Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Гено-фенотипические корреляции при болезни Вильсона в Республике Башкортостан

□030В344-;

На правах рукописи

МАГЖАНОВА АЛИЯ РИМОВНА

ГЕНО-ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ КОРРЕЛЯЦИИ ПРИ БОЛЕЗНИ ВИЛЬСОНА В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

14 00 13 - нервные болезни 03 00 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 1 Млп ?пп?

УФА - 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Хуснутдинова Эльза Камилевна Мурзабаева Салия Шарифьяновна

Шутов Александр Алексеевич Викторова Татьяна Викторовна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение зысшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 29 мая 2007 г в 10 часов на заседании диссертационного совета К 208 006 02 при Государственном образовательном учреждении зысшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 450000, г Уфа, Пр Октября, 71

2 диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по ¡дравоохранению и социальному развитию» по адресу 450000, г Уфа, ,'л Ленина, 3

Автореферат разослан апреля 2007 г

/ченый секретарь диссертационного совета,

зоктор медицинских наук, профессор Бабушкина Г В

ОБЩ V51 XAPAJLTEPIíClI!-. 1 ¡'Л. ; i Ы Актуальность проблемы. Гепатолентикулярная дегенерация (ГЛД) или болезнь Вильсона (БВ) - аутосомно-рецессивное полисистемное заболевание, обусловленное избыточным накоплением в организме и токсическим воздействием меди, характеризующееся сочеганным поражением внутренних органов и мозга Частота БВ составляет 1-3 на 100 ООО населения с неравномерным географическим и этническим распространением [Brewer G J , 1999]

Заболевание обусловлено мутациями в гене АТР7В, локализованном на длинном плече 13 хромосомы (13ql4 3), вследствие чего нарушается функционирование медь-транспортирующей АТФ-азы, внутриклеточный транспорт меди в гепатоцитах и выведение излишков меди с желчью, а также включение ее в молекулу церулоплазмина [Горбунова В H и др , 2002, Илла-риошкин С H и др , 2002, Thomas GR et al, 1995] Это приводит к гипоце-рулоплазминемии (биохимический маркер заболевания), увеличению концентрации "свободной" (не связанной с церулоплазмином) меди в крови, к развитию хронической медной интоксикации, накоплению ее в различных тканях и органах, прежде всего, в печени, мозге, почках, роговице, эритроцитах, дистрофическим и некротическим изменениям в них, чем и обусловлена клиника заболевания [Иванова-Смоленская И А и др , 2002]

Ген АТР7В состоит из 21 экзона и расположенных между ними нитронов, экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфоузлах [Okada Т et al, 2000] Характерными для болезни Вильсона являются различные танковые мутации гена АТР7В, а также мелкие инсерции и делеции, вызывающие сдвиг рамки считывания На сегодняшний момент известно свыше 280 различных мутаций гена АТР7В [www hgm org], из них наиболее распространенной в европейских популяциях, в России, в том числе и в Башкортостане, является миссенс-мутация Hisl069Gln [Карунас А С, 1999, Иллариошкин С H и др , 2002] Болезнь Внльсона характеризуется выраженным клиническим полиморфизмом в отношении как неврологических, так и соматических проявлений Изучению соотношения генотипа и фенотипа при БВ в разных популяциях мира уделяется пристальное внимание исследователей, но до сих пор нет объяснения разнообразию проявлений и тяжести течения при данной генетической патологии, а также выраженному внутрисемейному полиморфизму [Карабанов А В , 2000, Stapelbroek J M et al, 2004, Vrabelova S et al, 2005, Hermann W et al, 2006]

Цель исследования клиническое и молекулярно-генетическое изучение болезни Вильсона в Республике Башкортостан для оптимизации диагностики и лечебно-профилактической помощи.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1 Изучить распространенность и варианты клинического течения болезни Вильсона в Республике Башкортостан

2 Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене АТР7В и оценить их частоты у пациентов с болезнью Вильсона из Республики Башкортостан

3 Исследовать ассоциации обнаруженных мутаций с гаплотилами полиморфных ДНК-локусов (0138316, 0138133, 0138228), сцепленных с геном АТР7В

4 Изучить корреляции генотипа и фенотипа при болезни Вильсона в Республике Башкортостан

5. Оптимизировать подходы к диагностике и ведению пациентов с болезнью Вильсона в Республике Башкортостан и создать национальный компьютерный регистр "Болезнь Вильсона"

Научная новизна. Впервые в Республике Башкортостан проведено комплексное клиническое и молекулярно-генетическое исследование болезни Вильсона Выявлено 8 различных мутаций в гене АТР7В Впервые обнаружены две не описанные ранее мутации: А1а718Рго и Ьуз1315_Аг§]316{Зе11п$01и, последняя выявлена с высокой частотой (10,7%) Впервые в Республике Башкортостан обнаружены описанные ранее мутации Ьеи1305Рго и Ме1769Гз, 2 экзонных (Уа1456Ьеи, Уа11140А1а) и 1 интронный (1У818+бОТ) полиморфизмы Впервые в Республике Башкортостан оценено влияние различных мутаций в гене АТР7В на клинические проявления болезни Вильсона, так, гомозиготы по частой мутации Н|зЮ6901п характеризуются более мягким течением заболевания с поздней манифестацией, у пациентов с мутацией Ьуз1315_А^1316с1е1т8С1и отмечено тяжелое течение болезни с ранней манифестацией и выраженными нарушениями функций печени.

Практическая значимость. Установление мутаций на 83,93% хромосом дает возможность повысить эффективность молекулярно-генетической диагностики заболевания в Республике Башкортостан Выявление второй по

частоте мутации Lys 1315_Argl316deiinsGlu в гене АТР7В делает целесообразным скрининг вновь выявляемых пациентов с болезнью Вильсона в Республике Башкортостан на данную мутацию после проведения поиска самой частой мутации HisI069GIn в 14-ом экзоне Полученные данные о распределении семей с мутантными аллелями в гене АТР7В на территории Республики Башкортостан и оценка влияния генотипа на течение заболевания способствуют повышению качества лечебно-диагностической и медико-генетической помощи населению В двух семьях проведена пресимптомати-ческая ДНК-диагностика забопевания

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Болезнь Вильсона в Республике Башкортостан по частоте встречаемости сопоставима со средними показателями в мире и имеет неравномерное территориальное и этническое распространение

2 Обнаружены 8 мутаций и 3 полиморфных варианта в гене АТР7В Наиболее частой мутацией у пациентов с болезнью Вильсона в РБ является мутация Hisl069Gln (48,2%) гена АТВ7В, встречающаяся преимущественно в компаунд-гетерозиготном состоянии в сочетании с другими редкими мутациями Второй по частоте является впервые выявленная мутация Lysl 315_Arg 1316delinsGlu (10,7%)

3 При болезни Вильсона прослеживается определенная взаимосвязь по некоторым показателям между генотипом и фенотипом, но нет однозначной зависимости клинической картины только от мутационного дефекта в гене A TP 7 В

4 Мутации в гене АТР7В ассоциированы с определенными гаплотипа-ми полиморфных ДНК-локусов D13S316, D13S133, D13S228

