Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Функционально-морфологическая характеристика и экспериментальная профилактика развития модели нефропатического амилоидоза у крыс

На правах рукописи

ГАБУЕВА АЛИНА АКИМОВНА

ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОФИЛАКТИКА РАЗВИТИЯ МОДЕЛИ НЕФРОПАТИЧЕСКОГО АМИЛОИДОЗА У КРЫС

14.03.03. - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 СЕН 2011

Владикавказ - 2011

4853154

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

БРИН Вадим Борисович Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

КОЗЫРЕВ Константин Мурадиевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

ДЗУГКОЕВА Фира Соломоновна; доктор медицинских наук, профессор ОВСЯННИКОВ Виктор Григорьевич

Ведущая организация: государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 30 сентября 2011 г. на заседании диссертационного совета Д 208.095.01 при ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» (362019, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «СевероОсетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Автореферат разослан <$ЛЛ> 1 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

И.Г. Джиоев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на более чем столетнюю историю изучения, проблема амилоидоза продолжает привлекать внимание исследователей (F.Ferrario, M.Rastaldi, 2006), что обусловлено помимо достаточно широкой распространенности, тяжестью клинических проявлений со склонностью к развитию почечной недостаточности (R. Rysava, 2007). Амилоидоз и сегодня остается малоизученным, сложным для диагностики и лечения патологическим процессом. В связи с этим перспективными могут явиться экспериментальные исследования, направленные на создание моделей амилоидоза с использованием животных, совмещающих в себе два качества: достаточный размер и доступность. Кроме того актуальным остается поиск новых средств профилактики и лечения амилоидоза, обладающих минимальным количеством побочных эффектов и эффективностью.

Механизм лечебного действия сульфидных минеральных вод на организм в целом сложен, многообразен и подлежит дальнейшему изучению. Исследования, показавшие, что сульфидные минеральные воды обладают выраженным обезболивающим и противовоспалительным действием, дали возможность применять воду «Редант-4Р» для лечения многих воспалительных и системных заболеваний, обусловленных дезорганизацией соединительной ткани (Хетагурова З.В., Амбалова С.А., 1988; Чамокова Е.Ф., Тадеева С.Х., Осипова JI.B., 19741992гг; Гобеев В.Н., Кастуева Н.З., Цебоев Б.Б.,1989). Перечисленные свойства позволяют предположить, что минеральная вода Северной Осетии «Редант-4Р» может оказывать тормозящее действие на процессы синтеза и отложения амилоида.

Есть основание полагать, что играющие определенную роль в патогенезе приобретенного амилоидоза нарушения гомеостазиса могут корригироваться препаратами, оказывающими мембраностабилизирующий, антигипоксический и антиоксидантный эффекты. Одним из таких препаратов является янтарная кислота, обладающая иммуномодулирующим и цитомембраностабилизирующим действием (A.A. Хадарцев, 2003,2004; A.JI. Коваленко, А.Ю. Петров, М.Г. Романцов, 2005). Получен положительный терапевтический эффект от применения янтарной кислоты при экспериментальном амилоидозе у хомяков (Пухова И. У., Брин В.Б., Козырев K.M. 2009).

Все вышеизложенное диктует целесообразность изучения возможности применения сульфидной минеральной воды и янтарной кислоты раздельно и в их сочетании для коррекции нарушений при нефропатическом типе генерализованного амилоидоза.

Целью работы явилось создание моделей экспериментального нефропатического типа амилоидоза, изучение функциональных и патогистоструктурных характеристик их патогенеза, анализ возможности корригирующего влияния янтарной кислоты и минеральной воды «Редант-4».

Задачи исследования. Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Создать модели экспериментального генерализованного нефропатического амилоидоза у крыс: 1) методом длительного введения нативного яичного альбумина старым животным (возраст 18-24 месяца, масса тела 330-380 гр); 2) методом однократного введения нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда. Провести функциональное и морфологическое их сопоставление с ранее созданными в лаборатории моделями амилоидоза.

2. Изучить характер функционально-структурных изменений у животных, получавших в процессе моделирования амилоидоза минеральную воду «Редант-4».

3. Изучить характер функционально-структурных изменений у животных, получавших в процессе моделирования амилоидоза янтарную кислоту

4. Изучить характер функционально-структурных изменений у животных, получавших в процессе моделирования амилоидоза минеральную воду «Редант-4» в сочетании с янтарной кислотой.

Научная новизна. Впервые разработан метод моделирования амилоидоза путем длительного (60 дней) подкожного введения старым крысам нативного яичного альбумина в дозе 0,025 мл/г массы тела, а также метод моделирования амилоидоза путем однократного подкожного введения крысам равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в пять точек инъекций. Обе модели проявляются системным амилоидозом с преимущественным поражением почек, сердца, печени, селезенки. Выявлены особенности развития амилоидоза почек, сопровождающегося снижением основных показателей электролитоводовыделительной функции.

Установлено, что применение сульфидной минеральной воды, янтарной кислоты и их сочетания уменьшает изменения водовыделительной и ионовыделительной функции почек, значительно снижает степень протеинурии. Уменьшается выраженность патогистологических изменений в почках, сердце, печени, селезенке.

По теме диссертационной работы, на основании результатов исследования получены 3 патента на изобретение Федерального института промышленной собственности: от 20 ноября 2009 г под № 2373581; от 27 января под № 2410761; от 27 января под № 2410764.

Научно-практическая значимость работы. Исследование носит экспериментальный характер, полученные результаты, демонстрирующие эффекты длительного подкожного введения старым крысам яичного альбумина, а также однократного введения старым крысам равнодолевой смеси яичного альбумина и полного адьюванта Фрейнда, сопровождающиеся развитием амилоидоза, относятся к области фундаментальных знаний, так как расширяют представления о возможностях моделирования амилоидоза, вносят определенный вклад в теорию его этиологии и патогенеза. Выявленные эффекты применения сульфидной минеральной воды «Редант-4» и янтарной кислоты, демонстрируют возможность профилактического их применения с целью нормализующего влияния на измененное состояние электролито-водовыделительной функции почек при экспериментальном амилоидозе.

Результаты исследования могут быть использованы при преподавании патофизиологических и гистоструктурных основ стромально-сосудистых диспротеинозов, при разработке способов профилактики и лечения амилоидоза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Длительное (60 дней) подкожное введение старым крысам нативного яичного альбумина в дозе 0,025 мл/г массы тела приводит к развитию системного амилоидоза с преимущественным поражением почек, сердца, печени, селезенки. Однократное введение старым крысам равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в 5 точек инъекций также приводит к развитию системного амилоидоза с преимущественным поражением почек, сердца, печени, селезенки. Формирование экспериментального амилоидоза сопровождается протеинурией, изменением показателей электролито-и водовыделительной функции почек.

2. Применение сульфидной минеральной воды одновременно с нативным яичным альбумином способствует уменьшению выраженности признаков поражения почек, приводя к частичному восстановлению электролита- и водовыделительной функции и снижению уровня протеинурии.

3. Применение янтарной кислоты одновременно с нативным яичным альбумином способствует уменьшению выраженности признаков поражения почек, приводя к частичному восстановлению электролито- и водовыделительной функции и снижению уровня протеинурии.

4. Применение сульфидной минеральной воды в сочетании с янтарной кислотой при моделировании амилоидоза способствует более выраженному уменьшению признаков поражения почек, приводя к частичному восстановлению электролито- и водовыделительной функции и снижению уровня протеинурии.

Личный вклад автора: Автором самостоятельно выполнена экспериментальная часть работы, математическая и статистическая обработка данных.

Публикации и апробация диссертационной работы. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, включая 3 патента РФ на изобретение и 4 публикации в изданиях, определенных Высшей аттестационной комиссией.

