Генетические основы этиологической гетерогенности злокачественных новообразований

Казубская, Татьяна Павловна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Генетические основы этиологической гетерогенности злокачественных новообразований

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Казубская, Татьяна Павловна Москва 2010 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.01.12

Автореферат диссертации по медицине на тему Генетические основы этиологической гетерогенности злокачественных новообразований

На правах рукописи

00460

33?

КАЗУБСКАЯ ТАТЬЯНА ПАВЛОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

14.01.12- онкология 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 2 ДПР 2010

Москва 2010 г.

004601335

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук, онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН

(Директор академик РАН и РАМН, профессор М.ИДавыдов)

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор

Раиса Федоровна Гарькавцева, доктор медицинских наук, профессор, Владимир Юрьевич Сельчук.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Петр Васильевич Новиков, член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Николай Евгеньевич Кушлинский, доктор медицинских наук, профессор Валентин Сергеевич Мазурин.

Ведущая организация: ГОУ ДПО Российская медицинская академия постдипломного образования Минзравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «1&» «»н^ 2010 года в часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02.) по адресу: 115478 Москва, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им.Н.Н.Блохина

РАМН.

Автореферат разослан « ?» о "у гд-Ч 2010г.

Ученый секретарь диссертационного Сс доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Интерес клиницистов к роли генетических факторов, как первичных факторов риска в этиологии рака повышался с последовательными открытиями терминальных мутаций генов Rb, В RCA 1/2, RET, ассоциированных с развитием ретинобластомы (Friend SH. et al.,1986, Lee WH.et al.,1987), рака молочной железы (Wooster R. at al., 1994, Ford D. at al. 1994), синдромов множественных эндокринных неоплазий 2 типа (МЭН2) (Takahashi M.et al., 1985). Интерес стал более интенсивным, когда выяснилось, что анализ клинической картины болезни, выявление связи между клиническими проявлениями заболевания и лежащими в их основе молекулярными повреждениями, открывают возможности идентификации новых форм болезни и установления причин их возникновения, что может привести к более нацеленному изменению ракового контроля и таргетной терапии.

С генетической точки зрения главной особенностью неоплазий является клинический полиморфизм и генетическая гетерогенность, а для так называемых мультифакториальных злокачественных опухолей - существование их наследственных и ненаследственных форм без четких границ. Проблема генетической гетерогенности наследственных форм опухолей занимает важное место, поскольку кажущееся фенотипически однородным, генетически гетерогенное заболевание, может включать в себя несколько клинически, генетически и биохимически самостоятельных форм (Гинтер Е.К.,2001). Анализ клинической картины болезни (фенотипа) и выявление взаимосвязи между генотипом и фенотипом, предоставляет возможность установить не только какие генетические изменения лежат в основе формирования предрасположенности к неоплазии, но и разработать стратегию формирования прицельно однородных групп риска, оптимизировать процедуру проведения ДНК-анализа. Изучение особенностей проявления неоплазий и причин, которые их формируют, является одним из важнейших направлений в медицине вообще и клинической генетике в частности, и лежит в основе успешной диагностики и медико-генетического консультирования больных и их семей.

Указанные особенности характерны и для рака щитовидной железы (РЩЖ), меланомы кожи (МК) и первично-множественных злокачественных опухолей (ПМЗО). Имеющиеся на сегодняшний день работы, посвященные гетерогенности этих форм опухолей, не имели системного подхода и ограничивались областью профессиональных интересов (молекулярно-генетически-ми изучениями отдельных нозологических форм неоплазий). Однако недостаточная изученность отдельных генетических вариантов злокачественных опухолей может привести к тому, что в рамках одной нозологической формы рака, могут рассматриваться заболевания с различной генетической природой и различными патогенетическими механизмами развития.

Проблема своевременного выявления РЩЖ, МК, ПМЗО заключается не только в бессимптомном развитии, но и в отсутствии надежных маркеров, способствующих их раннему выявлению. Наряду с этим, первично-множественные опухоли представляет собой особую диагностическую проблему.

Изучения, прицельно направленные на выявление специфических признаков, которые могли бы у пациентов увеличивать риск проявления вторых первичных раков, являются актуальными с клинической и биологической точек зрения. Значение проблемы возрастает еще и в связи с неуклонным ростом заболеваемости и смертности от этих новообразований (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). В этой связи особое значение имеет идентификация наследственных форм РЩЖ, МК, ПМЗО, разработка стратегии преодоления генетической гетерогенности с использованием биологических параметров на клиническом, генетическом и молекулярном уровнях, которая позволит идентифицировать семьи со сходными клиническими признаками. При этом активное выявление даже относительно небольшого числа случаев злокачественных новообразований среди практически здоровых родственников из семей больных этими заболеваниями может рассматриваться как важная научно-практическая задача.

И хотя оценка генетических параметров наследственных форм опухолей затруднена, решение этих вопросов имеет первостепенное значение для разработки программы клинико-генетической диагностики, профилактики (в том числе и пренатальной) и патогенетически ориентированной терапии. Все эти вопросы планировались и разработаны на модели рака щитовидной железы, меланомы кожи, первично множественных злокачественных опухолях. Цель и задачи исследования.

Цель работы: определить роль наследственных факторов в этиологии рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично множественных злокачественных опухолей, выделить генетически детерминированные формы этих заболеваний, изучить их генетическую гетерогенность, разработать тактику медико-генетического консультирования при разных их вариантах. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить размах вариабельности клинико-генетического проявления рака щитовидной железы (РЩЖ) меланомы кожи (МК) и первично множественных злокачественных опухолей (ПМЗО).

2. Определить фенотипические и генетические корреляции различных форм опухолей в семьях больных РЩЖ, МК и ПМЗО.

3. Изучить клинические, цитогенетические и молекулярно-генетические особенности РЩЖ, МК и ПМЗО.

3.1 Изучить частоту и спектр молекулярных изменений при медуллярном РЩЖ (МРЩЖ).

3.2 Определить частоту и спектр повреждений некоторых участков хромосом в клетках крови больных МК и диспластических невусов (ДН).

3.3 Изучить молекулярно-генетические и эпигенетические изменения гена р16/СОШ2А в образцах опухолей МК.

3.4 Оценить значимость биологических микрочипов в диагностике терминальных мутаций генов В1{СА1,2 и СНЕК2 у больных первично множественным раком с поражением яичников.

3.5 Изучить статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: RASSF1A, RARß2, SEMA3B, определить их значение в молекулярном патогенезе и диагностике солитарного и первично множественного рака молочной железы и яичников.

4. Установить структуру и соотношение генетически детерминированных форм РЩЖ, МК и ПМЗО.

5. Разработать основные принципы медико-генетического консультирования семей РЩЖ, МК и ПМЗО.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые на основе комплексного клинико-генетического и молекулярно-биологического изучения больных раком щитовидной железы, меланомой кожи и первично множественными злокачественными опухолями, выявлены основные клинико-генетические особенности этих заболеваний. Расширены представления о генетической гетерогенности (аллельного или локусного происхождения) РЩЖ, МК, ПМЗО, определена структура и соотношение их генетически детерминированных форм, разработаны критерии для выделения генетически самостоятельных вариантов.

Показано, что молекулярной основой МЭН2 являются мутации в гене RET, установлена четкая ассоциация мутаций в этом гене с синдромами множественных эндокринных неоплазий 2 типа, определен спектр его мутаций, обнаружены новые мутации гена RET у российских больных, что позволяет расширить спектр мутаций, который можно рекомендовать для рутинного лабораторного анализа. Установлено, что причиной клинического полиморфизма медуллярного РЩЖ является разное положение точковой мутации в одном из цистеиновых кодонов гена RET, обнаруживая аллельную гетерогенность этого заболевания. Впервые в стране по результатам ДНК-диагностики медуллярного РЩЖ проведено профилактическое удаление щитовидной железы, внедрена в практику пренатальная диагностика этого заболевания.

Разработана комплексная программа выявления лиц предрасположенных к развитию МРЩЖ, позволяющая не только уточнить индивидуальный генетический диагноз, дать более точный прогноз течения заболевания, но и осуществить своевременные лечебно-профилактические мероприятия, направленные на предотвращение развития этой опухоли.

Выявлено наличие характерных для МК и ДН генетических и эпигенетических нарушений. У индивидов с МК, МК+ДН и у лиц носителей дисплас-тических невусов в трех участках короткого плеча хромосомы 1-1р22,1р31, 1р32 наблюдается общность в индивидуальном распределении разрывов и отличается от нормы с высокой достоверностью, что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью и является ранним событием в цепи изменений, предшествующих МК. Аномальное метилирование промоторного района гена CDKN2A является неслучайным изменением у больных МК и выявляется у всех больных ПМЗО с поражением МК.

С использованием технологии олигонуклеотидных биочипов показано, что частота наиболее распространенных терминальных мутаций в гене BRCA1 у больных ПМЗО с поражением яичников выявляется в 53% случаев.

Впервые проведено определение статуса метилирования CpG-островков генов RASSF1A, RARß2 и SEMA3B в опухолевых и нормальных тканях молочной железы, яичников больных первично множественными опухолями, больных солитарным РМЖ и РЯ и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Показана высокая частота аномального метилирования промотор-ных районов этих генов в тканях больных ПМЗО с поражением молочной железы и яичников и солитарных РМЖ и РЯ, с частотами от 30% до 90%. Впервые показано, что больные с аномальным метилированием генов RASSF1A, RARß2 могут иметь тенденцию к первично множественному поражению РМЖ и РЯ. Выявлена достоверная положительная корреляция частоты метилирования генов RARß2 и SEMA3B со стадией и степенью анаплазии РМЖ и РЯ. Показано, что аномальное метилирование промоторной области гена RASSF1A можно обнаружить на доклинической стадии развития этих опухолей, что позволяет рекомендовать их в качестве молекулярных маркеров диагностики и прогноза этих заболеваний и свидетельствует о больших возможностях метилирования ДНК для разработок неинвазивной диагностики рака.

Внедрение в практику.

Результаты исследования внедрены и используются в клинической практике различных подразделений РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Апробация работы.

Материалы диссертации представлены и обсуждены на Российских онкологических конгрессах:VII,X,XI,XII (Москва 2003, 2006-2008 г.); научно-практической конференции "Проблемы онкогенетики: научные и прикладные аспекты", Украина, Киев, 2002; Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research (USA, Boston, 2002), научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2003); Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research (Toronto, 2003); Human Genome Meeting"HGM'99"( Scotland, Edinburgh, 2001); 28th Meeting of the Federation of European Biochemica Societies (Turkey, Istanbul, 2002); Российской конференции по онкогинекологии (Москва, 2009); European School of Oncology "Меланома" (Москва 1995), "Thyroid cancer" (Moscow, 2004); съезде онкологов республики Казахстан (Алма-Ата, 2003); I Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 2005); IV съезде онкологов и радиологов СНГ (Баку, 2006); конференции с международным участием "Генетика в России и мире" (Москва, 2006); 30л Conference of American Society of Preventive Oncology (USA, Bethesda, 2006); 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", (Санкт-Петербург, 2008); 19th International Congress on Anti Cancer Treatment (ICACT) (Paris, France, 2008); III конгрессе с международным участием «Опухоли головы и шеи», (Сочи, 2009); II Российском симпозиуме «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» (Москва, 2009).

Апробация работы состоялась 11 декабря 2009 года на совместной научной конференции с участием лаборатории клинической онкогенетики, отделения

биотерапии опухолей, отделения гинекологического, отделения опухолей молочных желез, проктологического отделения, отдела опухолей головы и шеи НИИ клинической онкологии РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН; а также кафедры генетики и кафедры онкологии факультета последипломного образования Московского государственного медико-стоматологического университета Министерства здравоохранения и социального развития.

По теме диссертации опубликовано 83 печатных работы в российских и зарубежных журналах, из них - 36 в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, 3 работы оформлены как главы в справочниках и учебных пособий. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы, который содержит 22 отечественных и 290 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 39 таблицами, 2 графиками, 52 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В НИИКО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН за 1988-2008 годы сформирован канцер-регистр лаборатории клинической онкогенетики, ставший основой исследуемой выборки, объем которой составил 1495 больных и 8700 их родственников 1-2-й степени родства. Из них 208 больных РЩЖ (140 папиллярным и фолликулярным РЩЖ и 68 больных медуллярным РЩЖ), 460 больных МК, 400 больных ПМЗО, жителей Москвы и области. Каждая семья регистрировалась через одного члена семьи, т.е. путем одиночного отбора. Особое внимание уделялось подтверждению диагноза онкологического заболевания у родственников I степени родства: родителей, сибсов (братьев и сестер), детей, которые затем включались в дальнейший анализ.

В анализе использовались клинические, эпидемиологические, клинико-ге-неалогические, цитогенетические, молекулярно-генетические, генетико-мате-матические методы исследования. У всех пациентов было получено информированное согласие об участии в исследованиях. Все случаи рака классифицированы по TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989 г.)

В качестве контроля использовались популяционные частоты распространенности различных злокачественных новообразований, которые были вычислены по данным учетных форм № 090/V поступивших из всех районных онкологических отделений г. Москвы в отдел медицинской статистики МГОД. Данные о половозрастном составе населения г. Москвы в изучаемый период были получены в Московском городском статистическом управлении. Показатели заболеваемости были стандартизованы по возрасту прямым методом с использованием мирового стандарта возрастного распределения населения.

Идентификация наследственных синдромов проводилась в соответствии с установленными международными критериями для каждого из них.

Изучение распространенности ДН в г. Москве проводилось на основании результатов осмотра 509 человек, случайно отобранного контингента взрослого населения. Для поиска специфических опухолевых ассоциаций в семьях больных МК использовались клинико-генеалогические данные, включавшие 98 человек имеющих на коже множественные меланоцитарные невусы и их 259 родственников 1-й степени родства и 22 человека с множественными невусами, отобранных при осмотре 247 близких родственников из семей 91 больного с гистологически подтвержденным диагнозом МК. Каждый пациент-носитель множественных невусов получил лечение и наблюдался от 5 до 18 лет в клинических отделениях РОНЦ в период с 1988 по 2005 г. В качестве контрольных групп служили 2 выборки: одна из них состояла из 1001 больного с гистологически подтвержденным диагнозом - рак желудка и 3793 их родственника 1-й степени родства; вторая включала 1048 клинически здоровых лиц, не имевших злокачественных опухолей и их 4654 родственника 1-й степени родства также собранных среди московского населения в период с 1985 по 2003 годы. Все анализируемые группы были подобраны по полу и возрасту и были жителями Москвы и Московской области.

Молекулярные исследования, ДНК-диагностика наличия точковых мутаций в протоонкогене RET проводилась на базе Медико-генетического научного центра РАМН совместно с лабораторией молекулярной генетики и клиникой Гамбургского университета. Материалом для исследований служила ДНК пациентов медуллярным РЩЖ находившиеся в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН с 1998 по 2007г. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови, образцов опухолевых и нормальных тканей щитовидной железы (кусочки или гистологические срезы) и использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации экзонов гена RET.

Цитогенетическое изучение наиболее частых перестроек встречающихся при МК, включающих в себя сайты повышенной ломкости хромосом(СПЛХ), конститутивные (кСПЛХ) или fragile sites проводили на G-окрашенных мета-фазных пластинах лимфоцитов периферической крови, культивируемых по стандартной методике, проводилось совместно с лабораторией цитогенетики в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Молекулярно-генетические исследования МК проводились в лаборатории эпигенетики Медико-генетического научного центра РАМН. Материалом исследования служила ДНК лимфоцитов периферической крови и ткани опухолей больных МК. Для исследований использовали 10 микросателлитных маркеров на хромосоме 9р, расположенных в районе гена pl6/CDKN2A. Анализ метилирования промоторной области гена pl6/CDKN2A был проведен методом метилчувствительной ПЦР.

Определение спектра и частоты наиболее частых точковых мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у больных первично-множественными опухолями с поражением яичников и больных органоспецифическим раком яичников в популяции российских женщин проводились на базе Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельдгардта. Методом аллель-специфичной гибридизации, сочетающего мультиплексную ПЦР и гибридизацию с олигонуклео-тиднымй биочипами, определялась частота встречаемости мутаций в гене

ВЯСА1- 185с1е1АО, 300Т>С, 4153ае1А, 4158А>0 и 5382тБС, в гене ВЯСА2-695тэТ, 6174<1е1Т и в гене СНЕК варианта 110(ШС.

Исследование уровня метилирования промоторных районов генов /гЛSSF7Л, ЯАЩ2, БЕ МЛ 3 В проводилось на базе Государственного Научного Центра РФ ГосНИИ генетика и совместно с Каролинским институтом (Швеция). Исследование включало комбинацию методов: ПЦР-анализ образцов геномной ДНК, последовательно расщипленной с помощью набора метил-чувствительных рестриктаз (МЧРА), бисульфитной модификации ДНК с последующей метилспецифичной ПЦР. В анализ включены 330 пар образцов ДНК, выделенной из опухолевой и гистологически нормальной ткани больных раком молочной железы, яичников и первично-множественными опухолями с поражением молочной железы и яичников. В качестве контроля использовали лимфоциты периферической крови здоровых индивидов (15 человек). ДНК выделяли из ткани опухоли и из лимфоцитов крови по стандартной методике.

Пересмотр гистологических препаратов проведен в отделе патоморфоло-гии РОНЦ им. НН.Блохина РАМН.

Исследование проведено с использованием генетико-математических методов изложенных в методических разработках (Трубников В.И., Москва, 1998), в пакете программ "Вютейка". Для создания базы данных использовался программный продукт фирмы УМШБоА: КАРАТ. Основные статистические методы — критерии Фишера, ранговая корреляция Спирмана с использованием Ьтеста Стьюдента и критериев у\

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное исследование посвящено одной из сложных проблем в клинической онкологии: изучению генетической обусловленности и генетической гетерогенности и клинического полиморфизма рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично-множественных злокачественных опухолей.

Клшшко-генетический анализ рака щитовидной железы.

Раннее выявление РЩЖ, клинико-генетическая идентификация его наследственных вариантов, разработка методов выявления аналогичного заболевания среди родственников больных РЩЖ и тактика лечения бессимптомных носителей патологических мутаций гена/ов, ответственных за развитие РЩЖ, является важной задачей онкологии и генетики. Хотя папиллярный и фолликулярный (немедуллярный) РЩЖ (НМРЩЖ) является наиболее частой формой рака этой локализации, о его наследственном эквиваленте известно очень мало.

Для решения вопроса о наследственной предрасположенности к НМРЩЖ были изучены 140 больных, у которых папиллярный рак наблюдался у 74 %, папиллярно-фолликулярный в 23% и в 3% случаев - фолликулярный. При анализе установлены различия в проявлении этого заболевания в зависимости от пола (соотношение мужчин и женщин -1:5), что указывает на существование различных величин риска развития НМРЩЖ для мужчин и женщин.

Возраст диагностики заболевания в среднем составляет 47,7 ±1,61 года, у 78% больных первые признаки заболевания проявляются в среднем на 6 -7 лет раньше. У больных с НМРЩЖ обнаружено сочетанное поражение разных органов, частота первично-множественных неоплазий составила 5,7%, что выше частоты в популяции (0,003%)(р<0,01). Анализ показал наличие семейного накопления разных неоплазий, частота которых составила 4% и доброкачественных опухолевых и неопухолевых заболеваний щитовидной железы - составила 3,2%.

При изучении семейных случаев НМРЩЖ впервые установлен наследственный синдром семейного папиллярного РЩЖ (ПРЩЖ), признаками которого являются преимущественно мультифокальное и двустороннее поражение папиллярным раком только ткани щитовидной железы у трех и более членов семьи, рис.1. Возраст диагностики ПРЩЖ оказался много моложе общей выборки больных НМРЩЖ, составив 34,1± 6,8 года против (47,7 ± 1,6 года) (р< 0,05), в целом, показывая более тяжелый фенотип и аутосомно-доминантный тип (родители-дети) наследования заболевания. Родословная семей больных С и В, диагноз: синдром семейного ПРЩЖ

+40

'Щ-О:

'Щ-

ПРЩЖ 1 ПРЩЖ 2

-о

ПРЩЖ

III

ПРЩЖ К*«

у*4' 1

Рис.1. Отец больной (И-2) умер в 36 лет от ПРЩЖ, (И-1) умер в 38 лет от ПРЩЖ, (Ш-2) -папиллярный РЩЖ, его бабушка (1-4) умерла от ПРЩЖ на фоне множественных адено-матозных узлов щитовидной железы, а (1-5) -умерла в 73 года от рака поджелудочной железы.

В результате исследования выявлены наследственно обусловленные синдромы, компонентом которых является папиллярный и фолликулярный РЩЖ. Эти синдромы характеризуются двумя клинико-генетическими вариантами. Первый, ассоциирован с множественными типами опухолей, возникающих в тканях разных органов и наследуемых по аутосомно-доминантно-му типу. Это синдромы -Гарднера, Каудена и МЭН1, которые в анализируемой выборке больных идентифицированы в 3,6% случаев. Второй - синдром семейного ПРЩЖ(СПРЩЖ), при котором преобладающим и постоянным признаком является папиллярный РЩЖ, обнаружен в 1,4% случаев.

Проведенное исследование показало существование наследственно обусловленных форм НМРЩЖ и в отдельно взятых семьях косегрегацию НМРЩЖ с неоплазиями почки, молочной железы, кожи (меланомы), нервной системы и толстой кишки. В целом, среди больных НМРЩЖ наследственно детерминированные формы этого заболевания выявлены в 5% случаев.

Полученные данные позволяют идентифицировать семьи с наследственно обусловленными формами НМРЩЖ и формировать группы "высокого риска" среди родственников из семей больных НМРЩЖ, а также осуществлять индивидуальный прогноз развития заболевания для членов семьи больного в зависимости от конкретной семейной ситуации. На основании полученной информации, разработаны критерии идентификации лиц с высоким риском развития НМРЩЖ, которые включают: 1) поражение НМРЩЖ до 40 лет и наличие пораженных членов семьи аналогичным заболеванием; 2) наличие в анамнезе или в семье других неоплазий: в почках, толстой кишке, молочной железе, нервной системы, кожи и наличие гамартом; 3) наличие в анамнезе или у членов семьи доброкачественных опухолей в щитовидной железе; 4) наличию в семье ПМЗО с поражением щитовидной железы; 5) внимание к щитовидной железе при идентификации у пациентов наследственных муль-тиопухолевых синдромов.

Важной проблемой является выявление С-клеточной гиперплазии или медуллярного РЩЖ ("МРЩЖ) на ранней стадии заболевания. В этой связи, достижения в молекулярной биологии, позволили не только понять причины развития медуллярного рака, но и реально подойти к решению вопроса ранней диагностики и профилактики этой формы РЩЖ.

Проведенный анализ 68 семей больных МРЩЖ выявил генетически детерминированный МРЩЖ в 24,9% случаев, которые имели разные формы проявления, такие как МЭН2А, МЭН2Б, синдром СМРЩЖ и медуллярный РЩЖ как компонент нейрофиброматоза 1 типа. Исходя из важного наблюдения, что ген ЛЕТ экспрессируется только в определенных тканях нейроэндок-ринной дифференцировки, включая парафолликулярные С-клетки щитовидной железы, экстра и интраадреналовые хромафинные клетки надпочечников, периферические нервы, описываемые случаи совместного поражения этими редкими формами заболеваний как нейрофиброматоз и МРЩЖ предполагают возможность существования общего биологического механизма, ответственного за их развитие. Частота спорадического МРЩЖ составила 75,1%, среди которых, могут быть случаи обусловленные мутацией "de novo" в половых клетках одного из родителей.

