss (2001). "An enhancerelement 6 kb upstream of the mouse HNF4alphal promoter is activated by glucocorticoids and liver-enriched transcription factors." Nucleic Acids Res 29(17): 3495-505.
16. Baumhueter, S., G. Courtois, G.R. Crabtree (1988). "A variant nuclear protein indedifferentiated hepatoma cells binds to the same functional sequences in the beta fibrinogen gene promoter as HNF-1." EMBO J 7(8): 2485-93.
17. Baumhueter, S., D.B. Mendel, P.B. Conley, C.J. Kuo, C. l urk, M.K. Graves, C.A. Edwards, G. Courtois, G.R. Crabtree (1990). "HNF-1 shares three sequence motifs with the POU domain proteins and is identical to LF-B1 and APF." Genes Dev 4(3): 372-9.
18. Berenblum, I. (1941). "The cocarcinogenic action of croton resin." Cancer Research 1(1): 44-50.
19. Bergsland, E.K., A.P. Venook (2000). "Hepatocellular carcinoma." Curr Opin Oncol 12(4): 357-61.
20. Bergstrand, C.G., B. Czar (1956). "Demonstration of a new protein fraction in serum from the human fetus." Scand. J. Clin. Lab. Invest. 8: 174-179.
21. Brechot, C. (2000). "Introduction." Semin Cancer Biol 10(3): 159.
22. Buendia, M.A. (2000). "Genetics of hepatocellular carcinoma." Semin Cancer Biol 10(3): 185-200.
23. Bulla, G.A. (1997). "Selective loss of the hepatic phenotype due to the absence of a transcriptional activation pathway." Somat Cell Mol Genet 23(3): 185-201.
24. Bulla, G.A., R.E. Fournier (1994). "Genetic analysis of a transcriptional activation pathway by using hepatoma cell variants." Mol Cell Biol 14(11): 7086-94.
25. Cascio, S., K. Zaret (1991). "Hepatocyte differentiation initiates during endodermal-mesenchymal interactions prior to liver formation." Development 113: 217215.
26. Cereghini, S. (1996). "Liver-enriched transcription factors and hepatocyte differentiation." FASEB J 10(2): 267-82.
27. Cereghini, S., M. Blumenfeld, M. Yaniv (1988). "A liver-specific factor essential for albumin transcription differs between differentiated and dedifferentiated rat hepatoma cells." Genes Dev 2(8): 957-74.
28. Cereghini, S., M.O. Ott, S. Power, M. Maury (1992). "Expression patterns of vHNFl and HNF1 homeoproteins in early postimplantation embryos suggest distinct and sequential developmental roles." Development 116(3): 783-97.
29. Ceska, T.A., M. Lamers, P. Monaci, A. Nicosia. R. Cortese. D. Suck (1993). "The X-ray structure of an atypical homeodomain present in the rat liver transcription factor LFB1/HNF1 and implications for DNA binding." EMBO J 12(5): 180510.
30. Chen, M., J.H. Ou (1995). "Cell type-dependent regulation of the activity of thenegative regulatory element of the hepatitis B virus core promoter." Virology 214(1): 198-206.
31. Chouard, T„ M. Blumenfeld, I. Bach, J. Vandekerckhove. S. Cereghini. M. Yaniv (1990). "A distal dimerization domain is essential for DNA-binding by the atypical HNF1 homeodomain." Nucleic Acids Res 18(19): 5853-63.
32. Cirillo, L., K. Zaret (1999). "An early developmental transcription factor complex that is more stable on nucleosome core particles than on free DNA." Mol Cell 4: 961-969.
33. Clark, K.L., E.D. Halay, E. Lai, S.K. Burley (1993). "Co-crystal structure of the HNF-3/fork head DNA-recognition motif resembles histone H5." Nature 364(6436): 412-20.
34. Coffinier, C., J. Barra, C. Babinet, M. Yaniv (1999). "Expression of thevHNFl/HNFlbeta homeoprotein gene during mouse organogenesis." Meeh Dev 89(1-2): 211-3.
35. Coffinier, C., D. Thepot, C. Babinet, M. Yaniv. J. Barra (1999). "Essential role for the homeoprotein vFlNFl/HNFlbeta in visceral endoderm differentiation." Development 126(21): 4785-94.
36. Costa, R.H., D.R. Grayson, J.r. Darnell JE (1989). "Multiple hepatocyte-enriched nuclear factors function in the regulation of transthyretin and alpha 1 -antitrypsin genes." Mol Cell Biol 9(4): 1415-25.