Материалы исследований доложены и обсуждались на 10-й Юбилейной научной сессии, посвященной 70-летию СОГМА (Владикавказ, 2009); IX Конференции молодых ученых СОГМА (Владикавказ, 2010); X Конференции молодых ученых и специалистов СОГМА (Владикавказ, 2011); совместном заседании кафедр нормальной и патологической физиологии, патологической анатомии, фармакологии и ЦНИЛ ГОУ ВПО СОГМА Минздравсоцразвития РФ от 14 июня 2011 года.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, включая введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследования, их обсуждение, заключение, выводы, список использованной литературы и приложение. Работа иллюстрирована 57 рисунками и 10 таблицами, размещенными в приложении.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Опыты проводились на 330 крысах-самцах линии Vistar массой 330-380г. С учетом влияния возрастных сдвигов в

6

обменных процессах, для экспериментов отбирались старые особи самцы (возраст 18-24 месяца), ткани которых находятся в состоянии естественной гипотрофии. Опытные животные в период исследований содержались на стандартном рационе в условиях свободного доступа к пище и воде. Световой режим - естественный.

Эксперименты были поставлены в 11 сериях опытов. Одна из моделей амилоидоза создавалась введением нативного яичного альбумина инъекциями под кожу из расчета 0,025 мл/г массы тела животного на протяжении 60 дней. Вторую модель создавали, используя равнодолевую смесь нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда, которую вводили однократно в дозе по 0,2 мл в пять точек инъекций (подкожно в подмышечные и паховые области слева и справа и внутрибрюшинно). Сульфидную минеральную воду и, с целью контроля, водопроводную воду (из расчета 10 мл/кг массы тела) вводили интрагастрально -через зонд в желудок ежедневно в течение 2-х месяцев; янтарную кислоту (в дозе 1,5 ммоль/кг) растворяли в: 1) дистиллированной воде, полученный раствор вводили внутрижелудочно с помощью зонда ежедневно в течение 60 дней; 2)в сульфидной минеральной воде, полученный раствор вводили внутрижелудочно с помощью зонда через день в течение 60 дней.

Основные показатели во всех сериях опытов исследовались через 1 и 2 месяца эксперимента. Для изучения функции почек в условиях спонтанного диуреза крысы помещались в обменные клетки, где в течение 6 часов у них собиралась моча. В моче исследовали содержание натрия, калия, кальция, креатинина, общего белка.

По истечении срока эксперимента животные забивались под тиопенталовым наркозом для исследования плазмы и тканей. В плазме крови определялись концентрация креатинина, кальция, натрия и калия.

При проведении экспериментов руководствовались статьей 11 Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.).

Для гистологических исследований материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, затем подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином, конго красным. Изучение срезов проводилось в

проходящем свете при помощи микроскопа МИКМЕД - 1 под увеличением х80,х200,х400,х600.

Содержание натрия и калия в моче и сыворотке определяли методом пламенной фотометрии с помощью автоматического пламенного фотометра ФПА. Концентрацию кальция в моче и сыворотке определяли спектрофотометрически с помощью набора «Кальций» ООО «Агат-Мед» (г. Москва, Россия). Содержание креатинина в моче и сыворотке определяли спектрофотометрически с помощью набора «Креатинин» ООО «Ольвекс Диагностикум» (г. Санкт-Петербург, Россия). Определяли клубочковую фильтрацию по клиренсу эндогенного креатинина и рассчитывали канальцевую реабсорбцию воды. Концентрацию общего белка определяли спектрофотометрически с помощью реактива Фоллина.

Расчеты скорости клубочковой фильтрации, величины канальцевой реабсорбции воды, экскреции катионов, их фильтрационного заряда и относительной канальцевой реабсорбции натрия и кальция производились по формулам (Ю.В. Наточин, 1974). Результаты всех серий опытов математически обработаны на ПЭВМ РеШшт-З методом вариационного анализа с применением <Ф> критерия Стюдента с использованием программы Рпгта 2,04.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования функционального состояния почек показали, что у животных при моделировании амилоидоза методом длительного введения чужеродного белка через 1 месяц наблюдалось достоверное увеличение диуреза (р<0,001) относительно инактного фона, обусловленное снижением канальцевой реабсорбции воды (р<0,001) и увеличением скорости клубочковой фильтрации (р<0,001). Через 2 месяца отмечалось снижение диуреза, что было связано с уменьшением скорости клубочковой фильтрации ниже фоновых значений, несмотря на ослабление канальцевой реабсорбции воды (рис. 1).

Изучение ионоуретической функции почек через 1 месяц выявило повышение экскреции натрия (р<0,001) по сравнению с интактными животными, в связи с уменьшением его канальцевой реабсорбции (р<0,05) и увеличением фильтрационного заряда катиона (рис. 2). Концентрация натрия в плазме крови не менялась. Через 2 месяца уровень экскреции натрия снижался (р<0,01), что было обусловлено падением фильтрационного заряда катиона (р<0,001), несмотря на уменьшение и его канальцевой реабсорбции. Через 1 месяц эксперимента

8

наблюдался рост экскреции калия по сравнению с интактным контролем, видимо, из-за увеличения его фильтрационного заряда при тенденции к повышению содержания катиона в плазме крови. Через 2 месяца экскреция калия была достоверно выше интактного контроля, несмотря на одновременное снижение фильтрационного заряда калия, вероятно, вследствие повышения канальцевой секреции катиона в условиях гиперкалиемии. Под влиянием амилоидогена через 1 месяц происходило достоверное увеличение экскреции кальция, что было обусловлено ростом фильтрационного заряда катиона. Через 2 месяца экскреция кальция имела тенденцию к снижению, оставаясь все же достоверно выше фоновых данных, что было связано со значительным снижением его канальцевой реабсорбции. Уменьшался и фильтрационный заряд кальция, а также его содержание в плазме крови. Под влиянием введения нативного яичного альбумина через 1 месяц эксперимента экскреция белка с мочой была достоверно выше фона. Через 2 месяца введения амилоидогена отмечалось увеличение протеинурии почти в 3 раза (таблица).

ДиУРез с кф

Канальцевая реабсорбция воды во Фон

длительное введение амилоидогена 1 мес. длительное введение амилоидогена 2 мес. через 1 мес после введения амилоидогена с АФ через 2 мес после введения амилоидогена с АФ длит введение амилоидогена+мин вода 1мес длит введение амилоидогена+мин вода 2 мес. длит введ амилоидогена+янт кислота 1мес длит введ амилоидогена+янт кислота 2мес ЕЯ длит введ амилоидогена+мин в. и янт к. 1мес БСТдлит введ амилоидогена+мин в. и янт к. 1мес однократ введение амилоидогена+мин в 1мес однократ введение амилоидогена+мин в 2мес

Рис. 1. Изменения основных процессов мочеобразования при моделировании амилоидоза и его профилактике (АФ - адъювант Фрейнда).

Таким образом, подкожное введение яичного альбумина старым крысам на протяжении 2 месяцев в дозе 0,025 мл/г массы тела вызывает протеинурию,

изменение показателей ионо- и водовыделительной функций почек, что можно считать функциональными признаками развития нефропатического амилоидоза.

Исследования функционального состояния почек при моделировании амилоидоза методом однократного введения равнодолевой смеси яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда показали, что через 1 месяц эксперимента снижение канальцевой реабсорбции воды (р<0,001) обусловило достоверное увеличение диуреза данной группы животных относительно интактного фона (рис.1). Рост диуреза происходил, несмотря на уменьшение скорости клубочковой фильтрации. Через 2 мес диурез снизился ниже фона, что было обусловлено уменьшением скорости клубочковой фильтрации (с 18,41мл/час/100г до 6,02 мл/час/100г) (р<0,001), несмотря на падение канальцевой реабсорбции воды (р<0,001).

Экскреция натрия и концентрация иона в крови через 1 месяц не менялись по сравнению с интактными животными (рис.2). Через 2 месяца эксперимента уровень экскреции натрия снижался (р<0,001), что было обусловлено уменьшением его фильтрационного заряда, несмотря на повышение концентрации натрия в плазме крови. Через 1 месяц эксперимента наблюдалась тенденция к росту, а через 2 месяца - достоверный рост экскреции калия по сравнению с интактным контролем, концентрация калия в плазме крови повышалась. Под влиянием амилоидогена через 1 месяц происходило увеличение экскреции кальция, что было обусловлено снижением его канальцевой реабсорбции. Одновременно уменьшалась концентрация иона в плазме крови. Через 2 месяца направленность изменений усилилась, что было обусловлено еще более значительным снижением канальцевой реабсорбции кальция (с 99,40% до 98,14%), несмотря на достоверное снижение фильтрационного заряда катиона.