Внедрение результатов исследования. Разработанная формализованная карта и автоматизированный регистр «Болезнь Вильсона» используются в лечебно-диагностической деятельности медико-генетической консультации РПЦ, неврологической клиники РКБ им Г Г Куватова Результаты проведенных исследований используются в учебной и научно-исследовательской работе кафедр неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики и биологии с основами генетики ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава»

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на V Российском съезде медицинских генетиков (Уфа, 2005 г), на конфе-

ренции Европейского общества генетики человека (Прага, Чехия, 2005г ), на XIII Всемирном конгрессе по психиатрической генетике (Бостон, США, 2005 г), на IX Всероссийском съезде неврологов (Ярославль, 2006 г)

Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета и Ученого совета Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (06 04 2007 г)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе в журнале, рекомендованном ВАК

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы Работа иллюстрирована 44 рисунками и содержит 26 таблиц Список литературы содержит 217 источников, из которых 58 отечественных и 159 зарубежных авторов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клинико-эпидемиологическое исследование. В работе использованы данные о 60 пациентах и 11 сибсах пробандов из 49 семей с болезнью Вильсона, полученные в ходе личного осмотра пациентов и из архивных данных МГК РПЦ, РКБ им Г.Г.Куватова, из материалов ежегодных отчетов неврологической службы РБ за 2000-2006 гг Дата 1 января 2007 года выбрана как дата окончания сбора информации для исследования Данные о каждом пациенте, собранные из всех возможных источников, заносились в специально разработанную нами формализованную карту (ФК) и впоследствии вносились в генетический регистр «Болезнь Вильсона в РБ»

В случае подтверждения клинического диагноза болезни Вильсона проводился забор крови у пробанда и ближайших родственников для проведения молекулярно-генетического исследования Показатель распространенности рассчитывался на 100 000 населения В исследование включены пациенты с диагнозом «болезнь Вильсона» (Е 83 0 по МКБ-10), установленным на основании клинико-генеалогического, неврологического, лабораторно-инструментальных и молекулярно-генетического методов исследований в соответствии с современными диагностическими критериями [Иванова-

Смоленская ИЛ. Маркова ЕД, Илларпопшш С!', !<}'" 41 г Г ' ,

2002]

Степень тяжести заболевания определялась по шкале 0 баллов - пресимптоматическая стадия; легкая ст 1 балл - легкие проявления, выявляются при специальных

исследованиях и нагрузочных пробах, мягкая ст 2 балла - отчетливые симптомы, выявляются в покое,

трудоспособность снижена, умеренная 3 балла - выраженные симптомы, трудоспособность утрачена,

себя обслуживают, тяжелая 4 балла - резко выраженные симптомы, нуждаются в посторонней помощи, 5 баллов - exitus letalis Молекулярно-генетическое исследование. В работе использовался банк ДНК больных с БВ (39) и членов их семей (96) из РБ, а также ДНК здоровых лиц, жителей Башкортостана, различной этнической принадлежности русской (43), татарской (40) и башкирской (40) Забор крови производился с информированного согласия больных и их родственников после тщательного медицинского осмотра, ознакомления с медицинской документацией и уточнения сведений об этнической принадлежности

ДНК была выделена из лейкоцитов периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции по Mathew С С [1984] из 8 мл крови Анализ полиморфных ДНК-локусов D13S316, D13S133 и D13S228 проводили методом ПЦР Исследование образцов ДНК на наличие мутаций и полиморфизмов в 19 экзонах (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 18, 19, 20) гена АТР7В проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) [Orita М et al, 1989] Определение нук-леотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 310 (Applied Biosystems) Для подтверждения результатов секвенирования использовали метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

Статистическая обработка результатов. Для сравнения распределения частот встречаемости аллелей полиморфных ДНК-локусов использована компьютерная программа RxC (Rows х Columns) на основе алгоритма, описанного Роффом и Бенценом (1989) При анализе корреляций использовались

программные пакеты StatSoft STATISTICA 6 0 и Microsoft Excel с модулем Analyse-It.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Клиннко-эпидемиологическое исследование болезни Вильсона в Республике Башкортостан.

За исследуемый 40-летний период (1967-2006 гг) в РБ выявлен 71 больной БВ из 49 семей в 7 городах из 20 и в 18 районах из 54 по месту проживания пациентов к моменту их выявления Семейные случаи заболевания составили 34,7%, т е более чем 1/3 всех случаев В целом, в городах выявлены 25 семей (34 больных), в сельской местности - 24 семьи (37 пациентов) Территориальное распределение 35 семей с БВ, коренных жителей РБ, по месту их происхождения оказалось неравномерным, при этом подавляющая часть семей являлась уроженцами центрально-западных районов (рис 1)

Условные обозначения этнического состава семей О-башшры ф- русские <3-татары чуваши

Рис. 1. Распространение БВ на территории РБ (по происхождению семей).

Выявлены пучковый характер распределения пораженных семей с определенной концентрацией носителей гена БВ на территории РБ, а также незначительное расширение географии заболевания за последние 20 лет, связанное с миграцией брачных партнеров из мест происхождения своих предков в города республики

Пучковый характер территориального распределения БВ предполагает более высокую частоту мутантного аллеля в определенных районах республики и, отсюда, более высокую вероятность регистрации в них новых случаев заболевания вследствие вступления в брак гетерозигот по гену АТР7В Это определяет необходимость большей осведомленности и настороженности в этих регионах РБ служб здравоохранения, врачей различного профиля - интернистов, педиатров, неврологов и других специалистов в отношении БВ, проведения диагностического поиска в группах повышенного риска

По этнической принадлежности все выявленные семьи распределились следующим образом 11 русских, 19 татарских, 5 башкирских, 3 чувашских и в 11 семьях имел место межнациональный брак родителей пробандов Исходя из численности в РБ народов разной национальности по итогам последней переписи населения 2002 г и количества живых больных на момент переписи в изоэтнических семьях, распространенность БВ составляет среди русских 1 186339 (0,54 10"s), среди татар 1 110078 (0,91 10"5), среди башкир 1 407101 (0,24 10"5), среди чувашей 1. 29329 (3,41 10"5) Приведенные данные убедительно показывают неравномерность распространения БВ в популяциях РБ с более высокой ее частотой в этнической группе чувашей и татар (t = 3,2, р=0,04) В определенной мере это может быть связано с историей формирования популяций и особенностями их брачных традиций Кровное родство родителей больных не было установлено ни в одной из 49 семей, но в 2/3 семей родители и прародители пробандов происходили из одного или близ расположенных сел, т е имел место эндогамный характер браков

На 1 января 2007 года в республике проживают 34 пациента с болезнью Вильсона из 27 семей (из них 17 семейных случаев из 10 семей) Это определило уровень распространенности заболевания 0,83 на 100 000, что в 1,3 раза выше по сравнению с показателем (0,62) предшествующего 20-летнего периода Последнее может быть объяснено, прежде всего, увеличением продолжительности жизни больных и их накоплением в популяции благодаря проведению патогенетической медьэлиминирующей терапии Свидетельст-

