Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Гепатотоксичность противоопухолевых препаратов растительного происхождения паклитаксела и этопозида и ее фармакологическая коррекция

На правах рукописи

РГБ ОД

г е авг гоо8

ЕРМОЛАЕВА ЛЮБОВЬ АЛЕКСАНДРОВНА

ГЕПАТОТОКСИЧНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПАКЛИТАКСЕЛА И ЭТОПОЗИДА И ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ

14 00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2008

003445610

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН и ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Гольдберг Виктор Евгеньевич

Фомина Татьяна Ивановна

Зуева Елена Петровна Кондакова Ирина Викторовна

Ведущая организация.

ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 2008г в /Стасов на заседании диссертацион-

ного совета Д 001 031 01 в ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г Томск, пр Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Автореферат разослан Ш^ЛЛ- 2008г

Ученый секретарь

диссертационного совета „

доктор биологических наук ~ Амосова ЕН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В последние годы в лечении злокачественных новообразований все большее значение приобретает противоопухолевая химиотерапия При гемобластозах и диссеминированных формах солидных опухолей химиотерапия является основным методом лечения, а на ранних стадиях солидных опухолей она уснешно используется как компонент комплексного воздействия [Переводчикова Н И, 2005] Главным условием создания эффективных терапевтических программ по-прежнему остается разработка новых селективно действующих на опухолевые клетки цитостатических препаратов и их комбинаций [Поддуб-ная И В , 1998, 2003, Гершанович М Л, Филов В Л, Акимов М А и др, 1999] Как правило, цитостатические агенты применяются в высоких дозах, в результате чего достигается максимальное уничтожение опухолевых клеток. Это позволяет повысить эффективность химиотерапии злокачественных новообразований различных локализаций немелкоклеточного рака легкого, колоректалыюго рака, герминоген-пых злокачественных опухолей яичников и яичка, рака молочной железы, лимфогранулематоза и др [Моисеенко В М, 1999, Горбунова В А , 2002, 2006, Переводчикова Н И, Бычков М.Б, 2003, Орел Н Ф , 2004, Ре^ат М Б, Копсспу й Е, 0'Са1^!мп С, 2004], однако обусловливает и широкий спектр побочных реакций Наиболее изученными остаются токсические эффекты, лимитирующие проведение специфической терапии, со стороны быстро обновляющихся клеточных систем (кроветворной ткани, эпителия полости рта и желудочно-кишечного тракта, волосяных фолликулов, репродуктивных органов) [Гершанович М Л, Филов В А, Акимов М А и др, 1999, Птушкин В В, 2002] Важным аспектом в реабилитации, а значит и в улучшении качества жизни пациентов, прошедших курс химиотерапии, является тщательное изучение отдаленных последствий токсического влияния цитостатиков на различные органы и системы

Среди побочных эффектов противоопухолевого лечения нарушения функции печени ранее занимали незначительное место, но с появлением новых высокоэффективных антибластомных препаратов, а также с введением в опкологичсскую практику высокодознои химиотерапии, подобные осложнения выступили на первый план [Гершанович МЛ, 1982, Голиков СН, Саноцкий ИВ, Тиунов Л А, 1986, Городецкий В М, 1998, Ларионова В Б Горожанская Э Г, Коломейцев О А, 2004, Степанов Ю М, Филиппова А10, Кононов И Н, 2005, Ушкалова Е А, 2007] При поддерживающей химиотерапии небольшими дозами цитостатиков ге-патотоксичпость антибластомных средств нередко имеет длительное латентное бессимптомное течение, проявляясь изолированным повышением активности сывороточных трансаминаз В связи с этим, повреждение печени может диагностироваться лишь при углубленном обследовании и часта уже в отдаленные сроки [Гершанович М Л, Филов В А, Акимов М А и др 1999, Куценко С А, 2002]

Печень, являясь центральным органом метаболизма человеческою организма, обеспечивает биотрансформацию ксенобиотиков, в том числе, и цитостатиков [Богуш Г А, 1985, \Vatkins М Е), 1990, Куценко С А , 2002] Таким образом, можно

априори утверждать, что не существует лекарств, которые в определенных условиях не вызывали бы повреждения печени Экскреция биотрансформированных продуктов происходит с мочой и желчью [Буеверов А 0 , 2001, Куценко С А, 2002] При печеночной недостаточности, как показывают клинические наблюдения, самым серьезным является угнетение детоксицирующей функции печени, когда увеличивается период полураспада цитостатиков и их активных метаболитов в крови, что приводит к длительному поддержанию в организме высоких концентраций препаратов [Богуш ТА, 1985, Репу М.С, 1992, Lindros KD, 1997, Кинзирская Ю А, Богуш Т А, Остапчук Н В и др, 2003, McDonnell М Е, Braverman L Е, PatelKP et al, 2006]

Основную роль в превращении лекарственных веществ играют монооксиге-назы, осуществляющие одновремешга активирующую и детоксицирующую функции [Богуш Т А, 1985] В литературе имеется большое количество данных, демонстрирующих участие монооксигепаз печени в метаболизме цитостатиков [Богуш ТА, 1985, Schiano Т D, Black М, 1998, Groeneweg М, Quero J С, De Bruijn I et al, 2000, Кинзирская Ю A, Богуш T A, Остапчук H В и др, 2003]. Снижение эффективности указанной ферментной системы, происходящее при повреждении пече-почных клеток из-за низкой селективности действия противоопухолевых средств, приводит к увеличению токсичности этих препаратов [Богуш Т А, Богуш Е.А, Дурнов JLA и др, 2001, Ларионова В.Б, Горожанская ЭГ, Коломейцев OA, 2004]

Таким образом, угнетение метаболизма, возникающее вследствие повреждения гепатоцитов, создает условия для дальнейшего повреждения и нарушения функции печени, образуется «замкнутый круг» В такой ситуации приходится либо снижать дозу цитостатика, в результате чего терапевтический эффект еще более уменьшается, а токсичность остается на уровне полной дозы препарата, либо прерывать лечение, что может способствовать развитию рецидива опухолевого процесса [Богуш Т А, Богуш Е А, Дурпов JIА и др, 2001, Кинзирская 10 А, Богуш ТА,ОстапчукНВ идр,2003]

Важное место в развитии цитостатического поражения печени принадлежит активации процессов перекисного окисления липвдов, снижению аптиоксидантной защиты и повышению активности лизосомальных ферментов [Франциянц ЕМ, Сидоренко Ю С, Розенко Л.Я, 1995, Ветошкина Т В, Дубская Т Ю, Тимипа Е А, 1998, Ларионова В Б, Горожанская Э Г, Коломейцев О А, 2004] В связи с вышесказанным, перспективным является использование гепатопротекгорных средств с аптиоксидантной активностью для коррекции цито статической гепатотоксичности [Бурлакова Е Б, Пальмина Н П, 1990, Бунятян Н Д, Герасимова О А, Сахарова ТС идр, 1999] Среди гепатозащитных препаратов с подобным механизмом действия известны как синтетические, так и вещества природного происхождения [На-вашин С М, Вядро М М, 1989, Саратиков А С , Венгеровский А И, Батурина Н О и др, 1995, Егоров В А Мошкова Л В , Куркин В А, 1999, Оковигый С В , 2002]