Под влиянием однократного введения равнодолевой смеси яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда через 1 и 2 месяца эксперимента экскреция белка с мочой была достоверно выше фона, особенно по истечении 2 месяцев (таблица).

Таким образом, однократное введение равнодолевой смеси яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда старым крысам вызывает развитие нефропатического амилоидоза, характеризующегося выраженной протеинурией, изменением показателей электролите- и водовыделительной функций почек.

В группе животных, получавших ежедневно минеральную воду Р-4 на фоне длительного введения амилоидогена, в течение первого месяца снижение скорости клубочковой фильтрации вызывало уменьшение диуреза относительно амилоидной группы животных при имеющейся тенденции к снижению канальцевой реабсорбции воды (рис. 1). Через 2 мес. эксперимента отмечался рост диуреза относительно группы с изолированным введением яичного белка, хотя, тем не менее, диурез оставался всё же достоверно ниже фоновых значений (р<0,01). Результаты, полученные после 2 месяцев эксперимента в контрольной группе с введением водопроводной воды, достоверно от данных амилоидной группы не отличались. Профилактические эффекты минеральной воды были обусловлены приростом скорости клубочковой фильтрации (р<0,001), рост диуреза происходил несмотря на увеличение относительной канальцевой реабсорбции воды.

' " ' ф он

ШИдлительное введение амилоидогена 1мес ЩШ1 длительное введение амилоидогена 2мес однократное введение амилоидогена 1мес а однократное введение амилоидогена 2мес ЕГЭдлит введение амилоидогена+мин вода 1 мес ЕШдлит введение амилоидогена+мин вода 2мес ШШдлит введение амилоидогена+янт к-та 1мес ЕЗЗдлит введение амилоидогена+мин вода 2мес Еадлит введ амилоидогена+мин в и янт к 1мес еадлит введ амилоидогена+мин в и янт к 2мес ШШоднократ введение амилоидогена+мин в 1мес ^Эоднократ введение амилоидогена+мин в. 2мес

Рис. 2. Изменения экскреции электролитов при моделировании амилоидоза и его профилактике.

Профилактическое применение сероводородной минеральной воды Р-4 через 1 месяц выявило тенденцию к снижению экскреции натрия по сравнению с амилоидной группой (рис.2). Концентрации натрия в плазме крови не менялась. По истечении 2 месяцев отмечалось увеличение натриуреза относительно

Экскреция Са

животных с амилоидной нефропатией (р<0.001), но данные оставались ниже фоновых значений. Концентрация катиона в крови достоверно от интактного контроля не отличалась. Анализ данных в контрольной группе с применением водопроводной воды достоверных отличий от результатов амилоидной группы не выявил.

Изучение экскреции калия в группе с введением воды «Р-4»по истечении 1 и 2 месяцев достоверных изменений относительно амилоидной группы и контролем с водопроводной водой не выявило. Гиперкалиемия сохранялась как в группах с введением на фоне амилоидогена минеральной, так и водопроводной воды. Экскреция кальция через 1 месяц имела тенденцию к снижению относительно амилоидной группы благодаря уменьшению фильтрационного заряда. Содержание кальция в плазме крови оставалось сниженным. Контроль с водопроводной водой выявил достоверное снижение экскреции кальция по сравнению с моделированием амилоидоза за счет уменьшения фильтрационного заряда катиона. Через 2 месяца эксперимента в группе с введением минеральной воды направленность изменений усилилась, экскреция катиона продолжала снижаться, приближаясь к фоновым значениям за счет повышения относительной канальцевой реабсорбции кальция (р<0,01), одновременно происходило увеличение фильтрационного заряда катиона и его содержания в плазме крови.

Таблица. Изменения экскреции белка при моделировании амилоидоза и его профилактике.

Условия опыта Статистич. показат

М+т Р

Фон 13,99+0,94

Длительное введение амилоидогена1 мес. 31,56±1,335 0,001

Длительное введение амилоидогена 2 мес. 38,55+1,203 0,001

Через 1 мес после однократного введения амилоидогена с АФ 29,25±0,885 0,001

Через 2 мес после однократного введения амилоидогена с АФ 41,15+1,972 0,001

Длительное введение амилоидогена и мин воды 1 мес. 22,09±0,629 0,001

Длительное введение амилоидогена и мин воды 2 мес. 26,88+0,881 0,001

Длительное введение амилоидогена и янт кислоты 1 мес 20,17±0,855 0,001

Длительное введение амилоидогена и янт кислоты 2 мес 28,71+0,779 0,001

Длительное введение амилоидогена и янт кислоты с мин водой 1 мес 20,74±0,909 0,001

Длительное введение амилоидогена и янт кислоты с мин водой 2 мес 22,41±0,875 0,001

Однократное введение амилоидогена с АФ и мин воды 1 мес 21,25+0,611 0,001

Однократное введение амилоидогена с АФ и мин воды 1 мес 29,77±0,987 0,001

Примечание: АФ - адьювант Фрейнда

В контрольной группе с введением водопроводной воды экскреция катиона достоверных отличий от амилоидной группы не имела. Гипокальциемия в данной группе сохранялась. Через 1 и 2 месяца исследований степень протеинурии в группе с профилактическим применением минеральной воды была ниже амилоидных, но выше интактных животных (таблица).

Таким образом, профилактическое применение минеральной воды на фоне подкожного введения яичного альбумина способствовало уменьшению изменений водо- и ионовыделительной функции почек и значительному снижению протеинурии.

Профилактическое применение янтарной кислоты на фоне длительного введения яичного белка через 1 месяц эксперимента вызывало нормализацию скорости клубочковой фильтрации, тем самым препятствуя росту диуреза. Через 2 месяца диурез достоверно увеличивался относительно амилоидной группы (р<0,2), оставаясь всё же ниже интактного контроля, рост диуреза происходил за счет повышения уровня клубочковой фильтрации, несмотря на увеличение и канальцевой реабсорбции.

Достоверных изменений экскреции натрия (рис. 2) через 1 мес не выявлялось. Через 2 месяца экскреция натрия увеличивалась как относительно опытных, так и интактных животных (р<0,05). Содержание натрия в плазме крови снижалось до фоновых значений. Экскреция калия через 1 и 2 месяца эксперимента была достоверно выше фоновых значений, однако от данных амилоидной группы животных не отличалась, имелась лишь тенденция к ее снижению. В плазме крови имелась тенденция к снижению содержания калия относительно модели амилоидоза, относительно интактного контроля гиперкалиемия сохранялась. Профилактическое применение янтарной кислоты мало меняло экскрецию кальция относительно амилоидной группы в течение 1 месяца эксперимента. Через 2 месяца происходило увеличение фильтрационного заряда катиона (р<0,01), что и обусловливало прирост его экскреции. Содержание кальция в крови восстанавливалось до фоновых значений. Содержание белка в моче, относительно группы животных с моделью амилоидоза снизилась через 2 месяца почти в 2 раза, однако оставалось выше данных контрольной группы.

Таким образом, сочетанное введение нативного яичного альбумина и янтарной кислоты ослабляет нарушения показателей электролита- и

водовыделительной функции почек, характерные для модели амилоидоза, а также значительно уменьшает выраженность протеинурии.

Применение минеральной воды в сочетании с янтарной кислотой на фоне длительного введения амилоидогена через 1 месяц препятствовало росту диуреза, происходившего при введении амилоидогена, что было обусловлено уменьшением скорости клубочковой фильтрации на фоне имеющейся тенденции к росту канальцевой реабсорбции воды (рис. 1). Через 2 месяца скорость клубочковой фильтрации увеличивалась (р<0,01), что вызывало достоверный рост диуреза относительно амилоидной группы (р<0,001), но данные были ниже интактного контроля. При этом канальцевая реабсорбция также увеличивалась (р<0,01), т.е профилактические эффекты применения минеральной воды и янтарной кислоты были обусловлены восстановлением как канальцевой реабсорбции воды, так и скорости клубочковой фильтрации.