37. Courtois, G., J.G. Morgan, L.A. Campbell, G. Fourel, G.R. Crabtree (1987).1.teraction of a liver-specific nuclear factor with the fibrinogen and alpha 1 -antitrypsin promoters." Science 238(4827): 688-92.
38. Couvelard, A., A.F. Bringuier, M.C. Dauge, M. Nejjari, E. Darai, J.L. Benifla, G. Feldmann, D. Henin, J.Y. Scoazec (1998). "Expression of integrins during liver organogenesis in humans." Hepatology 27(3): 839-47.
39. Crowe, A.J., L. Sang, K. Li, K. Lee, B. Spear, M.C. Barton (1999). "Hepatocyte nuclear factor 3 relieves chrometin-mediated repression of the alpha-fetoprotein gene." J Biol Chem 274: 25113-25120.
40. Cuif, M.H., A. Porteu, A. Kahn, S. Vaulont (1993). "Exploration of a liver-specific, glucose/insulin-responsive promoter in transgenic mice." J Biol Chem 268(19): 13769-72.
41. De Simone, V., L. De Magistris, D. Lazzaro, J. Gerstner, P. Monaci, A. Nicosia, R. Cortese (1991). "LFB3, a heterodimer-forming homeoprotein of the LFB1 family, is expressed in specialized epithelia." Embo J 10(6): 1435-43.
42. Descombes, P., U. Schibler (1991). "A liver-enriched transcriptional activator protein, LAP, and a transcriptional inhibitory protein, LIP, are translated from the same mRNA." Cell 67(3): 569-79.
43. Diehl, A.M. (1998). "Roles of CCAAT/enhancer-binding proteins in regulation of liver regenerative growth." Journal Of Biological Chemistry 273(47): 308436.
44. Drewes, T., S. Senkel, B. Holewa, G.U. Ryffel (1996). "Human hepatocyie nuclear factor 4 isoforms are encoded by distinct and differentially expressed genes." Mol Cell Biol 16(3): 925-31.
45. Dufort, D., L. Schwartz, K. Harpal, J. Rossant (1998). "The transcription factor HNF3beta is required in visceral endoderm for normal primitive streak morphogenesis." Development 125(16): 3015-25.
46. Duncan, S. (2000). "Transcriptional regulation of Liver Development." Developmental Dynamics 219: 131-142.
47. Duncan, S.A., K. Manova, W.S. Chen, P. Hoodless, D.C. Weinstein, R.F.
48. Duncan, S.A., A. Nagy, W. Chan (1997). "Murine gastrulation requires HNF-4regulated gene expression in the visceral endoderm: tetraploid rescue of Hnf-4(-/-) embryos." Development 124(2): 279-87.
49. Duncan, S.A., M.A. Navas, D. Dufort, J. Rossant, M. Stoffel (1998). "Regulation of a transcription factor network required for differentiation and metabolism." Science 281(5377): 692-5.
50. Falvey, E., L. Marcacci, U. Schibler (1996). "DNA-binding specificity of PAR and C/EBP leucine zipper proteins: a single amino acid substitution in the C/EBP DNA-binding domain confers PAR-like specificity to C/EBP." Biol Chem 377(12): 797-809.
51. Flodby, P., C. Barlow, H. Kylefjord, L. Ahrlund-Richter, K.G. Xanthopoulos (1996). "Increased hepatic cell proliferation and lung abnormalities in mice deficient in CCAAT/enhancer binding protein alpha." J Biol Chem 271(40): 24753-60.
52. Frain, M., G. Swart, P. Monaci, A. Nicosia, S. Stampfli, R. Frank, R. Cortese (1989). "The liver-specific transcription factor LF-B1 contains a highly diverged homeobox DNA binding domain." Cell 59(1): 145-57.
53. Fukuda-Taira, S. (1981). "Hepatic induction in the avian embryo: specificity of reactive endoderm and inductive mesoderm." J Embryol Exp Morphol 63: 111-125.
54. Golubovskaya, V.M., S.C. Presnell, M.J. Hooth, G.J. Smith, W.K. Kaufmann (1997). "Expression of telomerase in normal and malignant rat hepatic epithelia." Oncogene 15(10): 1233-40.
55. Goomer, R.S., B.D. Hoist, I.C. Wood, F.S. Jones, G.M. Edelman (1994). "Regulation in vitro of an L-CAM enhancer by homeobox genes HoxD9 and HNF-1Proc Natl Acad Sci U S A 91(17): 7985-9.
56. Greenbaum, L.E., W. Li, D.E. Cressman, Y. Peng, G. Ciliberto, V. Poli. R. Taub (1998). "CCAAT enhancer- binding protein beta is required for normalhepatocyte proliferation in mice after partial hepatectomy." J Clin Invest 102(5): 996-1007.