Несмотря на сравнительно большое число работ, посвященных данной тематике, перечень используемых в клинике гепатопротекторов невелик наиболее часто используются препараты, содержащие эссенциальные фосфолипиды, силима-рин, витамины и аминокислоты [Саратиков А С, Венгеровский А И, Батурина НО и др, 1995, Буркова В Н, Венгеровский А И, Писарева СИ и др, 1998, Око-витыи С В, 2002] Актуальным остается вопрос фармакологической коррекции токсических нарушений в печени, вызванных цитостатиками, исходя из механизма их цитотоксического действия, а также изучение морфологического и функционального состояния печени в отдаленные сроки после противоопухолевой терапии

Цель исследования. Изучить морфологические и функциональные нарушения в печени экспериментальных животных, возникающие после применения противоопухолевых препаратов наклитаксела и этопозида, оценить возможность их фармакологической коррекции с помощью средств, обладающих антиоксидантной активностью

Задачи исследования*

1 Определить характер морфофункциональных измепений и их дипамику в печени крыс в ранние и отдаленные сроки после однократного введения наклитаксела в максимально переносимой дозе

2 Изучить характер морфо-функциональных изменений и их динамику в печени крыс в ранние и от даленные сроки после однократного введения этопозида в максимально переносимой дозе

3 Провести сравнительный анализ структурно-метаболических нарушений, вызванных противоопухолевыми препаратами

4 Изучить возможность фармакологической коррекции выявленных нарушений в печени с помощью средств с аотиоксидантной активностью - тиофана и эплира.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые установлено, что однократное внутривенное введение в максимально переносимых дозах противоопухолевых препаратов растительного происхождения паклитаксела и этопозида вызывает в печени экспериментальных животных морфологические и функциональные изменения, которые можно интерпретировать как острый токсический гепатит Впервые показано, что обнаруженные токсические изменения наиболее выражены в течение 30 суток после введения цитостатических препаратов, а часть нарушений сохраняется в течение всего срока наблюдения - 180 суток При этом этопозид оказывает более выраженное токсическое влияние на печень крыс по сравнению с паклитакселом Выявлено, что в основе повреждающего действия этопозида и паклитаксела на печень лежит активация иерекисного окисления ли-пидов и угнетение процессов микросомалыюго окисления

Новые знания фундаментального характера, касающиеся патогепеза токсического гепатита, вызванного введением пакпитаксела и этопозида в максимально переносимых дозах, и роли перскисного окисления липидов в повреждении мембран гепатоцитов, позволяют предложить в качестве гепатопротекторов средства с антиоксидантной активностью эплир и тиофап

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2006, 2007), региональных конференциях молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2007, 2008), конференции врачей-опкофармакологов «Проблемы онкофар-макологии» (Томск, 2008), 2-й и 3-й международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2007,2008)

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованной литературы Работа иллюстрирована 43 рисунками и 47 таблицами Библиографический указатель включает 255 литературных источников, из них 140 отечественный и 115 иностранных

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 190 белых беспородных крысах-самках, в возрасте 2,5 месяца, массой 150-250 г Содержание крыс осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986)

Противоопухолевые препараты - паклитаксел (Taxol, Bristol-Myers Squibb) и этопозид (Vepeside, Bristol-Myers Squibb) вводили животным однократно внутривенно в максимально переносимой дозе (МПД) Дозы препаратов были рассчитаны методом графического пробит-анализа при наблюдении за животными в течение 30 дней [Беленький М М, 1963] За величину МПД принимали дозу на пробитной сетке, вызывающую 5% гибель животных, которая оказалась равной для паклитак-села - 5 мг/кг и для этопозида - 30 мг/кг Цитостатики растворяли ex tempore в 0,9% NaCl и вводили в хвостовую вену крыс Контрольные животные получали эквиобъ-емное количество растворителя Материал для изучения морфологического и функционального состояния печени крыс после введения паклитаксела и этопозида забирали на 2,5,10, 15,30,90, 180 сутки после введения цитосгатиков

В качестве гепатопроте кторов были использованы препараты эплир (ООО «Биолит», г Томск, разрешен к применению в качестве БАД к пище, протокол №1 от 9 января 1997 г, регистрационное удостоверение МЗ РФ № 000962 Р 643 06 99) и тиофац (НИИ химии шггиоксидантов НГПУ, г Новосибирск) Эплир и тиофан вводили в дозе 30 мг/кг внутрижелудочно, в 1% крахмальной слизи ежедневно в течение 5 дней Введете начинали через 24 ч после применения цитостагиков Для оценки гепатопротекторного действия эплира и тиофана материал забирали на 10, 15,30 сутки после введения этопозида и на 10,15,30, 90,180 сутки после введения паклитаксела

Для гистологического исследования кусочки печени фиксировали в жидкости Карнуа Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Фельгену на ДНК, по Мак-Манусу на гликоген На препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, с помощью окулярной сетки Г Г Автапдилова (1990), содержащей 25 тест-точек, определяли площадь инфильтрации (%), среза печени На этих же препаратах подсчитывали количество пикнотизиро ванных и двуядсрных гепатоцитов па 500 печеночных клеток

В сыворотке крови крыс определяли активность АсАТ, АлАТ, 1ЦФ и 11111, кроме того, в сыворотке измеряли содержание малонового диальдегида (МДА), показателя интенсивности перскисного окисления липидов (ПОЛ) [Камышников В С, 2003] Для оценки функционирования микросомалыщй системы печени использовали гексеиаловый тест [Уланова И П, Авилова Г Г, 1970]

Для проведения статистической обработки полученного экспериментального материала производили подсчет среднего значения параметра и стандартной ошибки отклонения Значимость различий определяли с использованием непараметрического критерия Вилкоксона - Манна — Уитни Различия считали статистически достоверными при Р<0,05 [Лакин Г Ф, 1990]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование токсического влияния паклитаксела и этопозида на печень экспериментальных крыс показало, что в ранние сроки после их однократного внутривенного введения в МПД в печени животных развивались гемодинамиче-ские нарушения, мелкокапельная жировая дистрофия и моноцеллюлярные некрозы гепатоцитов, лимфомакрофагальная инфильтрация паренхимы и портальных трактов, снижение количества двуядерных гепатоцитов Вследствие отека и расширения синусоидов наблюдалась дискомплексация печеночных балок Наиболее выраженные нарушения происходили на протяжении первых 10-15 суток после введения цитостатиков Начиная с 30 суток, в печени животных имели место как остаточные повреждения, так и восстановительные процессы

Морфометрическая оценка гистологических препаратов печени, окрашенных гематоксилином и эозином, показала, что в течение 30 суток после введения паклитаксела и этопозида значительно увеличивалось количество гепатоцитов с пикно-тизированными ядрами На 2 сутки наблюдения их число при введении паклитак-