Изучение ионовыделительной функции почек через 1 месяц эксперимента выявило достоверное, относительно амилоидной группы, снижение экскреции натрия, вследствие уменьшения его фильтрационного заряда (рис. 2). Через 2 месяца эксперимента наблюдалось достоверное увеличение экскреции натрия (р<0,01), и восстановление её до фоновых значений, что было обусловлено повышением фильтрационного заряда катиона (р<0,01), несмотря на увеличение его относительной канальцевой реабсорбции (р<0,05). Содержание натрия в плазме крови на протяжении эксперимента достоверно от интактного контроля не отличалось. Экскреция калия через 1 и 2 месяца эксперимента имела тенденцию к снижению, вероятно, вследствие увеличения канальцевой секреции в условиях гиперкалиемии. Содержание калия в крови имело тенденцию к снижению. Экскреция кальция через 1 месяц эксперимента достоверно снижалась, за счет снижения фильтрационного заряда катиона (рис. 2). Содержание кальция в плазме крови относительно амилоидных животных достоверно не менялось. Через 2 месяца эксперимента экскреция катиона продолжала снижаться до фоновых значений. Содержание его в плазме крови увеличивалось, оставаясь все же ниже, чем у интаю ных животных.

Через 1 и 2 месяца исследований величина протеинурии была статистически достоверно ниже группы крыс с моделью амилоидоза, снижаясь почти в 2 раза к концу эксперимента, но оставалась достоверно выше фоновых значений (таблица)

Таким образом, сочетанное применение янтарной кислоты и минеральной воды «Р-4» на фоне введения яичного альбумина способствует уменьшению изменений водо- и ионовыделительной функции почек, вследствие ослабления выраженности изменений канальцевой реабсорбции воды и скорости клубочковой фильтрации, приводит к снижению протеинурии, т.е. оказывает более выраженное корригирующее влияние на развитие нефропатического амилоидоза, чем при профилактическом применении только минеральной воды или янтарной кислоты.

В ходе эксперимента в группе животных с моделированием амилоидоза методом однократного введения амилоидогена в смеси с адъювантом Фрейнда, сравнение эффектов минеральной воды проводилось с интактным фоном и с группой животных, получавших с первого дня моделирования амилоидоза водопроводную воду. Было установлено, что ежедневное введение минеральной воды Р-4 на фоне однократного введения амилоидогена вызывало снижение диуреза относительно амилоидной группы животных в течение 1 месяца эксперимента за счет повышения канальцевой реабсорбции. Скорость клубочковой фильтрации при этом оставалась достоверно ниже фона (р< 0,01). Через 2 мес в группе с введением на фоне амилоидогена минеральной воды отмечался рост диуреза относительно групп с амилоидозом и контролем с водопроводной водой, хотя, тем не менее, диурез оставался ниже фона. Частичное восстановление диуреза происходило за счет прироста клубочковой фильтрации (р<0,001), несмотря на увеличение и канальцевой реабсорбции (р<0,01).

Применение минеральной воды через 1 месяц выявило тенденцию к снижению экскреции натрия по сравнению с амилоидной группой, при этом отмечалось увеличение фильтрационного заряда катиона вследствие роста скорости клубочковой фильтрации (рис. 2). Концентрация натрия в плазме крови относительно фона не менялась. По истечении 2 месяцев наблюдалось увеличение натриуреза относительно амилоидной группы (р<0,1), но данные оставались ниже фона. Концентрация катиона в крови от фона не отличалась. Изучение экскреции калия по истечении 1 мес эксперимента выявило повышение его экскреции. Спустя 2 месяца экскреция калия с мочой имела тенденцию к снижению, вероятно, за счет изменения канальцевых процессов. Уровень калия в крови имел тенденцию к снижению относительно модели, оставаясь достоверно выше фона. Под влиянием минеральной воды у животных с моделью амилоидоза экскреция

кальция через 1 месяц имела лишь тенденцию к снижению относительно амилоидной группы за счет малых сдвигов канальцевой реабсорбции. Содержание кальция в плазме крови достоверных отличий от фона не имело. Через 2 месяца эксперимента в группе с введение минеральной воды экскреция катиона была также ниже модели амилоидной нефропатии, что было связано с повышением канальцевой реабсорбции кальция (р<0,01), одновременно происходило и увеличение фильтрационного заряда катиона, но все данные оставались все же ниже чем у интактных животных. В плазме крови уровень кальция имел тенденцию к повышению относительно животных с моделью амилоидоза и оставался достоверно ниже фона. Контроль с водопроводной водой выявил значительно меньшие положительные эффекты, чем в опытах с использованием минеральной воды.

Через 1 и 2 месяца исследований экскреция белка с мочой была достоверно ниже группы крыс с моделью амилоидоза, но всё же была выше фоновых значений (таблица).

Таким образом, применение сульфидной минеральной воды на фоне однократного введения амилоидогена в смеси с адъювантом Фрейнда приводило к уменьшению степени выраженности изменений водо- и ионовыделительной функций почек, вследствие частичного восстановления канальцевой реабсорбции и клубочковой фильтрации воды, что также способствовало значительному снижению уровня протеинурии.

При экспериментальном нефропатическом амилоидозе макроскопически почки были несколько увеличены в объеме, на разрезе ткани почки граница между корковым и мозговым слоями была сглажена, отмечалось выраженное полнокровие обоих слоев органа. При окраске срезов конго красным в стенках клубочковых артериол и капилляров, а также в средней оболочке сосудов артериального типа, в базальной мембране чашечно-лоханочной и канальцевой систем почек выявлялись амилоидположительные структуры, амилоидный характер которых подтверждался зеленоватым свечением с двойным лучепреломлением при поляризационной микроскопии. Все описанные изменения увеличивались с продолжительностью введения амилоидогена. В миокарде отмечалось очаговая конгофильная дегенерация кардиомиоцитов, в стенках сосудов - накопление амилоидположительных структур, очаговые отложения амилоида отмечались также в печени и селезенке.

Рис.3. Отложение амилоида в канальцах и клубочках почек при длительном введении нативного яичного альбумина в дозе 0,025 мл/г массы тела. Паренхиматозная дистрофия канальцев. Окраска конго красным (хбОО)

Энтеральное введение минеральной воды «Редант-4» в дозе 10 мл/кг массы тела животного каждый день в течение 2-х месяцев способствовало уменьшению выраженности изменений в исследуемых органах и тканях. Микроскопически в корковом и мозговом слоях почки отмечалось некоторое снижение гиперемии, отека и плазматического пропитывания стенок сосудов, незначительно снижались конгофилия стромально-сосудистых структур, гиперемия, отек, а также плазматическое пропитывание в тканях сердца, печени, селезенки.

Рис.4. Снижение конгофилии базальной мембраны канальцев и клубочка под влиянием минератьной воды «Р-4» и янтарной кислоты при моделировании амилоидоза у крыс. Окраска

I конгокрасным (х 400)

I

I Профилактическое применение янтарной кислоты вызывало снижение

признаков конгофилии в сосудистых клубочках и базальной мембране их капсул. Кроме того, несколько уменьшилось содержание конгофильного белка в эпителии проксимальных и дистальных канальцев, и, соответственно, в их просветах. Внутрижелудочное введение янтарной кислоты в дозе 1,5 ммоль/кг массы тела в

сочетании с минеральной водой «Редант-4» у животных с амилоидной нефропатией вызывало наиболее значительный эффект - уменьшение гиперемии, плазматического пропитывания и отека интерстиция, уменьшение накопления амилоидположительных структур и признаков дистрофии.

Анализ данных показал, что модели нефропатического амилоидоза, полученные описанными способами (методом длительных и однократных инъекций чужеродного белка) по своим функциональным и морфологическим признакам не отличаются друг от друга. Кроме того, описанные профилактирующие эффекты минеральной воды «Редант-4» также повторяют друг друга в названных двух моделях, что позволило нам не дублировать эксперименты с изучением протекторного и корригирующего влияния янтарной кислоты отдельно и в сочетании с минеральной водой при моделировании амилоидоза методом однократного введения чужеродного белка.

Таким образом, введение старым крысам нативного яичного альбумина длительно, а также однократно в смеси с полным адъювантом Фрейнда приводит к развитию системного амилоидоза с поражением почек, сердца, печени, селезенки. Формирование экспериментального амилоидоза сопровождается протеинурией, снижением показателей электролито- и водовыделительной функции почек.