вом этому может служить тот факт, что средняя продолжительность болезни у больных, умерших в первый двадцатилетний период (1967 — 1986 гг), составляет 5,3 ±4,5 лет, тогда как во второй (1987 — 2006 гг.) - 15,2 ± 13,5 лет, те в 3 раза больше (1 = 2,9, р<0,01) Немаловажное значение имеет также улучшение выявления пораженных семей вследствие применения высокоинформативных молекулярно-генетических методов подтверждающей диагностики заболевания Показатель распространенности БВ среди городского населения республики (0,87 10"5) заметно не отличается от показателя распространенности ее среди сельского населения (0,79 10"5) Это может свидетельствовать об одинаково высоком диагностическом уровне неврологической помощи как городским жителям РБ, так и жителям села Показатель распространенности болезни Вильсона в РБ сопоставим с большинством данных, приводимых в литературе [Руденская Г Е и др ,1996]

Из 34 наблюдаемых в настоящее время пациентов с БВ лиц мужского пола - 13, женского - 21, при этом соотношение мужчин и женщин составило 0,62.1, т е женщин оказалось в 1,6 раза больше, чем мужчин В то же время в предшествующее двадцатилетие (1967-1986 гг) имели место обратные пропорции М'Ж - 1,5 1 При включении в анализ всех случаев БВ за 40-летний период (1967-2006 гг) оказалось лиц мужского пола 34, женского -37 и соотношение М Ж составило 1:1,09, т е было почти равным, что соответствует теоретически ожидаемому распределению при аутосомно-рецессивном типе наследования. За анализируемый 40-летний период времени летальность в выборке больных БВ из Башкортостана составила 50,7% Возраст умерших больных колебался от 8 до 49 лет, составив в среднем 24,0 ± 10,0 лет, длительность болезни - от 1 года до 37 лет, в среднем 8,5 ± 9,2 года.

В соответствии с принятой в нашей стране клинической классификацией болезни Вильсона, предложенной Н В Коноваловым (1960), выявленные больные распределились следующим образом (рис 2) В общей выборке больных БВ из РБ преобладает дрожательно-ригидная форма (28 больных), за которой следует дрожательная (20 больных), затем преневрологическая или висцеральная («брюшная») форма (12 больных) и пресимптоматическая (8 чел) На редкую встречаемость наиболее тяжелой из неврологических форм - ригидно-аритмогиперкинетической указывают и другие авторы [Лекарь П Г, Макарова В А ,1984, Карабанов А.В , 2000]

ЕЭ Про симптоматическая В Прелевроло плеская

□ Ригашю-арнгмо гш (еркннгп гч е екая

□ Дрожательно-ригидная

В Дрожательная

Рис. 2. Распределение Гкшьны! Г>Ц из Р1» по клиническим формам (па момент выявления),

Возраст начала болезни в общей выборке больных варьировал от 7 до 36 лег, составив в среднем 17,9 ± 7,5 лет, что согласуется с данными литературы [Перкин Г.Д., 1994]. Он значимо не отличался у мужчин - 18,6 ± 8,4 года и женшин - 17,2 ± 6,6 лет, т.е. заметного модифицирующего влияния пола на возраст манифестации БВ в выборке больных из РБ не обнаружено. Средний возраст появления соматических расстройств, 15,0 ± 6,3 года, опережал дебют неврологических нарушений - 21,9 ± 7,3 года на 7 лет, что отражает более раннее поражение висцеральных органов и определяет необходимость ознакомления широкого круга врачей терапевтического профиля с особенностями течения БВ. Наименьший возраст манифестации Б В отмечен у больных с висцеральной и ранней р и ги дн и - ар итм огиперки нетн ческой формами заболевания, что, несомненно, характеризует тяжесть их течения в отличие от более благоприятной дрожательной формы (рис.3).

|25

Iго

¡15

г

Ь 10

Я

&

I 5 0

Преневролоточсскяя Ригидно- Д^жагельгю-рвгщпяя Дрохятелыпа ;э рнгм о ш пс рки] ге гнче с юа н

Рие. 3- Средний возраст манифестации при разных клинически* формах БВ.

У 16 пациентов с дрожательно-ригидной формой БВ отмечен соматический дебют в возрасте 15,8 ± 7,5 лет, неврологическая симптоматика развилась у них через 4,1±3,2 года Из 28 выявленных больных 14 умерли в возрасте 26,9 ± 11,3 года с длительностью болезни 11,5±9,8 лет. Представленные данные подтверждают наблюдения других авторов о сравнительно тяжелом течении этой формы БВ [Готовцева ЕВ, 1974, Лекарь ПГ, Макарова В А,1984, Иванова-Смоленская И А и др,1998] В группе с висцеральной формой болезни на первый план выступала печеночная патология, которая протекала в двух формах скоротечной (острой), проявлявшейся желтухой, асцитом и гибелью от печеночной недостаточности (9 чел), и постепенной (хронической), с клинической картиной хронического активного гепатита при отсутствии неврологической симптоматики (3 чел )

О двух основных вариантах течения поражения печени при БВ указывается и в литературе [Коларски В ,1980, Шайнберг Г ,1996] Нередко, однако, вызываемое скоплением меди повреждение печени переходит в цирроз без каких бы то ни было проявлений гепатита В этом случае начальные признаки болезни бывают внепеченочными, чаще всего неврологическими [Шайнберг Г ,1996]

При активном целенаправленном обследовании членов семей после обнаружения больного с БВ были выявлены 8 сибсов в ранней стадии, которая описывается в литературе под разными названиями: преклиническая, пресимптоматическая, бессимптомная, ранняя висцеральная [Готовцева Е В , 1974, Лекарь П Г, Макарова В А.,1984, Шайнберг Г ,1996; ВасЬшапп Н й а1, 1980]. Возраст пациентов колебался от 12 до 33 лет, составляя в среднем 19,4 ± 6,4 года. При тщательном сборе анамнеза у 3 пациентов из группы были выявлены указания на перенесенную желтуху в детском или подростковом возрасте, еще у 2 при лабораторном и инструментальном исследовании установлены признаки латентно текущего хронического гепатита. Последующее наблюдение за пациентами и результаты молекулярно-генетического исследования подтвердили диагноз БВ Именно у лиц данной группы превентивное или рано начатое лечение купруретиками оказывается высокоэффективным и позволяет предотвратить клиническую манифестацию заболевания Молекулярно-генетическое исследование болезни Вильсона. При проведении ЯБСР-анализа экзонов, сайтов сплайсинга и прилегающих интронных областей гена АТР7В найдены изменения электрофоре-

тической подвижности однонитевой ДНК в восьми экзонах (3, 6, 13, 14, 15, 16, 18, 19). В 14-ом экзоне обнаружено 4 типа изменений, при последующем секвенировании определены 2 мутации: Ш5Ю6901п и О1и1064Ьу8 (рис.4). Траисверсия С на А в 3207 положении, которая приводит к замене гистидина на глутамин в 1069 положении белка АТР7В, установлена в гомозиготном состоянии у 5 пациентов с БВ из 4 семей, в гетерозиготном - у 25 больных из 19 семей из РЬ. Таким образом, частота данной мутации в РБ составила 48,2%; она обнаружена на 55,5% хромосом русского происхождения и на 38,9 % - татарского, что сопоставимо с частотой данной мутации в других европейских популяциях. [Сайга Е. е1. а!., 2000; Саса.К е1. а1,, 2001; УгаЬе^а 5. е1, а!„ 2005; Ро1Ьо)Тег А., Бегепс! Р. е1. а!., 2007]. Также она найдена на 4 из 9 хромосомах башкирского происхождения, и на 5 из 6 чувашского.