57. Gregory, P., W. Horz (1998). "Life with nucleosomes: chromatin remodeling in gene regulation." Curr Opin Cell Biol 10: 339-345.
58. Gualdi, R., P. Bossard, M. Zheng, Y. Hamada, J.R. Coleman, K.S. Zaret (1996). "Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: cell signaling and transcriptional control." Gene Dev 10: 1670-1682.
59. Gumbiner, B.M. (1995). "Signal transduction of beta-catenin." Curr Opin Cell Biol 7(5): 634-40.
60. Hall, A.J., A. Chuansumrit, l.R. Peake, P.R. Winship (1994). "A single base pair deletion in the promoter region of the factor IX gene is associated with haemophilia B." Thromb Haemost 72(6): 799-803.
61. Hall, R.K., F.M. Sladek, D.K. Granner (1995). "The orphan receptors COUP-TF and HNF-4 serve as accessory factors required for induction of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene transcription by glucocorticoids." Proc Natl Acad Sci U S A 92(2): 412-6.
62. Hanahan, D., R.A. Weinberg (2000). "The hallmarks of cancer." Cell 100(1): 57-70.
63. Hardon, E.M., M. Frain, G. Paonessa, R. Cortese (1988). "Two distinct factorsinteract with the promoter regions of several liver-specific genes." Embo J 7(6): 1711-9.
64. Harnish, D.C., S. Malik, E. Kilbourne, R. Costa, S.K. Karathanasis (1996). "Control of apolipoprotein A1 gene expression through synergistic interactions between hepatocyte nuclear factors 3 and 4." J Biol Chem 271(23): 13621-8.
65. Hayashi, Y., W. Wang, T. Ninomiya, H. Nagano, K. Ohta, H. Itoh (1999). "Liverenriched transcription factors and differentiation of hepatocellular carcinoma." Mol Pathol 52(1): 19-24.
66. Hayhurst, G.P., Y.H. Lee, G. Lambert, J.M. Ward, F.J. Gonzalez (2001). "Hepatocyte nuclear factor 4alpha (nuclear receptor 2A1) is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis." Mol Cell Biol 21(4): 1393403.
67. Henderson, A.J., K.L. Calame (1997). "CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) sites are required for HIV-1 replication in primary macrophages but not CD4(+) T cells." Proc Natl Acad Sci U S A 94(16): 8714-9.
68. Hennemann, H., G. Kozjek, E. Dahl, B. Nicholson, K. Willecke (1992). "Molecular cloning of mouse connexins26 and -32: similar genomic organization but distinct promoter sequences of two gap junction genes." Eur J Cell Biol 58( 1): 81-9.
69. Hentsch, B., Lyons I, Li R, Hartley L, Lints TJ, Adams JM, H. RP. (1996). "Hlx homeo box gene is essential for an inductive tissue interaction that drives expansion of embryonic liver and gut." Genes Dev 10(1): 70-79.
70. Herbst, R.S., U. Nielsch, F. Sladek, E. Lai, L.E. Babiss, J.r. Darnell JE (1991).
71. Differential regulation of hepatocyte-enriched transcription factors explains changes in albumin and transthyretin gene expression among hepatoma cells." New Biol 3(3): 289-96.
72. Hertz, R., J. Magenheim, I. Berman, J. Bar-Tana (1998). "Fatty acyl-CoA thioesters are ligands of hepatic nuclear factor-4alpha." Nature 392(6675): 512-6.
73. Hilberg, F., Aguzzi A, Howells N, W. EF. (1993). "c-jun is essential for normalmouse development and hepatogenesis." Nature 365(6442): 179-181.
74. Huang, G.T., H.S. Lee, C.H. Chen, L.L. Chiou, C.Z. Lee, D.S. Chen, H.C. Hsu, J.C. Sheu (1999). "Tissue hepatocyte growth factor and proliferating cell nuclear antigen in hepatocellular carcinoma." J Formos Med Assoc 98(2): 92-6.
75. Jiang, G., F.M. Sladek (1997). "The DNA binding domain of hepatocyte nuclear factor 4 mediates cooperative, specific binding to DNA and heterodimerization with the retinoid X receptor alpha." J Biol Chem 272(2): 1218-25.
76. Johnson, R., van Lingen B, Papaioannou VE, S. BM. (1993). "A null mutation at the c-jun locus causes embryonic lethality and retarded cell growth in culture." Genes Dev 7: 1309-17.
77. Jung, J., M. Zheng, M. Goldfarb, K.S. Zaret (1999). "Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors." Science 284: 1998-2003.