Способность сульфидных минеральных вод улучшать обменные процессы в клетке, кровоснабжение и иннервацию органов, усиливать регенераторные процессы, активизировать ферментные системы, микроциркуляцию, а также модифицирующее влияние янтарной кислоты на процессы тканевого метаболизма - клеточное дыхание, ионный транспорт, синтез, могли способствовать уменьшению признаков нефропатии в наших опытах, приводя к частичному восстановлению электролито- и водовыделительной функции и значительному уменьшению степени протеинурии. Использование минеральной воды и янтарной кислоты приводило к уменьшению гистологических признаков амилоидоза в исследуемых органах и тканях - снижению конгофилии стромально-сосудистых структур, гиперемии, отека, а также плазматического пропитывания в тканях почек, сердца, печени и селезенки. Сочетанное применение минеральной воды и янтарной кислоты на фоне введения амилоидогена оказывало более выраженный протективный эффект на процессы мочеобразования и формирование гистологических признаков экспериментального амилоидоза за счет более полного восстановления канальцевой реабсорбции и скорости клубочковой фильтрации.

18

ВЫВОДЫ:

1. Длительное подкожное введение яичного альбумина в течение 2-х месяцев вызывает формирование экспериментального амилоидоза с отложениями амилоида в структурах почек, селезенки, миокарда, стенках кровеносных сосудов. Амилоидная нефропатия проявляется снижением объема 6-тичасового спонтанного диуреза при уменьшении скорости клубочковой фильтрации, снижением экскреции натрия, выраженной протеинурией.

2. Однократное введение яичного альбумина в равнодолевой смеси с полным адъювантом Фрейнда вызывает через 1 и 2 месяца формирование генерализованного экспериментального амилоидоза с выраженными функциональными и морфологическими признаками амилоидной нефропатии, подобными проявлениям модели амилоидоза, получаемой введением яичного альбумина в течение двух месяцев.

3. Внутрижелудочное ежедневное введение сульфидной минеральной воды «Редант-4» в количестве 10 мл/кг в течение 2-х месяцев, одновременно с воспроизведением экспериментального амилоидоза (как длительным введением яичного альбумина, так и с применением адъюванта Фрейнда), значительно уменьшает формирование морфологических признаков амилоидоза, снижает выраженность протеинурии и степень нарушения водовыделительной функции почек, профилактирует изменения электролитовыделительной функции почек.

4. Применение янтарной кислоты в дозе 1,5 ммоль/кг ослабляет выраженность морфологических признаков амилоидоза, нарушений процессов мочеобразования, водовыделительной и электролитовыделительной функции почек. Профилактирующий эффект янтарной кислоты проявляется и в виде отдаления сроков и значительном уменьшении степени выраженности протеинурии.

5. Сочетанное применение сульфидной минеральной воды «Редант-4» и янтарной кислоты оказывает более выраженный профилактический эффект на формирование гистологических признаков амилоидоза, выраженность нарушения водо- и электролитовыделительной функции почек, наиболее значимо снижает содержание белка в моче.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Брин В.Б., Габуева A.A., Козырев К. М.. Функционально-морфологическая характеристика новой модели амилоидной нефропатии у экспериментальных животных.// Вестник новых медицинских технологий.-2009 - Т. XVI, №4 -С.29-30

2 Габуева A.A. Функционально-морфологическая характеристика модели генарлизованного амилоидоза у экспериментальных животных.// Материалы 10-ой юбилейной научной сессии СОГМА. - 2009. - С.113-115.

3 Габуева A.A., Брин В.Б., Козырев К. М.. Функционально-морфологическая характеристика новой модели амилоидной нефропатии у крыс. // Вестник МАНЭБ.- 2010.-Т.15, №2.- С. 77-80

4 Габуева A.A., Брин В.Б., Козырев К. М.. Влияние сульфидной минеральной воды «Редант-4Р» на функциональное состояние почек при нефропатическом типе генерализованного амилоидозаУ/ Владикавказский медико-биологический вестник.-2009-2010-Т.1Х/-С10Ы04

5 Габуева A.A. Функционально-морфологическая характеристика новой модели экспериментального амилоидоза7 Брин В.Б., Козырев К. М., Габуева A.A., Дзадзиева Н.Г.// Журнал теоретической и практ. медицины,- 2010-Т.8.-С.80-82

6 Габуева A.A. Функционально-морфологическая характеристика новой модели экспериментального амилоидоза/ В.Б. Брин, К. М. Козырев, И.У. Пухова, A.A. Габуева, Н.Г. Дзадзиева // Журнал теоретической и практической медицины.-2010-Т.8.-С.181-183

7 Брин В.Б., Габуева A.A., Козырев K.M. Влияние янтарной кислоты и сульфидной минеральной воды «Редант-4» раздельно и в их сочетании на функционально-структурное состояние почек при моделировании генерализованного амилоидоза нефропатического типа. // Кубанский научный медицинский вестиик.-2010.-№7 (121).-C.33-37

8 Габуева A.A. О возможности моделирования генерализованного амилоидоза у экспериментальных животных // X международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке»: Тез. докл. науч.-практ. конф. 9-12 декабря 2009г. -2009.- С. 101

9 Патент 2373581 Российская Федерация. МПК G 09 В 23/28 (2006.01). Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных / Габуева A.A.,

Брин В.Б., Козырев K.M.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «СевероОсетинская государственная медицинская академия Росздрава». №2008128201/14; заяв.10.07.2008; опубл. 20.11.2009//Бюл.-2009.-№32 10 Патент 2410764 Российская Федерация. МПК G 09 В 23/28 (2006.01). Способ профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных / Габуева A.A., Брин В.Б., Козырев K.M.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Росздрава». - № 2009137449/14; заяв. 09.10.09; опубл. 27.01.11//Бюл.-2011.-№3 И Патент 2410761 Российская Федерация. МПК G 09 В 23/28 (2006.01). Способ моделирования экспериментального амилоидоза у крыс / Габуева A.A., Брин В.Б., Козырев K.M.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «СевероОсетинская государственная медицинская академия Росздрава». - № 2009137437/14; заяв. 09.10.09; опубл. 27.01.11// Бюл.-2011.-№3

Информационно-технический отдел ГОУ ВПО СОГМА Минздравсоцразвития России

Подписано в печать_Тираж 100 экз.

Формат издания 60X90 усл.печл. 1,0 Заказ №

Актуальность проблемы. Несмотря на более чем столетнюю историю изучения, проблема амилоидоза продолжает привлекать внимание исследователей (F.Ferrario, M.Rastaldi, 2006), что обусловлено помимо достаточно широкой распространенности тяжестью клинических проявлений со склонностью к развитию почечной недостаточности (R. Rysava, 2007).

Амилоидоз почек является одной из основных причин нефротического синдрома у взрослых (M.A.Gertz et al, 2002). Однако выявление амилоидоза и на современном уровне развития методов диагностики представляет значительные трудности (С.И.Овчаренко, Е.А.Сон, Е.А.Окишева, 2007), в частности по причине малой изученности его этиологии, что и обусловливает ту важную роль, которую отводят созданию новых моделей амилоидоза с целью изучения особенностей его патогенеза. В этом плане перспективными могут явиться экспериментальные исследования, направленные на создание моделей амилоидоза с использованием животных совмещающих в себе два качества: достаточный размер и доступность.

На сегодняшний день существует большое количество способов воспроизведения амилоидоза, большинство из которых основывается- на введении животным биологических или химических агентов раздельно и в различных их сочетаниях (D. Cui, Н. Kawano, М. Takahashi et al., 2002) с целью запуска иммуно-патобиохимичеких механизмов образования* амилоидных фибрилл (М. Garcia-Garcia, G. Mourad, М. Durfort et al., 2003). Получены модели экспериментального генерализованного амилоидоза при заражении животных возбудителями хронических инфекций (Mycobacterium butiricum), а также методом подкожного введения белым мышам нативного яичного альбумина. Положительную оценку получило моделирование экспериментального амилоидоза почек при помощи бычьей плазмы (Гиоева З.В., Брин В.Б, Козырев К.М., 2007). Есть данные о развитии амилоидоза при помощи введения свиной плазмы (Пухова И.У., Брин В.Б., Козырев К.М., 2008). При моделировании амилоидоза таким способом исследования функционального состояния различных систем затруднено ввиду малых физиологических объемов и анатомических размеров используемых экспериментальных животных. Попытки моделирования амилоидоза на крысах ранее были безуспешными ввиду особенностей иммунитена и высокой скорости обменных процессов у данного вида животных. Исключить этот аспект можно при использовании старых особей, ткани которых находятся в состоянии естественной брадитрофии. Также вызывает интерес возможность воспроизведения генерализованного амилоидоза у крыс введением нативного яичного альбумина в сочетании с полным адъювантом Фрейнда методом однократного введения амилоидогена. Необходимым в данном случае является анализ степени вовлечения почек в патологический процесс.