s

села превышало контрольные значения в 4 раза, а при введении этопозида - в 50 раз На 10 сутки использование паклитаксела приводило к увеличению исследуемого параметра более чем в 12 раз, а этопозида - в 57 раз, по сравнению с контролем (Рис 1) В паренхиме печени наряду с гепатоцитами с пикнотизировшгаими ядрами обнаруживались тельца Каунсилмена (округлые гаперэозинофилыгые образования с фрагментами ядра, или без него), представляющие собой гепатоциты в состоянии коагуляционного некроза [Гулак П В , Дудченко A M, Зайцев В В, 1985] К печеночным клеткам с пикнотизированными ядрами относятся как гепатоциты, погибшие в результате некроза, так и клетки, подвергшиеся апоптотиче-ской гибели Гибель клеток в данный период связана с неспецифической цитоток-сичносгью противоопухолевых препаратов [Филиппова M В, 1986, Голиков С H, Саноцкий И В , Тиунов Л А, 1995, Laidlaw S Т, Reilly J Т, Suarna S К, 1995, Фомина Т И, Ветошкина Т В, Дубская Т Ю, 1999] Погибшие клетки печени наблюдались преимущественно в центре дольки, где паренхима хуже кровоснабжается, и гепатоциты более чувствительны к токсическим воздействиям Имеются данные, что при обезвреживании ксенобиотиков в реакциях 1 фазы, катализируемых цито-хромом Р450 (который осуществляет и метаболизм паклитаксела и этопозида), в гепатоцитах происходит образование высокореакгивпых токсичных метаболитов, которые впоследствии инакгавируются путем конъюгации с глутагионом [Pumford N R, Halmes N С, 1997] В клетках печени 3-й зоны ацинусов имеет место высокая активпость Р450 и низкое содержание глутатиона, поэтому при введении цито-статиков в высоких дозах здесь образуется большое количество токсичных метаболитов, что приводит к истощению запасов глутатиона, развивается жировая дистрофия и некроз гепатоцитов [Логинов А С, Аруин Л И, 1985, Ltndros К D, 1997] Кроме того, для паклитаксела описана способность индуцировать bcl-2-,a для этопозида - р53-зависимый апоптоз [Lanni S, Scott Lowe W, Edward J, 1997, Стенина M Б, 2001, Custodio J В, Cardoso С M, Madeira V M et al, 2001, Kwan R, Burnside J et al, 2001]

К 30 (уткам эксперимента количество некротизированных гепатоцитов в печени крыс снижалось, но было все еще в 7 раз больше контроля при введении паклитаксела, и в 18 раз - при введении этопозида

По данным литературы в развитии непосредствешюго повреждения мембран клеток при цитостатическом воздействии ведущая роль отводится усилению процессов перекисного окисления липидов [Голиков С H, Саноцкий И В, Тиунов Л А, 1986, Франциянц Е M , Сидоренко Ю С, Розенко ЛЛ, 1995, Ветошкина Т В , Дубская Т Ю, Тимина Е А, 1998, Ларионова В Б, Горожанская Э Г Коломейцев О А, 2004] Перскисное окисление ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав мембран эндоплазматического ретикулума и митохондрий, приводит к высвобождению ферментов, включая цитохромы, в цитоплазму и активации апоптотиче-ского каскада, запускающего механизм программированной гибели клеток [Nelson S D, 1995, Sturgill M G, Lambert G H, 1997, Anderson К M, Seed T, Ou D et al, 1999, Ларионова В Б, Горожанская Э Г, Коломейцев О А, 2004]

6000 -

g 5000

14000 8

g 3000 -* 2000 1000 0

*

* *

10

15

30

90

180 сутки

Рис. 1 Содержание некротизированных гепатоцитов в печени крыс после однократного введения паклитаксела и этопозида

Рис. 3. Относительная площадь воспалительной инфильтрации печени крыс после однократного введения паклитаксела и этопозида

1:::Х] паклитаксел

30 сутки

Рис. 2. Уровень ГГТП в сыворотке крови крыс после однократного введения паклитаксела и этопозида

150

90 180 сутки

Рис. 4. Количество двуядерных гепатоцитов в печени крыс после однократного введения паклитаксела и этопозида И этопозид

Примечание: на Рис. 1-4 * - различия достоверны по сравнению с контролем при Р<0,05

Исследование активности процессов ПОЛ после введения паклитаксела и этопози-да проводилось по содержанию в сыворотке крови крыс МДА, высокотоксичпого конечного продукта ПОЛ Так, с 5 по 10 сутки после инъекции паклитаксела в крови животных отмечено высокое содержание МДА Повышение концентрации сывороточного МДА, яо сравнению с контролем, при введении этопозида происходило со 2 по 15 сутки Применение этопозида вызывало более выраженную стимуляцию ПОЛ, по сравнению с паклитакселом Причем на 15 сутки наблюдения содержание данного показателя при введении этопозида составило 605,6% от контроля, тогда как у животных, получавших паклитаксел, в этот срок зарегистрирована нормализация исследуемого параметра.

В сыворотке крови крыс после введения паклитаксела и этопозида отмечалось увеличение активности ферментов АлАТ, АсАТ, ЩФ, ГТТП Высокое содержание аминотрансфераз, ЩФ и 11 111, вызванное паклитакселом, нормализовалось уже к 15 суткам эксперимента, в то время как использование этопозида приводило к более длительному поддержанию в крови животных повышенной активпости ферментов восстаповление данных показателей до контрольных значений происходило лишь к 30 суткам после введения цитостатика (Рис 2) Повышение активности АлАТ и АсАТ является показателем нарушения целостности мембран гепа-тоцитов и свидетельствует об интенсивном цитолизе [Камышников В С, 2003] Нарушению структурно-функционального состояния мембран гепатоцитов способствует чрезмерная активизация ПОЛ Накопление реакционноспособных свобод-1гых радикалов и продуктов ПОЛ приводит к дезинтеграции липидного бислоя мембранных структур гепатоцитов, увеличению проницаемости мембран клеток и их органелл и формированию цитолитического синдрома, что сопровождается усиленным поступлением в кровеносное русло клеточных ферментов [Ларионова В Б , Горожалская Э Г, Коломейцев О А, 2004]

Увеличение в крови уровня ГТТП и ЩФ (ферментов, локализующихся в клетках, выстилающих желчные протоки) связано с нарастанием холестатического синдрома [Камышников В С, 2003] Отек, инфильтрация, нарушите балочного строения печеночных долек, видимо, приводят к застою желчи в желчных капиллярах и протоках, что и сопровождается повышением активности ГТТП и ЩФ ГТТП участвует в метаболизме глутатиопа, а, следовательно - в процессах микро-сомального окисления и обмепе аминокислот, поэтому увеличение активности фермента является показателем токсического поражения печени, некоторое снижение активности ГТТП к 30 суткам после введения цитостатиков может свидетельствовать об истощении запасов глутатиона и снижении антитоксической функции печени При введении паклитаксела и этопозида происходило угнетение обменных процессов в гепатоцитах снижение синтеза ДНК было констатировано на гистологических препаратах, окрашенных по Фельгену Оба препарата вызывали уменьшение содержания ДНК в ядрах гепатоцитов со 2 по 15 сутки опыта, к 30 суткам величина исследуемого показателя начала приближаться к контрольным значениям Использованные в работе противоопухолевые препараты не обладают прямым

повреждающим влиянием на структуру ДНК, подобно алкилирукмцим соединениям, плагиносодержащнм препаратам, анграцтшиновым антибиотикам [Гершанович M JI, Филов В А, Акимов M А, 1999] Снижение синтеза ДНК обусловлено анти-митогешюй активностью цитостатиков, но реализуется через различные механизмы Мишенью этопозида является фермент транскрипции топоизомераза II, кроме того, препараг способен ингибировать включение тимидина в Д1ПС [Clark PI S lev m M L, 1987, Павлова E Д, 1990, Saura J MacGibbon G, Dragunow M, 1997, Мещерякова H Г, 2004] Паклитаксел воздействует на тубулин микротрубочек, в результате чего блокируется процесс деления клетки, повреждается ее цитоскелет, что приводит к нарушению внутриклеточного транспорта (в том числе и транспорта нуклеотидов) и передачи трансмембранных сигналов [Стешша M Б, 2001, Carre M, Caries G, DouiIIard S et al, 2002, Ганыиина И П, Сельчус В Ю , 2004]

При гистохимическом исследовании срезов печени крыс, получавших паклитаксел и этопозид, выявлялась убыль гликогена из цитоплазмы гепатоцотов (наиболее выраженная на 10 сутки после инъекции цитостатиков), что позволяет утверждать о развитии нарушений углеводного обмена и ухудшении энергообеспе-чеиности гепатоцитов в условиях токсического поражения печени