78. Kaestner, K.H., H. Hiemisch, B. Luckow, G. Schutz (1994). "The HNF-3 gene family of transcription factors in mice: gene structure, cDNA sequence, and mRNA distribution." Genomics 20(3): 377-85.
79. Kaestner, K.H., H. Hiemisch, G. Schutz (1998). "Targeted disruption of the geneencoding hepatocyte nuclear factor 3gamma results in reduced transcription of hepatocyte-specific genes." Mol Cell Biol 18(7): 4245-51.
80. Kaestner, K.H., J. Katz, Y. Liu, D.J. Drucker, G. Schutz (1999). "Inactivation of the winged helix transcription factor HNF3alpha affects glucose homeostasis and islet glucagon gene expression in vivo." Genes Dev 13(4): 495-504.
81. Kaestner, K.H., W. Knochel, D.E. Martinez (2000). "Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors." Genes Dev 14(2): 142-6.
82. Keller, G.M. (1995). "In vitro differentiation of embryonic stem cells." Curr Opin Cell Biol 7(6): 862-9.
83. Khramkova, N.I., Z.A. Postnikova, G.I. Abelev (1963). "Antigenic structure of mouse hepatomas III. A study of organospecific liver antigens in the hepatomas with the aid of specific antibodies." Neoplasma 10(2): 127-131.
84. Kritis, A.A., E. Ktistaki, D. Barda, V.I. Zannis, I. Talianidis (1993). "An indirect negative autoregulatory mechanism involved in hepatocyte nuclear factor-1 gene expression." Nucleic Acids Res 21(25): 5882-9.
85. Krutovskikh, V.A., M. Oyamada, H. Yamasaki (1991). "Sequential changes of gap-junctional intercellular communications during multistage rat liver carcinogenesis: direct measurement of communication in vivo." Carcinogenesis 12(9): 1701-6.
86. Kuo, C.F., K.G. Xanthopoulos, J.r. Darnell JE (1990). "Fetal and adult localization of C/EBP: evidence for combinatorial action of transcription factors in cell-specific gene expression." Development 109(2): 473-81.
87. Kuo, C.J., P.B. Conley, L. Chen, F.M. Sladek, J.r. Darnell JE. G.R. Crabtree (1992). "A transcriptional hierarchy involved in mammalian cell-type specification." Nature 355(6359): 457-61.
88. Schibler, C. Bonfils (1999). "Circadian expression of the steroid 15 alpha-hydroxylase (Cyp2a4) and coumarin 7-hydroxylase (Cyp2a5) genes in mouse liver is regulated by the PAR leucine zipper transcription factor DBP." Mol Cell Biol 19(10): 6488-99.
89. Magee, T.R., Y. Cai, M.E. El-Houseini, J. Locker, Y.J. Wan (1998). "Retinoic acid mediates down-regulation of the alpha-fetoprotein gene through decreased expression of hepatocyte nuclear factors." J Biol Chem 273(45): 30024-32.
90. Marten, N.W., F.M. Siadek, D.S. Straus (1996). "Effect of dietary protein restriction on liver transcription factors." Biochem J 317 ( Pt 2): 361-70.
91. McPherson, C.E., E.Y. Shim, D.S. Friedman, K.S. Zaret (1993). "An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array." Cell 75(2): 387-98.
92. Mendel, D.B., L.P. Hansen, M.K. Graves, P.B. Conley, G.R. Crabtree (1991). "HNF-1 alpha and HNF-1 beta (vHNF-1) share dimerization and homeo domains, but not activation domains, and form heterodimers in vitro." Genes Dev 5(6): 1042-56.
93. Michalopoulos, G.K., M.C. DeFrances (1997). "Liver regeneration." Science 276(5309): 60-6.
94. Miller, J.R., R.T. Moon (1996). "Signal transduction through beta-catenin andspecification of cell fate during embryogenesis." Genes Dev 10(20): 2527-39.
95. Miura, N., K. Tanaka (1993). "Analysis of the rat hepatocyte nuclear factor (HNF) 1 gene promoter: synergistic activation by HNF4 and HNF1 proteins." "Nucleic Acids Res 21(16): 3731-6.
96. Molkentin, J., Q. Lin, S. Duncan, E. Olson (1997). "Requirement of the transcription factor GATA4 for heart tube formation and ventral morphogenesis." Genes Dev. 11: 1061-1072.
97. Molkentin, J.D. (2000). "The zinc finger-containing transcription factors GATA-4, -5, and -6. Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression." J Biol Chem 275(50): 38949-52.