При изучении семей с синдромами МЭН 2 типа установлен широкий спектр клинического проявления МРЩЖ, высокая вариабельность риска развития неоплазии среди родственников. Для синдрома МЭН2А характерно билатеральное развитие феохромоцитом у больных и их родственников, которые являлись частой причиной внезапной смерти. Наличие феохромоцитомы установлено в 50% семей, у одного из больных, помимо МРЩЖ и феохромо-циомы, был обнаружен третий первичный рак молочной железы. Выявлена ассоциация МРЩЖ с аномалией почек, обнаруженная у носительницы мутации гена RET.

специфическим медуллярным раком при отсутствии клинических или биохимических признаков поражения паращитовидных желез или надпочечников.

Возраст манифестации МРЩЖ у пациентов и их родственников с МЭН2 варьирует в зависимости от метода диагностики. При МЭН2А возраст диагностики в среднем 28 лет (колебался от 7 до 45 лет), а у некоторых родственников к моменту изучения этих семей возраст превышал 50, 62 и 75лет. При СМРЩЖ он в среднем составил 30 лет, в то время как при МЭН2Б развитие заболевания наблюдалось в среднем 8,6 года, показывая самый тяжелый фенотип.

Впервые в России проведен скрининг терминальных мутаций в гене RET в семьях больных с МЭН2. В результате установлена четкая ассоциация мутаций в этом гене с МЭН2 синдромами. В семьях с МЭН2А идентифицированы 2 специфические мутации в кодоне 634 гена RET, в семьях с МЭН2Б выявлена мутация в кодоне 918 гена RET. При синдроме семейного МРЩЖ обнаружена мутация в кодоне 620 гена RET. Характерные для этих синдромов межиндивидуальная изменчивость, как по возрасту начала заболевания, так и по тяжести его проявления (даже в пределах одного подтипа) могут быть обусловлены не только варьирующей экспрессивностью и пенет-рантностью гена RET, но и положением точковой мутации в одном из цисте-иновых кодонов этого гена. Молекулярная ДНК-диагностика гена RET, стала реальным подтверждением выявленных наследственных форм МРЩЖ.

Наличие аллельной гетерогенности находит свое отражение в выявленной взаимосвязи между фенотипом- RET генотипом и тяжестью проявления заболевания. У больных с МЭН2А мутация в кодоне 634 ассоциируется с фео-хромоцитомой и гиперпаратиреозом и до сих пор, не была обнаружена ни в одной из семей с синдромом семейного МРЩЖ, что позволяет рассматривать ее в качестве маркера при прогнозировании риска развития этих заболеваний у бессимптомных носителей этой мутации. Терминальные мутации в кодоне 918 характерны исключительно для МЭН2Б и связаны с пороками развития скелета и слизистых. Выявленная ассоциация позволяет дать более точный прогноз течения заболевания у больных МЭН2.

Единственным эффективным методом лечения МРЩЖ является тиреоидэк-томия, поэтому так важна ранняя и доклиническая диагностика этого заболевания. Однако вопрос о профилактической тиреоидэктомии остается предметом постоянной дискуссии, поскольку все еще отсутствуют данные длительного наблюдения за пациентами, перенесшими в раннем детском возрасте тиреоидэктомию, основанную на прямом тестировании гена RET, и которые могли бы показать, что МРЩЖ радикально излечен. Прямое тестирование гена RET среди родственников больных МЭН2А обнаружило 8 бессимптомных носителей терминальных мутаций этого гена в возрасте от 3,5 до 42 лет из 4-х обследованных нами семей (табл.1). Первый российский опыт профилактического хирургического лечения выполнен у 6 из них, согласившихся на оперативное лечение. Как оказалось, только у двух из них, самых юных пациентов (3,5и 9 лет), операция была профилактической, у остальных обнаружены очаги С-клеточной гиперплазии и медуллярный рак.

Таблица 1.

Клиническая характеристика родственников семей с МЭН 2А и результаты тестирования гена КЕТ (выявленный генотип) каждой семьи._

Пациенты: Наличие фео- Мутация гена RET Бессимптомные

№ семьи, хромоцитомы/ (генотип)замена носители мутации

(возраст/пол) медуллярного аминокислоты/кодон гена ЛЕТ (+ ),

рака у пациен- тиреоидэктомия

тов (Ф/М)

Семья №1:

32 года/м Ф/М TGC-> CGC, кодон 634, экзон 11

50 лет/м Ф Не тестировался

3,5 года/ж - TGC—tCGC, кодон 634, экзон 11 (+ ) тиреоидэктомия

9 лет/м - (-)

38 лет/ж - (-)

9 лет/ж - (-)

10 недель, - (-)

беременности

Семья №2:

35 лет/ж Ф/М TGC—>CGC, кодон 634, экзон 11

25 лет/ж Ф Не тестировалась

29 лет/ж Ф Не тестировалась

20 лет/м м TGC-+CGC, кодон 634, экзон 11 (+ ) тиреоидэктомия

9 лет/ж - TGC—>CGC, кодон 634, экзон 11 (+ ) тиреоидэктомия

2 года/м - (-)

Семья №3:

14 лет/ж м TGC—>CGC, кодон 634, экзон 11

21 год/ж - (-)

42 года/ж м TGC—>CGC, кодон 634, экзон 11 (+ ) тиреоидэктомия

31 год/ж Не обследована TGC—>CGC, кодон 634, экзон 11 ( + )

69 лет/ж Визуальное уве- TGC—iCGC, кодон 634, экзон 11 ( + )

личение щито- От обследования и лечения

видной железы отказалась

Семья №4:

14 лет/ж М TGC-^GGC, кодон634, экзон 11

12 лет/м М TGC—+GGC, кодон634, экзон 11 (+- ) тиреоидэктомия

38 лет/ж М TGC—*GGC, кодон634, экзон 11 (+ ) тиреоидэктомия

74 года/ж щитовид. железа Не тестировалась, от обследова-

удалена в 45 лет ния и лечения отказалась

Эти данные показали, что носители мутаций могут быть подвергнуты тиреоид-эктомии до появления МРЩЖ. Послеоперационное наблюдение от 1,5 до 8 лет (в среднем 4,8 года) позволило установить, что тиреоидэктомия проведенная на доклиническом уровне, позволяет избежать метастазирования и имеет более благоприятный исход заболевания (табл.2), раннее выявление заболевание на основе ДНК-тестирования может изменить течение МРЩЖ.

Изучение исходного и стимулированного уровня кальцитонина - как диагностического маркера показало, что этот тест не всегда является абсолютным критерием. У пациентки 3,5 лет из семьи с МЭН2А наблюдаемый уровень кальцитонина был выше нормы почти в 2,5 раза (76,8 пг\мл), однако при гистологическом исследовании признаков МРЩЖ обнаружено не было (табл.2). Неоспоримая ценность этого метода в возможности оценить полноту хирургического лечения.

Таблица 2.

Клиническая характеристика членов семей больных МЭН 2А, до и после тиреоидэктомии__

Данные обследования пациентов до тиреоидэктомии

Возраст 3,5 года 9лет 14 лет 20 лет 38 лет 42 года

Кальцито-нин (пг/мл) 76,8 42,3 97,0 20,3 40,0 83,4

Катехола-мины норма норма Норма норма норма норма

Мутация гена ЛЕТ + + + + + +

Данные обследования пациентов после тиреоидэктомии

Гистологи ческое исследование щитовид. железы Без признаков С-клеточ. гиперплазии Без призна ков С-кле-точной гиперплазии С-клеточная гиперплазия, узлы медуллярного рака (0,7-1,0 см) Множ. узлы медулл. рака (0,7-1,0 см), очаги С-кл. гиперпл. в обеих долях Множ. узлы медулл. рака (до1,0 см) с амилоидо-зом в обеих долях Множеств, узлы медул-ляр.рака (до 1,0 см) на фоне С-клет. гиперплазии

Кальцито-нин (пг/мл) норма норма норма норма 80,3 норма

Катехол-амины норма норма норма норма норма норма

Длительность наб-ния после опер. 4 года 8 лет 3 года 7 лет 5 лет 2 года

Исходя из приобретенного опыта, пациентам с мутацией в кодоне 634, мы рекомендуем проводить тиреоидэктомию независимо от уровня кальци-тонина. Выявленная взаимосвязь генотипа и фенотипа у носителей этих мутаций может способствовать планированию тиреоидэктомии, принятию решения относительно объема и времени провения профилактической тиреоидэктомии, разработке терапевтических подходов по отношению к пациентам-носителям мутаций. Комбинированный с молекулярными технологиями подход к клинической, биохимической диагностике и ведению пациентов из семей с МЭН2А может стать основным в уменьшение летальности от МРЩЖ.

Первый опыт дородовой диагностики синдрома МЭН2 в нашей стране проведен в семьях с МЭН2А и синдромом семейного МРЩЖ. Пренатальная диагностика проведена в семье №1 (табл.1), где у пациента 32 лет с синдромом МЭН2А (носителя мутации в кодоне 634) ожидалось появление потомства. На сроке беременности 10 недель проведена из клеток ворсин хориона, у его будущего ребенка, была выделена геномная ДНК и выполнена прямая ДНК-диагностика гена ЛЕТ. Для исключения контаминации исследуемого материала материнскими тканями проведено контрольное исследование. Мутации гена КЕТ не обнаружено, выявлен мужской пол плода, родился здоровый мальчик. В возрасте 1 месяца, ему проведено повторное тестирование ДНК, анализ оказался отрицательным. В семье с синдромом СМРЩЖ, у пациентки с мутацией ТСС(Суз)-+ССС(Аг$ в кодоне 620 (экзонЮ), в 35 лет на фоне лечения. МРЩЖ встал вопрос о дородовой диагностике. На сроке беремен-

ности 13-14 недель проведено прямое тестирование гена RET, у плода выявлена аналогичная мутация гена RET. Пациентка приняла решение прервать беременность.

Таким образом, применение Л£Г-анализа дает возможность диагностировать (или исключить) наследственную форму МРЩЖ, подготовить родителей к рождению больного ребенка или предотвратить рождение такового.

Проведенный поиск соматических мутаций в гене RET у больных со спорадическим МРЩЖ позволил идентифицировать мутации в 28,6%. Выявлено 6 типов соматических мутаций, три из которых - гетерозиготные мутации в кодонах 639, 641 и 922 оказались неизвестными ранее. Это дает новые сведения по молекулярной генетике синдромов МЭН2 и позволяет расширить спектр мутаций, который можно рекомендовать для рутинного лабораторного анализа. При изучении мутаций гена RET в образцах крови 13 больных со спорадическим МРЩЖ, обнаружена терминальная мутация "de novo" тем самым показана необходимость ДНК-тестирования спорадических форм МРЩЖ. Созданы предпосылки для формирования банка генетической информации клинически верифицированных больных с МЭН2 в России.

На основе полученных в ходе исследования данных, высокий риск развития гиперпаратироза и феохромоцитомы в семьях с синдромом МЭН2А предполагает необходимость включения в скринирующие программы диагностику этих заболеваний. Выявление мутации в кодоне 918 гена RET свидетельствует о самом агрессивном типе синдромов - МЭН2Б и возможности раннего метастазирования заболевания и соответственно планирования возраста тиреоидэктомии, выбор которого проводится индивидуально, но не позднее первых 5 лет жизни. Синдром семейного МРЩЖ протекает менее тяжело и возникает в более позднем возрасте. ДНК-диагностику в семьях с МЭН2 следует проводить основываясь на вариантах этого синдрома и в соответствии с характеристиками мутаций гена RET.

Структура и соотношение генетически детерминированных форм МРЩЖ включает: 1) семейный синдром МЭН2А (7,4%); 2) МЭН2Б (11,7%); 3) синдром СМРЩЖ (4,4%); 4) в составе синдрома Реклингхаузена (1,4%).

Проведенный генетический анализ МРЩЖ позволил разработать комплексную программу выявления лиц, предрасположенных к развитию этого заболевания, включающую три этапа мероприятий: 1) выявление и регистрация семей с МЭН2; 2) ДНК-диагностика бессимптомных членов семей с наследственным МРЩЖ («группа риска»), дающая индивидуальный прогноз, предусматривающий в зависимости от типа терминальных мутаций тактику ведения пациентов; 3) клинический мониторинг индивидов из группы риска, включающий общее клиническое обследование, определение уровня базаль-ного и пентагастрин-стимулированного кальцитонина, а также диагностику симптомов феохромоцитомы и гиперпаратиреоза (табл.3). Программа включает тактику создания профилактического регистра носителей онкопатологи-ческих генов, которая основана на соблюдении принципов добровольного проведения ДНК-диагностики, конфеденциальности генетической информации, права человека самому решать быть или не быть проинформи-

рованным о результатах генетического анализа и его последствиях. Только после согласия пациента-носителя, он включается в профилактический регистр с последующей организацией и координацией клинико-генетического мониторинга за состоянием его здоровья, профилактических операций, психологической помощи.

Таблица 3.

Выявление наследственных форм МРЩЖ и формирование «групп риска»

Разработанная нами система комплексной диагностики этих заболеваний позволила эффективно провести ДНК-диагностику в онкологическую практику.

Клинико-генетический анализ меланомы кожи.

Генетическая детерминация МК в определенной степени может определяться частотой поражения членов семьи. Изучено 460 больных МК, оценка семейной частоты этого заболевания (2,62±0,42%) в 4 раза превысила таковую "накопленную" заболеваемость (0,66%) в популяции, свидетельствуя о неслучайной сегрегации МК в семьях этих больных.

Анализ выявил особенности семейного проявления МК. Развитие МК у женщин наступает в более молодом возрасте (37,10±3,98) против общей выборки женщин (44,53±0,70) (р<0,05). Возраст проявления МК у мужчин (52,20± 5,26) превышает этот показатель общей выборки (44,65±1,09). Полученные данные о половых различиях возраста проявления МК указывают на существование различных критериев риска для мужчин и женщин и поддерживают идею генетической гетерогенности этого заболевания. Частота появление первично-множественных очагов МК - 0,22 во много раз выше аналогичной частоты несемейных форм (0,02) (р<0,01 при х2=28,067). В 17% случаев ПММК развилась на фоне атипичных и ДН, против 2,6% для общей выборки больных. Частота накопления ДН у родственников больных с семейными формами (0,86), достоверно выше таковых, без семейных накоплений МК (0,41) (р<0,05 при х2 =3,87), а наличие меланоцитарных и ДН оказалось типичным, как для больных МК, так для здоровых родственников из семей с накоплениями МК.

Изучена степень внутриклассовой корреляции фенотипического сходства по возрасту начала заболевания семейных форм МК, данные представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Данные возраста манифестации заболевания МК в парах родственников, их

средняя оценка и коэффициенты корреляции.

№ п/п Пробанды Родители Побанды Дети Пробанды Сибсы

1 34 60 64 34 33 35

2 33 49 57 25 64 29

3 30 44 77 52 42 36

4 41 80 64 35 37 32

5 32 78 57 42 44 44

6 23 49 41 33 61 49

7 34 28 68 39 64 30

8 34 59 42 19 57 58

9 52 42

10 61 56

Среднее значение 32,63 55,88 58,75 34,88 51,50 41,10

Дисперсия 25,13 301,55 153,64 102,13 135,83 110,54

Критерий Фишера 12,0021 Р<0,005 1,5044 1,23

Критерий Стьюдента 3,6384 Р<0,001 4,2216 Р<0,001 1,87

Корреляция Rl=0,4179±0,2919 R2=0,7418±0,159 R3=0,0679±0,3148

-Ч1 II 0 Х2 = 4,40 X2 =0,0461

Полученные значения коэффициентов корреляции для пар: пробанды-роди-тели 0,418, пробанды-дети 0,742, пробанды-сибсы 0,068 не показали достоверных различий по методу %2, подтверждая гипотезу доминантного наследования семейных случаев МК. Следовательно, характерные для семейных форм МК такие признаки как, сегрегация этого заболевания, появление первично-множественных очагов опухоли, наличие ДН и атипичных меланоци-тарных невусов и могут быть использованы в диагностике наследственных вариантов этого заболевания.

Оценивая степень участия меланоцитарных и ДН в развитии МК, были изучены три группы пациентов с большим количеством меланоцитарных невусов, изначально имеющих разный риск развития МК. Первая включала 29 человек, отобранных одномоментно среди 509 индивидов организованного населения г.Москвы. Вторую группу составили 70 человек, обратившихся в поликлинику РОНЦ с жалобами на наличие множественных пигментных невусов на коже. Третья группа, отобрана при осмотре 247 родственников 91 больного МК и составила 22 человека с большим количеством разнообразных невусов на коже туловища. ДН выявлены и подтверждены гистологически во всех трех изученных группах индивидов и у членов их семей. Полученные данные показали, что множественные меланоцитарные невусы, также как и ДН, имеют тенденцию накапливаться в семьях. Лица-носители множественных меланоцитарных и атипичных невусов имеют повышенный, хотя и разный риск развития МК, который значительно повыша-

ется при наличии в семье родственника пораженного МК. Об этом свидетельствует 0,8% обнаруженных нами новых случаев МК среди близких родственников больных МК, что в 3 раза превысило популяционную частоту (0,34%) этого заболевания. Из полученных данных следует, что ДН не всегда несут злокачественный потенциал и, по-видимому, существует ряд изменений в ме-ланоцитарных невусах, часть из которых, на определенной биологической стадии меланоцитарных повреждений, способна трансформироваться в меланому и это является причиной того, что клинические и морфологические признаки атипичных (диспластических) невусов не всегда совпадают. Активный метод выявления МК у лиц с большим количеством меланоцитарных невусов является предпочтительным.

Свидетельством гетерогенности МК в пределах категории наследственных меланом стали моногенно наследуемые синдромы, компонентом которых является МК, выявленные в 3,9% случаев. Одни из них, характеризуются развитием опухолей разных локализаций, такие как синдром «семейного рака» (синдрома Линча II), синдром 1л-Ргаитеш. Другие, включают нейрокожные нарушения, так называемые нейрокристопатии, такие как нейрокожный ме-' ланоз, синдром базальноклеточного невуса, Реклингхаузена, Гарднера, изучение которых, даёт основание для предположения о существовании общей патогенетической основы семейной предрасположенности к меланоме, поражению нервной системы и дериватов кожи. К нейрокристопатиям относится и синдром диспластических невусов, который установлен в 1,1% от общей выборки больных МК.

Частота поражения разными неоплазиями членов семей больных МК составила 14%, превысив аналогичную частоту в популяции - 4,0% (р<0,01^). Чтобы уяснить наличие или отсутствие закономерностей в развитии тех или иных форм опухолей, поражающих родственников больных МК, проведен анализ частоты разных неоплазий встречающихся в семьях: больных МК, лиц-носителей множественных невусов, больных раком желудка и здоровых лиц контрольной группы, данные приведены в таблице 5.

Как видно из таблицы родственники лиц-носителей множественных меланоцитарных невусов, наиболее часто поражаются МК (р<0,01), опухолью мозга (р<0,01), раком кожи (р<0,01) по сравнению с таковыми из группы здоровых индивидов. Сравнительный анализ частоты поражения неоплазиями членов семей больных МК с аналогичной частотой лиц носителей множественных невусов достоверных различий не выявил. Однако сравнение частоты поражения неоплазиями родственников этих двух групп с таковыми, поражающими родственников здоровых индивидов из контрольной группы, показало, что члены их семей статистически достоверно чаще поражаются МК, опухолями мозга и раком кожи. Следовательно, опухоли, которыми наиболее часто поражаются родственники из семей больных МК и лиц-носителей множественных невусов, имеют тенденцию к косегрегации МК, опухоли мозга и рака кожи, достоверно отличаясь от таковых, накапливающихся не только среди родственников здоровых лиц контрольной группы, но и в семьях больных раком желудка.

Таблица 5.

Частота различных форм опухолей в семьях исследуемых выборок

Локализация злокачественной опухоли Число пораженных (в %) среди родственников 1-й степени родства

Лиц- носителей меланоцитарных невусов (общее кол-во родствен-ников-259 чел-к) Больных мела-номой кожи (общее кол-во родственников -1667 человек) Больных раком желудка (общее кол-во родств-ков -3733 челов.) Контрольной группы ниц, не болевших неоплазиями (общее кол-во родственников - 4654 челов.)

Желудок 1,93 1,6 3,88 (р<0,01) 1,42

Толстая кишка 0,4 0,6 0,58 0,43

Молочная железа 1,54* 1,76* 0,48* 0,43*

Легкое 0,39 0,89 (р<0,05) 1,27 (р< 0,01) 0,32

Поджелудочная железа 0,38 0,42 0,43 (р< 0,05) 0,15

Мозг (нерв ная система) 1,54 (р< 0,01) 0,42 (р<0 ,05) 0,21 0,085

Меланома кожи 1,54 (р< 0,01) 0,89 (р<0,01) 0.08 0,024

Базальноклето чный рак кожи 1,54(р< 0,01) 0,48 (р<0,01) 0,29 0,15

Почка 0,48 (р< 0,05) 0,13 0,085

Лейкоз 0,39 0,66 (р< 0,01) 0,24 0,15

Саркома мягких, костных тканей 0,54 (р<0,01) 0,19 0,065

Эндометрий 0,4* 0,5* 0,77* (р< 0,05) 1,1*

Мочевой пузырь 0,24 0,21 (р< 0,05 ) 0,02

♦Расчет частоты поражения проводился только на женщин.

Таблица 6.

Оценки генетических корреляций между изучаемыми признаками на основе семейной выборки лиц-носителей меланоцитарных невусов

Дисплас-тический невус Родственники 1 степени родства

Меланома кожи Опухоль мозга Рак желудка

0,435±0,092 (#=0,87) 0,402±0,123 (Я=0,81) 0,138± 0,071 Г#=0,28)

Популяционная частота изучаемых заболеваний

(0,7%) 273 (0,1%) 4 (0,08%) 1467 (0,7%)

Оценки генетических корреляций: ДН-МК - 87%, ДН - опухоль мозга -81% показали существование высокого генетического сходства между ДН,

МК и опухолью мозга. Установленную в ходе исследования связь между опухолевой и предопухолевой патологией, у родственников из семей больных МК и у родственников лиц с множественными невусами, можно рассматривать как фактор формирующий повышенный риск развития вышеуказанных заболеваний, а появление этих заболеваний в семьях лиц-носителей множественных меланоцитарных невусов и МК, более закономерно, чем следует из традиционных клинических представлений. Возможность поражения этими злокачественными опухолями должна учитываться при определении риска в семьях больных МК и лиц с множественными невусами.

Цитогенетическое изучение частоты и характера распределения сайтов повышенной ломкости хромосом (СПЛХ), проведено у пациентов, условно распределенных на 4 группы: больные МК, больные МК и ДН, пациенты носители диспластических невусов, здоровые доноры (табл.7). Как видно из таблицы, наиболее высокая частота спонтанных аберраций наблюдается у пациентов с ДН. Средний процент аберрантных метафаз в группе «ДН» составил 6,69±0,8, в группе «меланома +ДН» -6,79 ±0,7, по сравнению с 2,43±0,6 у здоровых индивидов (Р<0,01). У 6 из 8 обследованных больных МК идентифицирован синдром ДН и для каждого из них зафиксирован повышенный уровень спонтанных аберраций.

Полученные данные позволяют рассматривать синдром ДН как заболевание с хромосомной нестабильностью, что соответствует современным представлениям об этом синдроме.

Таблица 7.