При введении противоопухолевых препаратов было обнаружено увеличение относительной площади воспалительной инфильтрации печени (Рис 3) Так, при использовании паклитаксела данный показатель был выше контрольных значений более чем на 40% уже на 2 сутки и не снижался до 30 суток наблюдения Применение этопозида приводило к увеличению инфильтрации на 2 сутки эксперимента на 190%, по сравнению с контролем, максимальное значение относительной площади воспалительной инфильтрации наблюдалось на 10 и 15 сутки после введения цито-статика и превысило контрольные значения более чем в 4,5 раза Клеточная инфильтрация, по данным ряда авторов [Логинов А С, Аруин JIИ, 1985, Городецкий В M, 1998, Schiano TD, Black M, 1998, Скрипник И H, Невойт А В, Ворошилова Т А, 2007], может расцениваться в этом случае как неспецифичсская реакция печени на токсическое воздействие и являться одним из звеньев в патогенезе токсического гепатита, вызванного цитостатиками Сами цито статики и их токсичные метаболиты, стимулируя обменные нарушения, способствуют развитию жировой дистрофии печени, активизации пероксидации лип идо в и накоплению гидроксиль-ных радикалов Свободные радикалы запускают реакции ПОЛ, а также продукцию про воспалительных цитокинов, включая фактор некроза опухоли-а, шггерлейкин-6 и интерлейкин-8 [Nelson S D , 1995, Sturgill M G, Lambert G H, 1997, Полунина T E, 1999, Зимин IO В, Сяткин С П, Бсрсзов Т Т, 2001] Эти патологические реакции приводят к некрозам гепатоцитов и развитию воспалительной клеточной инфильтрации, как в портальных трактах, так и в дольках

В печени крыс после введения паклитаксела и этопозида отмечалось снижение количества двуядерных гепатоцитов (Рис 4) Достоверное уменьшите числа двуядерных клеток было выявлено уже на 2 сутки при введении паклитаксела и на 15 сутки исследуемый параметр составил 52% от контрольных значений Этопозид

на 2 сутки после введения также вызывал снижение количества двуядерных гепа-тоцитов почти в 2 раза по сравнению с контролем, минимальное значение данного показателя наблюдалось на 5 сутки исследования и было ниже контрольных значений более чем па 62% Такая убыль двуядерных клеток печени отражает угнетение пролиферативпой активности органа под действием цитостатиков и связана со способностью препаратов блокировать клеточный цикл [Кафиапи К А, Бронштейн И Б, 1988, Стенина М Б , 2001] Уменьшение числа двуядерных гепатоцитов в печени крыс описано при введении оливомицина, рубомиципа, кармипомиципа, пла-тидиама, циклофосфана [Семенов Н В, 1979, Филиппова М В , 1995, Фомина Т И, Ветошкипа Т В , Дубская Т Ю, 1999, Саратиков А С, Ратькин А В , Фролов В Н и др, 2004]

Максимальные альтеративные изменения в печени как при введении пакли-таксела, так и при введении этопозида развивались на протяжении первых 15 суток после инъекции противоопухолевых препаратов Начиная с 30 суток после однократного введения каждого из них, в печени сосуществуют как остаточные повреждения (моноцеллюлярные некрозы, жировая дистрофия и пимфомакрофагальная инфильтрация паренхимы печени), так и развивающиеся репаративные процессы увеличивается число двуядерных гепатоцитов (хотя и не достигает еще контроль-нога уровня), увеличиваются размеры клеток и ядер, появляются резко базофиль-ные ядра. Менее выраженными становятся явления отека и гемодинамические нарушения В цитоплазме гепатоцитов повышается содержание гликогена, в ядрах начинает увеличиваться содержание ДНК

В отдаленные сроки после введения исследуемых цитостатиков многие морфологические и функциональные показатели состояния печени крыс достигают контрольного уровня К 90 суткам наблюдения в группе животных, получавших пакл итак сел, отмечена тенденция к увеличению количества двуядерных гепатоцитов (этот показатель даже превысил контрольные цифры) и содержания ДНК в ядрах клеток до контрольных значений У крыс, которым вводили этопозид, в данный срок не отличались от контроля относительная площадь воспалительной инфильтрации, количество двуядерных гепатоцитов и содержание ДНК в ядрах клеток На 180 сутки эксперимента при введении паклитаксела оставалась повышенной только площадь воспалительной инфильтрации, все остальные показатели находились в пределах контроля В печени крыс, получавших этопозид, через 180 суток отмечалось высокое содержание (почта в 3 раза больше контроля) гепатоцитов с пикноти-зировапными ядрами, количество двуядерных печеночных клеток было достоверно выше контрольных показателей, что является, по-видимому, компенсаторной реакцией печени, направленной на восстановление клеточных элементов [Tanaka Y, Nagasued N, Kanashima R, 2006, Ярыпш К Н, 2007]

Повышенная гибель гепатоцитов в отдаленные сроки после цитостатическо-го воздействия и наличие лимфо-макрофагального инфильтрата в печени крыс могут свидетельствовать о трансформации острого токсического гепатита, вызванно-

го введением паклитаксела и этопозида, в хронический неактивный гепатит [Логинов А С , Аруин Л И, 1985]

При сравнении влияния исследуемых противоопухолевых препаратов на печень, можно заключить, что более токсичным является этопозид Так, при введении блокатора топоизомсразы, деструктивные, дистрофические и гемодинамические нарушения в печени крыс были более выражены Максимальная разшща с контролем по количеству гепатоцитов с шпшотизированными ядрами при введении этопозида составляла 63 раза, тогда как при введении паклитаксела -12 раз Введение этопозида сопровождалось более длительной гиперферментемией и более значительной активацией ПОЛ по сравнешпо с паклитакселом

Таким образом, однократное внутривенное введение паклитаксела и этопозида в МПД вызывает в печени крыс структурно-метаболические нарушения, по своим проявлениям соответствующие картине острого токсического гепатита Эти нарушепия являются однотипными и неспецифическими Подобпые изменения в печени отмечались и другими исследователями при введении антрациклиновых антибиотиков, препаратов платины, метотрексата, 6-меркаптопурина и др [Семенов Н В, 1979, Филиппова М В, 1995, Фомина Т И, Ветошкина Т В , Дубская Т Ю, 1999, Саратиков А С, Ратькин А В, Фролов В Н и др, 2004, Тапака У, №§аБие<1 ^КапавЫтаЯ., 2006]

Как следует из полученных данных и литературных источников, один из механизмов цитостатического повреждения печени при введении паклитаксела и этопозида связан с повышением интенсивности ПОЛ [Туиппа У У , Туиппа V А, Уа-кмсИ 1С « а1, 1995, Встошюша Т В, Дубская Т10, Тимина Е А и др, 1998] Поэтому, в качестве корректоров геиатотоксического действия паклитаксела и этопозида были выбраны фосфолипидный препарат природного происхождения эп-лир, обладающий выраженным мембранопротекторным действием, и тиофан - соединение с антиоксидантной активностью

Результаты проведенного исследования показали, что курсовое введение корректоров эплира и тиофана па фоне действия цитосгатиков эффективно ослабляло их повреждающее влияние Такие признаки повреждения печени как отек, ве-нозпая гиперемия, жировая дистрофия гепатоцитов при использовании корректоров были выражены в мепыпей степени, по сравнению с группами крыс, получавших только цитостатик