Мутация СЫ064Ьу5, при которой происходит транзииия О на А в | 3190 основании, приводящая к замене глутаминовой кислоты на лизин в 1064 ; положении белка, была определена секвенированием и подтверждена ПДРФ-анализом с использованием рестриктазы Мп1\ в стандартных условиях.

1234 567 89 Рис. 4. Электрофореграмма SSCP-аналта 14 жзона гена АТР7В,

1 - контрольный образец ДНК здорового человека, N/N

2, 3 - гетерозиготы по Glul064Lys мутации (III тип изменений подвижности)

5,6 - больные без мутаций в 14 экзоне

7 - гомозигота по мутации Hisl069Gln (1 тип изменений)

8 - ко мпаунд-гетсро зигота по мутациям HislC69Gln и Glul064Lys (IV тип изменений ))

9 - гстерозигота но Hisl069Gln мутации (IIтип изменений)

V 5 пациентов из 4 семей в гетерозиготном состоянии {3 русского и 1 русско-литовского происхождения), причем в 2-х семьях она найдена в компаунд-гетерозиготном состоянии в сочетании с мутацией Hisl069Gln на второй хромосоме. Ранее эта мутация была описана с низкой частотой у турков IFigus А. ei al., 1995), венгров [Folhoffer F. et а!., 2003], чехов [Viabelova S. й al., 2005). При скрининге 19 экзона гена АТР7В с помощью SSCP-анализа у больных БВ обнаружено 3 типа изменений подвижности одно>жтсвой ДНК

(рис.5). При ееквенировании 19 экзопа гена АТИ7В у образцов с первым типом измененной подвижности однонитевоЙ ДНК обнаружена замена тимина на цитозик в 3914 положении (3914Т>С), которая приводит к замене аминокислоты лейцин па Пронин в 1305 положении (Ьеи1305Рго).

Рис. 5. SSCI'-ana.íin н сскпеинрованне f9 ikioiiíi lena АТР7В больных 1>В с I типом изменений.

Мутация была подтверждена с помощью ПДРФ-анализа с использованием рестриктазы Msp\ в стандартных условиях; она найдена в двух семьях (русской и русско-немецкой этнической принадлежности) в компаунд-гетерозиготном состоянии в сочетании с мутацией Hisl069Gln. Мутация Leu 1305Pro описана ранее у больных немецкого, французского и чешского происхождения [Gensehel J.T Czlonkowska Д., 2001; Vrabelova S. et al., 2005].

Секвенирование образцов ДНК со 2-м и 3-им изменениями подвижности однонитевой ДНК в 19-Ом экзоне гена АТР7В больных БВ показало делению трех нуклеотидов: цитозина и аденина в 3942-3943 положениях, и гуанина - в 3947 положении в гомо- и гетерозиготном состоянии (рис.6).

А) Гомозигота но мутации: Lvsl3]í Argl3 1SdelinsGiu

Рис. б. ЯвСР-аналиа и секвенирование 19 экзопа гена АТР7В у больных БВ из РБ. А) Гомозигота по мутации Ъуз1315_Аг£1316<1е1щШ1ц; Б) Контроль. Дорожки 24.25 - гетерозиготы по мутации I.у^ 1315_Лг§ 131 МеШ^СЛи; Дорожка 29 -гомозигота по мутации Ьуз! 315_Ащ1316сШт01и; Дорожки 27,30 - контроль.

В результате комбинации двух близко расположенных делений произошло нарушение синтеза аминокислот аминокислота серин не изменилась, так как произошла синонимичная замена кодона ТСС на ТСА, вместо делетировавшихся двух аминокислот лизина и аргинина, образовалась одна - глутаминовая кислота В сумме делетировалось 3 нуклеотида и дальнейшего сдвига рамки считывания не произошло нормальная последовательность:

3889 СТТ ТСС AAG AGG ACT GTC CGA AGG ATA 1313 Leu Sa L\% 1/;,- Thr Val Arg Arg lie измененная последовательность: 3889 СТТ 1С 1 G 1С, ACT GTC CGA AGG ATA 1313 Leu Ser Gin Thr Val Arg Arg lie

Данная делеция ранее в литературе описана не была Мутация затрагивает регион гена, кодирующий трансмембранный домен 7, и, вероятно, приводит к нарушению непосредственно медь-транспортирующей фунцкции АТФ-азы. Мутация Lys 1315_Arg 1316dehnsGlu установлена у 5 больных (у 1 в гомозиготном состоянии, 4 - в гетерозиготном) Таким образом, частота данной мутации у пациентов с БВ из Республики Башкортостан составила 10,7%, что вывело ее на второе место по частоте в регионе после мутации Hisl069Gln

Наиболее достоверно можно судить о фенотипическом проявлении мутации на примере больного - гомозиготы по этой мутации с тяжелым течением заболевания, манифестировавшего в возрасте 13 лет в виде печеночной недостаточности В настоящее время больному 20 лет, и клинические симптомы неуклонно нарастают, несмотря на начатую терапию Д-пеницилламином В 18 лет появилась неврологическая симптоматика (ригидность, периодическое дрожание ног) Еще трое больных, компаунд-гетерозигот по данной мутации в сочетании с Hisl069Gln, имеют выраженные нарушения функции печени (цирроз, признаки печеночной недостаточности)

Кроме того, было найдено 2 типа изменений подвижности однонитевой ДНК при SSCP-анализе 8 экзона гена АТР7В у пациентов с БВ из РБ (рис 7)

12 3 4 5 6

Л

1*ис. 7. 8ЙСР -анализ и секвеннрование & жзона гена АТР7В у пациентов с ЬВ

из РБ. 1, 3, 5, 6 дорожки - без изменений, 4 дорожка - первый тип изменений, 2 дорожка- второй тип изменений, секвенировэние образца с ] типом изменений подвижности ( гетерозиготы гю мутаций А1а718Рго (21520>С)).

При последующем секвенироваиии образца с I типом изменения подвижности выявлена замена гуанина на цитозии в 25 52 положении, которая приводит к замене аминокислоты аланин на пролин в 75 8 положении белка АТР7В (А1а718Рго). Для подтверждения данной мутации был проведен ПДРФ-анализ с помощью рестрикгазы МаеIII в стандартных условиях. Данных о выявлении этой мутации ранее в других популяциях в литературе не приведено. Подобный тип изменений не был обнаружен нами в контрольной группе. Данный регион гена АТР7В кодирует участок трансмембранного домена 12 на границе с доменом 13, и мутации в нем, скорее всего, приводят к нарушению транспорта меди. Мутация А1а718Рго выявлена у больного русской этнической принадлежности в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией 01иЮ64Ьу8. Заболевание у пациента протекает тяжело с быстрым прогредиентным течением, печеночной и неврологической симптоматикой значительной степени тяжести.