Результаты цитогенетических исследований разных групп пациентов

Здоровые доноры Больные меланомой Пациенты с ДН Больные с МК и ДН

Пол Частота Пол ТОМ Частота Пол Частота Пол там Часта

(воз- аберрант- (воз- класси- аберрант (воз- аберрант- (воз- Класс- аберрант-

раст) ных мета- раст) фикация ных мета- раст) ных мета- раст) ифика- ных мета-

фаз (%) фаз %) фаз (%) ция фаз %)

Спо Инд Спо- Инд- Сто- Инд- Спо- Ин

нтан уци- чтан -цир. птан уци- чтан дуц

-ных ров. :1ЫХ пых эов. ир.

Ж (33) 5.0 60.8 М(35) ТоГ«оМо 5.0 61.4 M (14) 3.0 37.6 Ж (23) ТЗ№>Мо 4.6 60.0

Ж (34) 2.0 27.3 Ж(37) Рецидив 4.0 58.8 ж (22) 0 80.4 М (38) Т4№>Мо 8.0 64.2

М (35) 0 33.3 Ж(37) ТЗКоМо 6.0 66.7 Ж (24) 14.0 34.1 Ж (41) Т2№Мо 1.0 30.5

Ж (36) 0 47.4 М(37) Т2\оМо 5.0 54.2 Ж (27) 9.0 47.1 М (52) Т2№Мо 4.0 67.3

М (36) 6.0 36.5 Ж(42) ТоК2Мо 6.0 38.0 М (53) Т2№Мо 9.0 26.0

Ж (41) 4.0 61.4 Ж(44) ТЗ!ЧоМо 2.0 64.1 М (63) То1\оМо 6.0 65.4

Ж (42) 0 51.8 Ж(51) ТЗГЧоМо 4.0 39.8 М (70) ТШоМо 8.0 72.8

Ж (51) 0 60.6 М(51) Т4Р.оМо 2.0 543 М (72) Т4№>Мо 14.0 55.1

Ж (53) 0 42.1 Ж(52) ТЗЛоМо 1.0 43.0

Ж (53) 3.0 58.5 Ж(53) ТЗ!ЧоМо 3.0 55.8

М(56) То\оМЗ 2.0 43.1

У индивидов с МК, ДН и МК+ДН в трех участках короткого плеча хромосомы 1 -1р22,1р31,1р32 наблюдается общность в индивидуальном распределении

разрывов и отличается от нормы с высокой достоверностью. Что ассоциируется

с локальной хромосомной нестабильностью ( рис.2).

2 _ В Здор.доноры (%)

И Пациенты с ДН (%) ■ Больные МК (%) 0 Больные МК+ДН

Рис.2. Сайты повышенной ломкости хромосом, экспрессия которых увеличена у больных МК и или ДН по сравнению со здоровыми индивидами контрольной группы.

Поскольку эти изменения присутствуют у пациентов с ДН, локальная хромосомная нестабильность относится к ранним событиям предшествующих развитию МК.

Анализ потери гетерозиготности в районе локализации гена р16/СОКЫ2А по микросателлитным маркерам (098157, 098161Д)98171,09Б169, 098301) у 37 больных МК показал, что в 24% случаев больных МК наблюдается геми-зиготность по различному набору используемых маркеров.

Изучение аномального метилирования промоторного района гена СБШ2А показало, что метилирование этой области ДНК гена СИКЫ2А определяется в 24,3% образцов МК. Причем гиперметилирование промоторного района гена СОКЫ2А выявлено у всех больных с первично-множественными злокачественными опухолями, включающими МК, позволяя предположить, что больные МК с аномальным метилированием гена СЭКЫ2А имеют тенденцию к развитию полинеоплазии.

Структура генетически детерминированных форм МК включает: 1) семейные формы заболевания (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%); 3) первично-множественную МК (2,6%); 4) первично-множественные злокачественные опухоли в сочетании с МК (4,1%); 5) МК в составе наследственных синдромов (3,9%).

ется при наличие более одного родственника больного МК); 2) наличие в семье первично множественной МК или ПМЗО, включающую МК 3) наличие в семье множественных невусов и опухоли мозга или немеланомного рака кожи; 4) наличие в семье ДН и МК; 5) наличие большого количества мелано-цитарных невусов и/или атипичных невусов у члена семьи; 6) наличие в семье моногенно наследуемого синдрома, компонентом которого может быть МК.

Клинико-генетический анализ первично-множественных злокачественных опухолей.

Другими изученными локализациями явились первично множественные злокачественные опухоли, включавшими оценку клинических, эпидемиологических и молекулярных особенностей 400 больных с синхронным и метах-ронным ПМЗО. Проведенный анализ создал основу для выделения разных вариантов патологии и показал существование косегрегации отдельных форм опухолей в семьях таких больных. Установлено, что риск развития этих заболеваний тесно коррелирует с семейным анамнезом заболевания. Частота ПМЗО среди родственников (0,8%), во много раз превышает аналогичную частоту в популяции г.Москвы (0,008%). Частота поражения разными злокачественными новообразованиями членов семей больных ПМЗО (26,9±-1,8 %) также превысила аналогичную частоту (4,0±0,03%) в популяции (Р<0,001). Сравнение частоты поражения неоплазиями родственников больных ПМЗО с таковой у больных солитарным раком контрольных групп (больных раком желудка, молочной железы и меланомы кожи) показало не только более тяжелый фенотип заболевания при ПМЗО, но и то, что члены семей этих больных являются предметом высокого онкологического риска (Р<0,001)( рис.3).

@ Отцы □ Матери ■ Братья

■ Сестры ЕЗСыновья ■ Дочери

1)2,2 16 (1 14,2 —1

9,7

Родственники больных ПМЗН

Родственники больных раком желудка

Родственники больных меланомой

Родственники больных РМЖ

Рис.3. Частота злокачественных опухолей среди различных групп родственников 1-ой степени родства больных ПМЗН, больных раком желудка и меланомой кожи и раком молочной железы.

Выявлена тенденция к предпочтительному поражению идентичных органов в семьях больных с первично множественным поражением раком толстой кишки (рис. 4).

Рис.4. Семейная агрегация колоректального рака в семьях больных единственным раком толстой кишки и в семьях больных первично-множественным раком толстой кишки (ПМ30ТК).

Частота накопления однотипных опухолей в семьях больных с первично множественным раком толстой кишки (5,8±0,6%) выше, чем аналогичный показатель в семьях больных с солитарным раком толстой кишки (3,0±0,2%) (Р<0,001), следовательно для членов семей больных с ПМЗО с поражением толстой кишки риск развития рака этой локализации повышен. Частота развития первично множественного рака у больных раком толстой кишки выше, чем у больных раком прямой кишки. Пропорция поражения множественной малигнизацией толстой кишки у мужчин больных раком толстой кишки (2,4±1,6%), по отношению к таковой у мужчин больных раком прямой кишки (0,8±1,8%), составила 3:1 (Р<0,001). У женщин больных раком толстой кишки и раком прямой кишки, таких различий не выявлено. Отсутствие этих различий у женщин исключает возможность артефакта из-за вероятности включения в анализ синдрома ННКРР. Исходя из полученных данных, больных с первично множественным раком толстой кишки и раком прямой кишки следует рассматривать как две отдельные, биологически более гомогенные группы.

В семьях больных ПМЗО выявлена тенденция к совместному развитию некоторых видов рака. Из группы женщин больных ПМЗО, при первом первичном раке молочной железы, вторая первичная опухоль чаще всего поражает: толстую кишку -25%, эндометрий - 5,8%, яичники -5,8%, шейку матки -4,5%, молочную железу -2,7%, желудок -11%, и др. Если развитие единственного РМЖ в значительной степени обусловлено влиянием окружающих факторов риска, то у пациенток, пораженных дополнительными первичными опухолями, влияние генетических факторов может быть доминирующим. Подтверждением этому является то, что 16% родственников, из семей этих пациенток, также были поражены полинеоплазиями, частота которых превышала таковую в популяции (4,2%) (р<0,05).

Изучение совместных локализаций полинеоплазий среди 543 женщин с ПМЗО, у половины которых, одной из первичных опухолей был РЯ, а у другой - рак эндометрия, выявило, что в обеих группах, сочетание поражения раком: яичников, эндометрия, молочной железы и органов желудочно-кишечного тракта, имеет устойчивую ассоциацию, данные представлены на рисунках 6,7.

РЖКТ РШ М Др.лок.

Рис. 6. Локализация второй первичной Рис.7. Локализация второй первичной опухоли у 211 больной ГТМЗО с пораже- опухоли у 232 больных ПМЗО с поражением эндометрия. нием яичников.

Полученные данные стали основанием для оценки генетических корреляций между выявленными формами рака в семьях больных ПМЗН. Установлены достаточно высокие оценки корреляций между раком эндометрия и раком толстой кишки (0,9±0,2), между раком молочной железы и раком толстой кишки (0,7±0,3), между раком желудка и раком молочной железы (0,8±0,6).

Хотя каждая из указанных форм опухолей имеет характерные именно для нее системы детерминации, однако доля общих генов подверженности свидетельствует о наличии общих этиологических механизмах (генетической общности) их развития и выраженности связей определенных типов опухолей в семьях больных ПМЗО. Эти наблюдения представляют интерес, поскольку, если у больного одна из первичных опухолей соответствует указанным выше, то можно ожидать в отдельно взятых семьях аналогичные солитарные опухоли у родственников.

Установленная общность генетических механизмов подверженности к проявлению указанных форм опухолей подтверждает наличие генетической гетерогенности между «спорадическими» формами рака женских репродуктивных органов, желудка, толстой кишки и ПМЗО, компонентами которых они являются.

Показано, что развитие ПМЗО ассоциируется с моногенно наследуемыми синдромами. Эти синдромы, обладают уникальными клиническими особенностями к поражению первичной злокачественной опухолью нескольких анатомических областей. Ассоциированная генетическая предрасположенность особенно выражена для остео-, мягкотканых сарком, лейкозов, РМЖ и для новых опухолей в области мозга и ЦНС при синдроме 1л-Ргаитеш, при синдроме Каудена - рака молочной железы, щитовидной железы и толстой кишки и др. В семьях больных ПМЗО наследственные варианты злокачественных опухолей встречаются значительно чаще (17,3%), по сравнению с таковыми, установленными при равных условиях в семьях 460 больных МК (3,9%) и семьях 950 больных раком желудка (2,1%) (р<0,01). Возраст диагностики первого первичного рака у больных с синдромами оказался более ранним (43,6± 1,6 года), по сравнению с таковым в общей группе больных ПМЗО (49,8±0,9 года) (р<0,01).

Коэффициент наследуемости ПМЗО, рассчитанный на основе корреляций, оказался равным - 77,4%, что без учета гетерогенности этих опухолей, свидетельствует о высокой генетической детерминации и, следовательно, генетической отягощенности этих семей.

Определение частоты наиболее распространенных терминальных мутаций в генах ВКСА1/2 и СНЕК2, с использованием технологии олигонуклеотидных биочипов у 20 больных ПМЗО с поражением яичников и 68 больных одним РЯ показало, что терминальные мутации в гене ВЯСА1 выявляются в 52,63% больных ПМЗО и только у 10,3% больных солитарным РЯ (р<0,01). Наличие у пациентки ПМЗО с поражением яичников увеличивает вероятность обнаружения в семье мутации в гене ВЯСА1. Синдромы «семейного рака» идентифицированы у 55% больных ПМЗО - носителей терминальной мутации в гене ВЯСА1. У больных одним РЯ выявлено два типа мутаций: 185<Зе1АО (1,47%) и 5382тзС (8,82%). У больных ПМЗО с поражением яичников, идентифицированы 4 типа мутаций гена ВЯСА1 (табл.8).

Таблица 8.

Типы мутаций гена ВЯСА1 обнаруженные у 11 из 20 пациенток, у которых

одной из первичных опухолей был рак яичников.

Локализация опухоли Мутация в гене Количество

ВЯСА! случаев

РЯ-РМЖ 5382тзС (экзон 20) 3

4153с1е1А (экзон 11) 1

185ёе1АО (экзон 2) 1

300Т>С (экзон 5) 2

РЯ + злокач.гистиоцитома 300Т>С (экзон 5) 1

пр.гематоракса

РЯ + рак щитовидной железы 5382тэС (экзон 20 1

РЯ + рак почки 5382тзС (экзон 20) 1

РЯ + меланома кожи 5382нн>С (экзон 20) 1

Анализ семей больных с выявленными генотипами гена ВЯСА1 показал, что формы опухолей, которыми поражаются родственники этих больных, различается в зависимости от вариантов мутаций в пределах гена. В семьях ассоциированных с мутацией в позиции 5382тзС, по сравнению с другими типами мутаций в гене ВЯСА1, родственники чаще поражаются раком женских репродуктивных органов, предстательной железы и меланомы кожи (МК), (рис. 9). Родословная больной С. (мутация 5382тзС гена ВЯСА1).

Рис. 9. У больной ( Ш-2) с терминальной мутацией 5382тБС, меланома кожи верхней трети правого бедра диагностирована в 41 год, РЯ в 51 год, у матери (Н-З) МК лица удалили в 41 год, а через 10 лет у не обнаружен рак эндометрия, умерла в 70 лет, дедушка (1-1) рак кожи. Сестра (III-1) полипоз эндометрия, мутации не обнаружено.

В семьях носителей мутации в позиции 300 замена Т>С гена ВЯСА1, члены семей поражались раками разных типов, среди которых рак толстой кишки и желудка встречался чаще, чем при других типах мутаций (рис.10).

Родословная больной Н. (мутация 300ТХ} гена ВЯСАГ).

+72 +54

Рис. 10. У больной (Н-2) с терминальной мутацией ЗииТ>0, рак молочной железы обнаружен в 34 года, а в 38 лет диагностирован второй первичный рак яичников, мать (1-4) умерла 54 года от РЯ, брат (П-З) умер от рака толстой кишки, сестра (II-4) рак эндометрия, бабушка (1-4) - РЯ, у дочери (111-1) выявлена мутация 300Т>С.

При мутациях 4153с1е1А и 185с1е1АО, родственники наиболее часто поражались раком той же самой анатомической локализации и/или РМЖ (рис.11).

Родословная больной О, (мутация 185с1е1АО) .

1 2

Рис. 11. У больной (Н-З) РМЖ обнаружен в 41 г, РЯ в 50 лет, у дочери (III-1) рак обеих яичников обнаружен в 39 лет, мать больной (1-2) умерла от РЯ в 44г. Мутация во 2 экзоне гена ВЯСА1 - 185<1е1АО обнаружена у матери (П-З) и дочери (III-1), у детей (1У-1,2) мутации не обнаружено.

Хотя полученные данные статистически незначимы, встречаемость этих форм рака следует учитывать в семьях больных ПМЗО с поражением яичников и их использование могло бы быть полезным при прогнозе риска

развития неоплазий у родственников в зависимости от варианта выявленной терминальной мутации у больного.

В анализируемых группах мутации в гене ВЯСА2 выявлены у больных с билатеральным РМЖ, мутаций в гене СНЕК2 не обнаружено.

Статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста ЯАБЗРЫ, и БЕМАЗВ исследован в представительной выборке, включавших 330 образцов РМЖ и РЯ. На рисунке 12 приведены примеры анализа метилирования Срв-островка гена КАЗБПА в образцах РМЖ и яичников.

Т<+) 14 т Т<-.» Г? ГТ1-) Т Т<—> N К< ->

Рисунок 12. Примеры типичных результатов анализа метилирования промоторной области гена RASSF1A с применением метода МС-ПЦР в образцах РМЖ и РЯ. Электрофоретическое разделение в 10 % ПААГ продуктов МС-полимеразной цепной реакции (ПЦР), полученных для образцов ДНК. ПЦР проводили на ДНК конвертированной бисульфитом. Исследован фрагмент 168 п.н. гена RASSF1A. М-маркер длин фрагментов с шагом 10 п.н. (10 bp DNA ladder ). Контроль полноты рестрикции - фрагмент 445 п.н.; контроль целостности ДНК - фрагмент 229 п.н.: анализируемый фрагмент гена RASSF1A 357 п.н.. К (-) - отрицательный контроль ( в отсутствие ДНК). М - маркер длин фрагментов с шагом 100 п.н. (100 bp DNA ladder). Т- опухоль, N- норма.

Выявлена высокая частота аномального метилирования CpG-островка генов RASSF1A, RARß2 и SEMA3B в опухолях молочной железы: 78% (32/41), 46% (26/56), 35% (22/65), в опухолях яичников:73% (33/45), 30% (15/50), 50% (25/51), соответственно. Впервые обнаружено, что у больных ПМЗО метилирование ДНК из образцов ткани рака молочной железы, принадлежащих CpG островкам генов RASSF1A, RARß2 выявлялось практически во всех случаях -90% (11712) и - 90% (4/5), соответственно. При наличии у больных ПМЗО с поражением яичников, аномальное метилирование CpG островка гена RASSF1A выявлялось в 67% (8/12), а гена RARß2 практически во всех случаях 90% (4/5). На рисунке 13 показано схематическое изображение метилирования промоторного района гена RASSFIA в образцах РМЖ.

Опухоль

Рисунок 13. Применение бисульфитного секвенирования и МЧРА при анализе метилирования CpG-островка промоторной области гена RASSF1A. Сверху даны позиции CpG-динуклеотидов; CpG- динуклеотиды 2,3, 9.. и 31; с левого края приведены номера образцов РМЖ. Черный прямоугольник указывает на выявление метилирования, белый прямоугольник - метилирование не выявлено. Приведены данные анализа для 12-ти образцов ДНК первичных опухолей РМЖ, №341-527, № 510 и 374- образцы, принадлежащие больным с ПМЗО. Справа показаны клинико-гистологические характеристики опухоли: D - инфильтративно-протоковый рак молочной железы; L - инфильтративно-дольковый рак молочной железы, Mix -смешанный; стадия и степень анаплазии опухоли.

Показано, что аномальное метилирование промоторной области гена RASSF1A можно обнаружить на доклинической стадии развития этих опухолей. В морфологически неизмененной ткани уровень метилирования для гена RASSF1A составил 14% (РМЖ) и 5% (РЯ). Отсутствие метилирования этих участков ДНК в крови здоровых доноров (0/15), что позволяет считать метилирование этого гена ранним молекулярным маркером злокачественной трансформации РМЖ и РЯ. Вьивлена корреляция частоты метилирования промоторных районов генов RAR/32, SEMA3B с клинической стадией и степенью анаплазии РМЖ и РЯ (рис.14).

АО 30

РМЖ РЯ

"2 3 |Л1 IIMV

Ст Стадия

оиаплази!

Рис. 14. А. Частота метилирования промоторного Срв-островка гена &4ЛД2 в образцах ДНК первичных опухолей РМЖ и РЯ по сравнению с образцами ДНК гистологически-нормальной ткани от тех же пациентов. В. Корреляция уровня метилирования (с учетом плотности метилирования Срв островка) гена ЯАЯр2 со степенью анаплазии опухоли (1/2 против 3, 1-я пара столбиков) и с клинической ста-

дней рака молочной железы (I/1I против III/1V, 2-я пара столбиков). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера (Р<0.005).

Как видно на рисунке 14 значение частоты метилирования в ДНК опухолей молочной железы и яичников достоверно выше соответствующих величин, полученных для ДНК морфологически нормальной ткани из этих органов, полученных от тех же пациентов (Р<0,001).

Результаты исследования метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RARß2 и SEMA3B, свидетельствуют о значительной роли эпигенетических факторов в регуляции функции этих генов в канцерогенезе рака молочной железы и рака яичников. Выявленные в ходе исследования данные показали, что больные с гиперметилированием гена RASSFIA и RARß2 имеют тенденцию к развитию первично множественных поражений, включающих молочную железу и яичники. Метилирование промоторных районов генов RASSFIA, RARß2, SEMA3B, может использоваться в качестве маркеров в комплексной диагностике и прогнозе этих заболеваний и имеет большие возможности для разработки неинвазивной диагностики рака.

Генетически детерминированных формы ПМЗО выявлены в 18,1%, из них семейные формы - 0,8%, в составе наследственных синдромов -17%. Еще одним существенным обстоятельством, в плане использования как диагностического инструмента определения предрасположенности к раку в семьях больных ПМЗО, является: 1) ранний возраст манифестации рака у больного или у члена его семьи; 2) наличие в семье больных с первично множественным поражением злокачественными опухолями; 3) наличие в семье большого числа мультифокального и двустороннего поражения парных органов; 4) большое число пораженных индивидов более чем в одном поколении родственников; 5) наличие в семье специфических опухолевых ассоциаций, которые можно объединить в понятие синдром; 6) выявление мутации гена, специфически связанного с возникновением неоплазии у одного из членов семьи.

Таким образом, разработаны и внедрены, основанные на применении кли-нико-генеалогических, цитогенетических и молекулярно-биологических исследований, методы оценки генетической детерминации развития рака щитовидной железы, меланомы кожи, первично-множественных злокачественных опухолей и их генетической гетерогенности, позволившие создать в медико-генетическом консультировании этих неоплазий новые возможности для ранней диагностики, профилактики, прогноза развития неоплазий у клинически здоровых родственников из семей этих больных, выборе тактики лечения, вопросах планирования семьи.

Разработаны рекомендации по ранней диагностике и оценке эффективности прогноза развития неоплазий у клинически здоровых родственников из семей этих больных и у ряда из них, с профилактической целью, проведены дородовая диагностика и хирургическое вмешательство, что практически исключало риск развития рака.

Разработан алгоритм медико-генетического консультирования при РЩЖ, МК и ПМЗО, включающий выявление и регистрацию семей с отягощенным семейным анамнезом, уточнение генетического диагноза (в том числе ДНК-диагностику), формирование групп риска и их мониторинг, который можно представить в виде схемы:

Оценка семейного отягощения и необходимости выполнения молекулярно-

генетического исследования у больного и у членов его семьи.

-^-

Формирование контингента повышенного риска

Клинический мониторинг «групп риска» в условиях специализированного медучреждения

ВЫВОДЫ

1. Анализ 1495 больных раком щитовидной железы (РЩЖ), меланомы кожи (МК) и первично множественных злокачественных опухолей (ПМЗО) и 8727 их родственниках 1-Й-2-Й степени родства выявил основные особенности и генетические закономерности их проявления.

2. Наследственные варианты немедуллярного РЩЖ (НМРЩЖ) установлены в 5% случаев, из них в 3,6% НМРЩЖ встречается у больных с наследственными синдромами. Впервые выявлен синдром семейного папиллярного РЩЖ (1,4%). Обнаружена тенденция к поражению разных органов у больных НМРЩЖ: частота первично множественного поражения в семьях (5,4%) превысила таковую в популяции (0,003%). Выявлена косегрегация НМРЩЖ с неоплазиями почки, молочной железы, МК, толстой кишки.

3. Генетически детерминированные формы медуллярного РЩЖ (МРЩЖ) идентифицированы в 24,9% случаев и клинически они проявляются как синдром МЭН2А, МЭН2Б и синдром семейного МРЩЖ. Молекулярной основой МЭН2 являются мутации в гене RET. Выявлены мутации гена RET в цистеи-новых кодонах: 634- в семьях с МЭН2А, 918 -в семьях МЭН2Б, 620 - при синдроме СМРЩЖ. Показано, что причиной клинического полиморфизма МРЩЖ является аллельная гетерогенность.

4. ДНК-диагностика МРЩЖ открывает возможность дородового выявления синдромов МЭН 2 и позволяет разработать терапевтические подходы у носителей мутаций гена RET. Первый опыт пренатальной диагностики в семьях с МЭН2А и синдромом СМРЩЖ показал высокую надежность и эффективность этого метода, а «профилактическая» тиреоидэктомия, проведенная у бессимтомных носителей мутации этого гена, получила гистологическое подтверждение диагноза медуллярного РЩЖ почти во всех случаях.