Использование эплира и тиофана приводило к снижению повышенного при введении исследуемых противоопухолевых препаратов количества пекротизиро-ванных гепатоцитов Дашшй эффект можно объяснить способностью корректоров ингибировать избыточную активацию ПОЛ, в связи с чем уменьшается повреждающее действие продуктов пероксидации на мембраны гепатоцитов Аптинекро-тическое действие корректоров более эффективно проявлялось на фоне введения этопозида, когда достоверное снижение числа печеночных клеток с пикнотизиро-вапными ядрами отмечалось уже на 10 сутки опыта, тогда как аналогичный эффект в группе паклитаксела проявлялся лишь к 90 суткам наблюдения Такое различие

можно объяснить большим вкладом ПОЛ в цитотоксичноегь этопозида, что и было продемонстрировано в наших исследованиях

Показано, что эплир и тиофан уменьшали концентрацию МДА в сыворотке крови крыс при введении цитостатиков По результатам проведенной работы тиофан отличался более выраженной антиоксидантной активностью по сравнению с эшшром Так, на фоне действия паклитакссла, применение эплира способствовало сцижеишо максимально повышенного на 10 сутки наблюдения содержания МДА в крови животных в 1,8 раза, а тиофана- в 2,7 раза (Рис 5) При введении этопозида, когда наибольший подъем МДА отмечался на 15 сутки, эплир приводил к уменьшению данного показателя в 3,5 раза, а тиофан - в 4,5 раза (Рис 6) Таким образом, тиофан и эплир обладают не одинаковыми антиокислительными свойствами, что обусловлено особенностями структурных компонентов, входящих в состав обоих препаратов В экспериментальных исследованиях специфической активности тиофана в НИИ химии антиоксида! 1тов НГПУ продемонстрировано, что в большинстве модельных систем тиофан существенно превосходит но антиоксидашшой активности ионол, пробукол, а-токоферол, кверцетин и убихинон Отличительной особенностью тиофана как антиоксиданта является способность эффективно нейтрализовать не только свободные радикалы, но и гидроперекиси, что обусловлено си-нергическим сочетанием антирадикалыюй активности его фенольных фрагментов с противопероксидным действием сульфидной группы [Просенко А Е, Терах Е И, Кандалинцева Н В и др, 2004] Антиокислительные свойства эплира связывают с имеющимися в его составе фосфолигшдами, ксантофиллами и каротиноидами, которые являются сильными акцепторами алкильных и перекисных радикалов Поэтому, встраиваясь в мембраны гепатоцитов, эти вещества нейтрализуют гидроперекиси, превращая их в неактивные оксикислоты, что приводит к обрыву цепей ПОЛ [Венгеровский А И, Паульс О В , Седых И М и др, 1988] Эшшр восстанавливает нормальный спектр фосфолипидов мембран, ингибируя фосфолиполиз и снижая образование лизофосфатидов Кроме того, полиненасыщенный фосфати-дилхолин эплира способен замещать молекулы эндогенного фосфатидилхолина, поврежденного в результате ПОЛ Иными словами, эплир способен как сам оказывать антирадикальное действие, так и повышать активность антиоксидантных систем оргапизма [Саратиков А С, Венгеровский А И, Батурина НО и др, 1995, Бс-лобородова Э И, Буркова В Н, Венгеровский А И и др, 1998, Буркова ВII, Венгеровский А И, Писарева С И, 1998]

Использование эплира и тиофана уже с 10 суток эксперимента вызывало достоверное снижение повышенной при введении этопозида и паклитаксела относительной площади воспалительной инфильтрации паренхимы печени и приводило к увеличению количества двуядерных гепатоцитов до контрольных значений Противовоспалительное действие эплира показано в клиническом исследовании на модели острого воспаления придатков матки [Петрова М С, Тихоновская О А, Ради-онченко А А и др, 1998, Тихоновская О А, Шустов ЛII, 2000] Имеются данные, свидетельствующие о том, что эплир воздействует на все фазы воспаления он ста-

билизирует мембраны клеток - эффекторов воспаления, чем снижает продукцию гистамина, серотонина, лизосомальных ферментов, интерлейкинов Это, н свою очередь, приводит к снижению проницаемости микрососудов и уменьшению экссудации Эплир активирует фагоциты и макрофаги и стимулирует восстановление поврежденных тканей [Логвинов С В, Арий Е Г, Байтингер В Ф, 2004, Саратиков А С, Буркова ВII, Венгеровский А И и др, 2004]

Вызванное тиофаном снижение воспалительной инфильтрации среза печени крыс, подвергавшихся цитостатическому воздействию, согласуется с результатами исследований об успешном применении тиофапа при токсических и вирусных гепатитах, а также воспалительных процессах различных локализаций [Просспко А Е, Вощинкин К И, Зайдман А М и др , 2004, Агеев А С, Сахаров А В, Просеп-ко А Е, 2005, Зайдман А М , Жуков Д В , Сахаров А В и др, 2005] Препарат приводил к улучшению микроциркуляции, снижал гиперпродукцию IgG и IgA и уровень циркулирующих иммунных комлсксов [Фридлянд И Ф, Просенко А Е Клепикова СЮ и др, 2001]

Одной из основных причин быстрого восстановления поврежденной цито-статиками печени при курсовом введении эплира и тиофапа является активизация гепатопротекторами регенераторных процессов в органе Стимуляция регенерации печеночной паренхимы осуществляется за счет увеличения количества двуядерных гепатоцитов и гипертрофии имеющихся клеток, что подтверждается данными, имеющимися в литературе [Хохлов АН, 2002, Ярыгин К Н, 2007] В экспериментальном исследовании на модели токсического поражепия печени циклофосфаном отмечалось увеличение количества двуядерных гепатоцитов, после курсового введения эплира [Саратиков А С, Ратышн А В , Фролов В Н и др, 2004] В других экспериментальных работах продемонстрированы репарационные свойства эплира на моделях заживления асептической раны, ожогов 2 степени, нейтронных лучевых поражений кожи [Саратиков А С, Буркова В Н, Венгеровский А И, 2004] Стимулирующее влияние тиофана на регенерацию костной ткани, кожи показано в ряде исследований [Просенко АЕ, Вощинкин КИ, Зайдман АМ и др, 2004, Агеев А С, Сахаров А В , Просенко А Е и др, 2005]

Использование эплира и тиофана приводило к восстановлению метаболических нарушений в печени (снижение синтеза ДНК и гликогена), отмеченных при введении паклитаксела и этопозида Такая активность корректоров, вероятно, связана с их способностью нейтрализовать свободные радикалы и гидроперекиси, образующиеся в результате активации цитостатиками ПОЛ и оказывающие повреждающее действие на специфические ферменты гепатоцитов, участвующие в углеводном обмене и обмене нуклеотидов [Буркова В Н, Венгеровский А И, Писарева С И и др, 1998, Просепко А Е, Терах Е И, Кандалинцева Н В и др, 2004]

Установлено, что курсовое введение эплира и тиофана снижало повышенную активность ферментов (АлАТ, АсАТ, ЩФ, ГГТП) в сыворотке крови крыс, получавших однократную инъекцию паклитаксела и этопозида в МПД

На рис. 5,7 щд паклитаксел ^ паклитаксел+эплир щ паклитаксел+тиофан

18 -,

.12 -

6 -

10

На рис. 6,8 ЕЭ этопозид

этопозид+эплир этопозид+тиофан

15

30

сутки

сутки

Рис. 5. Содержание МДА в сыворотке крови крыс при введении пак-литаксела и корректоров эплира и тиофана