При секвенироваиии второго типа изменений в 8 экзоне гена ЛТР7В у больных Б В была выявлена в гетерозиготном состоянии инсерция цитозина в 2304 положении, которая привела к сдвигу рамки считывания, начиная с аминокислоты метионнн в 769 положении (Met769fs) (рис. 8).

Рне.8. Сек пен нрава кие 8 зкзона гена АТР7В у пациента с ЬВ.

Мутация была найдена в гетерозиготном состоянии у двух сестер метисного происхождения (русско/мордовского) с тяжелой абдоминальной формой заболевания, характер которого объясним существенным молекулярным дефектом, образовавшимся в результате сдвига рамки считывания. Ранее мутация описана в различных популяциях мира; у русских, французов, англичан, итальянцев, чехов, поляков, северо-американцев европейского происхождения, тайванцев, японцев [Thomas G. et. al., 1995; Shah A. et.al., 1997; Tsai C. et. al., 1998; SViimizu N. et. al., Î999; Lec C. et. al., 2000; Loudianos G. et. al.,2003; Vrabclova S et. al., 2005]. Веротно, данный участок нуклеотил-ной последовательности (СССССС) является «горячей точкой» по мутационным изменениям.

Таким образом, в результате проведенного (Аопекулярно-генетического исследования мутации выявлены на 83,9% хромосом и спектр мутаций, установленных у пациентов с БВ из Республики Башкортостан, расширился на 4 вновь найденные мутации, 2 из которых описаны впервые (рис.9). В 21 семье из 28 установлены мутации в гене АТР7В на обеих хромосомах, кроме того, в 6 семьях определена мутация на 1 хромосоме, в одной семье не удалось установить молекулярно-генетический дефект на обеих хромосомах.

□ Mis1069Gin

■ Lysl315_Arg131 MdllWGfll

□ 3559+1 G>T

□ 1134Profs

■ G!u1064Lys

□ Leu1305Pro □Ala718Pro

□ M et769fs

■ Неустановленные мутации

Рис.9, Снектр мутаций в гене А ТР7В у больных БВ из РБ.

При SSCP-анализе экзонов, сайтов сплайсинга и прилегающих интрон-ных областей гена АТР7В у больных БВ и здоровых лиц контрольной группы нами также были обнаружены несколько описанных ранее в литературе полиморфных вариантов: Va1456Leu (1366G>C), Valil40Ala (3419Т>С),

1VS18+60T. При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта Val 1140А1а между пациентами с БВ и здоровыми лицами обнаружены стахисти'чески значимые различия: у больных чаще встречается аллель АТР7В* 1140 Ala и генотип АТР7 В*1140А1а/*1140А1а (%Z=I2,5; р=0.,034) (рис.! 1). Также было показано, что на всех хромосомах с ранее выявленной мутацией Hisl069Gln определялся ал-лельный вариант АГР7В*]140А1а, что свидетельствует о выраженном сцеплении данного полиморфизма с мутацией Hisl0ó9G!n.

В связи с тем, что, согласно данным литературы, мутации в гене АТР7В сцеплены с определенными гаги юти нам и гю полиморфным ДНК-локусам, нами проведен анализ ассоциации гашютяпов D13S316-D13S133-D13S228 с обнаруженными мутациями, который показал, что 84,6% хромосом с мутацией Hist069Gln имели наиболее распространенный гаплотип (144-134-[32), а четыре хромосомы с этой мутацией имели гаплотипы, отличающиеся от основного на 2 п.о. и 4 п.о. по ДНК-локусу DÍ3S228 (рис.10).

СО <D W Ф щ e^NNSKh.nrtWPÍrtnPJrtP)

I li Í Í Í I I I I 1 Í Í :1 I I i i i I- §

■ ^/У-хромосомы ВМ-хромосомы

Рнс. 10. Распределение частот гаплотипо* полиморфных ДНК-локусов (0138316,1)138133, 0138228) на мутантных и нормальных хромосомах.

Проведенный анализ ассоциации гаплотнпов с другими обнаруженными нами мутациями в гене АТР7В у пациентов с БВ из РБ показал, что мутации 3559+Ю—>Т, 1134Ргс^з, Ьуз1305Рго сцеплены с определенными галло-типами по трем полиморфным л оку сам 0138316, 0135133, 0138228, а мутации 01иТ064Ьуз и Ьуэ 1315_АгЁ1316<1е1 тз01и - по двум локусам 0135316, ЕИЗЭТЗЗ (табл.1).

Таблица 1 - Корреляция гаплотипов и мутаций в гене АТР7В у больных БВ из РБ

№ Мутация Гаплотип Ш38316-ОШ133-Ш38228 Число хромосом

1 Н1з106901п 144-134-132 22

144-134-130 2

144-134-128 2

2 01иЮ64Ьуз 144-179-134 1

144-179-132 3

3 1134Рго1з 148-179-130 3

4 3559+1а-*Т 142-134-130 3

5 Ьу51315_А^1316с1е11П501и 148-183-134 1

148-183-132 1

148-183-130 2

148-183-128 2

6 Ьуз1305Рго 140-134-130 2

7 Ме1769Гз 144-134-130 1

8 А1а718Рго 150-183-134 1

Учитывая, что во всех семьях с мутацией Ьуз1315_Агя1316с1е11пзС1и обнаружен схожий гаплотип 148-183 (0135316, 0138133), вероятно наблюдается «эффект родоначальника». Несмотря на то, что выявлена этническая гетерогенность мутантных хромосом (башкиры и татары), мы можем предположить их общее происхождение, принимая во внимание данные Р Г Кузеева [1998] о связи башкирского родового подразделения таныпцев с волжскими булгарами, а также данные по генетическому родству башкир и татар по ау-тосомным полиморфным ДНК-локусам Хуснутдиновой Э К [1999]

С помощью молекулярно-генетического анализа была проведена до-симптоматическая диагностика БВ в двух семьях, выявленным пациентам начата патогенетическая терапия пеницилламином.

Гепо-фенотипическпе корреляции при БВ в РБ. Нами проведено подробное изучение клинических проявлений у пациентов с БВ в 28 семьях, в которых выполнены молекулярно-генетические исследования В выборке больных у 34 из 39 найдена мутация Н15106901п у 6 - в гомозиготном состоянии, у 28 - в компаунд-гетерозиготном состоянии, из них у 7 - в сочетании с неизвестной мутацией и у 21 - с установленной на второй хромосоме мутацией (табл 2)