Получение согласия клинически здорового члена семьи на проведение ДНК-скрининга с целью выявления патологических генов,

дающих высокий риск развития рака. -^-

5. Структура генетической детерминации МК, включает: семейную форму (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%); 3) первично-множественную МК (2,6%); 4) первично-множественные злокачественные опухоли с включением МК (4,1%); 5) МК в составе наследственных синдромов (3,9%). Риск развития МК для лиц с большим количеством меланоцитарных, атипичных и ДН значительно повышается при наличии в семье МК. В семьях больных МК и лиц - носителей множественных и ДН выявлена косегрегация опухоли мозга, МК, рака кожи. Оценки генетических корреляций между ДН-МК, ДН-опухолью мозга, показали высокое генетическое сходство, подтверждая, что опухоли нервной системы и МК могут независимо накапливаться в этих семьях.

6. Установлено, что цитогенетические изменения с наибольшей частотой аккумулируются в трех участках кроткого плеча хромосомы 1(1р), обнаруживая общность в индивидуальном распределении разрывов в регионах 1р22, р31, р32 у индивидов с МК, МК+ДН и у лиц носителей ДН, что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью и является ранним событием в цепи изменений, предшествующих МК.

7. Гемизиготность по различному набору используемых маркеров (098157, 098161, 098171, 095169, 098301) в районе локализации гена р16/СОШ2А наблюдается у 24% больных МК. Аномальное метилирование промоторной области гена СОКЫ2А выявляется у 24,3%, однако инактивация этого участка ДНК гена СБКЫ2А в результате метилирования выявляется у всех больных с первично множественными неоплазиями, включающими МК.

8. ПМЗО являются наследственно детерминированными в 18,1%, из них семейные формы - 0,8%, в составе наследственных синдромов -17,3%. Частота поражения неоплазиями родственников из семей больных ПМЗО (26,9± 1,8 %) превышает аналогичную частоту в популяции (4,0±0,03%) (Р<0,001) и таковую у больных солитарным раком контрольных групп (РМЖ, МК и раком желудка), определяя, что члены семей больных ПМЗО относятся к группе высокого онкологического риска. У больных ПМЗО выявлена органная ассоциация между опухолями, поражающими больных и членов их семей. Тенденция к совместному развитию рака яичников, эндометрия, молочной железы и органов желудочно-кишечного тракта подтверждена оценками генетических корреляций между РЭ и РТК (0,9±0,2); РМЖ и РТК (0,7±0,3); раком желудка и РМЖ (0,8±0,6), указывая на наличие общности генов, детерминирующих предрасположенность к развитию этих опухолей.

9. Частота терминальных мутаций в генах ВЯСА1 больных ПМЗО с поражением яичников составляет 52,63%, тогда как у больных одним РЯ - 10,3% (р<0,01). У больных ПМЗО - носителей терминальной мутации в гене ВЯСА1, синдромы «семейного рака» выявлены в 55%. Обнаружено, что локализация неоплазий у родственников больных ПМЗО - носителей мутаций в гене ВЯСА1, различается в зависимости от типа мутаций: в семьях, ассоциированных с мутацией 5382шзС, родственники поражались раком женских репродуктивных органов, предстательной железы и МК; в семьях носителей мутации ЗООТМЗ, рак толстой кишки и желудка у членов семей встречался чаще, чем

при других типах мутаций, а при мутациях 4153delA и 185delAG родственники чаще поражались раком той же самой анатомической локализации и/или РМЖ.

10. Исследованный статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, RARß2 и SEMA3B в опухолях молочной железы и яичников показал, что аномальное метилирование промоторных районов этих генов выявляется в опухолях молочной железы, соответственно, в: 78%, 46% и 35%; в опухолях яичников: 73%,30% и 50%, тогда как, при наличии у больных ПМЗО аномальное метилирование CpG островка гена RASSF1A выявлялось практически во всех случаях РМЖ и РЯ, а гена RARß2-во всех случаях РЯ. Выявлена корреляция частоты метилирования промоторных райнов генов RARß2 и SEMA3B с клинической стадией и степенью анаплазии опухоли. Показано, что метилирование промоторных районов генов RASSF1A, RARß2, SEMA3B может использоваться в качестве маркеров в комплексной диагностике и прогнозе этих заболеваний, что дает возможность разработки неинва-зивной диагностики рака.

11. Разработан алгоритм медико-генетического консультирования при РЩЖ, МК и ПМЗО, включающий оценку семейной отягощенности (выявление и регистрацию семей с отягощенным семейным анамнезом),-уточнение генетического диагноза (в том числе ДНК-диагностику), формирование групп риска и их мониторинг.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Гарькавцева Р.Ф., Сотникова E.H., Казубская Т.П., АкуленкоЛ.В., Нефедов М.Д., Лиснянский И.Е. Медико-генетические аспекты злокачественных новообразований. // Обзорная информация «Медицина и здравоохранение», серия — Онкология. 1990, вып.2 ,С.1-18

2. Сельчук В.Ю., Казубская Т.П., Белев Н.Ф., Нефедов М.Д., Гарькавцева Р.Ф. Генетические аспекты первично-множественных злокачественных новообразований.// Вестник ВОНЦ АМН СССР. 1990 , № 1, С.28-31.

3. Казубская Т.П., Ситникова Т.С., Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В., Гарькавцева Р.Ф. Роль наследственных факторов в возникновении меланомы кожи.// Всесоюзный симпозиум «Клиника и лечение меланомы кожи» Саратов. 1990, С.28-30.

4. Сельчук В.Ю., Казубская Т.П. Генетическая гетерогенность и прогнозирование первично-множественных злокачественных новообразований.// YI республиканнская науч. конф. онкологов Молдавии, Кишинев. 1990, С. 9-10.

5. Sitnikova Т., Kazubskaya Т. Clinical genetic analisys malignat melanoma.// Eur. J. Cancer EACR-XI, Genua, Italy, 1991, Suppl.3, V. 27, Post. 2015, S.24

6. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Сельчук В.Ю. Анализ генетической предрасположенности к раку в семьях больных первично-множественными злокачественными новообразованиями.// Цитология и генетика. Киев, 1992, Т. 21, С.32-36.

7. Казубская Т.П., Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В., Мусатов В.К., Гарькав-цева Р.Ф. Диспластические невусы и их значимость для идентификации предрасположенности и ранней диагностики меланомы.// Вестник ОНЦ АМН России. 1993, № 1, С.20-25.

8. Сокова О.И., Кириченко О.П.,Чеботарев А.Н., Казубская Т.П., Харкевич Г.Ю., Мусатов В.К., Копнин Б. П. Повышенная частота повреждений некоторых участков хромосом в клетках крови больных меланомой и/или дисп-ластическими невусами.// Вестник ОНЦ России. 1993, № 1, С. 34-38.

9. Kazubskaya Т., Selchuk V., Belev N.,Garcavtseva R. Genetic-epidemiologi-cal study of multiple primary malignant neoplasms.// Cancer Detection and Prevention, 1993, V. 17, № 99, P.114-115.

10. Харкевич Г.Ю., Казубская Т.П. Идентификация наследственных вариантов меланомы кожи.// 50-лет Акад. мед. Наук, Москва. 1994, С.153-154.

11. Selchuk V., Kazubskaya Т., Klimenkov A., Garkavtseva R. Multiple Primary Malignant Neoplasms.// XVI International Cancer Congress. 1994, 30 Oct.-5 Nov. India, Delhi, Ref-00110, P.284

12. Гарькавцева Р.Ф., Ситникова T.C., Казубская Т.П., Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю. Генетический анализ предрасположенности к развитию меланомы кожи. Сообщение 1. Распространеность, семейное изучение, генетическая гетерогенность.// Генетика. 1995, Т.31, №11, С.557-1561.

13. Харкевич Г.Ю., Казубская Т.П.,Агапова Р.К., Мусатов В.К., Трубников В.И., Гарькавцева Р.Ф. Генетический анализ предрасположенности к развитию меланомы кожи. Сообщение 2. Взаимосвязь и патогенетическая общность меланомы кожи с диспластическими невусами.//Генетика. 1995, Т.31, №11, С.1562-1565.

14. Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф. Генетический анализ и разработка принципов прогнозирования злокачественных опухолей в семьях больных раком желудка и первично множественными новообразованиями.// Генетика. 1995, Т.31, №34, С.410-414.

15. Базов И.В., Аксенова М.Г., Казубская Т.П., Смирнов А.В., Забаровский Е.Р. Брага Э.А. Анализ аллельных потерь в области короткого плеча хромосомы 3 в карциномах почки, тела матки и яичников с помощью три- и тетра-мерных маркеров.//Молекулярная биология. 1997, №31,С. 805-809.

16. Kasubskaya Т.Р., Bazov I.V.,Braga Е.А., Pugacheva E.M., Ermilova V.D Garkavtseva R.F. Human chromosome 3p deletion mapping in carcinomas of kidney, lang and reproductive organs.// 17l International Cancer Congress. 1998, Brazil, A.600, P. 141.

17. Braga E, Pugacheva E, Bazov I, Ermilova V, Kazubskaya T, Garkavtseva R, Mazurenko N, Kisseljov F.,Liu J, Garkavtseva R, Zabarovsky E, Kisselev L. Comparative allelotyping of the short arm of human chromosome 3 in epithelial tumors of four different types.// FEBS Letters.1999 July 9; V.454, №3, P.215-219.

18. Амосенко Ф.А., Козлова B.M., Любченко Л.Н., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф. Мутации в протоонкогене RET у больных с медуллярным раком щитовидной железы и возможности доклинической диагностики и профилак-

тического лечения носителей этого заболевания.// Вестник онкологического научного центра им.Н.Н.Блохина РАМН. 2000, № 1, С.20-26.

19. Braga Е., Bazov, I., Senchenko V., Liu J, Loginov V., Ermilova V., Kazubs-kaya Т., Garkavtseva R. Common deletion regions on chromosome 3p in different types of cancer.// Abstracts of HUGO's Human Genome Meeting "HGM'99", Vancouver, Canada, April, 2000, P.75.

20. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Белев Н.Ф., Сельчук В.Ю. Генетика рака желудочно-кишечного тракта.// Современная онкология. 2001.T.3, №4. С.151-153.

21. Казубская Т.П., Мусатов В.К., Парфенова Д.Н., Михайловский A.B., Трубников В.И., Сельчук В.И., Гарькавцева Р.Ф. Результаты длительного активного наблюдения и клинико-генетический анализ пигментных невусов.// Вестник дерматологии и венерологии. 2001, №1, С.4-9.

22. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Любченко JI.H, Козлова В.М., Белев Н.Ф., Сельчук В.Ю. Наследственный рак: идентификация, генетическая гетерогенность, медико-генетическое консультирование.// Вестник РАМН.

2001, №9, С.27-33.

23. Амосенко Ф.А.,Фриллинг А.,Козлова В.М.,Любченко Л.Н., Казубская Т. П., Гарькавцева Р.Ф. Молекулярная диагностика множественной эндокринной неоплазии 2 типа.// Вестник Академии наук. 2001, №2,С.34-37.

24. Braga Е.,Bazov I.,Ermilova V., Kazubskaya Т., et al. Critical tumor-suppressor gene regions on chromosome 3p in major.// Int. J.Cancer.2002,V.100,P.534-41.

25. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Лиснянский И.Е. Генетические аспекты медуллярного рака щитовидной железы.// Проблемы эндокринологии. М.

2002, Т.48. №.4. С. 16-20.

26. Казубская Т.П., Мусатов В.К., Михайловский А., Сельчук В.Ю., Шабанов М.А., Трофимов Е.И. Меланома кожи: клинико-генетическая гетерогенность и принципы медико-генетического консультирования.// Российский онкологический журнал. 2003, №3, С.26-33.

27. Амосенко Ф.А., Бржезовский В.Ж., Любченко Л.Н., Шабанов М.А., Козлова В.М., Казубская Т.П., Ванушко В.Э. Анализ мутаций в прото-онко-гене RET у российских больных с медуллярным раком щитовидной железы.// Генетика. 2003, Т.29, №6. С.1-7.

28. Белев Н.Ф., Самотыя Е.Е., Халипли С.Д., Софрони М.Ф., Казубская Т.П., Гарькавцева Р. Ф. Сегрегационный и генетико-дисперсионный анализ предрасположенности к первично-множественным злокачественным новообразованиям.// Съезд онкологов республики Казахстан. Алма-Ата. 2003,С. 8-9.

29. Казубская Т.П., Козлова В.М., Мусатов В.К, Михайловский A.B., Шабанов М.А.,Трофимов Е.И., Сельчук В.Ю. Идентификация наследственных вариантов меланомы кожи.// Генетика. 2004, Т.40, №1, С. 1-9.

30. Senchenko V., Liu J, Loginov V, Bazov I. ,Ermilova V., Kazubskaya Т., Garkavtseva R, Braga E., ZabarovskyYu. Discovery of frequent homozygous deletions in chromosome 3p21.3 LUCA and AP20 regions in renal, lung and breast carcinomas.// Oncogene. 2004, V.23, №34, P.5719 -5728.

31. Логинов В.И.,Маликова A.B.,Серегин Ю.А., Ходырев Д.С, Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Киселев Л.Л, Брага Э.А. Метилирование промоторного региона гена RASSF1A кандидата в опухолевые супрессоры в первичных эпителиальных опухолях.// Молекулярная биология. 2004, Т.38, № 4, С.654-667.

32. Amosenko F., Kazubskaya T. Mutation analysis RET proto-oncogene in Russian patients with inherited medullary thyroid carcinoma.// 30th American Society of Preventive Oncology. 2006, Bethesda, USA, P. 37.

33. Корчагина Е.Л., Казубская Т.П., Сазонова М.А., Гарькавцева Р.Ф. Роль наследственной предрасположенности в возникновении рака толстой кишки. // Медицинская генетика. 2005., Т.4, №5, С.209-210.

34. Федорова O.E., Любченко Л.Н., Паяниди Ю.Г., Казубская Т.П., Амос-сенко Ф.А., Наседкина Т.В. Использование биочипов при изучении распространенных мутаций в генах BRCA 1/2 и СНЕК 2 у больных органоспецифичес-ким раком яичников и первично-множественными злокачественными новообразованиями с поражением яичников (российская популяция).//Молеку-лярная биология. 2007, Т.41, №1, С.37-42.

35. Казубская Т.П., Козлова В.М., Шишков Р.В., Поляков В.Г., Бржезовс-кий В.Ж., Амоссенко Ф.А., Гарькавцева Р.Ф. Синдром множественных эндокринных неоплазий типа 2А. Профилактическая тиреоидэктомия.// Детская онкология (Pediatric oncology). 2007, №2 , С.24-31.

36. Казубская Т.П., Белев Н.Ф, Нефедов М.Д., Паяниди Ю.Г., Сельчук В.Ю. Клинико-генетический анализ первично множественных злокачественных новообразований.// Российский онкологический журнал. 2007, №2, С.4-9.

37. Казубская Т.П, Амосенко Ф.А, Козлова В.М., Гарькавцева Р.Ф. Диагностика и профилактика медуллярного рака в семьях больных синдромом множественной эндокринной неоплазии тип 2.// Материалы XI Российского онкологического конгресса. Москва 2007. Издательская группа РОНЦ, С.179

38. Kazubskaya T., Shatalova Е., Loginov V., Sudomoina M., Blanchard P., Favorova O.O., Braga E.A. Genetic and epigenetic alterations associated with breast cancer risk in Russian women.// 19th International Congress on Anti Cancer Treatment. Paris, France. 2008, P.154, P.182.

39. Казубская Т.П., Козлова B.M., 5. Амосенко Ф.А., Шишков Р.В., Поляков В.Г., Бржезовский В.Ж., Любаев В.Л., Гарькавцева Р.Ф. Синдромы множественных эндокринных неоплазий и медуллярный рак щитовидной железы. // Российский онкологический журнал. 2008, №1, С. 4-9.

40. Логинов В.И., Базов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Районы потенциальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека.// Генетика. 2008, Т. 44, С.250-6

41. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Метилирование промоторной области гена RAR-beta2 в опухолях почки, молочной железы и яичников. //Генетика. 2008, Т. 44, С. 1126-1132.

42. Корчагина Е.Л., Белев Н.Ф., Казубская Т.П., Барсуков Ю.А.,Тимофеев Ю.М., Музаффарова Т.А., Карпухин A.B., Гарькавцева Р.Ф. Клинико-гене-

тические аспекты рака толстой кишки и идентификация его наследственных форм. // Колопроктология. 2008, Т.2, №24, С.9-14.

43. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Изменение уровня метилировния гена БЕМАЗВ в эпителиальных опухолях.// Мол. биология. 2009, Т.43, №3, С.436-445.

44. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Любченко Л.Н. Роль наследственных факторов в развитии злокачественных новообразований. // В справочнике практического врача «Онкология» под ред. чл-корр. РАМН, проф. И.В. Под-дубной, Москва 2009, издательство «МЕДпресс-информ», С. 18-30.

45. Брага Э.А., Логинов В.И., Пронина И.В., Ходырев Д.С. Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Забаровский Е.Р., Гарькавцева Р.Ф. От структурно-функциональных изменений в генах хромосомы 3 в эпителиальных опухолях к онко-маркерам.// II Российский симпозиум «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. 2009, Т.2, №1, С.79-80.

46. Казубская Т.П. Диагностика наследственной предрасположенности к па-иллярному и фолликулярному раку щитовидной железы.// Российский онкологический журнал. 2010, № 2, принята в печать.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность проф. д.м.н. Р.Ф.Гарькавцевой, проф. д.м.н. В.Ю.Сельчуку, за постоянный интерес к данным исследованиям, за обсуждение результатов диссертационной работы, критические замечания и большую помощь при подготовке рукописи.

Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Э.А. Браге, к.б.н. Ф.А. Амосенко, к.б.н. Т.А. Наседкиной., проф. Д.В. Залетаеву, проф. Н.Ф. Белеву, и всем коллегам, сотрудничество с которыми позволило осуществить эту работу.

Подписано в печать 17.02.10 Формат 60x84/16. Бумага офисная «SvetoCopy»■ Тираж 100 экз. Заказ №194 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Оглавление диссертации Казубская, Татьяна Павловна :: 2010 :: Москва

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Современные представления о генетике и генетической гетерогенности злокачественных новообразований (обзор литературы).

1.1 Генетика рака щитовидной железы (РЩЖ).

1.1.1 Генетика папиллярного и фолликулярного РЩЖ.

1.1.2 Генетика медуллярного рака щитовидной железы.

1.2 Генетика меланомы кожи.

1.3 Генетика первично-множественных злокачественных опухолей.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Общая характеристика больных и результатов генетико- эпидемиологического и клинико-генетического исследования.

2.2 Материалы и методы изучения рака щитовидной железы.

2.3 Материалы и методы изучения меланомы кожи.

2.4 Материалы и методы изучения первично-множественных злокачественных опухолей.

Глава 3. Генетические основы этиологической гетерогенности рака щитовидной железы.

3.1. Клинико-генетическое изучение папиллярного и фолликулярного рака щитовидной железы.

3.2 Клинико-генетическое изучение медуллярного рака щитовидной железы.

3.3 Наследственные формы медуллярного РЩЖ: клинико-генетические особенности, молекулярная диагностика и профилактическая тиреоид-эктомия.

3.4 Тактика медико-генетического консультирования на основе систематизации отбора лиц, предрасположенных к развитию МРЩЖ.

Глава 4. Клинико-генетические основы этиологической гетерогенности меланомы кожи, меланоцитарных и диспластических невусов (ДН).

4.1 Клинико-генеалогический и формально-генетический анализ меланомы кожи (МК).

4.2 Анализ особенностей клинического проявления меланомы кожи, степени участия меланоцитарных и диспластических невусов в развитии этого заболевания и поиск специфических опухолевых ассоциаций у больных мелано-мой кожи.

4.3 Идентификация наследственных синдромов среди больных МК.

4.4 Генетико-корреляционный анализ меланоцитарных и диспластических невусов.

4.5 Изучение клинических ассоциаций меланомы кожи и различных форм опухолей у членов их семей.

4.6 Изучение частоты повреждений некоторых участков хромосом в клетках крови больных меланомы кожи и диспластическими невусами.

4.7 Изучение молекулярно-генетических и эпигенетических изменений гена р16/СВКИ2А в опухолях больных МК.

4.8 Тактика медико-генетического консультирования на основе систематизации отбора лиц с высоким риском развития МК.

Глава 5. Генетические основы этиологической гетерогенности первично-множественных злокачественных опухолей (ПМЗО).

5.1 Клинико-генетический анализ семей больных ПМЗО.

5.2 Изучение клинических и генетических ассоциаций разных форм опухолей у больных ПМЗО и их родственников.

5.3 Идентификация наследственных синдромов у больных ПМЗО.

5.4 Использование технологии биологических микрочипов в диагностике терминальных мутаций генов ВЯСА1,2 и СНЕК2 у больных первично-множественным и солитарным раком яичников.

5.5 Изучение метилирования генов КАББЕЫ, ]М1ф2 и БЕМАЗВ у больных солитарным и первично-множественным раком молочной железы и яичников.

5.6 Тактика медико-генетического консультирования на основе систематизации отбора лиц с высоким риском развития первично-множественных злокачественных опухолей.

Введение диссертации по теме "Онкология", Казубская, Татьяна Павловна, автореферат

К настоящему времени роль генетических факторов (как первичных факторов риска в этиологии рака) стала бесспорной и теперь уже широко изучается при разных злокачественных новообразованиях. Интерес клиницистов к роли генетических факторов повышался с последовательными открытиями терминальных мутаций генов Rb, BRCA1/2, RET, ассоциированных с развитием ретинобластомы [81,164], рака молочной железы [79,295], синдромов множественных эндокринных неоплазий 2 типа (МЭН2)[268]. Интерес стал более интенсивным, когда выяснилось, что анализ клинической картины болезни, установление связи между клиническими проявлениями заболевания и лежащими в их основе молекулярными повреждениями, открывают возможности идентификации новых форм болезни и установления причин их возникновения, что может привести к более нацеленному изменению ракового контроля и таргетной терапии.

Проблема изучения рака осложняется тем, что дефект в одном гене может быть причиной развития только некоторых опухолей, как например ретинобластомы или медуллярного рака при синдромах множественных эндокринных неоплазий (МЭН2 типа), а для развития большинства злокачественных новообразований необходима аккумуляция генетических изменений, т.е. дополнительных соматических мутаций [150]. С генетической точки зрения главной особенностью неоплазий является клинический полиморфизм и генетическая гетерогенность, а для так называемых мультифакториальных злокачественных опухолей-существование их наследственных и ненаследственных форм без четких границ.

Проблема генетической гетерогенности наследственных форм опухолей занимает важное место, поскольку кажущееся фенотипически однородным, генетически гетерогенное заболевание, может включать в себя несколько клинически, генетически и биохимически самостоятельных форм [8]. Анализ клинической картины болезни (фенотипа) выявление взаимосвязи между генотипом и фенотипом, предоставляет возможность установить не толькие генетические изменения лежат в основе формирования предрасположенности к неоплазии, но и разработать стратегию формирования прицельно однородных групп риска, оптимизировать процедуру проведения ДНК-анализа. Особенности проявления злокачественных новообразований диктуют необходимость изучения возможного существования патогенетических вариантов злокачественных опухолей и уточнения типа их наследования. Разграничение в пределах одного и того же злокачественного заболевания ряда самостоятельных клинико-генетических вариантов, в настоящее время, рассматривается как важная научно-практическая задача. Своеобразие современного состояния генетики злокачественных опухолей заключается ещё и в том, что, несмотря на большое разнообразие накопленного фактического материала, вопрос их наследования в конкретных семьях остаётся полностью не решенным. Изучение этих особенностей проявления неоплазий и причин, которые их формируют, является одним из важнейших направлений в медицине вообще и клинической генетике в частности, и является основой успешной диагностики и медико-генетического консультирования больных и их семей.