98. Morrisey, E.E., H.S. Ip, M.M. Lu, M.S. Parmacek (1996). "GATA-6: a zinc finger transcription factor that is expressed in multiple cell lineages derived from lateral mesoderm." Dev Biol 177(1): 309-22.
99. Morrisey, E.E., Z. Tang, K. Sigrist, M.M. Lu, F. Jiang, H.S. Ip, M.S. Parmacek1998). "GATA6 regulates HNF4 and is required lor differentiation of \ isccn.il endodenn in the mouse embryo." Genes Dev 12(22): 3579-90.
100. Nakamura, T., H. Akiyoshi, G. Shiota, M. Isono, K. Nakamura, M. Moriyama, K. Sato (1999). "Hepatoprotective action of adenovirus-transferred HNF-3gamma gene in acute liver injury caused by CC1(4)." FEBS Lett 459(1): 1-4.
101. Nakhei, H., A. Lingott, I. Lemm, G.U. Ryffel (1998). "An alternative splice variant of the tissue specific transcription factor HNF4alpha predominates in undifferentiated murine cell types." Nucleic Acids Res 26(2): 497-504.
102. Nerlov, C., E.B. Ziff (1994). "Three levels of functional interaction determine the activity of CCAAT/enhancer binding protein-alpha on the serum albumin promoter." Genes Dev 8(3): 350-62.
103. Ott, M.O., J. Rey-Campos, S. Cereghini, M. Yaniv (1991). "vHNFl is expressed in epithelial cells of distinct embryonic origin during development and precedes HNF1 expression." Mech Dev 36(1-2): 47-58.
104. Pani, L., X.B. Quian, D. Clevidence, R.H. Costa (1992). "The restricted promoter activity of the liver transcription factor hepatocyte nuclear factor 3 betainvolves a cell-specific factor and positive autoactivation." Mol Cell Biol 12(2): 552-62.
105. Philippe, J., C. Morel, V.R. Prezioso (1994). "Glucagon gene expression is negatively regulated by hepatocyte nuclear factor 3 beta." Mol Cell Biol 14(5): 3514-23.
106. Piechocki, M.P., R.M. Toti, M.J. Fernstrom, R.D. Burk, R.J. Ruch (2000). "Livercell-specific transcriptional regulation of connexin32." Biochim Biophvs Acta 1491(1-3): 107-22.
107. Pontoglio, M., D.M. Faust, A. Doyen, M. Yaniv, M.C. Weiss (1997). "Hepatocyte nuclear factor 1 alpha gene inactivation impairs chromatin remodeling and demethylation of the phenylalanine hydroxylase gene." Mol Cell Biol 17(9): 4948-56.
108. Power, S.C., S. Cereghini (1996). "Positive regulation of the vHNFl promoter b\ the orphan receptors COUP-TFl/Ear3 and COUP-TFII/Arpl." Mol Cell Biol 16(3): 778-91.
109. Qian, X., R.H. Costa (1995). "Analysis of hepatocyte nuclear factor-3 beta proteindomains required for transcriptional activation and nuclear targeting." Nucleic Acids Res 23(7): 1184-91.
110. Qiu, Y., V. Krishnan, F.A. Pereira, S.Y. Tsai, M.J. Tsai (1996). "Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factors and their regulation." J Steroid Biochem Mol Biol 56(1-6 Spec No): 81-5.
111. Rana, B., Y. Xie, D. Mischoulon, N.L. Bucher, S.R. Farmer (1995). "The DNAbinding activity of C/EBP transcription factor is regulated in the G1 phase of the hepatocyte cell cycle." J Biol Chem 270(30): 18123-32.
112. Raney, A.K., P. Zhang, A. McLachlan (1995). "Regulation of transcription from the hepatitis B virus large surface antigen promoter by hepatocyte nuclear factor 3." J Virol 69(6): 3265-72.
113. Reimold, A., Etkin A, Clauss I, Perkins A, Z.J. Friend DS, Horton HF, Scott A, Orkin SH, Byrne MC, Grusby MJ, G. LH. (2000). "An essential role in liver development for transcription factor XBP-1." Genes Dev 14(2): 152-157.
114. Rey-Campos, J., T. Chouard, M. Yaniv, S. Cereghini (1991). "vHNFl is ahomeoprotein that activates transcription and forms heterodimers with HNF1 EMBOJ 10(6): 1445-57.
115. Ron, D., J.F. Habener (1992). "CHOP, a novel developmentally regulated nuclearprotein that dimerizes with transcription factors C/EBP and LAP and functions as a dominant-negative inhibitor of gene transcription." Genes Dev 6(3): 43953.