Положительные результаты экспериментальных исследований подтверждают возможность приостановки дальнейшего накопления амилоида в тканях и органах и даже его рассасывания. Это позволяет ставить вопрос о поиске методов и средств, действующих относительно избирательно на определенные звенья его патогенеза и направленных на. стимуляцию амилоидоклазии.

В литературе имеются данные об успешном применении сероводородных минеральных вод для лечения нефротоксического и аутоиммунного>нефрита в экспериментах на животных и в клинике, что объясняется высокой фармакологической активностью сероводорода в минеральной воде в свободном, т.е. молекулярном состоянии. Сульфидная бальнеотерапия широко рекомендована и используется для лечения заболеваний, в основе которых лежит тотальная системная дезорганизация соединительной ткани (Хетагурова З.В., Беликова И.М., 1979).

Механизм лечебного действия сульфидных вод на организм в целом сложен, многообразен и подлежит дальнейшему изучению. Доказано, что в организме сероводород, даже в очень малой концентрации, вызывает изменения различных функций организма. В результате капилляры и сосуды расширяются, кровообращение в них ускоряется, приток крови к сердцу возрастает, а отток облегчается. Это способствует рассасыванию остатков воспалительных заболеваний и ускорению восстановительных процессов (Лавров А.П., 1946).

В последние годы возникает вопрос о возможности применения антигипоксических препаратов для профилактики развития амилоидоза, в частности, по литературным данным получен положительный терапевтический эффект от применения янтарной кислоты при экспериментальном амилоидозе у хомяков (Пухова И. У., Брин В.Б. 2009). Антиоксидантное действие янтарной кислоты, представляющей собой универсальный метаболит, широко изучается в последнее десятилетие. Выполняя каталитическую функцию по отношению к циклу Кребса, янтарная кислота снижает концентрацию лактата, пирувата и цитрата, накапливающихся на ранних стадиях гипоксии. Биологическое значение феномена ускоренного окисления янтарной кислоты сукцинатдегидрогеназой заключается в быстром' ресинтезе АТФ. Янтарная кислота нормализует содержание гистамина и серотонина, повышает микроциркуляцию в органах и тканях, прежде всего в мозге; не оказывая влияния на артериальное давление и показатели работы сердца (Суслин 3. А., Румянцев С. А. М., 2005).

Исходя из описанных положительных многофакторных свойств янтарной кислоты (A.A. Хадарцев, 2003,2004; A.JI. Коваленко, А.Ю. Петров, М.Г. Романцов, 2005), в частности, ее иммуномодулирующего и цитомембраностабилизирующего действия, она получила широкое применение в медицине. Диапазон действия янтарной кислоты очень широк: она стимулирует нервную систему, применяется как противострессовое, противовоспалительное и антитоксическое средство. Используется янтарная кислота для лечения различного рода анемий, острых радикулитов, хронических сердечно-сосудистых заболеваний, не оказывая при этом побочных действий.

Можно предположить, что через механизмы своего действия, минеральная сероводородная- вода и янтарная кислота могут способствовать в определенной степени торможению отдельных звеньев амилоидогенеза, тем самым ограничивая процесс дальнейшего накопления субстрата.

В связи с этим представляется обоснованным изучение влияния на процессы амилоидогенеза и амилоидоклазии янтарной кислоты и сероводородной минеральной воды, в частности сульфидной воды Северной Осетии редантского месторождения, раздельно и в их сочетании.

Цель работы - создание моделей экспериментального нефропатического типа амилоидоза, изучение их функциональных и патогистоструктурных характеристик, анализ возможности корригирующего влияния на амилоидогенез сульфидной минеральной воды «Редант-4» отдельно и в сочетании с янтарной кислотой.

Задачи исследования. Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Создать модель экспериментального генерализованного нефропатического амилоидоза' у крыс, методом длительного введения нативного яичного альбумина старым животным. Провести функциональное и морфологическое ее сопоставление с ранее созданными в лаборатории моделями амилоидоза.

2. Создать модель экспериментального нефропатического генерализованного амилоидоза у крыс, методом однократного введения нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда. Провести функциональное и морфологическое ее сопоставление с ранее созданными в лаборатории моделями амилоидоза.

3. Изучить характер функционально-структурных изменений у животных, получавших в процессе моделирования амилоидоза минеральную воду «Редант-4».

4. Изучить характер функционально-структурных изменений у животных, получавших в процессе моделирования амилоидоза янтарную кислоту.

5. Изучить характер функционально-структурных изменений у животных, получавших в процессе моделирования амилоидоза минеральную воду «Редант-4» с янтарной кислотой.

Научная новизна. Впервые разработан метод моделирования амилоидоза путем длительного (60 дней) подкожного введения старым крысам нативного яичного альбумина в дозе 0,025 мл/г массы тела, при котором развивается системный амилоидоз с преимущественным поражением почек, сердца, печени, селезенки.

Впервые разработан метод моделирования амилоидоза путем однократного подкожного введения крысам равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в пять точек инъекций, при котором развивается системный амилоидоз с преимущественным поражением почек, сердца, печени, селезенки.

Показаны особенности развития амилоидоза почек, сопровождающегося снижением основных показателей электролито-водовыделительной функции.

Показано, что применение сульфидной минеральной воды, способствует уменьшению выраженности признаков поражения почек при экспериментальном амилоидозе, приводя к частичному восстановлению электролите- и водовыделительной функции и снижению уровня- протеинурии. Использование минеральной воды уменьшает выраженность патогистологических изменений в тканях внутренних органов (почки, сердце, печень, селезенка).

Установлено, что применение сульфидной минеральной воды, отдельно и в сочетании с янтарной кислотой уменьшает изменения водовыделительной и ионовыделительной функции почек, вследствие ослабления выраженности изменений канальцевой реабсорбции воды, значительно снижает степень протеинурии. Показано, что применение сульфидной минеральной воды и янтарной кислоты уменьшает выраженность структурных повреждений тканей почек, сердца, печени и селезенки, вызванных введением равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда.

По теме диссертационной работы, на основании результатов исследования получены 3 патента на изобретение Федерального института промышленной собственности от 20 ноября 2009 г под № 2373581; №2410764 от 27.01.2009г.; № 2410761 от 27.01.2011г.

Научно-практическая значимость работы. Исследование носит экспериментальный характер и полученные результаты, демонстрирующие эффекты длительного введения старым крысам нативного яичного альбумина, а также однократного подкожного введения старым крысам равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда, сопровождающиеся развитием амилоидоза почек, относятся к области фундаментальных знаний, так как расширяют представления о возможностях моделирования амилоидоза почек, вносят определенный вклад в теорию этиологии и патогенеза амилоидоза. Выявленные эффекты применения сульфидной минеральной воды «Редант-4» и янтарной кислоты, демонстрируют возможность их лечебного и профилактического применения с целью нормализующего влияния на измененное состояние электролито-водовыделительной функции почек при экспериментальном амилоидозе.

Результаты исследования могут быть использованы при преподавании патофизиологических и гистоструктурных основ стромально-сосудистых диспротеинозов, при разработке способов профилактики и лечения амилоидоза в клинике.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Длительное (60 дней) подкожное введение старым крысам нативного яичного альбумина в дозе 0,025 мл/г массы тела приводит к развитию системного амилоидоза с преимущественным поражением почек, сердца, печени, селезенки.

2. Однократное введение старым крысам равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в 5 точек инъекций приводит к развитию системного амилоидоза с преимущественным поражением почек, сердца, печени, селезенки.

3. Формирование экспериментального амилоидоза сопровождается протеинурией, изменением показателей электролито- и водовыделительной функции почек.