Таблица 2 - Мутации в гене АТР7В у больных БВ из РБ

Группа больных Кол-во семей Koi-bo больных

Гомозиготы по Lysl315_Argl316delinsGlu 1 1

Гомозиготы по Hisl069Gln 4 6

His 1069Gln/ Lys 1315_Arg 1316delmsGlu 3 3

Hisl069Gln/ Glul064Lys 2 3

Hisl069Gln/lI34Profs 4 5

His 1069Gin/Leu ¡305Pro 2 4

His 1069Gln/3559+ 1G-T 3 4

Hisl069Gln/Met769fs 1 2

Hisl069Gln, мутХ 4 7

Glul064L>s /Ala718Pro 1 1

Glul064Lys / мут X 1 1

Lysl315_Argl316delinsGlu / мут X 1 1

мут Х/мутХ 1 1

Всего 28 39

Проведен сравнительный анализ групп больных с различными типами мутаций в гене АТР7В по основным количественным и качественным показателям возрасту манифестации соматических и неврологических проявлений, длительности и тяжести болезни, клинической форме заболевания, основным лабораторным показателям крови (уровень церулоплазмина, количество лейкоцитов и тромбоцитов крови, билирубина, ACT, АЛТ), характеру и степени выраженности соматических проявлений заболевания нарушений функции печени (манифестные и скрытые формы), эндокринным, гематологическим и почечным отклонениям, характеру и степени выраженности неврологических и психических расстройств В связи с выраженной гетерогенностью компа-унд-гетерозигот по мутации Hisl069Gln, мы посчитали нецелесообразным объединять их в одну группу для анализа гено-фенотипических корреляций

Гомозиготы по частой мутации Hisl069Gln в гене АТР7В (N=6) характеризуются более мягким течением с поздней манифестацией заболевания по сравнению с другими группами (Х2= 36,54, р=0,048), проверка гипотезы с использованием U-критерия по Манну-Уитни также показала статистически значимые отличия (U=21,0, р=0,0096) Кроме того, учитывая большой временной период между соматической и неврологической манифестациями, можно отметить, что у пациентов-гомозигот по мутации Hisl069Gln наблюдается медленное течение заболевания Для этой группы также характерно в

целом стертая картина висцеральной стадии заболевания с менее тяжелым повреждением печени лишь у 2 пациентов имелись симптомы хронического гепатита, у остальных изменения были выявлены только при использовании специальных методов исследования и нагрузочных проб при отсутствии клинической симптоматики Полученные данные согласуются с мнением большинства исследователей, занимающихся вопросом изучения гено-фенотипических корреляций при упомянутой мутации [Thomas GR et al ,1995, Shah А В et al ,1997, Maier-Dobersberger T et al ,1997, Caca К et al 2001, Stapelbroek J M et al, 2004] В то же время имеются и другие данные, что у больных с мутацией Hisl069GIn, напротив, заболевание протекает более злокачественно и в меньшей степени поддается лечению [Карабанов А В , 2000]

Кроме того, статистически значимые различия (U=28,0, р=0,03) получены при сравнении группы пациентов с мутациями Hisl069Gln/l 1343Profs с остальными больными по длительности периода между возрастом проявления соматических и неврологических расстройств Это свидетельствует о более быстром течении заболевания у больных с данным сочетанием мутаций Анализ качественных показателей подтверждает этот вывод так, у трех из пятерых больных по этой выборке наступила инвалидизация в течение года после манифестации.

При сравнительном рассмотрении некоторых лабораторных показателей, отмечен стабильно низкий уровень церулоплазмина и повышенные уровни билирубина у больных с мутацией Lysl315_Argl316delinsGlu по сра-нению с больными с другими мутациями.

При анализе качественных показателей инвалидизации и экспертной оценки тяжести заболевания по 5 бальной шкале, выявлена статистически значимая связь тяжести заболевания с типом мутации (%2=46,59; р=0,046) (рис 11) Таким образом, установлено, что наиболее тяжело протекало заболевание в группе больных с Hisl069Gln/3559+lG>T генотипом, причем тяжесть была во многом обусловлена печеночными и гематологическими проявлениями Мутация 3559+lG>T затрагивает область на границе 16 экзона и 16 интрона гена. АТР7В и приводит к нарушению сплайсинга, что тяжело сказывается на структуре и функции белка и, как следствие, на течение заболевания

i

3

■¡Степень инвалидизации

□ Тяжесть (экспертная оценка по 5 балльной шкале}___

Рис.11. Степень тяжести течения заболевания у пациентов с БВ с различными типами мутации.

Также более тяжелым течением характеризовалось заболевание у пациентов с мутацией Lys!315_Argl316delinsGlu_ Результат теста также подтверждает объективность оценки тяжести заболевания по предложенной нами (ранговый тест Вилкоксона для проверки однородности двух генеральных совокупностей Z=2,55, р—0,01).

Для сравнен™ клинической картины заболевания проведена оценка количества имеющихся у больных симптомов поражения различных органов и систем с ранжированием их по тяжести проявлений: мутации с наибольшим показателем тяжести болезни - гомозиготы LysI315_Argi316de!insG!u, компаунд-гетер оз и готы Hisl069Gln/3559+lG>T и с наименьшим - гомозиготы Hisl069Gln, что также подтверждает более легкое течение заболевания у последних. Помимо этого наблюдается только слабая корреляция между тяжестью заболевания и количеством соматических проявлений). С другими качественными показателями (неврологическими, психическим проявлениями) тяжесть заболевания коррелирует слабо {Z=l,9, р=0,050), что вполне объяснимо: тяжело и быстро протекающие варианты болезни характеризуются "обвальными" соматическими проявлениями, остальная симптоматика может и не успеть развиться ввиду быстрого наступления летального исхода в результате осложнений висцеральной стадии заболевания, где на первый план выходят печеночная недостаточность и гематологические осложнения.

Для пациентов с БВ в целом характерны когнитивные и эмоционально-волевые расстройства личности, в группе больных БВ с редкой мутацией Leul305Pro, найденной в компаунд-гетерозиготном сочетании с Hisl069Gln мутацией, были отмечены наиболее серьезные психические нарушения разной степени тяжести (у 3 из 4 пациентов наблюдались неоднократные психотические эпизоды попытка убийства, суициды) на фоне более доброкачественно протекающих нарушений функции печени

Кроме того, обследованных семьях с повторными случаями БВ выявлены выраженные внутрисемейные вариации ее течения Установление этого факта очень существенно, так как он не может быть объяснен ни генокопи-рованием, ни множественной аллелией и свидетельствует о значительной подверженности мутантного гена воздействию генов-модификаторов [Маркова ЕД, 1978, Бочков НП, 2004] Возможно, на течение заболевания влияет не только характер мутаций в гене АТР7В, но имеют значение и сре-довые факторы, а также иные эпигенетические факторы, что требует дальнейшего исследования Проведенные исследования свидетельствуют также о целесообразности и важности молекулярно-генетической диагностики и активного обследования родственников пробанда для назначения адекватного и своевременного лечения

Автоматизированный регистр «Болезнь Вильсона». Нами разработан и введен в действие автоматизированный регистр «Болезнь Вильсона» На сегодняшний день регистр содержит данные о 60 больных и 78 здоровых членах семьи из 49 семей Основными функциями регистра являются

- формирование базы данных и автоматизация ведения медицинской документации по больным с БВ и их родственникам,

- определение круга лиц из группы риска путем генеалогического анализа,

- ведение, управление и контроль наблюдения за больными и их семьями;

- анализ возникновения новых случаев заболевания,

- мониторинг БВ по регионам и по республике в целом,

- ведение отчетной документации в ЛПУ по БВ,

- создание выборок по различным критериям для последующего анализа,

- расчет статистических данных о частоте по полученным выборкам

Автоматизированный регистр «Болезнь Вильсона» создан на при помощи пакета Borland Delphi, работает на любом компьютере под управлени-