116. Rudolph, D., Yeh WC, Wakeham A, Rudolph B, Nallainathan D, Potter J, Elia AJ, M. TW. (2000). " Severe liver degeneration and lack of NF-kappaB activation in NEMO/IKKgamma-deficient mice." Genes Dev 14(7): 854-862.
117. Ryffel, G.U. (2001). "Mutations in the human genes encoding the transcription factors of the hepatocyte nuclear factor (HNF)l and HNF4 families: functional and pathological consequences." J Mol Endocrinol 27(1): 11 -29.
118. Samadani, U., R.H. Costa (1996). "The transcriptional activator hepatocyte nuclear factor 6 regulates liver gene expression." Mol Cell Biol 16(11): 6273-84.
119. Samadani, U., R.H. Costa (1996). "The transcriptional activator hepatocyte nuclear factor 6 regulates liver gene expression." Mol Cell Biol 16(11): 6273-84.
120. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T., (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY., Cold Spring Harbor laboratory.
121. Sargent, T.D., J.R. Wu, J.M. Sala-Trepat, R.B. Wallace, A.A. Reyes, J. Bonner (1979). "The rat serum albumin gene: analysis of cloned sequences." Proc Natl Acad Sci U S A 76(7): 3256-60.
122. Sasaki, H., B.L. Hogan (1993). "Differential expression of multiple fork head related genes during gastrulation and axial pattern formation in the mouse embryo." Development 118(1): 47-59.
123. Sasaki, H., B.L. Hogan (1994). "HNF-3 beta as a regulator of floor plate development." Cell 76(1): 103-15.
124. Schaeffer, E., F. Guillou, D. Part, M.M. Zakin (1993). "A different combination of transcription factors modulates the expression of the human transferrin promoter in liver and Sertoli cells." J Biol Chem 268(31): 23399-408.
125. Schmidt, C., F. Bladt, Goedecke S, Brinkmann V, Zschiesche W, Sharpe M, Gherardi E, B. C. (1995). "Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development." Nature 373(6516): 699-702.
126. Sel, S., T. Ebert, G.U. Ryffel, T. Drewes (1996). "Human renal cell carcinogenesis is accompanied by a coordinate loss of the tissue specific transcription factors HNF4 alpha and HNF1 alpha." Cancer Lett 101(2): 205-10.
127. Shen, C.N., J.M. Slack, D. Tosh (2000). "Molecular basis of transdifferentiation of pancreas to liver." Nat Cell Biol 2(12): 879-87.
128. Shiota, G., J. Okano, H. Kawasaki, T. Kawamoto, T. Nakamura (1995). "Serum hepatocyte growth factor levels in liver diseases: clinical implications." Hematology 21(1): 106-12.
129. Sladek, F.M., W.M. Zhong, E. Lai, J.r. Darnell JE (1990). "Liver-enrichedtranscription factor HNF-4 is a novel member of the steroid hormone receptor superfamily." Genes Dev 4(12B): 2353-65.
130. Song, C.S., M.H. Jung, S.C. Kim, T. Hassan, A.K. Roy, B. Chatterjee (1998). "Tissue-specific and androgen-repressible regulation of the ratdehydroepiandrosterone sulfotransferase gene promoter." J Biol Chem 273(34): 21856-66.
131. Spath, G.F., M.C. Weiss (1997). "Hepatocyte nuclear factor 4 expression overcomes repression of the hepatic phenotype in dedifferentiated hepatoma cells." Mol Cell Biol 17(4): 1913-22.
132. Spath, G.F., M.C. Weiss (1998). "Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen in dedifferentiated hepatoma cells." J Cell Biol 140(4): 935-46.
133. Stamatoglou, S.C., C. Enrich, M.M. Manson, R.C. Hughes (1992). "Temporalchanges in the expression and distribution of adhesion molecules during liver development and regeneration." Journal Of Cell Biology 116(6): 1507-15.
134. Stamatoglou, S.C., R.C. Hughes (1994). "Cell adhesion molecules in liver function and pattern formation." Faseb Journal 8(6): 420-7.
135. Stoffel, M., S.A. Duncan (1997). "The maturity-onset diabetes of the young
136. MODY1) transcription factor HNF4alpha regulates expression of genes required for glucose transport and metabolism." Proc Natl Acad Sci U S A 94(24): 13209-14.
137. Suck, D., R. Ficner (1996). "Structure and function of PCD/DCoH, an enzyme with regulatory properties." FEBS Lett 389(1): 35-9.
138. Sund, N.J., S.L. Ang, S.D. Sackett, W. Shen, N. Daigle, M.A. Magnuson, K.H.
139. Kaestner (2000). "Hepatocyte nuclear factor 3beta (Foxa2) is dispensable for maintaining the differentiated state of the adult hepatocyte." Mol Cell Biol 20(14): 5175-83.