контроль

сутки

Рис. 7. Продолжительность гексеналового сна у крыс при введении паклитаксела и корректоров эплира и тиофана

Рис. 6. Содержание МДА в сыворотке крови крыс при введении этопозида и корректоров эплира и тиофана

160 -1

г 80 -

#

контроль

10

15

30

сутки

Рис. 8. Продолжительность гексеналового сна у крыс при введении этопозида и корректоров эплира и тиофана

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с цитостатиком при Р<0,05; # - различия достоверны по сравнению с контролем при Р<0,05

Отмеченный эффект обусловлен мембранопротекторным и антиоксиданшым действием корректоров [Просснко А Е, Терах Е И, Кандалинцева Н В и др, 2004, Саратаков А С, Буркова В Н, Венгеровский А И и др , 2004] Препятствуя повреждению мембран гепатоцитов продуктами ПОЛ, эшшр и тиофан предотвращают выход мембранных и цитозольных ферментов в кровоток

Корректоры уменьшали продолжительность гексеналового спа у крыс, получавших паклитакссл и этопозид, что свидетельствовало о восстановлении активности микросомальных ферментов печени (система цитохрома Р450), осуществляющих метаболизм противоопухолевых препаратов При введении паклитаксела, эп-лир снижал время гексеналового сна до контрольных значений к 30 суткам наблюдения, а при использовании эплира на фоне этопозида данный показатель хоть и снижался по сравнепию с группой животных, получавших только этопозид, но не достигал значений контроля (Рис 7, 8) Введение тиофана после инъекции паклитаксела также приводило к восстановлению продолжительности гексепалового сна к 30 суткам опыта, однако в группе крыс, получавших этопозид, тиофан способствовал снижению длительности теста до значений контроля уже на 10 сутки эксперимента Таким образом, тиофан проявлял более выраженный протекторный эффект в отношении монооксигеназных ферментов печени Восстановление активности печеночных монооксигеназ под действием эплира подтверждается исследованиями А С Саратикова с соавт (2002), в которых показано, что эплир препятствует конвертации цитохрома Р-450 в каталитически инертный Р-420, т е гепатопротек-тор предохраняет от инактивации ключевой фермент метаболизма ксенобиотиков цитохром Р-450 Стимулирующее влияние тиофана на микросомальные ферменты печени описано М И Душкиным с соавт (2003) Авторы установили, что прием тиофана, добавленного в диету животных, приводит к достоверному увеличению активности в микросомах печени различных форм цитохромов Р450, в том числе участвующих в метаболизме цитостатиков (ЗА4/5)

Таким образом, установлено, что повреждающее действие паклитаксела и этопозида на печень складывается из неспецифического и специфического механизмов Специфическая гепатотоксичносгь паклитаксела и этопозида обусловлена их способностью блокировать митоз Паклитаксел останавливает деление клетки, связываясь с тубулином и повреждая ее цитоскелет, при этом нарушается транспорт пуклеотидов Этопозид ингбирует транскрипцию, воздействуя на топоизоме-разу II, и также влияет на транспорт пуклеотидов Результатом такого действия цитостатиков явилось нарушение синтеза ДНК в гепатоцитах, снижение активности регенераторных процессов, проявляющееся в уменьшении количества двуядерных гепатоцитов в печени крыс и, в конечном итоге, индукция апонтоза

Неспецифическое повреждение обусловлено нарушением процессов биотрансформации цитостатиков, осуществляющихся системой микросомальных ферментов печени В результате в клетках накапливается большое количество токсичных метаболитов, которые способны нарушить энергетические и обменные процессы в гепатоцитах, что приводит к развитию мелкокапелыюго стеатоза гепатоци-

тов Нарастание жировой дистрофии вызывает активацию ПОЛ и дальнейшее повреждение гепатоцигон продуктами липопероксидации Формируются моноцеллю-лярныс пекрозы, в кровь поступают мембранные и цитозольные ферменты - маркеры повреждения печени АсАТ, АлАТ и 11ТП К погибшим гепатоцитам мигрируют лимфоциты и макрофаги, которые выбрасывают провоспалительные цитокины, в паренхиме печени развивается реактивная воспалительная реакция Все это приводит к венозному застою и отеку, нарушению гисто архите ктоники печеночных долек, затруднению оттока желчи По-видимому, активные метаболиты этопозида обладают более выраженной прооксидантной способностью, так как у животных, получавших этопозид, отмечено большее содержание МДА в крови

Использование эплира и тиофана препятствовало реализации неспецифической гепаготоксичности паклитаксела и этопозида Корректоры нейтрализовали свободные радикалы и гидроперекиси, вызывая тем самым обрыв цепей ПОЛ и предотвращая развитие цитолиза и некроза гепатоцитов, кроме того, выявлена способность препаратов восстанавливать нормальную активность микросомалыюй системы печени крыс, что позволило ускорить выведение токсичных метаболитов паклитаксела и этопозида Эплир и тиофан оказывали противовоспалительное действие, стимулировали регенерацию в поврежденной печени, восстанавливали обменные процессы, что проявлялось нормализацией синтеза ДНК, гликогена и снижением выраженности жировой дистрофии гепатоцитов На основании полученных данных можно предположить, что тиофан обладает более выраженным гепа-топротекторным действием, по сравнению с эплиром

ВЫВОДЫ

1 Однократное введение в максимально переносимых дозах цитостатических препаратов растительного происхождения с различным механизмом действия - паклитаксела и этопозида вызывает в печепи крыс неотецифичсские структурно-метаболические нарушения, но своим проявлениям соответствующие острому токсическому гепатиту

2 Нарушения, выявленные после введения паклитаксела и этопозида, характеризуются экссудативпо-инфильтративными изменениями в печени, жировой дистрофией и моноцеллюлярпым некрозом гепатоцитов, развитием гипер-фермснтемии и стимуляцией процессов перекисного окисления липидов

3 Деструктивные и дистрофические изменения в печени экспериментальных животных, индуцированные введением паклитаксела и этопозида, максимально выражены на 10-15 сутки после их введения и сохраняются до 6 месяцев наблюдения

4 При введении противоопухолевых препаратов в дозах, эквивалентных по общетоксическому эффекту, этопозид оказывает более выраженное гепато-токсическое воздействие по сравнению с паклитакселом

5 Курсовое введение средств с антиоксидаптпой активностью - тиофана и эп-лира снижает повреждающее действие паклитаксела и этопозида на печень животных и ускоряет процессы ее регенерации

6 Использование тиофапа и эплира на фоне введения паклитаксела и этопозида приводит к нормализации активности аланинаминотрапсферазы, аспарта-таминотрансферазы, у-глутамилтранспептидазы, концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови крыс и длительности гексеналового сна, при этом тиофан обладает более выраженной антоксидантной активностью

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морфофункциональное состояние печени крыс при введении противоопухолевого препарата таксола // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии (Материалы конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) - Томск, 2005 - С 15-17 (соавтор Дубская Т Ю)

2. Токсическое действие вепезида на морфофункциональное состояние печени крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2005 - Приложение 1 - С 27-29 (соавторы Ветошкина Т В, Дубская Т Ю, Фомина Т И, Гольд-берг В Е)

3. Морфофункциональное состояние печени крыс в отдаленные сроки после введения противоопухолевого препарата этопозида // Вестник РГМУ - 2007 - №2 -С 269(соавторДубскаяТЮ)

4. Токсическое действие паклитаксела на морфофункциональное состояние печени крыс // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии (Материалы конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМП) - Томск,2007 -С 26-28