4. Применение сульфидной минеральной воды одновременно с нативным яичным альбумином способствует уменьшению выраженности признаков поражения почек, приводя к частичному восстановлению электролито- и водовыделительной функции и снижению уровня протеинурии.

5. Применение сульфидной минеральной воды одновременно с равнодолевой смесью нативного яичного альбумина и полного* адъюванта Фрейнда уменьшает изменения водовыделительной и ионовыделительной функции почек, вследствие ослабления выраженности; изменений канальцевой реабсорбции воды. Показано, что применение минеральной воды, значительно уменьшает степень протеинурии.

6. Применение сульфидной минеральной воды в сочетании: с янтарной, кислотой одновременно, с нативным яичным альбумином способствует более выраженному уменьшению признаков поражения почек, приводя? к частичному восстановлению электролито- и водовыделительной функции и< снижению уровня протеинурии.

Апробация диссертационной работы.

1 Материалы исследований доложены и обсуждались на 10-й Юбилейной научной сессии, посвященной 70-летию СОГМА. ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Росздрава» (Владикавказ, 2009).

2 IX Конференции молодых ученых СОГМА (Владикавказ, 2010);

3 X Конференции молодых ученых и специалистов СОГМА (Владикавказ, 2011).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

За последние два десятилетия существенно изменились многие представления, касающиеся проблемы амилоидоза, что прежде всего относится к установлению механизмов развития отдельных форм амилоидоза, и получению возможности обосновать дифференцированные подходы к лечению (Я.А.Ку1е, М.А.СеНг, 1997).

Амилоид накапливается в органах и тканях в больших количествах, что приводит к атрофии, склерозу и функциональной недостаточности органов. Клинические проявления амилоидоза разнообразны и зависят от локализации амилоидных отложений, степени их распространенности в органах, наличия сопутствующих осложнений. Особенно1 развернутой клиническая картина становиться при поражении почек - наиболее частой локализации амилоида. Хотя в последние годы в. качестве причины смерти-при амилоидозе все чаще описывается недостаточность различных жизненно важных органов, особенно сердечная, все же, несомненно, что наиболее типична при этой болезни смерть от уремии. Вот почему поражение почек при амилоидозе по-прежнему представляет преимущественный интерес.

Постепенное распространение амилоидных отложений и все большее вовлечение в процесс сосудистой стенки обусловливают развитие ведущих симптомов амилоидоза почек - нарастание и развитие протеинурии, постепенного снижения кровотока, уменьшения клубочковой фильтрации и появления азотемии, нередко нефрогенной гипертонии.

В связи с тем, что патогенез и лечение амилоидоза не до конца изучены, следует считать актуальным как в фундаментальном, так и в прикладном плане поиск эффективных способов профилактики и коррекции нефропатического типа генерализованного амилоидоза, что объясняет целесообразность изучения препаратов янтарная кислота и минеральная вода «Редант-4».

Целью настоящего исследования было моделирование нефропатического типа генерализованного амилоидоза и изучение профилактического влияния фармакологических препаратов янтарная кислота и сульфидная минеральная вода «Редант-4» раздельно и в их сочетании на изменение водо- и электролитовыделительной функции почек при амилоидной нефропатии.

Опыты проводились на крысах-самцах массой 330-380 гр, отбирались старые особи (возраст 18-24 месяца) с целью исключения влияния на процесс моделирование особенностей обменных процессов данного вида животных. Амилоидную нефропатию вызывали путем подкожного введения нативного яичного альбумина в дозе 0,025 мл/г массы тела животного, (через день)' на протяжении 2-х месяцев, а также методом однократных инъекций равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейда в дозе по 0,2 мл в« пять, точек инъекций (подкожно в,подмышечные и паховые области слева и справа и внутрибрюшинно). Сульфидную минеральную воду «Редант-4» в дозе 10 мл/кг массы тела животного вводили ежедневно внутрижелудочно через зонд в течение 2-х месяцев. Янтарную кислоту вводили энтерально через день в дозе 1,5 ммоль/кг массы тела на протяжении 2-х месяцев. Через 1 и 2 месяца проводили изучение водо- и элетролитовыделительной функции почек в условиях спонтанного шестичасового диуреза.

При исследовании функционального состояния почек у животных при моделировании амилоидоза методом как длительного подкожного введения нативного яичного альбумина в дозе 0,025 мл/г массы тела, так и однократного введения его в смеси с адъювантом Фрейнда в дозе 1 мл, выявлялось достоверное снижение диуреза вследствие снижения скорости клубочковой фильтрации воды.

При изучении ионовыделительной функции почек выявлялось достоверное снижение экскреции натрия во все сроки эксперимента, относительно интактных животных. Уменьшение экскреции катиона было обусловлено снижением его фильтрационного заряда, при этом снижалась и канальцевая реабсорбция катиона. Концентрация натрия в плазме крови повышалась, по сравнению с данными интактного контроля.

Амилоидная нефропатия сопровождалась повышением экскреции калия. Рост катиона, вероятно, был обусловлен повышением канальцевой секреции калия в условиях гиперкалиемии.

Экскреция кальция с мочой при подкожном введении амилоидогена была достоверно выше контрольных данных. Увеличение экскреции кальция было связано со снижением канальцевой реабсорбции катиона, при этом фильтрационный заряд кальция снижался. Уменьшение фильтрационного заряда было обусловлено снижением скорости клубочковой фильтрации воды и уменьшения содержания кальция в плазме крови.

Экскреция белка с мочой на фоне введения амилоидогена увеличилась почти в 3 раза, по сравнению с данными контрольной группы животных.

Прежде чем приступить к анализу данных, полученных при изучении влияния минеральной воды «Редант-4» на функции почек у крыс при амилоидной нефропатии, отметим некоторые особенности, выявленные нами в результате проведения контрольных исследований у животных с изолированным введением названной минеральной воды.

Результаты 2-х месячного введения воды «Редант-4» в дозе 10 мл/кг массы тела у интактных животных показали, что длительное её применение вызывает достоверный рост диуреза за счет увеличения скорости клубочковой фильтрации при имеющейся тенденции к росту канальцевой реабсорбции. При изучении ионовыделительной функции почек отмечался достоверный рост натриуреза, тенденция к увеличению экскреция калия и кальция. Содержание электролитов и степень протеинурии достоверно от интактного контроля не отличались.

Применение минеральной воды на фоне введения нативного яичного альбумина препятствовало изменениям диуреза. Профилактические эффекты воды «Редант-4» были обусловлены увеличением канальцевой реабсорбции воды и скорости клубочковой фильтрации, по сравнению с амилоидной группой животных.

Исследования показали, что применение минеральной воды «Редант-4» на фоне эффектов амилоидогена во всех группах опытных животных, оказывало существенное влияние на обмен и показатели почечной обработки натрия, калия и кальция, нивелирует изменения ионовыделительной функции почек у крыс при амилоидной нефропатии. Применение минеральной воды значительно уменьшало степень протеинурии.

Таким образом, проведенные исследования позволяют предложить следующую- схему механизмов профилактирующего действия сульфидной минеральной воды (рис. 6.1.). В результате введения минеральной, воды в желудок, через зонд ежедневно в дозе 10 мл/кг одновременно с воспроизведением, модели амилоидоза проявляются эффекты сульфидных минеральных вод, известные из литературы в виде способности улучшать обменные процессы в клетке, кровоснабжение и иннервацию органов, повышать потребление кислорода * тканями; усиливать регенераторные процессы, активизировать ферментные системы, микроциркуляцию, подтверждает их противовоспалительный и диуретический эффект (Маныпина Н.В, 2007; Хетагурова З.В., Амбалова С.А., 1983). Этим объясняется их положительное влияние на изменения водо- и электротлито выделительную функции почек, полученное в ходе эксперимента (увеличение относительной канальцевой реабсорбции и скорости клубочковой фильтрации, частичное восстановление изменений ионовыделительной функции почек, уменьшение степени протеинурии) (рис. 6.1.).