Указанные особенности характерны и для рака щитовидной железы (РЩЖ), меланомы кожи (МК) и первично-множественных злокачественных опухолей (ПМЗО). Имеющиеся на сегодняшний день работы, посвященные гетерогенности этих форм опухолей, не имели системного подхода и ограничивались областью профессиональных интересов (молекулярно-генетическими изучениями отдельных нозологических форм неоплазий). Недостаточная изученность отдельных генетических вариантов указанных форм опухолей может привести к тому, что в рамках одной нозологической формы рака, могут рассматриваться заболевания с различной генетической природой, патогенетическими механизмами развития или мутация в одном гене может ассоциировать с несколькими патологическими формами [8].

Проблема своевременного выявления РЩЖ, МК, ПМЗО заключается не только в бессимптомном развитии новообразования, но и в отсутствии надежных маркеров, способствующих их раннему выявлению. Наряду с этим, первично-множественные опухоли представляет собой особую диагностическую проблему. Изучения прицельно направленные на выявление специфических признаков, которые могли бы у пациентов увеличивать риск проявления вторых первичных малигнизаций, являются актуальными с клинической и биологической точек зрения. Значение проблемы возрастает с неуклонным ростом заболеваемости и смертности от этих новообразований [17]. В этой связи особое значение приобретает идентификация наследственных форм РЩЖ, МК, ПМЗО, разработка стратегии преодоления генетической гетерогенности с использованием биологических параметров на клиническом, генетическом и молекулярном уровнях, которая позволит идентифицировать семьи со сходными клиническими признаками. При этом активное выявление даже относительно небольшого числа случаев злокачественных новообразований среди практически здоровых родственников из семей больных этими заболеваниями может рассматриваться как важная научно-практическая задача. И хотя, из-за генотипической неоднородности семейной выборки, оценка генетических параметров наследственных форм опухолей затруднена, решение этих вопросов имеет первостепенное значение для разработки программы клинико-гене-тической диагностики, профилактики (в том числе и пренатальной) и патогенетически ориентированной терапии. Все эти вопросы планировались и разработаны на модели рака щитовидной железы, меланомы кожи, первично-множественных злокачественных опухолях.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель работы: определить роль наследственных факторов в этиологии рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично-множественных злокачественных опухолей, выделить генетически детерминированные формы этих заболеваний, изучить их генетическую гетерогенность, разработать тактику медико-генетического консультирования при разных их вариантах. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить размах вариабельности клинико-генетического проявления рака щитовидной железы (РЩЖ) меланомы кожи (МК) и первично-множественных злокачественных опухолей (ПМЗО).

3. Изучить клинические, цитогенетические и молекулярно-генетические особенности РЩЖ, МК и ПМЗО.

3.1 Изучить частоту и спектр молекулярных изменений при медуллярном РЩЖ (МРЩЖ).

3.3 Изучить молекулярно-генетические и эпигенетические изменения гена р16/СОКЫ2А в образцах опухолей МК.

3.4 Оценить значимость биологических микрочипов в диагностике терминальных мутаций генов ВЯСА1,2 и СНЕК2 у больных первично-множественным раком с поражением яичников.

3.5 Изучить статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: ЛА58ПА, БЕМАЗВ, определить их значение в молекулярном патогенезе и диагностике солитарного и первично-множественного рака молочной железы и яичников.

4. Установить структуру и соотношение генетически детерминированных форм РЩЖ, МК и ПМЗО.

5. Разработать основные принципы медико-генетического консультирования семей РЩЖ, МК и ПМЗО.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые на основе комплексного клинико-генетического и молекулярно-биологического изучения больных раком щитовидной железы, меланомой кожи и первично-множественными злокачественными опухолями выявлены основные клинико-генетические особенности этих заболеваний. Расширены представления о генетической гетерогенности (аллельного или локусного происхождения) РЩЖ, МК, ПМЗО, определена структура и соотношение их генетически детерминированных форм, разработаны критерии для выделения генетически самостоятельных вариантов.

Показано, что молекулярной основой МЭН2 являются мутации в гене RET, установлена четкая ассоциация мутаций в этом гене с синдромами множественных эндокринных неоплазий 2 типа, определен спектр его мутаций, обнаружены новые мутации гена RET у российских больных, что позволяет расширить спектр мутаций, который можно рекомендовать для рутинного лабораторного анализа. Установлено, что причиной клинического полиморфизма медуллярного РЩЖ является разное положение точковой мутации в одном из цистеиновых кодонов гена RET, обнаруживая аллельную гетерогенность этого заболевания. Впервые в стране по результатам ДНК- диагностики медуллярного РЩЖ проведено профилактическое удаление щитовидной железы, внедрена в практику пренатальная диагностика этого заболевания.

Разработана комплексная программа выявления лиц предрасположенных, к развитию МРЩЖ, позволяющая не только уточнить индивидуальный генетический диагноз, дать более точный прогноз течения заболевания, но и осуществить своевременные лечебно-профилактические мероприятия, направленные на предотвращение развития этой опухоли.

Выявлено наличие характерных для МК и ДН генетических и эпигенетических нарушений. У индивидов с МК, МК+ДН и у лиц-носителей диспласти-ческих невусов в трех участках короткого плеча хромосомы 1-1р22,1р31, 1р32 наблюдается общность в индивидуальном распределении разрывов, отличающаяся от нормы с высокой достоверностью, что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью и является ранним событием в цепи изменений, предшествующих МК. Аномальное метилирование промоторного района гена CDKN2A является неслучайным изменением у больных МК и выявляется у всех больных ПМЗО с поражением МК.

Впервые проведено определение статуса метилирования СрО-островков генов ЯАББРЫ, ЯАЯр2 и БЕМАЗВ в опухолевых и нормальных тканях молочной железы, яичников больных первично-множественными опухолями, больных солитарным РМЖ и РЯ и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Показана высокая частота метилирования промоторных районов этих генов в тканях больных ПМЗО с поражением молочной железы и яичников и солитарных РМЖ и РЯ, с частотами от 30% до 90%. Впервые показано, что больные с аномальным метилированием генов ЯАББЕЫ, ВАЯ^2 могут иметь тенденцию к первично-множественному поражению РМЖ и РЯ. Выявлена достоверная положительная корреляция частоты метилирования генов ЕАЯр2 и БЕМАЗВ со стадией и степенью анаплазии РМЖ и РЯ. Показано, что аномальное метилирование промоторной области гена КАБЗПА можно обнаружить на доклинической стадии развития этих опухолей, что позволяет рекомендовать их в качестве молекулярных маркеров диагностики и прогноза этих заболеваний и свидетельствует о больших возможностях метилирования ДНК для разработок неинвазивной диагностики рака.

Заключение диссертационного исследования на тему "Генетические основы этиологической гетерогенности злокачественных новообразований"

219 ВЫВОДЫ

5. Структура генетической детерминации МК, включает: семейную форму (2,6%>); 2) синдром диспластических невусов (1,1%); 3) первично-множественную МК (2,6%); 4) первично-множественные злокачественные опухоли с включением МК (4,1%); 5) МК в составе наследственных синдромов (3,9%).

Риск развития МК для лиц с большим количеством меланоцитарных, атипичных и ДН значительно повышается при наличии в семье МК. В семьях больных МК и лиц - носителей множественных и ДН выявлена косегрегация опухоли мозга, МК, рака кожи. Оценки генетических корреляций между ДН-МК, ДН-опухолью мозга, показали высокое генетическое сходство, подтверждая, что опухоли нервной системы и МК могут независимо накапливаться в этих семьях.

7. Гемизиготность по различному набору используемых маркеров (D9S157, D9S161, D9S171, D9S169, D9S301) в районе локализации гена pló/CDKN2A наблюдается у 24% больных МК. Аномальное метилирование промоторной области гена CDKN2A выявляется у 24,3%, однако инактивация этого участка ДНК гена CDKN2A в результате метилирования выявляется у всех больных с первично множественными неоплазиями, включающими МК.

9. Частота терминальных мутаций в генах BRCA1 больных ПМЗО с поражением яичников составляет 52,63%, тогда как у больных одним РЯ - 10,3% (р<0,01). У больных ПМЗО - носителей терминальной мутации в гене BRCA1, синдромы «семейного рака» выявлены в 55%. Обнаружено, что локализация неоплазий у родственников больных ПМЗО - носителей мутаций в гене BRCA1, различается в зависимости от типа мутаций: в семьях, ассоциированных с мутацией 5382insC, родственники поражались раком женских репродуктивных органов, предстательной железы и МК; в семьях носителей мутации 300T>G, рак толстой кишки и желудка у членов семей встречался чаще, чем при других типах мутаций, а при мутациях 4153delA и 185delAG родственники чаще поражались раком той же самой анатомической локализации и/или РМЖ.

10. Исследованный статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, RARf32 и SEMA 3В в опухолях молочной железы и яичников показал, что аномальное метилирование промоторных районов этих генов выявляется в опухолях молочной железы, соответственно, в: 78%, 46% и 35%; в опухолях яичников: 73%,30%) и 50%, тогда как, при наличии у больных ПМЗО аномальное метилирование CpG островка гена RASSF1A выявлялось практически во всех случаях РМЖ и РЯ, а гена RARf32-во всех случаях РЯ. Выявлена корреляция частоты метилирования промоторных райнов генов RAR/32 и SEMA3B с клинической стадией и степенью анаплазии опухоли. Показано, что метилирование промоторных районов генов RASSF1A, RAR/32, SEMA3B может использоваться в качестве маркеров в комплексной диагностике и прогнозе этих заболеваний, что дает возможность разработки неинва-зивной диагностики рака.

11. Разработан алгоритм медико-генетического консультирования при РЩЖ, МК и ПМЗО, включающий оценку семейной отягощенности (выявление и регистрацию семей с отягощенным семейным анамнезом), уточнение генетического диагноза (в том числе ДНК-диагностику), формирование групп риска и их мониторинг.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенное исследование посвящено одной из сложных проблем в клинической онкологии: изучению генетической обусловленности, гетерогенности и клинического полиморфизма рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично-множественных злокачественных опухолей.

Раннее выявление РЩЖ, клинико-генетическая идентификация его наследственных вариантов, разработка методов выявления аналогичного заболевания среди родственников больных РЩЖ и тактика лечения бессимптомных носителей патологических мутаций гена/ов, ответственных за развитие РЩЖ, является важной задачей онкологии и генетики. Хотя папиллярный и фолликулярный (немедуллярный) РЩЖ (НМР1ЦЖ) является наиболее частой формой рака этой локализации, о его наследственном эквиваленте известно очень мало [186,188].

При анализе установлены различия в проявлении этого заболевания в зависимости от пола (соотношение мужчин и женщин -1:5), что указывает на существование различных величин риска развития НМРЩЖ для мужчин и женщин. Возраст диагностики заболевания в среднем составляет 47,7 ±1,61 года, у 78% больных первые признаки заболевания проявляются в среднем на 6 -7 лет раньше. У больных с НМРЩЖ обнаружено сочетанное поражение разных органов, частота первично-множественных неоплазий составила 5,7%, что выше частоты в популяции (0,003%) (р<0,01). Анализ показал наличие семейного накопления разных неоплазий, частота которых составила 4% и 3,2% доброкачественных опухолевых и неопухолевых заболеваний щитовидной железы.

При изучении семейных случаев НМРЩЖ впервые установлен наследственный синдром семейного папиллярного РЩЖ. Признаками которого, являются преимущественно мультифокальное и двустороннее поражение папиллярным раком только ткани щитовидной железы у трех и более членов семьи. Возраст диагностики ПРЩЖ оказался много моложе общей выборки больных НМРЩЖ, составив 34,1± 6,8 года (р<0,05) в целом, показывая более тяжелый фенотип и аутосомно-доминантный тип (родители-дети) наследования заболевания.

Полученные данные согласуются с литературными, где семейный ПРЩЖ также выделен как синдром семейного ПРЩЖ, выраженный двумя клиническими формами. Первая, включает поражение папиллярным раком только ткани щитовидной железы, а вторая - помимо ПРЩЖ, включает папиллярный рак почки [183,184].

В результате исследования выявлены наследственно обусловленные синдромы, компонентом которых является папиллярный и фолликулярный РЩЖ. Эти синдромы характеризуются двумя клинико-генетическими вариантами. Первый, ассоциирован с множественными типами опухолей, возникающих в тканях разных органов и наследуемые по аутосомно-доминантному типу. Это синдромы -Гарднера, Каудена и МЭН1, которые в анализируемой выборке больных идентифицированы в 3,6% случаев. Второй - синдром семейного ПРЩЖ, при котором преобладающим и постоянным признаком является папиллярный РЩЖ, обнаружен в 1,4% случаев.

Важной проблемой является выявление С-клеточной гиперплазии или медуллярного РЩЖ (МРЩЖ) на ранней стадии заболевания. В этой связи, достижения в молекулярной биологии, позволили не только понять причины развития медуллярного рака, но и реально подойти к решению вопроса ранней диагностики и профилактики этой формы РЩЖ.

Проведенный анализ 68 семей больных МРЩЖ выявил генетически детерминированный МРЩЖ в 24,9% случаев, которые имели разные формы проявления, такие как МЭН2А, МЭН2Б, синдром сесейного МРЩЖ и медуллярный РЩЖ как компонент нейрофиброматоза 1 типа. Исходя из важного наблюдения, что ген RET экспрессируется только в определенных тканях нейроэндокринной дифференцировки, включая парафолликулярные С-клетки щитовидной железы, экстра и интраадреналовые хромафинные клетки надпочечников, периферические нервы, описываемые случаи совместного поражения этими редкими формами заболеваний как нейрофиброматоз и МРЩЖ предполагают возможность существования общего биологического механизма, ответственного за их развитие. Частота спорадического МРЩЖ составила 75,1%, среди которого могут быть случаи, обусловленные мутацией "de novo" в половых клетках одного из родителей.

При изучении семей с синдромами МЭН 2 типа установлен широкий спектр клинического проявления МРЩЖ, высокая вариабельность риска развития неоплазии у родственников. Для синдрома МЭН2А характерно билатеральное развитие феохромоцитом у больных и их родственников, которые являлись частой причиной внезапной смерти. Наличие феохромоцитомы установлено в 50% семей, у одного из больных, помимо МРЩЖ и феохро-моциомы, был обнаружен третий первичный рак молочной железы. Выявлена ассоциация МРЩЖ с аномалией почек, которая была обнаружена у носительницы мутации гена RET.

Анализ семей с синдромом МЭН2Б показал, что 90% больных является результатом мутации de novo. МРЩЖ при этом синдроме возникает гораздо раньше (как правило, до 5 летнего возраста) и протекает более агрессивно. Для синдрома семейного МРЩЖ характерно поражение родственников сайт-специфическим медуллярным раком при отсутствии клинических или биохимических признаков поражения паращитовидных желез или надпочечников.

Изучение исходного и стимулированного уровня кальцитонина - как диагностического маркера показало, что этот тест не всегда является абсолютным критерием. У пациентки 3,5 лет из семьи с МЭН2А наблюдаемый уровень кальцитонина был выше нормы почти в 2,5 раза (76,8 пг\мл), однако при гистологическом исследовании признаков МРЩЖ обнаружено не было. Неоспоримая ценность этого метода в возможности оценить полноту хиРургического лечения.

Впервые в России проведен скрининг терминальных мутаций в гене RET в семьях больных с МЭН2. В результате установлена четкая ассоциация мутаций в этом гене с МЭН2 синдромами. В семьях с МЭН2А идентифицированы 2 специфические мутаций в кодоне 634 гена RET, в семьях с МЭН2Б выявлена одна и та же мутация в ко доне 918 гена RET. При синдроме семейного МРЩЖ обнаружена мутация в кодоне 620 гена RET. Характерные для этих синдромов межиндивидуальная изменчивость, как по возрасту начала заболевания, так и по тяжести его проявления (даже в пределах одного подтипа) могут быть обусловлены не только варьирующей экспрессивностью и пенет-рантностью гена RET, но и положением точковой мутации в одном из цисте-иновых кодонов этого гена. Молекулярная ДНК-диагностика гена RET, стала реальным подтверждением выявленных наследственных форм МРЩЖ.

Наличие аллельной гетерогенности находит свое отражение в выявленной фенотип-генотип корреляции заболевания. У больных с МЭН2А мутация в кодоне 634 ассоциируется с феохромоцитомой и гиперпаратиреозом и до сих пор, не была обнаружена ни в одной из семей с синдромом семейного МРЩЖ, что позволяет рассматривать ее в качестве маркера при прогнозировании риска развития этих заболеваний у бессимптомных носителей этой мутации. Терминальные мутации в кодоне 918 характерны исключительно для МЭН2Б и связаны с пороками развития. Подобные данные есть и в мировой литературе [9,30,66,120].

Прямое тестирование гена RET среди родственников больных МЭН2А обнаружило 8 бессимптомных носителей терминальных мутаций этого гена в возрасте от 3,5 до 42 лет. Первый российский опыт профилактического хирургического лечения выполнен у 6 из них. У 2-х из них, самых юных пациентов - 3,5-й и 9 лет, операция была профилактической, у остальных обнаружены очаги С-клеточной гиперплазии и медуллярный рак. Эти данные показали, что носители мутаций могут быть подвергнуты тиреоидэктомии до появления МРЩЖ. Послеоперационное наблюдение от 1,5 до 8 лет (в среднем 4,8 года) показало, что тиреоидэктомия, проведенная на доклиническом уровне, позволяет избежать метастазирования и имеет более благоприятный исход заболевания. Раннее выявление заболевание на основе ДНК-тестирования может изменить течение МРЩЖ.

Исходя из приобретенного опыта, пациентам с мутацией в кодоне 634, мы рекомендуем проводить тиреоидэктомию независимо от уровня кальцитони-на. Выявленная взаимосвязь генотипа и фенотипа у носителей этих мутаций может способствовать планированию тиреоидэктомии, принятию решения относительно объема и времени проведения профилактической тиреоидэктомии, разработке терапевтических подходов по отношению к пациентам-носителям мутаций. Комбинированный с молекулярными технологиями подход к клинической, биохимической диагностике и ведению пациентов из семей с МЭН2А может стать основным в уменьшение летальности от МРЩЖ.

Первый опыт дородовой диагностики синдрома МЭН2 в нашей стране проведен в семьях с МЭН2А и синдромом семейного МРЩЖ, который показал, что применение ЛЕГ-анализа дает возможность диагностировать (или исключить) наследственную форму МРЩЖ, подготовить родителей к рождению больного ребенка или предотвратить рождение такового.

Проведенный поиск соматических мутаций в гене RET у больных спорадическим МРЩЖ позволил идентифицировать мутации в 28,6%. Выявлено 6 типов соматических мутаций, три из которых - гетерозиготные мутации в ко-донах 639, 641 и 922 оказались неизвестными ранее. Это дает новые сведения по молекулярной генетике синдромов МЭН2 и позволяет расширить спектр мутаций, который можно рекомендовать для рутинного лабораторного анализа. При изучении мутаций гена ЛЕГ в образцах крови 13 больных со спорадическим МРЩЖ, обнаружена терминальная мутация "de novo" тем самым показана необходимость ДНК-тестирования спорадических форм МРЩЖ

Созданы предпосылки для формирования банка генетической информации клинически верифицированных больных с МЭН2 в России.

На основе полученных в ходе исследования данных, высокий риск развития гиперпаратироза и феохромоцитомы в семьях с синдромом МЭН2А предполагает необходимость включения в скринирующие программы диагностику этих заболеваний. Выявление мутации в кодоне 918 гена ЛЁГ свидетельствует о самом агрессивном типе синдромов - МЭН2Б и возможности раннего метастазирования заболевания и соответственно планирования возраста тиреоидэктомии, выбор которого проводится индивидуально. Синдром семейного МРЩЖ протекает менее тяжело и возникает в более позднем возрасте. ДНК-диагностику в семьях с МЭН2 следует проводить основываясь на вариантах этого синдрома и в соответствии с характеристиками мутаций гена RET.

Что касается меланомы кожи (МК), то генетическая детерминация этого заболевания в определенной степени может определяться частотой поражения членов семьи. Изучено 460 больных МК, оценка семейной частоты этого заболевания (2,62±0,42%) в 4 раза превысила таковую "накопленную" заболеваемость (0,66%) в популяции, свидетельствуя о неслучайной сегрегации МК в семьях этих больных.

Частота появление первично-множественных очагов МК- 0,22 во много раз выше аналогичной частоты несемейных форм (0,02) (р<0,01 при %2=28,067). В 17% случаев ПММК развилась на фоне атипичных и ДН, против 2,6% для общей выборки больных. Эти данные соответствуют литературным [80]. Частота накопления ДН у родственников больных с семейными формами (0,86), достоверно выше таковых, без семейных накоплений МК (0,41) (р<0,05 при X2 =3,87), а наличие меланоцитарных и ДН оказалось типичным, как для больных МК, так для здоровых родственников из семей с накоплениями МК.

Изучена степень внутриклассовой корреляции фенотипического сходства по возрасту начала заболевания семейных форм МК. Полученные значения коэффициентов корреляции для пар: пробанды-родители 0,418, пробанды-дети 0,742, пробанды-сибсы 0,068 не показали достоверных различий по методу подтверждая гипотезу доминантного наследования семейных случаев МК. Следовательно, характерные для семейных форм МК такие признаки как, сегрегация этого заболевания, появление первично-множественных очагов опухоли, наличие ДН и атипичных меланоцитарных невусов, могут быть использованы в диагностике наследственных вариантов этого заболевания.

Свидетельством гетерогенности МК в пределах категории наследственных меланом стали выявленные в 3,9% случаев моногенно наследуемые синдромы, компонентом которых явилась МК. Одни из них, характеризуются развитием опухолей разных локализаций, такие как синдром «семейного рака» (синдрома Линча II), синдром Li-Fraumeni. Другие, включают нейрокожные нарушения, так называемые нейрокристопатии, такие как нейрокожный меланоз, синдром базальноклеточного невуса, Реклингхаузена, Гарднера, изучение которых, даёт основание для предположения о существовании общей патогенетической основы семейной предрасположенности к меланоме, поражению нервной системы и дериватов кожи. Подобные сведения имеются и в данных литературы [84,198, 228]. К нейрокристопатиям относится и синдром диспластических невусов [198], который установлен в 1,9% от общей выборки больных МК.

Лица-носители множественных меланоцитарных и атипичных невусов имеют повышенный, хотя и разный риск развития МК, как в семейных, так и спорадических случаях. Однако для носителей множественных и атипичных меланоцитарных невусов риск развития МК значительно повышается при наличии в семье родственника пораженного МК. Об этом свидетельствует 0,8% обнаруженных нами новых случаев МК среди близких родственников больных МК, что в 3 раза превысило популяционную частоту этого заболевания (0,34%).

Анализ полученных данных показал, что ДН не всегда несут злокачественный потенциал и, по-видимому, существует ряд изменений в меланоцитарных невусах, часть из которых на определенной биологической стадии меланоцитарных повреждений способна трансформироваться в меланому и это является причиной того, что клинические и морфологические признаки атипичных (диспластических) невусов не всегда совпадают. Активный метод выявления МК у лиц с большим количеством меланоцитарных невусов является предпочтительным.