ем Microsoft Windows и позволяет хранить и анализировать большое количество информации Использование регистра позволяет повысить эффективности учета и диспансеризации больных БВ

ВЫВОДЫ

1 Болезнь Вильсона в Республике Башкортостан встречается с частотой 1 119000 населения (0,83 на 100 000), что сопоставимо с современными показателями в мире Установлено неравномерное территориальное и этническое распространение заболевания с очагами накопления в центрально-западных районах РБ и более высокой частотой встречаемости среди татарской этнической принадлежности Клиническая картина БВ в РБ характеризуется преобладанием тяжелых по течению форм заболевания

2 Выявлено 8 мутаций и 3 полиморфных варианта в гене АТР7В Наиболее распространенной в РБ является мутация Hisl069Gln (48,2%) Мутации Lysl315_Argl316delinsGlu и А1а718Рго описаны впервые Мутация Lysl315_Argl316delinsGlu выявлена с высокой частотой (10,7%) на хромосомах татарского и башкирского происхождения

3 Мутации Hisl069Gln, Lysl315_Argl316delmsGlu, Glul064Lys в гене АТР7В ассоциированы с определенными гаплотипами полиморфных ДНК-локусов D13S316, D13S133.

4 Гомозиготы по мутации Hisl069Gln в гене АТР7В характеризуются более мягким течением заболевания с поздней манифестацией по сравнению с больными, имеющими другие мутации Клиническая картина заболевания у пациентов с вновь выявленной мутацией Lysl315_Argl316delinsGlu характеризуется тяжелым течением с ранней манифестацией и выраженными нарушениями функций печени

5 Разработанный автоматизированный регистр "Болезнь Вильсона" и практические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению болезни Вильсона позволят улучшить качество оказываемой медико-социальной помощи больным и членам их семей

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 С целью уточнения диагноза, прогнозирования течения заболевания и выбора оптимальной тактики лечения пациентов с болезнью Вильсона следует использовать прямую и косвенную ДНК-диагностику

2 При проведении прямой ДНК-диагностики необходимо проводить первоочередной поиск мутаций в гене АТР7В, основываясь на данных о частоте мутаций, встречающихся в Республике Башкортостан

3 Для оптимизации медико-генетической помощи населению Республики Башкортостан следует использовать компьютеризированную базу данных "Болезнь Вильсона"

4 При выявлении у обследуемых, с предположительным диагнозом болезни Вильсона, мутаций в гене АТР7В на обеих хромосомах (доклиническая стадия), необходимо начинать превентивную патогенетическую терапию

5 Учитывая характер распространения заболевания в Республике Башкортостан, необходимо проявлять большую диагностическую настороженность в отношении болезни Вильсона в регионах с высокой частотой

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Болезнь Вильсона в Республике Башкортостан клинико-эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование /АР Маг-жанова, А С Карунас, С Ш Мурзабаева [и др ] // Сибирский консилиум -2006-№4(51) - С 55-59.

2 Гено-фенотипические корреляции при болезни Вильсона в Республике Башкортостан /АР Магжанова, А С Карунас, Р В Магжанов, Э.К Хуснут-динова // Материалы IX Всероссийского съезда неврологов - Ярославль, 2006 - С. 96.

3 Клинико-генетическое изучение болезни Вильсона в Республике Башкортостан /АР Магжанова, А С Карунас, СШ. Мурзабаева [и др ] // К 150-летию со дня рождения В М Бехтерева Развитие научных идей в XXI веке сб научных работ - Киров, 2007 - С 59-61

4 Некоторые гено-фенотипические корреляции при болезни Вильсона в Башкортостане / АР. Магжанова, А С Карунас, Э К. Хуснутдинова, Р В Магжанов // Медицинская генетика — 2005 — Т 4, №5' Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков (Ч II) - С 222

5 Geno'>, -- . trioi) coxit/iuons oi the Wilson aiseuse m Volga-Ural region/ A Magzhanova, A Kamnas, R Magzhanov, E Khusnutdinova // European Human Genetics Conference, - Prague, 2005 - Abstr.Nol068

6 Polymorphism of neuropsychiatry disorders of Wilson disease's patients in Volga-Ural population / A Magzhanova, A Karunas, R Magzhanov, E Khusnutdinova // World Congress of Psychiatric Genetics October - Boston, 2005 -Abstr No 13 05

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ACT - аспарагиновая трансаминаза AJIT - аланиновая трансаминаза

АТР7В - ген болезни Вильсона (медь-связывакмцая АТФ-аза II типа)

БВ - болезнь Вильсона

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛПУ - лечебно-профилактическое учреждение

МГК - медико-генетическая консультация

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

п н — пар нуклеотидов

ПТИ - протромбиновый индекс

РБ - Республика Башкортостан

ЦП - церулоплазмин

SSCP - single strand conformation polymorphism, анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК

Подписано в печать 24 04 07 Формат 60x84 '/,6 Бумага офсетная Отпечатано на ризографе Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ № 785 Гарнитура «Times New Roman» Отпечатано с готовых оригиналов-макетов в типографии «Печатный домъ», ИП ВЕРКО г Уфа, у л К Маркса, 12/4

Актуальность проблемы. Гепатолентикулярная дегенерация (ГЛД) или болезнь Вильсона (БВ) - аутосомно-рецессивное полисистемное заболевание, обусловленное избыточным накоплением в организме и токсическим воздействием меди, характеризующееся сочетанным поражением внутренних органов и мозга. Частота БВ составляет 1-3 на 100 000 населения с неравномерным географическим и этническим распространением [Brewer G.J., 1999].

Заболевание обусловлено мутациями в гене АТР7В, локализованном на длинном плече 13 хромосомы (J3ql4.3), вследствие чего нарушается функционирование медь-транспортирующей АТФ-азы, внутриклеточный транспорт меди в гепатоцитах и выведение излишков меди с желчью, а также включение ее в молекулу церулоплазмина [Горбунова В.Н. и др., 2002; Иллариошкин С.Н. и др., 2002; Thomas G.R. et al., 1995]. Это приводит к гипоцерулоплазминемии (биохимический маркер заболевания), увеличению концентрации "свободной" (не связанной с церулоплазмином) меди в крови, к развитию хронической медной интоксикации, накоплению ее в различных тканях и органах, прежде всего, в печени, мозге, почках, роговице, эритроцитах, дистрофическим и некротическим изменениям в них, чем и обусловлена клиника заболевания [Иванова-Смоленская И.А. и др., 2002].