Профилактическое применение сульфидной^4 4 минеральной воды при моделировании нефропатического типа амилоидоза

Улучшение обменных процессов в клетке, улучшени кровоснабжения и иннерва я

Повышение энергоресурсов клетки, непосредственное включение ЭН-групп в биохимические реакции, активизация ферментных систем V к I I

Снижение гиперемии, отека в печени, сердце, селезенке

Повышение потребления кислорода тканями, усиление регенераторных процессов

Уменьшение отложения амилоида в почках

Ослабление нарушения у,,,,.,. микроциркуляции

I . . — мшшшшж

КШШ

1,

Восстановление скорости клубочковой льтрации и канальцевой реабсорбции воды

ШИИдИнШи Г н

Снижение протеинурии I I

Рис.6.1 Влияние сульфидной минеральной воды Р-4 на повреждающее действие нативного яичного альбумина при нефропати ческом типе амилоидоза

Контрольные исследования у животных с введением янтарной кислоты в дозе 1,5 ммоль/кг массы тела интактным животным достоверно не изменяло показатели водовыделительной функции почек, ионоосмотических показателей плазмы крови, выявлялась лишь тенденция к увеличению экскреции электролитов по сравнению с интактным контролем: Профилактическое применение янтарной кислоты на фоне введения нативного яичного альбумина вызывало повышение уровня спонтанного диуреза, вследствие повышения скорости клубочковой фильтрации воды относительно амилоидной группы животных группы животных, но данные все же были ниже результатов интактных животных. Внутрижелудочное введение янтарной кислоты на фоне применения амилоидогена способствует уменьшению выраженности изменений экскреции электролитов, вследствие уменьшения выраженности изменений канальцевой реабсорбции катионов.

При изучении электролитовыделительной функции, почек выявлялось увеличение экскреции кальция и натрия, что было обусловлено ростом фильтрационного заряда катионов, несмотря на то что при этом происходило и увеличение их канальцевой реабсорбции Экскреция- белка с мочой по сравнению с данными амилоидной группы снизилась вдвое.

Таким образом, полученные результаты подтверждают сведения о значительном диуретическом эффекте янтарной кислоты, которые проявляются в условиях патологии (В.И.Малюк, A.A. Цыганий, З.Г.Овруцкая, 1976), а также положительный терапевтический эффект от применения янтарной кислоты при экспериментальном амилоидозе у хомяков (Пухова И. У., Брин В.Б. 2009). Модифицирующее влияние янтарной кислоты на процессы тканевого метаболизма - клеточное дыхание, ионный транспорт, синтез белков (Хадарцев A.A., 2003,2004; Коваленко A.JL, Петров А.Ю.,„ 2005) могли способствовать уменьшению признаков нефропатии в эксперименте, приводя к частичному восстановлению электролито- и водовыделительной функции и снижению уровня протеинурии (рис.6.2)

Профилактическое применение янтарной кислоты при моделировании нефропатического типа амилоидоза

Улучшение тканевого дыхания, увеличение потребления кислорода

Ч1заа^у» л1!й? Я - У

Снижение концентрации лактата, улучшение энергообеспечения клетки, усиление ^ транспорта электронов в

Активация ферментных и транспортных С£СТ£М ■-.- .^

Снижение конгофилии, гиперемии, отека в печени сердце, селезеике

Уменьшение отложения амилоида в почках п

Ослабление нарушения микроцир

Восстановление скорости кпубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды

ЩНМнНЙВнННМЙНН

Снижение

Рис.6.2 Влияние янтарной кислоты на повреждающее действие нативного яичного альбумина при нефропатическом типе амилоидоза

Сочетанное применение минеральной воды и янтарной кислоты на фоне введения нативного яичного альбумина оказывало более выраженный терапевтический эффект на процессы мочеобразования при моделировании экспериментального амилоидоза, чем раздельное применение названных препаратов, за счет более полного восстановления канальцевой реабсорбции и клубочковой фильтрации. В частности, было отмечено более выраженное корригирующее влияние сочетанного применения янтарной кислоты и минеральной воды на канальцевую реабсорбцию по сравнению с введением на фоне амилоидогена только янтарной кислоты, и на скорость клубочковой фильтрации - по сравнению с профилактическим применением только минеральной воды.

Отмечено более выраженное корригирующее влияние на нарушение экскреции с мочой натрия, по сравнению с изолированным применением на фоне яичного альбумина минеральной воды или янтарной кислоты. На нарушение почечной обработки и экскреции с мочой' калия сульфидная минеральная вода и янтарная- кислота оказывают незначительный профилактирующий эффект, выраженный в одинаковой степени при раздельном или сочетанном применении названных препаратов. Сочетанный профилактический прием названных препаратов нивелировал нарушения экскреции с мочой кальция, в той же степени, что и введение на фоне амилоидогена только минеральной воды.

Прогрессивное уменьшение степени протеинурии, развивавшейся в ходе моделирования амилоидоза, максимально проявлялось при сочетанном приеме препаратов, в меньшей степени - при изолированном введении на фоне амилоидогена минеральной воды и/или янтарной кислоты

Гистологическое исследование почек крыс при моделировании амилоидной нефропатии выявило макроскопически увеличение органа в объеме, на разрезе корковый и мозговой слои были полнокровны, граница между ними сглажена. Микроскопически при окраске гематоксилином и эозином и конго красным наблюдались явления мукоидного и фибриноидного набухания стромально-сосудистых структур, фибриноидного некроза и отложением конгофильных структур (фибриллярных белков амилоида). При окраске срезов амилоидной группы животных конго-красным в стенках клубочковых артериол и капилляров, а также в средней оболочке сосудов артериального типа, в базальной мембране чашечно-лоханочной и канальцевой системе почек выявлялись гомогенные амилоидположительные структуры, амилоидный характер которых подтверждался зеленоватым свечением с двойным лучепреломлением при поляризационной микроскопии. Все описанные изменения коррелировали с продолжительностью эксперимента.

При введении амилоидогена очаговые отложения амилоида наблюдались и в других органах: в миокарде, в стенках сосудов, в печени, в селезенке.

Энтеральное введение минеральной воды «Редант-4» в дозе 10-мг/кг массы тела животного каждый день в течение 2-х месяцев способствовало уменьшению выраженности изменений в-, исследуемых органах, и тканях. Микроскопически в корковом и мозговом слоях отмечалось некоторое снижение гиперемии, отека и плазматического- пропитывания стенок кортикальных и медуллярных сосудов. Контуры отдельных клубочков хотя и определялись не четко, но с видимыми просветами клубочковых капсул, в которых определялся серозный экссудат с рыхлыми белковыми массами.

Если в динамике микроскопических исследований у амилоидных животных выявлялась ярко выраженная конгофилия фиброзной капсулы почки, то у леченых животных этот феномен был менее выражении.

Отмечалось снижение гиперемии, плазматического пропитывания, отека и снижением конгофильной активности в сосудисто-стромальных элементах миокарда, печени, селезенки.

Микроскопическое подтверждение положительного влияния янтарной кислоты при экспериментальном амилоидозе почек корреллировало с результатами функциональных исследований. При введении животным яичного альбумина и янтарной кислоты в течение 60 дней в почках отмечалось снижение признаков конгофилии в сосудистых клубочках и базальной мембране их капсул. Уменьшились конгофилия, гиперемия, плазматическое пропитывание и отек в интерстиции. Кроме того, несколько снизилось содержание конгофильного белка в эпителии проксимальных и дистальных канальцев, а также в их просветах.

Внутрижелудочное введение янтарной кислоты в сочетании с минеральной водой «Редант-4»через день в течение 2-х месяцев вызывало у животных с моделью амилоидоза значительные морфологические изменения тканей внутренних органов экспериментальных животных. В почках происходило снижение признаков конгофилии базальной мембраны клубочков Боумена-Шумлянского и капиллярных петель сосудистого клубочка. В миокарде отмечалось уменьшение накопления амилоидпоплоительных структур в кардиомиоцитах и межуточном веществе. Происходила репарация структуры печени и регенераторная гиперплазия ретикуло-макрафагальной системы белой пульпы в селезенке.

Количество очагов слущивания эндотелия резко снижалось в отличие от модели амилоидоза. Контуры большинства клубочков определялись четко, с хорошо видимыми просветами клубочковых капсул. В просвете отдельных капсул Шумлянского-Боумена выявлялся серозный экссудат. Уменьшается гиперемия, плазматическое пропитывание и отек интерстиция внутренних органов.