Частота поражения разными неоплазиями членов семей больных МК составила 14%, превысив аналогичную частоту в популяции - 4,0% (р<0,01/ Чтобы уяснить наличие или отсутствие закономерностей в развитии тех или иных форм опухолей, поражающих родственников больных МК, проведен анализ частоты разных неоплазий встречающихся в семьях: больных МК, лиц-носителей множественных невусов, больных раком желудка и здоровых лиц контрольной группы. Родственники больных МК наиболее часто поражаются: МК (р<0,01), саркомами (р<0,01), лейкозом (р<0,01), раком кожи (р<0,05), опухолями мозга (р<0,05), раком почки (р<0,05), легкого (р<0,05). Родственники лиц-носителей множественных пигментных невусов наиболее часто поражаются меланомрй кожи (р<0,01), опухолью мозга (р<0,01), раком кожи (р<0,01). Показано, что опухоли, которыми поражаются родственники из семей больных МК и лиц-носителей множественных невусов имеют тенденцию к косегрегации меланомы кожи, опухоли мозга и рака кожи, статистически достоверно отличаясь от таковых, накапливающихся не только в семьях больных раком желудка, но и среди родственников здоровых лиц контрольной группы. Подобного рода данные, указывающие на повышенную частоту опухолей нервной системы в семьях больных МК, были представлены и в других работах [198]. Однотипность данных, полученных в разных популяциях, дает основание думать о непредвзятости полученных данных.

Выявленная закономерность подтверждена посредством расчета оценок корреляций между установленными формами опухолей на основе частоты этих заболеваний: у родственников носителей меланоцитарных невусов, в популяции и лиц контрольной группы. Оценки генетических корреляций: ДН-МК - 87%, ДН - опухоль мозга - 81% показали существование высокого генетического сходства между ДН, МК и опухолью мозга.

Установленную в ходе исследования связь между опухолевой и предопу-холевой патологией у родственников из семей больных МК и у членов семей лиц с множественными невусами, можно рассматривать как фактор, формирующий повышенный риск развития вышеуказанных заболеваний. Возможность поражения этими формами рака должна учитываться при определении риска в семьях больных МК и лиц с множественными невусами.

Цитогенетическое изучение участков повышенной ломкости хромосом установило, что наиболее высокая частота спонтанных аберраций наблюдается у больных с ДН. Средний процент аберрантных метафаз в группе «ДН» составил 6,69±0,8, в группе «меланома+ДН» - 6,79 ±0,7, по сравнению с 2,43±0,6 у здоровых индивидов (Р<0,01). У 6 из 8 обследованных больных МК идентифицирован синдром ДН и для каждого из них зафиксирован повышенный уровень спонтанных аберраций. Полученные данные позволяют рассматривать синдром ДН как заболевание с хромосомной нестабильностью, что соответствуют современным представлениям об этом синдроме.

Обнаружено, что у индивидов с МК, ДН и МК+ДН, в трех участках короткого плеча хромосомы 1 -1р22,1рЗ 1,1р32 наблюдается общность в индивидуальном распределении разрывов и отличается от нормы с высокой достоверностью, что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью. Поскольку эти изменения присутствуют у пациентов с ДН, локальная хромосомная нестабильность относится к ранним событиям, предшествующим развитию МК.

Анализ потери гетерозиготности в районе локализации гена р!6/СПКМ2А по микросателлитным маркерам (098157, 098161,098171,098169, 098301) у 37 больных МК показал, что в 24% случаев больных МК наблюдается геми-зиготность по различному набору используемых маркеров.

Изучение аномального метилирования промоторного района гена СЭКЫ2А показало, что метилирование этой области ДНК гена СИКМ2А определяется в 24,3% образцов МК. Причем гиперметилирование промоторного района гена СБКМ2А выявлено у всех больных с первично множественными неопла-зиями, включающими МК. Полученные данные позволяют предположить, что больные МК с аномальным метилированим гена СОКЫ2А, имеют тенденцию к развитию множественной малигнизации, включающую МК.

Структуру генетически детерминированных форм включает: 1) семейные формы заболевания (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%); 3) первично-множественная МК (2,6%); 4) первично-множественные злокачественные опухоли в сочетании с МК (4,1%); 5) МК в составе наследственных синдромов (3,9%).

Как показали наши исследования, семейный анамнез позволяет установить, является ли МК изолированной патологией, одним из проявлений опухолевых поражений в семейном кластере или является интегральной частью опухолевого спектра наследственных синдромов, ассоциируясь с другими опухолями. Полученные в ходе исследования данные явились основой для формирования групп риска среди семей больных МК, индивидуального прогнозирования развития заболевания для родственников больного в зависимости от формы МК и конкретной семейной ситуации. Показанием для включения пациента в группу риска является: 1) наличие МК у членов семьи (риск повышается при наличие более одного родственника больного МК); 2) наличие в семье первично множественной МК или ПМЗО включающую МК 3) наличие в семье множественных невусов и опухоли мозга или немеланом-ного рака кожи; 4) наличие в семье ДН и МК; 5) наличие большого количества меланоцитарных невусов и/или атипичных невусов у члена семьи; 6) наличие в семье моногенно наследуемого синдрома, компонентом которого может быть МК.

Другими изученными локализациями явились первично-множественные злокачественные опухоли, включавшими оценку клинических, эпидемиологических и молекулярных особенностей 400 больных с синхронным и метах-ронным ПМЗО. Проведенный анализ создал основу для выделения разных вариантов патологии и показал существование косегрегации отдельных форм опухолей в семьях таких больных. Установлено, что риск развития этих заболеваний тесно коррелирует с семейным анамнезом заболевания. Частота ПМЗО среди родственников (0,8%), во много раз превышает аналогичную частоту в популяции г. Москвы (0,008%). Частота поражения разными нео-плазиямии членов семей больных ПМЗО (26,9±1,8 %) также превысила аналогичную частоту (4,0±0,03%) в популяции (Р<0,001). Сравнение частоты поражения неоплазиями родственников больных ПМЗО с таковой у больных солитарным раком контрольных групп (больных раком желудка, молочной железы и меланомы кожи) показал не только более тяжелый фенотип заболевания при ПМЗО, но и то, что члены семей этих больных являются предметом высокого онкологического риска.

Выявлена тенденция к предпочтительному поражению идентичных органов в семьях больных с первично-множественным поражением раком толстой кишки. Частота накопления однотипных опухолей в семьях больных с первично-множественным раком толстой кишки (5,8±0,6%) выше, чем аналогичный показатель в семьях больных с солитарным раком толстой кишки (3,0±0,2%) (Р<0,001), следовательно для членов семей больных с ПМЗО с поражением толстой кишки риск развития рака этой локализации повышен, у Обнаружено, что у больных раком толстой частота развития первично-множественного рака толстой кишки выше, чем у больных раком прямой кишки. Пропорция поражения множественной малигнизацией толстой кишки у мужчин больных раком толстой кишки (2,4±1,6%), по отношению к таковой у мужчин больных раком прямой кишки (0,8±1,8%), составила 3:1 (Р<0,001). У женщин больных раком толстой кишки и раком прямой кишки, таких различий не выявлено. Отсутствие этих различий у женщин исключает возможность артефакта из-за вероятности включения в анализ синдрома ННКРР. Исходя из полученных данных, больных с первично-множественным раком толстой кишки и раком прямой кишки следует рассматривать как две отдельные, биологически более гомогенные группы.

В семьях больных ПМЗО выявлена тенденция к совместному развитию некоторых видов рака. Из группы женщин больных ПМЗО с поражением молочной железы, при первом первичном РМЖ, вторая первичная опухоль чаще всего поражает: толстую кишку -25%, эндометрий - 5,8%, яичники -5,8%), шейку матки -4,5%, молочную железу -2,7%, желудок -11%, и др. Если развитие единственного РМЖ в значительной степени обусловлено влиянием окружающих факторов риска, то у пациенток пораженных дополнительными первичными опухолями, влияние генетических факторов могут быть доминирующими. Подтверждением этому является то, что 16% родственников из семей этих пациенток, также были поражены различными опухолями, частота которых превышала таковую в популяции (4,2%) (р<0,05). Изучение совместных локализаций полинеоплазий среди 543 женщин с ПМЗО, у половины которых, одной из первичных опухолей был рак яичников, а у другой -рак эндометрия, выявило, что в обеих группах, сочетание поражения раком: яичников, эндометрия, молочной железы и органов желудочно-кишечного тракта, имеет устойчивую ассоциацию.

Оценки генетических корреляций в семьях больных ПМЗО между: раком эндометрия и раком толстой кишки (0,9±0,2), РМЖ и раком толстой кишки (0,7±0,3), раком желудка и РМЖ (0,8±0,6), оказались достаточно высокими. Хотя каждая из указанных форм опухолей, имеет характерные именно для нее системы детерминации, доля общих генов подверженности свидетельствует о наличии генетической общности развития этих заболеваний и выраженности связей определенных форм опухолей в семьях больных ПМЗО. Аналогичные данные были получены при изучении женщин больных первично-множественным РМЖ, собранных из 13 популяционных регистров разных стран [192]. Эти наблюдения представляют интерес, поскольку, если у больного одна из первичных опухолей соответствует указанным выше, то можно ожидать в отдельно взятых семьях аналогичные солитарные опухоли у родственников.

Общность генетических механизмов подверженности к проявлению указанных форм опухолей подтверждает наличие генетической гетерогенности между «спорадическими» формами рака женских репродуктивных органов, желудка и толстой кишки и ПМЗО, компонентом которых они являются.

Моногенно наследуемые синдромы в семьях больных ПМЗО встречаются значительно чаще (17,3%), по сравнению с таковыми, установленными при равных условиях в семьях 460 больных МК (3,9%) и семьях 950 больных раком желудка (2,1%) (р<0,01). Возраст диагностики первого первичного рака у больных с синдромами оказался более ранним (43,6±1,6 года), по сравнению с таковым в общей группе больных ПМЗО (49,8±0,9 года) (р<0,01).

Определение частоты наиболее распространенных терминальных мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2, с использованием технологии олигонуклео-тидных биочипов у 20 больных ПМЗО с поражением яичников и 68 больных одним РЯ показало, что терминальные мутации в гене ВЯСА1 выявляются в 52,63% больных ПМЗО и только у 10,3% больных солитарным РЯ (р<0,01). Наличие у пациентки ПМЗО с поражением яичников увеличивает вероятность обнаружения в семье мутации в гене ВЯСА1. Синдромы «семейного рака» идентифицированы у 55% больных ПМЗО - носителей терминальной мутации в гене BRCA1. У больных одним РЯ выявлено два типа мутаций: 185delAG (1,47%) и 5382insC (8,82%). У больных ПМЗО с поражением яичников выявлены 4 типа мутаций гена BRCA1: 5382insC, 300T>G, 185delAG, 4153delA. Анализ выявленных генотипов позволил установить, что локализация неоплазий у родственников больных ПМЗО - носителей мутаций в гене BRCAJ, различается в зависимости от типа мутаций. В семьях ассоциированных с мутацией 5382insC, родственники поражались раком женских репродуктивных органов, предстательной железы и МК, в семьях носителей мутации 300T>G, рак толстой кишки и желудка у членов семей встречался чаще, чем при других типах мутаций. При мутациях 4153delA и 185delAG, родственники наиболее часто поражались раком той же самой анатомической локализации и/или РМЖ. Подобного рода данные получены в других исследованиях [72,275]. В анализируемых группах мутации в гене BRCA2 выявлены у больных с билатеральным РМЖ, мутаций в гене СНЕК2 не обнаружено.

Исследован статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, RAR/32 и SEMA3B в представительной выборке, включавших 330 образцов РМЖ и РЯ. Выявлена высокая частота аномального метилирования CpG-островка генов RASSF1A, RAR/32 и SEMA3B в опухолях молочной железы: 78% (32/41), 46% (26/56), 35% (22/65), в опухолях яичников: 73% (33/45), 30% (15/50), 50% (25/51), соответственно. Впервые обнаружено, что у больных ПМЗО метилирование ДНК из образцов ткани рака молочной железы, принадлежащих CpG островкам генов RASSF1A, RAR/32 выявлялось с высокой частотой, в 90% случаев (11/12) и (4/5), соответственно. При наличии у больных ПМЗО с поражением яичников аномальное метилирование CpG островка гена RASSF1A выявлялось в 67% (8/12), а гена RAR/32 практически во всех случаях 90% (4/5).

Показано, что аномальное метилирование промоторной области гена RASSF1A можно обнаружить на доклинической стадии развития этих опухолей. В морфологически неизмененной ткани уровень метилирования для гена RASSF1A составил 14% (РМЖ) и 5% (РЯ). Отсутствие метилирования этих участков ДНК в крови здоровых доноров (0/15), что позволяет считать метилирование этого гена ранним молекулярным маркером злокачественной трансформации РМЖ и РЯ. Выявлена корреляция частоты метилирования промоторных районов генов RARß2, SEMA3B с клинической стадией и степенью анаплазии РМЖ и РЯ.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Казубская, Татьяна Павловна

1. Бабаянц P.C., Лоншаков ГО.И.// Расстройства пигментации кожи.- М.-1978.-143С.

2. Белев Н.Ф., Самотыя Е.Е., Пикхут П.М., Кудина E.H., Трубников В.И., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф. Сегрегационнй и генетико-дисперсион-ный анализ предрасположенности к аденомам и раку толстой кишки.// Генетика. 1999, Т.35, №4, С.524-529.

3. Бочков Н.П. Клиническая генетика 2001г. Москва. ГЭОТАР-Мед, 447С.

4. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. 2004.От идентификации геномных полиморфизмов к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей человека.//Молекуляр. Биология. 2004, Т.38, С.179-190.

5. Гарькавцева Р.Ф., Ситникова Т.С., Казубская Т.П. и др. Клинико-генети-ческие аспекты меланомы кожи.1. Распространенность, семейное изучение, генетическая гетерогенность.// Генетика. 1995, Т.31, №11, С. 15571561.

6. Гарькавцева Р,Ф, Нефедов М.Д., Летягин В.П., Самгина A.A. Наследственные аспекты и гетерогенность рака молочной железы.//Советская медицина. 1987, №9, С. 92-96.

7. Гинтер Е.К. Медицинская генетика. М., Медицина, 2001,528С.

8. Ильин Ф.Ф.,Румянцев П.О.,Медведев В. С соав.//Проблемы эндокринологии. 2003, №5, С. 45-48.

9. Имянитов E.H., Хансон К.П. //Молекулярная онкология: клинические аспекты.//Санкт-Петербург. 2007, 211С.

10. Казубская Т.П., Козлова В.М., Мусатов В.К. с соав. Идентификация наследственных вариантов меланомы кожи // Генетика. 2004, Т.40, №1,1. С.88-95.

11. Корчагина, Е.Л., Белев Н.Ф., Казубская Т.П., с соав. Клинико-генети-ческие аспекты рака толстой кишки и идентификация его наследственных форм // Колопроктология. 2008, №2, С. 19-24.

12. Логинов В, Базов И., Ходырев Д., Пронина М.Казубская Т., с соав. Районы потенциальных генов-супресеоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека. //Генетика. Т.44, С.209-214.

13. Нефедов М.Д., Гарькавцева Р.Ф., Трубников В.И. Генетика рака молочной железы. Генетико-дисперсионный анализ и генетическая гетерогенность.// Генетика. 1988, Т.24, №8, С. 1456-1461.

14. Ситникова Т.С. Медико-генетические аспекты меланомы кожи.// Автореферат диссертации кан. мед.наук. М. Москва. 1988,С.25.

15. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2006 г. под ред. М.И.Давыдова,Е.М.Аксель» Вестник РОНЦ им.Н.Н.Бло-хинаРАМН. 2008, Т. 19, приложение 1.

16. Трубников В.И. Корреляции между родственниками из серии: генетико-математические методы, алгоритмы и программы // Методические разработки. Москва, 1998, - 28С.

17. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., КазубскаяТ.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Метилирование промоторной области гена RAR-beta2 в опухолях почки, молочной железы, яичников// Генетика человека. 2008, Т.44, №8, С. 1-7.

18. Эндокринология под редакцией Н.Лавина, изд. «Практика».- г. Москва.-1999 г.- 1128 С.

19. Шимке Р. Генетика и рак человека. Москва, 1981,183 С.

20. Aarnio М, Sankila R, Pukkala Е, et al: Cancer risk in mutation carriers of DNA-mismatch-repair genes.// Int J Cancer 1999, V.81, P.214-218.

21. Angeloni D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes in disease // Brief. Funct. Genomic Prote-omic. 2007,V.6, №1,P. 19-39.

22. Annessi G, Cattaruzza MS, Abeni D et al. Correlation between clinical atypia and histologic dysplasia in acquired melanocytic nevi.//J Am Acad Dermatol. 1994,V.102, P.695-699.

23. Arighi E, Borrello MG, Sariola H. RET tyrosine kinase signaling in development and cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2005, V.16 №4-5, P.441-467.

24. Asai N, Iwashita T, Matsuyama M, Takahashi M. Mechanism of activation of the ret proto-oncogene by multiple endocrine neoplasia 2A mutations.//Mol Cell Biol.1995, V.15, №3, P.1613-1619.

25. Bale SJ, Dracopoli NC, Tucker MA, Clark WH, Fraser MC, et al. Mapping the gene for hereditary cutaneous malignant melanoma-dysplastic nevus to chromosome lp //N Engl J Med. 1989, V.320.1367-1372.

26. Ball D.W, Baylin S.B., DeBustos A.CV/Werner&Ingbar's the Thyroid: a Fundamental and Clinical Text. Philadelphia. 2000, P.930-943.

27. Ball DW. Medullary thyroid cancer, therapeutic targets and molecular markers.// Curr Opin Oncol. 2007, V.19, №1, P. 18-23.

28. Bataille V, Bishop JA, Sasieni P et al. Risk of cutaneous melanoma in relation to the numbers, types and sites of naevi: a case-control study.// Br J Cancer 1996, V.73,P. 1605-11.

29. Begg CB, Hummer AJ, Mujumdar U, et al. A design for cancer case-control studies using only incident cases: experience with the GEM study of melanoma. Int J Epidemiol 2006,V.5,P.756-64.

30. Bergfeldt K, Einhorn S, Rosendahl I, Hall P. Increased risk of second primary malignancies in patients with gynecological cancer. A Swedish record-linkage study. Acta Oncol. 1995, V.34, P. 771-777.

31. Bergman W, Watson P, de Jong J, Lynch HT, Fusaro RM. Systemic cancer and the FAMMM syndrome //Br J Cancer. 1990, V.61, №6, P.932-936.

32. Bevan S, Pal T, Greenberg CR, Green H, et al. A comprehensive analysis of MNG1, TCOl, fPTC, PTEN, TSHR and TRKA in familial nonmedullary thyroid cancer: confirmation of linkage to TCOl.// J Clin Endocrinol Metab. 2001,V.86, P.3701-3704.

33. Birindelli S, Tragni G, Bartoli C, et al. Detection of microsatellite alterations in the spectrum of melanocytic nevi in patients with or without individual or family history of melanoma. Hint J Cancer. 2000,V.86, P.255-61.

34. Biscolla RP, Ugolini C, Sculli M, et al. Medullary and papillary tumors are frequently associated in the same thyroid gland without evidence of reciprocal influence in their biologic behavior.// Thyroid. 2004, №11, P.946-52.

35. Block MA, Jackson CE, Greenawald KA, Yott JB, Tashjian AH. Clinical characteristics distinguishing hereditary from sporadic medullary thyroid carcinoma. Treatment implications.//Arch Surg. 1980, V.l 15, №2, P.142-148.

36. Bolino A., Schuffenecker I., Luo Y., Seri M., Silengo M., Tocco T., Charbrier G., et al. RET mutation in exons 13 and 14 of FMTC patients. //Oncogene. 1995, V.10, P.509-513.

37. Bonis PA, Trikalinos TA, Chung M, Chew P, Ip S, DeVine DA, Lau J. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: diagnostic strategies and their implications.//Evid Rep Technol Assess (Full Rep). 2007, V.150, P. 1-180.

38. Borg A. Sandberg T., Nilsson K., Johannsson O., et al. Frequency of Multiple Melanomas and Breast and Pancreas Carcinomas in CDKN2A MutationPositive Melanoma Families //Journal of the National Cancer Institute.2000, Y.92, No.15, P.1260-1266.

39. Bos JL . Ras oncogenes in human cancer: a review.//Cancer Res. 1989, V.49, P.4682-4689.

40. Brandi ML, Gagel RF, Angeli A, Bilezikian JP, et al. Guidelines for diagnosis and therapy of MEN type 1 and type 2.// J Clin Endocrinol Metab.2001,V.86, №12, P.5658-5671.

41. Burgess JR, Duffield A, Wilkinson SJ, Ware R, Greenaway TM, Percival J, Hoffman L Two families with an autosomal dominant inheritance pattern for papillary carcinoma of the thyroid.// J Clin Endocrinol Metab. 1997.V.82,1. P.345-348.

42. Butter A., Gagne J., Al-Jazaeri A., Emran M.A., Deal C., at al. Prophylactic thyroidectomy in pediatric carriers of multiple endocrine neoplasia type 2A or familial medullary thyroid carcinoma: mutation in C620 is associated with

43. Hirschprungs disease. // J. Pediatr. Surg. 2007,V.42, № 1, P. 203-206.

44. Canchola A., Horn-Ross P., PurdieD. Risk of Second Primary Malignancies in Women with Papillary Thyroid Cancer American.//Journal of Epidemiology 2006,V. 163, № 6, P. 521-527.

45. Canzian F, Amati P, Harach R, Kraimps J-L, Lesueur F, Barbier J, Levillain P, Romeo G, Bonneau D. A gene predisposing to familial thyroid tumors with cell oxyphilia maps to chromosome 19pl3.2.// Am J Hum Genet. 1998, V.63, P.1743—1748.

46. Carney JA, Gordon H, Carpenter PC, Carney J.A, Carpenter P.C, Shenoy B.V, Go V.L. //The complex of myxomas, spotty pigmentation, and endocrine overactivity. //Medicine (Baltimore). 1985,V.64, № 4, P.270-283.

47. Cetta F, Pelizzo MR, Curia MC, Barbarisi A Genetics and clinicopathological findings in thyroid carcinomas associated with familial adenomatous polyposis. //Am J Pathol. 1999, V.l 55, №1, P.7-9.

48. Chaudru V, Chompret A, Bressac-de Paillerets B, et al. Influence of genes, nevi, and sun sensitivity on melanoma risk in a family sample unselected by family history and in melanoma-prone families.// J Natl Cancer Inst., 2004, V.96, P.785-795.

49. Chen S, Iversen ES, Friebel T, Finkelstein D, Weber BL, et al. Characterization of BRCA1 and BRCA2 mutations in a large United States sample. J Clin Oncol. 2006, V.24, P.863-871.

50. Chun Y, Lindor N., Smyrk T. et al. Germline E-cadherin gene mutations: Is prophylactic total gastrectomy indicated? // Cancer, 2001,V.92 P. 181-187.

51. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. //Nucl. Acids Res. 1994, V.22, P.2990-2997.

52. Clark WH Jr, Elder DE, Guerry DT, et al. A study of tumor progression: the precursor lesions of superficial spreading and nodular melanoma.//Hum Pathol. 1984, V.15, P.l 147-1165.

53. Clark WH Jr, Reimer RR, Greene M, Ainsworth AM, Mastrangelo MJ. Origin of familial malignant melanomas from heritable melanocytic lesions: the B-Kmole syndrome. // Arch Dermatol. 1978, V.l 14, P.723-728.

54. Colman SD, Williams CA, Wallace MR. Benign neurofibromas in type 1 neurofibromatosis (NF1) show somatic deletions of the NF1 gene.// Nat Genet. 1995, V.l l,№l,P.90-92.

55. Courseaux A., Grosgeorge J., Gaudray P. et al. // European Consortium on MEN 1: Definition of the minimal MEN1 candidate area based on a 5-Mb integrated map of proximal llql3 Genomics. 1996, V.37, P.354-365.