140. Taipale, J., J. Keski-Oja (1997). "Growth factors in the extracellular matrix." FASEB J 11(1): 51-9.
141. Taraviras, S., A.P. Monaghan, G. Schutz, G. Kelsey (1994). "Characterization of the mouse HNF-4 gene and its expression during mouse embryogenesis." Mech Dev 48(2): 67-79.
142. Thomas, P., A. Brown, R. Beddington (1998). "Hex: a homeobox gene revealing periimplantation assymetry in mouse embryo and an early transient marker of edothelial cell precursors." Development 125: 85-94.
143. Tian, J.M., U. Schibler (1991). "Tissue-specific expression of the gene encodinghepatocyte nuclear factor 1 may involve hepatocyte nuclear factor 4." Genes Dev 5(12A): 2225-34.
144. Timchenko, N.A., M. Wilde, G.J. Darlington (1999). "C/EBPalpha regulatesformation of S-phase-specific E2F-p 107 complexes in livers of newborn mice." Mol Cell Biol 19(4): 2936-45.
145. Toniatti, C., P. Monaci, A. Nicosia, R. Cortese, G. Ciliberto (1993). "A bipartite activation domain is responsible for the activity of transcription factor HNF1/LFB1 in cells of hepatic and nonhepatic origin." DNA Cell Biol 12(3): 199-208.
146. Tranche, F., A. Rollier, P. Herbomel, I. Bach, S. Cereghini, M. Weiss, M. Yaniv1990). "Anatomy of the rat albumin promoter." Mol Biol Med 7(2): 173-85.
147. Tsujiuchi, T., M. Tsutsumi, A. Kido, M. Takahama, H. Sakitani, K. Iki, Y. Sasaki, A. Denda, Y. Konishi (1998). "Induction of telomerase activity during regeneration after partial hepatectomy in the rat." Cancer Letters 122(1.-2): 115-20.
148. Ueki, T., J. Fujimoto, T. Suzuki, H. Yamamoto, E. Okamoto (1997). "Expression of hepatocyte growth factor and its receptor c-met proto-oncogene in hepatocellular carcinoma." Hepatology 25(4): 862-6.
149. Vassy, J., Kraemer M, Chalumeau MT, F. J. (1988). " Development of the fetal rat liver: ultrastructural and stereological study of hepatocytes." Cell Differ 24(1): 9-24.
150. Velho, G., P. Froguel (1998). "Genetic, metabolic and clinical characteristics of maturity onset diabetes of the young." Eur J Endocrinol 138(3): 233-9.
151. Volpes, R., J.J. van den Oord, V.J. Desmet (1993). "Integrins as differential cell lineage markers of primary liver tumors." Am J Pathol 142(5): 1483-92.
152. Volpes, R., J.J. van den Oord, V.J. Desmet (1993). "Integrins as differential cell lineage markers of primary liver tumors." American Journal Of Pathology 142(5): 1483-92.
153. Wang, N.D., M.J. Finegold, A. Bradley, C.N. Ou, S.V. Abdelsayed, M.D. Wilde, L.R. Taylor, D.R. Wilson, G.J. Darlington (1995). "Impaired energy homeostasis in C/EBP alpha knockout mice/' Science 269(5227): 1108-12.
154. Wang, W., Y. Hayashi, T. Ninomiya, K. Ohta, H. Nakabayashi, T. Tamaoki, H. Itoh (1998). "Expression of HNF-1 alpha and HNF-1 beta in various histological differentiations of hepatocellular carcinoma." J Pathol 184(3): 272-8.
155. Wang, W.X., M. Li, X. Wu, Y. Wang, Z.P. Li (1998)."HNF1 is critical for the liver-specific function of HBV enhancer II." Res Virol 149(2): 99-108.
156. Wegner, M., Z. Cao, M.G. Rosenfeld (1992). "Calcium-regulated phosphorylation within the leucine zipper of C/EBP beta." Science 256(5055): 370-3.
157. Weigel, D., G. Jurgens, F. Kuttner, E. Seifert, H. Jackie (1989). "The homeotic gene fork head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the Drosophila embryo." Cell 57(4): 645-58.
158. Weinstein, D.C., A. Ruiz i Altaba, W.S. Chen, P. Hoodless, V.R. Prezioso, T.M.
159. Jessell, J.r. Darnell JE (1994). "The winged-helix transcription factor HNF-3 beta is required for notochord development in the mouse embryo." Cell 78(4): 575-88.