5. Токсическое действие этопозида на морфофункциональное состояние печени крыс // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии (Материалы региональной конференции молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН) - Томск, 2007 - С 39

6. Токсическое действие противоопухолевого препарата паклитаксела на морфофункциональное состояние печени крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2008 -№2 - С 225-228 (соавторы Ветошкина Т В, Дубская Т Ю, Фомипа Т И, Гольдберг В Е)

7. Возможность коррекции токсических эффектов паклитаксела // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии (Материалы региональной конференции молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН) - Томск, 2008 -С 66-68 (соавторы Колотова О В, Федорова Е П, Чурин А А)

8. Фармакологическая коррекция общетоксического действия паклитаксела // Проблемы онкофармакологии (Материалы конференции врачей опкофармаколо-гов) - Томск, 2008 - С 44-47 (соавторы Карпова Г В, Чурин А А, Фомина Т И идр)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланипаминотрансфераза АсАТ - аспартатаминотрансфераза I ГШ - у-глутамилтрапспсптидаза МДА - малоновый диальдегид МПД - максимально переносимая доза ПОЛ - перскиспое окисление липидов ЩФ - щелочная фосфатаза

Отпечатано в ООО «НИП» Томск, ул Советская, 47, тел 53-14-заказ № 4206-04, тираж 100 экз

Актуальность проблемы. В последние годы в лечении злокачественных новообразований все большее значение приобретает противоопухолевая химиотерапия. При гемобластозах и диссеминированных формах солидных опухолей химиотерапия является основным методом лечения, а на ранних стадиях солидных опухолей она успешно используется как компонент комплексного воздействия [Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний, 2005]. Главными условиями создания эффективных терапевтических программ по-прежнему остаются разработка новых селективно действующих на опухолевые клетки цитостатических препаратов и их комбинаций [Поддубная И.В., 1998, 2003; Гершанович M.JL, Филов В.А., Акимов М.А. и др., 1999]. Как правило, цитостатические агенты применяются в высоких дозах, в результате чего достигается максимальное уничтожение опухолевых клеток. Это позволило повысить эффективность химиотерапии злокачественных новообразований различных локализаций: немелкоклеточного рака легкого, колоректального рака, герминогенных злокачественных опухолей яичников и яичка, рака молочной железы, лимфогранулематоза и др. [Моисеенко В.М., 1999; Горбунова В.А., 2002, 2006; Переводчикова Н.И., Бычков М.Б., 2003; Орел Н.Ф., 2004; Pergam M.D., Konecny G.E., O'Callaghan С., 2004], однако обусловило и широкий спектр побочных реакций. Наиболее изученными остаются токсические эффекты, лимитирующие проведение специфической терапии, со стороны быстро обновляющихся клеточных систем (кроветворной ткани, эпителия полости рта и желудочно-кишечного тракта, волосяных фолликулов, репродуктивных органов) [Гершанович M.JL, Филов В.А., Акимов М.А. и др., 1999; Птушкин В.В., 2002]. Важным аспектом в реабилитации, а значит и в улучшении качества жизни пациентов, прошедших курс химиотерапии, является тщательное изучение отдаленных последствий токсического влияния цитостатиков на различные органы и системы.

Среди побочных эффектов противоопухолевого лечения нарушения функции печени ранее занимали незначительное место, но с появлением новых высокоэффективных антибластомных препаратов, а также с введением в онкологическую практику высокодозной химиотерапии подобные осложнения выступили на первый план [Гершанович M.JL, 1982; Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов JI.A., 1986; Городецкий В.М., 1998; Ларионова В.Б. Горожанская Э.Г., Коломейцев О.А., 2004; Степанов Ю.М., Филиппова А.Ю., Кононов И.Н., 2005; Ушкалова Е.А., 2007]. При поддерживающей химиотерапии небольшими дозами цитостатиков гепатотоксичность антибластомных средств нередко имеет длительное латентное бессимптомное течение, проявляясь изолированным повышением активности сывороточных трансаминаз. В связи с этим, повреждение печени может диагностироваться лишь при углубленном обследовании и часто уже в отдаленные сроки [Гершанович M.JL, Филов В.А., Акимов М.А. и др. 1999; Куценко С.А., 2002].

Печень, являясь центральным органом метаболизма человеческого организма, обеспечивает биотрансформацию ксенобиотиков, в том числе, и цитостатиков [Богуш Т.А., 1985; Watkins M.D., 1990; Куценко С. А., 2002]. Таким образом, можно априори утверждать, что не существует лекарств, которые в определенных условиях не вызывали бы повреждения печени. Экскреция биотрансформированных продуктов происходит с мочой и желчью [Буеверов А.О., 2001; Куценко С. А., 2002]. При печеночной недостаточности, как показывают клинические наблюдения, самым серьезным является угнетение детоксицирующей функции печени, когда увеличивается период полураспада цитостатиков и их активных метаболитов в крови, что приводит к длительному поддержанию в организме высоких концентраций препаратов [Богуш Т.А., 1985; Perry М.С., 1992; Lindros K.D., 1997; Кинзирская Ю.А., Богуш Т.А., Остапчук Н.В. и др., 2003; McDonnell М. Е., Braverman L.E., Patel К.Р. et al., 2006].

Основную роль в превращении лекарственных веществ играют монооксигеназы, осуществляющие одновременно активирующую и детоксицирующую функции [Богуш Т.А., 1985]. В литературе имеется большое количество данных, демонстрирующих участие монооксигеназ печени в метаболизме цитостатиков [Богуш Т.А., 1985; Schiano T.D., Black М., 1998; Groeneweg М., Quero J.C., De Bruijn I. et al., 2000; Кинзирская Ю.А., Богуш T.A., Остапчук H.B. и др., 2003]. Снижение эффективности указанной ферментной системы, происходящее при повреждении печеночных клеток из-за низкой селективности действия противоопухолевых средств, приводит к увеличению токсичности этих препаратов [Богуш Т.А., Богуш Е.А., Дурнов JI.A. и др., 2001; Ларионова В.Б., Горожанская Э.Г., Коломейцев О.А., 2004].

Таким образом, угнетение метаболизма, возникающее вследствие повреждения гепатоцитов, создает условия для дальнейшего повреждения и нарушения функции печени, образуется «замкнутый круг». В такой ситуации приходится либо снижать дозу цитостатика, в результате чего терапевтический эффект еще более уменьшается, а токсичность остается на уровне полной дозы препарата, либо прерывать лечение, что может способствовать развитию рецидива опухолевого процесса [Богуш Т.А., Богуш Е.А., Дурнов JI.A. и др., 2001; Кинзирская Ю.А., Богуш Т.А., Остапчук Н.В. и др., 2003].

Важное место в развитии цитостатического поражения печени принадлежит активации процессов перекисного окисления липидов, снижению антиоксидантной защиты и повышению активности лизосомальных ферментов [Франциянц Е.М., Сидоренко Ю.С., Розенко Л.Я., 1995; Ветошкина Т.В., Дубская Т.Ю., Тимина Е.А., 1998; Ларионова В.Б., Горожанская Э.Г., Коломейцев О.А., 2004]. В связи с вышесказанным, перспективным является использование гепатопротекторных средств с антирадикальной активностью для коррекции цитостатической гепатотоксичности [Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., 1990; Бунятян Н.Д., Герасимова О.А., Сахарова Т.С. и др., 1999]. Среди гепатозащитных препаратов с подобным механизмом действия известны как синтетические, так и вещества природного происхождения [Навашин С.М., Вядро М.М., 1989; Саратиков А.С., Венгеровский А.И., Батурина Н.О. и др., 1995; Егоров В.А. Мошкова Л.В., Куркин В.А., 1999; Оковитый С.В., 2002].