56. Crutcher WA, Cohen PJ. Dysplastic nevi and malignant melanoma. //Am Fam Physician. 1990, V.42 V.42, №2, P.372-85.

57. Czerninski R, Krichevsky S, Ashhab Y, Gazit D, Patel V, Ben-Yehuda D. Promoter hypermethylation of mismatch repair genes, hMLHl and hMSH2 in oral squamous cell carcinoma //Oral Dis. 2009,V.15, №3, P.206-213.

58. Dammann R., Schagdarsurengin U., Seidel C., Strunnikova M., Rastetter M., Baier K., Pfeifer G.P. The tumor suppressor RASSF1A in human carcinogenesis: an update.//Histol Histopathol. 2005,V.20, №.2, P.645-663.

59. Dammann R., Li C., Yoon J.H., Chin P.L., Bates S. and Pfeifer G.P. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. //Nat Genet. 2000, V.25, P.315-319.

60. Dong C, Plemminki K. Second primary neoplasms among 53 159 haematolym-phoproliferative malignancy patients in Sweden, 1958-1996: a search for common mechanisms.//Br J Cancer. 2001, V.85, №7, P.997-1005.

61. Dreijerink K., Braga E., Kuzmin I., Geil L.,et al. The candidate tumor suppressor gene, RASSF1A, from human chromosome 3p21.3 is involved in kidney tumorigenesis .//ProcNatl. Acad. Sci. 2001,V.98, P.7504-7509.

62. Drosten M, Putzer BM. Mechanisms of Disease, cancer targeting and the impact of oncogenic RET for medullary thyroid carcinoma therapy.//Nat Clin

63. Pract Oncol. 2006, V.3, №10, P.564-574.

64. Duffy MJ, Napieralski R, Martens JW, Span PN, et al. Methylated genes as new cancer biomarkers. Eur J Cancer. 2009,V.45, №3, P.335-46.

65. Dunn JM, Farndon JR. Medullary thyroid carcinoma.//Br J Surg. 1993,V.80, №1, P.6-9.

66. Easton DF, Steele L, Fields P, Ormistin W, Averill D, Daly PA, et al. Cancer risks in two large breast cancer families linked to BRCA2 on chromosome 13ql2-13. //Am J Hum Genet 1997, V.61, P. 120-125.

67. Eng C.// Will the real Cowden syndrome please stand up: revised diagnostic criteria. J Med Genet. 2000, V.37, P.828-830.

68. Eng C, Parsons R. Cowden syndrome. In: Vogelstein B, Kinzler KW,eds. The genetic basis of human cancer.- New York: McGraw Hill. 1998, P.519-526.

69. Fante R., Roncucci L., Di Gregorio C, Tamassia MG et al. // Frequency and clinical features of multiple tumors of large bowel in the general population and in patients with hereditary colorectal carcinoma Cancer. 1996, V.77, №10, P.2013-21.

70. Ferrone CR, Ben Porat L, Panageas KS, Berwick M, Halpern AC, Patel A, Coit DG. Clinicopathological features af and risk faktors for multiple primaiy melanomas.// JAMA. 2005, V.294, №13, P.647-54.

71. FitzGerald, M.G., D.P. Harkin, S. Silva-Arrieta, D.J , et al. Prevalence of germ -line mutations in pi6, pl9ARF, and CDK4 in familial melanoma: Analysis of a clinic-based population.//Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, V.93, P.8541-8545.

72. Ford D, Easton DF, Bishop DT, Narod SA, Goldar DE. Risk of cancer in BRCA1-mutation carriers. Lancet. 1994, №343, P.692-695.

73. Fountain JW, Bale SJ, Housman DE, Dracopoli NC. Genetics of melanoma. //Cancer Surv. 1990, V.9, P.645-71.

74. Friend SH, Bernards R, Rogelj S, Weinberg RA, et al. A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarco-ma.//Nature. 1986, V.323, P.643-6.

75. Gagel R.F., Tashjian A.H., Cummings T., et al., The clinical outcome of prospective screening for multiple endocrine neoplasia type 2 A. // N Engl. J of Med.1988, V. 318, P.478-480.

76. Gallino G, Belli F, Tragni G, Ferro F, et al. Association between cutaneous melanoma and neurofibromatosis type 1: analysis of three clinical cases and review of the literature.//Tumori. 2000,V.86, №1, P.70-4

77. Geary J, Sasieni P, Houlston R, Izatt L,et al. Gene-related cancer spectrum in families with hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC). //Fam Cancer. 2008, V.7, №2, P. 163-7.

78. Gibbs P, Brady BM, Robinson WA The genes and genetics of malignant melanoma.//.! Cutan Med Surg. 2002, V.6, №3, P.229-235.

79. Gayther SA, de Foy KA, Harrington P, Pharoah P, et al. The frequency of germ-line mutations in the breast cancer predisposition genes BRCA1 and BRCA2 in familial prostate cancer.//Cancer Res. 2000,V.60, P.4513-8.

80. Gilbert F, Potluri VR, Short MP, Kau CL, Lalatta F. Retinoblastoma, chromosome abnormalities and oncogene expression. // Ophthalmic Paediatr Genet. 1987, V.8, №1, P.3-10.

81. Giles G.,Staples M., McCredie M.,Coates M. Multiple primary melanomas:an analysis cancer registry data from Victoria and New South Wales. //Melanoma Res.1995, V.5, P.433-438.

82. Gillanders E, Hank Juo SH, Holland EA, et al. Localization of a novel melanoma susceptibility locus to Ip22.//Am J Hum Genet. 2003; V.73, P.301-313.

83. Gimm O, Attie-Bitach, Tees JA, et al. //Expression of the PTEN tumour suppressor protein during human development. //Hum Mol Genet. 2000, V.9,1. P.1633-39.

84. Giunti L, Bernini G, Forni M, et al. Clonality analysis of pediatric multiple tumors: two case reports and laboratory investigation. //J Pediatr ITematol Oncol. 2006, V.28, №4, P.241-248.

85. Goldgar DE, Easton DF, Cannon-Albright LA, Skolnick MH. Systematic population-based assessment of cancer risk in first-degree relatives of cancer probands.// J Natl Cancer Inst. 1994, V.86, P. 1600-1608.

86. Goldstein AM, Dracopoli NC, Ho EC, Fraser MC, et al. Further evidence for a locus for cutaneous malignant melanoma-dysplastic nevus (CMM/ DN) on chromosome lp, and evidence for genetic heterogeneity .//Am J Hum Genet 1993, V.52, №3, P.537-550.

87. Goldstein AM, Fraser MC, Clark WHJ, Tucker MA. Age at diagnosis and transmission of invasive melanoma in 23 families with cutaneous malignant melanoma/dysplastic nevi. //J Natl Cancer Inst. 1994. V.86, P.1385-1390.

88. Goldstein AM, Goldin LR, Dracopoli NC, Clark WH, Tucker MA: Two-locus linkage analysis of cutaneous malignant melanoma/dysplastic nevi.//Am J Hum Genet. 1996, V.58, P.1050-1056.

89. Greenlee RT, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer Statistics. //Cancer J Clin. 2000, V.50, P.7-33.

90. Greene MH, Clark WH Jr, Tucker MA, Kraemer KH, Elder DE, Fraser MC. High risk of malignant melanoma in melanoma-prone families with dysplastic nevi. //Ann Intern Med. 1985/V.102, №4,P.458-65.

91. Greene MH, Fraumeni JF Jr. The hereditary variant of malignant melanoma. In: Clark WH Jr, Goldman LI, Mastrangelo MJ, eds. Human Malignant Mela-noma.//New York, NY: Grune & Stratton Inc; 1979, P. 139-166.

92. Grossman R.F., Ozaki O, Ito K, Kobayashi K, Suzuki A, Manabe Y, Hosoda Y . Familial occurrence of differentiated, nonmedullary thyroid carcinoma. //World J Surg. 1988, V.12, P.565-571.

93. Grover S, Syngal S. Genetic testing in gastroenterology: Lynch syndrome. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2009, V.23, №2, P. 185-96.

94. Guldberg P, thor Straten P, Birck A, Ahrenkiel V, Kirkin AF, Zeuthen J. Disruption of the MMAC1/PTEN gene by deletion or mutation is a frequent event in malignant melanoma. //Cancer Res. 1997, V.57, №17, P.3660-3.

95. Ha PK, Califano JA. The molecular biology of mucosal field cancerization of the head and neck. //Cnt Rev Oral Biol Med 2003, V.14, P.363-369.

96. Hadley D W, Jenkins JF; Dimond E, Nakahara K, de Carvalho M, Kirsch I, Palmer CG. Genetic Counseling and Testing in Families With Hereditary

97. Nonpolyposis Colorectal Cancer//Arch Intern Med. 2003,V.163,P.573-582.

98. Hafner C, Knuechel R, Steehr R, Hartman A. Clonality of multifocal urothelial carcinomas: 10 years of molecular genetic studies. //Int J Cancer. 2002, V.101,P.l-6.

99. Halpem A, Holly EA et al. Clinically recognized dysplastic nevi. A central risk factor for cutaneous melanoma. //JAMA. 1997, V.277, P. 1439-1444.

100. Halpern AC, Guerry D IV, Elder DE et al. Dysplastic nevi as risk markers of sporadic (nonfamilial) melanoma. A case-control study.//Arch Dermatol. 1991, V.127, P.995-9.

101. Harper, J.W. and S.J. Elledge. Cdk inhibitors in development and cancer. //Curr. Opin. Genet. Dev. 1996, V.6, P.56-64.

102. Hashemi J., Platz A., IJeno T., Stierner U., Ringborg U., Hansson J. //CDKN2 Germ-line Mutations in Individuals with Multiple Cutaneus Melanoma. //Cancer Res. 2000,V.60, №24, P.6864-7

103. Hemminki D.C. Multiple primary cancers of the colon, breast and skin (melanoma) as models for polygenic cancers.//Cancer. 2001,V.15, P.883-887.

104. Hemminki K., Eng C., Chen B. // Familial risks for Nemedullary Thyroid Cancer. //J of Clin. Endocrin.and Metabolism. 2005, V.90, №10, P. 5753-57.

105. Hemminki K, Dong C Familial relationships n thyroid cancer by histolopa-thological type.// Int J Cancer. 2000, V.85, P.201-205.

106. Hemminki K, Dong C. Cancer in husbands of cervical cancer patients. I I Epidemiology 2000, V.l 1, P.347-9.

107. Hemminki K, Dong C. Familial relationships in squamous cell carcinoma of the skin. //Epidemiology. 2000, V.l 1, P. 309-314.

108. Hemminki K, Dong C. Subsequent cancers after in situ and invasive squamous cell carcinoma of the skin.// Arch Dermatol. 2000,V.136, №5, P.647-51.

109. Hemminki K, Li X. Cancer risks in Nordic immigrants and their offspring in Sweden Eur J Cancer. 2002, V.8, №18, P.2428-34.

110. Hemminki K, Li X. Familial and second primary pancreatic cancers: a nationwide epidemiologic study from Sweden.//Int J Cancer. 2003, V.103, №4, P.525-30.

111. Hofstra RM, Landsvater RM, Ceccherini I, et al. A mutation in the RET proto-oncogene associated with multiple endocrine neoplasia type 2B and sporadic medullary thyroid carcinoma. //Nature. 1994, V.367, №6461,P.375-6.

112. Holly EA , Kelly JW, Shpall SN, Chiu SH. Number of melanocytic nevi as a major risk factor for malignant melanoma.//J Am Acad Dermatol. 1987, V.17, P.459-68.

113. Howe HL, Wu X, Ries LA, Cokkinides V, Ahmed F, et al. Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2003, featuring cancer among U.S. Hispanic/Latino populations.// Cancer. 2006, V.107, №8, P.1711-42.

114. Huang SC, Koch CA, Vortmeyer AO, Pack SD, et al. Duplication of the mutant RET allele in trisomy 10 or loss of the wild-type allele in multiple endocrine neoplasia type 2-associated pheochromocytoma. //Cancer Res. 2000, V.60, P.6223-6226.

115. Hussein MR, Sun M, Tuthill RJ, et al. Comprehensive analysis of 112 melanocytic skin lesions demonstrates microsatellite instability in melanomas and dysplastic nevi, but not in benign nevi. //J Cutan Pathol. 2001, V.28, P.343-350.

116. Hussein MR, Wood GS. hMLFIl and hMSH2 gene mutations are present in radial growth-phase cutaneous malignant melanoma cell lines and can be induced further by ultraviolet-B irradiation.//Exp Dermatol. 2003, V.872, №5, P.32-42.

117. Hussein MR, Wood GS. Molecular aspects of melanocytic dysplastic nevi // J Mol Diagn.2002, V.4, №2, P.71-80.

118. Hussussian, C.J., Struewing J.P, Goldstein A.M., et al. Germline pi6 mutations in familial melanoma. //Nature Genet. 1994, V.8, P.15-21.

119. Hwang SJ, Cheng LS, Lozano G, Amos CI, Gu X, Strong LC. Lung cancer risk in germline p53 mutation carriers: association between an inherited cancer predisposition, cigarette smoking, and cancer risk. Hum Genet.2003,V.113, P.38-243.

120. Ikeda. I, Ishizaka Y., Tahira T. et al. Specific expression of the ret proto-oncogene in human neuroblastoma cell lines. // Oncogene. 1990.V.5. №9. P.1291-1296.

121. Imyanitov EN, Suspitsin EN, Grigoriev MY, et al. Concordance of allelic imbalance profiles in synchronous and metachronous bilateral breast carcinomas. //Int J Cancer. 2002, V.100, P. 557-64.

122. Indsto JO, Cachia AR, Kefford RF, et al. X inactivation, DNA deletion, and mierosatellite instability in common acquired melanocytic nevi.//Clin Cancer Res .2001,V.7, P.4054-9.

123. Inskip P.D. Multiple primary tumors involving cancer and central nervous system as the first or subsequent cancer.//Cancer. 2003, V.98, P.562-569.

124. Ishizaka Y, Itoh F, Tahira T, Ikeda I, Sugimura T, Tucker J, Fertitta A, Carrano AV, Nagao M. Human ret proto-oncogene mapped to chromosome 1 Oql 1.2.//Oncogene. 1989, V.4, P. 12, P. 1519-21.

125. Ivanova T., Petrenko A., Gritsko T., et al. Methylation and silencing of the retinoic acid receptor-(32 gene in cervical cancer. BMC Cancer. 2002,V.2,P. 411.

126. Iwashita T., Asai N., Nurakami H. et al. Identification of tyrosine residues that are essential for transforming activity of the ret proto-oncogene with MEN2A or MEN2B mutation.// Oncogene. 1996, V.12, P.481-487.

127. Janschek E, Kandioler-Eckersberger D, Ludwig C, et al. Contralateral breast cancer: molecular differentiation between metastasis and second primary cancer. Breast Cancer Res Treat 2001, V.67, P. 1-8.

128. Jo WS, Chung DC. Genetics of hereditary colorectal cancer.//Semin Oncol. 2005, V.32 №1, P.11-23.

129. Kahraman T., de Groot J W, Rouwe C, Hofstra RM, Links T.P., et al. Acceptable age for prophylactic surgery in children with multiple endocrine neoplasia type 2a. //Eur J Surg. Oncol.- 2003,V.29, № 4, P.331-335.

130. Kaldor J. Second cancer following chemotherapy and radiotherapy. An epidemiological perspective.//Acta Oncol 1990, V.29, P.647-55.

131. Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, Liu Q, Harshman K, Tavtigian SV, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.// Science 1994, V.264, P.436-440.

132. Kamb A. Cyclin-dependent kinase inhibitors and human cancer.// Curr Top Microbiol Immunol. 1998,V.227, P.139-148.

133. Kamb A., D. Shattuck-Eidens, R. Eeles, Q. et al. Analysis of the pi6 gene (CDKN2) as a candidate for the chromosome 9p melanoma susceptibility locus. //Nature Genet. 1994, V.8, P.23-26.

134. Kamijo T, Weber JD, Zambetti G, et al. Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2. //Proc Natl Acad Sci USA.1998, 95, №14, P.8292-8297.

135. Kamijo T., Bodner S., van de Kamp E., Randle D. H., Sherr C. J. Tumor spectrum in ARF-6bma deficient mice. //Cancer Res. 1999, V.59, P.2217-2222.

136. Kefford RF, Newton-Bishop JA, Bergman W, et al. Counseling and DNA testing for individuals perceived to be genetically predisposed to melanoma: a consensus statement of the Melanoma Genetics Consortium. // J Clin Oncol.1999, V.17, P.3245-51.

137. Keller G, Vogelsang H, Becker I, et al. Diffuse type gastric and lobular breast carcinoma in a familial gastric cancer patient with an E-cadherin germline mutation.//Am J Pathol. 1999/V.155, №2, P.337-42 .

138. Kimonis VE, Goldstein AM, Pastakia B, et al. Clinical manifestations in 105 persons with nevoid basal cell carcinoma syndrome// Am J Med Genet. 1997, V.69, №3, P.299-308.

139. King M. Chromosomal rearrangements, speciation and the theoretical approach. //Heredity. 1987, V.l, P. 1-6.

140. Kinzler KW, Vogelshtein B. Colorectal Cancer. //The Genetic Basis of Human Cancer. Ed. B.Vogelshtein and K.Kinzler /2nd Edition. 2002, P.583-642.

141. Kinzler ICW, Nilbert MC, Su NKL. // Identification of FAP locus genes from chromosome 5q21. Science. 1991, V.253, P.661-664.

142. Kleinerman RA, Tucker MA, Abramson DH, et al. Risk of soft tissue sarcomas by individual subtype in survivors of hereditary retinoblastoma. //J Natl Cancer Inst. 2007, V.99, №1, P.24-31.

143. Knudson AG. Epidemiology of genetically determined cancer. Ciba Found Symp. 1989, V.142, P.3-12.

144. Knudson AG Jr, Strong LC. Mutation and cancer: a model for Wilms' tumor of the kidney. //J Natl Cancer Inst. 1972, V.48, №2, P.313-24.

145. Knudson AG Jr. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. //Proc Natl Acad Sci USA. 1971, V.68, P.820-3.

146. Konopka B, Paszko Z, Janiec-Jankowska A, Goluda M. Assessment of the quality and frequency of mutations occurrence in PTEN gene in endometrial carcinomas and hyperplasias.// Cancer Lett. 2002,V.178, P.43-51.

147. Kopf F.W.Goldmann R.J.Revers J.K. et al Familial malignant melanoma //JAMA. 1986, V.256, P.1915-1919.

148. Kousseff B.G. The genetics of malignant melanomas //Ann.Plast.Surg. 1992, V.28, №1, P.11-13.

149. Kouvaraki MA, Shapiro SE, Perrier ND, et al. RET proto-oncogene, a review and update of genotype-phenotype correlations in hereditary medullarythyroid cancer and associated endocrine tumors.//Thyroid. 2005,V.15, №6, P.531-544.

150. Krassenstein R, Sauter E, Dulaimi E, et al. Detection of breast cancer in nipple aspirate fluid by CpG island hypermethylation. //Clin Cancer Res.2004,V.10, P.28-32

151. Kroiss MM, Vogt TM, Schlegel J, et al. Microsatellite instability in malignant melanomas.//Acta Derm Venereol. 2001,V.81, P.242-5.

152. Larson T., Sjogren T. A methodological, psychiatric and statistical study of large Swedish rural population //Acta psychiatrica at neurological scandinavica. 1954, V.89, P.44-47.

153. Lea CS, Holly EA, Hartge P, Lee JS, et al. Reproductive risk factors for cutaneous melanoma in women: a case-control study //Am J Epidemiol. 2007, V.165, №5, P.505-513.

154. Lee WC, Balsara B, Liu Z, Jhanwar SC, Testa JR. Loss of heterozygosity analysis defines a critical region in chromosome lp22 commonly deleted in human malignant mesothelioma. //Cancer Res. 1996, V 56, P.4297-4301.

155. Lee WH, Bookstein R, Hong F, Young LJ, Shew JY, Lee EY. Human retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification, and sequence Science. 1987,V.235, P.1394-9

156. Lee S., Lee H.,Kim J et al. Aberant CpG island hypermethylation along multistep hepatocarcinogenesis. //Am. J. Phathol. 2003.,V.163, P.1371-1378.

157. Lengauer C.,Kinzler K.,W.,Vogelstein B. Genetic instability in human cancer. //Nature. 1998, V.396, P.643-949.

158. Lerman M.I., Minna J.D. et al. The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome 3p21.3: identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor genes.// Cancer Research. 2000, V.60, P.6116-6133

159. Lesueur F, Stasrk M.,Tocco T. et al.// Genetic Heterogeneity in Familial Nonmedullary Thyroid Carcinoma:Exclusion of Linkage to RET, MNG1 and TCO in 56 Families. //J of Clin. Endocrin. Metabolism. 1999, V.84, №.6, P.2157-2162.

160. Levi F, Randimbison L, Te VC, La Vecchia C. Second primary cancers in patients with lung carcinoma. //Cancer. 1999, V.86, P. 186-90.

161. Levi F, Randimbison L, Te VC, Rolland-Portal I, Franceschi S, La Vecchia C. Multiple primary cancers in the Vaud Cancer Registry, Switzerland, 1974-89.//Br J Cancer. 1993, V.67, № 2, P.391-5.

162. Lewis C.M.,Cler L.R., Bu D.W. et al., Promoter hypermethylation in benign breast epithelium in relation to predicted breast cancer risk.// Clin Cancer Res.2005, V.l 1, P.166-72.

163. Li L, Liu F, Ross AH.// PTEN regulation of neural development and CNS stem cells. //J Cell Biochem. 2003, V.88, P.24-28.

164. Licciardello JT, Spitz MR, Hong WK. Multiple primary cancer in patients with cancer of the head and neck: second cancer of the head and neck, esophagus, and lung. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1989, V.17, P.467-76.

165. Lips CJ, Landsvater RM, Hoppener JW, Geerdink RA, et al. Clinical screening as compared with DNA analysis in families with multiple endocrine neoplasia type 2A. //N Engl J Med. 1994, V.331, №13, P.828-35.

166. Lore f., Talidis F., Cairano G.Di., Ranieri A. Multiple endocrine neoplasia type 2 syndromes may be associated with renal malformations. //J Int. Med. 2001,V.250, P.37-42.

167. Lucchina LC., Barnhill RL, Duke DM, et al. Familial cutaneous melanoma. //Melanoma Res. 1995, V.5, P.413-418.

168. Lynch H T, Clark WH, Reimer RR, Greene M, et al. Origin of familial malignant melanomas from heritable melanocytic lesions: the B-K mole syndrome. //Arch Dermatol. 1978, V.l 14, P.723-728.

169. Lynch HT, Fitzgibbons R Jr. Surgery, desmoid tumors, and familial adenomatous polyposis: case report and literature review.//Am J Gastroenterol. 1996, V.91, №1, P.2598-601.

170. Lynch HT, Frichot BC, Lynch JF. Familial atypical multiple mole-melanoma syndrome. //J Med Genet. 1978, V.15, P.352-356.

171. Lynch HT, Greene MH, Clark WH , Tucker MA, et al. High risk of malignant melanoma in melanoma-prone families with dysplastic nevi.//Ann Intern Med. 1985, V.102, №4, P.458-465.

172. Machens A., Gimm O., Hinze R., et al. Genotype -Phenotype correlation in hereditary medullary thyroid carcinoma: oncological features and biochemical properties. //J Clin. Endocrinol. Metab. 2001, V.86, P.l 104-1109.

173. Maehama, T. and Dixon J.E. // The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate.// J. Biol. Chem. 1998, V. 273, P.13375-13378.