160. Wogan, G.N. (2000). "Impacts of chemicals on liver cancer risk." Semin Cancer Biol 10(3): 201-10.
161. Wolfgang, C.D., B.P. Chen, J.L. Martindale, N.J. Holbrook, T. Hai (1997).gaddl53/Chopl0, a potential target gene of the transcriptional repressor ATF3." Mol Cell Biol 17(11): 6700-7.
162. Xanthopoulos, K.G., J. Mirkovitch (1993). "Gene regulation in rodent hepatocytesduring development, differentiation and disease." Eur J Biochem 216(2): 35360.
163. Xu, L„ L. Hui, S. Wang, J. Gong, Y. Jin, Y. Wang, Y. Ji, X. Wu, Z. Han, G. Hu (2001). "Expression profiling suggested a regulatory role of liver-enriched transcription factors in human hepatocellular carcinoma." Cancer Res 61(7): 3176-81.
164. Yamaguchi, Y., K. Nozawa, E. Savoysky, N. Hayakawa, Y. Nimura, S. Yoshida (1998). "Change in telomerase activity of rat organs during growth and aging." Experimental Cell Research 242(1): 120-7.
165. Yu, X., J.E. Mertz (1997). "Differential regulation of the pre-C and pregenomic promoters of human hepatitis B virus by members of the nuclear receptor superfamily." J Virol 71(12): 9366-74.
166. Zaret, K. (1998). "Early liver differentiation: genetic potentiation and multilevel growth control." Curr Opin Genet Dev 8(5): 526-31.
167. Zhang, D.E., X. Ge, J.P. Rabek, J. Papaconstantinou (1991). "Functional analysis of the trans-acting factor binding sites of the mouse alpha-fetoprotein proximal promoter by site-directed mutagenesis." J Biol Chem 266(31): 21179-85.
168. Zhong, W., J. Mirkovitch, J.r. Darnell JE (1994). "Tissue-specific regulation of mouse hepatocyte nuclear factor 4 expression." Mol Cell Biol 14(11): 7276-84.
169. Абелев, Г.И. (1988). О принципах организации тканей и их связи собразованием опухолей. Методологические вопросы изучения онкогенеза. Н. Н. Трапезников. Н. Соловьев and Г. X. Шингаров. Москва, Медицина: 127-138.
170. Абелев, Г.И. (2000). "Механизмы дифференцировки и опухолевый рост." Биохимия 65(1): 127-138.
171. БЭС (1986). Биологический Энциклопедический Словарь. Москва, "Советская Энциклопедия".
172. Варга, Е.В., И.Ф. Кустова, H.J1. Лазаревич (1999). "Экспрессия альфафетопротеина и гепатоцитарных ядерных факторов в клонах гепатомы крысы: влияние ретиноевой кислоты." Молекулярная Биология 33(2): 273-281.
173. Варга, Е.В., O.A. Черемнова, Д.А. Овчинников, А. Шапигузов, Е.И. Кудрявцева, О.В. Морозова, Н.В. Энгельгардт, Н.Л. Лазаревич (2001). "Экспрессия тканеспецифических генов при прогрессии гепатокарцином мыши." "Генетика" 37(6): 803-810.
174. Копнин, Б.П. (2000). "Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза." Биохимия 65( 1): 5-33.
175. Кудрявцева, Е.И., О.В. Морозова, Т.Д. Рудинская, Н.В. Энгельгардт (2001). "Нарушение межклеточных контактов и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом в быстрорастущей гепатокарциноме мышей." Архив Патологии 4: 33-37.
176. Куприна, Н.И. (1965). Органоспецифические антигены в печени иэкспериментальных гепатомах: Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. М.,.
177. Турусов, B.C. (1985). "Экспериментальные модели двухстадийного канцерогенеза." Экспериментальная онкология 7(3): 5-12.
178. Урываева, И.В., В. Бродский (1972). "Особенности репродукции гепатоцитов при регенерации печени мыши." Цитология 14(10): 1219-1228.
179. Урываева, И.В. В.М. Фактор (1975). "Фракция роста печени, ее состав поплоидности клеток и изменение при старении." Онтогенез 6(5): 458-465.
180. Фактор, В.М., И.В. Урываева (1972). "Митотический цикл диплоидных иполиплоидных клеток регенерирующей печени мыши." Цитология 14(7): 868-872.
181. Энгельгардт, Н.В., Е.И. Кудрявцева, О.В. Морозова, Т.Д. Рудинская (2000). "Скачкообразная прогрессия перевиваемой гепатокарциномы мышей, сопряженная с утратой полярности-клеток." Архив Патологии 62(3): 2429.