Несмотря на сравнительно большое число работ, посвященных данной тематике, перечень используемых в клинике гепатопротекторов невелик: наиболее часто используются препараты, содержащие эссенциальные фосфолипиды, силимарин, витамины и аминокислоты [Саратиков А.С., Венгеровский А.И., Батурина Н.О. и др., 1995; Буркова В.Н., Венгеровский А.И., Писарева С.И. и др., 1998; Оковитый С.В., 2002]. Актуальным остается вопрос фармакологической коррекции токсических нарушений в печени, вызванных цитостатиками, исходя из механизма их цитотоксического действия, а также изучение морфологического и функционального состояния печени в отдаленные сроки после противоопухолевой терапии.

Цель исследования. Изучить морфологические и функциональные нарушения в печени экспериментальных животных, возникающие после применения противоопухолевых препаратов паклитаксела и этопозида, оценить возможность их фармакологической коррекции с помощью средств, обладающих антиоксидантной активностью.

Задачи исследования:

1. Определить характер морфо-функциональных изменений и их динамику в печени крыс в ранние и отдаленные сроки после однократного введения паклитаксела в максимально переносимой дозе.

2. Изучить характер морфо-функциональных изменений и их динамику в печени крыс в ранние и отдаленные сроки после однократного введения этопозида в максимально переносимой дозе.

3. Провести сравнительный анализ структурно-метаболических нарушений, вызванных противоопухолевыми препаратами.

4. Изучить возможность фармакологической коррекции выявленных нарушений в печени с помощью средств с антиоксидантной активностью — тиофана и эплира.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые установлено, что однократное внутривенное введение в максимально переносимых дозах противоопухолевых препаратов растительного происхождения паклитаксела и этопозида вызывает в печени экспериментальных животных морфологические и функциональные изменения, которые можно интерпретировать как острый токсический гепатит. Впервые показано, что обнаруженные токсические изменения наиболее выражены в течение 30 суток после введения цитостатических препаратов, а часть нарушений сохраняется в течение всего срока наблюдения — 180 суток. При этом этопозид оказывает более выраженное токсическое влияние на печень крыс по сравнению с паклитакселом. Выявлено, что в основе повреждающего действия этопозида и паклитаксела на печень лежит активация перекисного окисления липидов и угнетение процессов микросомального окисления.

Новые знания фундаментального характера, касающиеся патогенеза токсического гепатита, вызванного введением паклитаксела и этопозида в максимально переносимых дозах, и роли перекисного окисления липидов в повреждении мембран гепатоцитов, позволяют предложить в качестве гепатопротекторов средства с антиоксидантной активностью эплир и тиофан.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2006, 2007), региональных конференциях молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2007, 2008), конференции врачей-онкофармакологов «Проблемы окофармакологии» (Томск, 2008), 2-й и 3-й международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2007, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 в журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 47 таблицами. Библиографический указатель включает 255 литературных источников, из них 140 отечественных и 115 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. Однократное внутривенное введение в максимально переносимых дозах цитостатических препаратов растительного происхождения с различным механизмом действия - паклитаксела и этопозида вызывает в печени крыс неспецифические структурно-метаболические нарушения, по своим проявлениям соответствующие острому токсическому гепатиту.

2. Нарушения, выявленные после введения паклитаксела и этопозида, характеризуются экссудативно-инфильтративными изменениями в печени, жировой дистрофией и моноцеллюлярныи некрозами гепатоцитов, развитием гиперферментемии и стимуляцией процессов перекисного окисления липидов.

3. Деструктивные и дистрофические изменения в печени экспериментальных животных, индуцированные введением паклитаксела и этопозида, максимально выражены на 10-15 сутки после их введения и сохраняются до 6 месяцев наблюдения.

4. При введении противоопухолевых препаратов в дозах, эквивалентных по общетоксическому эффекту, этопозид оказывает более выраженное гепатотоксическое воздействие по сравнению с паклитакселом.

5. Курсовое введение средств с антиоксидантной активностью - тиофана и эплира снижает повреждающее действие паклитаксела и этопозида на печень животных и ускоряет процессы ее регенерации.

6. Использование тиофана и эплира на фоне введения паклитаксела и этопозида приводит к нормализации активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глутамилтранспептидазы, концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови крыс и длительности гексеналового сна; при этом тиофан обладает более выраженной антиоксидантной активностью.

Заключение

Таким образом, повреждение структуры и функции печени является системным побочным эффектом применения большинства цитостатиков. Поражения печени, осложняющие цитостатическую терапию, варьируют по клинико-морфологическим характеристикам и тяжести; описаны цитотоксические и холестатические повреждения. Своевременное выявление гепатотоксических повреждений осложняется тем, что они зачастую носят латентный характер и могут обнаруживаться лишь в отдаленные сроки.

Противоопухолевые препараты растительного происхождения паклитаксел и этопозид в настоящее время широко применяются в онкологической практике и входят в современные схемы лечения рака яичников, опухолей молочной железы, межоклеточного рака легких. Механизм действия паклитаксела и этопозида не связан с непосредственным повреждением структуры ДНК, они блокируют клеточный цикл, селективно воздействуя на цитоплазматические и ядерные мишени. Паклитаксел блокирует митоз, ковалентно связываясь с тубулином и вызывая неправильную сборку микротрубочек, этопозид является ингибитором топоизомеразной активности. Из научной литературы известно, что метаболизм паклитаксела и этопозида осуществляется монооксигеназами печени, описаны единичные случаи возникновения гепатотоксических реакций при использовании этих цитостатиков. Однако отсутствуют данные о продолжительности поражения печени и сроках восстановительных процессов после химиотерапии паклитакселом и этопозидом.

Несмотря на существование большого количества гепатозащитных средств, число подобных препаратов, применяемых для снижения гепатотоксичности цитостатической терапии, невелико. В связи с этим, необходим дальнейший поиск корректоров, сочетающих в себе низкую токсичность, высокую эффективность и отсутствие стимулирующего влияния на рост и метастазирование опухолевых клеток.

Гепатопротекторы тиофан и эплир относятся к низкотоксичным соединениям, лишены аллергизирующих, иммунотоксических, мутагенных, эмбриотоксических свойств, способны благоприятно воздействовать на морфологию печени и ферменты биотрансформации при токсических гепатитах различной этиологии и не снижают эффективность химиотерапии. Гетерогенность химического состава препаратов обеспечивает широкий спектр их модулирующих и терапевтических эффектов. Все перечисленные свойства обусловливают перспективность использования тиофана и эплира для снижения гепатотоксичности противоопухолевой химиотерапии.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Экспериментальные животные

Эксперименты проведены на 190 белых беспородных крысах-самках в возрасте 2,5 месяца массой 150-250 г. Животные были получены из питомника «Рассвет» ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН, г. Томск (сертификат имеется). В исследуемых экспериментальных группах крысы имели одинаковую среднюю массу. Крысы содержались в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). До и в период эксперимента крысы находились в виварии при 1:.ВОзд = 20-^22 °С; влажности - не более 50%; объеме воздухообмена (вытяжка: приток) - 8:10; в световом режиме день-ночь; в стандартных пластиковых клетках (не более 10 особей в каждой) с мелкой древесной стружкой; на стандартном рационе — гранулированный корм ПК 120-3 (согласно приказу № 1179 МЗ СССР от 10.10.83).

В соответствии с задачами исследования крысы были разделены на группы (Таблица 1). В каждой группе было не менее 5 крыс.