174. Malchoff CD, Malchoff DM. Familial nonmedullary thyroid carcinoma. //Cancer Control. 2006, V.l, №2, P. 106-10.

175. Malchoff C., Malchoff D. The Genetics of Hereditary Nonmedullary Thyroid Carcinoma//J of Clin Endocrin. and Metabolism. 2002, V.87, №6, P.2455-59.

176. Malchoff D, Sarfarazi M, Tendler B, et al. Familial papillary thyroid carcinoma is genetically distinct from familial adenomatous polyposis coli. //Thyroid. 1999, V.9, P.247-252.

177. Marra G, Boland CR. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: the syndrome, the genes, and historical perspectives.//! Natl Cancer Inst. 1995, V.87, №15, P.1114-1125.

178. Marx S.J Multiple endocrine neoplasia type 1. In :Kinzler KW,ed.//The genetic basis of human cancer.- 2nd ed.NewYork.- McGraw Hill. 2002, P.475-500.

179. Massi D, Sardi I, Urso C, et al. Microsatellite analysis in cutaneous malignant melanoma. //Melanoma Res. 2002, V.12, P.577-584.

180. Matsuo K, Tang SH, Fagin JA.// Allelotype of human thyroid tumors: loss of chromosome 11 ql3 sequences in follicular neoplasms. //Mol Endocrinol., 1991, V.5,P.l 873-1879.

181. McKay JD, Lesueur F, Jonard L, Pastore A, et al. Localization of a susceptibility gene for familial nonmedullary thyroid carcinoma to chromosome 2q21. //Am J Hum Genet. 2001, V.69, P.440-446.

182. Meellemkjaer L., Friis S., Olsen J.H.,et al // Risk of cancer among women with breast cancer.// Int. J Cancer, 2006, V.l 18, №9, P.2285-92.

183. Merlo A., Herman J. G., Mao L., Lee D. J., et al. CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumor suppressor pl6/CDK2/ MTS1 in human cancers.//Nat. Med. 1995, V.l, P.686-692.

184. Mulligan L.M., Eng C., Healey CS., Clayton D., KwookJ.B., Gardner E., Ponder M.A. Specific mutations of the RET proto-oncogene are related to disease phenotype in MEN2A and FMTC. //Nature Genet. 1994, V.7, P.70-74.

185. Mulligan L.M., Kwok J.B., Healey C.S., Elsdon MJ, Eng C, Gardner E, Love DR, Mole SE, Moore JK, Papi L, et al. Germ-line mutations of the RET proto-oncogene in multiple endocrine neoplasia type 2K.II Nature. 1993, V.363, P.458-460.

186. Myers SM, Eng C, Ponder BA, Mulligan LM. Characterization of RET proto oncogene 3' splicing variants and polyadenylation sites: a novel C-terminus for RET// Oncogene. 1995, V.l 1, №10, №3, P.2039-2045.

187. Nakamura T, Ishizaka Y, Nagao M, Hara M, Ishikawa T. Expression of the ret proto-oncogene product in human normal and neoplastic tissues of neural crest origin.// J Pathol. 1994, V.l72, №.3, P.255-60.

188. Nakamura T. Genetic markers and animal models of neurocristopathy. //His-tol Histopathol. 1995, V.10, №3, P.747-759.

189. Nakamura M., Watanabe T., Klangby U., Asker C., Wiman K., Yonekawa Y., Kleihues P., Ohgaki H. pl4ARF deletion and methylation in genetic pathways to glioblastomas. //Brain Pathol. 2001, V.l 1, P.59-168

190. Nelen M.R., PadbergG.W., Peeters E.A. at al. Localization of the gene for Cowden disease to chromosome 10q22-23.//Nat. Genet. 1996, V.13, P. 114-116.

191. Nicolaides N., Papadopoulos N., Liu B. et al. Mutations of two PMS homologues in hereditary nonpolyposis colon cancer .//Nature. 1994,V. 371, P.75-80.

192. Nikiforov YE, Steward DL, Robinson-Smith TM, et al.Molecular testing for mutations in improving the fine-needle aspiration diagnosis of thyroid nodules. //J Clin Endocrinol Metab. 2009, V.94, №6, P.2092-8.

193. Nikiforova MN, Stringer JR, Blough R. et al. // Proximity of chromosomal loci that participate in radiation-induced rearrangements in human cells. //Science. 2000, V.290, P.138-141.

194. Nobori T., Miura K, Wu DJ,et al. Deletionsof the cyclin-dependent kinase-4 ingibitor gene in multiple human cancers. //Nature. 1994, V.368, P.753 -756.

195. Oda S, Maehara Y, Sumiyoshi Y, Sugimachi K. Microsatellite instability in cancer: what problems remain unanswered? Surgery. 2002,V.31, P. 55-62.

196. Pachnis V, Mankoo B, Costantini F // Expression of the c-ret proto-oncogene during mouse embryogenesis. //Development. 1993, V.l 19, P. 1005-1017.

197. Pal T, Vogl FD, Chappuis PO, Tsang R, et al. Increased risk for nonmedul-lary thyroid cancer in the first degree relatives of prevalent cases of nonmedul-lary thyroid cancer: a hospital-based study. //J Clin Endocrinol. 2001,V.86, №11, P.5307-5312.

198. Papadopoulos N, Nicolaides NC, Liu B, et al. Mutations of GTBP in genetically unstable cells. //Science. 1995,V.268, №5219, P. 1915-7.

199. Pavel S, Smit NP.Metabolic interference of melanogenesis in pigment cells. //Sb Lek. 1996, V.97, №13, P.29-39.

200. Pearse AG, Polak JM. Endocrine tumours of neural crest origin: neurolopho-mas, apudomas and the APUD concept.// Med Biol. 1974 V52, №1, P.3-18.

201. Peris K, Keller G, Chimenti S, et al. Microsatellite instability and loss of heterozygosity in melanoma.//J Invest Dermatol 1995,V.105, P.625-628.

202. Pitot HC. Animal models of neoplastic development //Dev Biol (Basel). 2001, V.106, P.53-7

203. Plail RO, Bussey HJ, Glazer G, Thomson JP. Adenomatous polyposis: an association with carcinoma of the thyroid. //Br J Surg. 1987, V.74, № 5, P.377-80.

204. Pollock PM, Walker GJ, Que Noy T, Bloch N, Hay ward NK. Loss of the PTEN gene is important for the propagation of melanoma cells in culture, but is infrequent in melanoma tumours. //Melanoma Res. 2002, V.12, P.565-575.

205. Pomerantz J., Schreiber-Agus N., Liegeois N. J., et al. The INK4a tumor suppressor gene product, pl9Arf, interacts with MDM2 and neutralizes MDM2's inhibition of p53. //Cell. 1998, V.92, P.713-723.

206. Ponder BA, Ponder MA, Coffey R, et al. Risk estimation and screening in families of patients with medullary thyroid carcinoma. //Lancet. 1988, V.l, №82, P.397-401.

207. Protopopov A., Kashuba V., Zabarovska V.I., et al. An integrated physical and gene map of the 3.5-Mb chromosome 3p21.3 (AP20) region implicated in major human epithelial malignancies.//Cancer Res. 2003, V.63, P.404-412.

208. Punales M.K., Graf H., Gross J.L., Maia A.L. RET Codon 634 Mutations in Multiple Endocrine Neoplasia Type 2: Variable Clinical Features and Clinical Outcome. //J Clin. Endocrinology.2002, V.88, P.2644-2649.

209. Quelle, D.E, Cheng M., Ashmun R.A, Sherr C.J. Cancer-associated mutations at the INK4a locus cancel cell cycle arrest by pl6/INK4a, but not by the alternative reading frame protein pl9/ARF. //Proc. Natl. Acad. Sci.1997, V.94, P.669-673.

210. Quelle, D.E, Zindy F., Ashmun R.A., Sherr C.J. Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest. //Cell. 1995, V.83, P.993-1000.

211. Quinn AG, Healy E, Rehman I, et al. Microsatellite instability in human non-melanoma and melanoma skin cancer. J Invest Dermatol. 1995,V. 104, P.309-312.

212. Raue F, Frank-Raue K. Genotype-phenotype relationship in multiple endocrine neoplasia type 2. Implications for clinical management. Hormones (Athens). 2009, V.8, №1, P.23-28.

213. Ranade K, Hussussian CJ, Sikorski RS, Varmus HE, Goldstein AM, Tucker MA, Serrano M, Hannon GJ, Beach D, Dracopoli N.Mutations associated with familial melanoma impair p 16INK4 function.//Nat. Genet. 1995, V.10, №1, P.114-116.

214. Regitnig P, Ploner F, Maderbacher M, Lax SF. Bilateral carcinomas of the breast with local recurrence; analysis of genetic relationship of the tumors.// Mod Pathol. 2004, V.l7, P.597-602.

215. Reifenberger J.,Wolter M.,Bostrom J., et al.Allelic losses on chromosome arm lOq and mutation of the PTEN(MMAC 1 )tumor supressor gene in primary and metastatic malignant melanomas. //Virchov Arch. 2000, №436, P.487-493.

216. Reynolds RM, Reynolds RM, Weir J, Stockton DL, Brewster DH, Sandeep TC, Strachan MW. Changing trends in incidence and mortality of thyroid cancer in Scotland.//Clin Endocrinol (Oxf). 2005, V.62, №2, P. 156-62.

217. Riccardi VM. The genetic predisposition to and histogenesis of neurofibromas and neurofibrosarcoma in neurofibromatosis type 1.// Neurosurg. Focus. 2007, V.22, №6 :E3. Review.

218. Richetta A, Ottini L, Falchetti M, et al. Instability at sequence repeats in melanocyte tumours. //Melanoma Res. 2001,V.l 1, P.283-289.

219. Richetta A, Silipo V, Calvieri S, et al. Microsatellite instability in primary and metastatic melanoma.// J Invest Dermatol 1997, V.109, P. 119-20.

220. Risinger JI, Berchuck A, Kohler MF, Boyd J. Mutations of the E-cadherin gene in human gynecologic cancers. //Nat Genet. 1994, V.7, P.98-102.

221. Risch HA, McLaughlin JR, Cole DE, Rosen B, et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.// J Nat Cancer Inst. 2006, V.98, №23, P. 1675-7

222. Roberts T, Chernova O, Cowell JK. Molecular characterization of the lp22 breakpoint region spanning the constitutional translocation breakpoint in a neuroblastoma patient with a t(l;10)(p22;q21). //Cancer Genet Cytogenet. 1998, V.100, P. 10-20.

223. Robertson, G.P., Fumari F.B, Miele M.E., et al. In vitro loss of heterozygosity targets the PTEN/MMAC1 gene in melanoma. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1998, V.95, P.9418-9423.

224. Ron E, Kleinerman RA, Boice Jr D, LiVolsi VA, Flannery JT, Fraumeni Jr.A population-based case-control study of thyroid cancer. //J Natl.Cancer Inst. 1987, V.79, P.1-12.

225. Ronckers CM, McCarron P, Ron E. Thyroid cancer and multiple primary tumors in the SEER cancer registries. // Int J Cancer. 2005, V.l 17, P.281-288.

226. Rossel M, Schuffenecker I, Schlumberger M, et al. Detection of a germline mutation at codon 918 of the RET proto-oncogene in French MEN 2B famili-es.//Hum Genet. 1995, V.95, №4, P.403-406.

227. Rossel M, Pasini A, Chappuis S, Geneste O, Fournier L, Schuffenecker I, et al. Distinct biological properties of two RET isoforms activated by MEN 2A and MEN 2B mutations. // Oncogene. 1997, V.14, №3, P.265-75.

228. Rubben A, Bogdan I, Grussendorf-Conen EI, Burg G, Boni R. Loss of heterozygosity and microsatellite instability in acquired melanocytic nevi: towards a molecular definition of the dysplastic nevus. Recent Results //Cancer Res. 2002, V.160, P.100-10.

229. Rubino C, de Vathaire F, Dottorini ME. et al. Second primary malignancies in thyroid cancer patients. //Br J Cancer. 2003, V.89, P. 1638^4.

230. Rydzanicz M, Wierzbicka M, Gajecka M, et al. The impact of genetic factors on the incidence of multiple primary tumors (MPT) of the head and neck. //Cancer Lett. 2005, V.224, № 2, P.263-78.

231. Samuels Y,Wang Z, Bardelli A, Silliman N at al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. //Science. 2004, V.304, P.554-558.

232. Sandberg T., Nilsson K., Johannsson O., et al. Frequency of Multiple Melanomas and Breast and Pancreas Carcinomas in CDKN2A Mutation-Positive Melanoma Families//J Natl. Cancer Inst. 2001,V. 92, №15,P.1260-1266.

233. Santoro M, Carlomagno F, Romano A, et al. Activation of RET as a dominant transforming gene by germline mutations of MEN2A and MEN2B.// Science.1995, V.267, №5196, P.381-3.

234. Sarantaus L, Vahteristo P, Bloom E, at al. BRCA1 and BRCA2 mutations among 233 unselected Finnish ovarian carcinoma patients.//Eur J Hum Genet. 2001,V.9, P.424-30.

235. Scélo G, Boffetta P, Corbex M, et al. Second primary cancers in patients with nasopharyngeal carcinoma: a pooled analysis of 13 cancer registries. //Cancer Causes Control. 2007, V.l 8, № 3, P.269-78.

236. Schimke R.N. The Genetics of Human Cancer. Eds J.Mulvihill, R.Miller, J.Fraumeni Jr. //Chap.- New York, 1977, P. 179-198.

237. Schreiber-Agus N, Meng Y, Hoang T, et al. Role of Mxil in ageing organ systems and the regulation of nonnal and neoplastic growth. //Nature. 1998, V.393, №6684, P.483-7.

238. Schuchardt A, D'Agati V, Larsson-Blomberg L, at al. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor RET. //Nature. 1994, Y.367, P.380-383.

239. Serrano M, Gomez-Lahoz E, DePinho RA, et al. Inhibition of ras-induced prolixferation and cellular transformation by pl6INK4.//Science. 1995,V.267, P.249-52.

240. Serrano M. The tumor suppressor protein pl6INK4a.// Exp Cell Res. 1997, V.23, №1, P.7-13.

241. Serrano M., Lee H., Chin L., et al. Role of the INK4a locus in tumor suppression and cell mortality. //Cell. 1996, V.85, P.27-37.

242. Sherr C.J. Cancer cell cycles. //Science. 1996, V.274, P.1672-1676.

243. Skender-Kalnenas N.M. English D.R., Heeman P.J. Benign melanocytic lesions: risk markers or precursors of melanoma? //J.Am. Acad. Dermatol. 1995, V.33, № 6, P.1000-1007.

244. Skinner M.A., Jeffrey A., Moley M.D., at al. Prophylactic Thyroidectomy in Multiple Endocrine Neoplasia Type 2A. //N Engl J of Med. 2005,V.353, №11, P.1105-1113.

245. Skinner MA, Moley JA, Dilley WG, Owzar K, Debenedetti MK, Wells SA., Jr Prophylactic thyroidectomy in multiple endocrine neoplasia type 2A. // N Engl J Med. 2005, V.353, №11, P. 1105-1113.

246. Sokova 01, Kirichenko OP, Mukeria AF, Demidov LV, Chebotarev AN, Kopnin BP. Enhanced expression of lp32 and lp22 fragile sites in lymphocytes in cutaneous malignant melanomas. //Cancer Genet Cytogenet. 1992, V.58, P.24-28.

247. Soravia C., Sugg S.L., Berk T., at all.// Familial adenomatous polyposis-as-sociated thyroid cancer.// Am J Pathol. 1999, Y.15, P. 127-135.

248. Stoffer SS, Van Dyke DL, Bach JV, Szpunar W, Weiss L. Familial papillary carcinoma of the thyroid.//Am J Med Genet. 1986, V.25, № 4, P.775-82.

249. Stratton MR, Ford D, Neuhasen S, Seal S, Wooster R, Friedman LS, King MC, Egilsson V, Devilee P, McManus R, et al. Familial male breast cancer is not linked to the BRCA1 locus on chromosome 17q. //Nat Genet. 1994, №1, P.103-7.

250. Suarez HG, du Villard JA, Severino M, et al. Presence of mutations in all three ras genes in human thyroid tumors.//Oncogene.l 990,V.5,P.565-570.

251. Suchy J., Kurzawski G., Jakubowska K at al. Frequency and Nature of MSH6 Gemline Mutation in Polish Patients with Colorectal, Endometrial and Ovarian Cancers.//Hereditary Cancer in Clinical Practice. 2006,V.4, №1, P.60-5.

252. Sugg SL, Zheng L, Rosen IB, Freeman JL, Ezzat S, Asa SL. ret/PTC-1, -2, and -3 oncogene rearrangements in human thyroid carcinomas: implications for metastatic potential?// J Clin Endocrinol Metab. 1996, V.81, P.3360-3365.

253. Sutherland GR, Ledbetter DH.Report of the committee on cytogenetic markers //Cytogenet Cell Genet. 1989,V.51, №1-4, P.452-458.

254. Szinnai G., Meier C., Komminoth P., Zumsteg U. Review of Multiple Endocrine Neoplasia Type 2 A in Children: Therapeutic Result of Early Thyroidectomy and Prognostic Value of Codon Analysis. //Pediatrics. 2003,V.l 11,№ 2, P.132-139.

255. Tai YC, Domchek S, Parmigiani G, Chen S. Breast cancer risk among male BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.// J Natl Cancer Inst. 2007, V.99, P. 1811 1814.

256. Takahashi M, Ritz J, Cooper GM. Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. //Cell. 1985, V.42, № 2, P.581-588.

257. Takahashi M. The GDNF/RET signaling pathway and human disease. //Cytokine Growth Factor Rev. 2001,V. 12, P.361-373.

258. Takahashi M., Buma Y., Hiai H. Isolation of ret proto-oncogene cDNA with an amino-terminal signal sequence.//Oncogene.l989, №6, P.805-806.

259. Tallini G, Asa SLRET oncogene activation in papillary thyroid carcinoma. //Adv Anat Pathol. 2001,V.8, №6, P.345-54.

260. Talwalkar VR, Scheiner M, Hedges LK, et al. Microsatellite instability in malignant melanoma. //Cancer Genet Cytogenet.l998,V.104, P.l 11-114.

261. Teppo L, Salminen E, Pukkala E. Risk of a new primary cancer among patients with lung cancer of different histological types. //Eur J Cancer. 200, V.37, № 5, P.613-619.

262. Thomas NE. BRAF somatic mutations in malignant melanoma and melanocyte naevi.//Melanoma Res. 2006,V.16, №2, P.97-103

263. Thompson D, Easton DF; Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Incidence in BRCA1 mutation carriers: J Natl Cancer Inst. 2002, 94, №18, P.1358-65.

264. Tomizawa Y., Kohno T., Kondo H., Otsuka A.et al. Clinicopathological sig-nifycance of epigenetic inactivation of RASSF1A at 3p21.3 in stage I lung adenocarcinoma.//Clin. Cancer Res. 2002, V.8, P.2362-2368.

265. Travis LB, Curtis RE, Boice JD Jr, Platz CE, Hankey BF, Fraumeni JF Jr. Second malignant neoplasms among long-term survivors of ovarian cancer. //Cancer Res., 1996, V.56, P.1564-70.

266. Tripp JM, Kopf AW, Marghoob AA, Bart RS. Management of dysplastic nevi: a survey of fellows of the American Academy of Dermatology. //J Am Acad Dermatol. 2002, V.46, P.674-682.

267. Tsao H, Sober AJ. Ultraviolet radiation and malignant melanoma.//Clin Dermatol. 1998, V.16, P.67-73.

268. Tucker MA, Halpern A, Holly EA et al. Clinically recognized dysplastic nevi. A central risk factor for cutaneous melanoma.// JAMA. 1997, V.277, P. 1439-1444.

269. Turleau C, De Grouchy J. Constitutional karyotypes in retinoblastoma. //Ophthalmic Paediatr Genet. 1987, V.8, №1, P. 11-17.

270. Uchino S, Noguchi S, Kawamoto H, Yamashita H, Watanabe S, Yamashita H, Shuto S. Familial nonmedullary thyroid carcinoma characterized by multifo-cality and a high recurrence rate in a large study population.// World J Surg. 2002, V.26, №8, P.897-902.

271. Vazina A, Baniel J, Yaacobi Y, Shtriker A, Engelstein D, Leibovitz I, et al. The rate of the founder Jewish mutations in BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer patients in Israel //Br J Cancer. 2000, V.83, P.463-6.

272. Venkitaraman A.R. Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2. //Cell. 2002, V.108, P.171-182.

273. Verma et al Verma M, Dunn BK, Ross S et al. Early detection and risk assessment: proceedings and recommendations from the Workshop on Epigene-tics in Cancer Prevention. Ann N Y //Acad Sci. 2003, V.983, P. 298-19.

274. Vlahovic G, Crawford J. Activation of tyrosine kinases in cancer. //Oncologist. 2003, V.8,№6,P.531-8.

275. Walker JG, Palmer JM, Walter MK. A genetic model of melanoma tumori-genesis based on allelic losses.// Genes Chromosomes Cancer. 1995, V.12, P.134-41.

276. Wassberg C, Thorn M, Yuen J, Ringborg U, Hakulinen T. Second primary cancers in patients with squamous cell carcinoma of the skin: a population-based study in Sweden.//Int J Cancer. 1999, V.80, P.511-515.

277. Watanabe T., Nakamura M., Yonekawa Y.,et al. H. Promoter hyperme-thylation and homozygous deletion of the pl4ARF and pl6INK4a genes in oligodendrogliomas. //ActaNeuropathol. 2001, V.101, P.185-189.

278. Wells SA, Gosnell JE, Gagel RF, et al. Vandetanib in metastatic hereditary medullary thyroid cancer: Follow-up results of an open-label phase II trial. ASCO Annual Meeting Proceedings Part 1. J Clin Oncol. 2007,V.25 (18S).

279. Willem J., de Groot В., Links T.P., Plukker J T.,et al. RET as a Diagnostic and Therapeutic Target in Sporadic and Hereditary Endocrine Tumors //Endocrine Reviews. 2006, V.27, №5, P.535-56.

280. Wooster R, Neuhausen SL, Mangion J, et al. Localization of a breast cancer susceptibility gene, BRCA2, to chromosome 13ql2-13. //Science. 1994,V.265, №5181, P.2088-90.

281. Wong SS, Lozano G, Gaff CL, Gardner RJ,et al/Novel p53 germline mutation in a patient with Li-Fraumeni syndrome.// Intern Med J. 2003, V.33, №12, P.621-623.

282. Yamamoto M, Taguchi K, Baba H, et al. Loss of protein expression of hMLHl and hMSH2 with double primary carcinomas of the stomach and colo-rectum. //Oncology Reports. 2006, V.16, №1, P.41-47.

283. Yamamoto S.Y,Yoshimura K., Ri S., et al. The risk of Multiple Primary Malignancies with Colorectal Carcinoma//Dis.Colon and Rectum. 2006,V. 19, P.830-836.

284. Yoshida K., Miki Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.//Cancer Sci. 2004, V.95, P.866-871.

285. You YN, Lakhani V, Wells SA, et al. New directions in the treatment of thyroid cancer. //J Am Coll Surg. 2007, V.205, №4, (Suppl), P.45-48.

286. Zedenius J, Wallin G, Svensson A, et al. //Allelotyping of follicular thyroid tumors. //Hum Genet. 1995, V.96, P.27-32.

287. Zhang J, Glatfelter AA, Taetle R, Trent JM. Frequent alterations of evolutio narily conserved regions of chromosome 1 in human malignant melanoma. //Cancer Genet Cytogenet. 1999, V.lll, P.119-23.