Ген АТР7В состоит из 21 экзона и расположенных между ними интронов, экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфоузлах [Okada T. et al., 2000]. Характерными для болезни Вильсона являются различные точковые мутации гена АТР7В, а также мелкие инсерции и делеции, вызывающие сдвиг рамки считывания. На сегодняшний момент известно свыше 280 различных мутаций гена АТР7В [www.hgm.org], из них наиболее распространенной в европейских популяциях, в России, в том числе и в Башкортостане, является миссенс-мутация Hisl069Gln [Карунас А.С., 1999; Иллариошкин С.Н. и др., 2002]. Болезнь Вильсона характеризуется выраженным клиническим полиморфизмом в отношении как неврологических, так и соматических проявлений. Изучению спектра и частоты мутаций гена АТР7В, соотношения генотипа и фенотипа при БВ в разных популяциях мира уделяется пристальное внимание исследователей, однако до сих пор нет объяснения разнообразию проявлений и тяжести течения при данной генетической патологии, а также выраженному внутрисемейному полиморфизму [Карабанов А.В., 2000; Stapelbroek J.M. et al., 2004; Vrabelova S. et al., 2005; Hermann W. et al., 2006]

Цель исследования: клиническое и молекулярно-генетическое изучение болезни Вильсона в Республике Башкортостан для оптимизации диагностики и лечебно-профилактической помощи.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Изучить распространенность и варианты клинического течения болезни Вильсона в Республике Башкортостан.

2. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене АТР7В и оценить их частоты у пациентов с болезнью Вильсона из Республики Башкортостан.

3. Исследовать ассоциации обнаруженных мутаций с гаплотипами полиморфных ДНК-локусов (D13S316, D13S133, D13S228), сцепленных с геном АТР7В.

4. Изучить корреляции генотипа и фенотипа при болезни Вильсона в Республике Башкортостан.

5. Оптимизировать подходы к диагностике и ведению пациентов с болезнью Вильсона в Республике Башкортостан и создать национальный компьютерный регистр "Болезнь Вильсона".

Научная новизна. Впервые в Республике Башкортостан проведено комплексное клиническое и молекулярно-генетическое исследование болезни Вильсона. Выявлено 8 различных мутаций в гене АТР7В. Впервые обнаружены две не описанные ранее мутации: А1а718Рго и Lysl315Argl316delinsGlu, последняя выявлена с высокой частотой (10,7%).

Впервые в Республике Башкортостан обнаружены описанные ранее мутации Leul305Pro и Met769fs, 2 экзонных (Val456Leu, Valll40Ala) и 1 интронный (IVS18+6C>T) полиморфизмы. Впервые в Республике Башкортостан оценено влияние различных мутаций в гене АТР7В на клинические проявления болезни Вильсона; при этом, у гомозигот по частой мутации Hisl069Gln отмечено более мягкое течение заболевания с поздней манифестацией, тогда как у пациентов с мутацией Lysl315Argl316delinsGlu выявлено тяжелое течение болезни с ранней манифестацией и выраженными нарушениями функций печени.

Практическая значимость. Установление мутаций на 83,9% хромосом дает возможность повысить эффективность молекулярно-генетической диагностики заболевания в Республике Башкортостан. Выявление второй по частоте мутации Lysl315Argl316delinsGlu в гене АТР7В делает целесообразным скрининг вновь выявляемых пациентов с болезнью Вильсона в Республике Башкортостан на данную мутацию после проведения поиска самой частой мутации Hisl069Gln в 14-ом экзоне. Полученные данные о распределении семей с мутантными аллелями в гене АТР7В на территории Республики Башкортостан и оценка влияния генотипа на течение заболевания способствуют повышению качества лечебно-диагностической и медико-генетическои помощи населению. В двух семьях проведена пресимптоматическая ДНК-диагностика заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Болезнь Вильсона в Республике Башкортостан по частоте встречаемости сопоставима со средними показателями в мире и имеет неравномерное территориальное и этническое распространение.

2. Обнаружены 8 мутаций и 3 полиморфных варианта в гене АТР7В. Наиболее частой мутацией у пациентов с болезнью Вильсона в РБ является мутация Hisl069Gln (48,2%) гена АТВ7В, встречающаяся преимущественно в компаунд-гетерозиготном состоянии в сочетании с другими редкими мутациями. Второй по частоте является впервые выявленная мутация Lys 1315Arg 1316delinsGlu ( 10,7%).

3. При болезни Вильсона прослеживается определенная взаимосвязь по некоторым показателям между генотипом и фенотипом, но нет однозначной зависимости клинической картины только от мутационного дефекта в гене АТР7В.

4. Мутации в гене АТР7В ассоциированы с определенными гаплотипами полиморфных ДНК-локусов D13S316, D13S133, D13S228.

Внедрение результатов исследования. Разработанная формализованная карта и автоматизированный регистр «Болезнь Вильсона» используются в лечебно-диагностической деятельности медико-генетической консультации РПЦ, неврологической клиники РКБ им. Г.Г.Куватова. Результаты проведенных исследований используются в учебной и научно-исследовательской работе кафедр неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики и биологии с основами генетики ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава».

ВЫВОДЫ

1. Болезнь Вильсона в Республике Башкортостан встречается с частотой 1:119000 населения (0,83 на 100 000), что сопоставимо с современными показателями в мире. Установлено неравномерное территориальное и этническое распространение заболевания с очагами накопления в центрально-западных районах РБ и более высокой частотой встречаемости среди лиц чувашской и татарской этнической принадлежности. Клиническая картина БВ в РБ характеризуется преобладанием тяжелых по течению форм заболевания.

2. Выявлено 8 мутаций и 3 полиморфных варианта в гене АТР7В. Наиболее распространенной в РБ является мутация Hisl069Gln (48,2%). Мутации Lysl315Argl316delinsGlu и А1а718Рго описаны впервые. Мутация Lysl315Argl316delinsGlu выявлена с высокой частотой (10,7%) на хромосомах татарского и башкирского происхождения.

3. Мутации Hisl069Gln, Lysl315Argl316delinsGlu, Glul064Lys в гене АТР7В ассоциированы с определенными гаплотипами полиморфных ДНК-локусов D13S316, D13S133.

4. Гомозиготы по мутации Hisl069Gln в гене АТР7В характеризуются более мягким течением заболевания с поздней манифестацией по сравнению с больными, имеющими другие мутации. Клиническая картина заболевания у пациентов с вновь выявленной мутацией Lysl315Argl316delinsGlu характеризуется тяжелым течением с ранней манифестацией и выраженными нарушениями функций печени.

5. Разработанный автоматизированный регистр "Болезнь Вильсона " и практические рекомендации по диагностике и профилактике болезни Вильсона позволяют улучшить качество оказываемой медико-социальной помощи больным и членам их семей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью уточнения диагноза, прогнозирования течения заболевания и выбора оптимальной тактики лечения пациентов с болезнью Вильсона следует использовать прямую и косвенную ДНК-диагностику.

2. При проведении прямой ДНК-диагностики необходимо проводить первоочередной поиск мутаций в гене АТР7В, основываясь на данных о частоте мутаций, встречающихся в Республике Башкортостан.

3. Для оптимизации медико-генетической помощи населению Республики Башкортостан следует использовать компьютеризированную базу данных "Болезнь Вильсона".

4. При выявлении у обследуемых, с предположительным диагнозом болезни Вильсона, мутаций в гене АТР7В на обеих хромосомах (доклиническая стадия), необходимо начинать превентивную патогенетическую терапию.

5. Учитывая характер распространения заболевания в Республике Башкортостан, необходимо проявлять большую диагностическую настороженность в отношении болезни Вильсона в регионах с высокой частотой.